CN113045665B - 一种hvem共刺激信号驱动的caix-car-t细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

一种hvem共刺激信号驱动的caix-car-t细胞及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种HVEM共刺激信号驱动的CAIX‑CAR‑T细胞及其制备方法和应用，本发明提供了一种HVEM共刺激信号驱动的CAIX‑CAR‑T细胞，并通过体外试验和体内试验验证了其对实体瘤的治疗效果，结果表明CAIX‑HVEM‑CAR‑T具有更好的治疗效果，本发明构建的HVEM共刺激信号驱动的CAIX‑CAR‑T细胞为解决CAR‑T治疗实体瘤的瓶颈提供了新的思路，在肿瘤治疗领域具有较好的临床应用前景，尤其是在实体瘤的治疗中。

Description

一种HVEM共刺激信号驱动的CAIX-CAR-T细胞及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体而言，涉及一种HVEM共刺激信号驱动的CAIX-CAR-T细胞及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，肿瘤的免疫治疗取得了重大的进展，有望成为未来肿瘤治疗的主流方向。其中，嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cells，CAR-T)免疫疗法在临床试验中已显示出治疗血液系统恶性肿瘤的重大优势，CAR-T免疫疗法是通过基因工程技术，人工改造肿瘤患者的T细胞，在体外大量培养后生成肿瘤特异性的CAR-T细胞，再将其回输入患者体内用以攻击癌细胞的一种治疗方法，这种方法的核心在于通过构建嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)，将识别肿瘤相关抗原的抗体单链可变区和T细胞的活化基团结合为一体，进而转染自体T细胞，使T细胞具有特异性识别并杀伤肿瘤细胞的能力，将这种经过基因修饰的自体T细胞移植回输至患者体内，就可以特异性地杀伤肿瘤细胞。目前，FDA批准上市的CAR-T药物有两项，包括Novartis公司开发的CAR-T药物Kymriah、KitePharma公司(被Gilead收购)开发的CAR-T药物Yescarta，分别用于治疗急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia，ALL)和非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma，NHL)，这两款CAR-T药物均是靶向CD19。CAR-T免疫疗法已在白血病和淋巴癌的治疗中取得了显著的效果。
然而，CAR-T细胞对包括肾细胞癌(Renal cell carcinoma，RCC)在内的实体瘤的疗效仍然存在局限性和缺乏实质性的进展。其原因是多方面的，包括实体瘤特殊的肿瘤异质性和免疫抑制性微环境等。首先是由于实体瘤致密的细胞外基质影响了CAR-T细胞的归巢，相较于血液肿瘤，实体瘤的这一特性导致了CAR-T细胞很难进入肿瘤内部。其次是因为肿瘤免疫微环境抑制了CAR-T细胞的功能，使CAR-T细胞的增殖和存活受到限制。肿瘤微环境中的免疫抑制因素主要包括：(1)调节性T细胞(Tregs)，髓样来源的抑制细胞(MDSC)和巨噬细胞等免疫抑制细胞；(2)恶性细胞表达的T细胞抑制性受体(CTLA-4，PD-1，LAG-3、TIM-3等)的相关配体。还有一个原因是实体瘤细胞表达抗原的差异性，这大大增加了由于抗原丢失导致的肿瘤免疫逃逸。针对以上这些原因，已有研究报道给出了不同的解决方法，来解决CAR-T治疗实体瘤的局限性，(1)改变CAR-T的给药方式，根据肿瘤生长部位不同给予最佳的给药方式；(2)采取CAR-T与化疗药物联合使用治疗实体瘤，一些化疗药物可以降低肿瘤微环境中免疫抑制性细胞的比例，从而恢复CAR-T细胞的功能；(3)采取CAR-T联合免疫检查点抑制剂；(4)构建靶向多种抗原的CAR-T细胞。以上这些方法都在一定程度上改善了CAR-T细胞治疗实体瘤的效果，但至今仍未见到临床疗效上的突破。
因此，对CAR-T细胞进行进一步的改造，以增强其功能，对于解决本领域所面临的CAR-T治疗实体瘤存在局限性的问题具有重要意义，鉴于此，本发明利用HVEM(Herpesvirusentry mediator)共刺激信号结构域构建靶向CAIX的CAR-T，并通过体外试验和体内试验验证了其对实体瘤的治疗效果。
发明内容
基于目前本领域存在的CAR-T治疗实体瘤存在局限性的技术缺陷，本发明的目的在于提供一种HVEM共刺激信号驱动的CAIX-CAR-T细胞及其制备方法和应用，并通过体外试验和体内试验验证了其对实体瘤的治疗效果，本发明构建的HVEM共刺激信号驱动的CAIX-CAR-T细胞在肿瘤治疗领域具有较好的临床应用前景，尤其是在实体瘤的治疗中。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种抗CAIX单克隆抗体或其抗原结合片段。
进一步，所述抗体或其抗原结合片段包含VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VLCDR2、VL CDR3；其中，
VH CDR1含有SEQ ID NO:5所述的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5具有至少80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；
VH CDR2含有SEQ ID NO:7所述的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7具有至少80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；
VH CDR3含有SEQ ID NO:9所述的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；
VL CDR1含有SEQ ID NO:13所述的氨基酸序列或与SEQ ID NO:13具有至少80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；
VL CDR2含有SEQ ID NO:15所述的氨基酸序列或与SEQ ID NO:15具有至少80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；
VL CDR3含有SEQ ID NO:17所述的氨基酸序列或与SEQ ID NO:17具有至少80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
术语“抗原结合片段”，是指免疫球蛋白分子的一部分，涉及抗原结合。抗原结合位点由重(H)和轻(L)链的N-末端可变(V)区的氨基酸残基形成。在H链和L链的V区内的三个高度不同的区段，称为“高变区”，间插在称为“框架区(FR)”的较保守的侧翼区段之间。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中彼此相对排列，以形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合的抗原的三维表面互补，重链和轻链各自的三个高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。
本发明的第二方面提供了一种靶向CAIX的嵌合抗原受体。
进一步，所述嵌合抗原受体包括本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括跨膜结构域、细胞内信号传导结构域；
更优选地，所述跨膜结构域包括选自下列蛋白质的跨膜区：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD123，CD134，CD137，CD154，PD1；
最优选地，所述跨膜结构域包括CD8的跨膜区；
最优选地，所述CD8的跨膜区包括如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列；
优选地，所述细胞内信号传导结构域包含共刺激结构域；
更优选地，所述共刺激结构域包括选自下列蛋白质的功能性信号传导结构域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、HVEM；
最优选地，所述共刺激结构域包括HVEM的功能性信号传导结构域；
最优选地，所述HVEM的功能性信号传导结构域包括如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；
优选地，所述细胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域；
更优选地，所述初级信号传导结构域包括选自下列蛋白质的功能性信号传导结构域：CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CDS、CD22、CD79a、CD79b、CD66d；
最优选地，所述初级信号传导结构域包括CD3ζ的功能性信号传导结构域；
最优选地，所述CD3ζ的功能性信号传导结构域包括如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；
优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示。
本发明的第三方面提供了一种缀合物。
进一步，所述缀合物包含本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述缀合物还包含连接于所述抗体或其抗原结合片段的修饰部分；
更优选地，所述修饰部分包括可检测的标记或治疗剂；
最优选地，所述可检测的标记包括酶、成像剂、造影剂、荧光染料、发光物质或生物素；
最优选地，所述治疗剂包括具有抗肿瘤活性的药物或细胞毒剂。
进一步，所述酶包括(但不限于)：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶，成像剂包括放射性同位素，造影剂包括(但不限于)：碘、钆、氧化铁，荧光染料包括(但不限于)：黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、修饰的红色荧光蛋白(mRFP)、红色荧光蛋白tdimer2(RFP tdimer2)、HCRED、铕衍生物，发光物质包括N-甲基吖啶鎓(methylacrydium)衍生物。
本发明的第四方面提供了一种核酸分子。
所述核酸分子包含编码本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列，或编码本发明第二方面所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
优选地，所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示。
本发明的第五方面提供了一种载体。
进一步，所述载体包含本发明第四方面所述的核酸分子；
优选地，所述载体选自：DNA载体、RNA载体、质粒、转座子载体、CRISPR/Cas9载体、病毒载体、病毒；
更优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体；
更优选地，所述病毒包括(但不限于)：逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒。
一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。载体还可含有复制起始位点、协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。
本发明的第六方面提供了一种经工程改造的细胞。
进一步，所述细胞包含本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或本发明第二方面所述的嵌合抗原受体，或本发明第三方面所述的缀合物，或本发明第四方面所述的核酸分子，或本发明第五方面所述的载体；
优选地，所述细胞包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞；
优选地，所述细胞包括免疫细胞；
更优选地，所述免疫细胞包括T淋巴细胞、NK细胞，单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞及其任意组合；
最优选地，所述免疫细胞包括T淋巴细胞。
本发明的第七方面提供了一种经工程改造的细胞群体。
进一步，所述细胞群体包含本发明第六方面所述的细胞；
优选地，所述细胞群体进一步包含不包含本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或本发明第二方面所述的嵌合抗原受体，或本发明第三方面所述的缀合物，或本发明第四方面所述的核酸分子，或本发明第五方面所述的载体的细胞；
优选地，所述细胞包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞；
优选地，所述细胞包括免疫细胞；
更优选地，所述免疫细胞包括T淋巴细胞、NK细胞，单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞及其任意组合。
本发明的第八方面提供了一种组合物或试剂盒。
进一步，所述组合物或试剂盒包含本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面所述的嵌合抗原受体、本发明第三方面所述的缀合物、本发明第四方面所述的核酸分子、本发明第五方面所述的载体、本发明第六方面所述的细胞、本发明第七方面所述的细胞群体。
进一步，所述组合物包括药物组合物；
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或辅料；
更优选地，所述药学上可接受的载体和/或辅料在Remington's PharmaceuticalSciences中有详细的记载；
优选地，所述药物组合物还包括另外的药学活性剂；
优选地，所述另外的药学活性剂包括另外的抗体、融合蛋白或药物(如抗癌症药物，如用于放疗的药物或化疗药物)。
本发明的第九方面提供如下任一方面的方法，所述方法包括：
(1)一种制备本发明第六方面所述经工程改造的细胞的方法；
优选地，所述方法包括如下步骤：将本发明第四方面所述的核酸分子或本发明第五方面所述的载体引入到细胞中，得到本发明第六方面所述的经工程改造的细胞；
更优选地，所述细胞包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞；
更优选地，所述细胞包括免疫细胞；
最优选地，所述免疫细胞包括T淋巴细胞、NK细胞，单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞及其任意组合；
最优选地，所述免疫细胞包括T淋巴细胞；
(2)一种检测样品中CAIX的方法；
优选地，所述方法包括如下步骤：将样品与本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段进行接触，检测所述抗体或其抗原结合片段与CAIX的反应；
更优选地，所述抗体或其抗原结合片段附着在固相底物上；
最优选地，所述的固相底物选自：微滴定板、磁颗粒、胶乳颗粒和硝化纤维素膜；
更优选地，所述反应是通过酶显色、荧光、或化学发光进行测定的。
本发明还提供了一种诊断受试者是否患有表达CAIX的癌症的方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：使用本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段检测CAIX在来自所述受试者的样品中的量；
优选地，所述方法还包括：将所述CAIX在来自所述受试者的样品中的量与其在已知标准品或参照样品中的量进行比较，并确定来自所述受试者的样品的CAIX的水平是否落入与癌症相关的CAIX的水平内；
更优选地，所述样品可选自：尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞、组织、组织学制备物；
优选地，所述表达CAIX的癌症包括肺癌、肾癌、宫颈癌、外阴癌、乳腺癌、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、造血系肿瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、皮肤癌、子宫癌、子宫内膜癌、腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肛门癌、肺癌、膀胱癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、原发性或转移性黑色素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、脑癌、血管肉瘤、血管内皮瘤、头颈癌、甲状腺癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、睾丸癌、胃肠道癌以及任何其他现在已知或以后发现的癌症。
本发明还提供了一种用于在受试者中预防和/或治疗癌症的方法。
进一步，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本发明第六方面所述的经工程改造的细胞、本发明第七方面所述的经工程改造的细胞群体，或本发明第八方面所述的药物组合物。
进一步，所述癌症包括(但不限于)：肺癌、肾癌、宫颈癌、外阴癌、乳腺癌、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、造血系肿瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、皮肤癌、子宫癌、子宫内膜癌、腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肛门癌、肺癌、膀胱癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、原发性或转移性黑色素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、脑癌、血管肉瘤、血管内皮瘤、头颈癌、甲状腺癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、睾丸癌、胃肠道癌以及任何其他现在已知或以后发现的癌症。
本发明的第十方面提供了如下任一方面的应用，所述应用包括：
(1)本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段在制备本发明第二方面所述的嵌合抗原受体、本发明第三方面所述的缀合物、本发明第四方面所述的核酸分子、本发明第五方面所述的载体、本发明第六方面所述的细胞、本发明第七方面所述的细胞群体、本发明第八方面所述的组合物或试剂盒中的应用；
(2)本发明第二方面所述的嵌合抗原受体在制备本发明第三方面所述的缀合物、本发明第四方面所述的核酸分子、本发明第五方面所述的载体、本发明第六方面所述的细胞、本发明第七方面所述的细胞群体、本发明第八方面所述的组合物或试剂盒中的应用；
(3)本发明第三方面所述的缀合物在制备本发明第四方面所述的核酸分子、本发明第五方面所述的载体、本发明第六方面所述的细胞、本发明第七方面所述的细胞群体、本发明第八方面所述的组合物或试剂盒中的应用；
(4)本发明第四方面所述的核酸分子在制备本发明第五方面所述的载体、本发明第六方面所述的细胞、本发明第七方面所述的细胞群体、本发明第八方面所述的组合物或试剂盒中的应用；
(5)本发明第五方面所述的载体在本发明第六方面所述的细胞、本发明第七方面所述的细胞群体、本发明第八方面所述的组合物或试剂盒中的应用；
(6)本发明第六方面所述的细胞在制备本发明第七方面所述的细胞群体、本发明第八方面所述的组合物或试剂盒中的应用；
(7)本发明第七方面所述的细胞群体在制备本发明第八方面所述的组合物或试剂盒中的应用；
(8)本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面所述的嵌合抗原受体、本发明第三方面所述的缀合物、本发明第四方面所述的核酸分子、本发明第五方面所述的载体、本发明第六方面所述的细胞、本发明第七方面所述的细胞群体、本发明第八方面所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用；优选地，所述肿瘤包括实体瘤、非实体瘤。
进一步，所述实体瘤包括(但不限于)：胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、皮肤癌、子宫癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、腺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肛门癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、原发性或转移性黑色素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、脑癌、血管肉瘤、血管内皮瘤、头颈癌、甲状腺癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、睾丸癌、胃肠道癌，所述非实体瘤包括(但不限于)：急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、造血系肿瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、急性髓性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤。
进一步，所述肿瘤还包括任何其他现在已知或以后发现的癌症(参见，例如Rosenberg(1996)《医学年鉴》47：481-491，其全部内容通过引用并入本文)；
优选地，所述肿瘤为实体瘤；
更优选地，所述实体瘤为肾癌。
本发明成功构建了一种HVEM共刺激信号驱动的CAIX-CAR-T细胞，通过体外试验验证了其对肾癌细胞的杀伤作用、细胞因子释放能力及代谢功能；通过建立NPG小鼠肾癌肺转移模型及原位肾癌模型，验证了其在体内增殖和存活能力，以及对肺转移肾癌和原位肾癌的治疗效果。
进一步，在本发明的具体实施例中，利用RTCA技术、流式细胞术体外检测在常氧条件和低氧条件下CAR-T细胞对肾癌细胞的杀伤作用，利用ELISA实验检测在常氧条件和低氧条件下CAR-T细胞细胞因子释放，利用Seahorse实验检测CAR-T细胞线粒体呼吸水平。
本发明的优点和有益效果如下：
本发明提供了一种HVEM共刺激信号驱动的CAIX-CAR-T细胞及其制备方法和应用，并通过体外试验和体内试验验证了其对实体瘤的治疗效果，结果表明CAIX-HVEM-CAR-T具有更好的治疗效果，本发明构建的HVEM共刺激信号驱动的CAIX-CAR-T细胞为解决CAR-T治疗实体瘤的瓶颈提供了新的思路，在肿瘤治疗领域具有较好的临床应用前景，尤其是在实体瘤的治疗中。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示CAIX-4-1BB-CAR、CAIX-CD28-CAR、CAIX-HVEM-CAR结构示意图；
图2显示Western blot检测CAR的表达的结果图；
图3显示流式检测CAIX-CAR的阳性率的结果图，其中，A图：Ctrl-T cell，B图：CAIX-4-1BB，C图：CAIX-CD28，D图：CAIX-HVEM；
图4显示流式检测肾癌细胞表面CAIX的表达的结果图，其中，A图：ACHN，B图：Ketr-3，C图：OSRC-2；
图5显示用ELISA方法检测在常氧条件下各靶细胞刺激后各组CAIX-CAR-T细胞释放细胞因子的量的结果图，其中，A图：Ketr-3，B图：OSRC-2，C图：ACHN，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；
图6显示RTCA检测在常氧条件下CAIX-HVEM-CAR-T细胞对肾癌细胞的杀伤作用的结果图，其中，A图：RTCA检测CAIX-HVEM-CAR-T细胞杀伤功能的代表性结果，B图：对RTCA检测第30h时CAR-T细胞杀伤作用的统计分析结果，*P<0.05；**P<0.01；
图7显示流式检测在常氧条件下CAIX-HVEM-CAR-T对肾癌细胞的杀伤效果的结果图，其中，A图：流式检测CAIX-HVEM-CAR-T对肾癌细胞杀伤作用代表图，B图：对A图的统计分析结果，*P<0.05；**P<0.01；
图8显示用ELISA方法检测在低氧条件下CAIX-HVEM-CAR-T细胞释放细胞因子的量的结果图，其中，A图：OSRC-2，B图：Ketr-3，C图：ACHN，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；
图9显示RTCA检测在低氧条件下CAIX-HVEM-CAR-T对肾癌细胞的杀伤效果的结果图，其中，A图：CAIX-HVEM-CAR-T细胞对肾癌细胞的杀伤曲线，B图：对A图中RTCA检测终点细胞指数的统计分析结果，*P<0.05；**P<0.01；
图10显示流式检测在低氧条件下CAIX-HVEM-CAR-T对肾癌细胞的杀伤效果的结果图，其中，A图：流式检测结果代表图，CD45+CD3+为CAR-T细胞，CD45—CD3—为靶细胞，B图：对A图中靶细胞比例进行统计分析的结果，*P<0.05；**P<0.01；
图11显示Seahorse检测CAR-T细胞呼吸能力的结果图，其中，A图：细胞呼吸能力曲线图，B图：基础OCR值统计结果，C图：最大OCR统计结果，*P<0.05；**P<0.01；
图12显示CAR-T细胞对肾癌肺转移瘤小鼠的治疗效果结果图，其中，A图：流式细胞术检测T细胞存活情况代表图，B图：对A图的统计结果，C图：生存期统计结果，*P<0.05，***P<0.001；
图13显示CAR-T治疗后小鼠肺脏大体标本及肺组织切片HE染色的结果图，其中，A图：Untreated，B图：Ctrl-T cell，C图：CAIX-4-1BB，D图：CAIX-HVEM；
图14显示CAR-T治疗后对小鼠原位肾癌影响的结果图，其中，A图：接种肿瘤后14，18，22，26，30，34天对小鼠进行活体成像拍照结果，B图：对A图结果中的平均荧光强度进行统计；
图15显示CAR-T细胞对原位肾癌小鼠的治疗效果的结果图，其中，A图：流式细胞术检测T细胞存活情况代表图，B图：对A图的统计结果，C图：生存期统计结果，*P<0.05，***P<0.001。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1 CAR-T细胞的制备
1、CAR表达质粒的构建
在CAIX(5C9B7)-HVEM-CAR编码DNA序列的5’端依次加上限制性酶切位点Nde I(CATATG)、起始密码子(ATG)、hCD8信号肽(SP)(GCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG)和C-myc标签(GAGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTG)的DNA序列，在3’端依次加上终止密码子(TAA)、限制性内切酶Spe I(ACTAGT)的DNA序列。通过全基因合成编码上述DNA序列。将合成的DNA片段通过限制性内切酶位点Nde I和Spe I插入慢病毒载体pRRL中，构建pRRL-CAIX(5C9B7)-HVEM-CAR表达质粒。
本发明构建的pRRL-CAIX(5C9B7)-HVEM-CAR表达质粒中嵌合抗原受体各个元件的组合顺序(从N端到C端)如下：
抗CAIX单克隆抗体(Clone 5C9B7)scFv-CD8铰链和跨膜区-HVEM共刺激信号结构域-CD3ζ信号结构域；
抗CAIX单克隆抗体(Clone 5C9B7)scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，DNA序列如SEQ ID NO:2所示。其中，重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，DNA序列如SEQ ID NO:4所示，VH CDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，DNA序列如SEQ ID NO:6所示，VH CDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，DNA序列如SEQ ID NO:8所示，VH CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，DNA序列如SEQ ID NO:10所示；轻链可变区(VL)的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，DNA序列如SEQ ID NO:12所示，VL CDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，DNA序列如SEQ ID NO:14所示，VL CDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，DNA序列如SEQID NO:16所示，VL CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，DNA序列如SEQ ID NO:18所示；
CD8铰链和跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，DNA序列如SEQ ID NO:20所示；
HVEM共刺激信号结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，DNA序列如SEQ IDNO:22所示；
CD3ζ信号结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，DNA序列如SEQ ID NO:24所示。
本发明构建的CAIX(5C9B7)-HVEM-CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，DNA序列如SEQ ID NO:26所示；构建的CAIX-4-1BB-CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，DNA序列如SEQ ID NO:28所示；构建的CAIX-CD28-CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，DNA序列如SEQ ID NO:30所示。
2、提取pRRL-CAIX-HVEM-CAR、pRRL-CAIX-4-1BB-CAR、pRRL-CAIX-CD28-CAR质粒
转化：从-80℃冰箱中取出质粒，常温静置待融化后，取2μL(500ng/μL)原始质粒加入到感受态细胞中，手指弹拨EP管混匀，冰浴30min。42℃热休克90s，再冰浴2min。然后转移至事先预热至37℃的800μL无抗生素LB培养基中，37℃恒温震荡1h。将液体转移至200mL含抗生素的LB培养基中，37℃，220rpm恒温震荡12h。
提取：取200mL过夜培养的菌液加入离心管中，室温5000rpm离心5min，去除上清，收集菌体沉淀。向留有菌体沉淀的离心管中加入8mL P1，移液器吹打重悬菌体沉淀。将8mLP2加入离心管中，上下翻转6-8次，室温放置5min。再将8mL P4加入上述离心管中，上下翻转6-8次，充分混匀溶液至出现白色絮状沉淀，室温放置15min。5000rpm离心15min，此时白色沉淀全部离心至管底，将上清小心倒入过滤器CS1中，慢慢推动推柄过滤，将滤液收集在干净的50mL离心管中。进行柱平衡，将吸附柱CP6放入50mL收集管内，再向CP6中加入2.5mL平衡液BL，5000rpm，5min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。将0.3倍滤液体积的异丙醇加入至上述得到的滤液中，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6。室温离心5000rpm，5min，离心结束后倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP6重新放回收集管中，再次将剩余液体加入CP6中，重复离心。10mL漂洗液PW加入离心完成的CP6中，5000rpm离心5min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。重复上述操作步骤。将3mL无水乙醇加入CP6中，室温5000rpm离心10min，倒掉废液。室温放置数分钟，将吸附柱CP6置于一个干净的50mL离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加1mL洗脱液TB，室温放置5min，然后离心，5000rpm，5min，收集洗脱液；将得到的洗脱液重新加入到吸附柱中，5000rpm，离心5min，收集洗脱液。-20℃保存。
3、包装慢病毒pRRL-CAIX-HVEM-CAR、pRRL-CAIX-4-1BB-CAR、pRRL-CAIX-CD28-CAR
(1)预处理培养皿：使用10％的多聚赖氨酸溶液5mL加入到15cm的细胞培养皿中均匀覆盖培养皿底部，于超净工作台中静置5min后回收，使用PBS冲洗，晾干；
(2)选择预先培养的293T细胞，确定状态良好，消化后计数，取1.8×107个铺板，置于培养箱孵育过夜；
(3)质粒转染前将PBS、质粒、PEI升至室温；
(4)准备转染试剂：从-20℃冰箱取出PEI(1μg/μL)，常温下复温至PEI完全溶解。从-20℃冰箱中取出质粒，室温解冻后，混匀(Vector质粒，packaging质粒delta8.9，envelope质粒VSVG)；
(5)准备PEI/DNA复合物(以下所用体积或质粒按照一个15cm的量，可等比例扩大)①PEI混合物：用500μL PBS稀释75μL PEI(1μg/μL)；②DNA混合物：取500μL PBS至EP管中，分别加入27μg vector质粒，18μg packaging质粒，9μg VSVG质粒，移液枪上下吹打小心混匀；③一边轻轻涡旋质粒混合物，一边将PEI混合物加入其中，室温下静置15min；④将上述DNA/PEI复合物缓慢逐滴分散的加入到一个15cm培养皿中，立即“米”字轻轻晃动培养皿，充分混匀。将培养皿置于37℃培养6小时以后，将含有PEI的培养基去掉，更换为新鲜含1％丙酮酸那的DMEM完全培养基；
(6)转染24h后收集上清，换液，置于培养箱继续培养；
(7)将转染24h、48h、72h后收集的上清离心2000rpm，5min，彻底去除细胞碎片；
(8)使用20mL注射器吸取含有病毒液的培养基经0.45μm滤膜过滤，除菌；
(9)配平以后使用超速离心机离心，25000rpm，3小时；
(10)离心后，弃去上清，使用L500基础培养基重悬，放置于4℃过夜。使用EP管分装后于-80℃保存。
4、检测制备的病毒滴度
(1)使用状态良好的293T细胞铺24孔板，1×105个/孔，置于培养箱过夜培养；
(2)第二天按照预定慢病毒浓度梯度，分别加入1μL、2μL、4μL、8μL病毒液，添加助转染试剂Polybrene(终浓度8μg/mL)；
(3)第四天使用5mM EDTA消化293T细胞，PBS清洗；
(4)使用一抗c-myc抗体(使用2％FPBS 400倍稀释)避光孵育30min，2％FPBS清洗；
(5)使用二抗Alexa Fluor647(使用2％FPBS 800倍稀释)避光孵育30min，2％FPBS清洗；
(6)用200μL 1％甲醛重悬细胞，流式上机检测。计算病毒滴度；
(7)选取阳性率在10％-20％之间的浓度计算病毒滴度，公式：细胞数*阳性率/最适阳性率对应浓度。
5、T细胞的活化
从徐州医科大学附属医院收集健康供者的外周血，所有受试者均已签署知情同意书，分离外周血单个核细胞PBMC冻存备用。
取上述制备的PBMC细胞悬液，将其接于10cm培养皿。于培养箱中静置2h以去除MDSC等贴壁细胞，收集悬浮细胞，计数。调整细胞密度，使用T细胞完全培养基将密度调整为1×106/mL。清洗磁珠，按照与细胞等量计算所需CD3/CD28磁珠体积，放置于磁力架上，使用基础培养基清洗CD3/CD28磁珠，清洗完成后使用完全培养基重悬磁珠。将磁珠与细胞混合吹打混匀。将磁珠与细胞的混合物接种于48孔板。
6、慢病毒感染
(1)抗人CD3/CD28抗体偶联磁珠刺激T细胞24小时后，半量弃去培养基。分组为：Untreated、CAR-T组。从-80℃取出病毒，放置于冰上缓慢融化，按照MOI＝5加入慢病毒液，加入促转染试剂Polybrene，终浓度为5μg/mL；
(2)使用水平离心机离心，将离心机设置为升4降1、1500g，2h，放入培养箱过夜，第2日将每孔补充500μL对应的完全培养基；
(3)感染72h后，收集细胞400g离心5min。弃去上清，使用完全培养基重悬后，放置于磁力架上去除磁珠。继续培养至第10天，进行阳性率检测。其中，将利用空载体感染的人T淋巴细胞作为Ctrl-T cell。
7、SDS-PAGE和Western-Blot
制备细胞蛋白样品，BCA法检测蛋白的浓度，具体检测步骤如下：配制浓度为0.5mg/mL的蛋白标准液BSA。按50:1体积加入BCA试剂A与试剂B，充分混匀。将蛋白标准液BSA按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板中，每孔用双蒸水补足至20μL。样品孔每孔加入1μL待测样品和19μL双蒸水。每孔加入200μL配置好的BCA工作液，37℃培养箱放置30min，用酶标仪测562nm波长处的吸光度值。根据吸光度值作标准曲线，并计算样品的浓度。
制备胶板，并进行Western-Blot检测，具体检测步骤如下：BCA法测定蛋白浓度后，制备样品，使蛋白含量在40-80μg之间，加入相应体积蛋白上样缓冲液(5×)，100℃金属水浴煮10min。安装电泳槽，向电泳槽中倒入电泳液。将marker和蛋白样品用微量上样针加入加样孔中，盖上电泳槽盖子，插上电极开始电泳，浓缩胶维持恒压80V跑，分离胶维持恒压120V。转膜后，取出PVDF膜，加入5％脱脂牛奶封闭，室温下置于摇床上摇1h。一抗孵育：将封闭好的PVDF膜用双蒸水浸洗后放进用5％BSA稀释好的一抗里，4℃摇床过夜。二抗孵育：取出PVDF膜，回收一抗，加入1×TBST在水平摇床上洗3次，每次10min。加入5％脱脂牛奶稀释的二抗，室温下置于摇床孵育1h。用TBST洗膜3次，每次10min，结束后滴加ECL显色液充分浸润PVDF膜，用扫描仪扫描曝光。
8、流式检测及分选
(1)流式染色所用抗体：PERCP-anti-human-CD45，PE-anti-human-CD3，Monoclonal Anti c-myc，Alexa Fluor 647-Goat anti Mouse IgG，Live/Dead Greendye；
(2)细胞表面染色：取2×105个待染色细胞，用水平转子离心机2000rpm离5min后，弃上清，每孔加入50μL染色体系(2％FPBS与2μL相应抗体)并混匀，4℃，避光孵育30min。孵育结束后，加入1mL的2％FPBS洗一遍，2000rpm离心5min，弃上清，沉淀用200μL的1％甲醛重悬以固定细胞，转移至流式管内并用流式细胞仪上机检测，流式检测结果用Flowjo10软件分析；
(3)流式分选：将要进行流式分选的细胞全部取出，水平转子离心机2000rpm离心5min后，弃上清，按照1×106个细胞加入50μL染色体系(2％FPBS与2μL相应抗体)计算所需要的2％FPBS的量和抗体的量。4℃，避光孵育30min，孵育结束后，加入2％FPBS清洗1遍，2000rpm离心5min，弃上清。用基础培养基重悬底部细胞沉淀，转移至无菌流式管内并用流式细胞分选仪分选CAR-T细胞用于后续的实验。
9、实验结果
本实施例成功构建靶向人CAIX分别含有HVEM、4-1BB或CD28共刺激信号结构域的CAR：CAIX-HVEM-CAR、CAIX-4-1BB-CAR、CAIX-CD28-CAR，在它们的N端插入信号肽和C-myc标签，将上述三种CAR的编码序列插入含有EF-1α的慢病毒载体pRRL中(见图1)；
T淋巴细胞经活化24h后进行慢病毒感染，并在体外培养扩增10天，利用抗CD3的抗体通过Western blot实验检测发现在3种CAIX-CAR-T细胞中均有55KD左右的蛋白条带，证实3种CAIX-CAR能够在T细胞中正确表达(见图2)；
利用抗C-myc抗体进行染色并通过流式检测其阳性率发现，CAIX-4-1BB-CAR的阳性率为43.4％，CAIX-CD28-CAR的阳性率为40.4％，CAIX-HVEM-CAR的阳性率为43.3％(见图3A-D)；
上述结果表明本发明成功构建了分别含有HVEM、4-1BB、CD28共刺激信号结构域的CAIX-CAR，并且这3种CAR均能够在人T淋巴细胞表面高效表达。
实施例2检测CAR-T细胞在常氧条件下细胞因子的释放能力
本实施例采用ELISA实验检测CAR-T细胞细胞因子的释放。人肾癌细胞Ketr-3、OSRC-2、ACHN及293T细胞为本发明的发明人实验室保存。Ketr-3、ACHN和293T细胞复苏后用含10％FBS的DMEM培养基培养，OSRC-2细胞复苏后用含10％FBS的RPMI-1640培养基培养，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
1、细胞上清收集
(1)收集靶细胞OSRC-2、Ketr-3、ACHN，将浓度调整至1×105/mL；
(2)收集培养至第10天的Ctrl-T细胞及CAIX-CAR-T细胞，将浓度调整至1×105/mL；
(3)取U型底96孔板，每孔加入100μL靶细胞悬液和100μL效应细胞悬液，置于37℃培养箱中24h；
(4)将96孔板400g离心3min，吸取上清至另一96孔板中，-80℃保存。
2、试剂的配制
(1)取出Washing buffer(50×)和即用溶液，使温度升至室温；
(2)Cytokine standard：按标签说明将冻干粉溶解，静置5-10min，再用Dilutionbuffer R(1×)稀释到400pg/mL。采用倍比稀释法，将标准品稀释至需要的浓度-20℃保存。标准品浓度梯度为：400pg/mL、200pg/mL、100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL、12.5pg/mL；
(3)Biotinylated antibody：取60μL原液与2.94mL Dilution buffer R(1×)按照1:50稀释至工作浓度；
(4)Streptavidin-HRP：取60μL原液与5.94mL Dilution buffer R(1×)按照1:100稀释至工作浓度；
(5)Washing buffer(50×)：1:50用双蒸水稀释。
3、操作步骤
(1)使用前，将所有试剂充分混匀，避免产生泡沫；
(2)共设置12个实验组，标准品及实验组均设置3个复孔，共计36个实验孔，18个标准品孔，3个空白对照孔；
(3)加样：每个浓度梯度的标准品准备300μL，按照100μL/孔加入到对应标准品孔中；将样本稀释3倍，按照100μL/孔加入至样本孔，空白孔中加入100μL Dilution buffer R(1×)；
(4)加检测抗体：将稀释到工作浓度的Biotinylated antibody按照50μL/孔加入到所有孔中，混匀后盖上封板膜，室温孵育2h；
(5)洗板：设置洗板机程序为Washing buffer(1×)300μL/孔，停留1min，重复此操作3次；
(6)加酶：将稀释到工作浓度的Streptavidin-HRP按照100μL/孔加入到所有孔中，盖上封板膜，室温孵育20min；
(7)洗板：重复步骤(5)；
(8)显色：每孔加入100μL TMB，室温避光孵育20min；
(9)终止反应：每孔迅速加入100μL Stop solution终止反应；
(10)读板：终止后10min内，用检测波长(measurement wavelength)450nm读值，用双波长即检测波长450nm、参考波长或校正波长(reference wavelength)610-630nm同时读板。
4、实验结果
为筛选合适的靶细胞用于研究CAIX-HVEM-CAR-T细胞对CAIX阳性肾癌细胞的杀伤能力，本研究利用流式细胞仪检测肾癌细胞Ketr-3、OSRC-2、ACHN表面CAIX的表达量。检测结果显示CAIX在Ketr-3、OSRC-2细胞中高表达，在ACHN细胞中不表达(见图4A-C)；
将CAR-T细胞及对照Ctrl-T细胞分别与3种靶细胞Ketr-3、OSRC-2、ACHN以效靶比(E:T)1:1的比例共孵育24h，收集上清后检测CAR-T细胞在接受抗原刺激后分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2的量。结果显示，在经CAIX阳性的肾癌细胞OSRC-2、Ketr-3刺激后，CAIX-HVEM-CAR-T细胞分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2的水平要显著高于CAIX-4-1BB-CAR-T组及CAIX-CD28-CAR-T组，而与CAIX阴性肾癌细胞ACHN共孵育后，CAIX-HVEM-CAR-T细胞分泌细胞因子的量也要高于CAIX-4-1BB-CAR-T组及CAIX-CD28-CAR-T组(见图5A-C和表1-3)；
上述结果均表明共刺激分子HVEM驱动的CAR-T细胞在接受抗原刺激后，其细胞因子的释放能力明显高于共刺激分子4-1BB及CD28驱动的CAR-T细胞。
表1经Ketr-3刺激后CAIX-CAR-T细胞及Ctrl-T细胞细胞因子释放量
Figure BDA0002987497710000201
表2经OSRC-2刺激后CAIX-CAR-T细胞及Ctrl-T细胞细胞因子释放量
Figure BDA0002987497710000202
表3经ACHN刺激后CAIX-CAR-T细胞及Ctrl-T细胞细胞因子释放量
Figure BDA0002987497710000203
实施例3检测CAR-T细胞在常氧条件下对靶细胞的杀伤作用
为探究CAIX-HVEM-CAR-T细胞的杀伤功能，本实施例首先通过RTCA(Real TimeCellular Analysi)实时分析CAR-T细胞对靶细胞的杀伤能力。为进一步研究CAIX-HVEM-CAR-T细胞的杀伤功能，本研究又利用流式细胞术检测了CAIX-HVEM-CAR-T细胞对肾癌细胞的杀伤效果。
1、实验方法
(1)将50μL的靶细胞培养所用完全培养基加入到xCELLigence细胞功能分析仪的E-Plate检测板的每个孔内，用以测定背景阻抗值；
(2)收集处于对数生长期的靶细胞通过计数，调整细胞悬液，使其浓度为1×105/mL，然后向E-Plate检测板的每个孔中加入100μL的靶细胞悬液(相当于104个细胞/孔的靶细胞)，并放置于培养箱中，静置30min；
(3)将加入靶细胞的E-Plate检测板放置于RTCA检测台上，进行实时的动态的细胞增殖杀伤检测；
(4)按照效靶比2:1的比例调整CAR-T细胞的细胞浓度；
(5)当观察到细胞增殖处于平台期，开始对数增长后，向实验组各个培养孔中加入50μL相应的效应细胞悬液，继续进行实时的动态的检测。
将CAR-T细胞分别与3种靶细胞以2:1的效靶比混合培养48h，用抗人CD45和CD3的抗体对细胞混合物进行染色，并进行流式检测。CD45+CD3+的为CAR-T细胞，CD45—CD3—的为靶细胞。
2、实验结果
RTCA结果显示，在相同效靶比的情况下，与共刺激分子4-1BB或CD28驱动的CAR-T细胞相比，共刺激分子HVEM驱动的CAR-T细胞对CAIX阳性的靶细胞具有更强的杀伤作用，而对于CAIX阴性的靶细胞，3种CAR-T细胞均无明显杀伤作用(见图6A)；分析实时监测第30h时的细胞指数(Cell Index，CI值)发现，对于CAIX阳性的靶细胞来说，HVEM组的CI值显著低于4-1BB和CD28组；对于CAIX阴性的靶细胞，CI值无明显差别(见图6B和表4)；
流式结果显示，在CAIX阳性靶细胞OSRC-2、Ketr-3存在的体系中，HVEM组的剩余靶细胞比例最低；在CAIX阴性靶细胞ACHN存在的体系中，Ctrl-T细胞组及各CAR-T细胞组的剩余靶细胞比例并没有明显的差异(见图7A-B和表5)；
以上结果表明，相较于4-1BB和CD28，共刺激分子HVEM驱动的CAR-T细胞对CAIX阳性的肾癌细胞具有更强的杀伤作用。
表4 RTCA细胞指数
Figure BDA0002987497710000221
表5常氧条件下共孵育后流式结果
Figure BDA0002987497710000222
实施例4检测CAR-T细胞在低氧条件下细胞因子的释放能力
相关研究报道肿瘤微环境是一个低氧的环境，因此本实施例在体外模拟肿瘤的低氧环境，研究HVEM驱动的CAR-T细胞是否依然具有最强的杀伤能力。
1、实验方法
进行了细胞因子释放实验，将CAR-T细胞分别与3种靶细胞Ketr-3、OSRC-2、ACHN以1:1的比例混合，在低氧条件下(氧气含量1％)共孵育24h后收集上清，ELISA实验检测CAR-T细胞分泌IFN-γ、IL-2的量，具体实验方法同实施例2。
2、实验结果
结果显示，在经过CAIX阳性的靶细胞刺激后，除经Ketr-3刺激后的CD28组和HVEM组CAR-T细胞释放IL-2的量相当外，HVEM组CAR-T细胞释放细胞因子的量均显著多于CD28和4-1BB组(见图8A-C、表6和表7)。在经CAIX阴性的ACHN细胞刺激后，HVEM组CAR-T的细胞因子释放量也显著高于其他三组(见图8C)，结果表明，在低氧条件下HVEM驱动的CAR-T细胞同样具有更强的细胞因子释放能力。
表6 CAIX-HVEM-CAR-T细胞的IL-2释放量
Figure BDA0002987497710000231
表7 CAIX-HVEM-CAR-T细胞的IFN-γ释放量
Figure BDA0002987497710000232
实施例5检测CAR-T细胞在低氧条件下对靶细胞的杀伤作用
为了进一步检测CAIX-HVEM-CAR-T细胞适应低氧环境的能力，本实施例分别采用RTCA和流式细胞术进行了验证实验。
1、实验方法
将RTCA机器置于低氧培养箱中，取1×104个靶细胞接种于检测孔中，在靶细胞处于对数增长期时，以2:1的效靶比加入Ctrl-T细胞和CAIX-HVEM-CAR-T、CAIX-4-1BB-CAR-T、CAIX-CD28-CAR-T细胞，观察杀伤曲线，并对实验终点时各组细胞的CI值进行分析。
将Ctrl-T细胞及CAIX-HVEM-CAR-T、CAIX-4-1BB-CAR-T、CAIX-CD28-CAR-T细胞分别与Ketr-3和OSRC-2以效靶比2:1的比例在低氧条件下共孵育48h，孵育结束后将细胞取出进行染色，利用流式细胞仪进行检测。
2、实验结果
RTCA结果显示，HVEM组的杀伤曲线处于最下端(见图9A)，HVEM组的细胞指数最低(见图9B和表8)，表明HVEM驱动的CAR-T细胞在低氧条件下对CAIX阳性的靶细胞依然具有更强的杀伤效果。
流式结果显示，CD45、CD3双阳性的细胞群为CAR-T细胞，而CD45、CD3双阴性的细胞群是靶细胞(见图10A)，统计结果显示，HVEM组的靶细胞的比例最低(见图10B和表9)，表明与CD28和4-1BB相比，HVEM驱动的CAR-T细胞在低氧条件下对CAIX阳性的靶细胞具有更强的杀伤作用。
表8 RTCA细胞指数
Figure BDA0002987497710000241
表9低氧条件下共孵育后流式结果
Figure BDA0002987497710000251
实施例6检测CAR-T细胞线粒体的呼吸水平
相关研究报道T细胞的衰竭会伴随着细胞代谢能力的下降，因此本实施例研究了CAIX-HVEM-CAR-T细胞被靶细胞激活后的呼吸能力，耗氧率(Oxygen Consumption Rate，OCR值)是线粒体呼吸能力的重要指标，本实施例采用Seahorse实验检测CAR-T细胞线粒体的呼吸水平。
1、实验方法
(1)预热仪器：实验开始前1天，打开Seahorse仪器和电脑，并打开软件，过夜预热至37℃；
(2)水化探针：在Utility Plate中加入Seahorse XF校准液，将带有探针的测试板放回Utility Plate上，置于37℃无CO2培养箱中过夜；
(3)准备检测液：用Seahorse XF Base Medium 1640配制100mL检测液，98mLSeahorse XF Base Medium+1mL 100mM谷氨酰胺+1mL 200mM丙酮酸那+0.45g葡萄糖，0.22μm滤膜过滤，将溶液加热至37℃，用NaOH调pH值至7.4，置37℃水浴中备用；
(4)准备细胞：将与靶细胞共孵育后的CAR-T细胞利用流式分选仪分选出来，每种细胞需要3.6×106个细胞；
(5)在室温下以400g离心细胞5min；
(6)离心细胞时，在细胞培养微孔板背景/对照孔中加入50μL测定培养基；
(7)离心结束，去除上清，加入600μL测定培养基重悬细胞；
(8)沿着每个孔的侧面用移液枪吸取50μL的细胞悬液加入孔内，背景/对照孔除外。将细胞板进行离心，200g，升0降0，1min；
(9)将细胞板转移到无CO2的37℃恒温箱中静置25-30min。
(10)将细胞板取出，缓慢并轻轻地在每个孔的侧面添加130μL测定培养基；
(11)将细胞板放回培养箱中静置15-25min；
(12)对加药孔进行处理，首先配药：根据试剂盒说明书，配制并稀释药物至所需浓度：1mM oligomycin，1mM FCCP，1mM rotenone and antimycin A；
(13)加药：将稀释好的药物分别加入测试板上的A，B，C三个加药孔中；
(14)将测试板放置在水化板上，放入机器中进行校准；
(15)校准后，取出水化板，将细胞板放在Seahorse XFe/XF分析仪中。
2、实验结果
实验结果显示，CAIX-HVEM-CAR-T细胞显示出最高水平的基础OCR值(见图11B)，依次加入ATP合成抑制剂寡霉素(oligomycin)、氧化磷酸化的解偶联剂FCCP、电子传递链复合体抑制剂鱼藤酮(rotenone)与抗霉素A(antimycin A)，加入FCCP后，线粒体膜解偶联，细胞达到最大呼吸能力，此时测量的结果为细胞的最大OCR水平(见图11A)，结果显示HVEM驱动的CAR-T细胞同样具有最高水平的最大OCR值(见图11C和表10)。以上结果均表明共刺激分子HVEM可提高CAR-T细胞的线粒体呼吸能力。
表10代谢实验结果统计表
Figure BDA0002987497710000261
实施例7 NPG荷瘤小鼠动物模型建立，分组及治疗方案
本实施例使用的NPG雄鼠(NOD-Prkdc scid IL2rg null)均购自于北京维通利华生物科技有限公司，并饲养于SPF级实验动物中心，饲料及饮水均经过严格灭菌处理。
1、构建过表达Luciferase的OSRC-2细胞系
用携带过表达Luciferase-GFP的慢病毒感染OSRC-2细胞，首先进行靶细胞铺板，将OSRC-2细胞以5×105接入6孔板，置于培养箱。然后进行慢病毒感染，弃去旧培养基，每孔加入3mL基础培养基。按照MOI＝5计算病毒体积，加入促转染试剂polybrene，保持终浓度5μg/mL，放置培养箱中培养。感染48h后换液，感染96h后流式分选。
2、NPG小鼠肾癌肺转移实验
免疫缺陷NPG小鼠，雄性，6-8周龄，饲养于恒温(22-25℃)、恒定湿度的SPF级的屏障系统内。NPG小鼠饲养1周后开始接种肿瘤细胞。OSRC-2细胞70％融合时，进行消化收集，将细胞沉淀用5mL PBS悬起后1000rpm离心3min，重复2次，之后用PBS重悬细胞，将细胞进行计数，调整为每200μL含有1×106个细胞。通过尾静脉将细胞输入到小鼠体内，构建肺转移模型。将小鼠放在动物中心继续饲养，7天后将荷瘤小鼠分为4组，分别为Untreated组、Ctrl组、4-1BB组、HVEM组。每只小鼠尾静脉回输1×107个CAR-T细胞，同时维持每日腹腔注射2000U的IL-2维持细胞增殖。治疗后第7天，尾静脉采血检测细胞增殖情况。每组荷瘤小鼠，以其自然死亡作为观察终点，记录荷瘤小鼠生存期。待小鼠死亡后，解剖小鼠，分离肺组织拍照并将其浸于4％多聚甲醛中固定48h，进行包埋、切片。
3、NPG小鼠肾原位肿瘤实验
免疫缺陷NPG小鼠，雄性，6-8周龄，饲养于恒温(22-25℃)、恒定湿度的SPF级的屏障系统内。NPG小鼠饲养1周后开始接种肿瘤细胞。OSRC-2-Luciferase细胞70％融合时，进行消化收集，将细胞沉淀用5mL PBS悬起后1000rpm离心3min，重复2次，之后用PBS重悬细胞，将细胞进行计数，调整为每10μL含有1×106个细胞。取出小鼠去除背部左侧毛发，用75％酒精对背部进行消毒，并进行麻醉。待小鼠麻醉后，切开1cm左右切口，暴露左肾，水平持注射器在肾被膜下打入10μL细胞悬液，可看见注射点变白，立即用生物胶封闭针口，然后缝合皮肤。将小鼠放在动物中心继续饲养，14天后进行小动物活体成像，根据成像结果，将小鼠分为4组，分别为Ctrl组、4-1BB组、CD28组、HVEM组。每只小鼠尾静脉回输2×106个CAR-T细胞，1周后再次给予相同数量的CAR-T细胞。开始接受治疗后的小鼠，每4天进行一次动物活体成像拍照，观察肿瘤生长情况。每组荷瘤小鼠，以其自然死亡作为观察终点，记录荷瘤小鼠生存期。待小鼠死亡后，解剖小鼠，分离肾组织及肿瘤拍照并将其浸于4％多聚甲醛中固定48h，进行包埋、切片。
4、小鼠尾静脉采血检测T细胞体内存活
CAR-T细胞注射后第7天通过尾静脉采血50μL，放置于装有50μL 20mM EDTA的EP管中，移液枪吹打混匀，放置冰上；将采集的1.5mL Ep管中的抗凝血2000rpm离心5min后弃上清；按照100μL血液加入1mL的1×红细胞裂解液，沉淀加入相应量的红细胞裂解液并用枪轻柔地吹打混匀；室温避光孵育10min后，2000rpm离心5min，弃上清；用2％FPBS洗一遍，2000rpm离心5min，弃上清；最后用2％FPBS重悬细胞沉淀，用于后续的流式染色步骤；使用一抗c-myc抗体(使用25％PBS 400倍稀释)避光孵育30min，2％FPBS清洗；使用二抗AlexaFluor647(使用2％FPBS 800倍稀释)避光孵育30min，2％FPBS清洗；用200μL1％甲醛重悬细胞，流式上机检测。
5、小鼠活体成像
用无菌ddH2O配置15mg/mL的荧光素储存液，混匀；按照150mg/kg的荧光素/体重浓度进行注射。大约每只小鼠注射200μL；通过腹腔注射入小鼠体内，作用10min以后进行活体成像。
6、小鼠肺组织HE染色
(1)透明脱水：将石蜡切片置于两缸二甲苯中分别脱蜡10min，依次放进无水乙醇5min、90％乙醇2min、80％乙醇2min、70％乙醇2min，蒸馏水2min；
(2)核染：滴加苏木素染液8min，ddH2O冲洗去多余的染色液，约10min；
(3)分化：1％盐酸分化约2-5s，自来水冲洗10min；
(4)质染：拭去组织周围液体，滴加伊红染色液染色1min；
(5)将片子依次置于70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、无水乙醇各10s；
(6)将片子置于两缸二甲苯中各透明10min；
(7)用中性树胶封片，晾干后，高通量玻片扫描仪进行扫描。
7、统计分析方法
用统计软件SPSS16.0对数据进行统计学分析。计量资料用均数±标准差
Figure BDA0002987497710000291
表示，两组数值之间采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和两因素方差分析(Two-way ANOVA)。假设检验水准按α＝0.05判定，P<0.05认为差异有统计学意义。*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001。统计图使用Graphpad prism6.0软件绘制。
8、实验结果
NPG小鼠肾癌肺转移实验的结果显示，流式检测CAR-T细胞在体内的存活及扩增情况见图12A，CAIX-HVEM-CAR-T细胞在小鼠外周血淋巴细胞中的含量约是CAIX-4-1BB-CAR-T组的3倍(见图12B和表11)，生存曲线的结果图显示，与CAIX-4-1BB-CAR-T治疗组相比，CAIX-HVEM-CAR-T治疗组的小鼠生存期明显延长(见图12C和表12)。为进一步观察CAIX-HVEM-CAR-T对肾癌肺转移瘤的治疗效果，对小鼠肺组织上的肿瘤结节进行了观察。经HVEM驱动的CAR-T细胞治疗后的小鼠肺组织上肿瘤转移灶明显减少，HE染色结果也显示，4-1BB组小鼠的肺组织可以看到明显的癌巢且整个肺组织内看不到正常的肺泡结构，而HVEM组的小鼠肺组织则可以观察到明显的正常肺泡结构，且肿瘤转移灶明显减少(见图13A-D)，表明与CAIX-4-1BB-CAR-T细胞相比，CAIX-HVEM-CAR-T对小鼠肾癌肺转移瘤具有更好的治疗效果。
NPG小鼠肾原位肿瘤实验的结果显示，接种CAR-T后每4天进行一次小鼠活体成像拍照的结果见图14A，对每组小鼠的平均荧光强度进行统计发现，与Ctrl-T cell、CAIX-4-1BB及CAIX-CD28组比较，从第22天开始，HVEM驱动的CAR-T细胞治疗后肿瘤体积明显缩小，到第34天时有3只小鼠的肿瘤完全消退(见图14A和B)。在肿瘤接种第21天，尾静脉采血，利用流式细胞术检测T细胞在小鼠体内存活情况(见图15A)，统计分析后发现在该模型中HVEM组的T细胞的存活能力仍具备较强的优势(见图15B和表13)；在实验结束后对小鼠生存期进行统计发现，HVEM组小鼠的生存期较其余三组有了明显的延长(见图15C和表14)，表明与4-1BB及CD28驱动的CAR-T细胞相比，HVEM驱动的CAR-T细胞对肾原位瘤模型具有更好的治疗效果。
表11体内T细胞存活情况
Figure BDA0002987497710000301
表12生存期统计
Figure BDA0002987497710000302
表13体内T细胞存活情况
Figure BDA0002987497710000303
表14生存期统计
Figure BDA0002987497710000311
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 徐州医科大学
<120> 一种HVEM共刺激信号驱动的CAIX-CAR-T细胞及其制备方法和应用
<141> 2021-03-22
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Lys Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Asn Met
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Ser Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Leu Pro Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Ser Leu Ala Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser
145 150 155 160
Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp
165 170 175
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala
180 185 190
Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu
210 215 220
Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly
225 230 235 240
Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 2
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caggtccaac tgcagcagcc tggtggagga ttggtgcagc ctaaagggtc attgaaactc 60
tcatgtgcag cctctggatt caccttcaat acctacgcca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccaggaaagg gtttggaatg ggttgctcgc ataagaagta aaagtaaaaa ttatgcaaca 180
tattatgccg attcagtgaa agacaggttc accatctcca gagatgattc acaaaacatg 240
ctctatctgc aaatgaacaa cttgaaaact gaggactcag ccatgtatta ctgtgtgaga 300
catctgcctc cctatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360
ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatctgacat ccagctgact 420
cagtctccat cctccctagc tgtgtcagtt ggagagaagg ttactatgag ctgcaagtcc 480
agtcagagcc ttttatatag tagaaatcaa aagaactact tggcctggta ccagcagaaa 540
ccagggcagt ctcctaaact gctgatttac tgggcatcca ctagggaatc tggggtccct 600
gatcgcttca caggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagtgtgaag 660
gctgaagacc tggcagttta ttactgtcag caatattata cctatccgct cacgttcggt 720
gctgggacca agctggaaat aaaacgg 747
<210> 3
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Lys Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Asn Met
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Ser Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Leu Pro Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caggtccaac tgcagcagcc tggtggagga ttggtgcagc ctaaagggtc attgaaactc 60
tcatgtgcag cctctggatt caccttcaat acctacgcca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccaggaaagg gtttggaatg ggttgctcgc ataagaagta aaagtaaaaa ttatgcaaca 180
tattatgccg attcagtgaa agacaggttc accatctcca gagatgattc acaaaacatg 240
ctctatctgc aaatgaacaa cttgaaaact gaggactcag ccatgtatta ctgtgtgaga 300
catctgcctc cctatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala
1 5
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggattcacct tcaataccta cgcc 24
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ile Arg Ser Lys Ser Lys Asn Tyr Ala Thr
1 5 10
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ataagaagta aaagtaaaaa ttatgcaaca 30
<210> 9
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Val Arg
1
<210> 10
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtgaga 6
<210> 11
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 12
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gacatccagc tgactcagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60
atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagaa atcaaaagaa ctacttggcc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatacctat 300
ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gaaataaaac gg 342
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Arg Asn Gln Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 14
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cagagccttt tatatagtag aaatcaaaag aactac 36
<210> 15
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Trp Ala Ser
1
<210> 16
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tgggcatcc 9
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Gln Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro
1 5
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cagcaatatt atacctatcc g 21
<210> 19
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys
65
<210> 20
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccctggccg ggacttgtgg ggtccttctc 180
ctgtcactgg ttatcaccct ttactgc 207
<210> 21
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Cys Val Lys Arg Arg Lys Pro Arg Gly Asp Val Val Lys Val Ile Val
1 5 10 15
Ser Val Gln Arg Lys Arg Gln Glu Ala Glu Gly Glu Ala Thr Val Ile
20 25 30
Glu Ala Leu Gln Ala Pro Pro Asp Val Thr Thr Val Ala Val Glu Glu
35 40 45
Thr Ile Pro Ser Phe Thr Gly Arg Ser Pro Asn His
50 55 60
<210> 22
<211> 180
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tgcgtgaagc gccgcaagcc ccgcggcgac gtggtgaagg tgatcgtgag cgtgcagcgc 60
aagcgccagg aggccgaggg cgaggccacc gtgatcgagg ccctgcaggc cccccccgac 120
gtgaccaccg tggccgtgga ggagaccatc cccagcttca ccggccgcag ccccaaccac 180
<210> 23
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 24
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cgcgtgaagt tcagccgcag cgccgacgcc cccgcctacc agcagggcca gaaccagctg 60
tacaacgagc tgaacctggg ccgccgcgag gagtacgacg tgctggacaa gcgccgcggc 120
cgcgaccccg agatgggcgg caagccccgc cgcaagaacc cccaggaggg cctgtacaac 180
gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgc 240
cgccgcggca agggccacga cggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggacacc 300
tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc ccccgc 336
<210> 25
<211> 490
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Lys Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Asn Met
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Ser Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Leu Pro Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Ser Leu Ala Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser
145 150 155 160
Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp
165 170 175
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala
180 185 190
Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu
210 215 220
Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly
225 230 235 240
Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
245 250 255
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
260 265 270
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
275 280 285
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
290 295 300
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Cys Val
305 310 315 320
Lys Arg Arg Lys Pro Arg Gly Asp Val Val Lys Val Ile Val Ser Val
325 330 335
Gln Arg Lys Arg Gln Glu Ala Glu Gly Glu Ala Thr Val Ile Glu Ala
340 345 350
Leu Gln Ala Pro Pro Asp Val Thr Thr Val Ala Val Glu Glu Thr Ile
355 360 365
Pro Ser Phe Thr Gly Arg Ser Pro Asn His Arg Val Lys Phe Ser Arg
370 375 380
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
385 390 395 400
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
405 410 415
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
420 425 430
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
435 440 445
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
450 455 460
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
465 470 475 480
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 26
<211> 1470
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
caggtccaac tgcagcagcc tggtggagga ttggtgcagc ctaaagggtc attgaaactc 60
tcatgtgcag cctctggatt caccttcaat acctacgcca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccaggaaagg gtttggaatg ggttgctcgc ataagaagta aaagtaaaaa ttatgcaaca 180
tattatgccg attcagtgaa agacaggttc accatctcca gagatgattc acaaaacatg 240
ctctatctgc aaatgaacaa cttgaaaact gaggactcag ccatgtatta ctgtgtgaga 300
catctgcctc cctatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360
ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatctgacat ccagctgact 420
cagtctccat cctccctagc tgtgtcagtt ggagagaagg ttactatgag ctgcaagtcc 480
agtcagagcc ttttatatag tagaaatcaa aagaactact tggcctggta ccagcagaaa 540
ccagggcagt ctcctaaact gctgatttac tgggcatcca ctagggaatc tggggtccct 600
gatcgcttca caggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagtgtgaag 660
gctgaagacc tggcagttta ttactgtcag caatattata cctatccgct cacgttcggt 720
gctgggacca agctggaaat aaaacggacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 780
gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 840
gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 900
ctggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgctgcgtg 960
aagcgccgca agccccgcgg cgacgtggtg aaggtgatcg tgagcgtgca gcgcaagcgc 1020
caggaggccg agggcgaggc caccgtgatc gaggccctgc aggccccccc cgacgtgacc 1080
accgtggccg tggaggagac catccccagc ttcaccggcc gcagccccaa ccaccgcgtg 1140
aagttcagcc gcagcgccga cgcccccgcc taccagcagg gccagaacca gctgtacaac 1200
gagctgaacc tgggccgccg cgaggagtac gacgtgctgg acaagcgccg cggccgcgac 1260
cccgagatgg gcggcaagcc ccgccgcaag aacccccagg agggcctgta caacgagctg 1320
cagaaggaca agatggccga ggcctacagc gagatcggca tgaagggcga gcgccgccgc 1380
ggcaagggcc acgacggcct gtaccagggc ctgagcaccg ccaccaagga cacctacgac 1440
gccctgcaca tgcaggccct gcccccccgc 1470
<210> 27
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Leu Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Leu Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Phe Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Arg Ser Gly Tyr Phe Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro
115 120 125
Gly Ser Gly Glu Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Arg Phe
130 135 140
Met Ser Thr Thr Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser
145 150 155 160
Gln Asn Val Val Ser Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
165 170 175
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val
180 185 190
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Asn Met Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Phe Phe Cys Gln Gln
210 215 220
Tyr Ser Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
225 230 235 240
Lys Thr Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
245 250 255
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
260 265 270
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
275 280 285
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
290 295 300
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
305 310 315 320
Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
325 330 335
Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
340 345 350
Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
355 360 365
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
370 375 380
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
385 390 395 400
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
405 410 415
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
420 425 430
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
435 440 445
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
450 455 460
Pro Arg
465
<210> 28
<211> 1398
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gacgtgaagc tcgtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ttggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aactattaca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccagagaaga ggctggagtt ggtcgcagcc attaatagtg atggtggtat cacctactat 180
ctagacactg tgaagggccg attcaccatt tcaagagaca atgccaagaa caccctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccttgt tttactgtgc aagacaccgc 300
tcgggctact tttctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctcaggg 360
agtacctcag gaagcgggaa accaggatct ggagaaggaa gtgacattgt gatgacccag 420
tctcaaagat tcatgtccac aacagtagga gacagggtca gcatcacctg caaggccagt 480
cagaatgtgg tttctgctgt tgcctggtat caacagaaac caggacaatc tcctaaacta 540
ctgatttact cagcatccaa tcggtacact ggagtccctg atcgcttcac aggcagtgga 600
tctgggacag atttcactct caccattagc aatatgcagt ctgaagacct ggctgatttt 660
ttctgtcaac aatatagcaa ctatccgtgg acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc 720
aaaacgcgta ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 780
cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 840
agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccctggccgg gacttgtggg 900
gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaagc gcggccgcaa gaagctgctg 960
tacatcttca agcagccctt catgcgcccc gtgcagacca cccaggagga ggacggctgc 1020
agctgccgct tccccgagga ggaggagggc ggctgcgagc tgcgcgtgaa gttcagccgc 1080
agcgccgacg cccccgccta ccagcagggc cagaaccagc tgtacaacga gctgaacctg 1140
ggccgccgcg aggagtacga cgtgctggac aagcgccgcg gccgcgaccc cgagatgggc 1200
ggcaagcccc gccgcaagaa cccccaggag ggcctgtaca acgagctgca gaaggacaag 1260
atggccgagg cctacagcga gatcggcatg aagggcgagc gccgccgcgg caagggccac 1320
gacggcctgt accagggcct gagcaccgcc accaaggaca cctacgacgc cctgcacatg 1380
caggccctgc ccccccgc 1398
<210> 29
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Leu Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Leu Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Phe Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Arg Ser Gly Tyr Phe Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro
115 120 125
Gly Ser Gly Glu Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Arg Phe
130 135 140
Met Ser Thr Thr Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser
145 150 155 160
Gln Asn Val Val Ser Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
165 170 175
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val
180 185 190
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Asn Met Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Phe Phe Cys Gln Gln
210 215 220
Tyr Ser Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
225 230 235 240
Lys Thr Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
245 250 255
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
260 265 270
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
275 280 285
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
290 295 300
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu
305 310 315 320
His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg
325 330 335
Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg
340 345 350
Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
355 360 365
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
370 375 380
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
385 390 395 400
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
405 410 415
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
420 425 430
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
435 440 445
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
450 455 460
Arg
465
<210> 30
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gacgtgaagc tcgtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ttggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aactattaca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccagagaaga ggctggagtt ggtcgcagcc attaatagtg atggtggtat cacctactat 180
ctagacactg tgaagggccg attcaccatt tcaagagaca atgccaagaa caccctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccttgt tttactgtgc aagacaccgc 300
tcgggctact tttctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctcaggg 360
agtacctcag gaagcgggaa accaggatct ggagaaggaa gtgacattgt gatgacccag 420
tctcaaagat tcatgtccac aacagtagga gacagggtca gcatcacctg caaggccagt 480
cagaatgtgg tttctgctgt tgcctggtat caacagaaac caggacaatc tcctaaacta 540
ctgatttact cagcatccaa tcggtacact ggagtccctg atcgcttcac aggcagtgga 600
tctgggacag atttcactct caccattagc aatatgcagt ctgaagacct ggctgatttt 660
ttctgtcaac aatatagcaa ctatccgtgg acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc 720
aaaacgcgta ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 780
cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 840
agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccctggccgg gacttgtggg 900
gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgccgca gcaagcgcag ccgcctgctg 960
cacagcgact acatgaacat gaccccccgc cgccccggcc ccacccgcaa gcactaccag 1020
ccctacgccc ccccccgcga cttcgccgcc taccgcagcc gcgtgaagtt cagccgcagc 1080
gccgacgccc ccgcctacca gcagggccag aaccagctgt acaacgagct gaacctgggc 1140
cgccgcgagg agtacgacgt gctggacaag cgccgcggcc gcgaccccga gatgggcggc 1200
aagccccgcc gcaagaaccc ccaggagggc ctgtacaacg agctgcagaa ggacaagatg 1260
gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag ggcgagcgcc gccgcggcaa gggccacgac 1320
ggcctgtacc agggcctgag caccgccacc aaggacacct acgacgccct gcacatgcag 1380
gccctgcccc cccgc 1395

Claims (22)

1.一种抗CAIX单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包含VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3；
所述VH CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；
所述VH CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；
所述VH CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；
所述VL CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；
所述VL CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；
所述VL CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.一种靶向CAIX的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段；
所述嵌合抗原受体还包括跨膜结构域、细胞内信号传导结构域；
所述跨膜结构域为CD8的跨膜区；
所述CD8的跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；
所述细胞内信号传导结构域包含共刺激结构域；
所述共刺激结构域为HVEM的功能性信号传导结构域；
所述HVEM的功能性信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；
所述细胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域；
所述初级信号传导结构域为CD3ζ的功能性信号传导结构域；
所述CD3ζ的功能性信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。
4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示。
5.一种缀合物，其特征在于，所述缀合物包含权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段。
6.根据权利要求5所述的缀合物，其特征在于，所述缀合物还包含连接于所述抗体或其抗原结合片段的修饰部分。
7.根据权利要求6所述的缀合物，其特征在于，所述修饰部分包括可检测的标记或治疗剂。
8.根据权利要求7所述的缀合物，其特征在于，所述可检测的标记包括酶、成像剂、造影剂、荧光染料、发光物质或生物素。
9.根据权利要求7所述的缀合物，其特征在于，所述治疗剂包括具有抗肿瘤活性的药物或细胞毒剂。
10.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列，或编码权利要求3或4所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列；
所述抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示。
11.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求10所述的核酸分子。
12.根据权利要求11所述的载体，其特征在于，所述载体选自：DNA载体、RNA载体。
13.一种经工程改造的细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求3或4所述的嵌合抗原受体，或权利要求5-9中任一项所述的缀合物，或权利要求10所述的核酸分子，或权利要求11或12所述的载体；
所述细胞为免疫细胞；
所述免疫细胞为T淋巴细胞。
14.一种经工程改造的细胞群体，其特征在于，所述细胞群体包含权利要求13所述的细胞。
15.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求3或4所述的嵌合抗原受体、权利要求5-9中任一项所述的缀合物、权利要求10所述的核酸分子、权利要求11或12所述的载体、权利要求13所述的细胞、权利要求14所述的细胞群体。
16.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求3或4所述的嵌合抗原受体、权利要求5-9中任一项所述的缀合物、权利要求10所述的核酸分子、权利要求11或12所述的载体、权利要求13所述的细胞、权利要求14所述的细胞群体。
17.一种制备权利要求13所述经工程改造的细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求10所述的核酸分子、或权利要求11或12所述的载体引入到细胞中，得到权利要求13所述的经工程改造的细胞。
18.一种检测样品中CAIX的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将样品与权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段进行接触，检测所述抗体或其抗原结合片段与CAIX的反应。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段附着在固相底物上。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述固相底物选自：微滴定板、磁颗粒、胶乳颗粒和硝化纤维素膜。
21.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述反应是通过酶显色、荧光、或化学发光进行测定的。
22.权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求3或4所述的嵌合抗原受体、权利要求5-9中的任一项所述的缀合物、权利要求10所述的核酸分子、权利要求11或12所述的载体、权利要求13所述的细胞、权利要求14所述的细胞群体、权利要求15所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为肾癌。
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