CN105504018A - Lag-3亲和肽n13、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种LAG-3亲和肽N13、制备方法及其在抗肿瘤方面的应用。该亲和肽包括12个氨基酸，分子量为1634.8Da，其序列具体DDFRVWWPNFPR。该肽可采用Fmoc固相多肽合成法制备，同时该肽可作为肿瘤治疗中的药物应用。本申请以真核蛋白rhLAG3-Fc为靶分子，以hIgG1-Fc为标签蛋白，通过噬菌体展示肽库高通量技术筛选出了LAG-3胞外段的亲和肽N13。针对该肽，进一步的体外信号通路阻断试验和小鼠荷瘤试验表明，该肽在肿瘤治疗、延长生物体生存期方面具有较好地应用前景，为生物体肿瘤的免疫治疗提供了新的可能。

Description

LAG-3亲和肽N13、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种LAG-3亲和肽N13、制备方法及其在抗肿瘤方面的应用。

背景技术

现有肿瘤治疗技术中，针对肿瘤的免疫治疗被认为是治愈肿瘤的终极手段。已有研究普遍认为：与传统的治疗方法相比，肿瘤免疫治疗能够激活或者诱导肿瘤患者建立起对肿瘤抗原的特异性免疫应答，清除原发的肿瘤细胞，并且建立免疫记忆，阻止肿瘤的复发和转移。但是由于肿瘤类型的多样性及复杂性，因而肿瘤的免疫治疗既是现有肿瘤研究中的热点，也是研究的难点。

现有肿瘤免疫治疗中，CD8⁺细胞毒T淋巴细胞（CTL）是主要的效应细胞，CD8⁺CTL需要通过MHC-I类分子介导的细胞免疫应答过程而被激活。肿瘤抗原等内源性抗原被树突状细胞（DC）等抗原提呈细胞（APC）加工处理后以MHC/表位复合物的形式提呈至APC的表面，该复合物能被T细胞表面的T细胞受体（TCR）识别，从而形成了激活T细胞的第一信号，即T细胞对抗原的识别；T细胞活化的第二信号来自协同刺激分子，即APC表达的协同刺激分子与T细胞表面的相应受体或配体相互作用介导的信号。根据产生效应的不同，可将上述共刺激分子分为正性共刺激分子和负性共刺激分子。在负性共刺激分子中，最重要的是CTLA-4、PD-1及LAG-3等分子。

在肿瘤免疫治疗过程中，肿瘤微环境中负性共刺激分子能引起CTL的功能耗竭和无反应性，而耗竭的CD8⁺CTL无法发挥细胞毒作用以及正常增值和释放细胞因子，最终引起肿瘤免疫耐受和逃逸。而现有针对肿瘤免疫治疗过程中遇到的最大挑战就是由于肿瘤免疫耐受和逃逸所导致的疗效不佳。因此，探讨通过联合抑制负性共刺激分子所介导的信号通路以打破机体已经建立的肿瘤免疫耐受具有更重要的理论意义和应用价值。

淋巴细胞活化基因-3（LAG-3，CD223）作为一个重要的负性共刺激分子，是免疫球蛋白超家族成员的一种膜蛋白，在1990年首次发现报道。成熟的LAG-3分子由470个氨基酸构成，主要通过胞外IgV样结构域与主要组织相容性复合体II类分子（MHC-II）结合。LAG-3通过直接作用于CD8+T细胞而维持自身和肿瘤抗原的免疫耐受性，抗LAG-3单克隆抗体可阻断LAG-3分子的功能，并使肿瘤实质细胞中CD4+T细胞、CD8+T的增殖及功能得以恢复。

针对LAG-3，已有研究认为，LAG-3及其配体MHC-II是T细胞活化过程中一对重要的负性共刺激分子，在诱导T细胞无能和免疫耐受维持方面起着非常重要的作用，并介导了肿瘤免疫耐受和逃逸，因而理论而言，如果能够获得LAG-3的亲和物质，避免或者减小LAG-3的负性共刺激作用，对于肿瘤的免疫治疗是有十分重要的意义的。

发明内容

本发明主要目的是提供一种LAG-3亲和肽物质N13，同时提供了该亲和肽的制备方法，将该亲和肽进行相应动物实验后，证明了其可以用于肿瘤的免疫治疗。

本发明所采取的详细技术方案介绍如下。

一种LAG-3亲和肽N13，利用噬菌体展示十二肽库液相、固相反向淘选法筛选出来，该亲和肽包括12个氨基酸，分子量为1634.8Da，其序列如序列表SEQIDNO.1所示，具体序列为：

Asp-Asp-Phe-Arg-Val-Trp-Trp-Pro-Asn-Phe-Pro-Arg，即DDFRVWWPNFPR。

所述LAG-3亲和肽N13，采用Fmoc固相多肽合成法制备而成。

所述LAG-3亲和肽N13作为肿瘤治疗中药物的应用，所述肿瘤具体例如：结肠癌。

本申请以真核蛋白rhLAG3-Fc为靶分子，以hIgG1-Fc为标签蛋白，通过噬菌体展示肽库高通量技术筛选出了LAG-3胞外段的亲和肽N13。针对该肽，进一步的体外信号通路阻断试验和小鼠荷瘤试验表明：该肽在肿瘤治疗、延长生物体生存期方面具有较好地应用前景，为生物体肿瘤的免疫治疗提供了新的可能。

附图说明

图1为LAG-3亲和肽N13的ESI-MS质谱分析鉴定结果；

图2为体外信号通路阻断试验的实验结果；

图3为小鼠抑瘤率试验中小鼠体重变化结果；

图4为LAG-3亲和肽N13对荷CT26的BALB/c小鼠移植瘤体积变化的影响结果图；

图5为LAG-3亲和肽N13对荷CT26的BALB/c小鼠生存期的影响结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，对本发明中所涉及部分物料及实验设备情况简要说明如下。

主要试剂：

IFN-r，PeproTech公司；

Balb/c小鼠，北京维通利华实验动物技术有限公司；

盐酸四环素（Tet），宝生物工程（大连）有限生物公司；

ProteinA/GMixMagneticBeads，Milipore公司；

ER2738菌、Ph.D.-12^TMphagedisplaypeptidelibrarykit（即实施例中噬菌体展示十二肽库），NEB公司；

rhLAG-3/Fc蛋白，江苏泰利达生物科技有限公司；

Rink树脂、Fmoc-氨基酸，上海吉尔生化公司；

Anti-humanIgG1-FcPE、Anti-HumanHLA-DRAPC，eBioscience公司。

主要仪器：

低温高速冷冻离心机，Sigma公司；

酶标板，Corning公司；

酶标仪，BIO-RAD公司；

多肽合成仪，江苏通州市南兴申海波仪器厂；

冻干机，SYNGENE公司；

FACSCalibur流式细胞仪，BD公司。

实施例1

本实施例主要简要介绍一下LAG-3亲和肽N13的筛选获得过程。

本发明中的LAG-3亲和肽N13主要采用液相、固相反向淘选法进行噬菌体展示十二肽库筛选获得，其主要技术流程是：与目标蛋白结合→扩增→与目标蛋白结合→洗脱。在经过3~5轮的筛选后，与靶蛋白LAG-3胞外段有亲和力的噬菌体单克隆逐轮得到富集，回收率大大提高。然后从第三轮、第五轮中挑选蓝斑进行测序，分别共得到多个不同插入十二肽序列，即亲和肽序列，其中N13肽是两种筛选方法所共有的。有关筛选的具体过程介绍如下。

首先需要介绍的是噬菌体滴度的测定方法，具体步骤为：

（1）于37℃预温LB平板；

（2）用LB培养基对噬菌体样品进行倍比系列稀释，扩增后噬菌体样品稀释范围为：10⁶~10⁹，未扩增的噬菌体样品稀释范围为：10¹~10⁵；

（3）取20μL活化的ER2738菌液加入离心管，每个噬菌体稀释度一管；

（4）分别在上述离心管内加入50μL不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温孵育2min；

（5）微波炉融化上层琼脂，待冷却至50℃左右，在每个离心管中加入1mL，快速混匀，倾注于37℃预温的LB平板上；

（6）平板避光冷却，倒置于37℃过夜培养。

检查平板，计数噬菌斑的平板上蓝色噬菌斑数目，按如下公式计算滴度，

噬菌体滴度(pfu/μL)=（噬菌斑数目×稀释倍数）/10。

其次，液相反向亲和淘选流程的具体步骤为：

（1）预处理：将ProteinA/GMixMagneticBeads悬液混匀后取3μL于1.5mL无菌离心管中，加入1mLTBST洗涤液，弃去液体，重复洗一次；

（2）封闭：加入1mL封闭液，4℃至少封闭20min，期间偶尔上下颠倒混匀；

（3）洗涤：弃去封闭液，用1mLTBST洗涤液洗涤，重复洗1次；

（4）在封闭期间，用TBST缓冲液将真核蛋白rhLGA3-Fc蛋白稀释至终浓度为10nM，取20μL真核rhLGA3-Fc蛋白投入到ProteinA/GMixMagneticBeads中，室温结合10min；

（5）结合：在ProteinA/GMixMagneticBeads与rhLAG3-Fc复合物中快速加入20μL提前用TBST缓冲液稀释至滴度为1×10⁹pfu/μL的文库噬菌体，室温孵育结合10min，不时上下混匀；

（6）将离心管置于磁架上，弃去上清，用TBST缓冲液洗涤3次；

（7）洗脱与中和：加入20μL洗脱液，室温洗脱3min后，将上清转移至预先已加入60μL中和液的新鲜离心管中，温和的吹打混匀；

此即为与靶蛋白rhLAG3-Fc结合的噬菌体克隆，取其中的10μL测定滴度，根据测定的滴度确定是否需要进行扩增；如果根据滴度计算出，所得到的噬菌体克隆总数不小于2×10⁷，即无需扩增。

（8）重复步骤（1）至（3），再加入20μL用TBST缓冲液稀释至终浓度为10nM的真核表达蛋白hIgG1-Fc，室温孵育结合3min，期间不时上下颠倒混匀；

（9）结合：在Beads-hIgG1-Fc复合物中快速加入20μL与靶蛋白rhLAG3-Fc结合的噬菌体克隆，室温孵育结合6min；

（10）将离心管置于磁架上，把上清转入一新鲜离心管中，得到与标签蛋白hIgG1-Fc不结合，只结合到LAG-3蛋白分子的噬菌体克隆；

（11）取出10μL测定其滴度，其余噬菌体克隆进行扩增，纯化得到的次级肽库后测定滴度，并计算其回收率，回收率=[洗脱噬菌体数目/投入噬菌体数目]×100%；

经过2~3轮的淘选后，即可富集得到含目的多肽的噬菌体。

噬菌体扩增的具体过程为：

（1）扩增：将ER2738以1:100的比例接种至60mL的LB液体培养基（含0.1%Tet），加入待扩增的噬菌体（即中和后的洗脱产物），37℃剧烈振荡培养5~8h；

（2）沉淀：将上述培养液4℃、12000rpm、离心6min，取30%的上清于新鲜离心管中，加1/6体积的PEG-8000/NaCl，混匀后4℃沉淀过夜；

（3）重悬：将沉淀过夜的上清4℃、12000rpm、离心6min，弃上清，把沉淀重悬于5mLTBS中；

（4）再沉淀：在重悬液中加入1/6体积的PEG-8000/NaCl，冰浴环境下再次沉淀20min；

（5）再重悬：4℃、12000g0rpm、离心2min，弃上清，沉淀重悬于30μLTBS中；

此即为扩增后的次级肽库，可用作下一轮筛选。

第三，固相反向亲和淘选流程的具体步骤为：

（1）包被：将50μL、500μg/mL的真核蛋白rhLAG3-Fc包被于96孔板，密闭湿盒4℃孵育过夜;

（2）封闭：弃尽包被液，迅速加满封闭液，4℃孵育1h；

（3）洗涤：TBST洗涤3次；

（4）结合：快速加入滴度为2×10⁹pfu/μL的文库噬菌体，50μL/孔，室温温和摇动3h；在这个过程中；

（5）洗涤：用TBST洗涤3次；

（6）洗脱：在每孔中加入10μL洗脱液，室温温和摇动60min；

（7）扩增：将第一轮筛选得到的噬菌体在大肠杆菌ER2738中进行扩增和纯化，得到次级肽库；

（8）包被标签蛋白hIgG1-Fc（10μg/mL）于96孔板，50μL/孔；

（9）快速加入10μL与靶蛋白rhLAG3-Fc结合的噬菌体克隆，室温温和摇动1h；

（10）取出10μL测定其滴度，其余噬菌体克隆进行扩增，纯化得到的次级肽库后测定滴度；

经过3~5轮的亲和淘选，即可富集得到含目的多肽的噬菌体。

最后，对筛选所得的噬菌斑进行扩增，具体步骤为：

（1）将ER2738过夜培养菌液以1:100的比例接种于LB液体培养基，2mL/管分装到灭菌的试管中；

（2）选取最后一到两轮的淘选物滴度平板上的克隆，挑取单一蓝色噬菌斑到上述培养管中；

（3）将试管置于37℃摇床中、剧烈震荡培养5~6h；

（4）将上述培养物4℃、13000rpm、离心2min，再将上清转入新鲜离心管，此即为扩增的噬菌体贮液。

结果分析，即多肽序列的同源性分析

取上述噬菌斑扩增后的噬菌体贮液400μL进行噬菌体克隆DNA测序，同时根据此测序结果推导噬菌体克隆所编码的氨基酸序列，再通过DNAMAN软件对获得的氨基酸序列进行同源性分析。结果表明，在两种方法所得到的数个插入十二肽序列中，亲和肽N13是共有的，即是特异性的结合于LAG-3的，而亲和肽N13的序列为Asp-Asp-Phe-Arg-Val-Trp-Trp-Pro-Asn-Phe-Pro-Arg，即DDFRVWWPNFPR。

实施例2

本实施例主要就LAG-3亲和肽N13的人工合成制备方法简要介绍如下。

LAG-3亲和肽N13的制备方法，采用Fmoc固相多肽合成法制备而成，其技术原理是：选用Rink树脂与待合成肽C端的第一个Fmoc-氨基酸羧基以共价键形式连接，再以该氨基酸的N端作为该条多肽合成的起点，并让其与下一个氨基酸的羧基端发生脱水缩合反应，形成肽键；然后，将N端的Fmoc-氨基酸的保护基进行脱保护，再让第二个氨基酸的N端与后面的氨基酸的羧基反应；如此不断重复这一过程直至多肽合成完毕；最后再将合成的多肽从树脂上切割下来，经过乙醚沉淀与洗涤，得到粗肽，进一步提纯后即可获得亲和肽N13的纯品。

其具体合成过程详述如下：

首先，溶胀树脂：

（1）树脂的溶胀：称取约0.15gRink树脂置于多肽合成仪内，加入适量的DMF，浸泡约10min使树脂充分溶胀，用真空泵抽出合成仪中的DMF溶液；

（2）洗涤：DMF两次→MeOH(甲醇)三次→DCM（二氯甲烷）三次→DMF两次，摇床中震荡洗涤，每次洗涤两分钟，洗涤结束时用真空泵将液体抽干；

其次，添加第一个氨基酸：

（3）添加第一个氨基酸：计算首个氨基酸、HoBt、DIC的量，并将氨基酸和HoBt用少量的DMF溶解后加入合成仪中，再吸取DIC加入合成仪；室温下震荡反应5h；

（4）洗涤：同步骤（2）；

（5）测定取代值：在290nm的波长下，挑取树脂，烘干后称量树脂的质量，将树脂装入5mL的离心管中，加入3mL的脱保护液震荡10min，测定样品的OD值；取代值在0.3~0.4最佳；

（6）封头：向合成仪加入适量的封头液震摇20min，共两次；

（7）洗涤：同步骤（2）；

第三，添加后续氨基酸：

（9）脱保护：加入适量的脱保护液，摇床室温震荡反应20min，共2次；

（10）洗涤：同步骤（2）；

（11）茚检：挑取少量树脂放入茚检管，加入茚检试剂，沸水浴2min后，观察树脂颜色，若树脂为蓝色为正常；

（12）后续氨基酸的添加：计算并将称量的氨基酸和HOBt，用少量DMF溶解后加入多肽合成仪，加入DIC，置于摇床中，室温下震荡反应2.5h；

（13）洗涤：同步骤（2）。

（14）茚检：同步骤（11），树脂为透明的亮黄色，且无蓝斑，则说明氨基酸缩合完全，可进行下一步反应；

（15）重复步骤（9）~（14）直至完成整条肽链的缩合反应；

第四，切割多肽：

（16）脱保护：同步骤（9）；然后茚检：同步骤（11）；再后洗涤，同步骤（2）；

（17）切割：在通风橱中配置切割试剂并将其迅速倒入合成仪，搅拌器缓慢搅拌切割3h左右；

反应完毕后，用真空抽滤泵将切割试剂抽滤至圆底烧瓶中，再用DCM把搅拌桨和树脂冲洗几遍，液体也移至圆底烧瓶中；

（18）旋转蒸发：把旋转蒸发仪的温度调整为65℃，将切割液旋转蒸发，以便去除TFA等有机溶剂；

（19）离心：将乙醚沉淀混合液，2000rpm离心2min，弃上清收集沉淀，用冰乙醚重悬洗涤沉淀5次；

（20）烘干：将收集的粗肽沉淀于37℃烘箱烘干，电子分析天平称重，然后将其密封并置于冰箱中-20℃保存。

对所收集的粗肽进一步纯化后即可进一步进行试验检测，纯化时可采用RP-HPLC进行粗肽的纯化，纯化体系为：乙腈，1‰；TFA=30%~50%；检测波长是228nm。

对纯化后的LAG-3亲和肽N13进行检测后，结果表明其纯度大于95%，可以较好用于后续实验。

对所制备的亲和肽N13进行进一步的质谱分析，其质谱鉴定结果如图1所示，ESI-MS质谱分析证实其分子量符合理论值，即亲和肽N13的分子量为1634.8Da。

实施例3

以实施例2所制备的LAG-3亲和肽N13为例，本实施例主要对LAG-3亲和肽N13与LAG-3的亲和效果进行了体外阻断实验，结果表明其可以阻断LAG3/MHC-II信号通路，相关实验情况介绍如下。

（1）将THP-1细胞用20ng/mL的IFN-r刺激12h，后冰上孵育Anti-HumanHLA-DRAPC流式抗体，然后流式细胞仪检测发现其表面的配体HLA-DR分子表达量达到最高，并且细胞状态良好；

（2）将上述刺激过的THP-1细胞上孵育不同浓度的LAG3-Fc融合蛋白，后冰上孵育Anti-humanIgG1-FcPE抗体，用流式细胞仪检测得到上述刺THP-1细胞表面LAG3-Fc融合蛋白的结合量约为400ng；

（3用PBS将亲和肽N13溶解，配置浓度分别为0.1μM、0.5μM、1μM的肽溶液，然后与400ng的LAG3-Fc蛋白在冰上晃动孵育50min；

（4）把孵育后的上述混合液与THP-1细胞在冰上再共同孵育60min；

（5）离心后，弃上清，并加入荧光二抗，冰上避光孵育20min后洗涤，上流式细胞仪检测其荧光强度。

不同多肽浓度的实验结果如图2所示。从图2可以得知，与对照组（不加N13肽）相比较，N13肽在浓度（0.5~1μM）时所对应的峰图偏移程度较大，则显示出N13肽有较好的阻断效果，其中横坐标FL2-H表示平均荧光强度。

实施例4

以实施例2所制备的LAG-3亲和肽N13为例，本实施例主要对亲和肽N13在体内的抗肿瘤活性进行了动物体内实验，相关实验过程介绍如下。

采用荷CT26（结肠癌）的Balb/c小鼠进行了抑瘤率实验，于每只小鼠背部部位荷瘤细胞约2×10⁷个，5天后随机分组。共分为NS（生理盐水，阴性对照组）、N18（无关肽对照组)、N13-H（LAG3亲和肽高剂量，2.0mg/kg)、N13-L（LAG3亲和肽低剂量，0.5mg/kg），共4组，每组Balb/c小鼠8~10只。

给药时，上述肽均溶于生理盐水中制成相应浓度的多肽药物，-20℃分装保存备用。

各组均采用瘤旁给药方式，共给药7天。实验期间小鼠自由进食和饮水。停止给药后，继续观察小鼠的生存状况，得到荷瘤小鼠的生存期数据。

实验期间每隔一日测量小鼠体重及肿瘤的长径（a）、短径（b），然后按公式（体积=π/6×a×b²）计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线。

需要说明的是，N18肽是以rhLAG3-Fc为靶分子，通过噬菌体十二肽库筛选得到的，但经过鉴定得知它是一条假阳性肽，因此可作为阳性对照。

实验期间小鼠体重变化情况如图3所示。从图3中可以看出，LAG-3亲和肽N13给药组的体重变化在正常范围内，可以初步表明LAG-3亲和肽没有明显毒副作用。

实验期间小鼠体内肿瘤体积变化情况如图4所示。从图4中可以看出，亲和肽N13给药组的瘤体积比阴性对照生理盐水组和无关肽对照组都要小，而低浓度的亲和肽N13更有优势，此结果表明LAG-3亲和肽N13具有一定的抗肿瘤应用前景。

实验期间小鼠的生存率结果如图5所示。从图5中可以看出，LAG-3亲和肽N13能延长荷瘤小鼠的生存期，此结果表明LAG-3亲和肽N13作为肿瘤治疗的药物应用时，能够明显延长生物体的生存期，具有一定地抗肿瘤应用效果。

SEQUENCELISTING

<110>郑州大学

<120>LAG-3亲和肽N13、制备方法及其应用

<130>none

<160>1

<170>PatentInversion3.5

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<211>12

<212>PRT

<213>LAG-3亲和肽N13

<400>1

AspAspPheArgValTrpTrpProAsnPheProArg

1510

Claims (3)

1.一种LAG-3亲和肽N13，其特征在于，该亲和肽包括12个氨基酸，分子量为1634.8Da，其序列如序列表SEQIDNO.1所示，具体序列如下：

Asp-Asp-Phe-Arg-Val-Trp-Trp-Pro-Asn-Phe-Pro-Arg，即DDFRVWWPNFPR。

2.权利要求1所述LAG-3亲和肽N13的制备方法，其特征在于，采用Fmoc固相多肽合成法制备。

3.权利要求1所述LAG-3亲和肽N13作为肿瘤治疗中药物的应用。