CN107459559B - 一种肿瘤免疫治疗预测生物标志物pd-l1靶向多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种肿瘤免疫治疗预测生物标志物PD‑L1靶向多肽及其应用，所述多肽通式为：X1FX2X3X4X5X6X7X8KX9C。本发明还涉及编码该多肽的DNA片段，表达该多肽的表达载体及宿主细胞，由该多肽形成的二价体、多价体或药物组合物。本发明制备方法简单、成本低廉，实用性强；用于检测肿瘤细胞中PD‑L1的表达情况，以实时监控免疫治疗的疗效及其相应的受益患者筛选。本发明的多肽可为多种肿瘤早期诊断和免疫治疗中检查点的动态监测等提供重要的理论和临床参考依据，优化个体患者的治疗方案有着重要的意义和应用价值。

Description

一种肿瘤免疫治疗预测生物标志物PD-L1靶向多肽及其应用
技术领域
本发明涉及医学生物检测技术和药物化学领域，具体涉及PD-L1肿瘤特异性靶向多肽筛选及其应用，尤其涉及一种肿瘤免疫治疗相关靶向多肽的制备方法及其应用。
背景技术
近年来，随着肿瘤学、免疫学以及分子生物学等相关学科的快速发展和相互渗透，肿瘤免疫治疗的研究和发展变得突飞猛进。肿瘤免疫治疗成为新一种重要的抗肿瘤治疗手段，与以往的手术治疗、化学治疗、放射治疗和靶向治疗不同，肿瘤免疫治疗是一种通过激活人体自身免疫系统来对抗肿瘤的治疗手段，也成为了攻克恶性肿瘤的新希望。肿瘤免疫治疗的核心是激活肿瘤患者T淋巴细胞的抗肿瘤反应，以提高其对肿瘤细胞的杀伤功能。T细胞对肿瘤细胞有明确的靶向性和特异性，能通过识别并聚集到肿瘤抗原表达的部位而产生长程免疫应答反应，直接抑制和杀伤肿瘤细胞。树突状细胞(dendritic cell，DC)在T细胞识别过程中发挥至关重要的作用，可作为肿瘤治疗工具，这使通过免疫干预实现肿瘤治疗成为可能。
目前，随着对肿瘤免疫逃逸机制研究的不断深入，针对免疫检查点的抑制剂在多种实体瘤的治疗中表现出了较好的临床效果，成为癌症治疗史上里程碑式的事件，使人们认识到免疫治疗能够真正成为恶性肿瘤治疗的重要角色。肿瘤免疫治疗有多种治疗策略，包括非特异性免疫刺激剂、肿瘤疫苗、过继性免疫细胞疗法，以及单抗治疗。由于肿瘤具有极大的异质性和遗传不稳定性，其发病机制复杂，单独依靠某一种治疗手段难以达到理想的抗肿瘤效果，因此在深入研究不同治疗手段之间相互作用机制的基础上，联合肿瘤靶向治疗和不同类型免疫治疗的抗肿瘤策略有可能是未来肿瘤免疫治疗的发展方向。
T细胞介导的细胞免疫在识别和杀伤肿瘤细胞的过程中起着重要的作用，T细胞通过T细胞受体与肿瘤细胞表面的带有特异性抗原的主要组织相容性复合体(MHC)结合，从而识别肿瘤细胞。TCR和MHC分子的相互作用受到一系列免疫检查点的控制，可以使T细胞激活或抑制。其中PD-1和其配体PD-L1通路是抑制性免疫检查点，它们结合可以使T细胞的免疫活性受到抑制，在免疫耐受中发挥重要作用，这也是肿瘤细胞免疫逃逸的重要原因。
程序性死亡配体-1(Programmed death receptor ligand-1,PD-L1,又称为B7-H1)是典型的负性协同刺激分子，在1992年首次作为基因被发现并进行了克隆，其可转录诱导T细胞程序化死亡，是目前免疫学研究领域的热门对象之一。PD-L1属于B7家族的Ⅰ型跨膜蛋白，是程序性死亡因子-1(Programmed death-1,PD-1)的配体。主要表达于抗原提呈细胞、B细胞、T细胞、上皮细胞、肌细胞、内皮细胞及各种肿瘤细胞，并参与肿瘤相关的免疫反应。PD-L1是由290个氨基酸亚基组成的跨膜蛋白，胞外段为两个免疫球蛋白恒定区(Ig C)和Ig V样结构域。在肿瘤免疫微环境中，PD-L1作为一个代表性的负性共刺激分子，其通过与T淋巴细胞表面PD-1结合，诱导免疫受体酪氨酸抑制基序的磷酸化，在体内、体外均能促进抗原特异性人类T细胞克隆的凋亡，抑制T细胞的增殖分化和诱导效应T细胞的耗竭。肿瘤细胞可异常上调PD-L1以及PD-1的表达，抑制T细胞的免疫活性，造成肿瘤免疫逃逸，导致肿瘤发生、发展。高表达PD-L1的患者预后差，生存率低。因此，通过阻断PD-1/PD-L1信号通路，重新激活机体免疫系统对肿瘤的杀伤作用，改造肿瘤赖以生存的“土壤”成为了新的恶性肿瘤治疗热点。
综上所述，PD-L1参与了肿瘤的发生、发展过程，并协助肿瘤细胞逃避机体免疫系统的杀伤作用，使肿瘤可进一步恶化。PD-1/PD-L1信号通路在肿瘤免疫中起到关键性作用，同时也为肿瘤免疫治疗提供了新的分子靶标。那么，如果能够从根源上阻断PD-1/PD-L1信号通路的激活，就有可能增强免疫治疗效应及维持内源性抗肿瘤效应，使肿瘤得到持久的控制。研究发现，PD-L1表达于人类多种肿瘤细胞表面，例如肺癌、黑素瘤、肝癌、卵巢癌、食管癌、乳腺癌等。所以，PD-1/PD-L1抗体已经成为肿瘤免疫治疗中的热点研究方向。
近年来，针对PD-1/PD-L1的抗体药物研究比较深入，部分药物已经市场化。目前，阻断PD-1/PD-L1通路的免疫检查点抑制剂主要分为两大类：(1)针对PD-1的单克隆抗体，nivolumab和pembrolizumab；(2)针对PD-L1的单克隆抗体，BMS-936559、MPDL3280A、atezolizumab、avelumab和durvalumab。在临床试验中，通过单克隆抗体阻断PD-1和PD-L1等已在恶性黑色素瘤、NSCLC等多种恶性肿瘤的免疫治疗临床试验中得到应用，具有良好的前景。目前，PD-1或PD-L1单克隆抗体已经在多种实体瘤如黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、肝癌、胃及食道癌、乳腺癌、小细胞肺癌等疾病中进行了临床研究，取得了显著性临床效果，能够阻止晚期转移性肿瘤的进程，有望实质性改善患者总生存期。研究数据显示，在肿瘤高水平表达PD-L1(肿瘤比例得分≥50％)的晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者中，与标准化疗相比，Keytruda单药治疗在主要终点(无进展生存期，PFS)和次要终点(总生存期，OS)均表现出优越性。
免疫检查点抑制剂，是现在最有前景的一种癌症治疗方法，目前的共识是PD-L1表达高，PD1或PDL1免疫药物整体效果比较好。然而多项临床试验结果提示，只有约20％的NSCLC患者能从中获益。不幸的是，其它肿瘤也有大量的患者和恶性肿瘤对治疗没有反应，也存在着药物相关不良反应，包括皮肤瘙痒、食欲不振、疲劳等，皮肤炎、结肠炎、肝炎、下垂体炎等。两种阻断剂的不良反应以及疗效之间的差异需要在临床试验中进一步探讨，用于指导临床用药，降低不良反应对特殊人群的危害，取得更好的临床疗效。因此，探寻合适的疗效预测标志物，进而精准的选择出免疫治疗潜在的获益人群成为研究的热点。准确预测肿瘤对PD-1/PD-L1阻断剂的反应依然是个挑战。缺乏生物标志物用于预测和监测临床检查点阻断的响应者的主要障碍是缺乏准确评估动态免疫检查点表达的检测工具。
PD-L1在肿瘤细胞或肿瘤基质的表达，已经被建议作为PD-1或PD-L1定向免疫治疗反应预测的潜在疗效预测标志物。但目前对PD-L1表达的检测尚未得到统一的国际标准，而且多方面因素导致了单一的PD-L1表达水平作为疗效预测物的不可靠性。研究PD-L1在不同肿瘤的表达情况，以及其与患者临床病理参数、预后的相关性，可为不同肿瘤的免疫治疗提供治疗及预后相关的临床参考和依据。二者与肿瘤的密切关系决定了其是当前肿瘤诊断和免疫治疗的热门分子靶标之一，其表达水平也是肿瘤预后的指标之一。到目前为止，通过手术切除肿瘤或组织活检等有创技术来检测PD-1和PD-L1的表达程度，由于用于检测抗体的品牌、检测技术、检测时的环境条件以及判定PD-L1阳性的cutoff值的不同均可导致检测结果的不一致。由于活检程序的相关风险和免疫组织化学(IHC)的缺陷，肿瘤异质性空间表达导致PD-L1表达的不敏感和肿瘤取样不完全等因素可能导致PD-L1检测出现假阳性。此外，获取样本时患者可处于基线或其他各线治疗状态，这也是造成检测结果差异的原因之一。这些因素不但影响了对PD-L1表达水平检测的一致性，同时也会影响其检测的可靠性和可重复性。除此之外，PD-L1表达水平的动态变化也是影响判定PD-L1确切的表达状态因素之一。因此，常规检测方法如免疫组织化学(IHC)方法、原位免疫杂交技术(FISH)等来预测抗PD-1/抗-PD-L1免疫治疗效果存在一定的片面性和局限性。随着癌症免疫疗法的不断发展，需要通过分子分型优化个体患者的治疗方法，并开发非侵入性分子影像工具，最终实现对临床免疫检查点封锁的动态监测。因此，快捷、简便、动态准确识别肿瘤细胞表面PD-L1蛋白表达水平的方法对肿瘤的诊断、免疫治疗及预后评估有着重要的意义。
目前，在肿瘤临床治疗过程中或治疗后，无创的、可重复性、高准确性地检测肿瘤PD-1和PD-L1的表达水平及活性尚难以实现，因而迫切需要特异性的影像检测技术来指导肿瘤治疗。分子影像在免疫治疗和个性化医学中发挥越来越重要的作用。其中分子探针的制备是分子影像的关键，只有高灵敏度和特异性的分子探针引入体内后可与细胞内特定的靶分子发生特异性结合并产生某种信号，体外通过特定的影像设备，如：正电子发射计算机断层扫描(PET-CT)、单光子发射计算机断层成像术(SPECT)、磁共振成像(MRI)以及化学发光设备等进行采集成像，从而达到特异性诊断的才能实现高度特异性的诊断。
但由于抗体药物存在着制备繁琐、体外稳定性较差、分子较大、标记困难、穿透力弱，翻译后修饰且费用昂贵等原因使其进一步应用受到限制。因此，为了提高癌症诊断和治疗的特异性和准确性，弥补抗体的缺陷，迫切需要寻求针对新的肿瘤标志物设计小分子探针，以作为检测和治疗癌症的有效方法。所以，开发一种针对PD-1/PD-L1的小分子探针对PD-L1高表达的多种肿瘤的诊断将有突破性的重大意义。多肽类靶向小分子药物及诊断探针以成本低、分子量小、生物相容性好、穿透性强、无免疫原性、并有较快的血液清除速率、且制备简单等特点，在肿瘤靶向给药、癌症诊断等方面彰显出很强的优越性，甚至显示了替代抗体类诊疗试剂的趋势。因此，在癌症研究中针对肿瘤标志物合理设计并筛选对癌细胞的高特异亲和多肽，继而发展成为肿瘤的诊断试剂及治疗药物，是解决上述难题的有效途径。采用非侵入性方法可对整个肿瘤和相关转移灶同时成像，其可能与PD-L1表达状态中的原发性肿瘤不同。具有IHC无可比拟的优势，也不需要切除任何组织。由于靶向多肽其对PD-L1的高亲和力和特异性以及其增强的组织穿透，因此放射性标记的PD-L1靶向多肽可用作评估肿瘤PD-L1表达的有效分子探针。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肿瘤免疫治疗相关的靶向多肽的制备方法及其应用，特别是一种能分别与黑色素瘤、非小细胞肺癌、结直肠癌、乳腺癌等多种肿瘤免疫治疗相关的标志物PD-L1蛋白结合的多肽和由该肽所衍生的且能PD-L1蛋白结合的产品及上述多肽或其衍生的产品在制备抗癌药物或显像制剂中的用途。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种肿瘤免疫治疗预测生物标志物PD-L1靶向多肽，该多肽能与PD-L1蛋白结合，所述多肽的通式为：
X1FX2X3X4X5X6X7X8KX9C
其中，F为苯丙氨酸，K为赖氨酸，C半胱氨酸，X1是碱性或酸性氨基酸；X2是非极性氨基酸；X3是碱性或芳香族氨基酸；X4是非极性氨基酸；X5是碱性或酸性氨基酸；X6是中性氨基酸；X7是碱性或中性氨基酸；X8中性氨基酸；X9是碱性或酸性氨基酸。
本发明所述的氨基酸残基可以是L-型，也可以是D-型，或者是L-、D-型的混合。
本发明中，根据已有的文献报道Krzysztof M.Zak等人基于PD-1/PD-L1复合物的X射线结构揭示二者相互作用的分子图谱，并提供了相互作用表面的详细分子图。通过对PD-1/PD-L1复合物的晶体结构解析发现它们CDR loop区的一些关键氨基酸在结合过程中其主要作用，如PD-1(Val64,Ile126,Leu128,Ala132,Ile134)和PD-L1(Ile54,Tyr56,Met115,Ala121,Tyr123)。在PD-L1/PD-1相互作用表面内，鉴定出了三个主要的热点(图6)。第一个是一个经典的口袋，主要是疏水性的容纳Ile134的口袋。该口袋由Tyr56，Glu58，Arg113，Met115和Tyr123的侧链组成，并且具有适合六元芳香环的完美尺寸和性质(该口袋称为Ile134口袋)。第二个热点位于附近，可容纳Ile126。它由Met115，Ala121和Tyr123组成，其可以与Ala121的羰基氧上的末端氢键供体基团锚定。第三个热点是容纳Tyr68，Gln75和Thr76的延伸槽。总之，提供的这些数据为合理设计破坏PD-1/PD-L1相互作用的小分子抑制剂和探针奠定了结构基础。
本发明中，根据PD-1/PD-L1相互作用热点氨基酸位点和分子识别理论进行肽库的设计和构建。采用氨基修饰的TentaGel树脂作为固相载体，利用Fmoc合成策略进行混合均分合成库容量为106的一珠一物肽库。利用荧光标记磁球和微流控芯片的方法进行高通量一珠一物肽库筛选，阳性肽珠经MALDI-TOF-MS鉴定，获得了一系列能特异性结合PD-L1的活性多肽。
作为优选技术方案，本发明所述多肽的氨基酸序列如下表PDP-4、PDP-6之一所示，其分别对应序列表中的序列1、2所示的氨基酸序列。
多肽的氨基酸序列：
SEQ ID PDP-4 DFRRTKGRTKDC
SEQ ID PDP-6 HFRYNDAIIKDC
本发明中，所述PDP-4和PDP-6所示的氨基酸序列对PD-L1高特异性亲和。
第二方面，本发明还提供了一种DNA片段，其包含编码上述本发明第一方面所述多肽的氨基酸序列。
作为优选技术方案，所述DNA片段包含编码本发明所述PDP-4、PDP-6之一的氨基酸序列。
第三方面，本发明还提供了一种表达载体，包括至少一个拷贝的编码氨基酸序列为本发明第一方面上述多肽的如本发明第二方面所述的DNA片段。
作为优选技术方案，本发明的表达载体，包括至少一个拷贝的编码氨基酸序列为PDP-4、PDP-6之一所示多肽的如本发明第二方面所述的DNA片段。
第四方面，本发明还提供了一种原核或真核宿主细胞，该宿主细胞含有如本发明第三方面所述的表达载体。
第五方面，本发明还提供了一种二价体或多价体，由本发明第一方面所述的多肽(如PDP-4、PDP-6之一)组装而成。
本发明中的二价体或多价体具有靶向PD-L1阳性的肿瘤细胞的特性。
作为优选技术方案，本发明的二价体或多价体是通过连接分子共价连接形成；或是通过与多聚体混合、非共价连接形成的。
优选地，所述的连接分子为6-叔丁氧羰肼基烟酸(HYNIC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；该连接分子是一种新型无毒、生物相容性良好的交联剂。
本发明可以根据具体需要来选择多聚体，例如可以是聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、环糊精、聚酰胺-胺型树枝状高分子(PAMAM)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇胺(PLGA)中的任意一种或至少两种的混合。
第六方面，本发明还进一步提供了一种药物组合物，包括本发明第一方面所述的多肽(如PDP-4、PDP-6之一)或本发明第五方面所述的二价体或多价体作为靶向多肽；以及能杀伤癌细胞的制剂。
作为优选技术方案，本发明所述的多肽、二价体或多价体作为靶向多肽，与能杀伤癌细胞的制剂相缀合或混合。
优选地，所述的制剂为能杀伤癌细胞的化学药物、生物药物、纳米药物、放射性药物、光热治疗或光动力治疗药物或包裹这些药物的载体中的任意一种。
进一步优选地，所述的制剂为烷化剂、抗代谢药物、抗肿瘤天然药物、抗肿瘤抗生素、激素及金属络合物或肿瘤放射靶向标记物中的任意一种。
进一步地，所述药物组合物还包括与所述的多肽(如PDP-4、PDP-6之)或所述二价体或多价体相缀合或混合可制备靶向药物的载体。
进一步优选地，所述载体为纳米材料，脂质体或油性化合物中的任意一种，或者由多种油性化合物所组成的混合物。
本发明采用将第一方面所述的多肽(如PDP-4、PDP-6之一)或第五方面所述的二价体或多价体与所述载体(纳米材料、脂质体等高分子材料)缀合，本发明所述的多肽、二价体或多价体可以使缀合后生成的化合物在机体内更稳定地被运输到靶细胞。
本发明涉及的多肽、二价体或多价体也可以与所述载体(油性化合物或多种油性化合物的混合物)相混合，本发明涉及的多肽也可以使所得到的混合物在机体内更稳定地被运输到靶细胞。
第七方面，本发明还进一步提供了另外一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明第一方面所述的多肽(PDP-4、PDP-6之一)或所述的二价体或多价体，以及显像制剂。
优选地，所述多肽、二价体或多价体与显像制剂相缀合或混合。
优选地，所述的显像制剂为放射性核素、放射性核素标记物或分子影像制剂中的任意一种。
第八方面，本发明还提供了如本发明第一方面所述的多肽(PDP-4、PDP-6之一)或所述的二价体或多价体在制备用于治疗、预防或诊断癌症的药物或显像制剂中的用途。
作为优选技术方案，本发明所述癌症为PD-L1过表达的癌症。
优选地，所述癌症为黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、肝癌、胃及食道癌、乳腺癌、小细胞肺癌等。
本发明的肽具有靶向PD-L1蛋白的作用，可以作为靶头增加药物或载有药物的载体如纳米材料、脂质体等在PD-L1阳性细胞中的含量，再添加药学上可接受的辅料或佐剂制成新型的更有效的靶向抗癌药物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的多肽具有靶向PD-L1阳性肿瘤细胞的特性，因而在实际应用中，可以将本发明的多肽作为分子探针用于筛查适于进行免疫治疗的病人和疗效评估。还可以作为靶向多肽，与能杀伤癌细胞的制剂相缀合或混合，用于多种肿瘤的靶向治疗和成像。同时，可以优化该多肽将其本身作为多肽抑制剂药物，阻断PD-1/PD-L1信号通路，激活免疫治疗。
(2)PD-1/PD-L1阻断剂在临床取得了较好的疗效和较高的耐受性，但是目前还缺乏相关生物标志物来预测该类抗体治疗的预后或指导患者的筛选。本发明的多肽探针选择性强，纯度高，分子量小，特异性强，无免疫原性，安全可靠，可以采用化学合成的方法制备，简单易行，适于作为基于PD-L1免疫治疗的预测和伴随诊断试剂。通过PD-L1生物标志物的鉴定有利于医生制定个性化治疗方案以取得最优的治疗效果，具有较好的研究前景和临床指导意义。
(3)本发明的PD-L1多肽是目前最为普适的一类肿瘤靶向多肽，还没有相关的报道。对于现有的基于PD-1/PD-L1阻断剂的免疫治疗中，如何在减少不良反应的同时应用到更多的恶性肿瘤治疗上，并且与其他免疫治疗、化疗、放疗、小分子靶向药物联合治疗提供了重要的理论和借鉴意义，具有广阔的应用前景。另外，鉴于PD-1/PD-L1通路在其他多系统疾病中也有着重要的调节作用，为类风湿性关节炎、HCV病毒感染、过敏性紫癜、再生障碍性贫血、动脉粥样硬化、冠心病等疾病的免疫治疗提供新的思路和适宜人群的筛选和预后检测评估等将是未来研究的热点。
本发明制备方法简单、成本低廉，具有很强的实用性和应用前景；用于检测肿瘤细胞中PD-L1的表达情况，以实时监控免疫治疗的疗效及其相应的受益患者筛选。本发明为实时监控肿瘤免疫治疗后的复发、转移提供了简便快捷、经济、准确的检测手段，以便及时调整治疗方案，尽早进行临床干预，防止病情进展，改善患者预后提供了新的手段。本发明的多肽可为黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、前列腺癌、神经胶质瘤、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、肝癌、胃癌、食道癌和乳腺癌等多种肿瘤早期诊断和免疫治疗中检查点的动态监测等提供重要的理论和临床参考依据，优化个体患者的治疗方案有着重要的意义和应用价值。
附图说明
图1PD-L1阳性多肽筛选图；
图2为阳性多肽二级质谱图；
图3表面等离子共振(SPRi)方法检测阳性多肽分别与人PD-L1蛋白的亲合力大小；
图4为PDP-4与PD-L1高表达细胞系NCI-H1975、HCCC 9810和阴性细胞293T的细胞水平特异亲和性检测；
图5为PDP-6与PD-L1高表达细胞系NCI-H1975、HCCC 9810和阴性细胞293T的细胞水平特异亲和性检测；
图6为PD-1/PD-L1蛋白复合物结合位点三维结构示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实验例1 本发明PD-L1靶向多肽筛选系统的构建和筛选
1)实验仪器与材料
N-甲基吗啉(NMM)，哌啶，三氟乙酸(TFA)，二氯甲烷(DCM)，茚三酮，维生素C，苯酚，四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，六氢吡啶，三异丙基硅烷(TIS)，乙二硫醇(EDT)，N,N二甲基甲酰胺(DMF)，无水乙醚，树脂，甲醇，各种Fmoc保护氨基酸，Alexa Fluor 647-anti-PD-L1抗体，MB-Streptavidin(链霉亲和素磁珠)，Streptavidin-HRP(链霉亲和素标记辣根过物氧化酶)，多肽合成管，摇床，真空水泵，旋转蒸发仪，激光共聚焦显微镜(ZEISS LSM 710)，上述试剂和材料均从商业途径获得。
2)PD-L1“一珠一物”多肽文库的合成
采用Fmoc固相肽合成方法合成多肽文库，具体方法为将被保护的氨基酸逐个偶联到固相树脂上，然后在强酸下将肽链从树脂上裂解同时去除侧链保护基团。
(1)称取200mg的Tentagel-NH2树脂，按照上述固相多肽合成程序循环，依次加入200mg的Met、Gly依次进行反应；
(2)待反应完成后，把树脂均分3份，向每管分别加入80mg的Asp、Asn、Arg与等量的HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把3管树脂脱保护后混合，再把树脂均分为3份，向每管分别加入90mg的Glu、Arg、Lys与等量的HBTU进行偶联；
(3)待偶联完毕后，把3管树脂脱保护后混合。再把树脂均分为5份，向每管分别加入60mg的Ile、Ser、Thr、His、Gln与等量的HBTU进行偶联；
(4)待偶联完毕后，把5管树脂脱保护后混合。再把树脂均分为4份，向每管分别加入80mg的Asp、Asn、Arg、Ile与等量的HBTU进行偶联；
(5)待偶联完毕后，把5管树脂脱保护后混合。再把树脂均分为2份，向每管分别加入100mg的Gly、Ala与等量的HBTU进行偶联；
(6)待偶联完毕后，把2管树脂脱保护后混合。再把树脂均分为4份，向每管分别加入80mg的Glu、Lys、Thr、Asp与等量的HBTU进行偶联；
(7)待偶联完毕后，把4管树脂脱保护后混合。再把树脂均分为4份，向每管分别加入80mg的His、Tyr、Thr、Asn与等量的HBTU进行偶联；
(8)待偶联完毕后，把4管树脂脱保护后混合。再把树脂均分为5份，向每管分别加入80mg的Gln、Lys、Thr、Tyr、Arg与等量的HBTU进行偶联；
(9)待偶联完毕后，把5管树脂脱保护后混合。再把树脂均分为3份，向每管分别加入90mg的Glu、Ser、Arg与等量的HBTU进行偶联；
(10)待偶联完毕后，把3管树脂脱保护后混合。再把树脂均分为5份，向每管分别加入60mg的His、Tyr、Phe、Asp、Val与等量的HBTU进行偶联；
(11)待偶联完毕后，把5管树脂脱保护后混合。再把树脂均分为4份，向每管分别加入80mg的Gln、Asp、His、Asn与等量的HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把4管树脂脱保护后混合。经过甲醇置换和收缩步骤，真空抽干，得到加载有肽库的干燥树脂备用。
3)PD-L1阳性多肽的筛选
(1)取干燥肽库用1×PBS洗3次，加入5％的脱脂牛奶在混旋仪上37℃对肽珠表面封闭2h，再用1×PBS洗3次；
(2)取生物素(biotin)标记的PD-L1蛋白与多肽库混合，37℃孵育2h后用1×PBS洗3次；
(3)然后分别取100μL MB-Streptavidin和Streptavidin-HRP同时加入肽库在混旋仪上37℃避光混合孵育2h。把孵育后含多肽库EP管置于磁力架上。阳性多肽受磁力影响吸附于EP管侧壁，而阴性多肽由于重力沉降在EP管底。
由图(1)看出阳性肽珠与生物素标记的受体蛋白孵育后，阳性肽珠特异性识别蛋白，标记HRP和磁性链霉亲和素通过识别生物素而识别阳性肽珠。阳性肽珠表面将包覆一层磁珠具有磁性从而被磁场捕获同时由于辣根酶的催化变蓝色。将阳性肽珠转移到微芯片阵列中，滴加溴化氢原位裂解，用MALDI-TOF-MS鉴定通过Mascot数据库解出相应序列信息，如图2(a)和(b)。按序列重新合成阳性多肽部分标记荧光，MALDI-TOF鉴定和HPLC纯化用于后续试验。经化学合成制得本发明的2条多肽分别为：PDP-4和PDP-6。
实验例2 通过表面等离子共振(SPRi)方法检测PDP-4和PDP-6多肽与PD-L1蛋白的亲和作用
将1mg/mL的PDP-4和PDP-6多肽及1×PBS点到芯片上，在4℃湿润条件下孵育过夜，然后用10×PBS清洗10min，再用1×PBS清洗10min，最后用去离子水清洗2次，每次10min，浸入含5％牛奶的1×PBS中，4℃条件下孵育过夜，然后用10×PBS清洗10min，1×PBS清洗10min，最后用去离子水清洗2次，每次10min，用氮气吹干，装芯片上机(Plexera
Figure BDA0001327311790000101
HT表面等离子共振成像系统)。
流动相依次通过1×PBS、2×PBS、0.78μg/mL、1.56μg/mL、3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL和25μg/mL的人PD-L1纯化蛋白，记录分析SPRi信号。
由图3(a)-(b)可以看出，PDP-4和PDP-6的SPRi信号随着蛋白浓度的增加逐渐增强，说明本发明的PDP-4和PDP-6多肽对PD-L1都有强结合的，而且达到109M，接近抗体的亲和力。可以作为探针靶向表达PD-L1的多种肿瘤细胞，用于相关的研究应用。
实验例3 PDP-4和PDP-6分别与PD-L1高表达细胞H1975和HCCC9810及正常细胞293T的相互作用
非小细胞肺癌细胞系NCI-H1975和胆管癌细胞系HCCC 9810用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基培养和正常人肾纤维母细胞293T培养在含10％胎牛血清的DMEM培养液中，以1×105/mL的细胞浓度植入圆形玻底培养皿(35mm)，37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h后，弃去培养液，三种细胞中分别加入含1μmol/L Hoechst 33342和2μL Alexa Fluor647-anti-PD-L1抗体，4℃避光孵育30min后，用预冷1×PBS洗涤2次，分别加入50μmol/L的Alexa Fluor 546标记PDP-4和PDP-6多肽，4℃避光孵育20min后，用预冷1×PBS洗涤3次。用激光扫描共聚焦显微镜(ZEISS LSM 710)检测细胞中的荧光分布。
结果如图4和图5所示，加入PDP-4和PDP-6的NCI-H1975和HCCC 9810细胞观测到有很强绿色荧光，而293T没有的荧光。同时Alexa Fluor 647标记的PD-L1抗体进行细胞膜上蛋白表达定位，结果表明PDP-4和PDP-6多肽结合在阳性细胞的细胞膜上，抗体定位显示与PD-L1表达部位相同。说明PDP-4和PDP-6多肽与人PD-L1阳性乳腺癌细胞系的识别是具有专一性的，是靶向PD-L1蛋白的，而且特异性与靶标蛋白的表达量呈正相关，可以作为靶向分子用于相关的诊断和检测。相反，PDP-4和PDP-6多肽对无PD-L1表达的阴性细胞293T没有观测到绿色荧光信号和抗体信号，由此进一步说明它们是特异性的靶向PD-L1，也进一步验证了图3中的SPRi数据的可靠性。
综上所述，从实验例1-3可以得出，本发明的多肽具有靶向表达PD-L1阳性肿瘤细胞的特性，因而在实际应用中，可以将本发明的多肽作为靶向多肽，与能杀伤癌细胞的制剂相缀合或混合，用于肿瘤的靶向治疗和成像，免疫治疗反应标志物的检测。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 国家纳米科学中心
<120> 一种肿瘤免疫治疗预测生物标志物PD-L1靶向多肽及其应用
<130> KHP171113685.3
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Asp Phe Arg Arg Thr Lys Gly Arg Thr Lys Asp Cys
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
His Phe Arg Tyr Asn Asp Ala Ile Ile Lys Asp Cys
1 5 10

Claims (15)

1.一种肿瘤免疫治疗预测生物标志物PD-L1靶向多肽，其特征在于，
其氨基酸序列为DFRRTKGRTKDC 或HFRYNDAIIKDC。
2.一种编码如权利要求1所述多肽的核酸。
3.一种表达载体，其特征在于，其含有至少一个拷贝的如权利要求2所述的核酸。
4.一种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求3所述的表达载体。
5.由权利要求1所述的多肽形成的二价体或多价体，其特征在于，所述的二价体或多价体具有靶向PD-L1阳性肿瘤细胞的特性。
6.根据权利要求5所述的二价体或多价体，其特征在于，其是通过连接分子共价连接形成的；或是通过与多聚体混合、非共价连接形成的。
7.根据权利要求6所述的二价体或多价体，其特征在于，所述的连接分子为6-叔丁氧羰肼基烟酸、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺；所述多聚体为聚乙二醇、聚乙烯醇、环糊精、聚酰胺-胺型树枝状高分子、聚乳酸、聚乳酸-乙醇胺中的任意一种或至少两种的组合。
8.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的多肽或权利要求5-7任一项所述的二价体或多价体；以及能杀伤癌细胞的制剂；
所述的制剂为能杀伤癌细胞的化学药物、生物药物、纳米药物、放射性药物、光热治疗或光动力治疗药物或包裹这些药物的载体中的任意一种。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述的制剂为烷化剂、抗代谢药物、抗肿瘤天然药物、抗肿瘤抗生素、激素、金属络合物或肿瘤放射靶向标记物中的任意一种。
10.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括与所述的多肽或所述二价体或多价体相缀合或混合可制备靶向药物的载体；所述载体为纳米材料，脂质体或油性化合物中的任意一种。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，所述载体为由多种油性化合物所组成的混合物。
12.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的多肽或权利要求5-7任一项所述的二价体或多价体；以及显像制剂；
所述的多肽、二价体或多价体与显像制剂相缀合或混合；
所述的显像制剂为放射性核素、放射性核素标记物、磁共振造影剂或分子影像制剂中的任意一种。
13.权利要求1所述的多肽或权利要求5-7任一项所述二价体或多价体在制备用于免疫治疗、预防或诊断癌症的靶向药物或显像制剂中的用途。
14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，所述癌症为PD-L1蛋白过表达的所有肿瘤相关的癌症。
15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述癌症为黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌、肝癌、胃癌、食道癌和乳腺癌中的任意一种。
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