CN112028982A - 一种靶向pd-l1的共价多肽抑制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学和医药技术领域，具体涉及一种靶向PD‑L1的共价多肽抑制剂及其制备方法和应用。所述共价多肽抑制剂的通式为X‑SKDEEWHKNNFPLSPGNTYYEDQG，其中X为羧基化四苯基乙烯分子。本发明提供的共价多肽抑制剂对PD‑L1具有极高的亲和性和特异性，并且其能够自组装形成纳米纤维，靶向高表达PD‑L1的肿瘤细胞，可作为分子探针用于筛查适于进行免疫治疗的病人和疗效评估，还可作为靶向多肽，用于高表达PD‑L1的肿瘤的靶向治疗和成像，具有较好的应用推广价值。

Description

一种靶向PD-L1的共价多肽抑制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和医药技术领域，具体地说，涉及一种靶向程序性死亡配体-1(PD-L1)的共价多肽抑制剂及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，随着肿瘤学、免疫学以及分子生物学等相关学科的快速发展和相互渗透，肿瘤免疫治疗的研究和发展变得突飞猛进。肿瘤免疫治疗成为一种新的重要抗肿瘤治疗手段。与以往的手术治疗、化药治疗、放射治疗和靶向治疗不同，肿瘤免疫治疗是一种通过激活人体自身免疫系统来对抗肿瘤的治疗手段，也成为了攻克恶性肿瘤的新希望。肿瘤免疫治疗的核心是激活肿瘤患者T淋巴细胞的抗肿瘤反应，以提高其对肿瘤细胞的杀伤功能。T细胞对肿瘤细胞有明确的靶向性和特异性，能通过识别并聚集到肿瘤抗原表达的部位而产生长程免疫应答反应，直接抑制和杀伤肿瘤细胞。树突状细胞(dendritic cell，DC)在T细胞识别过程中发挥至关重要的作用，可作为肿瘤治疗工具，使得通过免疫干预实现肿瘤治疗成为可能。

目前，随着对肿瘤免疫逃逸机制研究的不断深入，免疫检查点抑制剂成为目前最有前景的一种肿瘤治疗方法，针对免疫检查点的抑制剂在多种实体瘤的治疗中表现出了较好的临床效果，成为癌症治疗史上里程碑式的事件，使人们认识到免疫治疗能够真正成为恶性肿瘤治疗中的重要角色。肿瘤免疫治疗有多种治疗策略，包括非特异性免疫刺激剂、肿瘤疫苗、过继性免疫细胞疗法，以及单抗治疗。由于肿瘤具有极大的异质性和遗传不稳定性，其发病机制复杂，单独依靠某一种治疗手段难以达到理想的抗肿瘤效果，因此在深入研究不同治疗手段之间相互作用机制的基础上，联合肿瘤靶向治疗和不同类型免疫治疗的抗肿瘤策略有可能成为未来肿瘤免疫治疗的发展方向。

T细胞介导的细胞免疫在识别和杀伤肿瘤细胞的过程中起着重要的作用，T细胞通过T细胞受体(TCR)与肿瘤细胞表面的带有特异性抗原的主要组织相容性复合体(MHC)结合，从而识别肿瘤细胞。TCR和MHC分子的相互作用受到一系列免疫检查点的控制，可以使T细胞激活或抑制。其中程序性死亡受体1(PD-1)和程序性死亡配体-1(PD-L1)通路是抑制性免疫检查点，它们结合可以使T细胞的免疫活性受到抑制，在免疫耐受中发挥重要作用，这也是肿瘤细胞免疫逃逸的重要原因。

程序性死亡配体-1(Programmed death receptor ligand-1,PD-L1,又称为B7-H1)是典型的负性协同刺激分子，在1992年首次，其基因首次被发现并进行了克隆，其可转录诱导T细胞程序化死亡，是目前免疫学研究领域的热门对象之一。PD-L1属于B7家族的Ⅰ型跨膜蛋白，是程序性死亡因子-1(Programmed death-1,PD-1)的配体。主要表达于抗原提呈细胞、B细胞、T细胞、上皮细胞、肌细胞、内皮细胞及各种肿瘤细胞，并参与肿瘤相关的免疫反应。PD-L1是由290个氨基酸亚基组成的跨膜蛋白，胞外段为两个免疫球蛋白恒定区(IgC)和Ig V样结构域。在肿瘤免疫微环境中，PD-L1作为一个代表性的负性共刺激分子，其通过与T淋巴细胞表面PD-1结合，诱导免疫受体酪氨酸抑制基序的磷酸化，在体内、体外均能促进抗原特异性人类T细胞克隆的凋亡，抑制T细胞的增殖分化和诱导效应T细胞的耗竭。肿瘤细胞可异常上调PD-L1以及PD-1的表达，抑制T细胞的免疫活性，造成肿瘤免疫逃逸，导致肿瘤发生、发展。高表达PD-L1的患者预后差，生存率低。因此，通过阻断PD-1/PD-L1信号通路，重新激活机体免疫系统对肿瘤的杀伤作用，改造肿瘤赖以生存的“土壤”成为了新的恶性肿瘤治疗热点。

综上所述，PD-L1参与肿瘤的发生、发展过程，并协助肿瘤细胞逃避机体免疫系统的杀伤作用，使肿瘤可进一步恶化。PD-1/PD-L1信号通路在肿瘤免疫中起到关键性作用，同时也为肿瘤免疫治疗提供了新的分子靶标。那么，如果能够从根源上阻断PD-1/PD-L1信号通路的激活，就有可能增强免疫治疗效应及维持内源性抗肿瘤效应，使肿瘤得到持久的控制。研究发现，PD-L1表达于人类多种肿瘤细胞表面，例如肺癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、肝癌、卵巢癌、食管癌、乳腺癌等。所以，PD-1/PD-L1抗体已经成为肿瘤免疫治疗中的热点研究方向。

近年来，针对PD-1/PD-L1的抗体药物的研究比较深入，部分药物已经市场化。目前，阻断PD-1/PD-L1通路的免疫检查点抑制剂主要分为两大类：(1)针对PD-1的单克隆抗体，如nivolumab和pembrolizumab；(2)针对PD-L1的单克隆抗体，如BMS-936559、MPDL3280A、atezolizumab、avelumab和durvalumab。在临床试验中，通过单克隆抗体阻断PD-1和PD-L1等已在恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤的免疫治疗临床试验中得到应用，具有良好的前景。目前，PD-1或PD-L1单克隆抗体已经在多种实体瘤如黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、肝癌、胃及食道癌、乳腺癌、小细胞肺癌等疾病中进行了临床研究，取得了显著性临床效果，能够阻止晚期转移性肿瘤的进程，有望实质性改善患者总生存期。研究数据显示，在肿瘤高水平表达PD-L1(肿瘤比例得分≥50％)的晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者中，与标准化疗相比，Keytruda单药治疗在主要终点(无进展生存期，PFS)和次要终点(总生存期，OS)均表现出优越性。

目前对于PD-1/PD-L1信号通路为靶标的免疫治疗的共识是PD-L1高表达，PD1或PDL1免疫药物整体效果比较好。然而多项临床试验结果提示，只有约20％的NSCLC患者能从中获益。而且，其它肿瘤也有大量的患者和恶性肿瘤对治疗没有反应，同时也存在着药物相关不良反应，包括皮肤瘙痒、食欲不振、疲劳等，皮肤炎、结肠炎、肝炎、下垂体炎等。PD-1/PD-L1阻断剂在临床取得了较好的疗效和较高的耐受性，但是目前还缺乏相关生物标志物来预测阻断剂治疗的预后或指导患者的筛选。PD1或PDL1阻断剂的不良反应以及疗效之间的差异需要在临床试验中进一步探讨，用于指导临床用药，降低不良反应对特殊人群的危害，取得更好的临床疗效。因此，探寻合适的疗效检测标志物，进而精准的选择出免疫治疗潜在的获益人群成为研究的热点。然而，目前准确预测肿瘤对PD-1/PD-L1阻断剂的反应依然是个挑战。

尽管抗体药物取得了一定的免疫治疗效果，但是抗体药物存在着制备繁琐、体外稳定性较差、分子较大、标记困难、穿透力弱，翻译后修饰且费用昂贵等问题，使其进一步应用受到限制。因此，为了提高癌症诊断和治疗的特异性和准确性，弥补抗体的缺陷，迫切需要针对肿瘤标志物设计小分子探针，以作为检测和治疗癌症的有效方法。多肽类靶向小分子药物及其诊断探针以成本低、分子量小、生物相容性好、穿透性强、无免疫原性、并有较快的血液清除速率、且制备简单等特点，在肿瘤靶向给药、癌症诊断等方面彰显出很强的优越性，甚至显示了替代抗体类诊疗试剂的趋势。因此，在癌症研究中针对肿瘤标志物合理设计并筛选对癌细胞的高特异亲和的多肽，继而发展成为肿瘤的诊断试剂及治疗药物，是解决上述难题的有效途径。综上所述，开发针对PD-1/PD-L1具有高特异性和亲和力的多肽类小分子靶向药物对PD-L1高表达的多种肿瘤的诊断和治疗将有突破性的重大意义。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种靶向PD-L1的共价多肽抑制剂，该共价多肽抑制剂对于PD-L1具有较高的特异性和亲和力，并且能够自组装形成纳米纤维，可用于PD-L1高表达的肿瘤的诊断和免疫治疗。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：本发明通过对PDB数据库中有关PD-1-抑制剂-PD-L1三者复合物的晶体结构解析检索归纳和分析，发现CDR loop区的一些关键氨基酸在结合过程中发挥主要作用，如PD-1(Val64,Ile126,Leu128,Ala132,Ile134)和PD-L1(Ile54,Tyr56,Met115,Ala121,Tyr123)。在PD-L1/PD-1相互作用表面内选出了三个主要的热点：第一个热点是一个经典的疏水性口袋，该口袋由Tyr56，Glu58，Arg113，Met115和Tyr123的侧链组成，并且其尺寸适合容纳六元芳香环(该口袋称为Ile134口袋)；第二个热点位于Ile126附近，由Met115，Ala121和Tyr123组成，其可以与Ala121的羰基末端供体基团锚定；第三个热点是容纳Tyr68，Gln75和Thr76的一个延伸槽。本发明根据PD-1/PD-L1相互作用的上述热点氨基酸位点和分子识别理论进行肽库的设计和构建。采用氨基修饰的TentaGel树脂作为固相载体，利用Fmoc合成策略进行混合均分合成一珠一物肽库。利用磁珠和磁场相互作用的方法进行高通量一珠一物肽库筛选，阳性肽珠经质谱鉴定，获得了一系列能够特异性结合PD-L1的活性多肽，其通式为NX₅X₄X₃EX₂X₁G。为获得能够靶向肿瘤细胞发挥抑制肿瘤作用的共价多肽抑制剂，本发明通过将NX₅X₄X₃EX₂X₁G与SKDEEWHKNNFPLSPG多肽(Switchable probes:pH-triggered and VEGFR2targeted peptides screeningthrough imprinting microarray.Chem.Commun.,2016,52,5690；该多肽在酸性条件下形成α螺旋结构，中性条件下呈无规则卷曲状，是一条亲水性多肽)偶联，并在偶联多肽的N端修饰能够使共价多肽自组装为纳米分子的疏水化学基团，得到对PD-L1具有高度特异性和亲和力共价多肽抑制剂。

具体地，本发明提供一种靶向PD-L1的共价多肽抑制剂，所述共价多肽抑制剂的通式如下：X-SKDEEWHKNNFPLSPG NX₅X₄X₃EX₂X₁G，其中，SKDEEWHKNNFPLSPGNX₅X₄X₃EX₂X₁G为氨基酸序列，X₁是精氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸或谷氨酸；X₂是谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苏氨酸或甘氨酸；X₃是组氨酸、赖氨酸、酪氨酸、精氨酸、丝氨酸或谷氨酸；X₄是色氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、精氨酸、组氨酸或赖氨酸；X₅是赖氨酸、苏氨酸、酪氨酸、组氨酸、脯氨酸或谷氨酸；X为用于所述共价多肽抑制剂自组装的疏水化学基团。

本发明所述的氨基酸残基可以是L-型、D-型或L-型与D-型的混合。

作为优选，X为选自硅代环戊二烯、硅代环戊二烯的衍生物和四苯基乙烯的衍生物中的任意一种。

进一步优选地，所述共价多肽抑制剂的氨基酸序列为SKDEEWHKNNFPLSPGNTYYEDQG，X为羧基化四苯基乙烯(TPE)。

作为本发明的优选实施方案，所述共价多肽抑制剂为(TPE)-SKDEEWHKNNFPLSPGNTYYEDQG。

本发明提供的共价多肽抑制剂对于PD-L1具有较高的特异性和亲和力，并且可通过自组装的方式，在酸性条件下形成纳米纤维，可用于PD-L1高表达的肿瘤的诊断和免疫治疗。

本发明提供一种核酸，其包含编码所述共价多肽抑制剂的核苷酸序列。

本领域技术人员应该理解，上述核酸仅编码所述共价多肽抑制剂的氨基酸序列，而化学基团X可在所述氨基酸序列的N端经偶联得到所述共价多肽抑制剂。

本发明还提供包含所述核酸的生物材料。

所述生物材料包括表达盒、载体、转座子、宿主细胞或转基因细胞系。

所述载体包括但不限于克隆载体、表达载体、质粒载体，所有包含至少一个拷贝的所述编码本发明提供的共价多肽抑制剂的核酸的载体均在本发明的保护范围内。

所述宿主细胞或转基因细胞系可以为来源于微生物、植物或动物的细胞或细胞系，所有含有至少一个拷贝的所述编码本发明提供的共价多肽抑制剂的核酸或包含携带至少一个拷贝的所述核酸的载体的宿主细胞或转基因细胞系均在本发明的保护范围内。

本发明所述共价多肽抑制剂可采用本领域常规制备方法制备得到。

作为本发明的一种实施方式，采用Fmoc固相多肽合成法制备所述共价多肽抑制剂。其中，基团X的原料为羧基化四苯基乙烯。

本发明还提供所述共价多肽抑制剂的偶联物或衍生物，所述偶联物或衍生物为由所述的共价多肽抑制剂与载体以共价或非共价的方式连接得到。

优选地，所述载体包括荧光素、放射性元素、抗体、多聚物、高分子材料、纳米材料、脂质体、油性化合物、无机材料。

进一步优选地，所述高分子材料包括聚酯、聚酸酐、聚酰胺磷脂聚合物胶束、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙二醇、壳聚糖中的任意一种或多种。

进一步优选地，所述无机材料包括纳米金、碳材料、钙材料、磁性材料、介孔硅材料、量子点中的任意一种或多种。

本发明进一步提供所述共价多肽抑制剂或编码所述共价多肽抑制剂的核酸或含有所述核酸的生物材料或所述共价多肽抑制剂的欧联物或衍生物的如下任意一种应用：

(1)在制备用于PD-L1/PD1介导疾病的预防或治疗的药物、诊断试剂、诊断试剂盒或显影制剂中的应用；

(2)在诊断、预防或治疗PD-L1/PD1介导疾病中的应用。

本发明中，所述PD-L1/PD1介导疾病包括肿瘤、类风湿性关节炎、HCV感染、过敏性紫癜、再生障碍性贫血、动脉粥样硬化、冠心病中的任意一种。

优选地，所述肿瘤为PD-L1高表达的肿瘤，包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、前列腺癌、神经胶质瘤、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、肝癌、胃癌、食道癌和乳腺癌中的任意一种。

本发明还提供一种药物，其包含所述共价多肽抑制剂或所述共价多肽抑制剂的偶联物或衍生物。

上述药物以所述共价多肽抑制剂或其偶联物或衍生物为活性成分，或者以所述共价多肽抑制剂或其偶联物或衍生物以及其它能够作用于PD-L1/PD1介导疾病的活性成分混合组成的制剂作为活性成分。

本发明还提供包含所述共价多肽抑制剂或所述共价多肽抑制剂的偶联物或衍生物的PD-L1/PD1介导疾病的诊断试剂或试剂盒。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的共价多肽抑制剂对于PD-L1具有高度特异性和亲和力，具有靶向PD-L1阳性肿瘤细胞的特性。因此，在实际应用中，可作为分子探针用于筛查适于进行免疫治疗的病人和疗效评估；还可作为靶向多肽，与能杀伤癌细胞的制剂相缀合或混合，用于多种肿瘤的靶向治疗和成像；同时，可以本发明的多肽为基础通过优化制备多肽抑制剂药物，阻断PD-1/PD-L1信号通路，激活免疫治疗。

(2)本发明的共价多肽抑制剂的选择性强，纯度高，分子量小，特异性强，无免疫原性，安全可靠，可以采用化学合成的方法制备，简单易行，适于作为基于PD-L1免疫治疗的预测和伴随诊断试剂。通过PD-L1生物标志物的检测有利于医生制定个性化治疗方案以取得最优的治疗效果，具有较好的研究前景和临床指导意义。

(3)本发明针对PD-L1的共价多肽抑制剂属于目前最为普适、应用前景很好的一类肿瘤靶向多肽，对于现有的基于PD-1/PD-L1阻断剂的免疫治疗中，如何在减少不良反应的同时应用到更多的恶性肿瘤治疗上，并且与其他免疫治疗、化疗、放疗、小分子靶向药物联合治疗提供了重要的理论和借鉴意义，具有广阔的应用前景。另外，鉴于PD-1/PD-L1通路在其他多系统疾病中也有着重要的调节作用，也为类风湿性关节炎、HCV病毒感染、过敏性紫癜、再生障碍性贫血、动脉粥样硬化、冠心病等疾病的免疫治疗以及适宜人群的筛选和预后检测评估提供新的思路。

(4)本发明提供的共价多肽抑制剂具有较高的安全性，克服了现有技术中化学药物存在毒副作用的难题，为共价抑制剂药物的开发提供新的思路。

附图说明

图1为本发明实施例1中共价多肽抑制剂PD-P1的化学结构式。

图2为本发明实施例1中共价多肽抑制剂PD-P1序列的液相色谱纯化和质谱鉴定结果；其中，a为液相色谱纯化结果图；b为质谱鉴定结果图。

图3为本发明实施例2中共价多肽抑制剂PD-P1的自组装形貌以及与细胞相互作用的结果；其中，a为PD-P1的自组装形貌结果图；b为PD-P与细胞相互作用的结果图。

图4为本发明实施例3中细胞水平分析PD-P1与PD1蛋白竞争作用的结果图。

图5为本发明实施例4中PD-P1参与活体PD-L1高表达肿瘤的治疗的结果图，其中，a为治疗结束后小鼠的肿瘤大小变化比较，每组分别进行5次平行实验；b为各给药组的小鼠体重变化；c为治疗过程中小鼠的肿瘤大小变化数据统计。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1共价多肽抑制剂PD-P1的合成及表征

(1)实验仪器与材料

N-甲基吗啉(NMM)，哌啶，三氟乙酸(TFA)，二氯甲烷(DCM)，茚三酮，维生素C，苯酚，四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，六氢吡啶，三异丙基硅烷(TIS)，乙二硫醇(EDT)，N,N二甲基甲酰胺(DMF)，无水乙醚，树脂，甲醇，各种Fmoc保护氨基酸，羧基化四苯基乙烯(TPE)，多肽合成管，摇床，真空水泵，旋转蒸发仪，激光共聚焦显微镜(ZEISS LSM 710)，上述试剂和材料均从商业途径获得。

(2)溶剂配制

脱保护溶剂的配制为六氢吡啶：N，N二甲基甲酰胺＝1：4

反应液的配制为N-甲基吗啉：N，N二甲基甲酰胺＝1：24

裂解液的配制为三氟乙酸(92.5％)、三异丙基硅烷(2.5％)、乙二硫醇(2.5％)、超纯水(2.5％)。

茚三酮测试液的配制为茚三酮：维生素C：苯酚＝1：1：1

(3)共价多肽抑制剂PD-P1的合成

采用Fmoc固相肽合成方法合成PD-P1多肽，具体方法为：通过混合裂分的方式将氨基酸随机地逐个偶联到固相树脂上，然后在强酸下将侧链保护基团去除，继而进行纯化和鉴定。

称取400mg的wang树脂，按照上述固相多肽合成程序循环，依次加入300mg的Gly,Gln,Asp,Glu,Tyr,Tyr,Thr,Asn,Gly,Pro,Ser,Leu,Pro,Phe,Asn,Asn,Lys,His,Trp,Glu,Glu,Asp,Lys,Ser依次进行反应。其中，每次反应时加入等量的HBTU进行偶联，每次偶联完毕后树脂脱保护，加入新的氨基酸，重复以上反应。最后，偶联羧基化四苯基乙烯(TPE)分子，过夜反应。检验之后，经过甲醇置换和收缩步骤，真空抽干，得到干燥树脂备用。用含有95％的TFA裂解液将多肽将树脂上切除，用冰乙醚沉淀，得到的初步多肽用HPLC分离纯化。

(4)共价多肽抑制剂PD-P1的表征

采用质谱鉴定经过HPLC分离纯化的PD-P1多肽。结果表明，多肽抑制剂的序列为X-SKDEEWHKNNFPLSPGNTYYEDQG，其中X为羧基化四苯基乙烯。上述多肽抑制剂的化学结构式如图1所示。多肽序列为(TPE)-SKDEEWHKNNFPLSPGNTYYEDQG的PD-P1的纯化和质谱鉴定结果如图2所示。

实施例2多肽抑制剂PD-P1的自组装形貌以及与细胞的相互作用分析

(1)利用透射电子显微镜成像分析多肽抑制剂组装形貌

将纯化后的PD-P1多肽置于pH 6.5的超纯水中，37℃恒温震荡反应过夜，取少量置于铜网上，醋酸釉复染后，透射电子显微镜成像。结果如图3的a所示，结果显示多肽抑制剂PD-P1在酸性条件下形成了纳米纤维结构。

(2)利用扫描电子显微镜成像分析多肽抑制剂与肿瘤细胞MC38的相互作用，具体方法如下：

①玻片泡酸(1％HCl，H₂SO₄)过夜。

②清洗：自来水清洗至无色，三蒸水多次置换自来水(5-10次)，无水乙醇清洗(3次)。

③玻片放入装有50毫升无水乙醇的离心管内备用，使用前用滤纸吸干，放在超净台照紫外。

④使用时，玻片放入24孔板，接种细胞。

⑤加入多肽，4℃孵育一段时间，吸出培养液，PBS清洗两次。

⑥2.5％戊二醛固定细胞过夜。

⑦临界点干燥(二氧化碳置换出无水乙醇)。

⑧喷金30s。

⑨扫描电镜成像。

结果如图3的b所示，结果显示多肽抑制剂PD-P1在肿瘤细胞MC38表面有缠绕富集，在对照细胞肾上皮细胞293T上则无结合，说明多肽抑制剂PD-P1对于PD-L1具有较好的特异性。

实施例3细胞水平分析PD-P1与PD1蛋白的竞争作用

利用结肠癌细胞系MC38在细胞水平验证PD-P1与PD1蛋白的竞争作用，具体方法如下：

结肠癌细胞系MC38用含10％胎牛血清的MEM/EBSS培养基培养。以1×10⁵/mL的细胞浓度植入圆形玻底培养皿(35mm)，37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24h后，弃去培养液，1×PBS清洗2次，其中一个皿中加入多肽抑制剂PD-P1和PD1蛋白，另一个皿中单独加入PD1蛋白，孵育45min之后，用预冷1×PBS洗涤3次,BSA封闭30min,再加入链霉亲和素标记的FITC染料，继续孵育30min,最后，细胞中加入含2μmol/L DRAQ5,避光光孵育15min后，用预冷1×PBS洗涤3次，用激光共聚焦显微镜(ZEISS LSM 710)检测细胞中的荧光分布。

结果如图4所示，多肽抑制剂PD-P1与PD1蛋白存在竞争作用。PD1蛋白单独存在时，细胞表面具有绿色荧光信号；在多肽抑制剂PD-P1与PD1蛋白同时存在的情况下，细胞表面几乎没有绿色荧光信号。

实施例4 PD-P1参与活体PD-L1高表达肿瘤的治疗

本实施例利用小动物活体验证共价多肽抑制剂PD-P1对于肿瘤的治疗作用。小动物活体治疗实验采用6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠。所有的动物实验均按照北京大学动物研究委员会批准的方案进行。具体方法如下：

鼠源结直肠癌细胞系MC38经扩增培养后，胰酶消化，接种至小鼠右腿根部皮下。定期测量小鼠的肿瘤生长情况。当肿瘤体积达到150-200mm³时，进行肿瘤抑制性实验检测PD-P1，的肿瘤抑制效率，以PD-P1_Pt(Pt是化疗药物顺铂，PD-P1_Pt是负载化疗药物的多肽自组装体，赋予了药物主动靶向识别肿瘤的功能)、抗体Atezolizumab和PBS作为对照组。给药剂量按照PD-P1多肽4mg/kg，PD-P1Pt 2mg/kg，Atezolizumab抗体0.5mg/kg进行。每隔一天进行测量，记录小鼠体重和肿瘤尺寸，测三次取平均值。通过公式(L×W²)/2计算肿瘤体积，其中L为肿瘤的长，W为肿瘤的宽，单位：毫米。

结果如图5所示，图5的a显示治疗结束后小鼠肿瘤的变化(图5的a显示了为保证实验结果的可信性和严谨性，进行多次平行实验的结果)；图5的b显示Atezolizumab和PD-P1给药组的小鼠体重随着给药时间增长而增长，PD-P1组体重增长说明PD-P1的生物相容性好，对小鼠的毒副作用小，PD-P1_Pt组体重几乎无增涨，；图5的c显示Atezolizumab组的治疗效果最好，其次依次是PD-P1组、PD-P1_Pt和PBS组。综合上述实验结果表明，PD-P1共价多肽抑制剂具有抑制肿瘤的增长的作用，其效果优于化疗药物PD-P1_Pt，且生物相容性更好，对小鼠的毒副作用小。

综上所述，本发明的共价多肽抑制剂PD-P1具有靶向表达PD-L1的阳性肿瘤细胞的特性，因而在实际应用中，可作为靶向多肽，与能杀伤癌细胞的制剂相缀合或混合，用于肿瘤的靶向治疗、成像和诊断。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 国家纳米科学中心

<120> 一种靶向 PD-L1 的共价多肽抑制剂及其制备方法和应用

<130> KHP191112381.7

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Lys Asp Glu Glu Trp His Lys Asn Asn Phe Pro Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Asn Thr Tyr Tyr Glu Asp Gln Gly

20

Claims (10)

1.一种靶向PD-L1的共价多肽抑制剂，其特征在于，所述共价多肽抑制剂的通式如下：X-SKDEEWHKNNFPLSPGNX₅X₄X₃EX₂X₁G，其中，SKDEEWHKNNFPLSPGNX₅X₄X₃EX₂X₁G为氨基酸序列，X₁是精氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸或谷氨酸；X₂是谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苏氨酸或甘氨酸；X₃是组氨酸、赖氨酸、酪氨酸、精氨酸、丝氨酸或谷氨酸；X₄是色氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、精氨酸、组氨酸或赖氨酸；X₅是赖氨酸、苏氨酸、酪氨酸、组氨酸、脯氨酸或谷氨酸；X为用于所述共价多肽抑制剂自组装的疏水化学基团。

2.根据权利要求1所述的共价多肽抑制剂，其特征在于，X为选自硅代环戊二烯、硅代环戊二烯的衍生物和四苯基乙烯的衍生物中的任意一种；

优选地，所述共价多肽抑制剂的氨基酸序列为SKDEEWHKNNFPLSPGNTYYEDQG，X为羧基化四苯基乙烯。

3.一种核酸，其特征在于，其包含编码权利要求1或2所述共价多肽抑制剂的核苷酸序列。

4.包含权利要求3所述核酸的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括表达盒、载体、转座子、宿主细胞或转基因细胞系。

5.权利要求1或2所述共价多肽抑制剂的偶联物或衍生物，其特征在于，所述偶联物或衍生物为由权利要求1或2所述的共价多肽抑制剂与载体以共价或非共价的方式连接得到；

优选地，所述载体包括荧光素、放射性元素、抗体、多聚物、高分子材料、纳米材料、脂质体、油性化合物、无机材料中的一种或多种。

6.权利要求1或2所述共价多肽抑制剂或权利要求3所述核酸或权利要求4所述生物材料或权利要求5所述偶联物或衍生物在制备用于PD-L1/PD1介导疾病的预防或治疗的药物、诊断试剂、诊断试剂盒或显影制剂中的应用。

7.权利要求1或2所述共价多肽抑制剂或权利要求3所述核酸或权利要求4所述生物材料或权利要求5所述偶联物或衍生物在诊断、预防或治疗PD-L1/PD1介导疾病中的应用。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述PD-L1/PD1介导疾病包括肿瘤、类风湿性关节炎、HCV感染、过敏性紫癜、再生障碍性贫血、动脉粥样硬化、冠心病中的任意一种；

优选地，所述肿瘤为PD-L1高表达的肿瘤，包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、前列腺癌、神经胶质瘤、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、肝癌、胃癌、食道癌和乳腺癌中的任意一种。

9.一种药物，其特征在于，包含权利要求1或2所述共价多肽抑制剂或权利要求5所述共价多肽抑制剂的偶联物或衍生物。

10.包含权利要求1或2所述共价多肽抑制剂或权利要求5所述共价多肽抑制剂的偶联物或衍生物的PD-L1/PD1介导疾病的诊断试剂或试剂盒。

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