CN105198964A - 一种肿瘤靶向多肽、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肿瘤靶向多肽、其制备方法及应用，所述多肽如以下通式所示：X₁X₂X₃X₄X₅WX₆X₇。本发明还涉及编码该多肽的核苷酸序列，以及表达该多肽的表达载体及宿主细胞；本发明还涉及了该多肽、其形成的二价体、多价体或多肽偶联物及其作为靶向多肽与能杀伤癌细胞的制剂和显像制剂形成的药物组合物及其用途。本发明的多肽是目前最为理想的一类肿瘤靶向多肽，在肿瘤分子诊断和靶向治疗中具有重要应用价值，为乳腺癌，肺癌等多种肿瘤早期诊断、靶向治疗等提供了重要的理论和实践基础，具有广阔的应用前景。

Description

一种肿瘤靶向多肽、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及药物化学领域，具体涉及一种多肽，一种肿瘤特异性靶向多肽及其应用，尤其涉及一种肿瘤靶向多肽、其制备方法及应用。

背景技术

人表皮生长因子受体(EGFR)是原癌基因c-erbB-1(HER1)的表达产物，属受体型酪氨酸蛋白激酶。研究表明，HER1(EGFR)在上皮、间质、神经组织中都有较稳定的低表达，在调节正常细胞的增生、生长和分化中起着重要作用，但在许多恶性肿瘤中存在过表达，如非小细胞肺癌、乳腺癌、头颈部小细胞癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌等，HER1过表达的肿瘤细胞其侵袭性和转移能力更强，对放化疗不敏感，复发率高，预后差，易产生耐药性。

人表皮生长因子受体2(HER2)是与HER1同家族的受体酪氨酸激酶II型ErbB亚家族成员，研究表明，HER2在20-30％的乳腺癌中过度表达，HER2过表达的乳腺癌浸润性强，无病生存期短，预后差。卵巢癌，胃癌和子宫颈癌等多种肿瘤中都有HER2的过度表达，HER2已经成为治疗癌症的重要靶标。

HER1和HER2属于同一蛋白家族，因此两者在内部结构和生物学功能上极其相似。研究发现，二者胞外区同源性为42％，胞内激酶区高达82％。HER1和HER2通过活化酪氨酸蛋白激酶从而促进肿瘤细胞形成、增殖、黏附、转移和血管形成并与肿瘤的不良预后密切相关。它们在肿瘤细胞的生存、增殖、侵袭和转移，肿瘤形成过程中发挥相互协同的作用。二者与肿瘤的密切关系决定了其是当前肿瘤诊断和治疗的热门分子靶标之一，其表达水平也是肿瘤预后的指标之一。因此快捷、简便、准确识别在体肿瘤细胞表面HER1和HER2蛋白表达水平或活性的方法对肿瘤的诊断、治疗及预后有着重要的意义。

目前，常规检测HER1和HER2的方法如免疫组织化学(IHC)方法、原位免疫杂交技术(FISH)等，只能通过手术切除肿瘤或组织活检等有创技术来检测HER1和HER2的表达程度，检测结果存在一定的片面性和局限性。目前，在肿瘤临床治疗过程中或治疗后，无创的、可重复性、高准确性地检测肿瘤HER1和HER2的表达水平及活性尚难以实现，因而迫切需要特异性的影像检测技术来指导肿瘤治疗。其中分子探针的制备是分子影像的关键，只有高灵敏度和特异性的分子探针引入体内后可与细胞内特定的靶分子发生特异性结合并产生某种信号，体外通过特定的影像设备，如：正电子发射计算机断层扫描(PET-CT)、单光子发射计算机断层成像术(SPECT)、磁共振成像(MRI)以及化学发光设备等进行采集成像，从而达到特异性诊断的才能实现高度特异性的诊断。

近年来，针对HER1和HER2胞外区的抗体药物研究比较深入，部分药物已经市场化，如赫赛汀(trastuzumab)、西妥昔单抗(cetuximab)和帕尼单克隆抗体(Panitumumab)等。赫赛汀是一种人源化单克隆抗体，选择性地作用于HER2的胞外部位，1998年被FDA批准上市用于转移性乳腺癌的治疗，治疗效果明显好于现有的抗乳腺癌药物，现在已成HER2阳性乳腺癌患者的首选治疗药物。但由于抗体药物存在着制备繁琐、体外稳定性较差、分子较大、标记困难、穿透力弱，且费用昂贵等原因使其进一步应用受到限制。因此，为了提高癌症诊断和治疗的特异性和准确性，弥补抗体的缺陷，迫切需要寻求针对新的肿瘤标志物设计小分子探针，以作为检测和治疗癌症的有效方法。所以，研制一种针对HER1和HER2的小分子探针对HER1和HER2高表达的多种肿瘤的诊断将有突破性的重大意义。

多肽类靶向小分子药物及诊断探针以成本低、分子量小、生物相容性好、穿透性强、无免疫原性、并有较快的血液清除速率、且制备简单等特点，在肿瘤靶向给药、癌症诊断等方面彰显出很强的优越性，甚至显示了替代抗体类诊疗试剂的趋势。因此，在癌症研究中针对肿瘤标志物合理设计并筛选对癌细胞的高特异亲和多肽，继而发展成为肿瘤的诊断试剂及治疗药物，是解决上述难题的有效途径。

CN104130315A公开了一种特异靶向HER2(人表皮生长因子受体2)蛋白的多肽，所述多肽如以下通式所示：X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇RX₈YWX₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇RX₁₈X₁₉X₂₀X₂₁YX₂₂，能对HER2阳性细胞起靶向作用。尽管其公开了该多肽用于治疗癌症具有靶向作用，然而，其与HER2结合的相互作用不够高，且靶向作用也相对较差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肿瘤靶向多肽、其制备方法及应用，特别是一种能分别与乳腺癌、肺癌等多种肿瘤标志物HER1和HER2蛋白结合的多肽和由该肽所衍生的且能与HER1和HER2蛋白结合的产品及上述多肽或其衍生的产品在制备抗癌药物或显像制剂中的用途。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种能与HER1和HER2蛋白结合的多肽，其通式为：

X₁X₂X₃X₄X₅WX₆X₇

其中，W为色氨酸，X₁是极性氨基酸或芳香族氨基酸，优选为天冬酰胺或酪氨酸；X₂是芳香族氨基酸或碱性氨基酸，优选为组氨酸和色氨酸；X₃是碱性或酸性氨基酸，优选为天冬氨酸或精氨酸；X₄是芳香族氨基酸或碱性氨基酸，优选为赖氨酸或苯丙氨酸；X₅是极性氨基酸，优选为谷氨酸或苏氨酸；X₆是中性氨基酸，优选为天冬酰胺或亮氨酸；X₇是碱性氨基酸，优选为精氨酸和组氨酸。

本发明所述的氨基酸残基可以是L-型，也可以是D-型，或者是L-、D-型的混合。

本发明中，所述多肽来源为根据已有的文献报道，HER2靶向治疗的抗体Pertuzumab和Trastuzumab分别识别HER2胞外区的不同表位。HER2胞外区CR1domain主要参与异二聚化，而且CR1区的248-264位氨基酸比较保守在其异二聚化过程中是必不可少的。其中CR1loop在晶体结构上呈现一个裸露的单体分子与展示出与邻近分子晶体接触的潜能，由一个短发夹环构成一个二聚体臂来结合其他二聚体多肽分子完成二聚化过程。在本研究中，结合分子识别理论和已有的分子生物学数据进行肽库的设计和构建。采用氨基修饰的树脂作为固相载体，利用Fmoc合成策略进行混合均分合成库容量为10⁶的肽库。

EGFR的多肽序列DTCPPLMLYNPTTYQM是形成EGFR-EGFR二聚体，及EGFR-HER2异二聚体的关键位点，本发明的多肽经过分子动态模拟发现结合在HER1和HER2蛋白domain2区的230-295位氨基酸，且与蛋白的亲和力达到10^-8M。

本发明根据HER1和HER2蛋白结构域主要参与HER家族异二聚化激活信号通路，而且该区域氨基酸比较保守，针对这些特点设计并构建一珠一物肽库，利用荧光标记磁球和微流控芯片的方法进行高通量一珠一物肽库筛选，阳性肽珠经MALDI-TOF-MS鉴定，获得了一系列能特异性结合HER1和HER2的活性多肽。

作为优选技术方案，本发明所述多肽的氨基酸序列选自SEQIDNO.1-SEQIDNO.3之一所示的氨基酸序列。

氨基酸序列：

SEQ ID NO.1	AHDFEWLH
		SEQ ID NO.2	NWRKTWLH
SEQ ID NO.3	YWRFEWNR

本发明中，所述SEQIDNO.1所示的氨基酸序列对HER1高特异性亲和，对HER2不亲和；所述SEQIDNO.1所示的氨基酸序列对HER1不亲和，对HER2高特异性亲和；SEQIDNO.1所示的氨基酸序列对HER1高特异性亲和，对HER2高特异性亲和。

第二方面，本发明还提供了一种DNA片段，其包含编码第一方面所述多肽的氨基酸序列。

作为优选技术方案，所述DNA片段包含编码所述本发明SEQIDNO.1-SEQIDNO.3的氨基酸序列。

第三方面，本发明还提供了一种表达载体，包括至少一个拷贝的编码氨基酸序列为通式所示多肽的如本发明第二方面所述的DNA片段。

作为优选技术方案，本发明的表达载体，包括至少一个拷贝的编码氨基酸序列为SEQIDNO.1-SEQIDNO.3所示多肽的如本发明第二方面所述的DNA片段。

第四方面，本发明还提供了一种原核或真核宿主细胞，该宿主细胞含有如本发明第三方面所述的表达载体。

第五方面，本发明还提供了一种二价体或多价体，由本发明第一方面的通式所述的多肽及SEQIDNO.1-SEQIDNO.3所示多肽组装而成。

本发明中的二价体或多价体具有靶向HER1和HER2阳性的肿瘤细胞的特性。

作为优选技术方案，本发明的二价体或多价体是通过连接分子共价连接形成或通过与多聚体混合，非共价连接形成的。

优选地，所述的连接分子为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，所述1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)是一种新型无毒、生物相容性良好的交联剂。

本发明可以根据具体需要来选择多聚体，例如可以是聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、环糊精、聚酰胺-胺型树枝状高分子(PAMAM)、聚乳酸(PLA)或聚乳酸-乙醇胺(PLGA)中的任意一种或至少两种的混合。

第六方面，本发明还进一步提供了一种药物组合物，包括本发明第一方面所述的氨基酸序列为通式的多肽、如SEQIDNO.1-SEQIDNO.3之一所述的多肽或所述多肽的二价体或多价体作为靶向多肽，和能杀伤癌细胞的制剂。

作为优选技术方案，本发明所述的多肽、二价体或多价体作为靶向多肽，与能杀伤癌细胞的制剂相缀合或混合。

优选地，所述的制剂为能杀伤癌细胞的化学药物、生物药物、纳米药物、放射性药物、光热治疗或光动力治疗药物或包裹这些药物的载体中的任意一种。

进一步优选地，所述的制剂为烷化剂、抗代谢药物、抗肿瘤天然药物、抗肿瘤抗生素、激素及金属络合物或肿瘤放射靶向标记物中的任意一种。

进一步优选地，所述载体为纳米材料，脂质体或油性化合物中的任意一种，或者由多种油性化合物所组成的混合物。

本发明采用将第一方面所述的多肽、如SEQIDNO.1-SEQIDNO.3之一所述的多肽及第五方面所述的多肽二价体或多价体和纳米材料、脂质体等高分子材料缀合，本发明涉及的多肽、二价体或多价体可以使缀合后生成的化合物在机体内更稳定地被运输到靶细胞。

本发明涉及的多肽、二价体或多价体也可以和油性化合物或多种油性化合物的混合物相混合，本发明涉及的多肽也可以使所得到的混合物在机体内更稳定地被运输到靶细胞。

第七方面，本发明还进一步提供了另外一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明第一方面所述的氨基酸序列为通式所述肽、SEQIDNO.1-SEQIDNO.3之一所述的多肽或所述多肽的二价体或多价体和显像制剂。

优选地，所述多肽、二价体或多价体与显像制剂相缀合或混合。

优选地，所述的显像制剂为放射性核素、放射性核素标记物或分子影像制剂中的任意一种。

第八方面，本发明还提供了如本发明第一方面所述的氨基酸序列为通式所述肽、SEQIDNO.1-SEQIDNO.3之一所述的多肽或所述多肽的二价体或多价体在制备用于治疗、预防或诊断癌症的药物或显像制剂中的用途。

作为优选技术方案，本发明所述癌症为HER1和HER2过表达的癌症。

优选地，所述癌症为乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和子宫颈癌。

本发明的肽具有靶向HER1和HER2蛋白的作用，可以作为靶头增加药物或载有药物的载体如纳米材料、脂质体等在HER1和HER2阳性细胞中的含量，再添加药学上可接受的辅料或佐剂制成新型的更有效的靶向抗癌药物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的多肽具有靶向HER1和HER2阳性肿瘤细胞的特性，因而在实际应用中，可以将本发明的多肽作为靶向多肽，与能杀伤癌细胞的制剂相缀合或混合，用于肿瘤的靶向治疗和成像；

(2)本发明的多肽选择性强，纯度高，分子量小，特异性强，无免疫原性，安全可靠，可以采用化学合成的方法制备，简单易行，适于规模化工业生产；

(3)本发明的多肽是目前最为理想的一类肿瘤靶向多肽，在肿瘤分子诊断和靶向治疗中具有重要应用价值，为乳腺癌，肺癌等多种肿瘤早期诊断、靶向治疗等提供了重要的理论和实践基础，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明靶向多肽微阵列筛选图；

图2为表面等离子共振(SPRi)方法检测SEQIDNO.1-SEQIDNO.3分别与人HER1和HER2蛋白的亲合力大小；

其中，图2(a)为SEQIDNO.3与HER1蛋白结合的亲和力结果图；图2(b)为SEQIDNO.3与HER2蛋白结合的亲和力结果图；图2(c)为SEQIDNO.1与HER1蛋白结合的亲和力结果图；图2(d)为SEQIDNO.1与HER2蛋白结合的亲和力结果图；图2(e)为SEQIDNO.2与HER1蛋白结合的亲和力结果图；图2(f)为SEQIDNO.2与HER2蛋白结合的亲和力结果图；

图3为SEQIDNO.1-SEQIDNO.3分别与人HER1高表达细胞MDA-MB-468特异性结合的结果图；

其中，图3(a)～(d)是SEQIDNO.3与HER1高表达细胞MDA-MB-468特异性结合结果图，图3(e)～(h)是SEQIDNO.1与HER1高表达细胞MDA-MB-468特异性结合结果图，图3(i)～(l)是SEQIDNO.2与HER1高表达细胞MDA-MB-468特异性结合的结果图；

图4为SEQIDNO.1-SEQIDNO.3分别与人HER2高表达细胞SKBR3的特异性结合的结果图；

其中，图4(a)～(d)是SEQIDNO.3与HER2高表达细胞SKBR3特异性结合的结果图，图4(e)～(h)是SEQIDNO.1与HER2高表达细胞SKBR3特异性结合的结果图，图4(i)～(l)是SEQIDNO.2与HER2高表达细胞SKBR3特异性结合的结果图；

图5为SEQIDNO.1-SEQIDNO.3分别与无HER1和HER2表达的正常细胞293A的结合作用；

图6是通过MTT法检测SEQIDNO.1-SEQIDNO.3多肽探针对不同细胞的毒性。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1本发明多肽筛选系统的构建

1)实验仪器与材料

N-甲基吗啉(NMM)，哌啶，三氟乙酸(TFA)，二氯甲烷(DCM)，茚三酮，维生素C，苯酚，四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，六氢吡啶，三异丙基硅烷(TIS)，乙二硫醇(EDT)，N,N二甲基甲酰胺(DMF)，无水乙醚，树脂，甲醇，各种Fmoc保护氨基酸，PE-anti-HER1抗体，PE-anti-HER2抗体，Cy5-Streptavidin(链霉亲和素),FITC-Streptavidin(链霉亲和素)，Bio-AdembeadsStreptavidin(链霉亲和素标记纳米磁球)，多肽合成管，摇床，真空水泵，旋转蒸发仪，激光共聚焦显微镜(ZEISSLSM710)，上述试剂和材料均从商业途径获得。

2)“一珠一物”多肽文库的合成

采用Fmoc固相肽合成方法合成多肽文库，具体方法为将被保护的氨基酸逐个偶联到固相树脂上，然后在强酸下将肽链从树脂上裂解同时去除侧链保护基团。

称取150mg的Tentagel-NH₂树脂，按照上述固相多肽合成程序循环，依次加入180mg的Met、Gly、Cys依次进行反应三个循环。待反应完成后，把树脂均分3份，向每管分别加入60mg的His、Lys、Arg与等量的HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把3管树脂混合，脱保护。再把树脂均分为3份，向每管分别加入60mg的Glu、Leu、Asn与等量的HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把3管树脂混合，脱保护。再把树脂均分为4份，向每管分别加入45mg的Pro、Tyr、Trp、Phe与等量的HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把4管树脂混合，脱保护。再把树脂均分为5份，向每管分别加入36mg的Lys、Phe、Leu、Asp、Ser与等量的HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把5管树脂混合，脱保护。再把树脂均分为5份，向每管分别加入36mg的His、Ser、Leu、Asp、Tyr与等量的HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把5管树脂混合，脱保护。再把树脂均分为5份，向每管分别加入36mg的Tyr、Val、Ala、Asn、Lys与等量的HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把5管树脂混合，脱保护。

经过上述置换和收缩步骤，真空抽干，得到加载有肽库的干燥树脂备用。

3)HER1与HER2特异性结合的多肽的筛选

(1)取生物素(biotin)标记的HER2蛋白与Cy5-Streptavidin(链霉亲和素)等比例混合，37℃混合孵育1h，同样取生物素(biotin)标记的HER1蛋白与FITC-Streptavidin(链霉亲和素)等比例混合，37℃避光混合孵育1h。

(2)取干燥肽库用1×PBS洗3次，加入5％的脱脂牛奶在混旋仪上37℃对肽珠表面封闭2h，再用1×PBS洗3次。

(3)然后分别取200μLHER2-Streptavidin-Cy5和HER1-Streptavidin-FITC蛋白的反应混合物和1mLBio-AdembeadsStreptavidin(链霉亲和素标记纳米磁球)，同时加入肽库在混旋仪上37℃避光混合孵育2h。

(4)把孵育后含多肽库EP管置于磁力架上。阳性多肽受磁力影响吸附于EP管侧壁，而阴性多肽由于重力沉降在EP管底。阳性肽珠与生物素标记的受体蛋白孵育后，阳性肽珠特异性识别蛋白，标记荧光和磁性链霉亲和素通过识别生物素而识别阳性肽珠。阳性肽珠表面将包覆一层磁珠具有磁性从而被磁场捕获。将阳性肽珠转移到微芯片阵列中，形成一珠一坑。芯片在荧光显微镜可直观读出，偶联FITC发绿色荧光的珠子为结合HER1蛋白的多肽珠，偶联Cy5发红色荧光的珠子为结合HER2蛋白的多肽珠，发红绿两种荧光的肽珠即同时可结合HER1与HER2的多肽。通过逐一扫描和定位相应的三种阳性肽珠后，在芯片上滴加溴化氢原位裂解，用MALDI-TOF-MS鉴定通过Mascot数据库解出相应序列信息。结果如图1所示，按序列重新合成多肽部分标记FITC，MALDI-TOF鉴定和HPLC纯化用于后续试验。

经化学合成制得本发明的三条多肽分别为：SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3。

实验例1通过表面等离子共振(SPRi)方法检测SEQIDNO.1-3多肽与HER1和HER2蛋白的亲和作用

将1mg/mL的SEQIDNO.1-3多肽及1×PBS点到芯片上，在4℃湿润条件下孵育过夜，然后用10×PBS清洗10min，再用1×PBS清洗10min，最后用去离子水清洗2次，每次10min，浸入含5％牛奶的1×PBS中，4℃条件下孵育过夜，然后用10×PBS清洗10min，1×PBS清洗10min，最后用去离子水清洗2次，每次10min，用氮气吹干，装芯片上机(PlexeraHT表面等离子共振成像系统)。

流动相依次通过1×PBS、2×PBS、0.625μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL和10μg/mL的人HER1和HER2纯化蛋白，记录分析SPRi信号。

由图2(a)-(b)可以看出，SEQIDNO.3的SPRi信号随着蛋白浓度的增加逐渐增强，说明本发明的SEQIDNO.3多肽对HER1和HER2都有强结合的，而且达到10⁹M，接近抗体的亲和力。由图2(c)-(d)可以看出，SEQIDNO.1的SPRi信号可看出SEQIDNO.1与HER1有很强的结合而与HER2没有特异性结合，说明本发明的SEQIDNO.1多肽对HER1是特异性而对HER2是没结合的，由图2(e)-(f)可以看出，SEQIDNO.2的SPRi信号可看出SEQIDNO.2与HER2有很强的结合而与HER1没有特异性结合，说明本发明的SEQIDNO.2多肽对HER2是特异性而对HER1是没结合的。由此说明本发明的三条多肽既有单一靶向性，又有双靶向性，而且有非常好的特异性和亲和力。可以作为探针靶向表达HER1和HER2的多种肿瘤细胞，用于相关的研究应用。

实验例2SEQIDNO.1-3分别与HER1和HER2高表达细胞MDA-MB-468和SKBR3及正常细胞293A的相互作用

乳腺癌细胞系MDA-MB-468和SKBR3(HER2高表达)细胞用分别用含20％胎牛血清的DMEM和含10％胎牛血清的RPMI1640培养基培养和正常人肾纤维母细胞293A培养在含10％胎牛血清的H-DMEM培养液中，以1×10⁵/mL的细胞浓度植入圆形玻底培养皿(35mm)，37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24h后，弃去培养液，三种细胞中分别加入含1μmol/LHoechst33342的50μmol/L的FITC标记H1P,H2P,HMP多肽，4℃避光孵育0.5h后，分别弃去多肽溶液，并用预冷1×PBS洗涤2次，分别加入5μLPE-anti-HER1抗体和PE-anti-HER2抗体。4℃避光孵育1h后，并用预冷1×PBS洗涤3次。用激光扫描共聚焦显微镜(ZEISSLSM710)检测细胞中的荧光分布。

结果如图3所示，加入SEQIDNO.1-3的MDA-MB-468细胞观测到SEQIDNO.1和SEQIDNO.3有很强绿色荧光，而SEQIDNO.2没有的荧光。同时PE标记的抗体进行细胞膜上蛋白表达定位，结果表明SEQIDNO.1和SEQIDNO.3多肽结合在MDA-MB-468细胞的细胞膜上，抗体定位显示与HER1表达部位相同。说明SEQIDNO.1和SEQIDNO.3多肽与人HER1阳性乳腺癌细胞系的识别是具有专一性的，是靶向HER1蛋白的，而且特异性与靶标蛋白的表达量呈正相关，可以作为靶向分子用于相关的诊断和检测。相反，SEQIDNO.2对HER1蛋白则没有靶向性。

结果如图4所示，加入SEQIDNO.1-3的SKBR3细胞观测到SEQIDNO.2和SEQIDNO.3有很强绿色荧光，而SEQIDNO.1没有的荧光。同时PE标记的抗体进行细胞膜上蛋白表达定位，结果表明SEQIDNO.2和SEQIDNO.3多肽结合在SKBR3细胞的细胞膜上，HER2抗体定位显示与HER2表达部位相同。说明SEQIDNO.2和SEQIDNO.3多肽与人HER2阳性乳腺癌细胞系的识别是具有专一性的，是靶向HER2蛋白的，而且特异性与靶标蛋白的表达量呈正相关，可以作为靶向分子用于相关的诊断和检测。同样SEQIDNO.1对HER2蛋白则没有靶向性。

结果如图5所示，SEQIDNO.1-3多肽对无HER1和HER表达的阴性细胞2293A没有观测到绿色荧光信号，由此进一步说明它们是特异性的靶向HER1和HER2，也进一步验证了图2中的SPRi数据的可靠性。

实验例3MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)法检测H1P,H2P,HMP分别对不同细胞的毒性大小

在96孔板中分别接种SKBR3、MCF-7和293A三种细胞，每孔3000个细胞，三个复孔。37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24h后，弃去培养液，三种细胞中分别加入0.1μΜ、1μΜ、10μΜ、50μΜ和100μΜ的SEQIDNO.1-3多肽，37℃培养箱中培养48h后弃液体，加入200μL的MTT，37℃培养箱中培养4h后吸掉液体，再加入200μLDMSO放置10min，用酶标仪在570nm测OD值后计算存活率。

由图6可以看出，SEQIDNO.1-3多肽对SKBR3，MCF-7和293A三种细胞没有毒性，细胞存活率接近100％，可以作为靶向探针安全使用，这为我们后续研究的开展奠定了良好的基础。

综上所述，从实验例1-3可以得出，本发明的多肽具有靶向表达HER1和HER2阳性肿瘤细胞的特性，因而在实际应用中，可以将本发明的多肽作为靶向多肽，与能杀伤癌细胞的制剂相缀合或混合，用于肿瘤的靶向治疗和成像。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种区分肿瘤标志物HER1和HER2的靶向多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸其通式为：

X₁X₂X₃X₄X₅WX₆X₇

其中，W为色氨酸，X₁是极性氨基酸或芳香族氨基酸，优选为天冬酰胺或酪氨酸；X₂是芳香族氨基酸或碱性氨基酸，优选为组氨酸和色氨酸；X₃是碱性或酸性氨基酸，优选为天冬氨酸或精氨酸；X₄是芳香族氨基酸或碱性氨基酸，优选为赖氨酸或苯丙氨酸；X₅是极性氨基酸，优选为谷氨酸或苏氨酸；X₆是中性氨基酸，优选为天冬酰胺或亮氨酸；X₇是碱性氨基酸，优选为精氨酸和组氨酸。

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为SEQIDNO.1-SEQIDNO.3之一所示的氨基酸序列。

3.一种DNA片段，其特征在于，其包含编码权利要求1或2所述多肽的核苷酸序列。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的如权利要求3所述的DNA片段。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求4所述的表达载体。

6.根据权利要求1或2所述的多肽形成的二价体或多价体，其特征在于，所述的二价体或多价体具有靶向HER1和HER2阳性肿瘤细胞的特性；

优选地，所述的二价体或多价体是通过连接分子共价连接形成的；

优选地，所述的二价体或多价体是通过与多聚体混合，非共价连接形成的；

优选地，所述的连接分子为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；

优选地，所述多聚体为聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、环糊精、聚酰胺-胺型树枝状高分子(PAMAM)、聚乳酸(PLA)或聚乳酸-乙醇胺(PLGA)中的任意一种或至少两种的组合。

7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1或2所述的多肽和能杀伤癌细胞的制剂；

优选地，所述的药物组合物包括权利要求6所述的二价体或多价体和能杀伤癌细胞的制剂；

优选地，所述多肽、二价体或多价体作为靶向多肽，与能杀伤癌细胞的制剂相缀合或混合；

优选地，所述的制剂为能杀伤癌细胞的化学药物、生物药物、纳米药物、放射性药物、光热治疗或光动力治疗药物或包裹这些药物的载体中的任意一种；

进一步优选地，所述的制剂为烷化剂、抗代谢药物、抗肿瘤天然药物、抗肿瘤抗生素、激素、金属络合物或肿瘤放射靶向标记物中的任意一种；

进一步优选地，所述载体为纳米材料，脂质体或油性化合物中的任意一种，或者由多种油性化合物所组成的混合物。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1或2所述的多肽和显像制剂；

优选地，所述药物组合物包括权利要求6所述的二价体或多价体和显像制剂；

优选地，所述的多肽、二价体或多价体与显像制剂相缀合或混合；

优选地，所述的显像制剂为放射性核素、放射性核素标记物或分子影像制剂中的任意一种。

9.根据权利要求1-2中任一项或权利要求6所述的多肽、二价体或多价体在制备用于治疗、预防或诊断癌症的药物或显像制剂中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述癌症为HER1和HER2蛋白过表达的癌症；

优选地，所述癌症为乳腺癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌或子宫颈癌中的任意一种。