CN110669102A - 一种具有免疫检查点拮抗活性的多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种针对人程序性死亡因子配体1(PD‑L1)的具有免疫检查点拮抗活性的多肽及其应用,属于生物医药领域。本发明系列多肽分别具有氨基酸序列1.SNGLSQPV;2.KCAAFSNGLSQPVCD(C‑C),或其药学上可以接受的盐。多肽具体可以特异性识别细胞表面的PD‑L1,介导PD‑L1阳性的细胞的特异性杀伤,同时可以阻止PD‑1/PD‑L1的免疫抑制信号通路,消除肿瘤的免疫抑制作用,从而达到特异性杀伤作用。
Description
技术领域
本发明属于生物药物领域,更具体地说,涉及一系列具有免疫检查点拮抗活性的多肽及其应用。
背景技术
肿瘤免疫治疗分为细胞免疫疗法和免疫检查点抑制剂两种,单抗药物与嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞免疫治疗的效果逐渐获得认可,癌症免疫治疗的概念也越来越深入人心。前者是把患者体内免疫细胞拿到体外进行改造,使其具有对肿瘤细胞更有效、更精准的免疫能力,改造后将其回输肿瘤病人,发挥定向杀伤肿瘤细胞的作用,这种疗法包括LAK、DC、CAR-T、NK、CAR-NK疗法等。免疫检查点(immune Check-point)又称免疫卡控点,目前肿瘤免疫药物治疗的最主要方面是肿瘤免疫检查点抑制剂,而免疫检查点抑制剂则是解除肿瘤对免疫的耐受/屏蔽作用,让免疫细胞重新认识肿瘤细胞,对肿瘤细胞产生攻击。当前的研究主要集中在CTLA-4、PD-1和PD-L1三个分子上。
整个免疫应答过程中,T细胞激活需要双信号通路介导。首先通过T细胞表面的T细胞受体TCR特异性识别抗原递呈细胞APC或肿瘤细胞表面的MHC分子抗原肽复合体;其次APC或肿瘤细胞上的共刺激分子与T细胞上的共刺激受体结合,激活或者抑制T淋巴细胞。T细胞上的共刺激分子主要包括共激活分子4-1BB,CD27,CD28,OX40,ICOS,以及共抑制分子CTLA4,PD-1。程序性死亡受体1(ProgrammedDeath 1,PD-1)是主要表达于活化T细胞上的一种重要的免疫抑制跨膜蛋白,为CD28超家族成员。其最初是在凋亡细胞中筛选差异表达发现的,具体是从凋亡小鼠T杂交瘤2B4.11克隆出来的。其家族的其他成员如CTLA-4和BTLA则分别是在细胞毒T淋巴细胞和TH1细胞中筛选差异表达发现的。
PD-1包含两个配体:PD-L1(又称CD274或B7-H1)和PD-L2(又称CD273或B7-DC)。PD-L1是由290个氨基酸亚基组成的跨膜蛋白,胞外段为两个免疫球蛋白恒定区(IgC)和IgV样结构域,主要表达于成熟的CD4+T细胞、CD8+T细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞、树突状细胞等造血细胞,以及一些非造血细胞,如内皮细胞、胰岛细胞、肥大细胞等的膜表面。PD-L2是由274个氨基酸残基组成的跨膜蛋白,与PD-L1有很高的相似性,但两者也具有一定的差异,如PD-L2的体内组织分布具有局限性,只在巨噬细胞、树突状细胞和一些B细胞亚类的膜表面表达。除了在造血细胞和非造血细胞中由促炎症细胞因子诱导表达,PD-L1也被发现在许多实体瘤中过表达,如黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌等,并且能够增强肿瘤的转移能力、导致患者死亡率增加。结合在肿瘤浸润性的T淋巴细胞高表达的PD-1,指示高表达的PD-1/PD-L1信号通路介导肿瘤的免疫抑制。这两个配体与PD-1的结合会导致PD-1的胞内结构的酪氨酸磷酸化,并招募酪氨酸磷酸酶SHP-2,从而减少TCR信号通路的磷酸化,降低了TCR通路下游的激活信号以及T细胞的活化和增值以及调节性细胞因子的生成,同时,使细胞阻滞在G0/G1期从而抑制T细胞的增殖,阻碍其分化为浆细胞,并诱导T细胞的凋亡。这样就避免了T细胞的无限增殖,使其维持动态平衡。这种PD-1/PD-L1信号通路参与的T细胞负反馈调节作用对抗原的清除以及对维持机体的平衡起到至关重要的作用。因此PD-1与PD-L1通路的抑制会加速和加强自身免疫。
目前为止,通过抑制PD-1/PD-L1信号通路用于实现肿瘤治疗,也在临床阶段取得了良好的效果。PD-L1的抗体有罗氏/基因泰克的atezolizumab、阿斯利康的durvalumab和EMD serono/Pfizer的avelumab。先后被FDA获批用于治疗非小细胞肺癌,膀胱癌,头颈部鳞状细胞癌等。其他在临床研究的包括BMS的BMS936559,国产PD-1的抗体有恒瑞的SHR-1210,百济神州的BGB-A317,泰州君实的JS001等,抑制PD-1/PD-L1信号通路在肿瘤免疫治疗上的巨大潜力。
发明内容
1.要解决的问题
本发明提供一系列具有免疫检查点拮抗活性的多肽及其应用,本发明的多肽作用于PD-L1来抑制PD-1/PD-L1通路,经各种实验模型验证,具有良好的抑瘤效果极具开发前景。
2.技术方案
为了解决上述问题,本发明所采用的技术方案如下:
一种多肽,其特征在于:所述的多肽序列在SNGLSQPV的序列基础上,一个或多个氨基酸被删除、置换或添加后仍具有靶向PD-L1作用的多肽,或该多肽药学上可以接受的盐。
所述的一种多肽,其特征在于:所述的多肽含有氨基酸序列为x-SNGLSQPV-y所示或其药学上可接受的盐,其中x或y是1个以上任意氨基酸,或x缺失,或y缺失。
所述的多肽,其特征在于:所得多肽的氨基酸序列为:
SNGLSQPV或其药学上可接受的盐;或KCAAFSNGLSQPVCD(C-C)(为环肽,通过C-C连接),或其药学上可以接受的盐。
所述的多肽在制备预防或治疗癌症药物中的应用。
所述的应用,其特征在于:所述的应用通过所述的多肽与PD-L1特异性结合而实现。
所述的应用,其特征在于所述癌症为肾细胞癌、卵巢癌、头颈癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、尿路上皮癌、肝癌、淋巴瘤、骨肉瘤、脑瘤、膀胱癌、胰腺癌、宫颈癌、骨髓瘤、甲状腺癌、胆囊癌、唾液腺癌、睾丸癌或黑色素瘤。
一种复合物,其特征在于所述多肽中还可以加入一种以上得药学上可接受的辅料,所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂和稳定剂。
所述的复合物,其特征在于所述的复合物制成注射液、干粉针剂、药丸、胶囊或鼻喷剂。现阶段临床中免疫检查点抑制剂以单克隆抗体为主,但是抗体在使用过程中存在治疗费用昂贵等问题。因此,本发明通过计算机三维模拟技术,在对大量传统结构进行解析以及药理实验基础上,自主设计的多肽结构取具有良好的抑瘤效果。本发明利用三维结构自主设计出具有全新结构的作用于PD-L1的免疫检查点拮抗多肽。
3.有益效果
本发明的多肽是全新序列,有效抑制PD-1/PD-L1通路,消除免疫抑制的作用;具体来说本发明涉及的多肽消除免疫抑制效果在体内外模型中表现良好,具体效果为显著提高T细胞的活性,使其消除免疫抑制的作用,阻止肿瘤细胞的逃逸进而产生抑瘤效果;本发明的多肽不良反应和毒副性反应弱;此外其结构简单,容易合成、分离和纯化。
附图说明
图1流式细胞仪检测HT-29与FITC-抗PD-L1多肽的结合;A:阴性对照;B:15nM多肽;C:150nM多肽;D:1.5μM多肽;
图2荧光显微镜检测HT-29与FITC-抗PD-L1多肽的结合;
图3共孵育体系中的IFN-γ的分泌;G1:T细胞;G2:共孵育比例为100:1;G3:共孵育比例为80:1;G4:共孵育比例为60:1;G5:共孵育比例为40:1;G6:共孵育比例为20:1;G7:共孵育比例是10:1;与阴性组比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;
图4.共孵育体系中的IL-2的分泌;G1:T细胞;G2:共孵育比例为100:1;G3:共孵育比例为80:1;G4:共孵育比例为60:1;G5:共孵育比例为40:1;G6:共孵育比例为20:1;G7:共孵育比例是10:1。与阴性组比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
图5多肽对共孵育体系中的IFN-γ的影响;G1:对照组;G2:100nM抗PD-L1多肽;G3:200nM抗PD-L1多肽;G4:400nM抗PD-L1多肽;G5:800nM抗PD-L1多肽;G6:1.6μΜ抗PD-L1多肽。与模型组比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;
图6多肽对共孵育体系中的IL-2的影响;G1:对照组;G2:100nM抗PD-L1多肽;G3:200nM抗PD-L1多肽;G4:400nM抗PD-L1多肽;G5:800nM抗PD-L1多肽;G6:1.6μΜ抗PD-L1多肽。与模型组比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
图7生物发光检测抗PD-L1多肽对肿瘤细胞生长的抑制作用;第一组为阴性对照组;第二组为只注射HT-29细胞,同时注射抗PD-L1多肽;第三组为同时注射人T细胞和人HT-29细胞之后,皮下注射抗PD-L1抗体durvalumab(0.1mg/kg);第四组为同时注射人T细胞和人HT-29细胞之后,皮下注射抗PD-L1多肽(4mg/kg)。
图8通过肿瘤体积检测抗PD-L1多肽对肿瘤细胞生长的抑制作用;第一组为阴性对照组;第二组为只注射HT-29细胞,同时注射抗PD-L1多肽;第三组为同时注射人T细胞和人HT-29细胞之后,皮下注射抗PD-L1抗体durvalumab(0.1mg/kg);第四组为同时注射人T细胞和人HT-29细胞之后,皮下注射抗PD-L1多肽(4mg/kg)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明做其他形式的限制,任何熟悉本专业的技术人员均可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容,依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修饰或等同变化,均落在本发明的保护范围内。
实施例中主要以该多肽(SNGLSQPV)作为对象,研究其预防癌症和/或抑瘤活性的活性。该多肽由吉尔生化(上海)有限公司合成,纯度为95%以上。
实施例1
多肽在细胞水平上与靶点的特异性结合的检测实验
流式细胞分析是一种通过激光束激发单个单向流动的粒子,对粒子的散射光和其所携带荧光标志物进行检测,从而完成快速检测分析单个粒子的多个物理特性和细胞分选的技术。普遍应用于科学研究及临床医学检验,是当代最先进的细胞定量分析技术。本发明涉及的一种具有预防癌症和/或抑瘤活性的多肽的主要靶点为PD-L1,本研究将设计的抗PD-L1的多肽连接FITC荧光标记物,以细胞与FITC-抗PD-L1多肽溶液的结合率反映多肽在细胞水平上与细胞表面PD-L1的结合能力。
1.1实验材料
人结肠癌细胞(HT-29)购自ATCC。抗PD-L1多肽,本实验室自主合成,纯度为95%以上。BSA封闭液。CO2细胞培养箱、流式细胞仪、倒置显微镜、液氮罐、超净台、小型离心机、电子天平、pH计、全自动高压蒸汽灭菌锅、烘箱、超纯水制造仪、数显恒温水浴锅。
1.2实验方法
将HT-29细胞铺入6孔板中,当细胞达到80%的融合度后,消化收集。用冰预冷的PBS洗涤两次。加入1ml含1%的BSA溶液,固定于旋转混合仪上,4℃混合30min。避光条件下加入10μl 1mg/ml的FITC-抗PD-L1多肽溶液,固定于旋转混合仪上,黑暗处4℃混合1h。孵育药物完成后,800rpm,5min离心后弃上清。用冰预冷的PBS洗涤一次。用PBS调节细胞浓度,将样品浓度调至1×106cells/ml。每个细胞做3个平行,每个样品准备0.5ml。
使用流式细胞仪检测多肽与PD-L1的结合,从左到右依次打开稳压电源、变压器、流式细胞仪主机、电脑及打印机。打开液流抽屉,向鞘液桶中加入纯净水,直至到达2/3处。将废液倒掉,加入200ml含10%有效氯浓度的次氯酸钠溶液。将液压阀调到pressurize的位置,排除液流管路与过滤器之间的气泡。取下样品管,执行PRIME功能两次,1ml PBS,HINGRUN 2min。开始测量并分析样品。测量完成后,将样品支持架左移,真空抽取1ml FAC SClean。再将样品支持架回正,HING RUN 5min。将FACS Clean换成纯净水,样品支持架左移,真空抽取1ml,样品架回正,HING RUN 10min。按Standby,取下样品管,执行PRIME功能两次。最后留取1ml纯净水于流式试管中。按Standby,使其工作20min,是风扇冷却雷射后,关闭流式细胞仪。退出程序,关闭计算机。
1.3实验结果
HT-29与FITC偶联的抗PD-L1多肽的结合;见图1,其中A为阴性对照,B、C、D为HT-29与15nM,150nM,1.5μM的FITC偶联的抗PD-L1多肽的结合率。B-D分别是26.3%,58.0%和80.4%。
实施例2
多肽在细胞水平上与靶点的特异性结合的定性检测实验-荧光成像实验
1.1实验材料
人结肠癌细胞(HT-29)购自ATCC。抗PD-L1多肽,本实验室自主合成。Dil染料以及BSA封闭液。
1.2实验仪器
CO2细胞培养箱、单通道移液器、荧光显微镜、超纯水制造仪、倒置显微镜、超净台、电子天平、pH计、全自动高压蒸汽灭菌锅、烘箱。
1.3实验方法
将HT-29细胞铺入25cm2细胞培养瓶中,当细胞达到80%的融合度后,消化收集,将样品浓度调至1×105cells/ml铺在24孔板上。用冰预冷的PBS洗涤两次。加入1ml含1%的BSA溶液,4℃混合30min。避光条件下加入10μL 1mg/ml的FITC-抗PD-L1多肽溶液,黑暗处4℃混合1h。孵育药物完成后,用冰预冷的PBS洗涤一次。加入Dil染料,用冰预冷的PBS洗涤两次。
使用荧光显微镜检测多肽与PD-L1的结合,固定参数,分别在合适的通道拍摄,叠加不同通道的荧光图像,判断多肽与PD-L1的结合。
1.4实验结果
见图2,荧光显微镜检测HT-29与FITC-抗PD-L1多肽的结合,其中A为细胞膜(红色),B为FITC-抗PD-L1多肽(绿色),C为Merge(叠加色黄色),通过荧光显微镜法再次验证了抗PD-L1的多肽能与HT-29细胞结合,并且结合在细胞膜表面。
实施例3
检测抗PD-L1多肽对共孵育体系中细胞因子的影响
1.1实验材料
人结肠癌细胞(HT-29)。IFN-γ检测试剂盒以及IL-2检测试剂盒,Ficoll试剂,分选buff er,IL-2细胞因子,注射器。
1.2实验仪器
水平离心机、酶标仪、磁珠分选柱、磁珠分选器、倒置显微镜、小型离心机、电子天平、pH计、血球计数板、超净台。
1.3实验方法
HT-29肿瘤细胞株采用含10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100kU/L)、链霉素(100mg/L)的DMEM培养液,于37℃、含5%CO2的培养箱中培养至对数生长期。将细胞浓度调整为所需浓度,接种于96孔板中。于37℃、含5%CO2的培养箱培养24h。通过共孵育体系中细胞因子的变化来证明阻断淋巴细胞效应细胞的PD-L1途径所产生的影响。在检测多肽对共孵育体系的影响前需要首先筛选最佳孵育比例。从血液中提取外周血淋巴细胞,进一步提取获得T细胞。同时培养肿瘤细胞,等比稀释设置各个梯度,在37℃细胞培养箱中培养3天。利用筛选好的比例设置三组,分别是对照组,模型组,以及共孵育情况下加多肽实验组,共孵育3天后从每份培养物中取出细胞上清,测两组组实验组的IFN-γ,IL-2的分泌情况。采用SPSS 19.0(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)软件进行统计分析。结果以mean±SD表示。组间比较采用T检验,*P<0.05为差异有显著性统计学差异,**P<0.01,***P<0.001为差异有极显著性统计学差异。
结果:
1.见图3共孵育体系中的IFN-γ的分泌;其中G1:T细胞;G2:共孵育比例为100:1;G3:共孵育比例为80:1;G4:共孵育比例为60:1;G5:共孵育比例为40:1;G6:共孵育比例为20:1;G7:共孵育比例是10:1;与阴性组比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
通过检测共孵育体系中IFN-γ的分泌来筛选共孵育比例,综合考虑下选择共孵育比例是40:1检测多肽活性实验,实验结果具有统计学意义;
2.见图5共孵育体系中的IL-2的分泌,其中G1:T细胞;G2:共孵育比例为100:1;G3:共孵育比例为80:1;G4:共孵育比例为60:1;G5:共孵育比例为40:1;G6:共孵育比例为20:1;G7:共孵育比例是10:1。与阴性组比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;
通过检测共孵育体系中IL-2的分泌来筛选共孵育比例。综合考虑下选择共孵育比例是40:1检测多肽活性实验。实验结果具有统计学意义。
3.见图5多肽对共孵育体系中的IFN-γ的影响;G1:对照组;G2:100nM抗PD-L1多肽;G3:200nM抗PD-L1多肽;G4:400nM抗PD-L1多肽;G5:800nM抗PD-L1多肽;G6:1.6μΜ抗PD-L1多肽。与模型组比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
共孵育体系中IFN-γ的变化证明了多肽能激活T细胞。模型组与对照组有极显著性差异,说明造模成功。实验组与模型组相比较有极显著性差异说明多肽能够成功激活共孵育体系中的T细胞。
4.见图6多肽对共孵育体系中的IL-2的影响;G1:对照组;G2:100nM抗PD-L1多肽;G3:200nM抗PD-L1多肽;G4:400nM抗PD-L1多肽;G5:800nM抗PD-L1多肽;G6:1.6μΜ抗PD-L1多肽。与模型组比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
共孵育体系中IL-2的变化证明了多肽能激活T细胞。模型组与对照组有极显著性差异,说明造模成功。实验组与模型组相比较有极显著性差异说明多肽能够成功激活共孵育体系中的T细胞。
实施例4
检测抗PD-L1多肽对共孵育体系中HT-29细胞凋亡的影响
1.1实验材料
人结肠癌细胞(HT-29)购买自ATCC。LDH检测试剂盒,分选buffer,IL-2细胞因子。
1.2实验仪器
水平离心机、单通道移液器、酶标仪、磁珠分选架、小型离心机、电子天平、pH计、细胞计数仪、细胞培养箱。
1.3实验方法
HT-29肿瘤细胞株采用含10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100kU/L)、链霉素(100mg/L)的DMEM培养液,于37℃、含5%CO2的培养箱中培养至对数生长期。将细胞浓度调整为所需浓度,接种于96孔板中。于37℃、含5%CO2的培养箱培养24h。利用共孵育反应来证明阻断淋巴细胞效应细胞的PD-L1途径对肿瘤细胞凋亡所产生的影响。从血液中提取外周血淋巴细胞,进一步提取获得T细胞。同时培养肿瘤细胞,按照之前筛选出来的比例将细胞共孵育,37℃细胞培养箱静止培养3天。3天后,将两者共孵育之后测量,分别是对照组,实验组和Triton X阳性组,从每份培养物中取出测两组组实验组的LDH分泌情况。采用SP SS 19.0(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)软件进行统计分析。结果以mean±SD表示。组间比较采用T检验,*P<0.05有显著性统计学差异。
1.4实验结果
表1多肽对共孵育体系中的HT-29细胞细胞凋亡的影响
组别 | 剂量 | 细胞毒性(%) |
对照组 | / | 9.48±0.26 |
多肽低剂量组 | 100nM | 16.17±0.38* |
多肽中剂量组 | 400nM | 20.15±0.75* |
多肽高剂量组 | 1.6μΜ | 23.95±0.37* |
注:与对照组比,*P<0.05。
共孵育体系中LDH的变化反应多肽对共孵育体系中HT-29细胞凋亡的影响。实验组与对照组相比较有显著性差异说明多肽能够促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
实施例5
检测抗PD-L1多肽对对共孵育体系中BT474细胞凋亡的影响
1.1实验材料
乳腺癌(BT474)购买自ATCC。LDH检测试剂盒,分选buffer,IL-2细胞因子。
1.2实验仪器
水平离心机、单通道移液器、酶标仪、磁珠分选架、小型离心机、电子天平、pH计、细胞计数仪、细胞培养箱。
1.3实验方法
BT474肿瘤细胞株采用含10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100kU/L)、链霉素(100mg/L)的1640培养液,于37℃、含5%CO2的培养箱中培养至对数生长期。将细胞浓度调整为所需浓度,接种于96孔板中。于37℃、含5%CO2的培养箱培养24h。利用共孵育反应来证明阻断淋巴细胞效应细胞的PD-1/PD-L1途径对肿瘤细胞凋亡所产生的影响。从血液中提取外周血淋巴细胞,进一步提取获得T细胞。同时培养肿瘤细胞,按照之前筛选出来的比例将细胞共孵育,37℃细胞培养箱静止培养3天。3天后,将两者共孵育之后测量,分别是对照组,实验组和Triton X阳性组,从每份培养物中取出测两组组实验组的LDH分泌情况。采用SP SS 19.0(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)软件进行统计分析。结果以mean±SD表示。组间比较采用T检验,*P<0.05有显著性统计学差异。
1.4实验结果
表2多肽对共孵育体系中的BT474细胞细胞凋亡的影响
组别 | 剂量 | 细胞毒性(%) |
对照组 | / | 11.53±0.27 |
多肽低剂量组 | 100nM | 14.27±0.18* |
多肽中剂量组 | 400nM | 17.95±0.85* |
多肽高剂量组 | 1.6μΜ | 19.76±0.16* |
注:与对照组比,*P<0.05。
共孵育体系中LDH的变化反应多肽对共孵育体系中BT474细胞凋亡的影响。实验组与对照组相比较有显著性差异说明多肽能够促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
实施例6
检测抗PD-L1多肽对共孵育体系中SKmel100细胞凋亡的影响
1.1实验材料
黑色素瘤细胞(SKmel100)购买自ATCC。LDH检测试剂盒,分选buffer,IL-2细胞因子。
1.2实验仪器
水平离心机、单通道移液器、酶标仪、磁珠分选架、小型离心机、电子天平、pH计、细胞计数仪、细胞培养箱。
1.3实验方法
BT474肿瘤细胞株采用含10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100kU/L)、链霉素(100mg/L)的DMEM培养液,于37℃、含5%CO2的培养箱中培养至对数生长期。将细胞浓度调整为所需浓度,接种于96孔板中。于37℃、含5%CO2的培养箱培养24h。利用共孵育反应来证明阻断淋巴细胞效应细胞的PD-1/PD-L1途径对肿瘤细胞凋亡所产生的影响。从血液中提取外周血淋巴细胞,进一步提取获得T细胞。同时培养肿瘤细胞,按照之前筛选出来的比例将细胞共孵育,37℃细胞培养箱静止培养3天。3天后,将两者共孵育之后测量,分别是对照组,实验组和Triton X阳性组,从每份培养物中取出测两组组实验组的LDH分泌情况。采用SPSS 19.0(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)软件进行统计分析。结果以mean±SD表示。组间比较采用T检验,*P<0.05有显著性统计学差异。
1.4实验结果
表3多肽对共孵育体系中的SKmel 100细胞细胞凋亡的影响
注:与对照组比,*P<0.05。
共孵育体系中LDH的变化反应多肽对共孵育体系中SKmel100细胞凋亡的影响。实验组与对照组相比较有显著性差异说明多肽能够促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
实施例7
检测抗PD-L1多肽对共孵育体系中769-P细胞凋亡的影响
1.1实验材料
肾细胞癌(769-P)购买自ATCC。LDH检测试剂盒,分选buffer,IL-2细胞因子。
1.2实验仪器
水平离心机、单通道移液器、酶标仪、磁珠分选架、小型离心机、电子天平、pH计、细胞计数仪、细胞培养箱。
1.3实验方法
BT474肿瘤细胞株采用含10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100kU/L)、链霉素(100mg/L)的DMEM培养液,于37℃、含5%CO2的培养箱中培养至对数生长期。将细胞浓度调整为所需浓度,接种于96孔板中。于37℃、含5%CO2的培养箱培养24h。利用共孵育反应来证明阻断淋巴细胞效应细胞的PD-1/PD-L1途径对肿瘤细胞凋亡所产生的影响。从血液中提取外周血淋巴细胞,进一步提取获得T细胞。同时培养肿瘤细胞,按照之前筛选出来的比例将细胞共孵育,37℃细胞培养箱静止培养3天。3天后,将两者共孵育之后测量,分别是对照组,实验组和Triton X阳性组,从每份培养物中取出测两组组实验组的LDH分泌情况。采用SPSS 19.0(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)软件进行统计分析。结果以mean±SD表示。组间比较采用T检验,*P<0.05有显著性统计学差异。
1.4实验结果
表4多肽对共孵育体系中的769-P细胞细胞凋亡的影响
组别 | 剂量 | 细胞毒性(%) |
对照组 | / | 15.21±0.33 |
多肽低剂量组 | 100nM | 20.76±0.57* |
多肽中剂量组 | 400nM | 23.45±0.54* |
多肽高剂量组 | 1.6μΜ | 26.77±0.27* |
注:与对照组比,*P<0.05。
共孵育体系中LDH的变化反应多肽对共孵育体系中769-P细胞凋亡的影响。实验组与对照组相比较有显著性差异说明多肽能够促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
实施例8
检测抗PD-L1多肽对共孵育体系中H1299细胞凋亡的影响
1.1实验材料
非小细胞肺癌(H1299)购买自ATCC。LDH检测试剂盒,分选buffer,IL-2细胞因子。
1.2实验仪器
水平离心机、单通道移液器、酶标仪、磁珠分选架、小型离心机、电子天平、pH计、细胞计数仪、细胞培养箱。
1.3实验方法
H1299肿瘤细胞株采用含10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100kU/L)、链霉素(100mg/L)的DMEM培养液,于37℃、含5%CO2的培养箱中培养至对数生长期。将细胞浓度调整为所需浓度,接种于96孔板中。于37℃、含5%CO2的培养箱培养24h。利用共孵育反应来证明阻断淋巴细胞效应细胞的PD-1/PD-L1途径对肿瘤细胞凋亡所产生的影响。从血液中提取外周血淋巴细胞,进一步提取获得T细胞。同时培养肿瘤细胞,按照之前筛选出来的比例将细胞共孵育,37℃细胞培养箱静止培养3天。3天后,将两者共孵育之后测量,分别是对照组,实验组和Triton X阳性组,从每份培养物中取出测两组组实验组的LDH分泌情况。采用SPSS 19.0(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)软件进行统计分析。结果以mean±SD表示。组间比较采用T检验,*P<0.05有显著性统计学差异。
1.4实验结果
表5多肽对共孵育体系中的H1299细胞细胞凋亡的影响
组别 | 剂量 | 细胞毒性(%) |
对照组 | / | 6.34±0.15 |
多肽低剂量组 | 100nM | 14.27±0.42* |
多肽中剂量组 | 400nM | 22.18±0.27* |
多肽高剂量组 | 1.6μΜ | 25.32±0.95* |
注:与对照组比,*P<0.05。
共孵育体系中LDH的变化反应多肽对共孵育体系中H1299细胞凋亡的影响。实验组与对照组相比较有显著性差异说明多肽能够促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
实施例9
检测抗PD-L1多肽对共孵育体系中A2740细胞凋亡的影响
1.1实验材料
卵巢癌(A2780)购买自ATCC。LDH检测试剂盒,分选buffer,IL-2细胞因子。
1.2实验仪器
水平离心机、单通道移液器、酶标仪、磁珠分选架、小型离心机、电子天平、pH计、细胞计数仪、细胞培养箱。
1.3实验方法
H1299肿瘤细胞株采用含10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100kU/L)、链霉素(100mg/L)的DMEM培养液,于37℃、含5%CO2的培养箱中培养至对数生长期。将细胞浓度调整为所需浓度,接种于96孔板中。于37℃、含5%CO2的培养箱培养24h。利用共孵育反应来证明阻断淋巴细胞效应细胞的PD-1/PD-L1途径对肿瘤细胞凋亡所产生的影响。从血液中提取外周血淋巴细胞,进一步提取获得T细胞。同时培养肿瘤细胞,按照之前筛选出来的比例将细胞共孵育,37℃细胞培养箱静止培养3天。3天后,将两者共孵育之后测量,分别是对照组,实验组和Triton X阳性组,从每份培养物中取出测两组组实验组的LDH分泌情况。采用SPSS 19.0(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)软件进行统计分析。结果以mean±SD表示。组间比较采用T检验,*P<0.05有显著性统计学差异。
1.4实验结果
表6多肽对共孵育体系中的A2740细胞细胞凋亡的影响
组别 | 剂量 | 细胞毒性(%) |
对照组 | / | 5.18±0.28 |
多肽低剂量组 | 100nM | 12.67±0.47* |
多肽中剂量组 | 400nM | 15.10±0.16* |
多肽高剂量组 | 1.6μΜ | 18.14±0.08* |
注:与对照组比,*P<0.05。
共孵育体系中LDH的变化反应多肽对共孵育体系中A2780细胞凋亡的影响。实验组与对照组相比较有显著性差异说明多肽能够促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
实施例10
检测抗PD-L1多肽对共孵育体系中DU-145细胞凋亡的影响
1.1实验材料
前列腺癌(DU-145)购买自ATCC。LDH检测试剂盒,分选buffer,IL-2细胞因子。
1.2实验仪器
水平离心机、单通道移液器、酶标仪、磁珠分选架、小型离心机、电子天平、pH计、细胞计数仪、细胞培养箱。
1.3实验方法
DU-145肿瘤细胞株采用含10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100kU/L)、链霉素(100mg/L)的1640培养液,于37℃、含5%CO2的培养箱中培养至对数生长期。将细胞浓度调整为所需浓度,接种于96孔板中。于37℃、含5%CO2的培养箱培养24h。利用共孵育反应来证明阻断淋巴细胞效应细胞的PD-1/PD-L1途径对肿瘤细胞凋亡所产生的影响。从血液中提取外周血淋巴细胞,进一步提取获得T细胞。同时培养肿瘤细胞,按照之前筛选出来的比例将细胞共孵育37℃细胞培养箱静止培养3天。3天后,将两者共孵育之后测量,分别是对照组,实验组和Triton X阳性组,从每份培养物中取出测两组组实验组的LDH分泌情况。采用SP SS 19.0(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)软件进行统计分析。结果以mean±SD表示。组间比较采用T检验,*P<0.05有显著性统计学差异。
1.4实验结果
表7多肽对共孵育体系中的DU-145细胞细胞凋亡的影响
组别 | 剂量 | 细胞毒性(%) |
对照组 | / | 14.04±0.52 |
多肽低剂量组 | 100nM | 24.17±0.37* |
多肽中剂量组 | 400nM | 30.02±0.62* |
多肽高剂量组 | 1.6μΜ | 35.59±0.41* |
注:与对照组比,*P<0.05。
共孵育体系中LDH的变化反应多肽对共孵育体系中DU-145细胞凋亡的影响。实验组与对照组相比较有显著性差异说明多肽能够促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
实施例11
检测抗PD-L1多肽对共孵育体系中SCC-4细胞凋亡的影响
1.1实验材料
头颈鳞癌中的口腔鳞状细胞癌(SCC-4)购买自ATCC。LDH检测试剂盒,分选buffer,IL-2细胞因子。
1.2实验仪器
水平离心机、单通道移液器、酶标仪、磁珠分选架、小型离心机、电子天平、pH计、细胞计数仪、细胞培养箱。
1.3实验方法
SCC-4肿瘤细胞株采用含10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100kU/L)、链霉素(100mg/L)的1640培养液,于37℃、含5%CO2的培养箱中培养至对数生长期。将细胞浓度调整为所需浓度,接种于96孔板中。于37℃、含5%CO2的培养箱培养24h。利用共孵育反应来证明阻断淋巴细胞效应细胞的PD-1/PD-L1途径对肿瘤细胞凋亡所产生的影响。从血液中提取外周血淋巴细胞,进一步提取获得T细胞。同时培养肿瘤细胞,按照之前筛选出来的比例将细胞共孵育,37℃细胞培养箱静止培养3天。3天后,将两者共孵育之后测量,分别是对照组,实验组和Triton X阳性组,从每份培养物中取出测两组组实验组的LDH分泌情况。采用SP SS 19.0(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)软件进行统计分析。结果以mean±SD表示。组间比较采用T检验,*P<0.05有显著性统计学差异。
1.4实验结果
表8多肽对共孵育体系中的SCC-4细胞细胞凋亡的影响
组别 | 剂量 | 细胞毒性(%) |
对照组 | / | 19.26±0.18 |
多肽低剂量组 | 100nM | 26.34±0.28* |
多肽中剂量组 | 400nM | 30.93±0.49* |
多肽高剂量组 | 1.6μΜ | 37.67±1.98* |
注:与对照组比,*P<0.05。
共孵育体系中LDH的变化反应多肽对共孵育体系中SCC-4细胞凋亡的影响。实验组与对照组相比较有显著性差异说明多肽能够促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
实施例12
检测抗PD-L1多肽对共孵育体系中T24细胞凋亡的影响
1.1实验材料
尿路上皮癌中的膀胱癌细胞(T24)购买自ATCC。LDH检测试剂盒,分选buffer,IL-2细胞因子。
1.2实验仪器
水平离心机、单通道移液器、酶标仪、磁珠分选架、小型离心机、电子天平、pH计、细胞计数仪、细胞培养箱。
1.3实验方法
T24肿瘤细胞株采用含10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100kU/L)、链霉素(100mg/L)DMEM培养液,于37℃、含5%CO2的培养箱中培养至对数生长期。将细胞浓度调整为所需浓度,接种于96孔板中。于37℃、含5%CO2的培养箱培养24h。利用共孵育反应来证明阻断淋巴细胞效应细胞的PD-1/PD-L1途径对肿瘤细胞凋亡所产生的影响。从血液中提取外周血淋巴细胞,进一步提取获得T细胞。同时培养肿瘤细胞,按照之前筛选出来的比例将细胞共孵育,37℃细胞培养箱静止培养3天。3天后,将两者共孵育之后测量,分别是对照组,实验组和Triton X阳性组,从每份培养物中取出测两组组实验组的LDH分泌情况。采用SPSS19.0(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)软件进行统计分析。结果以mean±SD表示。组间比较采用T检验,*P<0.05有显著性统计学差异。
1.4实验结果
表9多肽对共孵育体系中的T24细胞细胞凋亡的影响
组别 | 剂量 | 细胞毒性(%) |
对照组 | / | 11.42±0.33 |
多肽低剂量组 | 100nM | 18.94±0.95* |
多肽中剂量组 | 400nM | 22.79±0.75* |
多肽高剂量组 | 1.6μΜ | 27.44±0.05* |
注:与对照组比,*P<0.05。
共孵育体系中LDH的变化反应多肽对共孵育体系中T24细胞凋亡的影响。实验组与对照组相比较有显著性差异说明多肽能够促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
实施例13
检测抗PD-L1多肽对共孵育体系中HepG2细胞凋亡的影响
1.1实验材料
肝癌细胞(HepG2)购买自ATCC。LDH检测试剂盒,分选buffer,IL-2细胞因子。
1.2实验仪器
水平离心机、单通道移液器、酶标仪、磁珠分选架、小型离心机、电子天平、pH计、细胞计数仪、细胞培养箱。
1.3实验方法
HepG2肿瘤细胞株采用含10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100kU/L)、链霉素(100mg/L)DMEM培养液,于37℃、含5%CO2的培养箱中培养至对数生长期。将细胞浓度调整为所需浓度,接种于96孔板中。于37℃、含5%CO2的培养箱培养24h。利用共孵育反应来证明阻断淋巴细胞效应细胞的PD-1/PD-L1途径对肿瘤细胞凋亡所产生的影响。从血液中提取外周血淋巴细胞,进一步提取获得T细胞。同时培养肿瘤细胞,按照之前筛选出来的比例将细胞共孵育,37℃细胞培养箱静止培养3天。3天后,将两者共孵育之后测量,分别是对照组,实验组和Triton X阳性组,从每份培养物中取出测两组组实验组的LDH分泌情况。采用SP SS 19.0(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)软件进行统计分析。结果以mean±SD表示。组间比较采用T检验,*P<0.05有显著性统计学差异。
1.4实验结果
表10多肽对共孵育体系中的HepG2细胞细胞凋亡的影响
注:与对照组比,*P<0.05。
共孵育体系中LDH的变化反应多肽对共孵育体系中HepG2细胞凋亡的影响。实验组与对照组相比较有显著性差异说明多肽能够促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
实施例14
检测抗PD-L1多肽对共孵育体系中L428细胞凋亡的影响
1.1实验材料
淋巴瘤细胞中的霍奇金淋巴瘤细胞(L428)购买自ATCC。LDH检测试剂盒,分选buffer,IL-2细胞因子。
1.2实验仪器
水平离心机、单通道移液器、酶标仪、磁珠分选架、小型离心机、电子天平、pH计、细胞计数仪、细胞培养箱。
1.3实验方法
L428肿瘤细胞株采用含10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100kU/L)、链霉素(100mg/L)DMEM培养液,于37℃、含5%CO2的培养箱中培养至对数生长期。将细胞浓度调整为所需浓度,接种于96孔板中。于37℃、含5%CO2的培养箱培养24h。利用共孵育反应来证明阻断淋巴细胞效应细胞的PD-1/PD-L1途径对肿瘤细胞凋亡所产生的影响。从血液中提取外周血淋巴细胞,进一步提取获得T细胞。同时培养肿瘤细胞,按照之前筛选出来的比例将细胞共孵育,37℃细胞培养箱静止培养3天。3天后,将两者共孵育之后测量,分别是对照组,实验组和Triton X阳性组,从每份培养物中取出测两组组实验组的LDH分泌情况。采用SPSS 19.0(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)软件进行统计分析。结果以mean±SD表示。组间比较采用T检验,*P<0.05有显著性统计学差异。
1.4实验结果
表11多肽对共孵育体系中的L428细胞细胞凋亡的影响
组别 | 剂量 | 细胞毒性(%) |
对照组 | / | 8.63±0.29 |
多肽低剂量组 | 100nM | 13.61±0.45* |
多肽中剂量组 | 400nM | 15.27±0.79* |
多肽高剂量组 | 1.6μΜ | 17.81±1.64* |
注:与对照组比,*P<0.05。
共孵育体系中LDH的变化反应多肽对共孵育体系中L428细胞凋亡的影响。实验组与对照组相比较有显著性差异说明多肽能够促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
实施例15
检测抗PD-L1多肽对共孵育体系中MG63细胞凋亡的影响
1.1实验材料
骨肉瘤细胞(MG63)购买自ATCC。LDH检测试剂盒,分选buffer,IL-2细胞因子。
1.2实验仪器
水平离心机、单通道移液器、酶标仪、磁珠分选架、小型离心机、电子天平、pH计、细胞计数仪、细胞培养箱。
1.3实验方法
MG63肿瘤细胞株采用含10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100kU/L)、链霉素(100mg/L)DMEM培养液,于37℃、含5%CO2的培养箱中培养至对数生长期。将细胞浓度调整为所需浓度,接种于96孔板中。于37℃、含5%CO2的培养箱培养24h。利用共孵育反应来证明阻断淋巴细胞效应细胞的PD-1/PD-L1途径对肿瘤细胞凋亡所产生的影响。从血液中提取外周血淋巴细胞,进一步提取获得T细胞。同时培养肿瘤细胞,按照之前筛选出来的比例将细胞共孵育,37℃细胞培养箱静止培养3天。3天后,将两者共孵育之后测量,分别是对照组,实验组和Triton X阳性组,从每份培养物中取出测两组组实验组的LDH分泌情况。采用SP SS 19.0(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)软件进行统计分析。结果以mean±SD表示。组间比较采用T检验,*P<0.05有显著性统计学差异。
1.4实验结果
表12多肽对共孵育体系中的MG63细胞细胞凋亡的影响
组别 | 剂量 | 细胞毒性(%) |
对照组 | / | 12.48±0.27 |
多肽低剂量组 | 100nM | 17.19±0.95* |
多肽中剂量组 | 400nM | 20.75±1.17* |
多肽高剂量组 | 1.6μΜ | 23.36±3.00* |
注:与对照组比,*P<0.05。
共孵育体系中LDH的变化反应多肽对共孵育体系中MG63细胞凋亡的影响。实验组与对照组相比较有显著性差异说明多肽能够促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
实施例16
检测抗PD-L1多肽对共孵育体系中SF17细胞凋亡的影响
1.1实验材料
脑瘤细胞(SF17)购买自ATCC。LDH检测试剂盒,分选buffer,IL-2细胞因子。
1.2实验仪器
水平离心机、单通道移液器、酶标仪、磁珠分选架、小型离心机、电子天平、pH计、细胞计数仪、细胞培养箱。
1.3实验方法
MG63肿瘤细胞株采用含10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100kU/L)、链霉素(100mg/L)DMEM培养液,于37℃、含5%CO2的培养箱中培养至对数生长期。将细胞浓度调整为所需浓度,接种于96孔板中。于37℃、含5%CO2的培养箱培养24h。利用共孵育反应来证明阻断淋巴细胞效应细胞的PD-1/PD-L1途径对肿瘤细胞凋亡所产生的影响。从血液中提取外周血淋巴细胞,进一步提取获得T细胞。同时培养肿瘤细胞,按照之前筛选出来的比例将细胞共孵育,37℃细胞培养箱静止培养3天。3天后,将两者共孵育之后测量,分别是对照组,实验组和Triton X阳性组,从每份培养物中取出测两组组实验组的LDH分泌情况。采用SPSS 19.0(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)软件进行统计分析。结果以mean±SD表示。组间比较采用T检验,*P<0.05有显著性统计学差异。
1.4实验结果
表13多肽对共孵育体系中的SF17细胞细胞凋亡的影响
组别 | 剂量 | 细胞毒性(%) |
对照组 | / | 6.06±0.95 |
多肽低剂量组 | 100nM | 12.58±1.49* |
多肽中剂量组 | 400nM | 17.29±0.47* |
多肽高剂量组 | 1.6μΜ | 20.24±0.15* |
注:与对照组比,*P<0.05。
共孵育体系中LDH的变化反应多肽对共孵育体系中SF17细胞凋亡的影响。实验组与对照组相比较有显著性差异说明多肽能够促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
实施例17
检测抗PD-L1多肽对共孵育体系中HTB-9细胞凋亡的影响
1.1实验材料
膀胱癌细胞(HTB-9)购买自ATCC。LDH检测试剂盒,分选buffer,IL-2细胞因子。
1.2实验仪器
水平离心机、单通道移液器、酶标仪、磁珠分选架、小型离心机、电子天平、pH计、细胞计数仪、细胞培养箱。
1.3实验方法
HTB-9肿瘤细胞株采用含10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100kU/L)、链霉素(100mg/L)DMEM培养液,于37℃、含5%CO2的培养箱中培养至对数生长期。将细胞浓度调整为所需浓度,接种于96孔板中。于37℃、含5%CO2的培养箱培养24h。利用共孵育反应来证明阻断淋巴细胞效应细胞的PD-1/PD-L1途径对肿瘤细胞凋亡所产生的影响。从血液中提取外周血淋巴细胞,进一步提取获得T细胞。同时培养肿瘤细胞,按照之前筛选出来的比例将细胞共孵育,37℃细胞培养箱静止培养3天。3天后,将两者共孵育之后测量,分别是对照组,实验组和Triton X阳性组,从每份培养物中取出测两组组实验组的LDH分泌情况。采用SPSS 19.0(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)软件进行统计分析。结果以mean±SD表示。组间比较采用T检验,*P<0.05有显著性统计学差异。
1.4实验结果
表14多肽对共孵育体系中的HTB-9细胞细胞凋亡的影响
组别 | 剂量 | 细胞毒性(%) |
对照组 | / | 8.74±0.37 |
多肽低剂量组 | 100nM | 14.62±0.45* |
多肽中剂量组 | 400nM | 16.27±0.29* |
多肽高剂量组 | 1.6μΜ | 20.12±0.31* |
注:与对照组比,*P<0.05。
共孵育体系中LDH的变化反应多肽对共孵育体系中HTB-9细胞凋亡的影响。实验组与对照组相比较有显著性差异说明多肽能够促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
实施例18
检测抗PD-L1多肽对共孵育体系中AsPc1细胞凋亡的影响
1.1实验材料
胰腺癌细胞(AsPc1)购买自ATCC。LDH检测试剂盒,分选buffer,IL-2细胞因子。
1.2实验仪器
水平离心机、单通道移液器、酶标仪、磁珠分选架、小型离心机、电子天平、pH计、细胞计数仪、细胞培养箱。
1.3实验方法
AsPc1肿瘤细胞株采用含10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100kU/L)、链霉素(100mg/L)DMEM培养液,于37℃、含5%CO2的培养箱中培养至对数生长期。将细胞浓度调整为所需浓度,接种于96孔板中。于37℃、含5%CO2的培养箱培养24h。利用共孵育反应来证明阻断淋巴细胞效应细胞的PD-1/PD-L1途径对肿瘤细胞凋亡所产生的影响。从血液中提取外周血淋巴细胞,进一步提取获得T细胞。同时培养肿瘤细胞,按照之前筛选出来的比例将细胞共孵育,37℃细胞培养箱静止培养3天。3天后,将两者共孵育之后测量,分别是对照组,实验组和Triton X阳性组,从每份培养物中取出测两组组实验组的LDH分泌情况。采用SPSS 19.0(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)软件进行统计分析。结果以mean±SD表示。组间比较采用T检验,*P<0.05有显著性统计学差异。
1.4实验结果
表15多肽对共孵育体系中的AsPc1细胞细胞凋亡的影响
组别 | 剂量 | 细胞毒性(%) |
对照组 | / | 15.82±0.47 |
多肽低剂量组 | 100nM | 19.16±0.85* |
多肽中剂量组 | 400nM | 25.61±0.13* |
多肽高剂量组 | 1.6μΜ | 29.44±1.14* |
注:与对照组比,*P<0.05。
共孵育体系中LDH的变化反应多肽对共孵育体系中AsPc1细胞凋亡的影响。实验组与对照组相比较有显著性差异说明多肽能够促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
实施例19
检测抗PD-L1多肽对共孵育体系中MS751细胞凋亡的影响
1.1实验材料
宫颈癌细胞(MS751)购买自ATCC。LDH检测试剂盒,分选buffer,IL-2细胞因子。
1.2实验仪器
水平离心机、单通道移液器、酶标仪、磁珠分选架、小型离心机、电子天平、pH计、细胞计数仪、细胞培养箱。
1.3实验方法
MS751肿瘤细胞株采用含10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100kU/L)、链霉素(100mg/L)DMEM培养液,于37℃、含5%CO2的培养箱中培养至对数生长期。将细胞浓度调整为所需浓度,接种于96孔板中。于37℃、含5%CO2的培养箱培养24h。利用共孵育反应来证明阻断淋巴细胞效应细胞的PD-1/PD-L1途径对肿瘤细胞凋亡所产生的影响。从血液中提取外周血淋巴细胞,进一步提取获得T细胞。同时培养肿瘤细胞,按照之前筛选出来的比例将细胞共孵育,37℃细胞培养箱静止培养3天。3天后,将两者共孵育之后测量,分别是对照组,实验组和Triton X阳性组,从每份培养物中取出测两组组实验组的LDH分泌情况。采用SPSS 19.0(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)软件进行统计分析。结果以mean±SD表示。组间比较采用T检验,*P<0.05有显著性统计学差异。
1.4实验结果
表16多肽对共孵育体系中的MS751细胞细胞凋亡的影响
组别 | 剂量 | 细胞毒性(%) |
对照组 | / | 13.03±1.62 |
多肽低剂量组 | 100nM | 17.59±0.97* |
多肽中剂量组 | 400nM | 21.43±1.12* |
多肽高剂量组 | 1.6μΜ | 24.36±0.49* |
注:与对照组比,*P<0.05。
共孵育体系中LDH的变化反应多肽对共孵育体系中MS751细胞凋亡的影响。实验组与对照组相比较有显著性差异说明多肽能够促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
实施例20
检测抗PD-L1多肽对共孵育体系中U266细胞凋亡的影响
1.1实验材料
骨髓瘤细胞(U266)购买自ATCC。LDH检测试剂盒,分选buffer,IL-2细胞因子。
1.2实验仪器
水平离心机、单通道移液器、酶标仪、磁珠分选架、小型离心机、电子天平、pH计、细胞计数仪、细胞培养箱。
1.3实验方法
U266肿瘤细胞株采用含10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100kU/L)、链霉素(100mg/L)1640培养液,于37℃、含5%CO2的培养箱中培养至对数生长期。将细胞浓度调整为所需浓度,接种于96孔板中。于37℃、含5%CO2的培养箱培养24h。利用共孵育反应来证明阻断淋巴细胞效应细胞的PD-1/PD-L1途径对肿瘤细胞凋亡所产生的影响。从血液中提取外周血淋巴细胞,进一步提取获得T细胞。同时培养肿瘤细胞,按照之前筛选出来的比例将细胞共孵育,37℃细胞培养箱静止培养3天。3天后,将两者共孵育之后测量,分别是对照组,实验组和Triton X阳性组,从每份培养物中取出测两组组实验组的LDH分泌情况。采用SPSS 19.0(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)软件进行统计分析。结果以mean±SD表示。组间比较采用T检验,*P<0.05有显著性统计学差异。
1.4实验结果
表17多肽对共孵育体系中的U266细胞细胞凋亡的影响
注:与对照组比,*P<0.05。
共孵育体系中LDH的变化反应多肽对共孵育体系中U266细胞凋亡的影响。实验组与对照组相比较有显著性差异说明多肽能够促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
实施例21
检测抗PD-L1多肽对共孵育体系中GBC-SD细胞凋亡的影响
1.1实验材料
胆囊癌细胞(GBC-SD)购买自ATCC。LDH检测试剂盒,分选buffer,IL-2细胞因子。
1.2实验仪器
水平离心机、单通道移液器、酶标仪、磁珠分选架、小型离心机、电子天平、pH计、细胞计数仪、细胞培养箱。
1.3实验方法
GBC-SD肿瘤细胞株采用含10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100kU/L)、链霉素(100mg/L)1640培养液,于37℃、含5%CO2的培养箱中培养至对数生长期。将细胞浓度调整为所需浓度,接种于96孔板中。于37℃、含5%CO2的培养箱培养24h。利用共孵育反应来证明阻断淋巴细胞效应细胞的PD-1/PD-L1途径对肿瘤细胞凋亡所产生的影响。从血液中提取外周血淋巴细胞,进一步提取获得T细胞。同时培养肿瘤细胞,按照之前筛选出来的比例将细胞共孵育,37℃细胞培养箱静止培养3天。3天后,将两者共孵育之后测量,分别是对照组,实验组和Triton X阳性组,从每份培养物中取出测两组组实验组的LDH分泌情况。采用SPSS 19.0(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)软件进行统计分析。结果以mean±SD表示。组间比较采用T检验,*P<0.05有显著性统计学差异。
1.4实验结果
表18多肽对共孵育体系中的GBC-SD细胞细胞凋亡的影响
组别 | 剂量 | 细胞毒性(%) |
对照组 | / | 11.75±0.28 |
多肽低剂量组 | 100nM | 16.67±1.71* |
多肽中剂量组 | 400nM | 19.25±1.69* |
多肽高剂量组 | 1.6μΜ | 22.71±0.45* |
注:与对照组比,*P<0.05。
共孵育体系中LDH的变化反应多肽对共孵育体系中GBC-SD细胞凋亡的影响。实验组与对照组相比较有显著性差异说明多肽能够促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
实施例22
检测抗PD-L1多肽对共孵育体系中TPC-1细胞凋亡的影响
1.1实验材料
甲状腺癌细胞(TPC-1)购买自ATCC。LDH检测试剂盒,分选buffer,IL-2细胞因子。
1.2实验仪器
水平离心机、单通道移液器、酶标仪、磁珠分选架、小型离心机、电子天平、pH计、细胞计数仪、细胞培养箱。
1.3实验方法
TPC-1肿瘤细胞株采用含10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100kU/L)、链霉素(100mg/L)1640培养液,于37℃、含5%CO2的培养箱中培养至对数生长期。将细胞浓度调整为所需浓度,接种于96孔板中。于37℃、含5%CO2的培养箱培养24h。利用共孵育反应来证明阻断淋巴细胞效应细胞的PD-1/PD-L1途径对肿瘤细胞凋亡所产生的影响。从血液中提取外周血淋巴细胞,进一步提取获得T细胞。同时培养肿瘤细胞,按照之前筛选出来的比例将细胞共孵育,37℃细胞培养箱静止培养3天。3天后,将两者共孵育之后测量,分别是对照组,实验组和Triton X阳性组,从每份培养物中取出测两组组实验组的LDH分泌情况。采用SPSS 19.0(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)软件进行统计分析。结果以mean±SD表示。组间比较采用T检验,*P<0.05有显著性统计学差异。
1.4实验结果
表19多肽对共孵育体系中的TPC-1细胞细胞凋亡的影响
组别 | 剂量 | 细胞毒性(%) |
对照组 | / | 6.24±0.58 |
多肽低剂量组 | 100nM | 10.59±0.76* |
多肽中剂量组 | 400nM | 15.26±1.03* |
多肽高剂量组 | 1.6μΜ | 20.17±0.37* |
注:与对照组比,*P<0.05。
共孵育体系中LDH的变化反应多肽对共孵育体系中TPC-1细胞凋亡的影响。实验组与对照组相比较有显著性差异说明多肽能够促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
实施例23
检测抗PD-L1多肽对共孵育体系中NTERA-2cl.D1细胞凋亡的影响
1.1实验材料
睾丸癌细胞(NTERA-2cl.D1)购买自ATCC。LDH检测试剂盒,分选buffer,IL-2细胞因子。
1.2实验仪器
水平离心机、单通道移液器、酶标仪、磁珠分选架、小型离心机、电子天平、pH计、细胞计数仪、细胞培养箱。
1.3实验方法
NTERA-2cl.D1肿瘤细胞株采用含10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100kU/L)、链霉素(100mg/L)1640培养液,于37℃、含5%CO2的培养箱中培养至对数生长期。将细胞浓度调整为所需浓度,接种于96孔板中。于37℃、含5%CO2的培养箱培养24h。利用共孵育反应来证明阻断淋巴细胞效应细胞的PD-1/PD-L1途径对肿瘤细胞凋亡所产生的影响。从血液中提取外周血淋巴细胞,进一步提取获得T细胞。同时培养肿瘤细胞,按照之前筛选出来的比例将细胞共孵育,37℃细胞培养箱静止培养3天。3天后,将两者共孵育之后测量,分别是对照组,实验组和Triton X阳性组,从每份培养物中取出测两组组实验组的LDH分泌情况。采用SPSS19.0(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)软件进行统计分析。结果以mean±SD表示。组间比较采用T检验,*P<0.05有显著性统计学差异。
1.4实验结果
表20多肽对共孵育体系中的NTERA-2cl.D1细胞细胞凋亡的影响
组别 | 剂量 | 细胞毒性(%) |
对照组 | / | 10.93±0.74 |
多肽低剂量组 | 100nM | 16.39±1.19* |
多肽中剂量组 | 400nM | 20.78±0.47* |
多肽高剂量组 | 1.6μΜ | 22.07±2.38* |
注:与对照组比,*P<0.05。
共孵育体系中LDH的变化反应多肽对共孵育体系中NTERA-2cl.D1细胞凋亡的影响。实验组与对照组相比较有显著性差异说明多肽能够促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
实施例24
检测抗PD-L1多肽对秀丽线虫的毒性
1.1实验材料
N2野心型秀丽线虫,抗PD-L1多肽,培养皿,多聚胰蛋白胨,琼脂粉,次氯酸钠。
1.2实验方法
培养OP50大肠杆菌,隔天转移至150mL的LB培养基中培养。在OP50大肠杆菌菌液上放置秀丽线虫,室温控制在20℃进行秀丽线虫的同步化,通过裂解成虫及控制营养使幼虫停留在L1期。设置100nM,400nM,1.6μM三个浓度,另外设置durvalumab组和空白组(抗PD-L1抗体,68nM)作为对照。96孔板中每孔先加入50μLOP50大肠杆菌菌液和40只L1期的幼虫(50μL)。空白组加入100μL/孔的M9缓冲液,阳性对照组加入100μL/孔的durvalumab,实验组按照剂量梯度加入100μL/孔的抗PD-L1多肽(100nM,400nM,1.6μM)。每组4个复孔且保证每孔最终体积为200μL。加药处理完成后,首先观察初始状态下每孔线虫数目,记做N0,然后将线虫放置于20℃电热恒温培养箱中进行培养48h,48h结束后记录此时每孔线虫数目Nt。使用SPSS 17.0数理统计软件包进行统计学分析,mean±SD表示。组间比较采用T检验,*P<0.05有显著性统计学差异。
1.3实验结果
表21多肽对秀丽线虫致死率的影响
组别 | 剂量 | 孵化率(%) |
空白对照组 | / | 1.46±0.35 |
durvalumab组 | 68nM | 13.53±0.42 |
多肽低剂量组 | 100nM | 1.69±0.57<sup>#</sup> |
多肽中剂量组 | 400nM | 1.87±0.41<sup>*#</sup> |
多肽高剂量组 | 1.6μΜ | 2.36±0.54<sup>*#</sup> |
注:与空白对照组比,*P<0.05;与durvalumab组相比,#P<0.05。
为了研究抗PD-L1多肽的急性毒性,主要评价秀丽线虫致死率。表21显示,在各浓度下与durvalumab组均有显著性差异。与空白的对照组相比,抗PD-L1多肽仅在1.6μM时才表现出显著性差异。可以推测在实验剂量下,抗PD-L1多肽对秀丽线虫的致死率基本无影响,而durvalumab能对秀丽线虫造成一定的毒性。
实施例25
检测抗PD-L1多肽体内对T细胞杀伤肿瘤细胞的活性影响
1.1实验材料
Balb/c裸鼠,抗PD-L1多肽,嘌呤霉素,T细胞分选磁珠,HT-29人结肠癌细胞,IL-2细胞因子、DMEM培养基,卡尺。
1.2实验方法
5-6周的雌性Balb/c裸鼠用于体内试验。HT-29细胞用plvx-pro/荧光素酶慢病毒质粒转染,并用1μg/ml的嘌呤霉素筛选,建立稳定表达荧光素酶的细胞系。人类外周血T细胞从健康志愿者血液中分离,首先离心法分离获得人外周血单核细胞层,再利用CD3磁珠分选技术获得T细胞,为了获得活化的T细胞,要向培养基中加IL-2(20ng/ml)和人T细胞激活剂(CD3/CD28颗粒,颗粒:T细胞=1:1)。肿瘤细胞培养第5天,人T细胞加入稳定表达荧光素酶的HT-29细胞中,共培养3天。然后,给每只小鼠皮下注射2×106个HT-29-luc和5×105个人T细胞,总体积0.1ml,注射部位为小鼠侧面腋下。抗PD-L1多肽(4mg/kg)、durvalumab(抗PD-L1抗体,0.1mg/kg)每两天皮下注射一次。只注射肿瘤细胞,并用抗PD-L1多肽(4mg/kg)处理的小鼠作为对照组。肿瘤长和宽用卡尺测量,并计算肿瘤体积(肿瘤体积=1/2×a×b2,a表示肿瘤的长,b表示肿瘤的宽)。肿瘤大小还可以通过用IVIS Lumina II system(PerkinElmer)检测肿瘤部位的生物发光来检测,每周检测一次,共检测5次。采用SPSS 19.0(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)软件进行统计分析。结果以mean±SD表示。组间比较采用T检验,*p<0.05为差异有显著性统计学差异,**p<0.01,***p<0.001为差异有极显著性统计学差异。
1.3实验结果
由图7可见,当同时注射人T细胞和人HT-29细胞之后,抗PD-L1多肽可以增加人T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用,抑制肿瘤生长。第三组注射抗PD-L1抗体durvalumab和第四组注射抗PD-L1多肽(4mg/kg)都显著的抑制了小鼠体内HT-29细胞的增殖。
由图8可见,当同时注射人T细胞和人HT-29细胞之后,抗PD-L1多肽可以增加人T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用,抑制肿瘤生长。第三组注射抗PD-L1抗体durvalumab和第四组注射抗PD-L1多肽(4mg/kg)都显著的抑制了小鼠体内HT-29细胞的增殖。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 一种具有免疫检查点拮抗活性的多肽及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
Ser Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val
1 5
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
Lys Cys Ala Ala Phe Ser Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Cys Asp
1 5 10 15
Claims (8)
1.一种多肽,其特征在于:所述的多肽序列在SNGLSQPV的序列基础上,一个或多个氨基酸被删除、置换或添加后仍具有靶向PD-L1作用的多肽,或该多肽药学上可以接受的盐。
2.根据权利要求1所述的一种多肽,其特征在于:所述的多肽含有氨基酸序列为x-SNGLSQPV-y所示或其药学上可接受的盐,其中x或y是1个以上任意氨基酸,或x缺失,或y缺失。
3.根据权利要求2所述的多肽,其特征在于:所得多肽的氨基酸序列为:
SNGLSQPV或其药学上可接受的盐;或KCAAFSNGLSQPVCD(C-C),或其药学上可以接受的盐。
4.权利要求1-3任意一项所述的多肽在制备预防或治疗癌症药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于:所述的应用通过所述的多肽与PD-L1特异性结合而实现。
6.根据权利要求4或5所述的应用,其特征在于所述癌症为肾细胞癌、卵巢癌、头颈癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、尿路上皮癌、肝癌、淋巴瘤、骨肉瘤、脑瘤、膀胱癌、胰腺癌、宫颈癌、骨髓瘤、甲状腺癌、胆囊癌、唾液腺癌、睾丸癌或黑色素瘤。
7.一种复合物,其特征在于权利要求1-3任意一项所述多肽中还可以加入一种以上得药学上可接受的辅料,所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂和稳定剂。
8.根据权利要求7所述的复合物,其特征在于所述的复合物制成注射液、干粉针剂、药丸、胶囊或鼻喷剂。
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