CN115125272A - 一种car-t治疗载体及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种CAR‑T治疗载体及其构建方法和应用。该CAR‑T治疗载体，包括AXL scFv；所述AXL scFv包括依次连接的AXL单链抗体轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；linker接头，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；AXL单链抗体重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。构建的CAR‑T治疗载体能够很好的进行慢病毒包被，且抗AXL CAR‑T细胞对AXL高表达的肿瘤细胞具备强大的杀伤能力。

Description

一种CAR-T治疗载体及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程和细胞治疗领域，具体涉及一种CAR-T治疗载体及其构建方法和应用。
背景技术
AXL是一种受体酪氨酸激酶，与TYRO3、MER同属于TAM受体家族。其内源激动剂为GAS6(K Nagata,Ohashi K,Nakano T,et al.Identification of the product of growtharrest-specific gene 6as a common ligand for Axl,Sky,and Mer receptortyrosine kinases[J].J Biol Chem,1996,271(47):30022-30027.Trevor-N Stitt,ConnGreg,Goret Martin,et al.The anticoagulation factor protein S and itsrelative,Gas6,are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosinekinases[J].Cell,1995,80(4):661-670)。AXL胞外区由两个免疫球蛋白样区和两个纤维连接蛋白III样区组成，胞内区具有酪氨酸激酶活性，转膜区连接胞外区与胞内区(GregLemke,Rothlin Carla-V.Immunobiology of the TAM receptors[J].Nature ReviewsImmunology,2008,8(5):327-336)。GAS6与AXL胞外区结合，促使AXL发生同源二聚化，胞内区自磷酸化(Takako Sasaki,Knyazev Pjotr-G,Clout Naomi-J,et al.Structural basisfor Gas6–Axl signalling[J].The EMBO Journal,2005,25(1):80-87)，激活RAS/RAF/MEK/ERK、PI3K/AKT/S6K和NF-κB等下游信号通路(Y Shen,Chen X,He J,et al.Axlinhibitors as novel cancer therapeutic agents[J].Life Sci,2018,19899-111)。
AXL在多种癌症中高表达，如粒细胞性白血病、拟除虫菊酯白血病、巨核细胞白血病、子宫内膜癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肾细胞癌、胶质母细胞瘤、黑素瘤、骨肉瘤等，且AXL过表达与不良预后相关(Rachel-M-A Linger,Keating Amy-K,Earp H-Shelton,et al.TAM Receptor Tyrosine Kinases:BiologicFunctions,Signaling,and Potential Therapeutic Targeting in Human Cancer[J].2008,10035-83)。除此之外，多项研究表明，GAS6/AXL信号通路的激活促进肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭、EMT，诱导耐药发生，对血管生成和肿瘤干细胞的维持有着重要的影响(C Zhu,Wei Y,Wei X.AXL receptor tyrosine kinase as a promising anti-cancer approach:functions,molecular mechanisms and clinical applications[J].Mol Cancer,2019,18(1):153)。因此，AXL是一个具有潜力的抗癌药物靶点。
目前已有多种AXL小分子抑制剂正在进行临床研究，但对于AXL单抗的研究都尚处于临床前阶段。多项研究初步探索了AXL单抗对癌症的治疗作用及其安全性。AXL单抗20G7-D9(Wilhem Leconet,Chentouf Myriam,du Manoir Stanislas,et al.TherapeuticActivity of Anti-AXL Antibody against Triple-Negative Breast Cancer Patient-Derived Xenografts and Metastasis[J].Clinical Cancer Research,2017,23(11):2806-2816)、D9和E8(W Leconet,Larbouret C,Chardès T,et al.Preclinicalvalidation of AXL receptor as a target for antibody-based pancreatic cancerimmunotherapy[J].Oncogene,2014,33(47):5405-5414)可分别抑制三阴性乳腺癌和胰腺癌的生长与转移。YW327.6S2可抑制肿瘤的生长、转移、血管生成，抑制肿瘤相关巨噬细胞分泌炎症因子，合用可增强VEGF抑制剂，EGFR抑制剂以及化疗的疗效(X Ye,Li Y,StawickiS,et al.An anti-Axl monoclonal antibody attenuates xenograft tumor growth andenhances the effect of multiple anticancer therapies[J].Oncogene,2010,29(38):5254-5264)。MAb173可诱导降解AXL，在体内抑制卡波西肉瘤的生长(Ren Liu,Gong Ming,Li Xiuqing,et al.Induction,regulation,and biologic function of Axl receptortyrosine kinase in Kaposi sarcoma[J].Blood,2010,116(2):297-305)。AXL抗体偶联药物AXL-107-MMAE的安全性在食蟹猴身上获得验证，没有出现AXL-特异性毒性(JuliaBoshuizen,Koopman Louise-A,Krijgsman Oscar,et al.Cooperative targeting ofmelanoma heterogeneity with an AXL antibody-drug conjugate and BRAF/MEKinhibitors[J].Nature Medicine,2018,24(2):203-212)。2018年的一项研究使用人源CD8+T细胞构建了AXL特异性CAR-T细胞，并发现其对表达AXL的肿瘤细胞具有杀伤作用且分泌出高水平的IFN-γ和IL-2(Jang-Hwan Cho,Okuma Atsushi,Al-Rubaye Dalal,etal.Engineering Axl specific CAR and SynNotch receptor for cancer therapy[J].Scientific Reports,2018,8(1))。综上所述，针对AXL的肿瘤免疫治疗具有极大的研究前景。
发明内容
为了发挥CAR-T细胞对肿瘤的特异性杀伤作用，获得高滴度的重组慢病毒载体，本发明公开了一种CAR-T治疗载体，包括AXL scFv；所述AXL scFv包括依次连接的AXL单链抗体轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；linker接头，其氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示；AXL单链抗体重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
进一步地，所述AXL单链抗体轻链可变区的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或其他编码SEQ ID NO:3的核苷酸序列；所述linker接头的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或其他编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列；所述AXL单链抗重轻链可变区的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列或其他编码SEQ IDNO:5的核苷酸序列。
进一步地，还包括人EF1α启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；CD8 hinge区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；CD28，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；CD3ζ，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；
所述人EF1α启动子、所述信号肽、所述AXL scFv、所述CD8 hinge区、所述CD28和所述CD3ζ依次连接；所述信号肽位于所述AXL单链抗体轻链可变区的N端；所述linker接头位于所述AXL单链抗体轻链可变区的C端。
进一步地，包括：
pSPAX2质粒，用于表达慢病毒外壳；
pMD2G质粒，用于表达慢病毒的膜蛋白；
携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒，用于转录AXL嵌合分子的RNA；依次连接的所述人EF1α启动子、所述信号肽、所述AXL scFv、所述CD8 hinge区、所述CD28和所述CD3ζ均位于所述携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒中；
其中，所述信号肽的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列或其他编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列；所述CD8 hinge区的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列或其他编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列；所述CD28的核苷酸序列包括如SEQ IDNO:14所示的核苷酸序列或其他编码SEQ ID NO:7的核苷酸序列；所述CD3ζ的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列或其他编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列。
进一步地，所述AXL单链抗体重链可变区与所述CD8 hinge区之间通过由甘氨酸残基和丝氨酸残基组成的二肽连接；所述二肽的核苷酸序列包括5’-GGATCC-3’或其他编码所述二肽的核苷酸序列；所述人EF1α启动子与所述信号肽之间通过如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列连接。
本发明还公开了一种如上所述的CAR-T治疗载体的构建方法，包括以下步骤：
步骤一、将AXL scFv插入穿梭质粒的多克隆位点，得到携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒；
步骤二、将所述步骤一得到的携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒与pSPAX2质粒、pMD2G质粒共同转染HEK293T细胞，在HEK293T细胞中进行基因转录、逆转录、表达后，使包装成功的重组慢病毒载体释放到细胞培养液中，收集包含重组慢病毒载体的上清液；
步骤三、将所述步骤二得到的重组慢病毒载体的上清液通过抽滤、吸附、洗脱纯化得到重组慢病毒载体。
进一步地，所述步骤一具体为：
将如SEQ ID NO:1所示的人EF1α启动子的核苷酸序列、如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO:9所示的信号肽的核苷酸序列、如SEQ ID NO:10所示的AXL单链抗体轻链可变区的核苷酸序列、如SEQ ID NO:11所示的linker接头的核苷酸序列、如SEQ IDNO:12所示的AXL单链抗重轻链可变区的核苷酸序列如、核苷酸序列为5’-GGATCC-3’的二肽的核苷酸序列、如SEQ ID NO:13所示的CD8 hinge区的核苷酸序列、如SEQ ID NO:14所示的CD28的核苷酸序列、如SEQ ID NO:15所示的CD3ζ的核苷酸序列插入穿梭质粒的多克隆位点，得到携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒。
进一步地，通过PCR来验证构建的所述携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒中是否引入了正确的序列；其中涉及的引物对为AXL-humab1-F：5’-GGTGGAGGAAGCCAAGTTCA-3’和AXL-humab1-R：5’-CTCTAAACCTTGGCCGGGAG-3’组成的引物对、AXL-humab2-F：5’-GTGTGACCCTGACTGTGGAC-3’和AXL-humab2-R：5’-AGTAGTCGAAGAAGCCGGTG-3’组成的引物对中的任意一种。
本发明还公开了一种如上所述的CAR-T治疗载体在制备治疗AXL高表达的肿瘤的药物中的应用；其中，所述AXL高表达的肿瘤指其AXL表达水平与LCLC-103H的AXL表达水平以及MDA-MB-231的AXL表达水平在同一数量级上。
进一步地，所述肿瘤包括大细胞肺癌、乳腺癌、急性髓系白血病中的任意一种或多种；所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
进一步地，包括以下步骤：
步骤I、将所述携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒与所述pSPAX2质粒、所述pMD2G质粒共同转染HEK293T细胞，在HEK293T细胞中进行基因转录、逆转录、表达后，使包装成功的重组慢病毒载体释放到细胞培养液中，收集包含重组慢病毒载体的上清液；
步骤II、将所述步骤I得到的重组慢病毒载体的上清液通过抽滤、吸附、洗脱纯化得到重组慢病毒载体；
步骤III、用所述步骤II得到的重组慢病毒载体转染T细胞，构建抗AXL-CAR-T细胞。
进一步地，还包括：
步骤IV、使用流式细胞术确定合适转染的MOI，用qPCR再验证CAR是否成功表达；所述MOI为2.5-10。
本发明还公开了一种如上所述的CAR-T治疗载体在制备治疗肿瘤肺转移的药物中的应用。
进一步地，包括以下步骤：
步骤I、将所述携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒与所述pSPAX2质粒、所述pMD2G质粒共同转染HEK293T细胞，在HEK293T细胞中进行基因转录、逆转录、表达后，使包装成功的重组慢病毒载体释放到细胞培养液中，收集包含重组慢病毒载体的上清液；
步骤II、将所述步骤I得到的重组慢病毒载体的上清液通过抽滤、吸附、洗脱纯化得到重组慢病毒载体；
步骤III、用所述步骤II得到的重组慢病毒载体转染T细胞，构建抗AXL-CAR-T细胞。
进一步地，还包括：
步骤IV、使用流式细胞术确定合适转染的MOI，用qPCR再验证CAR是否成功表达；所述MOI为2.5-10。
本发明的有益效果是：构建的CAR-T治疗载体(带有本发明的AXL scFv)能够很好的进行慢病毒包被，获得重组慢病毒载体滴度可达到1×108TU/ml；通过CAR-T治疗载体构建的抗AXL CAR-T细胞对肿瘤细胞具备强大的杀伤能力，且其杀伤具有选择性，这些特性使得抗AXL CAR-T细胞成为具有潜力的肿瘤治疗策略。本发明涉及的CAR-T治疗载体直接通过改造后的T细胞发挥抗癌作用，相对于AXL抗体和AXL-ADC(AXL抗体药物偶联物)，具有更明显的疗效。
以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。
附图说明
图1是本发明构建的携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒的结构示意图。
图2是转染含抗AXL CAR序列的重组慢病毒载体后，T细胞成功表达抗AXL CAR。A)使用重组慢病毒载体(MOI＝2.5，5，10)转染T细胞，培养2天后使用生物素化的蛋白L、链酶亲和素-PE、抗CD3-APC进行染色，染色结束后使用流式细胞技术检测。B)使用重组慢病毒载体(MOI＝5)转染T细胞，培养2天后裂解细胞，提取总RNA后进行逆转录，获得的cDNA作为模板进行qPCR。内参基因为GAPDH。使用双侧t检验，置信区间为95％，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
图3是抗AXL CAR T细胞对肿瘤细胞具有杀伤作用。空白组采用加入相同体积的培养基但不带有T细胞，对照组以E:T＝4:1加入对照T细胞(即转染CAR病毒之前的外周血提取的T细胞)，实验组以E:T＝4:1加入抗AXL CAR T细胞。通过RTCA，每15min检测一次细胞指数。增值率＝(实时细胞指数-加入T细胞时的细胞指数)/加入T细胞时的细胞指数。
图4是抗AXL CAR T细胞对肿瘤的杀伤具有选择性。空白组加入相同体积的培养基，对照组分别以E:T＝8:1，4:1，2:1加入对照T细胞，实验组分别以E:T＝8:1，4:1，2:1加入抗AXL CAR T细胞。A-C)抗AXL CAR T细胞对LCLC-103H细胞、MDA-MB-231细胞、H460细胞的杀伤。肿瘤细胞贴壁后，空白组加入加入相同体积的培养基，对照组分别以E:T＝8:1，4:1，2:1加入对照T细胞，实验组分别以E:T＝8:1，4:1，2:1加入抗AXL CAR T细胞。通过RTCA，每15min检测一次细胞指数。增值率＝(实时细胞指数-加入T细胞时的细胞指数)/加入T细胞时的细胞指数。D)抗AXL CAR T细胞对LCLC-103H细胞、H460细胞的杀伤选择性。图中为加入T细胞后34小时时的增值率。
图5是PBS组、Mock T组和AXL-CAR T组的MDA231肿瘤生长曲线。分别在0、4、6、8天给8*10^6个细胞/只小鼠。
图6是PBS组、Mock T组和AXL-CAR T组的小鼠肺部图片。第34天将小鼠处死，分离出的三组肺部图片。
图7是抗AXL-CAR T细胞具有体外杀伤HL-60的潜力。抗AXL CAR T细胞对HL-60的杀伤。空白组加入相同体积的培养基(Target cell alone)，对照组以E:T＝1:4加入对照T细胞(Mock T cell 1:4)，实验组以E:T＝1:4加入抗AXL CAR T细胞(CAR T cell 1:4)。培养5天后通过IFNγELISPOT检测T细胞分泌IFNγ。
具体实施方式
本发明所涉及的试剂和耗材均可以通过商业途径购买，除特别标注的外，均来自汉恒生物。
1、依次连接的人EF1α启动子、信号肽、AXL单链抗体轻链可变区、linker接头、AXL单链抗体重链可变区、二肽、CD8 hinge区、CD28、CD3ζ的氨基酸序列和核苷酸序列由本发明人设计，交北京安必奇公司合成。本发明所涉及的引物序列均由北京安必奇公司合成。
2、pSPAX2质粒、pMD2G质粒、用于构建携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒的穿梭质粒、HEK293T细胞、LipofiterTM转染试剂来自汉恒生物。
3、人外周血由健康志愿者提供。
4、细胞系：LCLC-103H(AXL高表达人大细胞肺癌细胞)、H460(AXL低表达人大细胞肺癌细胞)、MDA-MB-231(AXL高表达人乳腺癌细胞)由复旦大学余科老师课题组提供。
实施例1重组慢病毒载体的构建、纯化和检测
1、构建
将依次连接的人EF1α启动子(SEQ ID NO:1)、如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列、信号肽(SEQ ID NO:9)、AXL单链抗体轻链可变区(SEQ ID NO:10)、linker接头(SEQ ID NO:11)、AXL单链抗体重链可变区(SEQ ID NO:12)、二肽(5’-GGATCC-3’)、CD8 hinge区(SEQ IDNO:13)、CD28(SEQ ID NO:14)、CD3ζ(SEQ ID NO:15)的核苷酸序列经酶切、连接、重组反应克隆至穿梭质粒中，得到携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒，元件顺序和编号如图1所示。为了描述简便，将依次连接的人EF1α启动子(SEQ ID NO:1)、如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列、信号肽(SEQ ID NO:9)、AXL单链抗体轻链可变区(SEQ ID NO:10)、linker接头(SEQ IDNO:11)、AXL单链抗体重链可变区(SEQ ID NO:12)、二肽(5’-GGATCC-3’)、CD8hinge区(SEQID NO:13)、CD28(SEQ ID NO:14)、CD3ζ(SEQ ID NO:15)的核苷酸序列称为抗AXL CAR序列。
2、转化
1)DH5α感受态细胞从-80℃冰箱拿出来之后，要立刻放到冰上融化，感受态分装过程操作轻柔，减轻对其机械破坏；
2)待感受态融化后，以每管50μL的体积分装(对于质粒转化，20μL就足够了)，分装之后以不超过感受态体积1/10的量加入携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒(目前加5μL携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒)，冰上放置20-30min；
3)42℃热激90s(这个时间要非常严格)，热激完之后立刻插入冰上冰育2-3min；
在超净台中，加入500μL LB培养基(注意一定是无抗的LB培养基)，轻柔的上下颠倒3-5次；
5)37℃、230rpm震荡培养45-60min；
6)将菌液涂到相应抗性的固体平板上，涂布均匀，然后将板子倒放37℃恒温箱培养12-16h。
3、菌液PCR鉴定
3.1菌液PCR鉴定体系：
Figure BDA0002997044390000071
Figure BDA0002997044390000081
这里的引物1和引物2构成的引物对为AXL-humab1-F：5’-GGTGGAGGAAGCCAAGTTCA-3’(如SEQ ID NO:19所示)与AXL-humab1-R：5’-CTCTAAACCTTGGCCGGGAG-3’(如SEQ ID NO:20所示)；或AXL-humab2-F：5’-GTGTGACCCTGACTGTGGAC-3’(如SEQ ID NO:21所示)与AXL-humab2-R：5’-AGTAGTCGAAGAAGCCGGTG-3’(如SEQ ID NO:22所示)。
3.2菌液PCR鉴定程序
Figure BDA0002997044390000082
4、测序
将筛选出来的阳性克隆，选择两个克隆进行测序，并与设计的目的序列进行比对，确认测序结果与目的序列一致，携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒构建成功。
5、质粒抽提
测序成功之后，根据项目要求安排菌液扩增，进行质粒抽提纯化，质粒抽提的方案按照抽提试剂盒的说明书为准。抽提的质粒需要QC验证合格之后用于转染细胞。备注：质粒QC的原则是浓度大于200ng/uL，260-280在1.8-2.0之间(详细数据根据试剂盒的不同而不同)。
6、慢病毒包装
6.1实验试剂
Figure BDA0002997044390000083
Figure BDA0002997044390000091
6.2实验仪器
Figure BDA0002997044390000092
6.3慢病毒包装及浓缩纯化
6.3.1提前传代293T细胞用于转染(前提是细胞已经培养到可以满足后续转染实验需要)。操作完毕后置于37℃，5％CO2的培养箱中；
6.3.2转染前观察细胞密度，达到70～80％的汇合率即可进行转染；
6.3.3做脂转complex，转染100mm皿的complex成分如下：
Figure BDA0002997044390000093
注：LipofiterTM转染试剂为汉恒生物产品，使用说明参考LipofiterTM说明书。
脂转complex混匀后在室温下温育15min后缓慢滴加至293T细胞中，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；
6.3.4转染后16h更换含10％胎牛血清FBS的新鲜完全培养基；
6.3.5收毒：转染后48h和72h分别收集两次病毒上清(48h收集后置换新鲜完全培养基)。在48h收毒时，将100mm dish中的培养基倒入50mL离心管中，注意培养皿壁不要接触离心管口，以防出现细菌污染，随后补入10mL含10％胎牛血清FBS的新鲜完全培养基，平稳置于37℃，5％CO2的恒温培养箱中继续培养。在72h收毒时，直接将100mm dish中的培养基倒入50mL离心管中，同样注意培养皿壁不要接触离心管口，以防出现细菌污染；
6.3.6超速离心：将50mL离心管中的病毒上清，4℃，2000×g，离心10min，去除细胞碎片；然后收集病毒原液上清置于超速离心管中，4℃，82700×g，离心120min，完全培养基重悬病毒沉淀，最后将超离重悬液分装到灭菌处理的病毒管中。
6.3.7病毒保存：按照要求分装病毒，标记(病毒名称，年-月-日)，-80℃冰箱保存。
7、慢病毒质量检测
慢病毒的质量控制要点包括无菌检测、支原体检测及病毒滴度检测。
7.1无菌检测
检测方法：取10uL病毒加入96孔板的Hela细胞进行验证，培养24h后显微镜镜检：
QC标准：培养基需澄清透明，细胞间隙无明显颗粒，无任何细菌及真菌污染。
7.2支原体检测
检测方法：取10uL病毒，96℃水浴15min后于超净台中配置PCR反应体系。PCR反应后电泳确定是否含有支原体污染。
QC标准：PCR胶图无明显条带。
7.3滴度检测
慢病毒滴度检测采用稀释计数测定法：
滴度单位：TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。“TU”为“transducing units”的缩写，中文为“转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。IU/mL，指每毫升中含有的整合活性的病毒颗粒数。“IU”为integration units的缩写，中文为整合单位。
7.3.1细胞准备
将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1x105/mL,加入96孔板，100μL/孔，为每个病毒准备6个孔。放入37℃，5％CO2培养箱中培养。
7.3.2加病毒
第二天，准备6个1.5mL EP管，第一个EP管中加入10μL病毒液，然后做3倍梯度稀释，共6个稀释度。
7.3.3追加培养液
第三天，有需要加puromycin筛选的孔，先吸去100mL含病毒培养基，加入100μL含1.5μg/mL puromycin的10％FBS完全培养基。
7.3.4观察结果并计算滴度
第五天，在荧光显微镜下观察结果，在观察结果前6h需更换新鲜10％FBS完全培养基，从孔中吸出80μL培养基，然后加入80μL新鲜10％FBS完全培养基，放入37℃，5％CO2培养箱中培养。6h后荧光显微镜下观察结果，荧光百分比在10～50％的孔计算病毒滴度。
滴度(TU/mL)＝细胞数×阳性克隆百分比×MOI(1)×病毒稀释倍数×103TU/mL
结果获得的病毒滴度为1×108TU/ml。
实施例2重组慢病毒载体的功能检测
1、肿瘤细胞的培养
LCLC-103H、H460、MDA-MB-231在RPMI完全培养基【RPMI培养基(Hyclone)+10％FBS(Gibco,Life technologiesTM)+1％青霉素-链霉素混合液(Hyclone)+1％丙酮酸钠(Gibco，Life technologiesTM)】、37℃、5％CO2中培养，以1:3的比例传代。MDA-MB-453在MEM完全培养基【MEM培养基(Hyclone)+10％FBS(Gibco,Life technologiesTM)+1％青霉素-链霉素混合液(Hyclone)+1％丙酮酸钠(Gibco，Life technologiesTM)】、37℃、5％CO2中培养，以1:3的比例传代。
HL-60在RPMI完全培养基【RPMI培养基(Hyclone)+10％FBS(Gibco,LifetechnologiesTM)+1％青霉素-链霉素混合液(Hyclone)+1％丙酮酸钠(Gibco，LifetechnologiesTM)】、37℃、5％CO2中培养，保持细胞密度为1×105～1×106个。
2、T细胞的提取与培养
取健康志愿者血样10ml，加入20mL PBS稀释。将稀释后的血液沿管壁缓慢加至10ml Ficoll-PaqueTM PLUS试剂(GE healthcare)中，800g 30min室温离心(升速度和降速度分别设置为2和1)。离心后吸去血清层，吸取中间白色絮状细胞层<＝10mL至50ml离心管中，该层为人外周血单核细胞层。加入30mL PBS稀释细胞液，400g 15min室温离心(升速度和降速度分别设置为2和1)。弃去上清，用1mL PBS重悬，用70um滤膜过滤，1500rmp 5min室温离心。弃上清，用RPMI完全培养基加200U/mL rhIL-2(Biolegend)重悬细胞至1×106个/mL。放入CO2培养箱中培养2小时后，使用人源T细胞激活/增殖试剂盒(Miltenyi BiotecGmbH)进行刺激，随后培养4-5天，准备转染。每两天进行一次传代。
3、T细胞的转染
收集细胞，1500rmp 5min室温离心。弃上清，细胞使用EasySepTM Buffer重悬。转入5mL圆底试管，放入磁体5min。磁体与试管一同倾斜，倒出并收集细胞液。1500rmp 5min室温离心。弃上清，用RPMI培养基重悬细胞至1×106个/mL。
使用汉恒生物包装病毒进行转染(病毒滴度：1×108TU/ml)：取250ul上述细胞悬液置于24孔板中进行转染，转染体系如下：
Figure BDA0002997044390000121
按体系加入试剂后，200g 1h室温离心。放入培养箱中继续培养，6h后加入RPMI完全培养基加200U/mL rhIL-2将液体量补至500ul。培养48-72小时用流式细胞术检测转染效率。
4、流式细胞术
收集所需细胞，经计数后，调整浓度为1×106/mL，取约100-200ul细胞。4℃，800g离心5min，弃去上清。用200ul PBS洗涤细胞，以相同条件离心后，使用100μL PBS重悬细胞。加入2ul生物素化的蛋白L，4℃孵育45min。以相同条件离心后，使用100μL PBS重悬细胞，并加入2ul链酶亲和素-PE和2ul抗CD3-APC(invitrogen)，避光，4℃孵育45min。结束后，使用500ul PBS洗涤细胞，尽量洗干净，再以相同条件离心，200ul PBS重悬细胞后，使用流式细胞仪检测CAR表达量。
5、qPCR
总RNA抽提：细胞培养皿中细胞样品用PBS洗两次，加入1ml Trizol(invitrogen)溶液，吸至RNase free EP管中，室温静置5min，使细胞裂解。加入200ul氯仿，剧烈涡旋混匀30s，室温静置3-5min。4℃下，2,000g离心5min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管。加入等体积异丙醇，轻柔颠倒6-8次，充分混匀，4℃静置10min。4℃下，14,000g高速离心10min，收集RNA沉淀。加入100ul 75％乙醇，轻轻颠倒EP管，4℃12,000g离心5min，室温放置10min风干；视沉淀量加入20ulDEPC水(至少15ul)溶解沉淀。轻弹，稍微离心。
总RNA纯度和浓度检测：使用NanoDrop2000软件进行总RNA的纯度和浓度检测，并记录其浓度
逆转录反应：使用Takara
Figure BDA0002997044390000131
RT Master Mix试剂配制反应体系:
Figure BDA0002997044390000132
短暂离心去气泡后，水浴37℃，15min，铁浴85℃，5s。加40ul ddH2O将其稀释成10ng/ul，冰浴待用
qPCR反应体系配置：此实验有5组，每组3个复孔，测量2个基因(GAPDH，目的基因)，按照如下配置加入不同上下游引物的Mix：
SYBR Premix DimerEraser(2×) 10ul
Forward Primer(10uM) 0.8ul
Reverse Primer(10uM) 0.8ul
ROX Reference Dye(50×) 0.4ul
ddH2O 6ul
总体积 18ul
其中，GAPDH的引物对序列为：
Hu-GAPDH-F：5’-GTCAAGCTCATTTCCTGGTATG-3’(如SEQ ID NO:17所示)
Hu-GAPDH-R：5’-GTGGTCCAGGGGTCTTACTC-3’(如SEQ ID NO:18所示)
目的基因的引物对序列为：AXL-humab1-F：5’-GGTGGAGGAAGCCAAGTTCA-3’(如SEQID NO:19所示)与AXL-humab1-R：5’-CTCTAAACCTTGGCCGGGAG-3’(如SEQ ID NO:20所示)；和/或AXL-humab2-F：5’-GTGTGACCCTGACTGTGGAC-3’(如SEQ ID NO:21所示)与AXL-humab2-R：5’-AGTAGTCGAAGAAGCCGGTG-3’(如SEQ ID NO:22所示)。
按照每孔18ul Mix加2ul模板配置qPCR反应体系，涡旋一下，短暂离心，去气泡
qPCR反应：使用StepOne Software，设置参数为95℃，30s，1个循环；95℃，5s，60℃，30s，40个循环。测量溶解曲线。
6、RTCA
用RPMI完全培养基配制1×105个/ml肿瘤细胞悬液。在E-plate 16的孔中加入50ul RPMI完全培养基，轻拍成半月形。将E-Plate 16放到RTCA Station上，检测基线，确定所选择的孔接触正常且所有孔的CI低于0.063。取出E-Plate16，在孔中加入50ul混合均匀的肿瘤细胞悬液，使每孔中细胞数目为5,000个/100ul。将E-Plate 16置于超净台中，室温放置30min，随后放入培养箱中的RTCA Station。在系统自动扫描后，设置15min检测一次，10-15小时后肿瘤细胞贴壁时暂停程序，分别加入对照组T细胞及E:T比例为2:1、4:1、8:1的CAR-T后继续监测48h。
7、数据分析与作图
使用Excel进行数据处理，GraphPad Prism 8进行作图。qPCR结果使用双侧t检验分析，置信区间为95％，p<0.05即认为有显著性差异。
8、体内动物实验
10只NSG小鼠(上海南方模式生物科技股份有限公司)，雌性，6-8周。向每只小鼠的第四乳垫种植1*10^7个MDA231细胞，18天后成瘤。根据肿瘤大小平均分为3组，分别为PBS组，Mock T组和AXL-CAR T组。每2或3天分别给予100μL PBS、Mock T细胞和AXL-CAR T细胞(8*10^6个/100μL)，共给予4次。1天或2天测量一次肿瘤大小，在开始给药后34天处死，分离肿瘤与肺部，分别进行拍照、称重。肿瘤体积计算公式：肿瘤体积＝长*宽^2/2。
9、IFNγELISPOT检测
在96孔板中加入50μL混合均匀的HL-60细胞悬液，使每孔中细胞数目为3×104个。分别加入50μL E:T比例1:4的对照组T细胞及CAR-T后共培养5天。培养结束后300g离心5分钟，取上清。使用Human IFNγELISPOT Kit(abcam)进行实验，具体操作按照该试剂盒说明书进行。
10、结果
10.1转染含抗AXL CAR序列的病毒后，T细胞成功表达抗AXL CAR
为了研究转染含抗AXL CAR序列的重组慢病毒载体后的T细胞是否表达抗AXLCAR，使用基于蛋白L染色方法的流式细胞技术进行检测。蛋白L染色可以检测构建的T细胞的AXL CAR的scFv。转染了目标病毒的T细胞中有54.39％染色成功。相比于转染了对照病毒(不含抗AXL CAR序列)的T细胞(下文简称为对照T细胞)，多出了33.10％(图2.A)。由于蛋白L的结合位点是单链抗体中的κ型轻链(邓海峰，韩为东，蒋敬庭.基于蛋白L染色方法的流式细胞术检测嵌合抗原受体的表达[J].临床检验杂志,2018,36(04):241-244)，基于蛋白L的染色方法不能实现特异性结合抗AXL CAR的功能，因此需要使用qPCR验证抗AXL CAR的表达。利用抗AXL CAR上的抗体序列，设计了引物并通过Blast检查了引物的特异性，最后获得了特异性引物。qPCR结果显示，转染了目标病毒的T细胞成功表达了抗AXL CAR(图2.B)。综上所述，转染含抗AXL CAR序列的重组慢病毒载体后，T细胞成功表达抗AXL CAR。
为了提高病毒转染效率，对MOI进行了筛选。设置梯度MOI＝2.5,5,10，在其他条件相同的情况下进行转染，并使用基于蛋白L染色方法的流式细胞技术进行检测。相比于对照组，MOI＝2.5的实验组的染色细胞比例多出了25.38％，MOI＝5的实验组的染色细胞比例多出了33.1％，MOI＝10的实验组的染色细胞比例多出了13.17％(图2.A)。结果表明，MOI＝5是三组中最合适的转染条件。
10.2抗AXL CAR-T细胞对肿瘤细胞具有杀伤作用
为了确定抗AXL CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，选用AXL高表达的大细胞肺癌细胞LCLC-103H，通过RTCA检测加入抗AXL CAR-T细胞后LCLC-103H细胞的增殖情况。相比起空白组和对照组，实验组LCLC-103H细胞的增殖率明显降低(图3)。此结果说明抗AXL CAR-T细胞对LCLC-103H细胞具有杀伤作用。
10.3抗AXL CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤具有选择性
为了研究抗AXL CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用是否与其AXL特异性结合能力有关，选用AXL高表达人大细胞肺癌细胞LCLC-103H、乳腺癌细胞MDA-MB-231、AXL低表达人大细胞肺癌细胞H460，通过RTCA检测加入抗AXL CAR-T细胞后这3种细胞系的增殖情况。对于LCLC-103H、MDA-MB-231两种AXL表达高的细胞系，在E:T＝8:1，4:1，2:1三个比例下，抗AXL CAR-T细胞的杀伤效果都比相同比例下的对照T细胞强(图4.A，B)。而对于H460细胞，在E:T＝2:1的比例下，抗AXL CAR-T细胞与对照T细胞的杀伤效果没有明显差别；在E:T＝4:1、8:1的比例下，抗AXL CAR-T细胞的杀伤比对照T细胞稍强，但并不明显(图4.C)。由图4.D可直观看出，在E:T＝2:1、4:1的比例下，抗AXL CAR-T细胞对LCLC-103H细胞的杀伤能力明显强于对H460的杀伤能力。综上所述，抗AXL CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤具有选择性，杀伤能力强弱与肿瘤细胞的AXL表达水平有关。
10.4抗AXL-CAR T细胞具有体内抗肿瘤的潜力
相比于PBS组，AXL-CAR T组的肿瘤体积显著降低，肿瘤重量也有下降的趋势(图5)。PBS组小鼠的肺部颜色较深，表面能看到黑点，体积也稍大，产生肺转移；Mock T组的表面也有少量黑点；而AXL-CAR T组没有肉眼可见的黑点(图6)。综上所述，抗AXL-CAR T细胞具有体内抗肿瘤的潜力，并且可能能够抑制乳腺癌肺转移。
10.5抗AXL-CAR T细胞具有体外杀伤HL-60的潜力
HL-60是人急性早幼粒细胞白血病细胞，高表达AXL。通过IFNγELISPOT检测T细胞分泌IFNγ浓度，间接测定抗AXL CAR-T细胞对HL-60的杀伤作用。相比起空白组和对照组，实验组的IFNγ浓度有上升趋势(图7)。此结果说明抗AXL CAR-T细胞对HL-60细胞具有杀伤潜力。
AXL在多种肿瘤中高表达(Rachel-M-A Linger,Keating Amy-K,Earp H-Shelton,et al.TAM Receptor Tyrosine Kinases:Biologic Functions,Signaling,andPotential Therapeutic Targeting in Human Cancer[J].2008,10035-83)，且其信号通路被证明与肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭、EMT、耐药发生、血管生成和肿瘤干细胞的维持相关(C Zhu,Wei Y,Wei X.AXL receptor tyrosine kinase as a promising anti-cancerapproach:functions,molecular mechanisms and clinical applications[J].MolCancer,2019,18(1):153)，这些特点使得AXL成为潜在的肿瘤靶点。本课题通过慢病毒转染，成功构建了抗AXL CAR-T细胞，并通过RTCA检测其对肿瘤细胞的杀伤能力，发现其对AXL高表达细胞系LCLC-103H和MDA-MB-231具有强大的体外杀伤作用，对HL-60细胞具有杀伤潜力，而对AXL低表达细胞系H460的杀伤作用有所减弱，证明了其杀伤选择性，展现了抗AXLCAR-T细胞作为AXL表达异常肿瘤治疗策略的潜力。
在使用流式细胞术筛选MOI及检测CAR表达时，本发明使用的是基于protein L的染色方法。由于非特异性结合较多，此方法的背景较高，需要考虑增多洗涤细胞次数、适当降低protein L的用量或减少孵育时间等方法以降低背景。
CAR-T疗法在治疗血液恶性肿瘤中的作用已经被证实，但对于实体瘤的治疗，CAR-T疗法还面临着许多挑战。第一，实体瘤中靶抗原的确定是个难点，但多靶点CAR-T的出现为解决肿瘤异质性对CAR-T疗法的限制提供了一种策略。第二，在实体瘤的治疗中，CAR-T细胞的趋向与浸润限制阻碍其发挥杀伤作用。在CAR-T细胞中同时表达趋化因子受体可以提高CAR-T细胞在肿瘤区域的聚集，表达CXCR2的CAR-T细胞被证实可显着加速CAR-T体内运输和肿瘤特异性积累，并很好地抑制肝癌进展(Guangna Liu,Rui Wei,Zheng Hongli,etal.CXCR2-modified CAR-T cells have enhanced trafficking ability that improvestreatment of hepatocellular carcinoma.[J].European journal of immunology,2020,50(5):712-724)。第三，复杂的肿瘤微环境会对CAR-T细胞产生抑制，表达增强CAR-T持久性的细胞因子或与其他免疫疗法合用可增强CAR-T疗法的疗效。分泌细胞因子白介素-36γ(IL-36γ)的CAR-T细胞的扩增和持久性得到了显著改善，抗肿瘤反应也增强(XinghuoLi,Daniyan Anthony-F,Lopez Andrea-V,et al.Cytokine IL-36γimproves CAR-T-cellfunctionality and induces endogenous antitumor response.[J].Leukemia,2020)。以上挑战也是抗AXL CAR-T疗法需要面对的。通过研究抗AXL CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞的机制，找到抗AXL CAR-T疗法的弱点与所受的限制，并选择合适解决策略，是未来研究的方向和创新点。
除此之外，CAR-T疗法的安全性也是一个具有争议的问题。GTEx的数据显示，AXL在多种正常组织，如脑、心脏、肝脏、骨髓中都有表达。抗AXL CAR-T疗法的安全性也是日后需要研究的方面。
转染含抗AXL CAR序列的病毒后，T细胞成功表达抗AXL CAR。筛选条件发现，MOI＝5时转染效率最高。抗AXL CAR-T细胞能够杀伤AXL高表达LCLC-103H、MDA-MB-231细胞，且杀伤能力强；而对比LCLC-103H，抗AXL CAR-T细胞对AXL低表达H460的杀伤能力弱。抗AXLCAR-T细胞对肿瘤细胞具有强大的杀伤能力，且其杀伤具有选择性，这些特性使得抗AXLCAR-T细胞成为具有潜力的肿瘤治疗策略。
缩略词
GAS6：Growth Arrest-Specific Protein 6，生长停滞特异性蛋白6
EMT：Epithelial-Mesenchymal Transition，上皮-间充质转化
MOI：Multiplicity Of Infection，感染复数
CAR：Chimeric Antigen Receptor，嵌合抗原受体
RTCA：Real-time Cell Analysis，实时无标记细胞分析技术
E:T：Effector Cell to Target Cell，效应细胞：靶细胞
rhIL-2：Recombinant Human Interleukin-2，白细胞介素2
FBS：Fetal Bovine Serum，胎牛血清
PBS：Phosphate Buffer Saline，磷酸缓冲盐溶液
CI：Cell Index，细胞指数
qPCR：Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，实时定量PCR
PE：Phycoerythrin，藻红蛋白
APC：Allophycocyanin，别藻蓝蛋白
CI：Cell Index，细胞指数
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 复旦大学
<120> 一种CAR-T治疗载体及其构建方法和应用
<130> CN017-21001PICN
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1182
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg 60
gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg 120
atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag 180
tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg 240
tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta 300
cttccacgcc cctggctgca gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt tggaagtggg 360
tgggagagtt cgaggccttg cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc 420
tggcttgggc gctggggccg ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct 480
gctttcgata agtctctagc catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac gctttttttc 540
tggcaagata gtcttgtaaa tgcgggccaa gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg 600
gccgcgggcg gcgacggggc ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg 660
cgagcgcggc caccgagaat cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg 720
cctggcctcg cgccgccgtg tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca 780
ccagttgcgt gagcggaaag atggccgctt cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg 840
aggacgcggc gctcgggaga gcgggcgggt gagtcaccca cacaaaggaa aagggccttt 900
ccgtcctcag ccgtcgcttc atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc 960
gattagttct cgagcttttg gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg 1020
atggagtttc cccacactga gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg 1080
taattctcct tggaatttgc cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag 1140
acagtggttc aaagtttttt tcttccattt caggtgtcgt ga 1182
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 3
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Gly Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 5
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Phe
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 7
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
20 25 30
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
35 40 45
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
50 55 60
Ala Tyr Arg Ser
65
<210> 8
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 8
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 9
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 9
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggaga 67
<210> 10
<211> 316
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 10
tcgtgctgac ccagagcccc gctacactgt ctttaagccc cggtgagagg gccacattaa 60
gctgcagcgc cagcagcagc atcggctaca tgtactggta ccagcagaag cccggtcaag 120
ctcctcgtct gctgatctat ttaaccagca atttagccag cggcatcccc gctagattca 180
gcggcagcgg aagcggcacc gactacactt taaccatcag ctctttagag cccgaggact 240
tcgccgtgta ctactgccag cagtggagca gcaaccctcc caccttcggc caaggtacca 300
agctggagat caaggg 316
<210> 11
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 11
tggaggtggc agcggaggag gtgggtccgg cggtggagga agccaagttc agctggtgca 60
gtccggcgct gaggtgaag 79
<210> 12
<211> 312
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 12
aagcccggtg cctccgtgaa ggtgagctgc aaggccagcg gctacccctt caccgacttc 60
tacatcaact gggtgagaca agctcccggc caaggtttag agtggatggg ctggatctac 120
cccggctccg gcaacaccaa gtacaacgag aagttcaagg gtcgtgtgac cctgactgtg 180
gacaccagca tcagcaccgc ctacatggag ctgtctcgtc tgaggagcga cgacaccgcc 240
gtgtactact gcgctcgttc caccggcttc ttcgactact ggggccaagg tactttagtg 300
acagtgagca gc 312
<210> 13
<211> 156
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 13
accactaccc cagcaccgag gccacccacc ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg 60
tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt 120
gacttcgcct gcgatttctg ggtgctggtc gttgtg 156
<210> 14
<211> 237
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 14
ggcggcgtgc tggcctgcta cagcctgctg gtgacagtgg ccttcatcat cttttgggtg 60
aggagcaagc ggagcagact gctgcacagc gactacatga acatgacccc ccggaggcct 120
ggccccaccc ggaagcacta ccagccctac gcccctccca gggatttcgc cgcctaccgg 180
agccgcgtga aattcagccg cagcgcagat gctccagcct acaagcaggg gcagaac 237
<210> 15
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 15
cagctctaca acgaactcaa tcttggtcgg agagaggagt acgacgtgct ggacaagcgg 60
agaggacggg acccagaaat gggcgggaag ccgcgcagaa agaatcccca agagggcctg 120
tacaacgagc tccaaaagga taagatggca gaagcctata gcgagattgg tatgaaaggg 180
gaacgcagaa gaggcaaagg ccacgacgga ctgtaccagg gactcagcac cgccaccaag 240
gacacctatg acgctcttca catgcaggcc ctgccgcctc gg 282
<210> 16
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 16
ttcgaagccg ccacc 15
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 17
gtcaagctca tttcctggta tg 22
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 18
gtggtccagg ggtcttactc 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 19
ggtggaggaa gccaagttca 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 20
ctctaaacct tggccgggag 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 21
gtgtgaccct gactgtggac 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 22
agtagtcgaa gaagccggtg 20

Claims (15)

1.一种CAR-T治疗载体，其特征在于，包括AXL scFv；所述AXL scFv包括依次连接的AXL单链抗体轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；linker接头，其氨基酸序列如SEQID NO:4所示；AXL单链抗体重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
2.如权利要求1所述的CAR-T治疗载体，其特征在于，所述AXL单链抗体轻链可变区的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或其他编码SEQ ID NO:3的核苷酸序列；所述linker接头的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或其他编码SEQ IDNO:4的核苷酸序列；所述AXL单链抗重轻链可变区的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列或其他编码SEQ ID NO:5的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的CAR-T治疗载体，其特征在于，还包括人EF1α启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；CD8 hinge区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；CD28，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；CD3ζ，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；
所述人EF1α启动子、所述信号肽、所述AXL scFv、所述CD8 hinge区、所述CD28和所述CD3ζ依次连接；所述信号肽位于所述AXL单链抗体轻链可变区的N端；所述linker接头位于所述AXL单链抗体轻链可变区的C端。
4.如权利要求3所述的CAR-T治疗载体，其特征在于，包括：
pSPAX2质粒，用于表达慢病毒外壳；
pMD2G质粒，用于表达慢病毒的膜蛋白；
携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒，用于转录AXL嵌合分子的RNA；依次连接的所述人EF1α启动子、所述信号肽、所述AXL scFv、所述CD8 hinge区、所述CD28和所述CD3ζ均位于所述携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒中；
其中，所述信号肽的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列或其他编码SEQID NO:2的核苷酸序列；所述CD8 hinge区的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列或其他编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列；所述CD28的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列或其他编码SEQ ID NO:7的核苷酸序列；所述CD3ζ的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列或其他编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列。
5.如权利要求3所述的CAR-T治疗载体，其特征在于，所述AXL单链抗体重链可变区与所述CD8 hinge区之间通过由甘氨酸残基和丝氨酸残基组成的二肽连接；所述二肽的核苷酸序列包括5’-GGATCC-3’或其他编码所述二肽的核苷酸序列；所述人EF1α启动子与所述信号肽之间通过如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列连接。
6.一种如权利要求1所述的CAR-T治疗载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将AXL scFv插入穿梭质粒的多克隆位点，得到携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒；
步骤二、将所述步骤一得到的携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒与pSPAX2质粒、pMD2G质粒共同转染HEK293T细胞，在HEK293T细胞中进行基因转录、逆转录、表达后，使包装成功的重组慢病毒载体释放到细胞培养液中，收集包含重组慢病毒载体的上清液；
步骤三、将所述步骤二得到的重组慢病毒载体的上清液通过抽滤、吸附、洗脱纯化得到重组慢病毒载体。
7.如权利要求6所述的CAR-T治疗载体的构建方法，其特征在于，所述步骤一具体为：
将如SEQ ID NO:1所示的人EF1α启动子的核苷酸序列、如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO:9所示的信号肽的核苷酸序列、如SEQ ID NO:10所示的AXL单链抗体轻链可变区的核苷酸序列、如SEQ ID NO:11所示的linker接头的核苷酸序列、如SEQ ID NO:12所示的AXL单链抗重轻链可变区的核苷酸序列如、核苷酸序列为5’-GGATCC-3’的二肽的核苷酸序列、如SEQ ID NO:13所示的CD8 hinge区的核苷酸序列、如SEQ ID NO:14所示的CD28的核苷酸序列、如SEQ ID NO:15所示的CD3ζ的核苷酸序列插入穿梭质粒的多克隆位点，得到携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒。
8.如权利要求6或7所述的构建方法，其特征在于，通过PCR来验证构建的所述携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒中是否引入了正确的序列；其中涉及的引物对为AXL-humab1-F：5’-GGTGGAGGAAGCCAAGTTCA-3’和AXL-humab1-R：5’-CTCTAAACCTTGGCCGGGAG-3’组成的引物对、AXL-humab2-F：5’-GTGTGACCCTGACTGTGGAC-3’和AXL-humab2-R：5’-AGTAGTCGAAGAAGCCGGTG-3’组成的引物对中的任意一种。
9.一种如权利要求1～5任一项所述的CAR-T治疗载体在制备治疗AXL高表达的肿瘤的药物中的应用；其中，所述AXL高表达的肿瘤指其AXL表达水平与LCLC-103H的AXL表达水平以及MDA-MB-231的AXL表达水平在同一数量级上。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括大细胞肺癌、乳腺癌、急性髓系白血病中的任意一种或多种；所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
11.如权利要求9所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤I、将所述携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒与所述pSPAX2质粒、所述pMD2G质粒共同转染HEK293T细胞，在HEK293T细胞中进行基因转录、逆转录、表达后，使包装成功的重组慢病毒载体释放到细胞培养液中，收集包含重组慢病毒载体的上清液；
步骤II、将所述步骤I得到的重组慢病毒载体的上清液通过抽滤、吸附、洗脱纯化得到重组慢病毒载体；
步骤III、用所述步骤II得到的重组慢病毒载体转染T细胞，构建抗AXL-CAR-T细胞。
12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，还包括：
步骤IV、使用流式细胞术确定合适转染的MOI，用qPCR再验证CAR是否成功表达；所述MOI为2.5-10。
13.一种如权利要求1～5任一项所述的CAR-T治疗载体在制备治疗肿瘤肺转移的药物中的应用。
14.如权利要求13所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤I、将所述携带抗AXL嵌合分子的穿梭质粒与所述pSPAX2质粒、所述pMD2G质粒共同转染HEK293T细胞，在HEK293T细胞中进行基因转录、逆转录、表达后，使包装成功的重组慢病毒载体释放到细胞培养液中，收集包含重组慢病毒载体的上清液；
步骤II、将所述步骤I得到的重组慢病毒载体的上清液通过抽滤、吸附、洗脱纯化得到重组慢病毒载体；
步骤III、用所述步骤II得到的重组慢病毒载体转染T细胞，构建抗AXL-CAR-T细胞。
15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，还包括：
步骤IV、使用流式细胞术确定合适转染的MOI，用qPCR再验证CAR是否成功表达；所述MOI为2.5-10。
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