CN111269941B - 一种基于双色荧光系统的活化car-t细胞的示踪及定量方法 - Google Patents

一种基于双色荧光系统的活化car-t细胞的示踪及定量方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111269941B
CN111269941B CN202010122902.8A CN202010122902A CN111269941B CN 111269941 B CN111269941 B CN 111269941B CN 202010122902 A CN202010122902 A CN 202010122902A CN 111269941 B CN111269941 B CN 111269941B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
fluorescence
car
fluorescent protein
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010122902.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111269941A (zh
Inventor
许佩佩
欧阳建
陈兵
柳旭
程书文
彭苗新
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Drum Tower Hospital
Original Assignee
Nanjing Drum Tower Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Drum Tower Hospital filed Critical Nanjing Drum Tower Hospital
Priority to CN202010122902.8A priority Critical patent/CN111269941B/zh
Publication of CN111269941A publication Critical patent/CN111269941A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111269941B publication Critical patent/CN111269941B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Abstract

本发明公开了一种基于多色荧光系统的活化CAR‑T细胞的示踪及定量方法，使用第一载体包装慢病毒并筛选稳转细胞，可以显示体内CAR‑T细胞总数量及所在位置。在此基础上转染第二载体包装的慢病毒，在CAR‑T细胞与靶细胞表面抗原结合并被成功激活之后，NFAT转录因子入核，与NFAT转录因子特异性增强序列结合并启动第二荧光表达，显示体内激活态的CAR‑T细胞的位置，同时通过计算即可得知活化的CAR‑T细胞占总输注细胞的比值，指示免疫活性细胞的激活状态、激活比例以及耗竭程度。本发明不仅可以实时追踪活化细胞所在位置，也可以计算出活化CAR‑T细胞所占比例，从而了解体内免疫过继细胞激活程度及存活时间，对后续治疗计划的维持及调整具有重要意义。

Description

一种基于双色荧光系统的活化CAR-T细胞的示踪及定量方法
技术领域
本发明涉及细胞免疫治疗领域，具体涉及一种基于多色荧光系统的活化CAR-T细胞的示踪及定量方法。
背景技术
近年来，免疫疗法在肿瘤治疗中占据了越来越重要的地位。其中，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，CAR-T)在血液性肿瘤中得到了广泛应用并逐渐向实体瘤领域发展。CAR-T细胞是通过将与肿瘤抗原相对应的抗体的抗原结合部分与CD3-ζ链或FcεRIγ的胞内段形成的融合蛋白编码基因转染入患者的T细胞，使患者自身的T细胞能够表达肿瘤特异性的嵌合抗原受体，从而清除肿瘤细胞。
CAR-T细胞在体内发挥的疗效受到许多因素的影响，包括患者疾病状态、是否曾经接受化疗、输注CAR-T细胞的时机以及患者的基因表达状态等，其中两个重要因素就是修饰后的T细胞进入体内是否被有效激活，激活的T细胞是否持续活化。因此，在免疫细胞治疗的临床前研究中，一种能够快速、简便的监测免疫活性细胞的分布、迁徙、激活状态和存活时间的方法对于疗效的预测和评估具有重要意义。
当前，已经发展出的用于监测细胞分布、迁徙和存活时间的方法，包括组织病理学技术、核素成像技术、磁共振成像技术和光学成像技术等。然而，迄今为止，这些方法均不能够直接用于评估免疫活性细胞的激活状态、激活比例以及耗竭程度。因此，在免疫细胞治疗领域，亟需一种新的，能够实时监测患者体内CAR-T细胞状态的新方法。
发明内容
本发明的目在于针对现有CAR-T细胞治疗及临床研究过程中缺乏能够直接评估免疫活性细胞的激活状态、激活比例以及耗竭程度的检测方法的不足，提供一种基于多色荧光系统的活化CAR-T细胞的示踪及定量方法。使用第一载体包装慢病毒并筛选稳转细胞，该稳转细胞均能表达第一荧光蛋白，可以显示体内CAR-T细胞总数量及所在位置。在此基础上转染第二载体包装的慢病毒。在CAR-T细胞与靶细胞表面抗原结合并被成功激活之后，NFAT转录因子入核，与NFAT转录因子特异性增强序列结合并强烈启动第二荧光表达，显示体内激活态的CAR-T细胞的位置，同时通过计算第二荧光蛋白积分光密度与第一荧光蛋白的积分光密度的比值即可得知活化的CAR-T细胞占总输注细胞的比值，指示免疫活性细胞的激活状态、激活比例以及耗竭程度。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：
一种基于多色荧光系统的活化CAR-T细胞的示踪及定量方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：合成第一插入序列，并在上下游引入AsisⅠ和MluⅠ酶切位点，然后酶切原始慢病毒载体A和得到的含有AsisⅠ和MluⅠ酶切位点的第一插入序列，将AsisⅠ和MluⅠ酶切后的第一插入序列与原始慢病毒载体A于22℃连接2小时，构建得到第一载体；
S2：合成第二插入序列，并在上下游引入AsisⅠ和MluⅠ酶切位点，然后酶切原始慢病毒载体B和得到的含有AsisⅠ和MluⅠ酶切位点的第二插入序列，将AsisⅠ和MluⅠ酶切后的第二插入序列与原始慢病毒载体B于22℃连接2小时，构建得到第二载体；
S3：取HEK293T细胞按1：3的比例传至细胞培养盘，并置于CO2培养箱中培养24小时，获得待转染细胞，然后对待转染细胞更换含FBS的DMEM培养基，获得转染前细胞；
S4：取步骤S1制备的第一载体或步骤S2制备的第二载体、pMD2G质粒和psPAX2质粒加入DMEM培养基中制备得到试剂Ⅱ，取PlolyJet转染试剂加入DMEM培养基中制备得到试剂Ⅰ，将试剂Ⅰ与试剂Ⅱ混合后，逐滴加入至步骤S3制备得到的转染前细胞中，然后置于CO2培养箱中培养24小时后，并更换含FBS的DMEM培养基，48小时后收取转染体系上清培养基，将上清培养基过孔径为0.22μm的滤膜后，超速离心滤液，弃上清，将沉淀重悬于TBS缓冲液中，获得第一载体或第二载体转染的慢病毒颗粒；
步骤S5：取外周血单个核细胞，计数细胞以1×107个，以300g离心离心10min，以80uL的MACS Buffer每107个细胞重悬，按照20uL每107个细胞加入CD8+T磁珠，4℃孵育15min；然后按照1～2mL每107个细胞加入MACS Buffer洗涤，以300g离心10min，弃去上清；以MACS Buffer重悬细胞至108个/mL，将离心管置于稳定强磁场中，小心弃去上清，移去磁场，使用MACS Buffer稍用力洗涤并以300g离心10min，得到T细胞，将分选得到的T细胞重悬于RPMI1640培养基中，并添加10％FBS，100U/mL IL-2和5ng/mL IL-15备用；
步骤S6：将步骤S4得到的第一载体和第二载体转染的慢病毒颗粒感染步骤S5分选得到的T细胞，感染过程中每隔一天用DMEM培养基对细胞进行换液，维持细胞浓度在(0.5～2)×106个/mL，感染72小时后，分别选用嘌呤霉素和新霉素经过7天筛选，获得具有嘌呤霉素和新霉素双重抗性的多克隆细胞株，即双荧光CAR-T细胞；
步骤S7：将步骤S6得到的双荧光CAR-T细胞注射入动物体内，分别激发第一荧光和第二荧光，记录荧光位置并计算第一荧光积分光密度和第二荧光积分光密度，以此计算得到活化的CAR-T细胞比例。
为优化上述技术方案，采取的具体措施还包括：
上述步骤S1中，原始慢病毒载体A包括pLent-EF1α-Blasticidin-CMV、pLent-EF1α-Puro-CMV或pLent-EF1α-Neo-CMV。
上述步骤S2中，原始慢病毒载体B包括pLent-Blasticidin-CMV、pLent-Puro-CMV或pLent-Neo-CMV。
上述步骤S1中，第一插入序列从5’端到3’端依次为血液肿瘤相关靶抗原、2A肽和第一荧光蛋白编码基因。
上述的血液肿瘤相关靶抗原为CD分子，具体包括cCD3、CD19、CD22、CD34、CD123和BCMA中的任意一种，优选为CD19、CD22、BCMA或CD123。
上述的2A肽包括E2A、F2A、P2A和T2A中的任意一种，所述的2A肽为自剪切连接肽，功能为连接肿瘤相关靶抗原以及第一荧光蛋白编码基因，使二者能够通过同一个启动子表达但最终形两个分别执行功能的蛋白，优选为P2A或T2A，其中，P2A的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示，P2A编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，T2A编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
上述的第一荧光蛋白编码基因编码近红外荧光蛋白或远红外荧光蛋白，其中，所述近红外荧光蛋白包括IFP1.4、IFP2.0、BDFP1.1、BDFP1.5、iRFP670、iRFP682、iRFP702、iRFP713、iRFP720、PAiRFP1、PAiRFP2、miRFP670、miRFP670-2、miRFP702、miRFP703、miRFP709、miRFP713、miRFP720和miRFP670nano中的任意一种，优选为iRFP713或iRFP720；所述的远红外荧光蛋白包括mKate2、E2-Crimson、mNeptune、iBlueberry、smURFP、TagRFP657和eqFP670中的任意一种，优选为iBlueberry。
上述步骤S2中，第二插入序列从5’端到3’端依次为增强序列、启动子和第二荧光蛋白编码基因。
上述的增强序列与NFAT转录因子特异性结合，序列包括5’-DATGASTCAK-3’、5’-NDATGASTCATH-3’、5’-GAGAGTAGGGAA-3’、5’-AGCGCTCCAAAT-3’、5’-GCTTTAAGGCAA-3’、5’-TGASTCABHNNNNNN-3’、5’-TGGAAATTTCCAVKB-3’和5’-GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT-3’中的任意一种及其反义链；优选为5’-GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT-3’。
所述的启动子包括EF1α、PGK1、Ubc、minP、minADH1和TATAbox中的任意一种，优选为minP或TATAbox；
所述的第二荧光蛋白编码基因编码近红外荧光蛋白或远红外荧光蛋白，其中，所述的近红外荧光蛋白包括IFP1.4、IFP2.0、BDFP1.1、BDFP1.5、iRFP670、iRFP682、iRFP702、iRFP713、iRFP720、PAiRFP1、PAiRFP2、miRFP670、miRFP670-2、miRFP702、miRFP703、miRFP709、miRFP713、miRFP720和miRFP670nano中任意一种，优选为iRFP713或iRFP720，所述的远红外荧光蛋白包括mKate2、E2-Crimson、mNeptune、iBlueberry、smURFP、TagRFP657和eqFP670中的任意一种，优选为iBlueberry。
上述步骤S7中，所述的第一荧光选择远红外荧光蛋白时，第二荧光应选择近红外荧光蛋白或与第一荧光最大发射峰差异在40nm以上的远红外荧光蛋白。
上述CAR-T细胞比例的具体计算公式为：活化的CAR-T细胞比例＝(第一荧光积分光密度/第一荧光相对强度)/(第二荧光积分光密度/第二荧光相对强度)，其中，荧光相对强度为在相同的物质的量下该荧光蛋白与iRFP720荧光强度之比。
本发明的有益效果在于：
本发明使用能够与CAR-T细胞特异性结合的第一荧光标记显像，得到CAR-T细胞的位置及总体荧光强度，在此基础上，利用活化特异性的转录因子激动第二荧光标记显像，并与第一荧光显像对比，不仅可以实时追踪活化细胞所在位置，也可以计算出活化CAR-T细胞所占比例，从而了解体内免疫过继细胞激活程度及存活时间，对后续治疗计划的维持及调整具有重要意义。
附图说明
图1为本发明的第一载体的结构示意图。
图2为本发明的第二载体的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。实施例中未注明具体条件的，按照本领域熟知的常规条件或制造商建议的条件进行，所用仪器或试剂未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
在本实施例中，第一载体采用pLent-EF1α-Puro-CMV作为原始慢病毒载体A，CD19作为肿瘤相关靶抗原，P2A作为连接肽，iRFP720作为第一荧光蛋白。第二载体采用pLent-Neo-CMV作为原始慢病毒载体B，5’-GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT-3’的4次重复作为增强子序列，minP作为启动子，miRFP670nano作为第二荧光蛋白，进行活化CAR-T细胞的定位及定量检测。
术语：
在本发明中，术语“CD19-P2A-iRFP720”指从5’端到3’端依次为CD19编码基因、P2A编码基因和iRFP720编码基因的核苷酸序列，其中CD19的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：5所示，P2A编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，iRFP720编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
在本发明中，术语“Enhenser-minP-miRFP670nano”指从5’端到3’端依次为5’-GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT-3’的4次重复、minP序列和miRFP670nano编码基因的核苷酸序列，其中minP的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，miRFP670nano编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
1.构建第一及第二载体
1.1合成CD19-P2A-iRFP720序列，并在上下游引入AsisⅠ和MluⅠ酶切位点；
1.2合成Enhenser-minP-miRFP670nano序列，并在上下游引入AsisⅠ和MluⅠ酶切位点；
1.3酶切pLent-EF1α-Puro-CMV载体和步骤1.1得到的含有AsisⅠ和MluⅠ酶切位点的CD19-P2A-iRFP720序列，酶切体系如下：
Figure BDA0002393525410000051
1.4酶切pLent-Neo-CMV载体和步骤1.2得到的含有AsisⅠ和MluⅠ酶切位点的Enhenser-minP-miRFP670nano序列，酶切体系如下：
Figure BDA0002393525410000052
1.5将AsisⅠ和MluⅠ酶切后的CD19-P2A-iRFP720序列和pLent-EF1α-Puro-CMV载体于22℃连接2小时，连接体系如下：
成分 体积
CD19-P2A-iRFP720 6μL
pLent-EF1α-Puro-CMV载体 2μL
10×T4 Buffer 1μL
T4 DNA连接酶 1μL
共计 10μL
1.6将AsisⅠ和MluⅠ酶切后的Enhenser-minP-miRFP670nano序列和pLent-Neo-CMV载体于22℃连接2小时，连接体系如下：
成分 体积
Enhenser-minP-miRFP670nano 6μL
pLent-Neo-CMV载体 2μL
10×T4 Buffer 1μL
T4 DNA连接酶 1μL
共计 10μL
连接产物采用化学法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，使用含有100μg/mL氨卞青霉素的LB平板上进行涂布培养，挑选单菌落培养后提取质粒进行酶切和测序验证序列准确性，得到第一载体pLent-EF1α-CD19-P2A-iRFP720-Puro-CMV以及第二载体pLent-Enhenser-minP-miRFP670nano-Neo-CMV。结构分别参见图1和图2。
2.包装慢病毒
2.1将细胞生长量为10cm培养盘最大负载量的90％以上的HEK293T细胞按1：3的比例传至10cm细胞培养盘(每盘细胞数约为2.5×106个)，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时；获得待转染细胞；1：3的比例指1个10cm培养盘的细胞，平均传代到三个同样的培养盘里；
2.2转染前换液，对步骤2.1获得的待转染细胞更换5mL含10％FBS的DMEM培养基，获得转染前细胞；
2.3按下表配制转染试剂
Figure BDA0002393525410000061
Figure BDA0002393525410000071
将试剂Ⅰ与试剂Ⅱ分别配置好，室温放置5-10分钟后；将试剂Ⅰ与试剂Ⅱ混合均匀，室温放置15-30分钟后，得到试剂；将试剂3逐滴加入转染前细胞中，操作保持稳定，使转染体系均匀分布于10cm细胞培养盘，然后置于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时后，更换5mL含10％FBS的DMEM培养基；48小时后，收取转染体系上清培养基，将上清培养基过0.22μm滤膜后，超速离心滤液，弃上清，将沉淀重悬于1mL的TBS缓冲液中，获得第一载体或第二载体转染的慢病毒颗粒。
3.磁珠分选T细胞
首先按如下组成配制MACS Buffer：FBS 0.5％(v/v)+EDTA2mM，溶剂为PBS。以300g离心外周血单个核细胞(PBMCs)10min，计数细胞为1×107个。以80uL的MACS Buffer每107个细胞重悬，按照20uL每107个细胞加入CD8+T磁珠，4℃孵育15min；然后按照1～2mL每107个细胞加入MACS Buffer洗涤，以300g离心10min，弃去上清；以MACS Buffer重悬细胞至108个/mL，将离心管置于稳定强磁场中，小心弃去上清，移去磁场，使用MACS Buffer稍用力洗涤并以300g离心10min，得到T细胞，将分选得到的T细胞重悬于RPMI1640培养基中，并添加10％FBS，100U/mL IL-2和5ng/mL IL-15备用
4.制备双荧光CAR-T细胞
4.1慢病毒感染：在6孔板中，使用第2步中所得的慢第一载体和第二载体转染的慢病毒颗粒一起感染T细胞，按照感染复数为MOI＝10计算慢病毒颗粒用量，感染过程中每隔一天用DMEM培养基对细胞进行换液，维持细胞浓度在(0.5～2)×106个/mL；
4.2抗性筛选：感染72小时后，开始进行抗性筛选：使用浓度为2μg/mL的嘌呤霉素经过7天筛选，获得具有嘌呤霉素抗性的多克隆细胞株，再使用浓度为2μg/mL的新霉素经过7天筛选，获得具有嘌呤霉素和新霉素双重抗性的多克隆细胞株，即双荧光CAR-T细胞。
5.确定可检测到双色荧光所需最少CAR-T细胞数
倍比稀释CAR-T细胞，制备1×108个/mL至1×104个/mL的CAR-T细胞细胞悬液，进行荧光检测，体外检测的曝光时间为5～200s。
6.裸鼠体内检测双荧光CAR-T细胞
将荧光抗体标记的CAR-T细胞注射入小动物体内的方式包括但不限于腹部皮内注射，测定荧光强度，计算相关数值。所述CAR-T细胞比例的具体计算公式为：活化的CAR-T细胞比例＝(第一荧光积分光密度/第一荧光相对强度)/(第二荧光积分光密度/第二荧光相对强度)，其中，荧光相对强度为在相同的物质的量下该荧光蛋白与iRFP720荧光强度之比。
部分荧光的相对强度如下表：
Figure BDA0002393525410000081
本实施例中，活化的CAR-T细胞比例＝(第二荧光积分光密度/第二荧光相对强度)/(第一荧光积分光密度/第一荧光相对强度)＝(第二荧光积分光密度/第一荧光积分光密度)/(第二荧光相对强度/第一荧光相对强度)＝((3.45×106)/(5.3×106))/1.72×100％＝37.8％。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Figure BDA0002393525410000091
Figure BDA0002393525410000101
Figure BDA0002393525410000111
Figure BDA0002393525410000121
序列表
<110> 南京鼓楼医院
<120> 一种基于双色荧光系统的活化CAR-T细胞的示踪及定量方法
<130> not published yet
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> PRT
<213> P2A
<400> 1
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 2
<211> 66
<212> DNA
<213> P2A
<400> 2
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60
ggacct 66
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> T2A
<400> 3
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 4
<211> 63
<212> DNA
<213> T2A
<400> 4
ggaagcggag agggcagagg aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctgga 60
cct 63
<210> 5
<211> 1671
<212> DNA
<213> CD19
<400> 5
atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60
gaggaacctc tagtggtgaa ggtggaaggt gagggagata acgctgtgct gcagtgcctc 120
aaggggacct cagatggccc cactcagcag ctgacctggt ctcgggagtc cccgcttaaa 180
cccttcttaa aactcagcct ggggctgcca ggcctgggaa tccacatgag gcccctggca 240
tcctggcttt tcatcttcaa cgtctctcaa cagatggggg gcttctacct gtgccagccg 300
gggcccccct ctgagaaggc ctggcagcct ggctggacag tcaatgtgga gggcagcggg 360
gagctgttcc ggtggaatgt ttcggaccta ggtggcctgg gctgtggcct gaagaacagg 420
tcctcagagg gccccagctc cccttccggg aagctcatga gccccaagct gtatgtgtgg 480
gccaaagacc gccctgagat ctgggaggga gagcctccgt gtgtcccacc gagggacagc 540
ctgaaccaga gcctcagcca ggacctcacc atggcccctg gctccacact ctggctgtcc 600
tgtggggtac cccctgactc tgtgtccagg ggccccctct cctggaccca tgtgcacccc 660
aaggggccta agtcattgct gagcctagag ctgaaggacg atcgcccggc cagagatatg 720
tgggtaatgg agacgggtct gttgttgccc cgggccacag ctcaagacgc tggaaagtat 780
tattgtcacc gtggcaacct gaccatgtca ttccacctgg agatcactgc tcggccagta 840
ctatggcact ggctgctgag gactggtggc tggaaggtct cagctgtgac tttggcttat 900
ctgatcttct gcctgtgttc ccttgtgggc attcttcatc ttcaaagagc cctggtcctg 960
aggaggaaaa gaaagcgaat gactgacccc accaggagat tcttcaaagt gacgcctccc 1020
ccaggaagcg ggccccagaa ccagtacggg aacgtgctgt ctctccccac acccacctca 1080
ggcctcggac gcgcccagcg ttgggccgca ggcctggggg gcactgcccc gtcttatgga 1140
aacccgagca gcgacgtcca ggcggatgga gccttggggt cccggagccc gccgggagtg 1200
ggcccagaag aagaggaagg ggagggctat gaggaacctg acagtgagga ggactccgag 1260
ttctatgaga acgactccaa ccttgggcag gaccagctct cccaggatgg cagcggctac 1320
gagaaccctg aggatgagcc cctgggtcct gaggatgaag actccttctc caacgctgag 1380
tcttatgaga acgaggatga agagctgacc cagccggtcg ccaggacaat ggacttcctg 1440
agccctcatg ggtcagcctg ggaccccagc cgggaagcaa cctccctggg gtcccagtcc 1500
tatgaggata tgagaggaat cctgtatgca gccccccagc tccgctccat tcggggccag 1560
cctggaccca atcatgagga agatgcagac tcttatgaga acatggataa tcccgatggg 1620
ccagacccag cctggggagg agggggccgc atgggcacct ggagcaccag g 1671
<210> 6
<211> 948
<212> DNA
<213> iRFP720
<400> 6
atggcggaag gatccgtcgc caggcagcct gacctcttga cctgcgacga tgagccgatc 60
catatccccg gtgccatcca accgcatgga ctgctgctcg ccctcgccgc cgacatgacg 120
atcgttgccg gcagcgacaa ccttcccgaa ctcaccggac tggcgatcgg cgccctgatc 180
ggccgctctg cggccgatgt cttcgactcg gagacgcaca accgtctgac gatcgccttg 240
gccgagcccg gggcggccgt cggagcaccg atcactgtcg gcttcacgat gcgaaaggac 300
gcaggcttca tcggctcctg gcatcgccat gatcagctca tcttcctcga gctcgagcct 360
ccccagcggg acgtcgccga gccgcaggcg ttcttccgcc gcaccaacag cgccatccgc 420
cgcctgcagg ccgccgaaac cttggaaagc gcctgcgccg ccgcggcgca agaggtgcgg 480
aagattaccg gcttcgatcg ggtgatgatc tatcgcttcg cctccgactt cagcgggtcc 540
gtgatcgcag aggatcggtg cgccgaggtc gagtcaaaac taggcctgca ctatcctgcc 600
tcattcatcc cggcgcaggc ccgtcggctc tataccatca acccggtacg gatcattccc 660
gatatcaatt atcggccggt gccggtcacc ccagacctca atccggtcac cgggcggccg 720
attgatctta gcttcgccat cctgcgcagc gtctcgccca accatctgga gttcatgcgc 780
aacataggca tgcacggcac gatgtcgatc tcgattttgc gcggcgagcg actgtgggga 840
ttgatcgttt gccatcaccg aacgccgtac tacgtcgatc tcgatggccg ccaagcctgc 900
gagctagtcg cccaggttct ggcctggcag atcggcgtga tggaagag 948
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> minP
<400> 7
tagagggtat ataatggaag ctcgacttcc ag 32
<210> 8
<211> 441
<212> DNA
<213> miRFP670nano
<400> 8
atggcaaacc tggacaagat gctgaatacc acagtaacag aggtgcggca gttcctgcag 60
gtggacagag tgtgcgtgtt ccagtttgag gaggattata gcggagtggt ggtggtggag 120
gccgtggacg ataggtggat ctccatcctg aagacccagg tgcgggatag atacttcatg 180
gagacaaggg gcgaggagta ttctcacggc cgctaccagg ccatcgccga catctacacc 240
gcaaacctga cagagtgcta cagggatctg ctgacacagt ttcaggtgag agcaatcctg 300
gccgtgccca tcctgcaggg caagaagctg tggggcctgt tggtggcaca ccagctggcg 360
gcccctagac agtggcagac ctgggagatc gactttctga agcagcaggc cgtggtggtg 420
ggcatcgcca tccagcagag c 441

Claims (6)

1.一种基于双色荧光系统的活化CAR-T细胞的示踪及定量方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：合成第一插入序列，并在上下游引入AsisⅠ和MluⅠ酶切位点，然后酶切原始慢病毒载体A和得到的含有AsisⅠ和MluⅠ酶切位点的第一插入序列，将AsisⅠ和MluⅠ酶切后的第一插入序列与原始慢病毒载体A于22℃连接2小时，构建得到第一载体；
S2：合成第二插入序列，并在上下游引入AsisⅠ和MluⅠ酶切位点，然后酶切原始慢病毒载体B和得到的含有AsisⅠ和MluⅠ酶切位点的第二插入序列，将AsisⅠ和MluⅠ酶切后的第二插入序列与原始慢病毒载体B于22℃连接2小时，构建得到第二载体；
S3：取HEK293T细胞按1：3的比例传至细胞培养盘，并置于CO2培养箱中培养24小时，获得待转染细胞，然后对待转染细胞更换含FBS的DMEM培养基，获得转染前细胞；
S4：取步骤S1制备的第一载体或步骤S2制备的第二载体、pMD2G质粒和psPAX2质粒加入DMEM培养基中制备得到试剂Ⅱ，取PlolyJet转染试剂加入DMEM培养基中制备得到试剂Ⅰ，将试剂Ⅰ与试剂Ⅱ混合后，逐滴加入至步骤S3制备得到的转染前细胞中，然后置于CO2培养箱中培养24小时后，并更换含FBS的DMEM培养基，48小时后收取转染体系上清培养基，将上清培养基过孔径为0.22μm的滤膜后，超速离心滤液，弃上清，将沉淀重悬于TBS缓冲液中，获得第一载体或第二载体转染的慢病毒颗粒；
步骤S5：取外周血单个核细胞，计数细胞为1×107个，以300g离心10min，以80uL的MACSBuffer每107个细胞重悬，按照20uL每107个细胞加入CD8+T磁珠，4℃孵育15min；然后按照1~2mL每107个细胞加入MACS Buffer洗涤，以300g离心10min，弃去上清；以MACS Buffer重悬细胞至108个/mL，将离心管置于稳定强磁场中，小心弃去上清，移去磁场，使用MACS Buffer稍用力洗涤并以300g离心10min，得到T细胞，将分选得到的T细胞重悬于RPMI1640 培养基中，并添加10% FBS，100U/mL IL-2和5ng/mL IL-15备用；
步骤S6：将步骤S4得到的第一载体和第二载体转染的慢病毒颗粒感染步骤S5分选得到的T细胞，感染过程中每隔一天用DMEM培养基对细胞进行换液，维持细胞浓度在(0.5~2)×106个/mL，感染72小时后，分别选用嘌呤霉素和新霉素经过7天筛选，获得具有嘌呤霉素和新霉素双重抗性的多克隆细胞株，即双荧光CAR-T细胞；
步骤S7：将步骤S6得到的双荧光CAR-T细胞注射入动物体内，分别激发第一荧光和第二荧光，记录荧光位置并计算第一荧光积分光密度和第二荧光积分光密度，以此计算得到活化的CAR-T细胞比例；
所述步骤S1中，第一插入序列从5’端到3’端依次为血液肿瘤相关靶抗原、2A肽和第一荧光蛋白编码基因；
所述步骤S2中，第二插入序列从5’端到3’端依次为增强序列、启动子和第二荧光蛋白编码基因；
所述的增强序列与NFAT转录因子特异性结合，序列包括5’-DATGASTCAK-3’、5’-NDATGASTCATH-3’、5’-GAGAGTAGGGAA-3’、5’-AGCGCTCCAAAT-3’、5’-GCTTTAAGGCAA-3’、 5’-TGASTCABHNNNNNN-3’、5’-TGGAAATTTCCAVKB-3’和5’- GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT-3’中的任意一种及其反义链；所述的启动子包括EF1α、PGK1、Ubc、minP、minADH1和TATAbox中的任意一种；所述的第二荧光蛋白编码基因编码近红外荧光蛋白或远红外荧光蛋白，其中，所述的近红外荧光蛋白包括IFP1.4、IFP2.0、BDFP1.1、BDFP1.5、iRFP670、iRFP682、iRFP702、iRFP713、iRFP720、PAiRFP1、PAiRFP2、miRFP670、miRFP670-2、miRFP702、miRFP703、miRFP709、miRFP713、miRFP720和miRFP670nano中任意一种，所述的远红外荧光蛋白包括mKate2、E2-Crimson、mNeptune、iBlueberry、smURFP、TagRFP657和eqFP670中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的一种基于双色荧光系统的活化CAR-T细胞的示踪及定量方法，其特征在于：所述步骤S1中，原始慢病毒载体A包括pLent-EF1α-Blasticidin-CMV、pLent-EF1α-Puro-CMV或pLent-EF1α-Neo-CMV。
3.根据权利要求1所述的一种基于双色荧光系统的活化CAR-T细胞的示踪及定量方法，其特征在于：所述步骤S2中，原始慢病毒载体B包括pLent-Blasticidin-CMV、pLent-Puro-CMV或pLent-Neo-CMV。
4.根据权利要求1所述的一种基于双色荧光系统的活化CAR-T细胞的示踪及定量方法，其特征在于：所述的血液肿瘤相关靶抗原为CD分子，具体为cCD3、CD19、CD22、CD34、CD123和BCMA中的任意一种；所述的2A肽为E2A、F2A、P2A和T2A中的任意一种；所述的第一荧光蛋白编码基因编码近红外荧光蛋白或远红外荧光蛋白，其中，所述近红外荧光蛋白为IFP1.4、IFP2.0、BDFP1.1、BDFP1.5、iRFP670、iRFP682、iRFP702、iRFP713、iRFP720、PAiRFP1、PAiRFP2、miRFP670、miRFP670-2、miRFP702、miRFP703、miRFP709、miRFP713、miRFP720和miRFP670nano中的任意一种，所述的远红外荧光蛋白为mKate2、E2-Crimson、mNeptune、iBlueberry、smURFP、TagRFP657和eqFP670中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的一种基于双色荧光系统的活化CAR-T细胞的示踪及定量方法，其特征在于：所述步骤S7中，所述的第一荧光选择远红外荧光蛋白时，第二荧光应选择近红外荧光蛋白或与第一荧光最大发射峰差异在40nm以上的远红外荧光蛋白。
6.根据权利要求1所述的一种基于双色荧光系统的活化CAR-T细胞的示踪及定量方法，其特征在于：所述CAR-T细胞比例的具体计算公式为：活化的CAR-T细胞比例=（第一荧光积分光密度/第一荧光相对强度）/（第二荧光积分光密度/第二荧光相对强度），其中，荧光相对强度为在相同的物质的量下该荧光蛋白与iRFP720荧光强度之比。
CN202010122902.8A 2020-02-27 2020-02-27 一种基于双色荧光系统的活化car-t细胞的示踪及定量方法 Active CN111269941B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010122902.8A CN111269941B (zh) 2020-02-27 2020-02-27 一种基于双色荧光系统的活化car-t细胞的示踪及定量方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010122902.8A CN111269941B (zh) 2020-02-27 2020-02-27 一种基于双色荧光系统的活化car-t细胞的示踪及定量方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111269941A CN111269941A (zh) 2020-06-12
CN111269941B true CN111269941B (zh) 2022-02-11

Family

ID=70999560

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010122902.8A Active CN111269941B (zh) 2020-02-27 2020-02-27 一种基于双色荧光系统的活化car-t细胞的示踪及定量方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111269941B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210179675A1 (en) * 2019-12-12 2021-06-17 Vladislav V. Verkhusha Small near-infrared fluorescent proteins developed from cyanobacteriochrome and methods for their engineering
CN111795957B (zh) * 2020-06-30 2022-07-08 浙江大学 一种利用近红外荧光蛋白衍生物或类似物进行近红外二区荧光成像的方法、装置及应用
CN112210540A (zh) * 2020-10-12 2021-01-12 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种表达免疫调控因子的car-t细胞及其应用
CN112210539A (zh) * 2020-10-12 2021-01-12 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种第四代car-t细胞及其应用
CN112735511B (zh) * 2021-01-13 2023-11-03 西北农林科技大学 一种基于qga-svr的冷害黄瓜psii潜在活性预测方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL302133A (en) * 2017-07-13 2023-06-01 Io Therapeutics Inc A combination of a rexinoid and retinoid substance with immunomodulatory properties and immunomodulatory substances for cancer treatment
CN107287207B (zh) * 2017-08-01 2019-02-26 上海优卡迪生物医药科技有限公司 一种用于体内示踪和人工清除car-t细胞的标签和应用
CN109134467B (zh) * 2018-08-09 2022-01-21 中国医学科学院北京协和医院 用于控制嵌合抗原受体t细胞激活/抑制的连接臂及其应用
CN111826398A (zh) * 2019-04-16 2020-10-27 常州费洛斯药业科技有限公司 用于活细胞间膜蛋白展示和相互作用检测的工程质粒系统

Also Published As

Publication number Publication date
CN111269941A (zh) 2020-06-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111269941B (zh) 一种基于双色荧光系统的活化car-t细胞的示踪及定量方法
JP2021184749A (ja) 融合タンパク質を用いたｔｃｒの再プログラミングのための組成物及び方法
CN108026151A (zh) Pd-1-cd28融合蛋白及其在医学中的用途
CN109111525B (zh) 一种hla-g嵌合抗原受体、编码序列和表达载体以及应用
EP3518944A1 (en) Adaptive chimeric antigen receptor t-cell design
CN113234169B (zh) 靶向cll1嵌合抗原受体及其应用
CN109097396B (zh) 一种制备靶向间皮素的car-t细胞的方法
CN115803824A (zh) 鉴定与临床反应相关的特征的方法及其用途
CN114222758A (zh) 抗bcma抗体及其在car-t领域中的应用
CN111484563A (zh) 一种抗cd38嵌合抗原受体及其应用
CN115125272A (zh) 一种car-t治疗载体及其构建方法和应用
CN114921496B (zh) 一种具有nk细胞及adcc能力的人源化免疫系统动物模型的构建方法及其应用
CN111205361B (zh) 白介素21蛋白(il21)突变体及其应用
CN111826398A (zh) 用于活细胞间膜蛋白展示和相互作用检测的工程质粒系统
CN114106199B (zh) 靶向adgre2的嵌合抗原受体及其应用
CN111983218A (zh) 一种用于检测活细胞-活细胞表面受体-配体相互作用的试剂盒
CA3200770A1 (en) Methods and reagents for characterizing car t cells for therapies
CN113736810A (zh) 构建体、载体、蛋白、细胞、制备方法、产品及应用
CN114262382A (zh) 双特异性抗体及其应用
CN114213527A (zh) 一种t细胞受体及其应用
CN114938632A (zh) Mog用于引发胶质母细胞瘤治疗的用途
CN113308491B (zh) 一种共表达nfat和人dnam-1蛋白的重组质粒、重组细胞及其构建方法和应用
CN111434674A (zh) 多肽组合物及其在癌症免疫治疗中的用途
CN114853902B (zh) 嵌合抗原受体及其表达基因、car修饰的nk细胞和应用
CN113045665B (zh) 一种hvem共刺激信号驱动的caix-car-t细胞及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant