CN108997478B - 一种具有免疫检查点拮抗活性的多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有免疫检查点拮抗活性的多肽及其应用，属于生物医药领域。本发明系列多肽分别具有氨基酸序列YRCMISYGGADYKCIT(C‑C)，或其药学上可以接受的盐，更进一步地，所述的多肽序列在上述的序列基础上，一个或多个氨基酸被删除、置换或添加后仍具有靶向PD‑1作用的多肽，或该多肽药学上可以接受的盐。多肽具体可以特异性识别激活的T表面的PD‑1，介导PD‑L1阳性的细胞的特异性杀伤，同时可以阻止PD‑1/PD‑L1的免疫抑制信号通路，消除免疫抑制作用，从而达到特异性杀灭PD‑L1阳性细胞的作用。

Description

一种具有免疫检查点拮抗活性的多肽及其应用

技术领域

本发明属于生物药物领域，更具体地说，涉及一种具有免疫检查点拮抗活性的多肽及其 应用。

背景技术

PD-1/PD-L1信号通路与肿瘤的免疫逃逸密切相关，是通过免疫抑制治疗肿瘤的重要新靶 点。利用抗PD-1、PD-L1的多肽阻断PD-1/PD-L1信号通路，恢复T细胞的免疫杀伤功能， 能够发挥良好的治疗效果，并且比单抗治疗成本更低，具有很好的应用前景。

整个免疫应答过程中，T细胞激活需要双信号通路介导。首先通过T细胞表面的T细胞 受体TCR特异性识别抗原递呈细胞APC或肿瘤细胞表面的MHC分子抗原肽复合体；其次APC或肿瘤细胞上的共刺激分子与T细胞上的共刺激受体结合，激活或者抑制T淋巴细胞。 T细胞上的共刺激分子主要包括共激活分子4-1BB，CD27，CD28，OX40，ICOS，以及共抑 制分子CTLA4，PD-1。

程序性死亡受体1(Programmed Death 1，PD-1)是主要表达于活化T细胞上的一种重要 的免疫抑制跨膜蛋白，为CD28超家族成员。由268个氨基酸组成的I型跨膜蛋白，定位于 PDCD1基因上，它的结构主要包括胞外免疫球蛋白可变区(IgV)样结构域、疏水的跨膜区以 及胞内区。胞内区包括C端和N端氨基酸残基，含有2个独立的磷酸化作用位点，分别为免疫受体酪氨酸抑制基序(Immunoreceptor tyrosine based inhibitory motif，ITIM)和免疫受体酪 氨酸转换基序(Immunoreceptor tyrosine based switch motif，ITSM)。其最初是在凋亡细胞中筛 选差异表达发现的，具体是从凋亡小鼠T杂交瘤2B4.11克隆出来的。其家族的其他成员如 CTLA-4和BTLA则分别是在细胞毒T淋巴细胞和TH1细胞中筛选差异表达发现的。

PD-1包含两个配体：PD-L1和PD-L2，其在造血细胞和非造血细胞中由促炎症细胞因子 诱导表达，PD-L1也被发现在许多肿瘤细胞中过表达，如黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞 癌等，并且与癌症患者较差的预后有关。结合在肿瘤浸润性的T淋巴细胞高表达的PD-1，指 示高表达的PD-1/PD-L1信号通路介导肿瘤的免疫抑制。这两个配体与PD-1的结合会导致使 细胞阻滞在G0/G1期从而抑制T细胞的增殖，阻碍其分化为浆细胞，并诱导T细胞的凋亡。 这样就避免了T细胞的无限增殖，使其维持动态平衡。这种PD-1/PD-L1信号通路参与的T 细胞负反馈调节作用对抗原的清除以及对维持机体的平衡起到至关重要的作用。因此PD-1 与PD-L1通路的抑制会加速和加强自身免疫。

目前为止，通过抑制PD-1/PD-L1信号通路用于实现肿瘤治疗，也在临床阶段取得了良好 的效果。其中PD-1的抗体比如默克(Merck)的pembrolizumab用于治疗恶性黑色素瘤，百 时美施贵宝(BMS)的nivolumab用于治疗黑色素瘤和肺癌等。先后被FDA获批用于治疗转 移性黑色素瘤，晚期肾细胞癌，霍奇金淋巴瘤，转移性非小细胞肺癌，头颈癌，尿路上皮癌 等，抑制PD-1/PD-L1信号通路在肿瘤免疫治疗上的巨大潜力。

发明概述

定义

如本文所用，术语“一”或“一个”可以表示一个或多个。

如本文所使用的，术语“或”是指“和/或”，除非明确地指示仅替代物或替代物是相互 排斥的，尽管本公开支持指代仅是替代物以及“和/或”的定义。

如本文所用，术语“另一”是指至少第二个或更多个。

如本文所使用的，术语“约”用于指示值包括用于确定值的设备、方法的误差的固有变 化，或存在于研究对象之间的变化。

可使用本治疗方法的癌症包括任何恶性细胞类型，例如在实体瘤或血液肿瘤中发现的那 些。通常，肿瘤是指任何大小的恶性或潜在恶性的赘生物或组织块包括原发性肿瘤和继发性 肿瘤。实体肿瘤是通常不含囊肿或液体的异常组织块或生长。示例性的实体瘤可以包括但不 限于选自以下器官的肿瘤，选自：胰腺、胆囊、结肠、盲肠、胃、脑、头、颈、卵巢、睾丸、 肾、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑素瘤、前列腺和乳腺。示例性的血液肿瘤包括骨髓的肿瘤、T或B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、母细胞瘤、骨髓瘤等。可以使用本文提供的方法治疗 的癌症的其它实例包括但不限于上皮组织癌(carcinoma)、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、白血病、鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌或胃部癌症(包括胃肠癌和胃肠道间质癌)、胰腺癌、胆囊癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液 腺癌、肾癌症或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、多种头颈癌、黑素瘤、浅表性扩散性 黑色素瘤、雀斑恶性黑色素瘤、肢端雀斑样黑色素瘤、结节性黑素瘤、以及B细胞淋巴瘤(包 括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中级/滤泡NHL、中级弥漫性 NHL、高级免疫母细胞NHL、高级淋巴细胞性NHL、高级小型非裂解细胞NHL、大体积NHL、 套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤Waldenstrom氏巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、 急性淋巴细胞白血病(ALL)、毛细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性骨髓性白血病(AML)和慢性 成髓细胞白血病。

癌症可以具体地具有以下组织学类型，但不必局限于此：赘生物，恶性；上皮组织癌； 上皮组织癌，未分化的；巨细胞和梭状细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上 皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；联合肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤息肉中的腺瘤； 腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌肿瘤，恶性；分支肺泡腺癌；乳头状腺癌；发色细 胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸细胞腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡腺癌； 乳头状和滤泡性腺癌；非包囊硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜癌；皮肤附件癌；大汗腺 腺癌；皮脂腺腺癌；盯聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺 癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉 特病，乳腺；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴随鳞状上皮化生；胸腺瘤，恶性；卵巢基质肿瘤， 恶性；泡膜细胞瘤、恶性；颗粒细胞瘤，恶性；成骨细胞瘤，恶性；支持细胞癌；间质细胞 (leydig cell)瘤，恶性；脂质细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳腺外副神经节瘤，恶性； 嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤，恶性黑色素瘤；无色素黑素瘤；浅表扩散性黑色素瘤；巨型色素 痣恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑素瘤；蓝色痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤， 恶性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤； 间质肉瘤；混合肿瘤，恶性；穆勒混合肿瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间质瘤， 恶性；膀胱肿瘤，恶性；叶状肿瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎癌； 畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺瘤，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤、血管内皮瘤， 恶性；卡波西肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管瘤、骨瘤、并发骨肉瘤；软骨肉瘤；软 骨细胞瘤，恶性；间充质软骨肉瘤；骨巨细胞肿瘤；尤因氏瘤；牙源性肿瘤，恶性；成釉细 胞性牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；胶质瘤， 恶性；室管膜瘤、星形细胞瘤；原生质星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶 质母细胞瘤；少突胶质细胞瘤；少突胶质母细胞瘤；原始神经外胚层瘤；小脑肉瘤；神经节 母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅觉神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维 肉瘤；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞肿瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金病；副肉芽肿；恶性淋 巴瘤，小淋巴细胞；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡性；蕈样肉芽肿病； 其它指定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增 生性小肠疾病；白血病；淋巴样白血病；浆细胞白血病；红细胞白血病；淋巴肉瘤细胞白血 病；骨髓性白血病；嗜碱性白血病；嗜酸粒细胞性白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血 病；巨核细胞白血病；骨髓肉瘤和毛细胞白血病。

待治疗的癌症优选地对于PD-L1是阳性的。

发明内容

1.要解决的问题

本发明提供一种具有免疫检查点拮抗活性的多肽及其应用，本发明的多肽作用于PD-1 来抑制PD-1和PD-L1通路，经各种实验模型验证，具有良好的抑瘤效果极具开发前景。

2.技术方案

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种具有免疫检查点拮抗活性的多肽及其应用，其特征在于：具有氨基酸序列YRCMISYGGADYKCIT(C-C)或其药学上可以接受的盐，或其药学上可以接受的盐。更进一 步地，所述的多肽序列在上述的序列基础上，一个或多个氨基酸被删除、置换或添加后仍具有抗肿瘤作用的多肽，或该多肽药学上可以接受的盐。

上述的多肽在制备预防癌症和/或抑瘤的产品中的应用。

一种预防癌症和/或抑瘤的产品，其活性成分为上述的多肽。

上述产品具体可为药物。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的辅料，所述辅料包括 药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润 滑剂和稳定剂等。

本发明的药物可以制成注射液、干粉针剂、片剂或粒剂等多种形式。上述各种剂型的药 物均可以按照药学领域的常规方法制备。

现阶段临床中免疫检查点抑制剂以单克隆抗体为主，但是抗体在使用过程中存在治疗费 用昂贵等问题。因此，本发明通过计算机三维模拟技术，在对大量传统结构进行解析以及药 理实验基础上，自主设计的多肽结构取具有良好的抑瘤效果。本发明利用三维结构自主设计 出具有全新结构的作用于PD-1的免疫检查点拮抗多肽。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明的多肽结构简单，容易合成、分离和纯化，有效抑制PD-1/PD-L1通路，消除免疫抑制的作用；

(2)本发明的多肽不良反应和毒副性反应弱；

(3)本发明涉及的多肽消除免疫抑制效果在体内外模型中表现良好，具体效果为显著提 高T细胞的活性，使其消除免疫抑制的作用，阻止肿瘤细胞的逃逸进而产生抑瘤效果。

附图说明

图1流式细胞仪检测T细胞与FITC-抗PD-1多肽的结合。图中，A为阴性对照，B、C、D为T细胞与15nM，150nM，1.5μM的FITC偶联的抗PD-1多肽的结合率。分别是24.2％， 48.1％和71.8％。

图2图A为细胞膜，图B为FITC-抗PD-1多肽，图C为Merge后的图。

图3共孵育体系中的IFN-γ的分泌其中G1组为T细胞，G2组为共孵育比例为100∶1，G3 组为共孵育比例为80∶1，G4组为共孵育比例为60∶1，G5组为共孵育比例为40∶1，G6组为共 孵育比例为20∶1，G7组为共孵育比例是10∶1。与阴性组比，*P＜0.05，**P＜0.01，***p＜0.001。 通过荧光显微镜法再次验证了抗PD-1的多肽能与T细胞结合，并且结合在细胞膜表面。

图4共孵育体系中的IL-2的分泌其中G1组为T细胞，G2组为共孵育比例为100∶1，G3组 为共孵育比例为80∶1，G4组为共孵育比例为60∶1，G5组为共孵育比例为40∶1，G6组为共孵 育比例为20∶1，G7组为共孵育比例是10∶1。与阴性组比，*P＜0.05，**P＜0.01，***p＜0.001。 通过荧光显微镜法再次验证了抗PD-1的多肽能与T细胞结合，并且结合在细胞膜表面。

图5共孵育体系中IFN-γ的变化证明了多肽能激活T细胞。G1为对照组，G2为模型组，G3 为100nM抗PD-1多肽，G4为200nM抗PD-1多肽，G5为400nM抗PD-1多肽，G6为 800nM抗PD-1多肽，G7为1.6μM抗PD-1多肽。与模型组比，*P＜0.05，**P＜0.01，***p＜0.001。 模型组与对照组有极显著性差异，说明造模成功。实验组与模型组相比较有极显著性差异说 明多肽能够成功激活共孵育体系中的T细胞。

图6共孵育体系中IL-2的变化证明了多肽能激活T细胞。G1为对照组，G2为模型组，G3 为100nM抗PD-1多肽，G4为200nM抗PD-1多肽，G5为400nM抗PD-1多肽，G6为 800nM抗PD-1多肽，G7为1.6μM抗PD-1多肽。与模型组比，*P＜0.05，**P＜0.01，***p＜0.001。 模型组与对照组有极显著性差异，说明造模成功。实验组与模型组相比较有极显著性差异说 明多肽能够成功激活共孵育体系中的T细胞。

图7共孵育体系中LDH的变化反应多肽对共孵育体系中肿瘤细胞凋亡的影响。G1组为对 照组，G2组为100nM抗PD-1多肽，G3组为200nM抗PD-1多肽，G4组为400nM抗PD-1 多肽，G5组为800nM抗PD-1多肽，G6组为1.6μM抗PD-1多肽。与模型组比，*P＜0.05， **P＜0.01，***p＜0.001。实验组与对照组相比较有显著性差异说明多肽能够促进T细胞对肿 瘤细胞的杀伤作用。

图8生物发光检测抗PD-1多肽对肿瘤细胞生长的抑制作用。第一组为阴性对照组；第二组为 只注射HT-29细胞，同时注射抗PD-1多肽；第三组为同时注射人T细胞和人HT-29细胞之 后，皮下注射抗PD-L1抗体durvalumab(0.1mg/kg)；第四组为同时注射人T细胞和人HT-29 细胞之后，皮下注射抗PD-1多肽(4mg/kg)。由图8可见，当同时注射人T细胞和人HT-29 细胞之后，抗PD-1多肽可以增加人T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，抑制肿瘤生长。第三组注射抗PD-L1抗体durvalumab和第四组注射抗PD-1多肽(4mg/kg)都显著的抑制了小鼠体内HT-29细胞的增殖。

图9肿瘤体积检测抗PD-1多肽对肿瘤细胞生长的抑制作用。

第一组为阴性对照组；第二组为只注射HT-29细胞，同时注射抗PD-1多肽；第三组为同时 注射人T细胞和人HT-29细胞之后，皮下注射抗PD-L1抗体durvalumab(0.1mg/kg)；第四组 为同时注射人T细胞和人HT-29细胞之后，皮下注射抗PD-1多肽(4mg/kg)。由图9可见， 当同时注射人T细胞和人HT-29细胞之后，抗PD-1多肽可以增加人T细胞对肿瘤细胞的杀 伤作用，抑制肿瘤生长。第三组注射抗PD-L1抗体durvalumab和第四组注射抗PD-1多肽(4 mg/kg)都显著的抑制了小鼠体内HT-29细胞的增殖。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下所述，仅是本发明的较佳实施例而 已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员均可能利用上述揭示的技 术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术 实质对以下实施例所做的任何简单修饰或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1

多肽在细胞水平上与靶点的特异性结合的检测实验

本发明涉及的一种具有预防癌症和/或抑瘤活性的多肽，具有氨基酸序列YRCMISYGGADYKCIT(C-C)，或其药学上可以接受的盐。更进一步地，所述的多肽序列在 上述的序列基础上，一个或多个氨基酸被删除、置换或添加后仍具有抗肿瘤作用的多肽，或 该多肽药学上可以接受的盐。

实施例中主要以该多肽为对象，研究其预防癌症和/或抑瘤活性的活性。该多肽本实验室 合成，纯度为95％以上。

流式细胞分析是一种通过激光束激发单个单向流动的粒子，对粒子的散射光和其所携带 荧光标志物进行检测，从而完成快速检测分析单个粒子的多个物理特性和细胞分选的技术。 普遍应用于科学研究及临床医学检验，是当代最先进的细胞定量分析技术。本发明涉及的一 种具有预防癌症和/或抑瘤活性的多肽的主要靶点为PD-1，本研究将设计的抗PD-1的多肽连 接FITC荧光标记物，以细胞与FITC-抗PD-1多肽溶液的结合率反映多肽在细胞水平上与细 胞表面PD-1的结合能力。

1.1实验材料

T细胞，通过提取纯化获得。BSA封闭液，Ficoll试剂，分选磁珠等。

1.2实验仪器

CO₂细胞培养箱、流式细胞仪、磁珠分选架、磁珠分选柱、水平离心机、液氮罐、超净台、小型离心机、电子天平、全自动高压蒸汽灭菌锅、烘箱。

1.3实验方法：

将含有1640培养液的T细胞收集，冰预冷的PBS洗涤两次。加入1ml含1％的BSA溶液，固定于旋转混合仪上，4℃混合30min。避光条件下加入10μl 1mg/ml的FITC-抗PD- L1多肽溶液溶液，固定于旋转混合仪上，黑暗处4℃混合1h。孵育药物完成后，800rpm， 5min离心后弃上清。用冰预冷的PBS洗涤一次。用PBS调节细胞浓度，将样品浓度调至1 ×10⁶cells/ml。每个细胞做3个平行，每个样品准备0.5ml。

使用流式细胞仪检测多肽与PD-1的结合，从左到右依次打开稳压电源、变压器、流式细 胞仪主机、电脑及打印机。打开液流抽屉，向鞘液桶中加入纯净水，直至到达2/3处。将废 液倒掉，加入200ml含10％有效氯浓度的次氯酸钠溶液。将液压阀调到pressurize的位置， 排除液流管路与过滤器之间的气泡。取下样品管，执行PRIME功能两次，1ml PBS，HINGRUN 2min。开始测量并分析样品。测量完成后，将样品支持架左移，真空抽取1ml FAC SClean。再将样品支持架回正，HING RUN 5min。将FACS Clean换成纯净水，样品支 持架左移，真空抽取1ml，样品架回正，HING RUN 10min。按Standby，取下样品管，执 行PRIME功能两次。最后留取1ml纯净水于流式试管中。按Standby，使其工作20min， 是风扇冷却雷射后，关闭流式细胞仪。退出程序，关闭计算机。

实施例2

多肽在细胞水平上与靶点的特异性结合的定性检测实验-荧光成像实验

1.1实验材料

T细胞，通过提取纯化获得。培养条件：采用含10％胎牛血清(FBS)、青霉素(100kU/L)、链霉素(100mg/L)的1640培养液，于37℃、含5％CO₂的培养箱中培养至对数生长期。

1.2实验仪器

CO₂细胞培养箱、单通道移液器、荧光显微镜、倒置显微镜、液氮罐、超净台、小型离心机、电子天平。

1.3实验方法

将T细胞浓度调至1×10⁵cells/ml铺在24孔板上。用冰预冷的PBS洗涤两次。加入1ml含1％的BSA溶液，4℃混合30min。避光条件下加入10μl 1mg/ml的FITC-抗PD-1 多肽溶液，黑暗处4℃混合1h。孵育药物完成后，用冰预冷的PBS洗涤一次。加入Dil染料， 用冰预冷的PBS洗涤两次。

使用荧光显微镜检侧检测多肽与PD-1的结合，固定参数，分别在合适的通道拍摄，叠加 不同通道的荧光图像，判断多肽与PD-1的结合。

实施例3

检测抗PD-1多肽对共孵育体系中细胞因子的影响

1.1实验材料

人结肠癌细胞(HT-29)中国科学院上海细胞库。IFN-γ检测试剂盒以及IL-2检测试剂 盒，Ficoll试剂，分选buffer，IL-2细胞因子，注射器。

1.2实验仪器

水平离心机、酶标仪、磁珠分选柱、磁珠分选器、倒置显微镜、小型离心机、电子天平、 pH计、血球计数板、超净台。

1.3实验方法

HT-29肿瘤细胞株采用含10％胎牛血清(FBS)、青霉素(100kU/L)、链霉素(100mg/L)的DMEM培养液，于37℃、含5％CO2的培养箱中培养至对数生长期。将细胞浓度调整 为所需浓度，接种于96孔板中。于37℃、含5％CO₂的培养箱培养24h。通过共孵育反应来 证明阻断淋巴细胞效应细胞的PD-L1途径所产生的影响。首先筛选最佳孵育比例。从血液中 提取外周血淋巴细胞，进一步提取获得T细胞。同时培养肿瘤细胞，等比稀释设置各个梯度， 37℃细胞培养箱中培养3天。利用筛选好的比例设置三组，分别是对照组，模型组，以及共 孵育情况下加多肽实验组，共孵育3天后从每份培养物中取出细胞上清，测两组组实验组的IFN-γ，IL-2的分泌情况。采用SPSS 19.0(SPSS Inc.Chicago，IL，USA)软件进行统计 分析。结果以mean±SD表示。组间比较采用T检验，*p＜0.05为差异有显著性统计学差异， **p＜0.01，***p＜0.001为差异有极显著性统计学差异。

实施例4

检测抗PD-L1多肽对对共孵育体系中肿瘤细胞凋亡的影响

1.1实验材料

人结肠癌细胞(HT-29)中国科学院上海细胞库。LDH检测试剂盒，分选buffer，IL-2细胞因子。

1.2实验仪器

水平离心机、单通道移液器、酶标仪、磁珠分选架、小型离心机、电子天平、pH计、细胞计数仪、细胞培养箱。

1.3实验方法

HT-29肿瘤细胞株采用含10％胎牛血清(FBS)、青霉素(100kU/L)、链霉素(100mg/L)的DMEM培养液以及1640培养液，于37℃、含5％CO₂的培养箱中培养至对数生长期。 将细胞浓度调整为所需浓度，接种于96孔板中。于37℃、含5％CO₂的培养箱培养24h。利 用共孵育反应来证明阻断淋巴细胞效应细胞的PD-L1途径对肿瘤细胞凋亡所产生的影响。从 血液中提取外周血淋巴细胞，进一步提取获得T细胞。同时培养肿瘤细胞，按照之前筛选出 来的比例将细胞共孵育，37℃细胞培养箱静止培养3天。3天后，将两者共孵育之后测量， 分别是两组对照组，实验组和Triton X阳性组，从每份培养物中取出测两组组实验组的LDH 分泌情况。采用SPSS 19.0(SPSS Inc.Chicago，IL，USA)软件进行统计分析。结果以m ean±SD表示。组间比较采用T检验，*p＜0.05为差异有显著性统计学差异，**p＜0.01，*** p＜0.001为差异有极显著性统计学差异。

实施例5

检测抗PD-1多肽体内对T细胞杀伤肿瘤细胞的活性影响

1.1实验材料

Balb/c裸鼠，抗PD-L1多肽，嘌呤霉素，T细胞分选磁珠，HT-29人结肠癌细胞，IL-2细胞因子、DMEM培养基，卡尺。

1.2实验方法

5-6周的雌性Balb/c裸鼠用于体内试验。HT-29细胞用plvx-pro/荧光素酶慢病毒质粒转染， 并用1μg/ml的嘌呤霉素筛选，建立稳定表达荧光素酶的细胞系。人类外周血T细胞从健康志 愿者血液中分离，首先离心法分离获得人外周血单核细胞层，再利用CD3磁珠分选技术获得 T细胞，为了获得活化的T细胞，要向培养基中加IL-2(20ng/ml)和人T细胞激活剂(CD3/CD28 颗粒，颗粒∶T细胞＝1∶1)。肿瘤细胞培养第5天，人T细胞加入稳定表达荧光素酶的HT-29 细胞中，共培养3天。然后，给每只小鼠皮下注射2×10⁶个HT-29-luc和5×10⁵个人T细胞， 总体积0.1ml，注射部位为小鼠侧面腋下。抗PD-1多肽2(4mg/kg)durvalumab(抗PD-L1 抗体，0.1mg/kg)每两天皮下注射一次。只注射肿瘤细胞，并用抗PD-1多肽2(4mg/kg)处 理的小鼠作为对照组。肿瘤长和宽用卡尺测量，并计算肿瘤体积(肿瘤体积＝1/2×a×b²，a表 示肿瘤的长，b表示肿瘤的宽)。肿瘤大小还可以通过用IVIS Lumina II system(PerkinElmer) 检测肿瘤部位的生物发光来检测，每周检测一次，共检测5次。结果以mean±SD表示。组 间比较采用T检验，p＜0.05为差异有显著性统计学差异，p＜0.01为差异有极显著性统计学 差异。

Claims (4)

1.一种具有免疫检查点PD-1拮抗活性的多肽，其特征在于：所述的多肽为YRCMISYGGADYKCIT(C-C)或其药学上可接受的盐。

2.权利要求1所述的多肽在制备预防或治疗癌症药物中的应用，其中所述的癌症为PD-L1阳性。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的癌症为上皮组织癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、鳞状细胞癌、肺癌、腹膜癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、胆囊癌、、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌、肠癌、肾癌、前列腺癌、外甲状腺癌、头颈癌、黑素瘤、淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。

4.一种预防癌症和/或抑瘤的产品，其活性成分为权利要求1所述的多肽。

Images