CN107556367B - 一种肿瘤免疫治疗预测生物标志物pd-l2靶向多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肿瘤免疫治疗预测生物标志物PD‑L2靶向多肽及其应用，所述多肽通式为：HX₁RX₂X₃X₄X₅RIRN。本发明还涉及编码该多肽的DNA片段，表达该多肽的表达载体及宿主细胞，由该多肽形成的二价体、多价体或药物组合物。本发明的多肽可用于检测肿瘤细胞和免疫细胞中PD‑L2的表达情况，作为预测抗PD‑L1/PD‑L2‑PD‑1疗法临床疗效的检测指标，同时可特异区分高同源性的PD‑L1和PD‑L2蛋白，对优化个体患者的治疗方案和疗效监测有着重要的临床价值和意义。

Description

一种肿瘤免疫治疗预测生物标志物PD-L2靶向多肽及其应用

技术领域

本发明涉及医学生物检测技术和药物化学领域，具体涉及PD-L2特异性靶向多肽筛选及其应用，尤其涉及一种肿瘤免疫治疗相关靶向多肽的制备方法及其应用。

背景技术

目前，随着对肿瘤免疫逃逸机制研究的不断深入，针对免疫检查点的抑制剂在多种实体瘤的治疗中表现出了较好的临床效果，成为癌症治疗史上里程碑式的事件，使人们认识到免疫治疗能够真正成为恶性肿瘤治疗的重要角色。其中PD-L1/PD-L2-PD-1途径作为重要的细胞周期检查点，发挥着特异性的抗原依赖性负性调控作用，它们结合可以使T细胞的免疫活性受到抑制，在免疫耐受中发挥重要作用，这也是肿瘤细胞免疫逃逸的重要原因。PD-1/PD-L2途径可在淋巴样组织和实质器官组织部位双重抑制淋巴细胞的活化,在维持机体的外周耐受、防止过度的免疫损伤及自身免疫性疾病的发生方面发挥重要的作用。PD-L1/PD-L2-PD-1途径是目前最热门的抗肿瘤免疫治疗的靶分子之一，具有巨大的应用价值。

PD-1分子有两种配体—PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)，PD-L2作为B7家族的第5个成员，是Tseng等在2001年研究PD-L1功能时被发现的。人的PD-L2定位于人染色体9p24.2，其cDNA的全长约为1.7kb与PD-L1转录方向相同，两者仅间隔4.2kb。PD-L2基因编码247个氨基酸，相对分子量约25kD，包含有IgV样区、IgC样区、跨膜区及一个短的胞浆区尾部。人和鼠的PD-L2mRNA在胎盘、肝癌细胞、乳癌细胞和神经母细胞中呈高表达，但在脾脏、淋巴结、胸腺和成纤维组织中呈低表达，这些使得其和PD-L1与其他B7家族成员在表达谱上有很大的差异。另外，两者在mRNA水平上的差异甚大，如人胎肝高表达PD-L1，而人的胰腺和肝高表达PD-L2。PD-L1在IFN-γ作用下表达上调,而PD-L2却在IL-4和IL-13的作用下表达上调。PD-L2主要表达于单核细胞上，并在DC上呈选择性表达。PD-L1和PD-L2在基因水平上有37.4％的同源性，在氨基酸水平上，PD-L1与PD-L2之间有34％的一致性和48％的相似性。但PD-L1/PD-L2与B7-1/B7-2仅有20％的同源性，这些可能导致它们在功能上的差异性。PD-L2是除IL-12外又一种介导Th1细胞反应的重要因子。PD-L1表达在免疫细胞细胞和肿瘤细胞上，而PD-L2主要由抗原呈递细胞表达，包括巨噬细胞，树突状细胞，肥大细胞和一些B细胞，以响应白介素(IL)4和干扰素。总体来看，PD-L2相比于PD-L1的表达范围更窄一些。目前上市的5个anti-PD-1/PD-L1单抗药物(Opdivo、Keytruda、Tecentriq、Bavencio、Imfinzi)，可以跟T细胞上的PD-1蛋白结合，所以可以同时阻断PD-1和PD-L1以及PD-L2的结合；而PD-L1抗体只能和PD-L1结合，所以只能阻断PD-1跟PD-L1的结合，不能阻断PD-1跟PD-L2的结合，所以使用PD-L1抗体意味着T细胞还可能被PD-1/PD-L2通路抑制。不管是PD-L1，还是PD-L2，一旦与PD-1结合，就会使T细胞的功能受到抑制，从而让肿瘤细胞逃脱了免疫系统的追杀。

耿卫朴等用免疫组织化学染色检测60例宫颈鳞状细胞癌患者癌组织中PD-L2蛋白的表达。结果宫颈鳞状细胞癌中的PD-L2阳性率53.3％。PD-L2的表达与宫颈鳞状细胞癌的淋巴结转移相关。PD-L2通过促进T细胞凋亡而削弱宫颈微环境的抗肿瘤免疫，并促进肿瘤的淋巴结转移。PD-L2/PD-1途径有可能成为宫颈鳞状细胞癌免疫治疗的靶点之一。王征帆等采用组织芯片和免疫组化方法，检测40例肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)结果PD-L1在HCC中的表达率为50％，PD-L2的表达率为70％，HCC中PD-L2表达高于PD-L1。PD-L1和PD-L2的过度表达与肝癌患者的生存率和肿瘤复发相关。PD-L1/PD-L2可作为HCC的治疗靶点和预测生物标志物，因此，评估HCC患者PD-L1和PD-L2的表达是很有必要的。此外，HCC免疫治疗迫切需要进一步研究靶向HCC的PD-1和PD-L1/PD-L2。PD-L1的表达水平与PD-1/PD-L1类药物的临床疗效密切相关，最经典的案例当属Opdivo与Keytruda在竞争NSCLC一线疗法时，对患者PD-L1表达水平的限定成为关键。

虽然PD-1和其配体PD-L1之间的相互作用已被广泛研究，并且PD-L1被用作对PD-1免疫治疗的响应性的预测性生物标志物，但是对于PD-1与其另一个配体PD-L2的相互作用知之较少。默沙东研究人员在《Clinical Cancer Research》杂志上发表的一篇论文《PD-L2Expression in Human Tumors:Relevance to Anti-PD-1Therapy in Cancer》。他们发现PD-L2的表达水平与PD-1单抗Keytruda(pembrolizumab)治疗头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的临床疗效密切相关。PD-L2可以预测患者对包括Keytruda在内的PD-1检查点抑制剂的响应，表明PD-L2表达可以作为PD-L1状态之外的信息来预测临床反应。阿斯利康和GSK合作开发的AMP-224是含有PD-L2胞外结构域和IgG的Fc部分的融合蛋白，已经完成了临床I期试验。此外，研究人员对172例接受Keytruda治疗的复发或转移性HNSCC患者的组织样本进行了回顾性分析，发现PD-L1和PD-L2表达均为阳性的患者的ORR为27.5％，PD-L1表达阳性而PD-L2表达阴性的患者ORR仅为11.4％，前者是后者的2倍，提示同时抑制PD-L1和PD-L2可能会提高临床应答率。此外，PD-L2表达阳性患者的mPFS和mOS都要长于PD-L2表达阴性的患者，这种预测作用独立于PD-L1的表达情况。这个研究结果表明，PD-L2的表达水平可以作为补充信息和PD-L1的表达水平一起作为预测抗PD1疗法临床疗效的检测指标。因此，急需开发一种高特异性、高灵敏度的探针检测PD-L2在不同肿瘤中表达水平，并评估PD-L2表达水平与Keytruda等药物的临床疗效。

到目前为止，在肿瘤临床治疗过程中或治疗后，无创的、可重复性、高准确性地检测肿瘤PD-1和PD-L1/PD-L2的表达水平及活性尚难以实现，因而迫切需要特异性的影像检测技术来指导肿瘤治疗。分子影像在免疫治疗和个性化医学中发挥越来越重要的作用。其中分子探针的制备是分子影像的关键，只有高灵敏度和特异性的分子探针引入体内后可与细胞内特定的靶分子发生特异性结合并产生某种信号，才能实现高度特异性的诊断。多肽类靶向小分子药物及诊断探针以成本低、分子量小、生物相容性好、穿透性强、无免疫原性、并有较快的血液清除速率、且制备简单等特点，在肿瘤靶向给药、癌症诊断等方面彰显出很强的优越性。因此，在癌症研究中针对肿瘤标志物合理设计并筛选对癌细胞的高特异亲和多肽，继而发展成为肿瘤的诊断试剂及治疗药物，是解决上述难题的有效途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种PD-L2靶向多肽及其制备方法与应用，特别是一种能区分高同源性的肿瘤免疫治疗标志物PD-L1和PD-L2蛋白的多肽，和由该多肽所衍生的且能PD-L2蛋白结合的产品及上述多肽或其衍生的产品在制备抗癌药物或显像制剂中的用途。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种肿瘤免疫治疗预测生物标志物PD-L2靶向多肽，该多肽能与PD-L2蛋白结合，所述多肽的通式为：

HX₁RX₂X₃X₄X₅RIRN

其中，H为组氨酸，R为精氨酸，I为异亮氨酸，N为天冬酰胺，X₁是芳香族氨基酸；X₂是非极性氨基酸；X₃是中性氨基酸；X₄是碱性或酸性氨基酸；X₅是中性氨基酸，优选为丙氨酸或甘氨酸。

本发明所述的氨基酸残基可以是L-型，也可以是D-型，或者是L-、D-型的混合。

本发明中，根据已有的文献报道PD-1/PD-L2相互作用热点氨基酸位点和分子识别理论进行肽库的设计和构建。采用氨基修饰的TentaGel树脂作为固相载体，利用Fmoc合成策略进行混合均分合成库容量为10⁶的一珠一物肽库。利用荧光标记磁球和微流控芯片的方法进行高通量一珠一物肽库筛选，阳性肽珠经MALDI-TOF-MS鉴定，获得了一系列能特异性结合PD-L2的活性多肽。

作为优选技术方案，本发明所述多肽的氨基酸序列如下表PLP-1、PLP-7之一所示，其分别对应序列表中的序列1、2所示的氨基酸序列。

多肽的氨基酸序列：

SEQ ID PLP-1	HYRYNEGRIRN
		SEQ ID PLP-7	HVRRTKARIRN

本发明中，所述PLP-1和PLP-7所示的氨基酸序列对PD-L2高特异性亲和。

第二方面，本发明还提供了一种DNA片段，其包含编码上述本发明第一方面所述多肽的核苷酸序列。

作为优选技术方案，所述DNA片段包含编码本发明所述PLP-1和PLP-7之一的氨基酸序列。

第三方面，本发明还提供了一种表达载体，包括至少一个拷贝的编码氨基酸序列为本发明第一方面上述多肽的如本发明第二方面所述的DNA片段。

作为优选技术方案，本发明的表达载体，包括至少一个拷贝的编码氨基酸序列为PLP-1和PLP-7之一所示多肽的如本发明第二方面所述的DNA片段。

第四方面，本发明还提供了一种原核或真核宿主细胞，该宿主细胞含有如本发明第三方面所述的表达载体。

第五方面，本发明还提供了一种二价体或多价体，由本发明第一方面所述的多肽(如PLP-1、PLP-7之一)组装而成。

本发明中的二价体或多价体具有靶向PD-L2阳性的肿瘤细胞的特性。

作为优选技术方案，本发明的二价体或多价体是通过连接分子共价连接形成；或是通过与多聚体混合、非共价连接形成的。

优选地，所述的连接分子为6-叔丁氧羰肼基烟酸(HYNIC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；该连接分子是一种新型无毒、生物相容性良好的交联剂。

本发明可以根据具体需要来选择多聚体，例如可以是聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、环糊精、聚酰胺-胺型树枝状高分子(PAMAM)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇胺(PLGA)中的任意一种或至少两种的混合。

第六方面，本发明还进一步提供了一种药物组合物，包括本发明第一方面所述的多肽(如PLP-1、PLP-7之一)或本发明第五方面所述的二价体或多价体作为靶向多肽；以及能杀伤癌细胞的制剂。

作为优选技术方案，本发明所述的多肽、二价体或多价体作为靶向多肽，与能杀伤癌细胞的制剂相缀合或混合。

优选地，所述的制剂为能杀伤癌细胞的化学药物、生物药物、纳米药物、放射性药物、光热治疗或光动力治疗药物或包裹这些药物的载体中的任意一种。

进一步优选地，所述的制剂为烷化剂、抗代谢药物、抗肿瘤天然药物、抗肿瘤抗生素、激素及金属络合物或肿瘤放射靶向标记物中的任意一种。

进一步地，所述药物组合物还包括与所述的多肽(如PLP-1、PLP-7之)或所述二价体或多价体相缀合或混合可制备靶向药物的载体。

进一步优选地，所述载体为纳米材料，脂质体或油性化合物中的任意一种，或者由多种油性化合物所组成的混合物。

本发明采用将第一方面所述的多肽(如PLP-1、PLP-7之一)或第五方面所述的二价体或多价体与所述载体(纳米材料、脂质体等高分子材料)缀合，本发明所述的多肽、二价体或多价体可以使缀合后生成的化合物在机体内更稳定地被运输到靶细胞。

本发明涉及的多肽、二价体或多价体也可以与所述载体(油性化合物或多种油性化合物的混合物)相混合，本发明涉及的多肽也可以使所得到的混合物在机体内更稳定地被运输到靶细胞。

第七方面，本发明还进一步提供了另外一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明第一方面所述的多肽(PLP-1、PLP-7之一)或所述的二价体或多价体，以及显像制剂。

优选地，所述多肽、二价体或多价体与显像制剂相缀合或混合。

优选地，所述的显像制剂为放射性核素、放射性核素标记物或分子影像制剂中的任意一种。

第八方面，本发明还提供了如本发明第一方面所述的多肽(PLP-1、PLP-7之一)或所述的二价体或多价体在制备用于治疗、预防或诊断癌症的药物或显像制剂等中的用途。

作为优选技术方案，本发明所述癌症为PD-L2过表达的癌症。

优选地，所述癌症为肝癌、头颈部鳞状细胞癌、黑色素瘤、宫颈鳞状细胞癌、胃癌、非小细胞肺癌、胰腺癌和三阴性乳腺癌等中的任意一中。

本发明的肽具有靶向PD-L2蛋白的作用，可以作为靶头增加药物或载有药物的载体如纳米材料、脂质体等在PD-L2阳性细胞中的含量，再添加药学上可接受的辅料或佐剂制成新型的更有效的靶向抗癌药物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的多肽具有靶向PD-L2阳性肿瘤细胞的特性，因而在实际应用中，可以将本发明的多肽作为分子探针用于筛查适于进行免疫治疗的病人和疗效评估。还可以作为靶向多肽，与能杀伤癌细胞的制剂相缀合或混合，用于多种肿瘤的靶向治疗和成像。PD-1/PD-L2阻断剂在临床取得了较好的疗效和较高的耐受性，但是目前还缺乏相关生物标志物来预测该类抗体治疗的预后或指导患者的筛选，尤其是PD-L2的靶向多肽还没有研究报道。本发明的多肽探针选择性强，纯度高，分子量小，特异性强，无免疫原性，安全可靠，可以采用化学合成的方法制备，简单易行。适于作为基于PD-1免疫治疗的预测和伴随诊断试剂。以便及时调整治疗方案，尽早进行临床干预，防止病情进展，改善患者预后提供了新的手段。

附图说明

图1PD-L2阳性多肽与PD-L2蛋白结合筛选图；

图2为阳性多肽的微阵列捕获图；

图3为阳性多肽二级质谱图；

图4表面等离子共振(SPRi)方法检测阳性多肽与人PD-L2蛋白的亲合力大小；

图5为表面等离子共振(SPRi)方法检测阳性多肽与人血清白蛋白(HSA)的亲合力大小。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实验例1本发明PD-L2靶向多肽筛选系统的构建和筛选

1)实验仪器与材料

N-甲基吗啉(NMM)，哌啶，三氟乙酸(TFA)，二氯甲烷(DCM)，茚三酮，维生素C，苯酚，四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，六氢吡啶，三异丙基硅烷(TIS)，乙二硫醇(EDT)，N,N二甲基甲酰胺(DMF)，无水乙醚，树脂，甲醇，各种Fmoc保护氨基酸，MB-Streptavidin(链霉亲和素磁珠)，Streptavidin-HRP(链霉亲和素标记辣根过物氧化酶)，多肽合成管，摇床，真空水泵，旋转蒸发仪，上述试剂和材料均从商业途径获得。

2)PD-L2“一珠一物”多肽文库的合成

采用Fmoc固相肽合成方法合成多肽文库，具体方法为将被保护的氨基酸逐个偶联到固相树脂上，然后在强酸下将肽链从树脂上裂解同时去除侧链保护基团。称取150mg的Tentagel-NH₂树脂，按照上述固相多肽合成程序循环，依次加入200mg的Met、Gly依次进行反应；待反应完成后，把树脂均分3份，向每管分别加入60mg的Asp、Asn、Arg与等量的HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把3管树脂脱保护后混合，再把树脂均分为3份，向每管分别加入80mg的Glu、Arg、Lys与等量的HBTU进行偶联；待偶联完毕后，把3管树脂脱保护后混合。再把树脂均分为5份，向每管分别加入40mg的Ile、Ser、Thr、His、Gln与等量的HBTU进行偶联；待偶联完毕后，把5管树脂脱保护后混合。再把树脂均分，向每管分别加入50mg的Asp、Asn、Arg、Ile、Gly、Tyr、Ala、Glu、Phe、Val与等量的HBTU进行偶联；待偶联完毕后，把树脂脱保护后混合。经过甲醇置换和收缩步骤，真空抽干，得到加载有肽库的干燥树脂备用。

3)PD-L2阳性多肽的筛选

取干燥肽库用1×PBS洗3次，加入5％的脱脂牛奶在混旋仪上37℃对肽珠表面封闭2h，再用1×PBS洗3次；取生物素(biotin)标记的PD-L2蛋白与多肽库混合，37℃孵育2h后用1×PBS洗3次；然后分别取100μL MB-Streptavidin和Streptavidin-HRP同时加入肽库在混旋仪上37℃避光混合孵育2h。通过磁场分离富集阳性多肽到微阵列芯片上。

由图1看出阳性肽珠与生物素标记的受体蛋白孵育后，阳性肽珠特异性识别蛋白，标记HRP和磁性链霉亲和素通过识别生物素而识别阳性肽珠。阳性肽珠表面将包覆一层磁珠具有磁性从而被磁场捕获同时由于辣根酶的催化变蓝色。将阳性肽珠转移到微芯片阵列中(图2)，滴加溴化氢原位裂解，用MALDI-TOF-MS鉴定通过Mascot数据库解出相应序列信息，如图3。按序列重新合成阳性多肽部分标记荧光，MALDI-TOF鉴定和HPLC纯化用于后续试验。经化学合成制得本发明的2条多肽分别为：PLP-1和PLP-7。

实验例2通过表面等离子共振(SPRi)方法检测PLP-1和PLP-7多肽与PD-L2和HSA蛋白的亲和作用

将1mg/mL的PLP-1和PLP-7多肽及1×PBS点到芯片上，在4℃湿润条件下孵育过夜，然后用10×PBS清洗10min，再用1×PBS清洗10min，最后用去离子水清洗2次，每次10min，浸入含5％牛奶的1×PBS中，4℃条件下孵育过夜，然后用10×PBS清洗10min，1×PBS清洗10min，最后用去离子水清洗2次，每次10min，用氮气吹干，装芯片上机(Plexera

HT表面等离子共振成像系统)。

流动相依次通过1×PBS、2×PBS、0.78μg/mL、1.56μg/mL、3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL和25μg/mL的人PD-L2和同样浓度的人血清白蛋白HSA，记录分析SPRi信号。

由图4(a)-(b)可以看出，PLP-1和PLP-7的SPRi信号随着蛋白浓度的增加逐渐增强，说明本发明的PLP-1和PLP-7多肽对PD-L2都有强结合的，亲和常数(K_D)分别为8.94×10^-8M和5.71×10^-8M，接近抗体的亲和力。由于HAS是血液中含量最多的蛋白，而图5显示该多肽与HAS没有结合，由此进一步说明该多肽良好特异性。因此，PLP-1和PLP-7可作为靶向分子靶向表达PD-L2的多种肿瘤细胞，用于相关的检测研究。

综上所述，从实验例1-2可以得出，本发明的多肽具有靶向表达PD-L2阳性肿瘤细胞的特性，因而在实际应用中，可以将本发明的多肽作为靶向多肽，与能杀伤癌细胞的制剂相缀合或混合，用于肿瘤的靶向治疗和成像，免疫治疗反应标志物的检测。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 国家纳米科学中心

<120> 一种肿瘤免疫治疗预测生物标志物PD-L2靶向多肽及其应用

<130> KHP171114293.9

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

His Tyr Arg Tyr Asn Glu Gly Arg Ile Arg Asn

1 5 10

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

His Val Arg Arg Thr Lys Ala Arg Ile Arg Asn

1 5 10

Claims (9)

1.一种肿瘤免疫治疗预测生物标志物PD-L2靶向多肽，其氨基酸序列为HYRYNEGRIRN或HVRRTKARIRN。

2.一种DNA片段，其编码权利要求1所述多肽的核苷酸序列。

3.一种表达载体，其含有至少一个拷贝的如权利要求2所述的DNA片段。

4.一种宿主细胞，其含有权利要求3所述的表达载体。

5.一种药物组合物，包括权利要求1所述的多肽；还包括与所述的多肽相缀合或混合可制备靶向药物的载体。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中，所述载体为纳米材料，脂质体或油性化合物中的任意一种；或者所述载体为由多种油性化合物所组成的混合物。

7.一种药物组合物，包括权利要求1所述的多肽以及显像制剂；其中，所述的多肽与所述显像制剂相缀合；所述显像制剂为放射性核素或分子影像制剂。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中，所述分子影像制剂为磁共振造影剂。

9.权利要求1所述的多肽在制备用于诊断癌症的药物或显像制剂中的用途；其中，所述癌症为肝癌、头颈部鳞状细胞癌、黑色素瘤、宫颈鳞状细胞癌、胃癌、非小细胞肺癌、胰腺癌和三阴性乳腺癌中的任意一种。

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