CN110177808A - 针对axl或ror2的嵌合抗原受体及其使用方法 - Google Patents

针对axl或ror2的嵌合抗原受体及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110177808A
CN110177808A CN201880007323.XA CN201880007323A CN110177808A CN 110177808 A CN110177808 A CN 110177808A CN 201880007323 A CN201880007323 A CN 201880007323A CN 110177808 A CN110177808 A CN 110177808A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
seq
car
antibody
chimeric antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201880007323.XA
Other languages
English (en)
Inventor
格雷戈里·伊恩·弗罗斯特
詹姆斯·约瑟夫·奥努弗
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Exuma Biotech Corp
Original Assignee
F1 Oncology Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F1 Oncology Inc filed Critical F1 Oncology Inc
Publication of CN110177808A publication Critical patent/CN110177808A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/59—Reproductive system, e.g. uterus, ovaries, cervix or testes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本公开提供了与Axl和Ror2结合的嵌合抗原受体，以及识别Axl和Ror2的条件活性嵌合抗原受体(CAR)。此外，本文提供了编码这些CAR的核酸以及制备和使用CAR的方法，包括治疗癌症的方法，尤其是表达Axl和/或Ror2的癌症，例如肾细胞癌。本公开提供了经遗传修饰以产生CAR的细胞。

Description

针对AXL或ROR2的嵌合抗原受体及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年1月18日提交的美国临时申请号62/447,898、2017年3月3日提交的美国临时申请号62/467,059和2017年7月8日提交的美国临时申请号62/530,193的权益。本段中引用的这些申请通过引用整体并入本文。
序列表
本申请在此通过引用并入与此同时提交的电子序列表的材料。电子序列表中的材料作为文本(.txt)文件提交，文件名为“F1.002.WO.01_Seqlist.txt”，创建于1/17/2018，文件大小为126KB，并通过引用整体并入本文。
联合研究协议
F1 Oncology，Inc.和BioAtla，LLC是与本文公开的主题有关的联合研究协议的缔约方。
技术领域
本公开涉及嵌合抗原受体和嵌合抗原受体在诊断和治疗方法中的用途。
背景技术
在基于细胞的过继免疫治疗中，可以修饰从患者分离的免疫细胞以表达合成蛋白质，使得细胞在随后转移回患者体内后能够执行新的治疗功能。这种合成蛋白质的一个示例是嵌合抗原受体(CAR)。当前使用的CAR的实例是细胞外识别结构域(例如抗原特异性靶向区域或ASTR)、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域的融合体。在抗原结合后，CAR的细胞内信号传导部分可以在免疫细胞中启动活化相关的反应，例如释放细胞溶解分子以诱导肿瘤细胞死亡等。尽管CAR和CAR-T治疗对某些类型的血癌非常有效，但仍需要针对实体瘤的CAR和CAR-T治疗，迄今为止已证明这些治疗更难以实现。
虽然CAR代表了治疗各种疾病的令人印象深刻的方法，但CAR的安全性最近在临床试验期间通过不良事件而受到质疑。减少这些不良事件的一种方法是通过减少ASTR的靶肿瘤外结合。具有条件活性ASTR的CAR仅在某些条件下与抗原结合，例如存在于肿瘤微环境中的那些，并且提供靶肿瘤外结合的减少，使得CAR在正常生理条件下不结合抗原。因此，这些CAR的副作用减少，并且治疗可以更安全地进行。
受体酪氨酸激酶(RTK)是细胞表面受体家族，其通过配体控制的酪氨酸激酶活性调节一系列正常细胞过程。在过去的20年中，RTK的失调已被证明在癌症的发展和进展中起着关键作用。RTK现在被认为是预后分子生物标志物和肿瘤学治疗的靶标。
Axl蛋白(也称为Ark，UFO，Tyro-7)是Tyro-3激酶家族中的RTK。Tyro-3受体激酶的特征在于细胞外区域和细胞质激酶结构域中两个免疫球蛋白样结构域和双纤连蛋白III型重复的组合。Tyro-3受体激酶的配体是Gas6(生长停滞特异性6)和蛋白S，两种维生素K依赖性蛋白，其显示43％的氨基酸序列同一性并具有相似的结构域结构。每种蛋白质都具有含11g-羧基谷氨酸残基的N末端Gla结构域，接着是四个表皮生长因子(EGF)样模块，以及C末端性激素结合球蛋白(SHBG)样结构，其由两个串联层粘连蛋白G结构域组成。SHBG结构域对于Tyro-3受体激酶结合和活化是必需的和足够的，而Gla结构域结合带负电荷的膜磷脂并且在Tyro-3激酶介导的凋亡细胞的吞噬作用中起重要作用。
Axl活化导致通过PI-3-激酶/Akt和其它主要途径如Ras/Erk和β-连环蛋白/TCF的信号传导。Axl在一系列正常组织中弱表达，包括脑，心脏，骨骼肌，器官囊和几个其它器官的结缔组织，以及在单核细胞中，而不是淋巴细胞。已经在成纤维细胞，内皮细胞，血管平滑肌细胞和神经元的存活中描述了由Axl诱导的Akt磷酸化。此外，Axl在细胞粘附和趋化性中起作用，因为Axl基因敲除动物由于血小板整联蛋白IIb3的活化减少而显示出受损的血小板聚集体稳定和血栓形成。
Axl或其配体Gas6的失调涉及多种人癌症的发病机理。Axl过度表达已经在各种癌症类型中得到证实，例如乳腺(Meric等人,Clin.Cancer Res.,vol.8,pp.361-367,2002；Berclaz等人,Ann.Oncol.,vol.12,pp.819-824,2001)，结肠(Chen等人,Int.J.Cancer,vol.83,pp.579-584,1999；Craven等人,Int.J.Cancer,vol.60,pp.791-797,1995)，前列腺(Jacob等人,Cancer Detect.Prey.,vol.23,pp.325-332,1999)，肺(Wimmel等人,Eur JCancer,vol.37,pp.2264-2274,2001)，胃(Wu等人,Anticancer Res.,vol.22,pp.1071-1078,2002)，卵巢(Sun等人,Oncology,vol.66,pp.450-457,2004)，子宫内膜(Sun等人,Ann.Oncol.,vol.14,pp.898-906,2003)，肾(Chung等人,DNA Cell Biol.,vol.22,pp.533-540,2003)，肝细胞(Tsou等人,Genomics,vol.50,pp.331-340,1998)，甲状腺(Ito等人,Thyroid,vol.12,pp.971-975,2002；Ito等人,Thyroid,vol.9,pp.563-567,1999)，骨肉瘤(Nakano等人,J.Biol.Chem.,vol.270,pp.5702-5705,2003)，黑色素瘤(van Ginkel等人,Cancer Res.,vol.64,pp.128-134,2004)，头颈部鳞状细胞癌(Green等人,Br J.Cancer.,vol.94,pp.1446-51,2006)，卵巢癌，肾癌，神经胶质瘤，内分泌，胰腺，淋巴瘤，脑，肝，肾细胞癌，肾透明细胞，膀胱，直肠，宫颈鳞状细胞癌，以及淋巴瘤和各种白血病中，包括慢性髓性白血病(Janssen等人,Oncogene,vol.6,pp.2113-2120,1991；Braunger等人,Oncogene,vol.14,pp.2619-2631 1997；O'Bryan等人,Mol.Cell.Biol.,vol.11,pp.5016-5031,1991)和急性髓性白血病(Rochlitz等人,Leukemia,vol.13,pp.1352-1358,1999)。
Axl表达由靶向化疗药物诱导，并且药物诱导的Axl表达赋予对急性髓性白血病化疗的抗性(Hong et al,Cancer Letters,vol.268,pp.314-324,2008)，以及分别在胃肠道间质瘤(Mehadevan,et al,Oncogene,vol.26,pp.3909-3919,2007)和乳腺癌(Liu et al,Cancer Research,vol.281,pp.6871-6878,2009)中对伊马替尼和拉帕替尼/赫赛汀的抗性。
此外，已经鉴定出Axl与肿瘤转移相关，因为与非侵入性细胞相比，Axl在侵袭性乳腺癌细胞系中上调。在体外，发现Axl活性是迁移和侵袭所需的，并且该活性可以通过抗体处理来抑制(WO 04/008147)。类似地，通过表达Axl的显性阴性形式来体内消除Axl活性(Vajkoczy,P.,等人,Proc.Natl.Acad.Science U.S.A.,vol.103,pp.5799-5804,2005)或通过siRNA介导的Axl下调(Holland等人,Cancer Res.,vol.65,pp.9294-9303,2005)在鼠异种移植实验中防止皮下和原位细胞生长。
因此，已提出抗Axl单克隆抗体用于治疗癌症。例如涉及抗Axl抗体的出版物包括WO2009/063965，WO2009/062690，WO2011/014457，US2014/0227283和美国专利号8,853,369。US2014/0227283公开了单克隆抗Axl抗体及其在诊断和治疗方法中的用途。WO2009/062690公开了与Axl蛋白的细胞外结构域结合并且可以至少部分抑制Axl活性的抗体。然而，即使对于诸如Axl的靶标，其中已经鉴定出单克隆抗体并且可用作试剂，但仍存在许多挑战，使得很难创建针对Axl或Ror2的条件活性CAR。
另一种RTK即Ror2也称为受体酪氨酸激酶样孤儿受体2，是膜结合的，其在正常骨和软骨发育期间通过其与Wnt5A糖蛋白的结合而被非经典Wnt信号传导活化。Ror2仅具有一个跨膜结构域，分离其细胞外和细胞内结构域。已知Ror2在各种器官和组织的正常发育中起关键作用。在哺乳动物中，Ror2和Wnt5A缺陷型小鼠在发育形态发生过程中表现出相似的异常，反映了它们在会聚伸展运动和平面细胞极性方面的缺陷。此外，人Ror2基因的突变负责遗传性骨骼疾病的主导型短指型B型和隐性罗宾尼综合征。已经发现Ror2介导极化细胞迁移和Ror2的功能失调导致可遗传的骨骼疾病和肿瘤侵袭(Minami等人,“Ror-familyreceptor tyrosine kinases in noncanonical Wnt signaling:their implications indevelopmental morphogenesis and human diseases,”Dev Dyn.,vol.239,pp.1-15,2010)。此外，Debebe等人(“Ror2 as a therapeutic target in cancer,”Pharmacol.Ther.,vol.50,pp.143-148,2015)公开了Ror2介导经典和非经典信号传导途径。
还报道了Ror2具有促肿瘤发生作用。US2014/0322234公开了Ror2在各种癌症中的表达和活性与正常组织不同。因此，表明Ror2的失调在多种人癌症的发病机理中起作用。US2014/0322234还预期针对Ror2的抗体可用于诊断癌症和抑制癌细胞生长。例如，这种抗体可以与对表达Ror2的癌细胞具有高度细胞毒性的细胞毒性剂缀合，使得细胞毒剂可以有效杀伤癌细胞。根据癌症中的Ror2表达模式，Ror2基因也可用于癌症的分类。
Ror2参与癌症的发展和进展(“The dual role of the novel Wnt receptortyrosine kinase,Ror2,in human carcinogenesis,”International Journal ofCancer,vol.133,pp.779–787,2013)。具体地，已发现Ror2在许多癌症的癌发生中起关键作用，包括结肠癌，肝细胞癌，转移性黑素瘤和肾细胞癌。例如，Ror2在骨肉瘤，黑素瘤，肾细胞癌，前列腺癌，头颈部鳞状细胞癌，结肠癌，乳腺癌，淋巴瘤，白血病，甲状腺，内分泌胰腺，脑，卵巢，肾乳头状，肺，胰腺，肝脏，肾透明细胞，膀胱，子宫内膜，直肠，宫颈鳞状细胞癌和间质瘤中过度表达。在大多数这些癌症类型中，Ror2表达与更具侵袭性的癌症状态相关。因此，Ror2具有通过抑制Wnt信号传导途径成为癌症治疗的药物靶标的潜力。
仍然需要有效的治疗方法，该方法利用免疫系统的能力来对抗癌症，但是已经减少或消除了靶内肿瘤外以及靶外效应。尽管针对Ror2和Axl的单克隆抗体是可商购的，但是需要CAR包括靶向Ror2或Axl的具有条件活性的抗体片段，其仅在某些环境(例如癌症微环境)中有效靶向表达Ror2或Ax1的细胞。创造这种有条件活跃的CAR存在许多挑战。例如，必须创建和鉴定抗体片段，当它们作为CAR的一部分在T细胞或NK细胞的表面上表达时不仅结合Axl或Ror2，而且还具有识别暴露于癌细胞的表位的能力。此外，这种CAR以条件活性方式与其靶标结合很多，特别是在与正常生理pH相比的肿瘤的酸性pH下。另外，当这些候选CAR与其靶标结合时，必须活化表达CAR的T细胞或NK细胞以表达细胞毒性功能。因此，对含有这种抗体片段的CAR有许多要求，以帮助解决当前CAR-T方法带来的问题。这种针对Axl或Ror2的条件活性CAR将有望用CAR-T治疗治疗实体癌，因此克服了目前CAR-T治疗的主要限制。
发明内容
本公开提供了嵌合抗原受体(CAR)，和包含编码与Ax1和/或Ror2结合的CAR的核苷酸序列的核酸，以及与Ax1和Ror2结合的条件活性生物学(CAB)CAR。本公开提供了经遗传修饰以产生CAR的细胞，以及制备此类细胞的方法。还提供了本公开的CAR可以用于各种方法，包括用于在某些条件例如低于阈值的pH下活化免疫细胞的方法，用于进行过继细胞治疗例如CAR治疗的方法，例如针对癌症例如肾细胞癌的CAR治疗。
在整个本公开中提供了本文提供的方面和实施方式的细节。为了清楚起见，本发明内容部分不旨在且不应被解释为限制本文提供的本公开的范围。
附图说明
图1提供了条形图，其显示了基于eTag表达的FACS分析的CD3+细胞的转导百分比。
图2A-2F显示了CHO-Axl细胞在pH 6.7和pH 7.4下的实时杀伤测定的结果，其中通过表达具有识别Axl的野生型ASTR的对照CAR的T细胞(图2A)和表达识别Axl的候选CAB-CAR的T细胞，其具有识别Axl的条件活性ASTR(图2B-2F)进行。效应物与靶标的比例在图2A和2B中为3：1，并且在图2C-2F中为1：1。
图3A-3J显示了CHO-Ror2细胞在pH 6.7和pH 7.4下的实时杀伤测定的结果，其中通过表达具有识别Ror2的野生型ASTR的对照CAR的T细胞(图3A)和表达识别Ror2的候选CAB-CAR的T细胞，其具有识别Ror2的条件活性ASTR(图3B-J)进行。效应物与靶标的比例为1：1。
图4A显示了在各种pH下表达本文提供的针对Axl的条件活性CAR之一的T细胞对CHO-Axl细胞的实时杀伤测定的代表性结果。图4B提供了对于与图4A相同的CAB-CAR，在所述的各种pH下在20小时时间点的裂解结果。
图5A显示了在各种pH下表达针对本文提供的Ror2的条件活性CAB-CAR之一的T细胞对CHO-Ror2细胞的实时杀伤测定的代表性结果。图5B提供了对于与图5A相同的CAB-CAR，在所述的各种pH下20小时时间点的裂解结果。
图6A显示了人Caki-1细胞在pH 6.7和pH 7.4下的实时杀伤测定的结果，其中通过表达针对Axl的条件活性CAB-CAR之一的T细胞进行。图6B显示了人HEK293细胞在pH 6.7和pH 7.4下的实时杀伤测定的结果，其中通过表达针对Ror2的条件活性CAB-CAR之一的T细胞进行。
图7A显示了用不同浓度的西妥昔单抗或对照(同位素)处理后用表达eTag的慢病毒表达载体转导的PBMC的细胞消耗结果。图7B提供了在用西妥昔单抗或对照(同位素)以各种比例的转导(E)与非转导(T)细胞处理后用表达eTag的慢病毒表达载体转导的PBMC的细胞消耗结果。
图8A-8D显示了在pH 6.7或pH 7.4下共培养或不共培养不同细胞的培养基中细胞因子水平的条形图。使用的各种细胞是表达GMCSF信号序列和eTag的T细胞(F1-0-01)，表达Axl CAB-CAR(F1-2-15)的T细胞，表达Ror2 CAB-CAR的T细胞(F1-1-15)，CHO细胞，表达Axl的CHO细胞(CHO-AXL)和表达Ror2的CHO细胞(CHO-ROR2)。图8A显示了单独或与CHO或CHO-Axl共温育时来自F1-0-01或F1-2-15T细胞的培养基中IL-2的水平。图8B显示了单独或与CHO或CHO-Axl共温育时来自F1-0-01或F1-2-15T细胞的培养基中IFN-γ的水平。当在不存在效应T细胞的情况下温育CHO或CHO-Axl细胞时，培养基中的细胞因子水平也显示为图8A和8B中的对照。图8C显示了单独或与CHO或CHO-Ror2共温育时来自F1-0-01或F1-1-15T细胞的培养基中IL-2的水平。图8D显示单独或与CHO或CHO-Ror2共温育时来自F1-0-01或F1-1-15T细胞的培养基中IFN-γ的水平。当在不存在效应T细胞的情况下温育CHO或CHO-Ror2细胞时，培养基中的细胞因子水平也显示为图8C和8D中的对照。
图9A-9C显示了CHO-Axl细胞的实时杀伤测定的代表性结果，其中在有和没有用pH调节药理学剂处理下，通过表达本文提供的针对Axl的条件活性CAB-CAR之一的T细胞进行。在图9A中，培养基最初处于pH 6.7，并且在箭头指示的时间分别用或不用NaHCO3处理实验孔(实线)和对照细胞(虚线)。在图9B中，培养基最初处于pH 6.7，并且在箭头指示的时间分别用或不用NaOH处理实验孔(实线)和对照细胞(虚线)。在图9C中，培养基最初为pH 7.4，分别用或不用HCl处理实验孔(实线)和对照细胞(虚线)。
图10是显示在施用PBS或碳酸氢盐之前和之后来自携带CHO-异种移植肿瘤的小鼠中来自ProSense FAST探针的RFU百分比的图。
图11A显示了静脉内给药PBS或含有编码F1-0-01(eTag)或F1-1-15(针对Ror2的条件活性CAB-CAR之一)的核酸的慢病毒颗粒转导的人T细胞的B-NSG小鼠中CHO肿瘤的平均肿瘤体积。图11B显示了静脉内给药PBS或含有编码F1-0-01或F1-1-15的核酸的慢病毒颗粒转导的人T细胞的B-NSG小鼠中CHO-Ror2肿瘤的平均肿瘤体积。
图12A显示了瘤内给药PBS或含有编码F1-0-01(eTag)或F1-2-15或F1-2-22的核酸的慢病毒颗粒转导的人T细胞的B-NSG小鼠中CHO肿瘤的平均肿瘤体积。F1-2-15和F1-2-22编码两种针对Axl的条件活性CAB-CAR。图12B显示了瘤内给药PBS或含有编码F1-0-01，F1-2-15或F1-2-22的核酸的慢病毒颗粒转导的人T细胞的B-NSG小鼠中CHO-Axl肿瘤的平均肿瘤体积。
图13A显示了静脉内给药PBS或含有编码F1-0-01(eTag)或F1-2-15或F1-2-22的核酸的慢病毒颗粒转导的人T细胞的B-NSG小鼠中CHO肿瘤的平均肿瘤体积。F1-2-15和F1-2-22编码两种针对Axl的条件活性CAB-CAR。图13B显示了静脉内给药PBS或含有编码F1-0-01，F1-2-15或F1-2-22的核酸的慢病毒颗粒转导的人T细胞的B-NSG小鼠中CHO-Axl肿瘤的平均肿瘤体积。
图14A显示了静脉内给药PBS或含有编码F1-0-01(eTag)或F1-2-15或F1-2-22的核酸的慢病毒颗粒转导的人T细胞的B-NSG小鼠中CHO肿瘤的平均肿瘤体积。F1-2-15和F1-2-22编码两种针对Axl的条件活性CAB-CAR。图14B显示了静脉内给药PBS或含有编码F1-0-01，F1-2-15或F1-2-22的核酸的慢病毒颗粒转导的人T细胞的B-NSG小鼠中CHO-Axl肿瘤的平均肿瘤体积。在图14A和14B中用T细胞给药的小鼠也在前3天每天在远离肿瘤的对侧部位皮下注射IL-2(50000IU)。
定义
本文所用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指工程化受体，其将抗原特异性移植到细胞上，例如T细胞，NK细胞，巨噬细胞和干细胞。本公开的CAR可包括至少一个抗原特异性靶向区(ASTR)，铰链或茎结构域(即细胞外茎结构域(ESD))，跨膜结构域(TM)，一个或多个共刺激结构域(CSD)和细胞内活化结构域(IAD)。在某些实施方式中，ESD和/或CSD是可选的。本文在一些实施方式中提供的CAR具有特异性引用的结构域(例如CD3Z细胞内活化结构域)。对于此类特别引用的结构域，意图是该结构域保留野生型结构域的活性，使得其可以有效地用于CAR(即CAR保留结合靶标的能力，并且作为响应，通过在CAR中发现的细胞内活化结构域传递信号)，并且在提供这种活性的结构域部分上与该特定结构域的已知人序列具有至少80％序列同一性。例如，CD3Z细胞内结构域在氨基酸水平上与已知人CD3Z序列具有至少80％序列同一性，并且当在CAR上发现时保留了在CAR的ASTR与其靶标结合时传递信号的能力。在另一个实施方式中，CAR是双特异性CAR，其对两种不同的抗原或表位具有特异性。在ASTR特异性结合靶抗原后，IAD活化细胞内信号传导。例如，IAD可以利用抗体的抗原结合特性，以非MHC限制的方式将T细胞特异性和反应性重定向到选定的靶标。非MHC限制性抗原识别使表达CAR的T细胞能够识别独立于抗原加工的抗原，从而绕过肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞中表达时，CAR有利地不与内源性T细胞受体(TCR)α和β链二聚化。
本文关于CAR或ASTR使用的术语“条件活性”是指具有较低结合亲和力的CAR或ASTR，或者在说明性实施方式中是在靶微环境中的条件下比在正常生理环境中的条件下对一种或多种靶抗原的更高结合亲和力。在说明性实施方式中，与在非肿瘤微环境中的条件或正常条件下相比，本文提供的条件活性CAR在肿瘤微环境或体外肿瘤替代测定中的条件下更具活性。与非肿瘤微环境相比，肿瘤微环境中的条件包括较低的pH，较高浓度的乳酸和丙酮酸，缺氧，较低的葡萄糖浓度和略高的温度。例如，在某些实施方式中，条件活性CAR在正常体温下实际上是无活性的，但在肿瘤微环境中的较高温度下是活性的。在又另一个实施方式中，条件活性CAR在正常含氧血液中活性较低，但在肿瘤中存在的较少氧化环境下活性较高。在本文提供的说明性实施方式中，条件活性CAR在正常生理pH 7.2-7.8中活性较低，但在存在于肿瘤微环境中的酸性pH 6.0-6.8下更具活性。在本领域技术人员已知的肿瘤微环境中存在其它条件，其也可以用作本公开中的条件，其中条件活性CAR和ASTR具有不同的结合亲和力。条件活性CAR在本文中可称为“条件活性生物CAR”或“CAB-CAR”和“微环境限制生物CAR”或“MRB-CAR”。
本文所用的术语“微环境”是指组织或身体的任何部分或区域，其与其它的组织区域或身体区域具有恒定的或时间的、物理的或化学的差异。对于肿瘤，本文所用的术语“肿瘤微环境”是指肿瘤存在的环境，其是肿瘤内的非细胞区域和肿瘤组织外部的区域，但不属于癌细胞本身的细胞内区域。肿瘤与肿瘤微环境密切相关，不断相互作用。肿瘤可以改变其微环境，微环境可以影响肿瘤的生长和扩散。通常，肿瘤微环境具有5.8至7.0的低pH，更通常在6.0至6.8的范围内，在6.2-6.8的范围内。另一方面，正常的生理pH在7.2-7.8的范围内。还已知肿瘤微环境具有较低浓度的葡萄糖和其它营养物，但与血浆相比具有较高浓度的乳酸。此外，肿瘤微环境的温度可以比正常生理温度高0.3至1℃。肿瘤微环境已在Gillies等人“MRI of the Tumor Microenvironment,”Journal of Magnetic ResonanceImaging,vol.16,pp.430-450,2002中讨论，其全部内容在此引入作为参考。术语“非肿瘤微环境”是指除肿瘤之外的部位的微环境。
本文可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，如核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA，基因组DNA，cDNA，DNA-RNA杂合体，或包含嘌呤和嘧啶碱基的聚合物或其它天然的、化学的或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白，以及保留与表位特异性结合的抗体片段，当抗体的重链和轻链两者都存在用于测定时，通常是与完整抗体具有相同的表位，包括但不限于Fab，Fab'，Fab'-SH，(Fab')2Fv，scFv，二价scFv和Fd片段，嵌合抗体，人源化抗体，单链抗体和融合蛋白，其包含抗体的抗原特异性靶向区和非抗体蛋白。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，例如完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab，Fab'，F(ab')2和Fv片段；双体；线性抗体(Zapata等人,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段具有单个抗原结合位点，和残留的“Fe”片段，该名称反映了容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。
“单链Fv”，“scFv”或“sFv”抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。在一些实施方式中，Fv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使sFv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。
如本文所用，术语“亲和力”是指两种试剂可逆结合的平衡常数，并表示为解离常数(Kd)。亲和力可以比不相关氨基酸序列的抗体的亲和力更高至少1倍，更高至少2倍，更高至少3倍，更高至少高倍，更高至少5倍，更高至少6倍，更高至少7倍，更高至少8倍，更高至少9倍，更高至少10倍，更高至少20倍，更高至少30倍，更高至少40倍，更高至少50倍，更高至少60倍，更高至少70倍，更高至少80倍，更高至少90倍，更高至少100倍，或更高至少1000倍或更多。抗体与靶蛋白的亲和力可以是例如约100纳摩尔(nM)至约0.1nM，约100nM至约1皮摩尔(pM)，或约100nM至约1飞摩尔(fM)或更多。如本文所用，术语“亲合力”是指两种或更多种试剂的复合物在稀释后对解离的抗性。术语“免疫反应性”和“优先结合”在本文中可互换地用于抗体和/或抗原结合片段。
术语“结合”是指两个分子之间的直接缔合，这是由于例如共价，静电，疏水和离子和/或氢键相互作用，包括诸如盐桥和水桥的相互作用。非特异性结合是指结合的亲和力小于约10-7M，例如以10-6M，10-5M，10-4M等的亲和力结合。
如本文所用，术语“铰链区”是指柔性多肽连接区(在本文中也称为“铰链”或“间隔子”)，其提供结构灵活性和与侧翼多肽区域的间隔，并且可由天然或合成的多肽组成。衍生自免疫球蛋白(例如IgG1)的“铰链区”通常定义为从人IgG1的Glu216延伸至Pro230(Burton(1985)Molec.Immunol.,22:161-206)。通过将第一个和最后一个半胱氨酸残基置于相同位置形成重链间二硫键(S-S)键，可以将其它IgG同种型的铰链区与IgG1序列比对。铰链区可以是自然发生的或非自然发生的，包括但不限于如美国专利号5,677,425中所述的改变的铰链区。铰链区可包括完整的铰链区，其衍生自与CH1结构域不同的类或亚类的抗体。术语“铰链区”还可以包括衍生自CD8，CD28或其它受体的区域，其提供类似的功能以提供对侧翼区域的柔性和间隔。
“分离的”多肽是已经从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的多肽。其天然环境的污染组分是会干扰多肽的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施方式中，通过Lowry方法测定，将多肽纯化(1)至大于90％，大于95％或大于98％的抗体重量，例如大于99重量％，(2)通过使用旋转杯测序仪足以获得至少15个残基的N末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)使用考马斯蓝或银染色在还原或非还原条件下通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)得到均一性。分离的多肽在重组细胞内原位包含多肽，因为不存在多肽天然环境的至少一种组分。在一些情况下，分离的多肽将通过至少一个纯化步骤制备。
本文使用的术语“免疫细胞”通常包括白细胞(白细胞)，其衍生自骨髓中产生的造血干细胞(HSC)。“免疫细胞”包括例如淋巴细胞(T细胞(即T淋巴细胞)，B细胞，自然杀伤(NK)(CD3-CD56+)细胞)和骨髓衍生细胞(中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，单核细胞，巨噬细胞，树突状细胞)。“T细胞”包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括T辅助细胞(CD4+细胞)，细胞毒性T细胞(CD8+细胞)，T调节细胞(Treg)和γ-δT细胞，以及NK T细胞(CD3+和CD56+)。本领域技术人员将理解，如在整个公开中使用的，T细胞和/或NK细胞可仅包括T细胞，仅包括NK细胞，或包括T细胞和NK细胞两者。在本文提供的某些说明性实施方式和方面中，T细胞被活化和转导。此外，在本文提供的某些说明性组合物实施方式和方面中提供T细胞。“细胞毒性细胞”包括CD8+T细胞，天然杀伤(NK)细胞，NK-T细胞，T细胞和嗜中性粒细胞，它们是能够介导细胞毒性反应的细胞。
如本文所用，术语“干细胞”通常包括多能干细胞或专能干细胞。“干细胞”包括例如胚胎干细胞(ES)；间充质干细胞(MSC)；诱导多能干细胞(iPS)；和定型祖细胞(造血干细胞(HSC)；骨髓衍生细胞等)。
除非另有说明，本文所用的术语“Axl”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然Ax1，包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括“全长”，未加工的Axl以及由细胞加工产生的任何形式的Axl。该术语还包括Axl的天然存在的变体，例如剪接变体或等位基因变体。人Axl的氨基酸序列在本领域中是公知的，并且可从诸如GenBank的公共数据库获得。
如本文所用的术语“Axl活化”是指Axl受体的活化或磷酸化。通常，Axl活化导致信号转导(例如由磷酸化Axl或底物多肽中酪氨酸残基的Axl受体的细胞内激酶结构域引起)。Axl活化可以通过Axl配体(Gas6)与目的Axl受体结合来介导。与Axl结合的Gas6可以活化Axl的激酶结构域，从而导致Axl中酪氨酸残基的磷酸化和/或其它底物多肽中酪氨酸残基的磷酸化。
本文所用的术语“Axl介导的抗凋亡”是指所有涉及Axl的过程，其阻止人细胞优选但不限于人癌细胞的程序性细胞死亡(凋亡)。特别地，它指的是阻止人细胞的过程，优选但不限于人癌细胞通过生长因子戒断，缺氧，暴露于化学治疗剂或辐射诱导细胞凋亡，或启动Fas/Apo-1受体介导的信号，通过Axl的非催化或催化活性刺激或介导，优选包括Axl磷酸化和/或Axl介导的信号转导。
如本文所用的术语“Ror2”是指受体酪氨酸激酶样孤儿受体2，其是具有体外蛋白激酶活性的预测的943-氨基酸蛋白，以Genbank登录号AAI30523显示。许多谱系限制性受体酪氨酸激酶最初被鉴定为与已知受体同源的“孤儿”，并且仅随后用于鉴定其未知的生长因子。DeChiara等人(2000)确定了一个由Ror2编码的孤儿。
如本文所用，术语“治疗”等是指获得所需的药理学和/或生理学作用。该效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的不良作用而言可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖哺乳动物(例如人)中疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病在可能易患该疾病但尚未诊断为患有它的受试者中发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展；(c)缓解疾病，即引起疾病消退。
本文可互换使用的术语“个体”，“受试者”，“宿主”和“患者”是指哺乳动物，包括但不限于人，鼠(例如大鼠，小鼠)，兔类动物(例如兔子)，非人灵长类动物，人，犬科动物，猫科动物，有蹄类动物(例如马科动物，牛科动物，绵羊科动物，猪科动物，刚果科动物)等。
“治疗有效量”或“有效量”是指药剂的量或两种药剂的组合量，当施用于哺乳动物或其它受试者治疗疾病时，足以影响对于疾病的这种治疗。“治疗有效量”将根据待治疗受试者的药剂，疾病及其严重程度和年龄，体重等而变化。
如本文所用，术语“进化”是指使用一种或多种诱变方法产生编码不同多肽的不同多核苷酸，其本身是改进的生物分子和/或有助于生成另一种改进的生物分子。
“生理学”或“正常”或“正常生理学”条件是诸如但不限于温度，pH，渗透压，重量摩尔渗透压浓度，氧化应激和电解质浓度以及其它参数的条件，其被认为在受试者的施用部位的正常范围内，或在作用部位的组织或器官处。
应理解，本公开以及本文提供的方面和实施方式不限于所公开的具体实例，因此当然可以改变。还应理解，本文使用的术语仅是为了公开具体的实施例和实施方式，而不是限制性的，因为本公开的范围仅受所附权利要求的限制。
应理解的是，在值范围提供为下限单位的十分之一(除非上下文另有明确规定)、在该范围的上限和下限之间、以及所述范围内的任何其它所述或中间值时，该中间值各自包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包括在本发明内，受所述范围内的任何特别排除的限制。在所述范围包括一个或两个限制的情况下，排除那些包括的限制之一或两者的范围也包括在本发明中。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料也可用于本发明的实践或测试，但现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用并入本文，以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。
必须注意，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一种”、“一个”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“嵌合抗原受体”包括多种这样的嵌合抗原受体及其本领域技术人员已知的等同物等。还应注意，可以起草权利要求以排除任何可选要素。因此，本声明旨在用作与权利要求要素的叙述或使用“否定”限制有关的“单独”和“仅”等专用术语的先行基础。
应当理解，为了清楚起见，在单独的实施方式的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。本发明具体包括与本发明有关的实施方式的所有组合，并且在本文中公开，就好像每个和所有组合被单独和明确地公开。此外，各种实施方式及其要素的所有子组合也具体包含在本发明中并且在本文中公开，就好像每个和所有这样的子组合在本文中单独和明确地公开。
具体实施方式
本文公开的方面和实施方式通过在一个方面提供用于结合Axl和/或Ror2的条件活性嵌合抗原受体(CAR)来克服当前治疗的肿瘤外效果的问题。用于结合Axl和/或Ror2的CAR在肿瘤环境中是活性的，但在正常的生理组织/器官不是。除了结合Axl和/或Ror2的CAR的各种实施方式之外，本文提供的核酸实施方式包括编码本文提供的任何CAR的核苷酸序列，以及用于表达任何CAR的病毒构建体，用至少一种病毒构建体感染的细胞，以及表达CAR的重组细胞。本公开的CAR可以以各种方法使用，还提供了用编码本公开的CAR的表达载体(例如重组病毒载体)感染T细胞和其它细胞毒性细胞的方法。
嵌合抗原受体
本公开提供了嵌合抗原受体，为简单起见，其在本文中称为“CAR”。在说明性实施方式中，本公开的CAR结合Ax1或Ror2，并且在进一步的说明性实施方式中，CAR以条件活性方式结合Ax1或Ror2。在某些示例性实施方式中，本文提供的CAR包括：a)至少一种条件活性抗原特异性靶向区(ASTR)，其在pH 6.7与pH 7.4相比下表现出增加的结合；b)跨膜结构域；和c)细胞内活化结构域。在说明性实施方式中，CAR的抗原特异性靶向区域是抗Axl或抗Ror2抗体的条件活性scFv部分。此外，在说明性实施方式中，与正常生理环境相比，ASTR在肿瘤环境或体外肿瘤替代测定条件下表现出活性的增加。
本公开的CAR可以存在于真核细胞例如哺乳动物细胞的质膜中，其中合适的哺乳动物细胞包括但不限于细胞毒性细胞，T淋巴细胞，干细胞，干细胞的后代，祖细胞，祖细胞的后代，NK细胞，NK-T细胞和巨噬细胞。当存在于真核细胞的质膜中时，本公开的CAR在Axl和/或Ror2存在下具有活性，在某些条件下，其与ASTR结合。Axl和Ror2是特异性结合对的第二成员。特异性结合对的Axl和/或Ror2可以是可溶(例如不与细胞结合)因子；存在于细胞例如靶细胞表面的因子；存在于固体表面上的因子；和存在于脂质双层中的因子等。当ASTR是抗体，并且特异性结合对的第二成员是抗原时，抗原可以是可溶(例如不与细胞结合)抗原；存在于细胞例如靶细胞表面上的抗原；存在于固体表面上的抗原；和存在于脂质双层中的抗原等。
在一些情况下，本公开的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且被Axl和/或Ror2活化时，增加细胞中至少一种核酸的表达。例如，在一些情况下，本公开的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且被Axl和/或Ror2活化时，使得与不存在Axl和/或Ror2时核酸的转录水平相比，该细胞中至少一种核酸的表达增加至少约10％，至少约15％，至少约20％，至少约25％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约75％，至少约2倍，至少约2.5倍，至少约5倍，至少约10倍或超过10倍。
作为实例，本公开的CAR可包括基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的细胞内信号传导多肽；在这种情况下，本公开的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且被Axl和/或Ror2活化时，增加活化T细胞(NFAT)依赖性转录的核因子。NFAT依赖性转录包括由NFAT家族的任何成员诱导的转录，包括例如NFATel，NFATc2，NFATc3，NFATc4，NFAT5；AP-1；SPL；和NKKB等。
本公开的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且被Axl或Ror2活化时，在某些情况下可导致细胞产生一种或多种细胞因子。例如，本公开的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且被Axl或Ror2活化时，可以使得与不存在Axl和/或Ror2时细胞产生的细胞因子的量相比，该细胞产生的细胞因子增加至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少40％，至少50％，至少75％，至少2倍，至少2.5倍，至少5倍，至少10倍或超过10倍。在一些实施方式中，本公开的CAR在存在于真核细胞的膜中时且被Axl和/或Ror2活化时，可以使得与不存在Axl和/或Ror2时细胞分泌的细胞因子的量相比，该细胞分泌的细胞因子增加至少10％，至少15％。至少20％，至少25％，至少30％，至少40％，至少50％，至少75％，至少2倍，至少2.5倍，至少5倍，至少10倍或超过10倍。可以增加产生的细胞因子包括但不限于干扰素γ(IFN-γ)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，IL-2，IL-15，IL-12，IL-4，IL-5，IL-10；趋化因子；和增长因素等。
在一些情况下，本公开的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且被Axl和/或Ror2活化时，可以导致细胞中核酸转录的增加，细胞因子产生的增加，和细胞分泌细胞因子的增加。
在一些情况下，本公开的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且被Axl和/或Ror2活化时，导致细胞对靶细胞的细胞毒活性，所述靶细胞在其细胞表面上表达CAR的第一多肽的抗原结合结构域所结合的抗原。例如，当真核细胞是细胞毒性细胞(例如NK细胞或细胞毒性T淋巴细胞)时，本公开的CAR在存在于细胞的质膜中时且被Axl和/或Ror2活化时，增加细胞对靶细胞的细胞毒活性，所述靶细胞在其细胞表面上表达Axl和/或Ror2。例如，当真核细胞是NK细胞或T淋巴细胞时，本公开的CAR在存在于细胞的质膜中时且被Axl和/或Ror2活化时，使得与不存在Axl和/或Ror2时细胞的细胞毒活性相比，该细胞的细胞毒活性增加至少约10％，至少约15％，至少约20％，至少约25％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约75％，至少约10％，至少约2倍，至少约2.5倍，至少约5倍，至少约10倍或超过10倍。
在一些情况下，本公开的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且被Axl和/或Ror2活化时，可导致其它CAR活化相关事件，例如增殖和扩增(由于增加的细胞分裂或抗细胞凋亡反应)。
在一些情况下，本公开的CAR在存在于真核细胞的质膜中时且被Axl和/或Ror2活化时，可导致其它CAR活化相关事件，例如细胞内信号传导调节，细胞分化或细胞死亡。
本公开的CAR可以存在于真核细胞膜中，其中CAR的第一和第二多肽彼此不共价连接。本公开的CAR可以作为单个异二聚体存在于真核细胞膜中，其不与膜中的任何其它多肽共价连接。或者，本公开的第一CAR可以作为异二聚体存在于真核细胞膜中，其与本公开的第二CAR共价或非共价连接。在一些情况下，第一和第二CAR通过存在于第一CAR的第一多肽和第二CAR的第一多肽两者中的铰链区中存在的半胱氨酸之间形成的二硫键共价连接。
在一些情况下，本公开的CAR可以存在于真核细胞膜中，其中CAR的第一多肽包括抗体片段，并且CAR的第二多肽包括源自细胞因子受体的信号转导结构域，使得在二聚化时，CAR可以代表异二聚体-信号体CAR，例如由至少两个独立多肽组成的信号体。如本领域已知的，“信号体”是由抗体片段和衍生自细胞因子受体的信号转导结构域组成的单一嵌合大分子。在某些情况下，本公开的异二聚体-信号体CAR在存在于真核细胞的细胞膜中、通过二聚化物二聚化并被抗原(例如寡聚化的抗原)活化时，可以诱导异二聚体-信号体CAR的寡聚化。异二聚体-信号体CAR的这种配体诱导的寡聚化可以活化，例如增加或延续(例如维持)信号转导，例如异二聚体-信号体CAR的配体诱导的寡聚化可以传递引发细胞反应的信号。在一些情况下，可以组合使用多个异二聚体-信号体CAR以引发所需的细胞反应。
抗原特异性靶向区域
本公开的CAR包括特异性结合对的成员，其通常是ASTR。特异性结合对包括但不限于抗原-抗体结合对；和配体-受体结合对等。因此，适用于本公开的CAR的特异性结合对的成员包括作为抗体，抗原，配体，配体的受体结合结构域，受体，受体的配体结合结构域和亲和体的ASTR。
适用于本公开的CAR的ASTR可以是任何抗原结合多肽。在某些实施方式中，ASTR是抗体，例如全长抗体，单链抗体，Fab片段，Fab'片段，(Fab')2片段，Fv片段和二价单链。抗体或双抗体。
在一些实施方式中，ASTR是单链Fv(scFv)。在一些实施方式中，重链位于CAR中轻链的N末端。在其它实施方式中，轻链位于CAR中重链的N末端。在任何公开的实施方式中，重链和轻链可以通过接头分开，如本文更详细讨论的。在任何公开的实施方式中，重链或轻链可以位于CAR的N末端，并且通常是另一个结构域的C末端，例如信号序列或肽。
其它基于抗体的识别结构域(cAb VHH(骆驼抗体可变结构域)和人源化形式，IgNAR VH(鲨鱼抗体可变结构域)和人源化形式，sdAb VH(单结构域抗体可变结构域)和“骆驼”抗体可变结构域适用于使用本公开的CAR和使用CAR的方法。在一些情况下，基于T细胞受体(TCR)的识别结构域如单链TCR(scTv，含有VαVβ的单链双结构域TCR)也适合使用。
条件活性生物CAR(CAB-CAR)
本公开的CAR通常是条件活性的。该属性通常是CAR的ASTR结构域的条件活性性质的结果。在说明性实施方式中，本公开的CAB-CAR在肿瘤微环境中的条件下比在非肿瘤微环境中的条件下对Axl或Ror2具有更高的结合亲和力。在一些实施方式中，肿瘤微环境中的条件和非肿瘤微环境中的条件都是pH。因此，CAB-CAR可以以条件活性方式选择性地结合Axl或Ror2，这通常是因为它们在pH为约6.0-6.8(在肿瘤微环境中遇到的pH)相比于pH为7.2-7.8(在正常生理环境中遇到的pH)下对Axl或Ror2具有更高的结合亲和力。例如，CAB-CAR在pH 6.7下比在pH 7.4下对Axl或Ror2可以具有更高的结合亲和力。另外或可替代地，CAB-CAR在pH 6.0下比在pH 7.4下对Axl或Ror2可以具有更高结合亲和力。可以在体外肿瘤替代测定中测试这样的条件，例如在体内肿瘤环境中发现的一种或多种条件下测试抗原结合和/或CAR活性(例如细胞裂解)，如下面更详细地阐述的，它与正常生理组织中的相应条件不同。例如，与生理pH(7.2-7.8)相比，体外肿瘤替代测定条件可以是低pH(例如6.0-6.8)。在说明性实例中，肿瘤替代测定条件是pH为6.7，而相应的生理pH为7.4。
在一些实施方式中，可以通过鉴定在生理条件下鉴定的抗体的VH和/或VL(即亲本、“野生型”或“wt”抗体)来获得CAB-CAR。然后可以对抗体进行突变和测试(进化)。本领域技术人员可利用该方法鉴定8,709,755中公开的条件活性抗体，以鉴定可用于本公开CAB-CAR的ASTR中的其它条件活性抗体和抗体片段。互补决定区(CDR)是通过VH和VL的相互作用形成的三维结构。为了改变起始点(“wt”抗体)的结合特异性，有理由期望突变VH/VL中的一个或两个可导致CAB-CAR中的CAB活性。为了产生条件活性抗体，通常在生理条件下鉴定VH和VL两者，然后对VH或VL或更通常VH和VL两者在非生理条件例如pH6.0至6.7或肿瘤微环境的另一种条件下(例如pH)进行突变和测试，以产生条件活性抗体。
可以使用已知方法克隆编码野生型抗体的VH和/或VL区的核酸。然后可以通过将修饰引入编码重链和轻链可变区的核苷酸序列来制备这种野生型VH和VL区的变体。此类修饰包括例如抗体或抗体片段的氨基酸序列内的残基的缺失、和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以获得条件活性抗体片段。
用于制备和/或分离条件活性ASTR的更详细方法在本文的单独部分中提供。
针对Axl的条件活性ASTR
本文提供的任何各方面的说明性实施方式包括具有条件活性ASTR的CAR，其pH6.7下与pH 7.4相比特异性结合Axl蛋白。此类ASTR和含有此类ASTR的CAR的实例在本文的实施例中提供。在某些实施方式中，ASTR与包含SEQ ID NO：79的重链和SEQ ID NO：80的轻链的抗体结合Axl的相同表位。在示例性实施方式中，ASTR与包含SEQ ID NO：79的抗体重链和SEQ ID NO：80的抗体轻链的单链可变抗体片段结合Axl的相同表位。
ASTR可以是单链抗体，Fab片段，Fab'片段，(Fab')2片段，Fv片段，二价单链抗体或双抗体。在说明性实施方式中，结合Axl的条件活性ASTR是包含重链和轻链的单链可变片段。
在ASTR结合Axl的一些实施方式中，并且在说明性实施方式中是与包含SEQ IDNO：79的抗体重链和SEQ ID NO：80的抗体轻链的单链可变抗体片段结合Axl的相同表位，重链可变区可包括三个互补决定区，所述互补决定区具有序列H1，H2和H3，其中：
H1序列是X1GX2TMN(SEQ ID NO：87)；
H2序列是LIKPSNGGTSYNQKFKG(SEQ ID NO：88)；和
H3序列是GX3YX4SYX5AMDY(SEQ ID NO：89)，其中X1是T或W；X2为H或A，X3为H或D；X4是E或H；X5是E或F。
在ASTR结合Axl的一些实施方式中，并且在说明性实施方式中是与包含SEQ IDNO：79的抗体重链和SEQ ID NO：80的抗体轻链的单链可变抗体片段结合Axl的相同表位，所述片段包括紧接在上面的重链实施方式，ASTR可包括含有三个互补决定区的轻链可变区，所述互补决定区具有序列L1，L2和L3，其中：
L1序列是KASQDVX6SAVA(SEQ ID NO：90)；
L2序列是WX7X8TRX9T(SEQ ID NO：91)；和
L3序列是QEHFSX10PLX11(SEQ ID NO：92)，
其中X6是S或V；X7是A或Q；X8是S或D；X9是H或D；X10是T或P；X11是T或R。
在ASTR结合Axl的一些实施方式中，并且在说明性实施方式中是与包含SEQ IDNO：79的抗体重链和SEQ ID NO：80的抗体轻链的单链可变抗体片段结合Axl的相同表位，重链可变区可包括三个互补决定区，所述互补决定区具有序列H1，H2和H3，其中：
H1序列是X1GX2X3MX4(SEQ ID NO：134)；
H2序列是LIKX5SNGGTX6YNQKFKG(SEQ ID NO：135)；和
H3序列是GX7X8X9X10X11X12X13X14DYX15X16(SEQ ID NO：136)，
其中X1是T，A或W；X2是H或A；X3是T或I；X4是N或I；X5是P或N；X6是S，I或T；X7是H，D，E，P，R或W；X8是Y或N；X9是E，A，D，F，G，H，I，L，M，N，R，V或Y；X10是S，D，M，N或Q；X11是Y，C，E或P；X12是F，E，N，S，T或V；X13是A，D，G，L或Y；X14是M，E或F；X15是W，A，D，H，L，N，P，R或T；X16是G或H。
在ASTR结合Axl的一些实施方式中，并且在说明性实施方式中是与包含SEQ IDNO：79的抗体重链和SEQ ID NO：80的抗体轻链的单链可变抗体片段结合Axl的相同表位，所述片段包括紧接在上面的重链实施方式，ASTR可包括含有三个互补决定区的轻链可变区，所述互补决定区具有序列L1，L2和L3，其中：
L1序列是KASQDX17X18SX19VX20(SEQ ID NO：137)；
L2序列是X21X22X23TRX24T(SEQ ID NO：138)；和
L3序列是QEX25X26SX27X28X29X30(SEQ ID NO：139)，
其中X17是V，D，G，N或W；X18是S或V；X19是A，L或M；X20是A，D，N或Q；X21是W或F；X22是A，I，N，P或Q；X23是S或D；X24是H或D；X25是H，C，F，I，L，Q，S，T，V或Y；X26是F，C，D，E，G，N或S；X27是T，C或P；X28是P，A，C，D，E，H，K，S，T，V或W；X29是L，G或R；和X30是T，I或R。
在某些说明性实施方式中，ASTR包括SEQ ID NO：80的轻链可变区和/或SEQ IDNO：79的重链可变区。这些说明性实施方式可包括轻链N末端的重链或重链N末端的轻链。在说明性实施方式中，抗Axl ASTR可包括SEQ ID NO：128，SEQ ID NO：129，SEQ ID NO：159，SEQ ID NO：160或SEQ ID NO：161中任一个的序列。
任何这些抗Axl实施方式的重链和轻链包括两个可变区，可变区通常通过接头分开。接头长度可以为6至100个氨基酸。在一些实施方式中，接头是接头1(SEQ ID NO：53)，接头2(SEQ ID NO：54)或接头3(SEQ ID NO：55)。在说明性实施方式中，两个可变区是重链可变区和轻链可变区。重链或轻链可以位于ASTR上其它的N末端。在某些说明性实施方式中，重链在轻链的N末端。
在pH 6.7下与pH 7.4相比已增加与Ax1结合的示例性条件活性CAR(CAB-CAR)在本文实施例1中发现。在说明性实施方式中，CAR或ASTR可以与包含SEQ ID NO：79的抗体重链和SEQ ID NO：80的抗体轻链的单链可变抗体片段结合Axl的相同表位。在此类说明性实施方式的进一步的实施方式中，抗Axl CAR或ASTR包含或是单链可变片段(scFv)。在进一步的说明性实例中，抗Axl scFv包含在轻链N末端的重链或在重链N末端的轻链。在本文包括CAR的任何实施方式中，并且在说明性实施方式中是与包含SEQ ID NO：79的抗体重链和SEQ IDNO：80的抗体轻链的抗体结合Axl的相同表位，ASTR可包括SEQ ID NO：128，129，159，160或161中的任一个。此外，本文任何实施方式的抗Axl CAR可包括本文提供的任何CAR组分。在某些示例性实施方式中，抗Axl CAR可以包括表1中列出的CAR组分，并且可以是表1中的任何CAR。更典型地，对于本文包括抗Axl CAR的任何实施方式，CAR是CAB-CAR和在非限制性说明性实施方式中可包括例如表1中提供的任何CAB-CAR组分和CAB-CAR，其显示细胞毒活性。例如，抗Axl CAB-CAR可包括CD8信号肽，CD8或CD28茎/跨膜结构域，CD137，ICΔ，或ICΔ共刺激结构域和CD137共刺激结构域两者，和/或CD3Z活化结构域。此外，在非限制性说明性实施方式中，本文任何实施方式的示例性CAR包括抗Axl CAR，尤其是抗Axl CAB-CAR，包括在表1中显示条件细胞毒活性的任何抗Axl CAB-CAR。这种说明性的CAB-CAR包括表1的F1-2-1，F1-2-2，F1-2-3，F1-2-6，F1-2-8，F1-2-10，F1-2-13表1的F1-2-14，F1-2-15，F1-2-22或F1-2-23。在包括ASTR的本文的任何实施方式中，ASTR可包括F1-2-1，F1-2-2，F1-2-3，F1-2-6，F1-2-8，F1-2-10，F1-2-13，F1-2-14，F1-2-15F1-2-22或F1-2-23的ASTR。此外，在非限制性说明性实施方式中，本文任何实施方式的示例性CAR包括抗Axl CAR，尤其是抗Axl CAB-CAR，包括在表1中显示高条件细胞毒活性的任何抗Axl CAB-CAR。这种示例性的CAB-CAR包括F1-2-13，F1-2-15，F1-2-22或F1-2-23。因此，在本文包括ASTR的任何实施方式中，ASTR可包括F1-2-1，F1-2-2，F1-2-3，F1-2-6，F1-2-8，F1-2-10，F1-2-13，F1-2-14，F1-2-15，F1-2-22或F1-2-23的ASTR。
使用美国专利号8,709,755中公开的方法，使用亲本抗体重链可变区(SEQ ID NO：93)和亲本抗体轻链可变区(SEQ ID NO：94)鉴定本文公开的重链可变区多肽和轻链可变区多肽。技术人员可利用该方法鉴定8,709,755中公开的条件活性抗体，以鉴定可用于本公开CAB-CAR的ASTR中的其它条件活性抗体和抗体片段。
在一些实施方式中，重链可变区可以是SEQ ID NO：112-114。在一些实施方式中，轻链可变区可以是SEQ ID NO：108-111。这些重链和轻链可变区可以特异性结合Axl。已发现包含这些重链和轻链可变区中的任一个的抗体在pH 6.7下比在pH 7.4下对Axl具有更高的结合亲和力。pH 6.7是在肿瘤微环境中发现的pH。pH 7.4是在非肿瘤的正常生理微环境中发现的pH。
CAR还可以包括SEQ ID NO：108-114的序列的重链和轻链可变区的变体，其可以特异性结合Axl。为了得到这些变体，确定重链可变区(H1-H3)的互补决定区(CDR)和轻链可变区(L1-L3)的CDR应保持完整。这些重链和轻链可变区的变体可以通过在编码重链和轻链可变区的核苷酸序列中引入适当的修饰，或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体或抗体片段的氨基酸序列内的残基的缺失、和/或插入和/或取代。可以使缺失、插入和取代的任何组合达到最终构建体，条件是最终构建体具有至少一种所需特征，例如抗原结合。
针对Ror2的条件活性ASTR
本文提供的任何各方面的说明性实施方式包括具有条件活性ASTR的CAR，其在pH6.7下与pH 7.4相比特异性结合Ror2蛋白。在本文的实施例中提供了这种ASTR和含有这种ASTR的CAR的实例。在某些实施方式中，ASTR与包含SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：83的重链的抗体结合Ror2的相同表位，或ASTR与包含重链SEQ ID NO：151的抗体结合Ror2的相同表位。在说明性实施方式中，ASTR与包含SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：83的抗体重链的单链可变抗体片段结合Ror2的相同表位，或ASTR与包含SEQ ID NO：151的抗体重链的单链可变抗体片段结合Ror2的相同表位。在说明性实施方式中，ASTR与包含SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：83的抗体重链和SEQ ID NO：84的抗体轻链的单链可变抗体片段结合Ror2的相同表位，或ASTR与包含SEQ ID NO：151的抗体重链和SEQ ID NO：152的抗体轻链的单链可变抗体片段结合Ror2的相同表位。
ASTR可以是单链抗体，Fab片段，Fab'片段，(Fab')2片段，Fv片段，二价单链抗体或双抗体。在说明性实施方式中，结合Ror2的条件活性ASTR是包含重链和轻链的单链可变片段。
在ASTR结合Ror2的一些实施方式中，ASTR可包括具有三个互补决定区的重链可变区，所述互补决定区具有H1，H2和H3序列，其中：
H1序列是GYTX1TEX2TX3H(SEQ ID NO：95)或X4GYSITTGYYWN(SEQ ID NO：96)；
H2序列是GX5NX6NNGGTGYNQKFKG(SEQ ID NO：97)或YITYDGSKNYNPSLKN(SEQ ID NO：98)；和
H3序列是GSLYSYGNSYFDY(SEQ ID NO：99)或FEGVWX7GLDY(SEQ ID NO：100)，
其中X1是F或E；X2为Y或D，X3为M或D；X4是T或S；X5是E或I；X6是T或D；X7是Y或G。
在ASTR结合Ror2的一些实施方式中，并且在说明性实施方式中是与包含SEQ IDNO：151的抗体重链和SEQ ID NO：152的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，ASTR可包括具有三个互补决定区的重链可变区，所述互补决定区具有H1，H2和H3序列，其中：
H1序列是GYTX1TEX2TX3H(SEQ ID NO：95)；
H2序列是GX5NX6NNGGTGYNQKFKG(SEQ ID NO：97)；和
H3序列是GSLYSYGNSYFDY(SEQ ID NO：99)，
其中X1是F或E；X2为Y或D，X3为M或D；X5是E或I；X6是T或D。
在ASTR结合Ror2的一些实施方式中，并且在说明性实施方式中是与包含SEQ IDNO：82或SEQ ID NO：83的抗体重链和SEQ ID NO：84的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，ASTR可包括具有三个互补决定区的重链可变区，所述互补决定区具有H1，H2和H3序列，其中：
H1序列是X4GYSITTGYYWN(SEQ ID NO：96)；
H2序列是YITYDGSKNYNPSLKN(SEQ ID NO：98)；和
H3序列是FEGVWX7GLDY(SEQ ID NO：100)，
其中X4是T或S；X7是Y或G。
在ASTR结合Ror2的一些实施方式中，包括但不限于具有上述H1，H2和H3序列的重链的那些，ASTR包括含有三个互补决定区的轻链可变区，所述互补决定区具有L1，L2和L3序列，其中：
L1序列是SATSSX8SYMH(SEQ ID NO：101)或RASESVDRYGNSFIH(SEQ ID NO：102)；
L2序列是X9TSNLAS(SEQ ID NO：103)或RTYNLES(SEQ ID NO：104)；和
L3序列是QQRSSYPFT(SEQ ID NO：105)或QQTNEDPWT(SEQ ID NO：106)，
其中X8是E或V；X9是G或H。
在ASTR结合Ror2的一些实施方式中，并且在说明性实施方式中是与包含SEQ IDNO：151的抗体重链和SEQ ID NO：152的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，ASTR可包括具有三个互补决定区的轻链可变区，所述互补决定区具有L1，L2和L3序列，其中：
L1序列是SATSSX8SYMH(SEQ ID NO：101)；
L2序列是X9TSNLAS(SEQ ID NO：103)；和
L3序列是QQRSSYPFT(SEQ ID NO：105)，
其中X8是E或V；X9是G或H。
在ASTR结合Ror2的一些实施方式中，并且在说明性实施方式中是与包含SEQ IDNO：82或SEQ ID NO：83的抗体重链和SEQ ID NO：84的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，ASTR可包括具有三个互补决定区的轻链可变区，所述互补决定区具有L1，L2和L3序列，其中：
L1序列是RASESVDRYGNSFIH(SEQ ID NO：102)；
L2序列是RTYNLES(SEQ ID NO：104)；和
L3序列是QQTNEDPWT(SEQ ID NO：106)。
在ASTR结合Ror2的一些实施方式中，ASTR可包括含有三个互补决定区的重链可变区，所述互补决定区具有H1，H2和H3序列，其中：
H1序列是GYTX1TEX2X3X4H(SEQ ID NO：140)或GYSITTGX29YWN(SEQ ID NO：141)；
H2序列是X5X6X7X8NNGGTGYNQKFKG(SEQ ID NO：142)或YITYDGSX30NYNPSLKN(SEQ IDNO：143)；和
H3序列是X9X10X11SX12YX13YX14X15SYFX16X17X18(SEQ ID NO：144)或CSX31X32X33X34VX35X36X37LDX38(SEQ ID NO：145)，
其中X1是F或E；X2是Y或D；X3是T或C；X4是M，D，E或Y；X5是G或S；X6是I或E；X7是N，C，L或V；X8是T，D或E；X9是A，M或T；X10是R或H；X11是G或E；X12是L或F；X13是S或G；X14是G或D；X15是N或E；X16是D或L；X17是Y，C或T；X18是W或L；X29是Y，E，R或T；X30是K或N；X31为R，G，H，W或Y；X32是F，C，N或Q；X33是E或S；X34是G，E，F，H，M，Q或S；X35是W，A，I，P，Q，T或V；X36是Y，G，N或Q；X37是G，S或T；和X38是Y或I。
在ASTR结合Ror2的一些实施方式中，并且在说明性实施方式中是与包含SEQ IDNO：151的抗体重链和SEQ ID NO：152的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，ASTR可包括含有三个互补决定区的重链可变区，所述互补决定区具有H1，H2和H3序列，其中：
H1序列是GYTX1TEX2X3X4H(SEQ ID NO：140)；
H2序列是X5X6X7X8NNGGTGYNQKFKG(SEQ ID NO：142)；和
H3序列是X9X10X11SX12YX13YX14X15SYFX16X17X18(SEQ ID NO：144)，
其中X1是F或E；X2是Y或D；X3是T或C；X4是M，D，E或Y；X5是G或S；X6是I或E；X7是N，C，L或V；X8是T，D或E；X9是A，M或T；X10是R或H；X11是G或E；X12是L或F；X13是S或G；X14是G或D；X15是N或E；X16是D或L；X17是Y，C或T；和X18是W或L。
在ASTR结合Ror2的一些实施方式中，并且在说明性实施方式中是与包含SEQ IDNO：82或SEQ ID NO：83的抗体重链和SEQ ID NO：84的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，ASTR可包括含有三个互补决定区的重链可变区，所述互补决定区具有H1，H2和H3序列，其中：
H1序列是GYSITTGX29YWN(SEQ ID NO：141)；
H2序列是YITYDGSX30NYNPSLKN(SEQ ID NO：143)；和
H3序列是CSX31X32X33X34VX35X36X37LDX38(SEQ ID NO：145)，
其中X29是Y，E，R或T；X30是K或N；X31为R，G，H，W或Y；X32是F，C，N或Q；X33是E或S；X34是G，E，F，H，M，Q或S；X35是W，A，I，P，Q，T或V；X36是Y，G，N或Q；X37是G，S或T；和X38是Y或I。
在ASTR结合Ror2的一些实施方式中，ASTR可包括含有三个互补决定区的轻链可变区，所述互补决定区具有L1，L2和L3序列，其中：
L1序列是SATSSX19X20X21MX22(SEQ ID NO：146)或RASESVDRYGNSX39IH(SEQ ID NO：147)；
L2序列是X23TSNLAS(SEQ ID NO：148)或X40TYX41LES(SEQ ID NO：149)；和
L3序列是QX24X25SX26YPFX27X28(SEQ ID NO：150)或QQX42NX43DPX44TX45(SEQ ID NO：85)，
其中X19是V或E；X20是S或D；X21是Y，C或D；X22是H，G或L；X23是G，C，H或P；X24是Q或E；X25是R或H；X26是S，D，G，I，Q或V；X27是T或D；X28是F，D或E；X39是F，S或T；X40是R，C，D，E或W；X41是N或D；X42是T，I或P；X43是E或V；X44是W或T；和X45是F或T。
在ASTR结合Ror2的一些实施方式中，并且在说明性实施方式中是与包含SEQ IDNO：151的抗体重链和SEQ ID NO：152的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，ASTR可包括含有三个互补决定区的轻链可变区，所述互补决定区具有L1，L2和L3序列，其中：
L1序列是SATSSX19X20X21MX22(SEQ ID NO：146)；
L2序列是X23TSNLAS(SEQ ID NO：148)；和
L3序列是QX24X25SX26YPFX27X28(SEQ ID NO：150)，
其中X19是V或E；X20是S或D；X21是Y，C或D；X22是H，G或L；X23是G，C，H或P；X24是Q或E；X25是R或H；X26是S，D，G，I，Q或V；X27是T或D；X28是F，D或E。
在ASTR结合Ror2的一些实施方式中，并且在说明性实施方式中是与包含SEQ IDNO：82或SEQ ID NO：83的抗体重链和抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位。如SEQ ID NO：84所示，ASTR可包括含有三个互补决定区的轻链可变区，所述互补决定区具有L1，L2和L3序列，其中：
L1序列是RASESVDRYGNSX39IH(SEQ ID NO：147)；
L2序列是X40TYX41LES(SEQ ID NO：149)；和
L3序列是QQX42NX43DPX44TX45(SEQ ID NO：85)，
其中X39是F，S或T；X40是R，C，D，E或W；X41是N或D；X42是T，I或P；X43是E或V；X44是W或T；和X45是F或T。
在一些实施方式中，结合Ror2的条件活性ASTR，并且在说明性实施方式中是与包含SEQ ID NO：151的抗体重链和SEQ ID NO：152的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位的条件活性ASTR包括重链可变区，其具有选自SEQ ID NO：115-119和SEQ ID NO：151的序列的氨基酸序列。在条件活性ASTR与包含SEQ ID NO：151的抗体重链和SEQ ID NO：152的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位的这些说明性实施方式中，其任选地包括在先前句子中列出的重链，轻链可包括SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：122-124或SEQ ID NO：152的轻链。
在某些说明性实施方式中，条件活性ASTR与包含SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：83的抗体重链的抗体和包含SEQ ID NO：84的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，并且包括SEQ ID NO：120-121和82-83中任一个的抗体重链可变区。在条件活性ASTR与包含SEQ IDNO：82或SEQ ID NO：83的抗体重链的抗体和包含SEQ ID NO：84的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位的这些说明性实施方式中，其任选地包括在先前句子中列出的重链，轻链包括SEQ ID NO：84或86的轻链。
在pH 6.7下与pH 7.4相比已增加Ror2结合的示例性条件活性CAR(CAB-CAR)在本文的实施例1中发现。在说明性实施方式中，CAR或ASTR可以与包含SEQ ID NO：82或SEQ IDNO：84的抗体重链和SEQ ID NO的抗体轻链的单链可变抗体片段结合Ror2的相同表位，或者CAR或ASTR可以与包含SEQ ID NO：151的抗体重链和SEQ ID NO：152的抗体轻链的单链可变抗体片段结合Ror2的相同表位。在此类说明性实施方式的进一步实施方式中，抗Ror2CAR或ASTR包含或是单链可变片段(scFv)，并且在进一步的说明性实例中，包含重链N末端的轻链，或包含重链N末端的轻链。在本文包括CAR或ASTR的任何实施方式中，并且在说明性实施方式中是与包含SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：83的抗体重链和SEQ ID NO：84的抗体轻链的单链可变抗体片段结合Ror2的相同表位，或与包含SEQ ID NO：151的抗体重链和SEQ IDNO：152的抗体轻链的单链可变抗体片段结合Ror2的相同表位，ASTR可包括SEQ ID NO：130-132或153-158中的任一个。此外，本文任何实施方式的抗ROR2CAR可包括本文提供的任何CAR组分。在某些示例性实施方式中，抗Ror2CAR可以包括表2中列出的CAR组分，并且可以是表2中的任何CAR。更典型地，对于本文包括抗Ror2CAR的任何实施方式，CAR是CAB-CAR和在非限制性说明性实施方式中可包括例如表2中提供的任何CAB-CAR组分和CAB-CAR，其显示细胞毒活性。例如，抗Ror2 CAB-CAR可包括CD8信号肽，CD8或CD28茎/跨膜结构域，CD137共刺激结构域和/或CD3Z活化结构域。此外，在非限制性说明性实施方式中，本文任何实施方式的示例性CAR包括抗Ror2CAR，尤其是抗Ror2 CAB-CAR，包括在表2中显示条件细胞毒活性的任何抗Ror2 CAB-CAR。这种说明性的CAB-CAR包括F1-1-9，F1-1-10，F1-1-11，F1-1-12，F1-1-15，F1-1-17，F1-1-18，F1-1-19，F1-1-20，F1-1-21，F1-1-23，F1-1-25或F1-1-26。在本文包括抗Ror2ASTR的任何实施方式中，ASTR可包括表2的F1-1-9，F1-1-10，F1-1-11，F1-1-12，F1-1-15，F1-1-17，F1-1-18，F1-1-19，F1-1-20，F1-1-21，F1-1-23，F1-1-25，或F1-1-26的ASTR。此外，在非限制性说明性实施方式中，本文任何实施方式的示例性CAR包括抗Ror2CAR，尤其是抗Ror2 CAB-CAR，包括在表2中显示高条件细胞毒活性的任何抗Ror2 CAB-CAR。这种示例性CAB-CAR包括F1-1-11，F1-1-12，F1-1-15，F1-1-17，F1-1-19，F1-1-20或F1-1-23。因此，在本文包括抗Ror2ASTR的任何实施方式中，ASTR可包括F1-1-11，F1-1-12，F1-1-15，F1-1-17，F1-1-19，F1-1-20，F1-1-23的ASTR。
更一般地，关于本文提供的任何实施方式，无论是针对Axl还是Ror2，ASTR可以是单链抗体，Fab片段，Fab'片段，(Fab')2片段，Fv片段，二价单链抗体或双抗体。在说明性实施方式中，结合Ror2的条件活性ASTR是包含重链和轻链的单链可变片段。
通过美国专利号8,709,755中公开的方法从亲本抗体鉴定本文公开的重链可变区多肽和轻链可变区多肽。技术人员可利用该方法鉴定8,709,755中公开的条件活性抗体，以鉴定可用于本公开CAB-CAR的ASTR中的其它条件活性抗体和抗体片段。
一些示例性ASTR的重链可变区的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：115-121中。这些示例性ASTR的轻链可变区的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：81，86和122-124中。这些重链可变区和轻链可变区可以特异性结合人Ror2。已经发现包括这些重链可变区和轻链可变区中任一个的抗体或抗体片段在肿瘤微环境中的pH下比在非肿瘤微环境中或在生理条件下对Ror2具有更高的结合亲和力。例如，抗体和抗体片段在pH 6.0下比在pH 7.4下对Ror2具有更高的结合亲和力。在一些实施方式中，抗体和抗体片段在pH 6.7下比在pH 7.4下对Ror2具有更高的结合亲和力。
与它们在正常组织中对Ror2的结合亲和力相比，抗Ror2抗体或抗体片段对肿瘤中的Ror2具有更高的结合亲和力。与本领域已知的单克隆抗Ror2抗体相比，这些抗Ror2抗体或抗体片段被认为具有更长的半衰期和降低的副作用，以及相当的功效。这些特征允许使用更高剂量的这些抗Ror2抗体或抗体片段递送给患者，因此是更有效的治疗选择。
尽管ASTR可以包括具有SEQ ID NO：81，86和115-124的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区，但是本发明还提供了可以特异性结合人Ror2的其变体。为了得到这些变体，重链可变区(H1-H3)的互补决定区(CDR)和轻链可变区(L1-L3)的互补决定区应保持完整。然而，可以根据取代、插入和缺失的原理突变互补决定区外的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。重链可变区和轻链可变区的变体可以通过将适当的修饰引入编码重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列中，或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列内的残基的缺失、和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以达到CAR的ASTR，条件是它们具有所需的特征，例如与人Ror2的条件性抗原结合。
多特异性ASTR
在一些实施方式中，ASTR可以是多特异性，例如双特异性抗体。多特异性抗体对至少两个不同位点或靶标具有结合特异性。在某些实施方式中，结合特异性之一针对Axl或Ror2，另一种针对另一种抗原。在某些实施方式中，双特异性抗体可以结合Axl或Ror2的两个不同表位。双特异性抗体也可用于将细胞毒性剂定位于表达Axl或Ror2的细胞。双特异性抗体可以制备成全长抗体或抗体片段。在某些实施方式中，结合特异性之一结合Ax1而另一个结合Ror2，其中没有、一者或两者具有条件活性。
适用于本公开的CAR的ASTR可具有多种抗原结合特异性。在说明性实施方式中，ASTR结合Axl或Ror2，已知其在某些癌细胞(即癌特异性抗原)上表达。在一些情况下，ASTR是双特异性的，并且除了结合Axl或Ror2的抗体结合结构域之外，通常以条件活性方式，ASTR可以包括对第二抗原具有特异性的第二抗原结合结构域，其由癌细胞即癌细胞相关抗原表达(由其合成)。癌细胞相关抗原可以是与例如乳腺癌细胞，B细胞淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤细胞，卵巢癌细胞，前列腺癌细胞，间皮瘤，肺癌细胞(例如小细胞肺癌细胞)，非霍奇金B细胞淋巴瘤(B-NHL)细胞，卵巢癌细胞，前列腺癌细胞，间皮瘤细胞，肺癌细胞(例如小细胞肺癌细胞)，黑素瘤细胞，慢性淋巴细胞性白血病细胞，急性淋巴细胞性白血病细胞，神经母细胞瘤细胞，神经胶质瘤，成胶质细胞瘤，髓母细胞瘤，结肠直肠癌细胞等相关的抗原。癌细胞相关抗原也可以通过非癌细胞表达。
除了Axl或Ror2之外，CAR的双特异性ASTR可以结合的抗原的非限制性实例包括例如CD19，CD20，CD38，CD30，ERBB2，CA125，MUC-1，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，CD44表面粘附分子，间皮素，癌胚抗原(CEA)，表皮生长因子受体(EGFR)，EGFRvIII，血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)，高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)，MAGE-A1，IL-13R-a2和GD2等。
在一些情况下，除了结合Axl或Ror2的特异性结合对成员外，适用于CAR的受试双特异性ASTR的特异性结合对的成员结合受体的配体。配体包括但不限于细胞因子(例如IL-13等)；生长因子(例如调节蛋白；和血管内皮生长因子(VEGF)等)；和整联蛋白结合肽(例如包含序列Arg-Gly-Asp的肽)等。
当受试双特异性CAR中特异性结合对的成员是配体时，CAR可以在特异性结合对的第二成员存在下被活化，其中特异性结合对的第二成员是配体的受体。例如，在配体是VEGF的情况下，特异性结合对的第二成员可以是VEGF受体，包括可溶性VEGF受体。
如上所述，在一些情况下，包含在受试双特异性CAR中的特异性结合对的成员是作为受体的ASTR，例如配体的受体、共受体等。受体可以是受体的配体结合片段。合适的受体包括但不限于生长因子受体(例如VEGF受体)；杀伤细胞凝集素样受体亚家族K，成员1(NKG2D)多肽(MICA受体，MICB和ULB6)；细胞因子受体(例如IL-13受体；IL-2受体等)；CD27；天然细胞毒性受体(NCR)(例如NKP30(NCR3/CD337)多肽(HLA-B相关转录物3(BAT3)和B7-H6的受体)等)等。
茎区
在一些情况下，CAR包括铰链结构域(在本文中也称为“间隔子”或“茎”)，其位于细胞外的CAR部分中并插入ASTR和跨膜结构域之间。在说明性实施方式中，铰链结构域是CD8茎结构域或CD28茎结构域。在一些情况下，茎结构域与野生型CD8茎区(TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGG AVHTRGLDFA(SEQ ID NO：125))具有至少85，90，95，96，97，98，99或100％同一性，与野生型CD28茎区(FCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQID NO：126))具有至少85，90，95，96，97，98，99或100％同一性，或与野生型免疫球蛋白重链铰链/茎区域具有至少85，90，95，96，97，98，99或100％同一性。在一些情况下，茎结构域是衍生自受体(例如CDS衍生的铰链区)的铰链区多肽。在CAR中，所采用的茎允许条件活性的抗原特异性靶向区域(并且通常是整个CAR)相对于相应的生理条件，在体外肿瘤替代测定条件下保持其与Ror2或Ax1的结合增加的特性。
茎区域可具有约4个氨基酸至约50个氨基酸的长度，例如约4aa至约10aa，约10aa至约15aa，约15aa至约20aa，约15aa至约20aa，约20aa至约30aa，约30aa至约40aa，或约40aa至约50aa。
在一些情况下，受试CAR的铰链区包括至少一个半胱氨酸。例如，在一些情况下，铰链区可包括序列Cys-Pro-Pro-Cys(SEQ ID NO：62)。如果存在，第一CAR的铰链区中的半胱氨酸可用于与第二CAR中的铰链区形成二硫键。
免疫球蛋白铰链/茎区氨基酸序列是本领域已知的；参见例如Tan等人.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:162；和Huck等人.(1986)Nucl.Acids Res.14:1779。作为非限制性实例，免疫球蛋白铰链区可包括与任何以下氨基酸序列的至少10、15、20个或所有氨基酸的区段具有至少50，60，70，75，80，85，90，95，96，97，98，99或100％序列同一性的结构域：DKTHT(SEQ ID NO：63)；CPPC(SEQ ID NO：62)；CPEPKSCDTPPPCPR(SEQ ID NO：64)(参见例如Glaser等人.(2005)J.Biol.Chem.280:41494)；ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO：65)；KSCDKTHTCP(SEQ ID NO：66)；KCCVDCP(SEQ ID NO：67)；KYGPPCP(SEQ ID NO：68)；EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：69)(人IgG1铰链)；ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：70)(人IgG2铰链)；ELKTPLGDTTHTCPRCP(SEQ ID NO：71)(人IgG3铰链)；和SPNMVPHAHHAQ(SEQ ID NO：72)(人IgG4铰链)等。铰链区可包括人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4铰链区的氨基酸序列。与野生型(天然存在的)铰链区相比，该铰链区可包括一个或多个氨基酸取代和/或插入和/或缺失。例如，人IgG1铰链的His229可以被Tyr取代，因此铰链区包括序列EPKSCDKTYTCPPCP；参见例如Yan等人.(2012)J.Biol.Chem.287:5891。铰链区可包括衍生自人CD8的氨基酸序列；如铰链区可包括氨基酸序列：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO：73)，或其变体。
跨膜结构域
本公开的CAR包括用于插入真核细胞膜的跨膜结构域。跨膜结构域可插入ASTR和共刺激结构域之间。跨膜结构域可插入铰链区和共刺激结构域之间，使得嵌合抗原受体从氨基末端(N末端)到羧基末端(C末端)依次包括：ASTR；铰链区；跨膜结构域；和活化结构域。
提供将多肽插入真核(例如哺乳动物)细胞的细胞膜中的任何跨膜(TM)结构域适用于本文公开的方面和实施方式。在本文提供的某些实施方式中，本文提供的包含CAR的任何方面的TM结构域是C*αTM结构域，CD8TM结构域，CD4TM结构域，C3Z TM结构域，C28TM结构域，C134TM结构域，CD7TM结构域，CD8TM结构域或CD28TM结构域。本文提供的CAR的说明性实施方式包括CD8TM结构域或CD28TM结构域。适用于本文提供的任何方面或实施方式的TM结构域的其它非限制性实例包括与任何以下TM结构域的至少10、15、20个或所有氨基酸的区段具有至少50，60，70，75，80，85，90，95，96，97，98，99或100％序列同一性的结构域：
a)CD8α(IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO：46))；
b)CD8β(LGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCC(SEQ ID NO：47))；
c)CD4(ALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFCVRC(SEQ ID NO：48))；
d)CD3Z(LCYLLDGILFIYGVILTALFLRV(SEQ ID NO：49)；
e)CD28(FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO：50))；
f)CD134(OX40)：(VAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLL(SEQ ID NO：51))；
g)CD7(ALPAALAVISFLLGLGLGVACVLA(SEQ ID NO：52))，
h)CD8α茎和TM(TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO：75))，和
i)CD28茎和TM(IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO：76))。
作为非限制性实例，本发明一个方面的跨膜结构域可以与SEQ ID NO：46跨膜结构域，CD8β跨膜结构域，CD4跨膜结构域，CD3ζ跨膜结构域，CD28跨膜结构域，CD134跨膜结构域或CD7跨膜结构域具有至少80，90或95％序列同一性。
CAR接头
在一些情况下，CAR包括任何两个相邻结构域之间的接头。例如，接头可以位于跨膜结构域和第一共刺激结构域之间。作为另一个示例，ASTR可以是抗体，并且接头可以在重链和轻链之间。作为另一个示例，接头可以在ASTR和跨膜结构域之间以及共刺激结构域之间。作为另一个示例，接头可以位于第二多肽的共刺激结构域和细胞内活化结构域之间。
接头肽可具有多种氨基酸序列中的任一种。蛋白质可以通过间隔肽连接，通常具有柔性，但不排除其它化学键。接头可以是长度为约1至约100个氨基酸，或长度为约1至约25个氨基酸的肽。这些接头可以通过使用合成的编码接头的寡核苷酸以偶联蛋白质来生产。可以使用具有一定程度柔性的肽接头。连接肽实际上可以具有任何氨基酸序列，记住合适的接头将具有产生通常柔性肽的序列。使用小氨基酸如甘氨酸和丙氨酸可用于产生柔性肽。这种序列的产生对于本领域技术人员来说是常规的。
合适的接头可以容易地选择，并且可以是任何合适的不同长度，例如1个氨基酸(例如Gly)至20个氨基酸，2个氨基酸至15个氨基酸，3个氨基酸。至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸，5个氨基酸至9个氨基酸，6个氨基酸至8个氨基酸，或7个氨基酸至8个氨基酸，并可能为1，2，3，4，5，6或7个氨基酸。
示例性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n，甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n，GSGGSn，GGGSn和GGGGSn，其中n是至少为一的整数)，甘氨酸-丙氨酸聚合物，丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其它柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是令人感兴趣的，因为这两种氨基酸都是相对非结构化的，因此可以作为组分之间的中性系链。甘氨酸聚合物是特别令人感兴趣的，因为甘氨酸比甚至丙氨酸获得显著更多的phi-psi空间，并且比具有更长侧链的残基更少限制(参见Scheraga，Rev.Computational Chem.11173-142(1992))。示例性的柔性接头包括但不限于GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：53)，GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：54)，GGGGSGGGSGGGGS(SEQ ID NO：55)，GGSG(SEQ ID NO：56)，GGSGG(SEQ ID NO：57)，GSGSG(SEQ ID NO：58)，GSGGG(SEQ ID NO：59)，GGGSG(SEQ ID NO：60)和GSSSG(SEQ ID NO：61)等。普通技术人员将认识到，与上述任何元件缀合的肽的设计可包括全部或部分柔性的接头，使得接头可包括柔性接头以及赋予较少柔性结构的一个或多个部分。
调节结构域
调节结构域可以改变CAR中活化结构域的作用，包括增强或抑制活化结构域的下游作用或改变响应的性质。适用于本公开的CAR且包括在本文包括CAR的任何方面的某些说明性实施方式中的调节结构域包括共刺激结构域。在一些实施方式中，CAR可以具有一个以上的调节结构域(例如共刺激结构域)，或CAR的调节结构域(例如共刺激结构域)可以衍生自一种以上的多肽。适合包含在CAR中的调节结构域(例如共刺激结构域)可具有约30个氨基酸至约70个氨基酸(aa)的长度，例如调节结构域(例如共刺激结构域)可具有长度为约30aa至约35aa，约35aa至约40aa，约40aa至约45aa，约45aa至约50aa，约50aa至约55aa，约55aa，约55aa至约60aa，约60aa至约65aa，或约65aa至约70aa。在其它情况下，调节结构域的长度可为约70aa至约100aa，约100aa至约200aa，或大于200aa。
共刺激结构域通常增强和/或改变对活化结构域活化的响应的性质。适用于本公开的CAR的共刺激结构域通常是衍生自受体的多肽。在一些实施方式中，共刺激结构域同二聚化。受试共刺激结构域可以是跨膜蛋白的细胞内部分(即共刺激结构域可以衍生自跨膜蛋白)。合适的共刺激多肽的非限制性实例包括但不限于4-1BB(CD137)，B7-H3，CD2，CD7，CD27，CD28，CD28缺失用于Lck结合(ICΔ)，ICOS，OX40，BTLA，CD27，CD30，CD40，GITR，HVEM，LFA-1，LIGHT，NKG2C，PD-1，TILR2，TILR4，TILR7，TILR9，Fc受体γ链，Fc受体ε链或与CD83特异性结合的配体。例如，本发明一个方面的共刺激结构域可以与4-1BB(CD137)，CD27，CD28，缺失Lck结合的CD28(ICΔ)，ICOS，OX40，BTLA，CD27，CD30，GITR或HVEM的共刺激结构域具有至少80％，90％或95％的序列同一性。在一些实施方式中，CAR可包括一个以上的共刺激结构域，例如，CAR可包括来自ICΔ的共刺激结构域和来自4-1BB的共刺激结构域(CD137)，
在一些情况下，共刺激结构域衍生自跨膜蛋白CD137的细胞内部分(也称为TNFRSF9；CD137；4-1BB；CDw137；ILA等)。例如，合适的共刺激结构域可包括与以下氨基酸序列中至少10、15、20个或所有氨基酸的区段具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的结构域：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO：1)。在这些实施方式的一些中，共刺激结构域的长度为约30aa至约35aa，约35aa至约40aa，约40aa至约45aa，约45aa至约50aa，约50aa至约55aa，约50aa至约60aa，约60aa至约65aa，或约65aa至约70aa。
在一些情况下，共刺激结构域衍生自跨膜蛋白CD28的细胞内部分(也称为Tp44)。例如，合适的共刺激结构域可包括与以下氨基酸序列中至少10、15、20个或所有氨基酸的区段具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的结构域：RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO：2)。在这些实施方式的一些中，共刺激结构域的长度为约30aa至约35aa，约35aa至约40aa，约40aa至约45aa，约45aa至约50aa，约50aa至约55aa，约50aa至约60aa，约60aa至约65aa，或约65aa至约70aa。
在一些情况下，共刺激结构域衍生自缺失Lck结合的跨膜蛋白CD28的细胞内部分(ICΔ)。例如，合适的共刺激结构域可包括与以下氨基酸序列中至少10、15、20个或所有氨基酸的区段具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的结构域：RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQAYAAARDFAAYRS(SEQ IDNO：3)。在这些实施方式的一些中，共刺激结构域的长度为约30aa至约35aa，约35aa至约40aa，约40aa至约45aa，约45aa至约50aa，约50aa至约55aa，约50aa至约60aa，约60aa至约65aa，或约65aa至约70aa。
在一些情况下，共刺激结构域衍生自跨膜蛋白ICOS的细胞内部分(也称为AILIM，CD278和CVID1)。例如，合适的共刺激结构域可包括与以下氨基酸序列中至少10、15、20个或所有氨基酸的区段具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的结构域：TKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL(SEQ IDNO：4)。在这些实施方式的一些中，共刺激结构域的长度为约30aa至约35aa，约35aa至约40aa，约40aa至约45aa，约45aa至约50aa，约50aa至约55aa，约50aa至约60aa，约60aa至约65aa，或约65aa至约70aa。
在一些情况下，共刺激结构域衍生自跨膜蛋白OX40的细胞内部分(也称为TNFRSF4，RP5-902P8.3，ACT35，CD134，OX-40，TXGP1L)。例如，合适的共刺激结构域可包括与以下氨基酸序列中至少10、15、20个或所有氨基酸的区段具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的结构域：RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(SEQ ID NO：5)。在这些实施方式的一些中，共刺激结构域的长度为约30aa至约35aa，约35aa至约40aa，约40aa至约45aa，约45aa至约50aa，约50aa至约55aa，约50aa至约60aa，约60aa至约65aa，或约65aa至约70aa。
在一些情况下，共刺激结构域衍生自跨膜蛋白CD27的细胞内部分(也称为S152，T14，TNFRSF7和Tp55)。例如，合适的共刺激结构域可包括与以下氨基酸序列中至少10、15、20个或所有氨基酸的区段具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的结构域：HQRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO：6)。在这些实施方式的一些中，共刺激结构域的长度为约30aa至约35aa，约35aa至约40aa，约40aa至约45aa，或约45aa至约50aa。
在一些情况下，共刺激结构域衍生自跨膜蛋白BTLA的细胞内部分(也称为BTLA1和CD272)。例如，合适的共刺激结构域可包括与以下氨基酸序列中至少10、15、20个或所有氨基酸的区段具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的结构域：CCLRRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS(SEQ ID NO：7)。
在一些情况下，共刺激结构域衍生自跨膜蛋白CD30的细胞内部分(也称为TNFRSF8，D1S166E和Ki-1)。例如，合适的共刺激结构域可包括与以下氨基酸序列中约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)，约110aa至约115aa，约115aa至约120aa，约120aa至约130aa，约130aa至约140aa，约140aa至约150aa，约150aa至约160aa，或约160aa至约185aa的区段具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的结构域：RRACRKRIRQKLHLCYPVQTSQPKLELVDSRPRRSSTQLRSGASVTEPVAEERGLMSQPLMETCHSVGAAYLESLPLQDASPAGGPSSPRDLPEPRVSTEHTNNKIEKIYIMKADTVIVGTVKAELPEGRGLAGPAEPELEEELEADHTPHYPEQETEPPLGSCSDVMLSVEEEGKEDPLPTAASGK(SEQ ID NO：8)。
在一些情况下，共刺激结构域衍生自跨膜蛋白GITR的细胞内部分(也称为TNFRSF18，RP5-902P8.2，AITR，CD357和GITR-D)。例如，合适的共刺激结构域可包括与以下氨基酸序列中至少10、15、20个或所有氨基酸的区段具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的结构域：HIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV(SEQ ID NO：9)。在这些实施方式的一些中，共刺激结构域的长度为约30aa至约35aa，约35aa至约40aa，约40aa至约45aa，约45aa至约50aa，约50aa至约55aa，约50aa至约60aa，约60aa至约65aa，或约65aa至约70aa。
在一些情况下，共刺激结构域衍生自跨膜蛋白HVEM的细胞内部分(也称为TNFRSF14，RP3-395M20.6，ATAR，CD270，HVEA，HVEM，LIGHTR和TR2)。例如，合适的共刺激结构域可包括与以下氨基酸序列中至少10、15、20个或所有氨基酸的区段具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的结构域：CVKRRKPRGDVVVVIVSVQRKRQEAEGEATVIEALQAPPDVTTVAVEETIPSFTGRSPNH(SEQ ID NO：10)。在这些实施方式的一些中，第一和第二多肽两者的共刺激结构域的长度为约30aa至约35aa，约35aa至约40aa，约40aa至约45aa，约45aa至约50aa，约50aa至约55aa，约50aa至约60aa，约60aa至约65aa，或约65aa至约70aa。
细胞内活化结构域
适用于本公开的CAR的细胞内活化结构域在活化时通常诱导一种或多种细胞因子的产生；细胞死亡增加；和/或CD8+T细胞，CD4+T细胞，天然杀伤T细胞，γδT细胞和/或嗜中性粒细胞的增殖增加。在一些实施方式中，细胞内活化结构域包括如下所述的至少一个(例如一个，两个，三个，四个，五个，六个等)ITAM基序。细胞内活化结构域在本文中可称为活化的结构域或活化结构域。用于工程化信号传导多肽的细胞内活化结构域可包括几种类型的免疫信号传导受体的细胞内信号传导结构域，包括T细胞信号传导蛋白，如CD3，B7家族共刺激因子和肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族受体；NK和NKT细胞使用的信号结构域，如NKp30(B7-H6)，DAP12，NKG2D，NKp44，NKp46，DAP10和CD3z；和含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的人免疫球蛋白受体的信号传导结构域，如FcγRI，FcγRIIA，FcγRIIC，FcγRIIIA和FcRL5。因此，在用于本公开的任何方面的CAR的某些实施方式中，细胞内活化结构域是来自NKp30(B7-H6)，DAP12，NKG2D，NKp44，NKp46，DAP10，CD3z，FcγRI，FcγRIIA，FcγRIIC，FcγRIIIA或FcRL5的信号传导结构域。这些在本文中称为NKp30(B7-H6)活化结构域，DAP12活化结构域，NKG2D活化结构域，NKp44活化结构域，NKp46活化结构域，DAP10活化结构域，CD3z活化结构域，FcγRI活化结构域，FcγRIIA活化结构域，FcγRIIC活化结构域，FcγRIIIA活化结构域或FcRL5活化结构域。
在一些实施方式中，细胞内活化结构域包括DAP10/CD28型信号传导链。在一些实施方式中，细胞内活化结构域不与膜结合的CAR共价连接，而是在细胞质中扩散。作为非限制性实例，包括CAR的本发明任何方面的细胞内活化结构域可以是CD3Z活化结构域，CD3D活化结构域，CD3E活化结构域，CD3G活化结构域，CD79A活化结构域，DAP12活化。结构域，FCER1G活化结构域，DAP10/CD28活化结构域或ZAP70活化结构域。作为非限制性实例，包含CAR的本发明任何方面的细胞内活化结构域可与CD3Z，CD3D，CD3E，CD3G，CD79A，DAP12，FCER1G具有至少80％，90％或95％的序列同一性。，DAP10/CD28或ZAP70域如下所述。
ITAM
适用于本公开的CAR的细胞内活化结构域包括基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的细胞内信号传导多肽。ITAM基序是YX1X2L/I，其中X1和X2独立地是任何氨基酸。在一些情况下，受试CAR的细胞内活化结构域包括1，2，3，4或5个ITAM基序。在一些情况下，ITAM基序在细胞内活化结构域中重复两次，其中ITAM基序的第一和第二实例彼此分开6至8个氨基酸，例如(YX1X2L/I)(X3)n(YX1X2L/I)，其中n是6至8的整数，并且6-8X3中的每一个可以是任何氨基酸。在一些情况下，受试CAR的细胞内活化结构域包括3个ITAM基序。
合适的细胞内活化结构域可以是含有ITAM基序的部分，其衍生自含有ITAM基序的多肽。例如，合适的细胞内活化结构域可以是来自任何含有ITAM基序的蛋白质的含ITAM基序的结构域。因此，合适的细胞内活化结构域不需要包含衍生它的整个蛋白质的完整序列。合适的含有ITAM基序的多肽的实例包括但不限于：CD3Z(CD3ζ)；CD3D(CD3Δ)；CD3E(CD3ε)；CD3G(CD3γ)；CD79A(抗原受体复合物相关蛋白α链)；DAP12；和FCER1G(Fcε受体Iγ链)。
在一些情况下，细胞内活化结构域衍生自T细胞表面糖蛋白CD3ζ链(也称为CD3Z，T细胞受体T3ζ链，CD247，CD3-ZETA，CD3H，CD3Q，T3Z，TCRZ等)。例如，合适的细胞内活化结构域可包括与以下序列中至少10、15、20个或所有氨基酸的区段或与以下氨基酸序列中约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)，约110aa至约115aa，约115aa至约120aa，约120aa至约130aa，约130aa至约140aa，约140aa至约150aa，或约150aa至约160aa的连续区段具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的结构域(2个同种型)：MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMKGERRRGKGHDGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQALPPR(SEQ ID NO：11)或MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]DKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMKGERRRGKGHDGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQALPPR(SEQ ID NO：12)，其中ITAM基序用括号列出。
同样，合适的细胞内活化结构域多肽可包括含有全长CD3ζ氨基酸序列的一部分的ITAM基序。因此，合适的细胞内活化结构域可包括与以下序列中至少10、15、20个或所有氨基酸的区段或与以下氨基酸序列中约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)，约110aa至约115aa，约115aa至约120aa，约120aa至约130aa，约130aa至约140aa，约140aa至约150aa，或约150aa至约160aa的连续区段具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的结构域：RVKFSRSADAPAYQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMKGERRRGKGHDGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQALPPR(SEQ ID NO：13)；RVKFSRSADAPAYQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]DKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMKGERRRGKGHDGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQALPPR(SEQ ID NO：127)；NQL[YNELNLGRREEYDVL]DKR SEQ ID NO：14)；EGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMK(SEQ ID NO：15)；或DGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQ(SEQ ID NO：16)，其中ITAM基序用括号列出。
在一些情况下，细胞内活化结构域衍生自T细胞表面糖蛋白CD3δ链(也称为CD3D；CD3-DELTA；T3D；CD3抗原，δ亚基；CD3δ；CD3d抗原，δ多肽(TiT3)复合物；OKT3，δ链；T细胞受体T3δ链；T细胞表面糖蛋白CD3δ链等)。因此，合适的细胞内活化结构域可包括与以下序列中至少10、15、20个或所有氨基酸的区段或与以下氨基酸序列中约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)，约110aa至约115aa，约115aa至约120aa，约120aa至约130aa，约130aa至约140aa，约140aa至约150aa，或约150aa至约160aa的连续区段具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的结构域：MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQV[YQPLRDRDDAQYSHL]GGNWARNK(SEQ ID NO：17)或MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRTADTQALLRNDQV[YQPLRDRDDAQYSHL]GGNWARNK(SEQ ID NO：18)，其中ITAM基序用括号列出。
同样，合适的细胞内活化结构域多肽可包含全长CD3δ氨基酸序列的含ITAM基序的部分。因此，合适的细胞内活化结构域可包括与以下序列中至少10、15、20个或所有氨基酸的区段具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的结构域：DQV[YQPLRDRDDAQYSHL]GGN(SEQ ID NO：19)，其中ITAM基序用括号列出。
在一些情况下，细胞内活化结构域衍生自T细胞表面糖蛋白CD3ε链(也称为CD3e，T细胞表面抗原T3/Leu-4ε链，T细胞表面糖蛋白CD3ε链，AI504783，CD3，CD3ε，T3e等)。因此，合适的细胞内活化结构域可包括与以下序列中至少10、15、20个或所有氨基酸的区段或与以下氨基酸序列中约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)，约110aa至约115aa，约115aa至约120aa，约120aa至约130aa，约130aa至约140aa，约140aa至约150aa，或约150aa至约160aa的连续区段具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的结构域：MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPD[YEPIRKGQRDLYSGL]NQRRI(SEQ ID NO：20)，其中ITAM基序用括号列出。
同样，合适的细胞内活化结构域多肽可包含全长CD3ε氨基酸序列的含有ITAM基序的部分。因此，合适的细胞内活化结构域可包括与以下序列中至少10、15、20个或所有氨基酸的区段具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的结构域：NPD[YEPIRKGQRDLYSGL]NQR(SEQ ID NO：21)，其中ITAM基序用括号列出。
在一些情况下，细胞内活化结构域衍生自T细胞表面糖蛋白CD3γ链(也称为CD3G，T细胞受体T3γ链，CD3-Γ，T3G，γ多肽(TiT3复合物)等)。因此，合适的细胞内活化结构域可包括与以下序列中至少10、15、20个或所有氨基酸的区段或与以下氨基酸序列中约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)，约110aa至约115aa，约115aa至约120aa，约120aa至约130aa，约130aa至约140aa，约140aa至约150aa，或约150aa至约160aa的连续区段具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的结构域：MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQL[YQPLKDREDDQYSHL]QGNQLRRN(SEQ ID NO：22)，其中ITAM基序用括号列出。
同样，合适的细胞内活化结构域多肽可包含全长CD3γ氨基酸序列的含有ITAM基序的部分。因此，合适的细胞内活化结构域可包括与以下序列中至少10、15、20个或所有氨基酸的区段具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的结构域：DQL[YQPLKDREDDQYSHL]QGN(SEQ ID NO：23)，其中ITAM基序用括号列出。
在一些情况下，细胞内活化结构域衍生自CD79A(也称为B细胞抗原受体复合物相关蛋白α链；CD79a抗原(免疫球蛋白相关α)；MB-1膜糖蛋白；Ig-α；膜结合免疫球蛋白相关蛋白；表面IgM相关蛋白等)。因此，合适的细胞内活化结构域可包括与以下序列中至少10、15、20个或所有氨基酸的区段或与以下氨基酸序列中约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)，约110aa至约115aa，约115aa至约120aa，约120aa至约130aa，约130aa至约140aa，约140aa至约150aa，或约150aa至约160aa的连续区段具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的结构域：MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNGTLIIQNVNKSHGGIYVCRVQEGNESYQQSCGTYLRVRQPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENL[YEGLNLDDCSMYEDI]SRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP(SEQ ID NO：24)或MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNEPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENL[YEGLNLDDCSMYEDI]SRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP(SEQ ID NO：25)，其中ITAM基序用括号列出。
同样，合适的细胞内活化结构域多肽可包含全长CD79A氨基酸序列的含有ITAM基序的部分。因此，合适的细胞内活化结构域可包括与以下序列中至少10、15、20个或所有氨基酸的区段具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的结构域：ENL[YEGLNLDDCSMYEDI]SRG(SEQ ID NO：26)，其中ITAM基序用括号列出。
在一些情况下，细胞内活化结构域衍生自DAP12(也称为TYROBP；TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白；KARAP；PLOSL；DNAX-活化蛋白12；KAR相关蛋白；TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白)；杀伤活化受体相关蛋白；杀伤活化受体相关蛋白等)。例如，合适的细胞内活化结构域可包括与以下序列中至少10、15、20个或所有氨基酸的区段或与以下氨基酸序列中约100个氨基酸至约110个氨基酸(aa)，约110aa至约115aa，约115aa至约120aa，约120aa至约130aa，约130aa至约140aa，约140aa至约150aa，或约150aa至约160aa的连续区段具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的结构域(4个同种型)：MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQRPYYK(SEQ ID NO：27)，MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQ(SEQ ID NO：28)，MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQRPYYK(SEQ IDNO：29)，或MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQRPYYK(SEQ ID NO：30)，其中ITAM基序用括号列出。
同样，合适的细胞内活化结构域多肽可包含全长DAP12氨基酸序列的含有ITAM基序的部分。因此，合适的细胞内活化结构域可包括与以下序列中至少10、15、20个或所有氨基酸的区段具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的结构域：ESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQ(SEQ ID NO：31)，其中ITAM基序用括号列出。
在一些情况下，细胞内活化结构域衍生自FCER1G(也称为FCRG；Fcε受体Iγ链；Fc受体γ链；fc-εRI-γ；fcRγ；fceRIγ；高亲和力免疫球蛋白ε受体亚单位γ；免疫球蛋白E受体，高亲和力，γ链等)。例如，合适的细胞内活化结构域可包括与以下序列中至少10、15、20个或所有氨基酸的区段或与以下氨基酸序列中约50个氨基酸至约60个氨基酸(aa)，约60aa至约70aa，约70aa至约80aa，或约80aa至约88aa的连续区段具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的结构域：MIPAVVLLLLLLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQVRKAAITSYEKSDGV[YTGLSTRNQETYETL]KHEKPPQ(SEQ ID NO：32)，其中ITAM基序用括号列出。
同样，合适的细胞内活化结构域多肽可包含全长FCER1G氨基酸序列的含有ITAM基序的部分。因此，合适的细胞内活化结构域可包括与以下序列中至少10、15、20个或所有氨基酸的区段具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的结构域：DGV[YTGLSTRNQETYETL]KHE(SEQ ID NO：33)，其中ITAM基序用括号列出。
适用于本公开的CAR的细胞内活化结构域包括DAP10/CD28型信号链。DAP10信号链的实例是氨基酸序列是：RPRRSPAQDGKV[YINM]PGRG(SEQ ID NO：34)。在一些实施方式中，合适的细胞内活化结构域包括与以下序列中至少10、15、20个或所有氨基酸的区段具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的结构域：RPRRSPAQDGKV[YINM]PGRG(SEQ ID NO：34)，其中ITAM基序用括号列出。
CD28信号链的实例是氨基酸序列是FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSD[YMNM]TPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO：35)。在一些实施方式中，合适的细胞内结构域包括与以下序列中至少10、15、20个或所有氨基酸的区段具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的结构域：FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSD[YMNM]TPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO：35)。
适用于本公开的CAR的细胞内活化结构域包括ZAP70多肽。例如，合适的细胞内活化结构域可包括与以下序列中至少10、15、20个或所有氨基酸的区段或与以下氨基酸序列中约300个氨基酸至约400个氨基酸，约400个氨基酸至约500个氨基酸，或约500个氨基酸至约619个氨基酸的连续区段具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的结构域：MPDPAAHLPFFYGSISRAEAEEHLKLAGMADGLFLLRQCLRSLGGYVLSLVHDVRFHHFPIERQLNGTYAIAGGKAHCGPAELCEFYSRDPDGLPCNLRKPCNRPSGLEPQPGVFDCLRDAMVRDYVRQTWKLEGEALEQAIISQAPQVEKLIATTAHERMPWYHSSLTREEAERKLYSGAQTDGKFLLRPRKEQGTYALSLIYGKTVYHYLISQDKAGKYCIPEGTKFDTLWQLVEYLKLKADGLIYCLKEACPNSSASNASGAAAPTLPAHPSTLTHPQRRIDTLNSDGYTPEPARITSPDKPRPMPMDTSVYESPYSDPEELKDKKLFLKRDNLLIADIELGCGNFGSVRQGVYRMRKKQIDVAIKVLKQGTEKADTEEMMREAQIMHQLDNPYIVRLIGVCQAEALMLVMEMAGGGPLHKFLVGKREEIPVSNVAELLHQVSMGMKYLEEKNFVHRDLAARNVLLVNRHYAKISDFGLSKALGADDSYYTARSAGKWPLKWYAPECINFRKFSSRSDVWSYGVTMWEALSYGQKPYKKMKGPEVMAFIEQGKRMECPPECPPELYALMSDCWIYKWEDRPDFLTVEQRMRACYYSLASKVEGPPGSTQKAEAACA(SEQ ID NO：36)。
其它结构域
CAR还可以包括一个或多个另外的多肽结构域，其中这些结构域包括但不限于信号序列；表位标签；亲和结构域；和产生可检测信号的多肽。本文提供的任何方面或实施方式的其它结构域的非限制性实例包括与如下所述的以下序列中任一个具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的结构域：信号序列，表位标签，亲和结构域或产生可检测信号的多肽。
适用于受试CAR，例如受试CAR的第一多肽的信号序列包括任何真核信号序列，包括天然存在的信号序列，合成(例如人造)信号。在一些实施方式中，例如，信号序列可以是CD8信号序列MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO：74)。
合适的表位标签包括但不限于血凝素(HA；例如YPYDVPDYA；SEQ ID NO：37)；FLAG(例如DYKDDDDK；SEQ ID NO：38)；和c-myc(例如EQKLISEEDL；SEQ ID NO：39)等。
亲和结构域包括可以与结合配偶体相互作用的肽序列，例如固定在固体载体上的结合配偶体，可用于鉴定或纯化。当与表达的蛋白质融合时，编码多个连续单个氨基酸(例如组氨酸)的DNA序列可以通过与树脂柱(例如镍琼脂糖凝胶)的高亲和力结合用于重组蛋白质的一步纯化。示例性亲和结构域包括His5(HHHHH；SEQ ID NO：40)，HisX6(HHHHHH；SEQID NO：41)，c-myc(EQKLISEEDL；SEQ ID NO：39)，Flag(DYKDDDDK；SEQ ID NO：38)，StrepTag(WSHPQFEK；SEQ ID NO：42)，血凝素，例如HA标签(YPYDVPDYA；SEQ ID NO：37)，GST，硫氧还蛋白，纤维素结合结构域，RYIRS(SEQ ID NO：43)，Phe-His-His-Thr(SEQ ID NO：44)，几丁质结合结构域，S-肽，T7肽，SH2结构域，C末端RNA标签，WEAAAREACCRECCARA(SEQ ID NO：45)，金属结合结构域，例如锌结合结构域或钙结合域如来自钙结合蛋白的那些，例如钙调蛋白，肌钙蛋白C，钙调神经磷酸酶B，肌球蛋白轻链，恢复素，S-调节素，视锥蛋白，VILIP，神经钙蛋白，海马钙蛋白，频蛋白，钙牵蛋白，钙蛋白酶大亚基，S100蛋白，小白蛋白，钙结合蛋白D9K，钙结合蛋白D28K和钙结合蛋白，内含肽，生物素，链霉抗生物素蛋白，MyoD，Id，亮氨酸拉链序列和麦芽糖结合蛋白。
合适的可检测信号产生蛋白包括例如荧光蛋白；和催化产生可检测信号作为产物的反应的酶等。
合适的荧光蛋白包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)或其变体，GFP的蓝色荧光变体(BFP)，GFP的青色荧光变体(CFP)，GFP的黄色荧光变体(YFP)，增强的GFP(EGFP)，增强的CFP(ECFP)，增强的YFP(EYFP)，GFPS65T，Emerald，Topaz(TYFP)，Venus，Citrine，mCitrine，GFPuv，不稳定的EGFP(dEGFP)，不稳定的ECFP(dECFP)，不稳定的EYFP(dEYFP)，mCFPm，Cerulean，T-Sapphire，CyPet，YPet，MKO，HcRed，t-HcRed，DsRed，DsRed2，DsRed单体，J-Red，二聚体2，t-二聚体2(12)，mRFPl，杯形珊瑚，Renilla GFP，Monster GFP，paGFP，Kaede蛋白和引火蛋白，藻胆蛋白和包括B-藻红蛋白、R-藻红蛋白和别藻蓝蛋白的藻胆蛋白缀合物。荧光蛋白的其它实例包括mHoneydew，mBanana，mOrange，dTomato，tdTomato，mTangerine，mStrawberry，mCherry，mGrapel，mRaspberry，mGrape2，mPlum(Shaner等人(2005)Nat.Methods 2:905-909)等。描述于Matz et al.(1999)Nature Biotechnol.17:969-973中的来自Anthozoan物种的各种荧光和有色蛋白质中的任一种适合使用。
合适的酶包括但不限于辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)，β-半乳糖苷酶(GAL)，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，β-N-乙酰葡糖胺酶，β-葡糖醛酸酶，转化酶，黄嘌呤氧化酶，萤火虫荧光素酶和葡萄糖氧化酶(GO)等。
识别和/或消除结构域
本文公开的任何CAR可包括识别或消除结构域。在一些实施方式中，识别或消除结构域可以源自单纯疱疹病毒衍生的酶胸苷激酶(HSV-tk)或诱导型半胱天冬酶-9，或者可以是FLAG表位(SEQ ID NO：38)。在一些实施方式中，识别或消除结构域被政府管理机构批准用于人的抗体识别，例如但不限于西妥昔单抗，利妥昔单抗或赫赛汀。在一些实施方式中，识别或消除结构域可包括修饰的内源细胞表面分子，如美国专利8,802,374中所述。修饰的内源细胞表面分子可以是任何修饰的细胞表面相关受体，配体，糖蛋白，细胞粘附分子，抗原，整联蛋白或分化簇(CD)。在一些实施方式中，修饰的内源细胞表面分子是截短的酪氨酸激酶受体。在一个方面，截短的酪氨酸激酶受体是表皮生长因子受体家族的成员(例如ErbB1，ErbB2，ErbB3，ErbB4)，例如SEQ ID NO：78。识别或消除结构域可以表达为也包括CAR的单一多肽的一部分。在一些实施方式中，识别或消除结构域可以在单个多肽的N末端处或附近，例如在N末端信号肽之后。在一些实施方式中，识别或消除结构域可位于多肽的C末端或其附近。在一些实施方式中，C末端或其附近的识别或消除结构域可以通过切割信号或核糖体跳跃序列与编码CAR的氨基酸序列分开。切割信号可以是本领域已知的任何切割信号。核糖体跳跃序列可以是本领域已知的任何核糖体跳跃序列，例如具有氨基酸序列GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：77)的2A-1。在一些实施方式中，识别或消除结构域可以在CAR的任何结构域之间，例如在茎和跨膜结构域之间或识别，或消除结构域可以在接头中，例如单链抗体的重链和轻链之间的接头。
表皮生长因子受体也称为EGFR，ErbB1和HER1，是细胞外配体的表皮生长因子家族成员的细胞表面受体。EGFR活性的改变与某些癌症有关。在一些实施方式中，编码包括人表皮生长因子受体(EGFR)的EGFR多肽的基因通过去除编码包括膜远端EGF结合结构域和细胞质信号传导尾部的多肽的核酸序列，但保留细胞外膜由抗EGFR抗体识别的近端表位而构建。在说明性实施方式中，抗体是已知的市售抗EGFR单克隆抗体，例如西妥昔单抗，马妥珠单抗，耐昔妥珠单抗或帕尼单抗。
生物素化西妥昔单抗与抗生物素微珠组合在免疫磁性选择中的应用成功地富集了已用含有EGFRt的构建体进行慢病毒转导的T细胞，其从低至2％的群体到大于90％的纯度而对细胞制备没有可观察到的毒性。这种惰性EGFR分子的组成型表达不影响T细胞表型或效应功能，如协调表达的嵌合抗原受体(CAR)CD19R所指示的。通过流式细胞术分析，EGFR被成功用作小鼠T细胞植入的体内追踪标记物。此外，EGFR通过介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)途径被证明具有自杀基因潜力。因此，EGFR可用作具有免疫治疗潜力的转导T细胞的非免疫原性选择工具、追踪标记和自杀基因。还可以通过本领域熟知的方法检测EGFR核酸。
在一些实施方式中，EGFR表达为也包括CAR的单一多肽的一部分。在一些实施方式中，编码EGFR识别结构域的氨基酸序列可以通过切割信号或核糖体跳跃序列与编码CAR的氨基酸序列分开。切割信号可以是本领域已知的任何切割信号。核糖体跳跃序列可以是本领域已知的任何核糖体跳跃序列，例如具有氨基酸序列GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ IDNO：77)的2A-1。在一些实施方式中，编码识别结构域的多核苷酸序列可以与CAR在相同的转录物上，但通过内部核糖体进入位点与编码CAR的多核苷酸序列分开。
序列的重组
在某些情况下，CAR的多肽序列例如CAR结构域可以通过使用位点特异性重组技术在细胞中重排或缺失。在某些实施方式中，可以通过位点特异性重组来改变对特定CAR的细胞活化相关反应，例如引发第一活化相关反应的CAR的第一细胞内活化结构域可以被交换为引发第二活化相关反应的第二细胞内活化结构域。如本领域技术人员所清楚的，位点特异性重组可用于细胞中以将CAR的任何结构域或序列与本文公开的任何其它结构域或序列交换。如本领域技术人员还清楚的，可以在细胞中使用位点特异性重组来删除CAR的任何结构域或序列。这种序列和结构域的交换和切除是本领域已知的，参见例如Tone等人(2013)Biotechnology and Bioengineering,3219-3226中所述的信号体中的结构域转换，其公开通过引用公开于此。在体内进行位点特异性重组的机制和要求也是本领域熟知的，参见例如Grindley等人(2006)Annual Review of Biochemistry,567-605和Tropp(2012)Molecular Biology(Jones&Bartlett Publishers,Sudbury,MA)，其公开通过引用并入本文。
CAR是嵌合蛋白，其通过将上文讨论的所有不同结构域融合在一起以形成融合蛋白而产生。CAR通常由包含多核苷酸序列的表达载体产生，所述多核苷酸序列编码如本文所讨论的CAR的不同结构域。本发明的ASTR的功能是识别靶细胞上的抗原并与其结合，是条件活性的。具体地，与相应野生型蛋白质的ASTR相比，ASTR在正常生理条件下活性较低或无活性，并且在与靶抗原结合的体外肿瘤替代测定条件下具有活性。
通过产生蛋白质文库并筛选文库中对靶抗原具有所需结合亲和力的蛋白质，可以发现适合全部或部分用于至少其靶抗原的结合域的野生型或天然蛋白质，作为本发明中的ASTR。可以通过筛选cDNA文库发现野生型蛋白质。cDNA文库是插入宿主细胞集合中的克隆cDNA(互补DNA)片段的组合，它们一起构成生物体转录组的一部分。cDNA由完全转录的mRNA产生，因此含有生物体表达蛋白的编码序列。cDNA文库中的信息是通过筛选文库中对靶抗原具有所需结合亲和力的蛋白质来发现具有所需特性的蛋白质的有力且有用的工具。
肿瘤微环境
实体瘤中的癌细胞能够在其周围环境中形成肿瘤微环境，以支持癌细胞的生长和转移。肿瘤微环境是肿瘤存在的细胞环境，包括周围血管，免疫细胞，成纤维细胞，其它细胞，可溶性因子，信号分子，细胞外基质和可促进肿瘤转化、支持肿瘤生长和侵袭、保护肿瘤免受宿主免疫、培养治疗抵抗力、并为休眠转移茁壮成长提供利基的机械信号。肿瘤及其周围的微环境密切相关并不断相互作用。肿瘤可以通过释放细胞外信号、促进肿瘤血管生成和诱导外周免疫耐受来影响其微环境，而微环境中的免疫细胞可以影响癌细胞的生长和进化。参见Swarts等人"Tumor Microenvironment Complexity:Emerging Roles in CancerTherapy,"Cancer Res,vol.,72,pages 2473-2480,2012。
肿瘤微环境通常是缺氧的。随着肿瘤质量的增加，肿瘤内部越来越远离现有的血液供应，这导致难以向肿瘤微环境充分供应氧气。与血浆中约40mm Hg的部分氧气压力相比，肿瘤环境中的氧分压在超过50％的局部晚期实体瘤中低于5mm Hg。相比之下，身体的其它部位并不缺氧。缺氧环境通过下调核苷酸切除修复和错配修复途径导致遗传不稳定，这与癌症进展相关。缺氧还引起缺氧诱导因子Iα(HIF1-α)的上调，其诱导血管生成，并且与较差的预后和与转移相关的基因活化相关。参见Weber等人,"The tumormicroenvironment,"Surgical Oncology,vol.21,pages 172-177,2012和Blagosklonny,"Antiangiogenic therapy and tumor progression,"Cancer Cell,vol.5,pages 13-17,2004。
另外，肿瘤细胞倾向于依赖于不需要氧气的乳酸发酵产生的能量。因此肿瘤细胞不太可能使用需要氧气的正常有氧呼吸。使用乳酸发酵的结果是肿瘤微环境是酸性的(pH6.5-6.9)，而身体的其它部分通常是中性或略微碱性的。例如，人血浆的pH为约7.4。参见Estrella等人,"Acidity Generated by the Tumor Microenvironment Drives LocalInvasion,"Cancer Research,vol.73,pages 1524-1535,2013。由于与位于身体其它部位的细胞相比，增殖癌细胞的营养需求相对较高，因此肿瘤微环境中的营养素可用性也很低。
此外，肿瘤微环境还包含许多在身体的其它部分中不常见的不同细胞类型。这些细胞类型包括内皮细胞及其前体，周细胞，平滑肌细胞，成纤维细胞，癌相关成纤维细胞，肌成纤维细胞，中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，肥大细胞，T和B淋巴细胞，天然杀伤细胞和抗原呈递细胞(APC)例如巨噬细胞和树突细胞(Lorusso等人,"The tumormicroenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis,"Histochem Cell Biol,vol.130,pages 1091-1103,2008)。
因此，肿瘤微环境具有至少几种不同于身体其它部分的生理条件，例如血浆中的生理条件。肿瘤微环境的pH(酸性)低于身体的其它部位，尤其是血浆(pH 7.4)。肿瘤微环境的氧浓度低于身体的其它部分，例如血浆。此外，肿瘤微环境的营养可用性低于身体的其它部分，尤其是血浆。肿瘤微环境还具有一些不同的细胞类型，这些细胞类型在身体的其它部位，尤其是血浆中不常见。
在说明性实施方式中，本发明的CAR包括由野生型生物(即天然)蛋白产生的条件活性ASTR，例如分离自哺乳动物生物的野生型或天然抗体，例如小鼠和人，例如可以是用于肿瘤治疗的候选者。在这样的说明性实施方式中，条件活性ASTR在除肿瘤微环境之外的身体部分中的至少一种生理条件下比天然或野生型生物蛋白质具有较低活性，例如血浆，而它在肿瘤微环境中至少一种生理条件下比天然或野生型生物蛋白质具有更高的活性。这种条件活性的天然或生物蛋白质可以优先作用于肿瘤微环境中的癌细胞以治疗肿瘤，因此不太可能引起副作用。在天然或生物蛋白质是抗原暴露于肿瘤微环境的肿瘤细胞表面上抗原的抗体的实施方式中，条件活性抗体在身体的其它部位例如非肿瘤微环境中比天然或野生型抗体对抗原具有更低的亲和力，而它在肿瘤微环境中比天然或野生型抗体对抗原具有更高的亲和力。这种条件活性抗体可以弱结合或根本不结合体内其它部分的抗原，但与肿瘤微环境中的抗原具有更强的结合或强烈紧密结合。
体外肿瘤代谢测定
在说明性实施方式中，CAR或本公开中使用的ASTR以及通常本文的CAR(包括此类ASTR)在肿瘤环境和/或体外肿瘤替代测定条件下是条件活性的。体外肿瘤替代测定条件可以是在体外测试的任何条件，其中通过比较在体内至少一些癌症中发现的值或水平的条件与在生理条件下在生理组织中发现的值或水平的条件。本文实施例中提供的是与生理pH(例如7.4)相比在低pH(例如6.0或6.7)下细胞裂解的非限制性体外肿瘤替代测定。本公开的CAR可以具有活性的体外肿瘤替代测定条件包括但不限于高透明质酸，乳酸和/或白蛋白，其中正常条件是低水平的乳酸，透明质酸和白蛋白。另一种体外肿瘤替代测定条件是pH，尤其是体外肿瘤替代测定条件中的pH低于正常生理pH的特定条件。例如，肿瘤替代检测条件可以是在范围低端为pH 6.0、6.1、6.2、6.3、6.4和6.5，与范围高端为6.6，6.7，6.8和6.9之间的pH。然而生理pH可以在范围低端为7.2，7.3和7.4与范围高端为7.5，7.6，7.7和7.8之间。在说明性实施方式中，体外肿瘤替代测定条件中的低pH在6.5和6.9之间，并且可以特别是6.7。生理pH可以是pH 7.2至7.6，或者可以特别设定为pH 7.4。在另一个实施方式中，pH未改变，但体外肿瘤替代测定条件仅在乳酸浓度方面不同。在另一个实施方式中，体外肿瘤替代测定条件包括与生理环境相比升高的腺苷水平。在另一个实施方式中，体外肿瘤替代测定条件包括与生理环境相比升高的R-2-羟基戊二酸水平。在其它实施方式中，scFv从单克隆抗体的重链和轻链移植，所述单克隆抗体已经通过分子进化选择用于微环境特异性，例如美国专利8709755B2和申请WO/2016/033331A1中描述的那些。
核酸
本公开提供了核酸，其包括编码本公开的条件活性CAR的多肽的核苷酸序列。在一些实施方式中，包含编码本公开的条件活性CAR的核苷酸序列的核酸将是DNA，包括例如重组表达载体。在一些实施方式中，包含编码本公开的条件活性CAR的核苷酸序列的核酸将是RNA，例如体外合成的RNA。
在一些情况下，核酸用于产生本公开的CAR，例如在哺乳动物细胞中。在其它情况下，受试核酸提供CAR编码核酸的扩增。
编码本公开的CAR的核苷酸序列可以与转录控制元件(例如启动子和增强子等)可操作地连接。
合适的启动子和增强子元件是本领域已知的。为了在细菌细胞中表达，合适的启动子包括但不限于lacI，lacZ，T3，T7，gpt，λP和trc。为了在真核细胞中表达，合适的启动子包括但不限于轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子和增强子元件；巨细胞病毒立即早期启动子；单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；早期和晚期SV40启动子；存在于逆转录病毒的长末端重复序列中的启动子；小鼠金属硫蛋白-I启动子；和各种本领域已知的组织特异性启动子。
合适的可逆启动子包括可逆诱导型启动子，是本领域已知的。这种可逆启动子可以分离并衍生自许多生物，例如真核生物和原核生物。将衍生自第一生物的可逆启动子的修饰用于第二生物例如第一原核生物，第二生核生物，第一真核生物和第二真核生物等是本领域熟知的。此类可逆启动子和基于此类可逆启动子但也包含其它对照蛋白的系统包括但不限于醇调节启动子(例如醇脱氢酶I(alcA)基因启动子，对醇反式活化蛋白(AlcR)有响应的启动子等)，四环素调节的启动子(例如包括TetActivators，TetON，TetOFF等的启动子系统)，类固醇调节的启动子(例如大鼠糖皮质激素受体启动子系统，人雌激素受体启动子系统，类视黄醇启动子系统，甲状腺启动子系统，蜕皮激素启动子系统，米非司酮启动子系统等)，金属调节启动子(例如金属硫蛋白启动子系统等)，发病机制相关的调节启动子(例如水杨酸调节启动子，乙烯调节启动子，苯并噻二唑调节启动子等)，温度调节启动子(例如热休克诱导型启动子(如HSP-70，HSP-90，大豆热休克启动子等)，光调节启动子和合成诱导型启动子等。
在一些情况下，通过诱导诱导系统不可逆地转换含有合适启动子的基因座或构建体或反式基因。用于诱导不可逆开关的合适系统是本领域熟知的，例如不可逆开关的诱导可利用Cre-lox介导的重组(参见例如Fuhrmann-Benzakein等人，PNAS(2000)28:e99，其公开通过引用并入本文)。本领域已知的任何合适的重组酶，内切核酸酶，连接酶，重组位点等的组合可用于产生不可逆转换的启动子。本文其它地方描述的用于进行位点特异性重组的方法、机制和要求可用于产生不可逆转换的启动子，并且是本领域熟知的，参见例如Grindley等人(2006)Annual Review of Biochemistry,567-605和Tropp(2012)MolecularBiology(Jones&Bartlett Publishers,Sudbury,MA)，其公开通过引用并入本文。
在一些情况下，启动子是CD8细胞特异性启动子，CD4细胞特异性启动子，嗜中性粒细胞特异性启动子或NK特异性启动子。例如，可以使用CD4基因启动子；参见例如Salmon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7739；和Marodon等人(2003)Blood 101:3416。作为另一个示例，可以使用CD8基因启动子。通过使用Neri(p46)启动子可以实现NK细胞特异性表达；参见例如Eckelhart等人(2011)Blood117:1565。
在一些实施方式中，例如为了在酵母细胞中表达，合适的启动子是组成型启动子，例如ADH1启动子，PGK1启动子，ENO启动子和PYK1启动子等；或可调节启动子，例如GALI启动子，GAL10启动子，ADH2启动子，PH05启动子，CUP1启动子，GAL7启动子，MET25启动子，MET3启动子，CYC1启动子，HIS3启动子，ADH1启动子，PGK启动子，GAPDH启动子，ADCl启动子，TRP1启动子，URA3启动子，LEU2启动子，ENO启动子，TP1启动子和AOX1(例如用于毕赤酵母)。选择合适的载体和启动子完全在本领域普通技术人员的水平内。
用于原核宿主细胞的合适启动子包括但不限于噬菌体T7RNA聚合酶启动子；trp启动子；lac操纵子启动子；杂合启动子，例如lac/tac杂合启动子，tac/trc杂合启动子，trp/lac启动子，T7/lac启动子；trc启动子；和tac启动子等；araBAD启动子；体内调节启动子，例如ssaG启动子或相关启动子(参见例如美国专利公开号20040131637)，pagC启动子(Pulkkinen和Miller，J.Bacterial.,1991:173(1):86-93；Alpuche-Aranda等人,PNAS,1992；89(21):10079-83)，和nirB启动子(Harborne等人(1992)Mal.Micro.6:2805-2813)等(参见例如Dunstan等人(1999)Infect.Immun.67:5133-5141；McKelvie等人(2004)Vaccine22:3243-3255；和Chatfield等人(1992)Biotechnol.10:888-892)；σ70启动子，例如共有σ70启动子(参见例如GenBank登录号AX798980，AX798961和AX798183)；固定相启动子，例如dps启动子和spv启动子等；来源于致病岛SPI-2的启动子(参见例如WO96/17951)；actA启动子(参见例如Shetron-Rama等人(2002)Infect.Immun.70:1087-1096)；rpsM启动子(参见例如Valdivia和Falkow(1996).Mal.Microbial.22:367)；tet启动子(参见例如Hillen,W.和Wissmann,A.(1989)In Saenger,W.和Heinemann,U.(eds),Topics in Molecular andStructural Biology,Protein-Nucleic Acid Interaction.Macmillan,London,UK,Vol.10,pp.143-162)；和SP6启动子(参见例如Melton等人(1984)Nucl.Acids Res.12:7035)等。适用于原核生物如大肠杆菌的强启动子包括但不限于Trc，Tac，T5，T7和Pλ。用于细菌宿主细胞的操纵基因的非限制性实例包括乳糖启动子操纵基因(当与乳糖接触时Laci阻遏蛋白改变构象，从而阻止Laci阻遏蛋白与操纵基因结合)，色氨酸启动子操纵子(当与色氨酸复合时，TrpR阻遏蛋白具有结合操纵子的构象；在没有色氨酸的情况下，TrpR阻遏蛋白具有不与操纵子结合的构象)和tac启动子操纵子(参见例如deBoer等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:21-25)。
编码CAR的核苷酸序列可以存在于表达载体和/或克隆载体中。当CAR包括两个单独的多肽时，编码这两个多肽的核苷酸序列可以克隆在相同或不同的载体中。表达载体可包括选择标记，复制起点和提供载体复制和/或维持的其它特征。合适的表达载体包括例如质粒和病毒载体等。
大量合适的载体和启动子是本领域技术人员已知的；许多可商购获得用于产生受试重组构建体。通过示例提供以下载体。细菌：pBs，噬菌体，PsiX174，pBluescript SK，pBsKS，pNH8a，pNH16a，pNH18a，pNH46a(Stratagene，La Jolla，CA，USA)；pTrc99A，pKK223-3，pKK233-3，pDR540和pRIT5(Pharmacia，Uppsala，Sweden)。真核生物：pWLneo，pSV2cat，pOG44，PXR1，pSG(Stratagene)pSVK3，pBPV，pMSG和pSVL(Pharmacia)。
表达载体通常具有位于启动子序列附近的方便的限制性位点，以提供编码异源蛋白质的核酸序列的插入。可以存在在表达宿主中有效的选择标记。合适的表达载体包括但不限于病毒载体(例如基于痘苗病毒的病毒载体；脊髓灰质炎病毒；腺病毒(参见例如Li等人，Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549,1994；Borras等人，Gene Ther 6:515 524,1999；Li和Davidson，PNAS 92:7700 7704,1995；Sakamoto等人，H Gene Ther 5:10881097；WO 94/12649，WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)；腺相关病毒(参见例如Ali等人，Hum Gene Ther 9:81 86,1998，Flannery等人，PNAS 94:6916 6921,1997；Bennett等人，Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863,1997；Jomary等人，Gene Ther 4:683 690,1997，Rolling等人，Hum Gene Ther 10:641648,1999；Ali等人，Hum Mol Genet 5:591 594,1996；WO 93/09239中的Srivastava，Samulski等人，J.Vir.(1989)63:3822-3828；Mendelson等人，Virol.(1988)166:154-165；和Flotte等人，PNAS(1993)90:10613-10617)；SV40；单纯疱疹病毒；γ逆转录病毒；人免疫缺陷病毒(参见例如Miyoshi等人，PNAS 94:10319 23,1997；Takahashi等人，J Virol 73:7812 7816,1999)；和逆转录病毒载体(例如鼠白血病病毒，脾坏死病毒和衍生自逆转录病毒的载体，例如劳氏肉瘤病毒，哈维肉瘤病毒，禽白血病病毒，人免疫缺陷病毒，骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒)等。
如上所述，在一些实施方式中，包含编码本公开的条件活性CAR的核苷酸序列的核酸将在一些实施方式中是RNA，例如体外合成的RNA。用于体外合成RNA的方法是本领域已知的；任何已知的方法可用于合成RNA，包括编码本发明的条件活性CAR的核苷酸序列。将RNA引入宿主细胞的方法是本领域已知的。参见例如Zhao等人(2010)Cancer Res.15:9053。将包含编码本发明的条件活性CAR的核苷酸序列的RNA引入宿主细胞可以在体外或离体或体内进行。例如，宿主细胞(例如NK细胞，细胞毒性T淋巴细胞等)可以用包含编码本发明的条件活性CAR的核苷酸序列的RNA在体外或离体电穿孔。
细胞
本公开的一些方面包括或是细胞，在说明性实例中是哺乳动物细胞，其用作包装细胞以制备病毒，例如慢病毒，用于转导T细胞和/或NK细胞。根据本发明，可以选择多种细胞中的任一种用于体外产生病毒，例如假型逆转录病毒。通常使用真核细胞，特别是哺乳动物细胞，包括人，猿，犬，猫，马和啮齿动物细胞。在说明性实例中，细胞是人细胞。在进一步的说明性实施方式中，细胞无限繁殖，因此是永生的。可有利地用于本发明的细胞的实例包括NIH 3T3细胞，COS细胞，Madin-Darby犬肾细胞，人胚胎293T细胞和衍生自这些细胞的任何细胞，例如gpnlslacZφNX细胞，其衍生自293T细胞。可以使用高度可转染的细胞，例如人胚肾293T细胞。“高度可转染的”是指至少约50％，更优选至少约70％，最优选至少约80％的细胞可以表达引入DNA的基因。
合适的哺乳动物细胞包括原代细胞和永生化细胞系。合适的哺乳动物细胞系包括人细胞系，非人灵长类细胞系和啮齿动物(例如小鼠，大鼠)细胞系等。合适的哺乳动物细胞系包括但不限于HeLa细胞(例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)号CCL-2)，CHO细胞(例如ATCC号CRL9618，CCL61，CRL9096)，293细胞(例如ATCC号CRL-1573)，Vero细胞，NIH 3T3细胞(例如ATCC号CRL-1658)，Huh-7细胞，BHK细胞(例如ATCC号CCL10)，PC12细胞(ATCC号CRL1721)，COS细胞，COS-7细胞(ATCC号CRL1651)，RAT1细胞，小鼠L细胞(ATCC号CCLI.3)，人胚肾(HEK)细胞(ATCC号CRL1573)，HLHepG2细胞，Hut-78，Jurkat，HL-60，NK细胞系(例如NKL，NK92和YTS)等。
活化免疫细胞的方法
本公开提供了体外、体内或离体活化免疫细胞的方法。该方法通常涉及使免疫细胞(体外、体内或离体)与Axl和/或Ror2接触，其中免疫细胞已遗传修饰以产生(即表达)本公开的条件活性CAR。在Axl和/或Ror2存在下，条件活性CAR活化免疫细胞，从而产生活化的免疫细胞。免疫细胞包括例如细胞毒性T淋巴细胞，NK细胞，CD4+T细胞，T调节(Treg)细胞，T细胞，NK-T细胞，嗜中性粒细胞等。在说明性实施方式中，免疫细胞细胞是T细胞或NK细胞，在特别说明性的实施方式中，免疫细胞是T细胞，其包括NK-T细胞。在此类说明性实施方式中，活化通常是活化T细胞或NK细胞的细胞毒活性。可以使用多种免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)进行这些方法。在进一步的说明性实施方式中，接触涉及使表达Axl和/或Ror2的靶哺乳动物细胞与免疫细胞接触。这种活化T细胞或NK细胞的方法可以通过检测T细胞或NK细胞释放细胞因子如IFN-γ或IL-2的释放，T细胞和/或NK细胞针对表达Axl或Ror2的细胞的细胞毒活性增加，T细胞或NK细胞中IFNγ和/或IL-2的细胞内表达增加，以及T细胞或NK细胞的CD107a和/或CD69表达增加来检测，如通过荧光活化细胞分选(FACS)分析测量。本文的实施例1、3和4提供了检测T细胞和/或NK细胞活化的这些方法中一些的细节。
本文提供的其它方面包括用于将免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)结合至靶哺乳动物细胞的方法，其包括在体外、体内或离体使靶哺乳动物细胞与免疫细胞接触，其中靶哺乳动物细胞表达Axl和/或Ror2，并且免疫细胞表达与Ax1或Ror2结合的本文提供的任何CAR。这种结合可以活化免疫细胞。可以使用多种免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)进行这些方法。通过细胞因子的释放检测T细胞或NK细胞的活化和细胞毒活性的增加所检测的这种结合方法在本文的实施例1、实施例3和实施例4中提供。
在本文的说明性实施方式中，结合或活化免疫细胞的方法中的接触涉及在小于7.4的pH的微环境中使免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)接触。例如，在示例性实施方式中，pH可以小于5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8或6.9，或在5.8-7.0的范围内，在说明性实施方式中是在6.0至6.8的范围内，在6.1至6.9的范围内，在6.2至6.8的范围内，或在范围低端为6.0，6.1，6.2，6.3，6.4和6.5与范围高端为6.6，6.7，6.8和6.9之间。在此类说明性实施方式中，CAR是本文公开的任何CAB-CAR，其识别本文提供的Axl或Ror2。
使经遗传修饰的免疫细胞(例如T淋巴细胞，NK细胞)与Axl和/或Ror2接触可以使得与不存在Axl和/或Ror2时免疫细胞产生的细胞因子的量相比，该免疫细胞产生的细胞因子增加至少约10％，至少约15％，至少约20％，至少约25％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约75％，至少约2倍，至少约2.5倍，至少约5倍，至少约10倍或超过10倍。使经遗传修饰的免疫细胞(例如T淋巴细胞或NK细胞)与Axl和/或Ror2接触可以使得与不存在Axl和/或Ror2时免疫细胞分泌的细胞因子的量相比，该免疫细胞分泌的细胞因子增加至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少40％，至少50％，至少75％，至少2倍，至少2.5倍，至少5倍，至少10倍或超过10倍。可以增加产量的细胞因子包括但不限于IL-2和IFN-γ。
使经遗传修饰的细胞毒性细胞(例如细胞毒性T淋巴细胞)与AAR接触可使得与不存在Axl和/或Ror2的细胞毒性细胞的细胞毒活性相比，该细胞毒性细胞的细胞毒活性增加至少约10％，至少约15％，至少约20％，至少约25％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约75％，至少约2倍，至少约2.5倍，至少约5倍，至少约10倍或超过10倍。
使经遗传修饰的细胞毒性细胞(例如细胞毒性T淋巴细胞)与Axl和/或Ror2接触可使得与不存在Axl和/或Ror2的细胞毒性细胞的细胞毒活性相比，该细胞毒性细胞的细胞毒活性增加至少约10％，至少约15％，至少约20％，至少约25％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约75％，至少约2倍，至少约2.5倍，至少约5倍，至少约10倍或超过10倍。
在其它实施方式中，例如取决于宿主免疫细胞，使遗传修饰的宿主细胞与抗原接触可以增加或减少细胞增殖、细胞存活和细胞死亡等。
制备/分离条件活性的抗原特异性靶向区的方法
在说明性实施方式中，本文公开的抗Axl和抗Ror2抗原受体是条件活性的，使得它们在pH 6.7(肿瘤环境和/或体外肿瘤替代测定条件中的示例性pH)下与7.4(正常生理条件)相比表现出与Axl或Ror2的结合增加。在本文公开的任何方面的一些说明性实施方式中，条件活性的抗Axl或抗Ror2ASTR从初始多肽文库中鉴定，而在筛选/进化之前没有突变/进化文库成员和/或在任选重复轮次筛选期间或之间不发生突变。在其它实施方式中，条件活性的抗Axl或抗Ror2ASTR通过包括突变/进化的方法鉴定，并且在一些实施方式中以野生型抗体开始。示例性的跨膜结构域和细胞内活化结构域可以是本文公开的CAR中的任一种。
在一个方面，本文提供了用于选择条件活性抗Axl或抗Ror2ASTR的方法，包括通过以下方式淘选多肽展示文库：
a.使多肽展示文库的多肽在pH 7.4(或其它正常生理条件)下进行Axl或Ror2结合试验，并在pH 6.7(或其它体外肿瘤替代试验条件)下进行Axl或Ror2结合试验；和
b.选择与pH7.4相比在pH6.7下表现出Axl或Ror2结合活性增加的多肽，或与正常生理条件相比的其它体外肿瘤替代测定条件，从而选择条件活性的抗原特异性靶向区域。
在一些实施方式中，进行单轮选择以获得条件活性的抗Axl或抗Ror2靶向区域。在某些实施方式中，在鉴定在体外肿瘤替代测定条件下结合抗原并且在生理条件下不结合的游离抗体、或表达具有这些特性的测试抗体的细胞、或用在初始或前一轮中具有此类特性的测试抗体涂覆的噬菌体后，重复筛选或淘选方法。在一些方法中，收集的噬菌体用于感染细胞，其也可以用辅助噬菌体感染，以扩增收集的噬菌体。在测试细胞表面上的抗体的其它方法中，可以通过扩增编码多肽的细胞中的抗体来生长收集的细胞以“扩增”细胞表达的抗体。在一些实施方式中，通过培养表达所鉴定抗体的细胞来完成扩增，而不执行在轮次之间突变编码所鉴定抗体的抗体的过程。因此，然后通过扩增含有编码这些所收集抗体的抗体的细胞来富集在前一轮中收集的抗体。
淘选或筛选方法可以进行一次，或重复1至1000次。在说明性实施方式中，淘选重复1至20次或2至10次或2至5次。
在其它方法中，使用多轮淘选之间的一轮或多轮突变/进化产生条件活性的抗Axl或抗Ror2ASTR。在一种方法中，鉴定野生型蛋白质(例如抗体)，例如通过产生多肽或蛋白质文库并筛选多肽或蛋白质文库以获得对靶抗原具有所需结合亲和力的多肽或蛋白质。在野生型蛋白质是抗体的一些实施方式中，可以通过产生和筛选多克隆或单克隆抗体文库(包括噬菌体展示抗体文库，例如噬菌体展示人源化抗体文库)来发现野生型抗体。
可以通过使野生型蛋白质或编码野生型蛋白质的核酸序列经历诱变过程来产生进化的抗Axl或Ror2ASTR，以产生可以筛选为鉴定突变ASTR的突变多肽群体，其在肿瘤环境和/或体外肿瘤替代测定条件中与正常生理环境相比具有增加的活性(例如增强的对靶抗原的结合亲和力)。WO2016033331(“用于修饰的T细胞的条件活性嵌合抗原受体”)或美国专利号8,709,755中提供了这些方法的实例。
使用本文提供的方法鉴定的条件活性抗Axl或抗Ror2ASTR通常是多肽，更具体地是多肽抗体，并且在说明性实施方式中是单链抗体，如本文更详细讨论的。这些多肽可以在体外肿瘤替代测定条件下与正常生理条件下相比以更高或更低的亲和力结合Axl或Ror2，但是在说明性实施方式中是在体外肿瘤替代测定条件下比正常条件具有更高的亲和力结合。在一些实施方式中，这些多肽可以在体外肿瘤替代测定条件下以比生理学(即正常)条件更高10％，20％，25％，50％，75％，90％，95％或99％的亲和力与其同源抗原结合。在一些实施方式中，使用本文提供的方法鉴定的ASTR在正常生理条件下不与其同源抗原结合至高于使用阴性对照(例如阴性对照抗体)获得的背景水平的任何可检测水平。
编码通过本文提供的方法分离的条件活性的抗Axl或抗Ror2ASTR的核苷酸序列可以通过测序表达条件活性抗Axl或抗Ror2抗原特异性靶向的收集细胞的核苷酸来确定。然后，通过产生编码包含条件活性的抗Axl或抗Ror2抗原特异性靶向区域、跨膜结构域和细胞内活化结构域的多肽的多核苷酸，该核苷酸序列信息可用于制备条件活性的抗Axl或抗Ror2生物嵌合抗原受体(CAB-CAR)。可将条件活性的抗Axl或抗Ror2抗原特异性靶向区克隆到CAR构建体表达系统中，该系统可用于产生在其基因组中包含CAR的重组慢病毒，然后重组慢病毒可用于转导在肿瘤选择性环境与正常生理条件相比中测试CAR介导的Axl或Ror2表达靶细胞杀伤的T细胞，如本文实施例1中所示。
产生条件活化细胞的方法
本公开提供了产生条件活化细胞的方法。该方法通常涉及用表达载体(例如质粒或病毒)或RNA(例如体外转录的RNA)遗传修饰哺乳动物细胞，包括编码本公开的条件活性CAR的核苷酸序列。在Axl和/或Ror2存在下，遗传修饰的细胞可以是条件活化的。遗传修饰可以在体内、体外或离体进行。细胞通常是免疫细胞(例如T淋巴细胞，T辅助细胞或NK细胞)，干细胞，祖细胞等。在说明性实施方式中，细胞是T细胞。
在一些情况下，遗传修饰是离体进行的。例如，从个体获得T淋巴细胞，干细胞，T辅助细胞或NK细胞；并且从个体获得的细胞经遗传修饰以表达本公开的CAR。在Axl和/或Ror2存在下，遗传修饰的细胞可以是条件活化的。在一些情况下，遗传修饰的细胞离体活化。在其它情况下，将遗传修饰的细胞引入个体(例如获得细胞的个体)；并且遗传修饰的细胞在体内被活化。例如，当Axl和/或Ror2存在于个体细胞的表面上时，不需要施用抗原。遗传修饰的细胞与个体细胞表面上存在的抗原接触，并且遗传修饰的细胞被活化。例如，当遗传修饰的细胞是T淋巴细胞时，遗传修饰的细胞可以对在其CAR结合的表面上表达Axl和/或Ror2的细胞表现出细胞毒性。
在一个方面，本文提供了用于制备条件活化的T细胞和/或NK细胞的离体方法，其包含用于条件结合Axl或Ror2的嵌合抗原受体(CAR)，其中该方法包括：
a)富集外周血单核细胞(PBMC)以分离来自分离血液的包含T细胞和/或NK细胞的PBMC；
b)在有效条件下活化富集的PBMC的T细胞和/或NK细胞；
c)在有效条件下用非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒转导活化的T细胞和/或NK细胞，从而产生经遗传修饰的T细胞和/或NK细胞，其中非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒各自包含一个或多个逆转录病毒基因组，所述逆转录病毒基因组包含一种或多种与在T细胞和/或NK细胞中有活性的启动子可操作地连接的核酸序列，其中一个或多个核酸序列的第一核酸序列编码根据本文提供的任何实施方式的CAB-CAR；和
d)扩增经遗传修饰的T细胞和/或NK细胞，从而制备条件活化的T细胞和/或NK细胞。
在上述方面的一些实施方式中，该方法还包括收获扩增的经遗传修饰的T细胞和/或NK细胞。在上述方面的一些实施方式中，该方法还包括在富集PBMC之前从受试者采集血液。在进一步的实施方式中，该方法还包括将收获的扩增的经遗传修饰的T细胞和/或NK细胞引入受试者。在进一步的实施方式中，经遗传修饰的T细胞和/或NK细胞在它们被引入受试者后1，2，3，4，5，6，7或14天存在于受试者体内。
血液收集
可以通过本领域已知的任何合适的方法从受试者收集或获得含有PBMC的血液。例如，可以通过静脉穿刺或任何其它血液收集方法收集血液，通过该方法收集血液和/或PBMC样品。在一些实施方式中，PBMC可通过如下所述的单采血液成分术获得。
富集PBMC
在用于制备条件活化的T细胞和/或NK细胞的离体方法中，在富集步骤中将包括T细胞和/或NK细胞的外周血单核细胞(PBMC)与血液样品的其它组分分离。可以使用本领域已知的任何方法，例如使用单采血液成分法和/或密度梯度离心从其它血液成分和血细胞中富集PBMC。在一些实施方式中，可以使用Ficoll-Paque(GE Healthcare)。在一些实施方式中，使用从受试者采集血液的自动血液分离术分离器使血液通过分选出特定细胞类型的装置(例如PBMC)，并将剩余物返回到受试者体内。可以在单采血液成分术后进行密度梯度离心。在一些实施方式中，可以使用白细胞减少过滤装置富集和分离PBMC。在一些实施方式中，然后根据细胞表型(即阳性选择)，将磁珠活化细胞分选用于从PBMC纯化特定细胞群，例如T细胞和/或NK细胞。在一些实施方式中，可以使用本领域已知的方法从PBMC中除去单核细胞和/或巨噬细胞。关于待治疗的受试者，细胞可以是异体的和/或自体的。在PBMC富集过程期间，可以在分离富集的PBMC然后活化之前，如本领域已知的进行一次或多次洗涤。洗涤溶液可以是适用于洗涤血液和/或PBMC的任何溶液。根据本领域已知的方法，可以将分离的PBMC重悬于用于培养T细胞和/或NK细胞的任何合适的基础培养基中。在一些实施方式中，培养基可以补充有HSA，人AB+血清，来自受试者的血清和/或血清替代物。
活化PBMC
用于制备本文提供的条件活化的T细胞和/或NK细胞的离体方法通常包括用一种或多种活化剂活化或刺激分离的PBMC以产生活化的T细胞和/或NK细胞的步骤。可以对新鲜分离的PBMC或先前冷冻保存的PBMC进行活化。在使用冷冻保存的细胞的情况下，可以在使用前使用开发的方案解冻细胞。
在活化期间通常存在培养基，例如本领域已知的用于离体过程的那些(作为非限制性实例，X-VIVO 15(Lonza)或CTS培养基(Thermo Fisher))。在一些实施方式中，培养基可以补充有HSA，人AB+血清，源自受试者的血清和/或血清替代物。在说明性实施方式中，培养基可以补充有血清替代物，例如CTS血清替代物(Thermo Fisher)。在一些实施方式中，培养基可以补充有HSA，人AB+血清，来自受试者的血清和/或血清替代物。
可以将一种或多种活化剂的任何组合添加到培养基中以产生活化的T细胞和/或NK细胞。通常形成反应混合物以进行活化。在一些实施方式中，可以通过向培养基中添加一种或多种活化剂来形成反应混合物。在本文公开的任何实施方式中，一种或多种活化剂以有效量使用，从而产生活化的T细胞和/或NK细胞。
值得注意的是，在制备条件活化的T细胞和/或NK细胞的实施方式中的这种活化可涉及在低于7.0的pH下用Axl或Ror2活化细胞，例如分离的可溶性Axl或Rors。然而，制备条件活化的T细胞和/或NK细胞的方法中的活化通常使用更通用的活化剂。因此，在一些实施方式中，活化剂可以是靶向或结合T细胞刺激或共刺激分子、T细胞细胞因子或任何其它合适的促分裂原(例如抗CD2，抗CD3和/或抗CD28)或其功能片段(例如十四烷酰佛波醇乙酸酯(TPA)，植物血凝素(PHA)，伴刀豆球蛋白A(conA)，脂多糖(LPS)，商陆有丝分裂原(PWM))的多肽或抗体，即T细胞刺激或共刺激分子、磷酸抗原或氨基二膦酸盐如唑来膦酸盐的天然配体。本领域已知各种抗体及其功能片段以活化或刺激T细胞和/或NK细胞。在一些实施方式中，一种或多种抗体或其功能片段可以固定在固体表面例如珠子上。
T细胞和/或NK细胞的转导
本文提供的用于制备条件活化的T细胞和/或NK细胞的离体方法通常包括转化或转导活化的T细胞和/或NK细胞的步骤。在此类方法的一些实施方式中，T细胞和/或NK细胞与表达载体离体接触，例如非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒，以遗传修饰T细胞和/或NK细胞。不受理论限制，在接触期间，非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒与T细胞和/或NK细胞结合，此时逆转录病毒和宿主细胞膜开始融合。然后，通过转导过程，来自非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒的遗传物质进入T细胞和/或NK细胞，并且通常掺入宿主细胞DNA中。因此，此类方法包括通过转导对T细胞和/或NK细胞进行遗传修饰。本领域已知用非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒离体转导T细胞和/或NK细胞的方法，例如非复制胜任型重组慢病毒颗粒。示例性方法描述于例如Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637-1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；和Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505。在一些实施方式中，T细胞和/或NK细胞可以与非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒接触。在说明性实施方式中，T细胞和/或NK细胞可以与非复制胜任型重组慢病毒颗粒接触。
扩增转导的T细胞和/或NK细胞
在用于制备本文提供的条件活化的T细胞和/或NK细胞的离体方法的说明性实施方式中，转导的T细胞和/或NK细胞在收获前扩增。在本文公开的任何实施方式中，存在用于活化和转导的培养基，并且可以在转导后进一步添加或交换培养基，以进行扩增。在一些实施方式中，可以将介质添加到活化期间形成的反应混合物中。用于扩增的培养基通常包括用于活化和转导的相同基础培养基，例如本领域已知的用于离体过程的培养基，尤其是用于T细胞和/或NK细胞(作为非限制性实例，X-VIVO 15(Lonza)或Optimizer CTS培养基(Thermo Fisher))。在一些实施方式中，培养基可以补充有HSA，人AB+血清，来自受试者的血清和/或血清替代物，例如CTS血清替代物(Thermo Fisher)。细胞因子如IL-2，IL-7或IL-15或在HSA中发现的细胞因子可在活化、转导和扩增之前、期间和/或之后加入培养基中。细胞扩增可以进行一定天数。在一些实施方式中，可以进行扩增4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20或21天。在一些实施方式中，可以在范围低端为4，5，6，7或8天与范围高端为9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20或21天之间进行扩增。在某些说明性实施方式中，进行扩增6至12天，或8至10天。
细胞收获
用于制备本文提供的条件活化的T细胞和/或NK细胞的离体方法通常包括在扩增后收获遗传修饰的T细胞和/或NK细胞。在一些实施方式中，可以使用本领域已知的方法在收获期间浓缩或收集转导的T细胞和/或NK细胞。在一些实施方式中，可以在收获期间使用本领域已知的任何合适的洗涤溶液洗涤T细胞和/或NK细胞一次或多次。在收获结束时，可以将T细胞和/或NK细胞重悬浮于本领域已知的任何合适的培养基中。在本文公开的任何实施方式中，可以基于扩增完成标准进行收获扩增的T细胞和/或NK细胞。在一些实施方式中，扩增完成标准可以是乳酸盐浓度，细胞密度或扩增天数。
在一些实施方式中，可以将收获的细胞引入，引回，再引入，输注或再输注入受试者体内。在一些实施方式中，收获的细胞可以在再引入受试者之前如下所述进行冷冻保存。在说明性实施方式中，将收获的细胞引入，引回，再引入，输注或再输注入受试者中，而无需首先冷冻保存细胞。受试者通常是从中收集血液的相同受试者。
在整个本公开中，转导的T细胞和/或NK细胞包括转导细胞的后代，其保留至少一种在离体转导期间掺入细胞中的核酸。在本文中引用“再引入”转导细胞的方法中，应当理解，当从受试者的血液中收集时，这种细胞通常不处于转导状态。
细胞引入/再引入
在用于制备本文公开的条件活化的T细胞和/或NK细胞的离体方法的某些实施方式中，可以将收获的T细胞和/或NK细胞引入，引回，再引入，输注或再输注入受试者中以为了治疗效果。待再引入的T细胞和/或NK细胞的数量可以是预定剂量，其可以是治疗有效剂量。在一些实施方式中，预定剂量可取决于在细胞上表达的CAR(例如在转导的T细胞和/或NK细胞上表达的抗原特异性靶向区域的亲和力和密度)，靶细胞的类型，疾病的性质或正在治疗的病理状况，或其组合。在一些实施方式中，收获细胞的预定剂量可以基于受试者的质量，例如每千克受试者的细胞(细胞/kg)。
细胞冷冻保存
在用于制备本文提供的条件活化的T细胞和/或NK细胞的离体方法中，通过本文所述的方法产生的收获细胞可以预定剂量冷冻保存以供稍后使用。用于冷冻保存细胞的方法和试剂在本领域中是众所周知的。冷冻保存可包括一次或多次洗涤和/或浓缩T细胞和/或NK细胞的步骤。该方法还可包括形成冷冻保存混合物的步骤，其包括T细胞和/或NK细胞在稀释剂溶液和合适的冷冻保存溶液中。在一些实施方式中，该方法可包括如本领域已知的冷冻冷冻保存混合物的步骤。解冻冷冻保存的T细胞和/或NK细胞的方法是本领域已知的。
通过改变pH调节CAB-CAR表达T细胞和/或NK细胞活性的方法
本文在某些方面提供了调节免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)的活化的方法，其通过在pH低于7.0(例如低于6.9或6.8)的微环境中使免疫细胞与Axl或Ror2接触，然后改变微环境的pH使其达到或高于7.0(例如高于7.1，7.2或7.3)来进行，其中免疫细胞表达本文提供的任何CAB-CAR。在说明性实施方式中，Axl或Ror2在靶哺乳动物细胞的表面上表达。在某些实施方式中，这种用于调节活化的方法与本文提供的活化免疫细胞的方法相同，还包括将微环境的pH增加至pH达到或高于7.0(例如高于7.1，7.2或7.3)的额外步骤，从而减少免疫细胞的活化。在说明性实施方式中，pH的这种增加使免疫细胞失活。
本文在某些方面提供了用于调节表达CAB-CAR的T细胞或NK细胞的靶细胞的结合和产生的裂解/杀伤的方法，其通过在包含靶细胞的微环境内引起pH的改变或转变来进行，所述靶标通过调节CAB-CAR与靶细胞上的同源抗原结合而在靶组织内或在一个或多个靶外(例如健康/正常)组织内，其中同源抗原是Axl多肽或其表位，或Ror2多肽或其表位。此类方法通常包括使靶细胞(例如哺乳动物细胞(例如人细胞))与微环境中表达CAB-CAR的T细胞或NK细胞接触，然后通过降低或更通常增加pH来改变微环境的pH。微环境可以是靶微环境，例如肿瘤，或靶外微环境，其中靶外结合可引起副作用。在一些实施方式中，此类方法可提供肿瘤微环境敏感性CAR-T靶标结合的瞬时减少。
因此，在一个方面，本文提供了用于调节表达条件活性的生物嵌合抗原受体(CAB-CAR)的T细胞或NK细胞与受试者中表达CAB-CAR的同源抗原的细胞结合的方法，包括以下内容：
a.将包含编码CAB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞引入受试者，其中在引入之后(并且任选地和/或期间)，包含编码CAB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞表达CAB-CAR并与受试者中表达同源抗原的细胞结合，其中同源抗原是Axl多肽或其表位，或Ror2多肽或其表位；和
b.以足够量向受试者施用药理学试剂以增加血液pH和/或组织pH和/或微环境pH，其中施用在引入之前、期间或之后进行，并且其中血液、组织和/或微环境的pH增加调节表达CAB-CAR的T细胞和/或NK细胞与表达具有增加的pH的血液、组织或微环境中的同源抗原的细胞结合。
在包括施用本公开的pH调节药理学试剂的步骤的方面中，pH的改变/变化可以通过将靶或非靶细胞/组织暴露于pH调节药理学试剂来完成，例如通过将pH调节药理学试剂施用于受试者。本文提供了pH调节药理学试剂的非限制性实例。在某些方面，本文提供了用于调节CAB-CAR与其同源抗原结合或用于调节表达CAB-CAR的T细胞和/或NK细胞与表达其同源抗原的细胞结合或用于减少或减轻受试者中的靶内肿瘤外毒性的方法中的药理学试剂。在某些实施方式中，这些方面涉及治疗肿瘤生长，癌症，增生或细胞增殖性疾病。
在其它方面，本文提供了pH调节药理学试剂在制备用于在受试者中体内控制遗传工程化T细胞和/或NK细胞与靶哺乳动物细胞结合的药物或试剂盒中的用途，其中靶细胞表达Axl多肽或其表位、或Ror2多肽或其表位。在其它方面，本文提供了试剂盒，其包括含有非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒的容器，以及其用于实施治疗肿瘤生长的方法的说明书，其中说明书指导了通过调节pH控制T细胞和/或NK细胞与靶哺乳动物细胞结合的方法，其中靶哺乳动物细胞表达Axl多肽或其表位、或Ror2多肽或其表位。这种方法可以是本文提供的用于通过改变pH调节表达CAB-CAR的T细胞和/或NK细胞结合和/或活性的任何方法。含有重组逆转录病毒颗粒的容器可以是管，小瓶，孔板或其它容器，用于储存重组逆转录病毒颗粒和/或pH调节药理学试剂。任何这些都可以具有工业强度和等级。在某些实施方式中，试剂盒可包括两个或更多个容器。一个容器/器皿可包括重组逆转录病毒颗粒，另一个容器/器皿可包括pH调节药理学试剂。在这些方法中，以足够量递送/施用药理学试剂以增加血液pH和/或组织pH和/或微环境pH以调节表达CAB-CAR的修饰/重组T细胞和/或NK细胞的CAB-CAR与具有增加pH的血液和/或组织中的其同源抗原结合。本文提供了非限制性的示例性细节，用于以足够量和足够时间施用pH调节药理学试剂。
在将CAB-CAR引入受试者后，可以使靶细胞(无论相对于组织是靶内还是靶外)与pH调节剂(例如pH调节药理学试剂)接触。因此，本文提供的用于调节表达CAB-CAR的T细胞的结合和/或细胞毒活性的示例性方面能够结合(即识别)Axl多肽或其表位，或Ror2多肽或其表位。例如，为了减轻靶内肿瘤外活性和/或抑制靶细胞增殖，例如肿瘤细胞增殖，可以包括以下步骤：
a.将包含编码CAB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞引入受试者中，其中在引入后，包含编码CAB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞表达CAB-CAR，其中CAB-CAR能够结合Axl多肽或其表位，或Ror2多肽或其表位，并任选地与受试者中表达同源抗原的细胞结合；和
b.以足够量向受试者施用药理学试剂以增加血液pH和/或组织pH和/或微环境pH以调节表达CAB-CAR的T细胞和/或NK细胞与在具有增加pH的血液，组织或微环境中表达CAB-CAR的同源抗原的细胞结合。应当理解，取决于用于将编码CAB-CAR的核酸引入T细胞和/或NK细胞的特定方法，T细胞和/或NK细胞可以在引入受试者之前表达或不表达CAB-CAR。然而，在引入受试者后的某个时间点例如2小时，4小时，8小时，12小时，1天，2天，4天和/或7天或更长时间，包含编码CAB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞表达CAB-CAR。然后这些细胞通常与表达CAB-CAR的同源抗原的靶细胞结合。
本文提供的用于遗传修饰和任选地扩增受试者的淋巴细胞的方法可用于将编码CAB-CAR的核酸序列引入受试者的T细胞和/或NK细胞的基因组中以产生能够表达CAB-CAR的T细胞和/或NK细胞，然后将能够表达CAB-CAR的T细胞和/或NK细胞引入受试者，其中在引入后，T细胞和/或NK细胞表达CAB-CAR以使CAB-CAR与靶细胞/组织接触。本公开提供了如何进行这些方法的细节，以及不同CAR组分的各种替代方案，其中任一种都可以用于本公开的方面，包括改变pH以调节表达CAB-CAR的T细胞和/或NK细胞与表达CAB-CAR的同源抗原的靶细胞结合。
用于遗传修饰和扩增淋巴细胞的此类方法通常涉及使T细胞和/或NK细胞与非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒接触以转导T细胞和/或NK细胞。这种接触通常在从受试者中除去淋巴细胞后离体发生。然后将T细胞和/或NK细胞引入/再引入通常从中去除的受试者。非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒包括具有编码CAB-CAR的多核苷酸的基因组。关于这种非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒的许多替代实施方式和进一步细节在本文的其它部分中提供，并且可以用于本文提供的用于调节表达CAB-CAR的T细胞或NK细胞的靶细胞的结合和产生的裂解/杀伤的方法，所述CAB-CAR能够结合Axl多肽或其表位，或Ror2多肽或其表位，其通过调节表达由CAB-CAR以pH依赖性方式识别的同源靶多肽的细胞的微环境中的pH进行。
用于通过表达CAB-CAR的T细胞和/或NK细胞调节靶细胞结合的此类方法可用于例如通过增加受试者体内的血液和/或非肿瘤组织pH来降低靶内肿瘤外毒性。例如，在受试者内的“正常”组织pH瞬时变低的情况下，可以以正常组织pH增加而肿瘤pH保持较低并且仍然在其中表达CAB-CAR的T细胞和/或NK细胞结合靶肿瘤细胞的pH的方式递送pH调节剂。在这些实施方式中，pH调节剂可以较低浓度或以靶方式递送至正常组织。
在一些实施方式中，这可以在允许肿瘤微环境内的pH保持足够低以使CAB-CAR T细胞和/或NK细胞与在肿瘤内的其同源靶表达细胞结合时完成。在本文提供的方法的说明性方面，组织pH保持在其中表达CAB-CAR的T细胞和/或NK细胞结合其靶标的pH下一段足以使表达CAB-CAR的T细胞和/或NK细胞接触并结合表达其同源抗原的细胞的时间(例如2，4，8，12或24小时，或2，4，7，14，28或30天，或1，2，3，4，5，6，12，24个月或更长)，并然后变化/改变pH，例如通过将组织pH增加到影响表达CAB-CAR的T细胞和/或NK细胞与靶细胞结合的程度进行。
因此，在一个方面，本文提供了通过血管和组织pH的药理学修饰瞬时减少肿瘤微环境敏感性CAR-T细胞靶标结合的方法，其中CAR-T细胞表达CAB-CAR，其为能够结合Axl多肽或其表位，或Ror2多肽或其表位。CAR-T细胞中的这些微环境控制的ASTR提供额外水平的针对靶内肿瘤外毒性的保护，所述毒性需要肿瘤局部环境条件以使T细胞接合。虽然对于一些单克隆抗体治疗具有吸引力，但过继性细胞治疗可能会产生瞬时允许其CAR-T靶标的局部环境。例如，在具有低pH的组织中活化的CAR-T细胞可以进一步降低微环境的pH，这取决于CAR构建体中存在的细胞质结构域。在其它情况下，细胞因子释放综合征和与过继性细胞治疗相关的其它发病率可能导致血液的碳酸氢盐缓冲能力丧失，导致乳酸性酸中毒。已经确定通过静脉内输注施用的过继性细胞治疗导致暂时的肺部截留。对于一些细胞治疗，输注速率需要持续监测溶解氧(Fischer等人，Stem Cells Dev.2009Jun；18(5):683–691)。肺部截留的程度取决于细胞大小，活化状态，细胞剂量和输注速率。Cruz等人(Cytotherapy.2010Oct；12(6):743–749)报道了T细胞输注的超过300个不良发现，低剂量和缓慢输注可减少肺部截留。然而，对于某些高效CAR-T细胞，甚至在肺内皮上存在低水平的靶标，例如Her2(Morgan等人，Mol Ther.2010Apr；18(4):843–851)，由于输注后肺中初始高CAR-T细胞浓度和这些组织中存在T细胞靶，可导致不可控的立即毒性，并导致患者病情迅速恶化。在其它情况下，在其它靶外组织(如胆管)中存在T细胞靶标可能会产生无可控的靶内肿瘤外毒性(Lamers Mol Ther.2013Apr；21(4):904-12)并导致可以使用其它药剂如类固醇或细胞消除表位之前的严重器官毒性。虽然静脉和动脉血浆对酸中毒具有强烈的缓冲能力，但是在用过继性细胞治疗治疗的癌症患者中可发生呼吸性酸中毒，休克，代谢性酸中毒和缺血性酸中毒的病症。
在本文提供的一些方面，可以通过向受试者施用药理学试剂来调节CAB-CAR在受试者中的结合，以增加或降低血液，组织和/或微环境pH。在一些方面，通过向受试者施用药理学试剂以增加或降低血液pH和/或组织pH和/或微环境pH，可以减轻受试者的靶内肿瘤外毒性。在一些方面，可以通过引入药理学试剂来增加或降低血液pH和/或组织pH和/或微环境pH以控制T细胞和/或NK细胞与靶哺乳动物细胞的结合。在一些方面，可以通过向受试者施用pH调节药理学试剂来控制遗传工程化T细胞和/或NK细胞与受试者体内靶哺乳动物细胞的结合。在说明性实施方式中，药理学试剂可以增加血液pH和/或组织pH和/或微环境pH。在一些实施方式中，微环境可以是体内微环境。在说明性实施方式中，微环境可以是肿瘤微环境。在一些实施方式中，微环境可包括靶哺乳动物细胞，其中靶哺乳动物细胞在其表面上表达靶抗原。在一些实施方式中，向受试者施用药理学试剂可以使血液、组织和/或微环境pH从小于5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8或6.9的pH增加到至少6.6，6.7，6.8，6.9，7.0，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5或7.6的pH，其中血液、组织和/或微环境pH在施用药理学试剂之前比在施用药理学试剂之后更低。在一些实施方式中，向受试者施用药理学试剂可以使血液、组织或微环境pH从大于6.6，6.7，6.8，6.9，7.0，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5或7.6的pH降低至小于5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8或6.9的pH，其中血液、组织和/或微环境pH在施用药理学试剂之前比施用药理学试剂之后更高。在一些实施方式中，向受试者施用药理学试剂可引起受试者在血液、组织和/或微环境中的pH变化。在一些实施方式中，pH变化可以在任选方向为至少0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7或1.8个pH单位，即在施用药理学试剂之前的pH相对于施用药理学试剂之后pH增加或减少。在说明性实施方式中，pH变化是pH增加。
本公开的CAB-CAR在一个pH下比在不同pH下与同源抗原的结合降低。在示例性实施方式中，其中CAB-CAR的差异结合的示例性pH值尚未在最广泛的方面提供，并且替代地用于其它实施方式代替这些方面的那些值，CAB-CAR可以在更高pH下比在更低pH下具有降低的结合。例如，CAB-CAR在高于7.0，7.1，7.2，7.3，7.4或7.5的pH下比在低于6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9或7.0的pH下具有降低的与其同源抗原的结合。在其它实施方式中，CAB-CAR在低于6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9或7.0的pH下比在高于7.0，7.1，7.2，7.3，7.4或7.5的pH下具有降低的与其同源抗原的结合。在一些说明性实施方式中，CAB-CAR在6.5至6.7的pH下与pH 7.4至7.6相比表现出增加的结合。在其它说明性实施方式中，CAB-CAR在pH 6.7下与pH7.4相比表现出增加的结合。在其它实施方式中，CAB-CAR在肿瘤pH中与血液pH相比表现出增加的结合。在一些实施方式中，CAB-CAR可包括抗原特异性靶向区，茎和细胞内活化结构域。在一些实施方式中，CAB-CAR还可包括共刺激结构域。在一些实施方式中，CAB-CAR可以结合肿瘤相关抗原。在一些实施方式中，CAB-CAR结合Axl多肽或其表位，或Ror2多肽或其表位。
在包括调节血液，组织或微环境的pH的方法中，微环境的pH可以从低于7.0的pH增加至高于7.0的pH。例如，pH可以从低于6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9或7.0的pH增加至高于7.0，7.1，7.2，7.3或7.4的pH。在一些实施方式中，CAB-CAR可以在增加的pH而不是在引入药理学试剂之前的微环境pH下与同源抗原结合。在某些实施方式中，pH可以从低于7.0升至pH7.1至8.0或pH 7.1至7.8或pH 7.2至7.8或pH 7.2至7.6或pH 7.3至7.6或pH值7.4至7.8或pH值7.4至7.6。pH的这种增加可以发生少于1，2，4，6，8，12或24小时或超过1，2，4，6，8，12或24小时，这取决于所使用药理学试剂的类型和剂量。在某些实施方式中，施用药理学试剂使得靶组织例如肿瘤中的pH保持高于7.0，7.1，7.2，7.3，7.4或7.5；或者在范围低端为7.0，7.1，7.2，7.3与范围高端为7.4，7.5，7.6，7.7或7.8之间，例如在至少靶组织(例如肿瘤)微环境的表面中，在靶组织(例如肿瘤)微环境的至少一部分中，且在说明性实施方式中是在整个靶组织(例如肿瘤)微环境中。微环境可以是体内微环境，例如肿瘤，组织，非肿瘤组织，正常组织或已经历pH瞬时变化的组织。例如，通常经历pH瞬时变化的组织包括厌氧条件下的肌肉组织或经历运动的肌肉组织或发炎的组织或经历炎症的组织。在包括靶哺乳动物细胞的一些实施方式中，靶哺乳动物细胞可以是肿瘤细胞或非肿瘤细胞或正常细胞。
在一些方面，提供了用于瞬时增加血管pH以降低微环境控制的CAB-CAR的亲和力的方法，其识别，能够结合，并且在一些实施方式中是结合Axl多肽或其表位，或Ror2多肽或表位。血液pH值的0.4U变化可以降低形成CAB-CAR的一部分的某些scFv对其同源抗原的亲和力大于10倍。在一些实施方式中，治疗性pH控制可通过各种药理学试剂的IV或口服施用途径实现。例如，在一些实施方式中，可以用碳酸氢盐或碳酸氢钠实现结合亲和力的失活。在其它实施方式中，可以使用三羟甲基氨基甲烷(也称为三乙醇胺，氨丁三醇和THAM)和/或CarbicarbTM(碳酸氢钠和碳酸钠的等摩尔高渗溶液)以足够量增加血液pH，以减轻靶内肿瘤外毒性。在其它实施方式中，小分子质子泵抑制剂可用于以足够量增加血液pH和/或组织pH以减轻靶内肿瘤外毒性。可用于包括调节pH的方法的质子泵抑制剂包括但不限于埃索美拉唑(Nexium)，埃索美拉唑和萘普生(Vimovo)，兰索拉唑(Prevacid)，奥美拉唑(Prilosec和Zegerid)和雷贝拉唑(Aciphex)。质子泵抑制剂的施用可以在较长时间段内有效地用于调节抗原结合结构域与其同源抗原的结合亲和力达数天，数周，数月或数年。在其它实施方式中，可以通过控制转运蛋白和泵的转录，翻译，膜表达和稳定性来改变血液pH和/或组织pH，从而调节抗原结合结构域对其同源抗原的亲和力。其改变的表达可以调节pH的这种转运蛋白和泵的实例包括但不限于质子泵，钠质子交换家族(NHE)，碳酸氢根转运蛋白家族(BCT)和单羧酸转运蛋白家族的成员。
在某些实施方式中，在输注表达条件活性生物学ASTR的患者CAR-T细胞之前或同时施用pH调节药理学试剂，例如碳酸氢盐，THAM或CaricarbTM(例如scFv或scFvFcs)。这种治疗将减轻与CAR-T细胞输注的暂时肺部截留相关的即时细胞毒性。因此，在某些方面，本文提供了减少对受试者的正常健康组织造成的细胞毒性的方法，其通过向受试者施用足够量以增加血液pH和/或组织pH和/或微环境pH的药理学试剂；并伴随或随后(例如1，2，4，6，8，12或24小时，或1，2，3，4或7天后)将表达CAB-CAR的T细胞或NK细胞引入受试者来进行。在某些实施方式中，在这种引入后的靶时间(例如1，2，4，6，8，12或24小时，或1，2，3，4或7天后)，药物制剂的施用是终止一段时间或无限期地，以便改变受试者的血液、组织或微环境的pH并调节表达CAB-CAR的T细胞的结合/活性。
如本领域技术人员将理解的，可以使用施用能够调节pH的药理学试剂(例如增加受试者的血液pH和/或组织pH和/或微环境pH)的各种有效施用方案。本文中，施用可以指向受试者施用药理学试剂，包括通过IV将药理学试剂注射到受试者中或者向受试者或服用药理学试剂的受试者提供口服剂量的药理学试剂。可以将药理学试剂施用于受试者或患者不同的时间长度，例如至少1，2，3，4，5或6天；1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或11周；3，4，5，6，7，8，9，10，12，15或18个月；或2，2.5，3，3.5，4，4.5或5年或无限期。在一些实施方式中，药理学试剂可以是碳酸氢盐，碳酸氢钠(NaHCO3)，或碳酸氢钠和碳酸钠的溶液，并且肠胃外或IV剂量可以是：0.2×受试者体重(kg)×受试者碱缺乏；需求HCO3(mEq)＝0.5×重量(kg)×[24-血清HCO3(mEq/L)]；或在4至8小时内静脉输注2至5mEq/kg。在一些实施方式中，取决于酸中毒的严重程度，可以使用碳酸氢盐，碳酸氢钠或碳酸氢钠溶液的标准给药方案。例如，在1L 5％葡萄糖水溶液中稀释的50至150mEq碳酸氢盐可以通过IV以1至1.5L/小时的速率施用。在另一个非限制性实例中，在1L 5％葡萄糖水溶液中稀释的90至180mEq碳酸氢盐可以通过IV以1至1.5L/小时的速率施用。在药理学试剂是碳酸氢盐或碳酸氢钠(NaHCO3)的一些实施方式中，肠内或口服剂量可以是例如将325至2000mg碳酸氢钠给予受试者1至4次/天。
在一些实施方式中，药理学试剂可以是三羟甲基氨基甲烷(也称为三乙醇胺，氨丁三醇和THAM)，并且肠胃外或IV剂量可以估计为：所需三乙醇胺溶液(0.3M)＝体重(kg)×碱基缺乏(mEq/升)×1.1。在一些实施方式中，通过Siggaard-Andersen诺模图测定，可以从mEq/L的细胞外液的缓冲碱缺乏估计T-羟甲基氨基甲烷的IV剂量。在一些实施方式中，初始剂量可以是通过缓慢IV输注注射的500ml(150mEq)的三羟甲基氨基甲烷，至多1000mL，其中最大剂量为500mg/kg(227mg/lb)达不少于一小时的时间段。
在一些实施方式中，药理学试剂可以是小分子质子泵抑制剂，并且可以施用延长的治疗长度。例如，小分子质子泵抑制剂可以施用至少1，2，3，4，5或6天；1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或11周；3，4，5，6，7，8，9，10，12，15或18个月；或2，2.5，3，3.5，4，4.5或5年或无限期。在一些实施方式中，质子泵抑制剂可以是埃索美拉唑(Nexium)，并且可以每天口服施用一次或两次20mg或40mg埃索美拉唑。在一些实施方式中，质子泵抑制剂可以是埃索美拉唑和萘普生(Vimovo)的组合，并且可以每天口服施用两次20mg埃索美拉唑和375或500mg萘普生。在一些实施方式中，质子泵抑制剂可以是兰索拉唑(Prevacid)，并且可以每天口服施用一次或两次15，30或60mg兰索拉唑。在一些实施方式中，兰索拉唑可以通过IV施用，每天一次在30分钟内注射30mg兰索拉唑以达7天。然后受试者可以改用口服兰索拉唑并继续治疗。在一些实施方式中，质子泵抑制剂可以是奥美拉唑(Prilosec和Zegerid)，并且可以每天口服施用一次或两次10，20或40mg奥美拉唑。在一些实施方式中，质子泵抑制剂可以是雷贝拉唑(Aciphex)，并且可以每天口服施用一次或两次20或60mg雷贝拉唑，或者可以每天口服施用一次100mg雷贝拉唑。在本文公开的任何实施方式中，药理学试剂可以彼此组合使用。
在本文公开的任何实施方式中，可以在施用药理学试剂之前、期间或之后测量受试者的血液、组织和/或微环境的pH。在一些实施方式中，向受试者施用或继续施用药理学试剂以增加或降低pH的决定可以基于受试者的血液、组织和/或微环境的pH测量。测量受试者血液的血液pH和/或碳酸氢盐水平的方法是本领域熟知的。在一些实施方式中，正电子发射断层扫描(PET)，磁共振波谱(MRS)，磁共振成像(MRI)和光学成像可用于测量微环境中的体内pH，例如在肿瘤中(关于测量肿瘤pH的细节参见：Zhang X，Lin Y，Gillies RJ.TumorpH and its measurement.J Nucl Med.2010Aug；51(8):1167-70)。
在另一方面，本文提供了用于减轻受试者的靶内肿瘤外毒性的方法，其包括以下：
a.将编码条件活性生物嵌合抗原受体(CAB-CAR)的多核苷酸引入受试者的T细胞或NK细胞中以产生能够表达CAB-CAR的T细胞和/或NK细胞，其中CAB-CAR能够结合Axl多肽或其表位，或Ror2多肽或其表位；
b.将能够表达CAB-CAR的T细胞和/或NK细胞引入受试者，其中T细胞和/或NK细胞在受试者中表达CAB-CAR；和
c.以足够量向受试者施用药理学试剂以增加血液pH和/或组织pH和/或微环境pH以调节CAB-CAR与具有增加pH的血液、组织和/或微环境中的其同源抗原的结合，从而减轻受试者的靶内肿瘤外毒性。
在引入步骤中，T细胞或NK细胞能够表达能够结合Axl多肽或其表位，或Ror2多肽或其表位的CAB-CAR，因为它被遗传修饰为含有编码CAB-CAR的核酸。该遗传修饰可以是通过转染或转导已经在T细胞或NK细胞内引入的载体上存在CAB-CAR编码序列。在说明性实施方式中，编码CAB-CAR的核酸整合到T细胞或NK细胞的基因组中。
设想本领域已知的用于将多核苷酸引入T细胞和/或NK细胞的各种方法可与本文提供的方法一起用于该方面，其包括使用诸如pH调节药理学试剂的试剂改变pH以影响CAB-CAR T细胞或NK细胞与细胞上的其同源抗原的结合(本文有时称为“pH转换方面”)。通常，载体，在说明性实施例中是表达载体用于递送多核苷酸。此类载体可包括本领域已知的用于将核酸递送至T细胞和/或NK细胞的各种载体。本发明的说明性方面利用逆转录病毒载体和逆转录病毒颗粒，并且在一些特别说明性的实施方式中是慢病毒载体，并且在说明性实施方式中是重组慢病毒颗粒。
其它合适的表达载体可用于本文提供的pH转换方面。此类表达载体包括但不限于病毒载体(例如基于痘苗病毒的病毒载体；脊髓灰质炎病毒；腺病毒(参见例如Li等人，Invest Opthalmol Vis Sci 35:25432549,1994；Borras等人，Gene Ther 6:515 524,1999；Li和Davidson，PNAS 92:7700 7704,1995；Sakamoto等人，H Gene Ther 5:10881097,1999；WO 94/12649，WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)；腺相关病毒(参见例如Ali等人，Hum Gene Ther 9:81 86,1998，Flannery等人，PNAS 94:6916 6921,1997；Bennett等人，Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863,1997；Jomary等人，Gene Ther 4:683 690,1997，Rolling等人，Hum Gene Ther 10:641648,1999；Ali等人，Hum Mol Genet 5:591 594,1996；WO 93/09239中的Srivastava，Samulski等人，J.Vir.(1989)63:3822-3828；Mendelson等人，Virol.(1988)166:154-165；和Flotte等人，PNAS(1993)90:10613-10617)；SV40；单纯疱疹病毒；或逆转录病毒载体(例如鼠白血病病毒，脾坏死病毒，以及衍生自逆转录病毒的载体，例如劳氏肉瘤病毒，哈维肉瘤病毒，禽白血病病毒，人免疫缺陷病毒，骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒，例如γ逆转录病毒；或人免疫缺陷病毒(参见例如Miyoshi等人，PNAS 94:10319 23,1997；Takahashi等人，J Virol 73:7812 7816,1999)等。
在一些实施方式中，使用含DNA的病毒颗粒代替重组逆转录病毒颗粒。此类病毒颗粒可以是腺病毒，腺相关病毒，疱疹病毒，巨细胞病毒，痘病毒，禽痘病毒，流感病毒，水疱性口炎病毒(VSV)或辛德毕斯病毒。技术人员将理解如何修改本文公开的方法以用于不同的病毒和逆转录病毒。在使用包含DNA基因组的病毒颗粒的情况下，技术人员将理解，功能单元可以包括在这样的基因组中以诱导病毒颗粒的全部或部分DNA基因组整合到用这种病毒转导的T细胞和/或NK细胞的基因组中。或者，可以将功能性DNA递送至在细胞中表达但未整合到T细胞和/或NK细胞的基因组中的T细胞和/或NK细胞。
在说明性实施方式中，在本公开的pH转换方面中使用的载体是重组逆转录病毒颗粒，并且在某些实施方式中是重组慢病毒颗粒。这种逆转录病毒颗粒通常包括位于病毒包膜内的衣壳内的逆转录病毒基因组。本公开在本文的各个部分中提供了重组逆转录病毒颗粒的各种实施方式，其公开了可以包含在重组逆转录病毒颗粒的表面上或内和/或基因组中的元件。任何这些重组逆转录病毒颗粒实施方式均可用于本文提供的pH转换方面。
在上文公开的任何实施方式中，CAB-CAR结合的同源抗原可以是Axl多肽或其表位，或Ror2多肽或其表位。在一些实施方式中，同源抗原可以是与Axl多肽或其表位或Ror2多肽或其表位的至少10、15、20个或所有氨基酸的区段具有至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的多肽。如本文所公开的，能够结合Axl多肽或其表位或Ror2多肽或其表位的CAB-CAR通常在6.7的pH下比在7.4的pH下具有更高的结合其同源抗原的结合亲和力。因此，本公开的这种抗ROR2和抗AXL CAB-CAR通常与其同源抗原结合，其在肿瘤微环境中比具有生理pH的正常组织具有更高的结合亲和力。
治疗方法
本公开提供了用于治疗包括本文提供的抗Axl或抗Ror2 CAB-CAR的病症的各种方法。在一些实施方式中，该方法利用以下事实：当存在于T淋巴细胞或NK细胞中并由其表达时，本公开的CAB-CAR可介导对靶细胞的细胞毒性。本公开的CAB-CAR在某些靶条件下与靶细胞上存在的抗原结合，从而通过T淋巴细胞或NK细胞遗传修饰为产生CAB-CAR来介导靶细胞的杀伤。CAB-CAR的ASTR通常与靶细胞表面上存在的抗原结合。
靶细胞包括但不限于癌细胞。因此，本公开提供了杀伤或抑制靶癌细胞生长的方法，该方法涉及使遗传修饰为产生受试CAR的细胞毒性免疫效应细胞(例如细胞毒性T细胞或NK细胞)接触，使得T淋巴细胞或NK细胞识别靶癌细胞表面上存在的抗原，并介导靶细胞的杀伤。这些方法的说明性方面提供了治疗癌症的方法。CAB-CAR不限于用于治疗癌症或靶肿瘤或癌细胞，而是可以适用于一种或多种适应症，包括治疗循环障碍，关节炎，多发性硬化，自身免疫性疾病，皮肤病，病毒性疾病和障碍以及用于各种诊断形式。
在某些方面，本公开提供了治疗患有癌症的受试者中的癌症的方法。因此，本公开提供了针对癌症的过继性细胞治疗的方法，尤其是表达Axl或Ror2的癌症，其使用本文提供的抗Axl和抗Ror2 CAB-CAR。因此，在一个方面，该方法包括以下步骤：A.将表达载体引入外周血细胞中，所述表达载体配置成使编码针对本文提供的Axl或Ror2的CAB-CAR的多核苷酸序列表达，所述外周血细胞从受试者获得以产生遗传工程化细胞毒性细胞(例如T细胞或NK细胞)；和B.将遗传工程化细胞毒性细胞施用于受试者。本文提供了用于处理T细胞以活化、转导和通常扩增此类细胞的详细方法，其提供了上述步骤A的说明性实施方式。
癌症通常分别表达Ror2或Ax1，并且在说明性实施方式中，癌症是这种癌症的细胞表达Ror2和/或Ax1的任何癌症，例如肾细胞癌。CAR可以是识别本文公开的Axl或Ror2的任何CAB-CAR，尤其是对表达这些抗原的癌细胞具有细胞毒性的那些。编码抗Axl CAB-CAR或抗Ror2 CAB-CAR的表达载体可通过用载体转导包括T细胞和/或NK细胞的外周血白细胞而引入外周血细胞。在某些说明性实施方式中，载体是重组病毒，例如重组逆转录病毒，在一些实施方式中是重组慢病毒。在一些实施方式中，癌症是表达Ror2的软组织肉瘤或间皮瘤，并且受试者的T细胞和/或NK细胞(例如软组织肉瘤患者或间皮瘤患者)用抗Ror2CAR转导，例如本文公开的抗Ror2 CAB-CAR。
用于治疗本文提供的病症的方法通常包括向受试者施用表达本文提供的抗Axl或抗Ror2 CAB-CAR的遗传修饰的T细胞或NK细胞。施用可以是例如静脉内施用，皮下施用或肿瘤内施用。在静脉内施用遗传修饰的T细胞和/或NK细胞的方法中，通常为在合适的缓冲液中递送1×104个细胞/kg至1×108个细胞/kg细胞以用于肠胃外施用。在肿瘤内施用经遗传修饰的T细胞和/或NK细胞的方法中，通常为在等渗溶液中递送1×106个细胞和5×108个细胞。
在一些实施方式中，在施用白细胞介素或其修饰形式之前、伴随间和/或之后施用。例如，本文提供的一些实施方式包括IL-2的共同施用，或已持续释放和/或结合某些IL-2受体的IL-2的修饰形式，所述IL-2受体偏向于T细胞的活化增殖和/或杀伤活性。例如，在某些实施方式中，修饰的IL-2是聚乙二醇化的IL-2，并且可以是NKTR-214(NektarTherapeutics，San Francisco，CA)。在其它实施方式中，修饰的IL-2是ALKS 4230(Alkermes，Inc.)。
可通过本文公开的方法治疗的癌包括但不限于食道癌，肝细胞癌，基底细胞癌(皮肤癌形式)，鳞状细胞癌(各种组织)，膀胱癌包括移行细胞癌(膀胱恶性肿瘤)，支气管肺癌，结肠癌，结直肠癌，胃癌，肺癌，包括小细胞癌和肺非小细胞癌，肾上腺皮质癌，甲状腺癌，胰腺癌癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，囊腺癌，髓样癌，肾细胞癌，原位导管癌或胆管癌，绒毛膜癌，精原细胞瘤，胚胎癌，威尔姆肿瘤，宫颈癌，子宫癌，睾丸癌，成骨细胞癌癌，上皮癌和鼻咽癌。
可通过本文公开的方法适于治疗的肉瘤包括但不限于纤维肉瘤，粘膜肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，脊索瘤，成骨肉瘤，骨肉瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管内皮瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤因氏肉瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤和其它软组织肉瘤。
可通过本文公开的方法适于治疗的其它实体瘤包括但不限于神经胶质瘤，星形细胞瘤，髓母细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，成血管细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，脑膜瘤，黑色素瘤，神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
可通过本文公开的方法适于治疗的白血病包括但不限于a)慢性骨髓增生综合征(多能造血干细胞的肿瘤性疾病)；b)急性髓性白血病(多能造血干细胞或限制谱系潜能的造血细胞的肿瘤转化；c)慢性淋巴细胞白血病(CLL；免疫不成熟和功能不全的小淋巴细胞的克隆增殖)，包括B细胞CLL，T细胞CLL幼淋巴细胞白血病和毛细胞白血病；d)急性淋巴细胞白血病(以淋巴母细胞的累积为特征)。可以使用受试者方法治疗的淋巴瘤包括但不限于B细胞淋巴瘤(例如伯基特氏淋巴瘤)；霍奇金淋巴瘤；非霍奇金淋巴瘤等。
可根据本文公开的方法适于治疗的其它癌症包括非典型脑膜瘤(脑)，胰岛细胞癌(胰腺)，髓样癌(甲状腺)，肠系膜瘤(肠)，肝细胞癌(肝)，肝母细胞瘤(肝)，透明细胞癌(肾)和神经纤维瘤纵隔。
联合治疗
在一些实施方式中，CAR细胞作为标准癌症治疗的辅助治疗施用。标准癌症治疗包括手术(例如手术切除癌组织)，放射治疗，骨髓移植，化学治疗，抗体治疗，生物反应调节剂治疗和前述的某些组合。
放射治疗包括但不限于从外部施加的源(例如束)或通过植入小放射源递送的x射线或γ射线。
用于癌症治疗的合适抗体包括但不限于裸抗体，例如曲妥珠单抗(赫赛汀)，贝伐单抗(AvastinTM)，西妥昔单抗(ErbituxTM)，帕尼单抗(VectibixTM)，伊匹单抗(YervoyTM)，利妥昔单抗(Rituxan)，阿仑单抗(LemtradaTM)，奥法木单抗(ArzerraTM)，奥戈伏单抗(OvaRexTM)，兰博珠单抗(MK-3475)，帕妥珠单抗(PerjetaTM)，雷珠单抗(LucentisTM)等，以及缀合抗体，例如吉妥珠单抗(MylortargTM)，本妥昔单抗90Y标记的替伊莫单抗(ZevalinTM)，131I标记的托西莫单抗(AdcetrisTM)，(BexxarTM)等。用于癌症治疗的合适抗体包括但不限于针对肿瘤相关抗原产生的抗体。此类抗原包括但不限于CD20，CD30，CD33，CD52，EpCAM，CEA，gpA33，粘蛋白，TAG-72，CAIX，PSMA，叶酸结合蛋白，神经节苷脂(例如GD2，GD3，GM2等)，Ley，VEGF，VEGFR，整合素α-V-β-3，整合素α-5-β-1，EGFR，ERBB2，ERBB3，MET，IGF1R，EPHA3，TRAILR1，TRAILR2，RANKL，PAP，肌腱蛋白等。
适合与本公开的方法结合使用的生物反应调节剂包括但不限于(1)酪氨酸激酶(RTK)活性的抑制剂；(2)丝氨酸/苏氨酸激酶活性抑制剂；(3)肿瘤相关抗原拮抗剂，例如与肿瘤抗原特异性结合的抗体；(4)凋亡受体激动剂；(5)白细胞介素-2；(6)干扰素-α；(7)干扰素-γ；(8)集落刺激因子；(9)血管生成抑制剂；和(10)肿瘤坏死因子拮抗剂。
化学治疗剂是非肽(即非蛋白质)化合物，其减少癌细胞的增殖，并且包括细胞毒性剂和细胞抑制剂。化学治疗剂的非限制性实例包括烷化剂，亚硝基脲，抗代谢物，抗肿瘤抗生素，植物(长春花)生物碱和类固醇激素。
用于减少细胞增殖的药剂是本领域已知的并且被广泛使用。这些试剂包括烷化剂，例如氮芥，亚硝基脲，乙烯亚胺衍生物，烷基磺酸盐和三氮烯，包括但不限于氮芥，环磷酰胺(CytoxanTM)，美法仑(L-溶血素)，卡莫司汀(BCNU)，洛莫司汀(CCNU)，司莫司汀(甲基-CCNU)，链脲霉素，氯脲霉素，尿嘧啶芥子气，氯甲炔，异环磷酰胺，苯丁酸氮芥，哌泊溴烷，三亚乙基三聚氰胺，三乙烯基硫代膦胺，白消安，达卡巴嗪和替莫唑胺。
抗代谢剂包括叶酸类似物，嘧啶类似物，嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂，包括但不限于阿糖胞苷(CYTOSAR-U)，胞嘧啶阿拉伯糖苷，氟尿嘧啶(5-FU)，氟尿苷(FudR)，6-硫鸟嘌呤，6-巯基嘌呤(6-MP)，喷司他丁，5-氟尿嘧啶(5-FU)，甲氨蝶呤，10-炔丙基-5,8-二氮杂萘(PDDF，CB37l 7)，5,8-二肼基三氢叶酸(DDATHF)，甲酰四氢叶酸，氟达拉滨磷酸盐，喷司他丁和吉西他滨。
合适的天然产物及其衍生物(例如长春花生物碱，抗肿瘤抗生素，酶，淋巴因子和表鬼臼毒素)包括但不限于Ara-C，紫杉醇多西紫杉醇脱氧同型霉素，丝裂霉素-C，L-天冬酰胺酶，硫唑嘌呤；布喹那；生物碱，例如长春新碱，长春碱，长春瑞滨，长春花碱等；鬼臼毒素，例如，依托泊苷，替尼泊苷等；抗生素，例如蒽环霉素，盐酸柔红霉素(道诺霉素，红霉素，柔红霉素)，伊达比星，多柔比星，表柔比星和吗啉代衍生物等；苯氧嗪双环肽，例如放线菌素D；碱性糖肽，例如博莱霉素；蒽醌糖苷，例如普卡霉素(光辉霉素)；蒽二酮类，例如米托蒽醌；阿际吡咯烷吲哚二酮，例如丝裂霉素；大环免疫抑制剂，例如环孢菌素，FK-506(他克莫司，普乐可复)，雷帕霉素等。
其它抗增殖细胞毒性剂是长春瑞滨，CPT-11，阿那曲唑，来曲唑，卡培他滨，来洛昔芬，环磷酰胺，异环磷酰胺和屈洛昔芬。
影响具有抗增殖活性的试剂的微管也适合使用，包括但不限于别秋水仙碱(NSC406042)，软海绵素B(NSC 609395)，秋水仙碱(NSC 757)，秋水仙碱衍生物(例如NSC33410)，海兔毒素10(NSC 376128)，美登素(NSC 153858)，根瘤菌素(NSC 332598)，紫杉醇衍生物，多西紫杉醇硫代秋水仙碱(NSC 361792)，三苯甲基半胱氨酸，长春碱硫酸盐，长春新碱硫酸盐，天然和合成的埃博霉素，包括但不限于埃博霉素A，埃博霉素B，圆皮海绵内酯；雌莫司汀，诺考达唑等。
适合使用的激素调节剂和类固醇(包括合成类似物)包括但不限于肾上腺皮质激素，例如泼尼松，地塞米松等；雌激素和孕激素，例如己酸羟孕酮，醋酸甲羟孕酮，醋酸甲地孕酮，雌二醇，克罗米芬，他莫昔芬等；和肾上腺皮质抑制剂，例如鲁米特；l 7a-乙炔雌二醇；己烯雌酚，睾酮，氟睾酮，丙酸甾醇酮，睾酮，甲基强的松龙，甲基睾酮，泼尼松龙，曲安奈德，氯代三苯乙烯，羟孕酮，氨基乙酰亚胺，雌莫司汀，醋酸甲羟孕酮，亮丙瑞林，氟他胺(Drogenil)，托瑞米芬(Fareston)和雌激素刺激增殖和分化，因此与雌激素受体结合的化合物用于阻断这种活性。皮质类固醇可抑制T细胞增殖。
其它化学治疗剂包括金属络合物，例如顺铂(cis-DDP)，卡铂等；脲，例如羟基脲；和肼，例如N-二甲基肼；鬼臼毒素；拓扑异构酶抑制剂；甲基苄肼；米托蒽醌；亚叶酸；替加氟等。其它感兴趣的抗增殖剂包括免疫抑制剂，例如霉酚酸，沙利度胺，脱氧精胍菌素，氮杂孢菌素，来氟米特，咪唑立宾，氮杂螺垸(SKF 105685)；(ZD1839，4-(3-氯-4-氟苯基氨基)-7-甲氧基-6-(3-(4-吗啉基)丙氧基)喹唑啉)等。
“紫杉烷”包括紫杉醇，以及任何活性紫杉烷衍生物或前药。“紫杉醇”(在此应理解为包括类似物，制剂和衍生物，例如多西紫杉醇，TAXOLTM，TAXOTERETM(多西紫杉醇的制剂)，紫杉醇的10-去乙酰基类似物和紫杉醇的3'N-去苯甲酰基-3'N-丁氧基羰基类似物)可以利用本领域技术人员已知的技术容易地制备(也参见WO 94/07882，WO 94/07881，WO 94/07880，WO 94/07876，WO 93/23555，WO 93/10076；美国专利号5,294,637；5,283,253；5,279,949；5,274,137；5,202,448；5,200,534；5,229,529；和EP 590,267)，或从各种商业来源获得，包括例如Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo(来自短叶红豆杉的T7402；或来自南方红豆杉的T-1912)。
紫杉醇应理解为不仅指泛紫杉醇的常见化学形式，还指类似物和衍生物(例如如上所述的TaxotereTM多西紫杉醇)和紫杉醇缀合物(例如紫杉醇-PEG，紫杉醇-葡聚糖或紫杉醇-木糖)。
术语“紫杉烷”还包括多种已知衍生物，包括亲水衍生物和疏水衍生物。紫杉烷衍生物包括但不限于国际专利申请号WO 99/18113中描述的半乳糖和甘露糖衍生物；WO 99/14209中描述的哌嗪和其它衍生物；WO 99/09021，WO 98/22451和美国专利号5,869,680中描述的紫杉烷衍生物；WO 98/28288中描述的6-硫代衍生物；美国专利号5,821,263中描述的亚磺酰胺衍生物；和美国专利号5,415,869中描述的紫杉醇衍生物。它还包括紫杉醇的前药，包括但不限于WO 98/58927；WO 98/13059；和美国专利号5,824,701中描述的那些。
适合治疗的受试者
多种受试者适合用治疗癌症的方法治疗。合适的受试者包括任何个体，例如患有癌症，已诊断患有癌症，有患癌症风险，患有癌症并且有复发癌症风险，已用癌症药物治疗并且没有对这种治疗有反应，或者已用癌症药物治疗但在对这种治疗的初始反应后复发的人或非人动物。
适合用免疫调节方法治疗的受试者包括患有自身免疫疾病的个体；和作为器官或组织移植受者的个体等；免疫力低下的个体；和感染病原体的个体。
示例性实施方式
本公开提供了嵌合抗原受体(CAR)，和包含编码CAR的核苷酸序列的核酸，所述CAR与Axl和/或Ror2结合，以及与Ax1和Ror2结合的条件活性CAR。本公开提供了经遗传修饰以产生CAR的细胞，以及制备此类细胞的方法。本公开的CAR可以用于也提供的各种方法，包括用于进行过继细胞治疗的方法，例如CAR治疗，例如针对癌症的CAR治疗，例如肾细胞癌。
在以下实施方式中提供了作为本公开的方面的一些非限制性示例性实施方式：
实施方式1.用于结合Axl或Ror2的嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
a)条件活性抗原特异性靶向区(ASTR)，其在pH 6.7下与pH 7.4相比展现出与Axl或Ror2的结合增加；
b)跨膜结构域；和
c)细胞内活化结构域。
实施方式A1.用于结合Axl或Ror2的嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
a)条件活性抗原特异性靶向区域(ASTR)，，其在肿瘤微环境和/或体外肿瘤替代测定条件中与正常生理环境相比表现出活性的增加(即更大)，其中ASTR与Axl或Ror2结合；
b)跨膜结构域；和
c)细胞内活化结构域。
实施方式A2.除非另有明确说明，否则实施方式1或A1中任一项或根据本文提供的任何其它实施方式的CAR，其中ASTR选自抗体，抗原，配体，配体的受体结合结构域，受体，受体的配体结合结构域和亲和体。
实施方式A3.除非另有明确说明，否则实施方式A2或根据本文提供的任何其它实施方式的CAR，其中ASTR是抗体片段。
实施方式A4。除非另有明确说明，否则实施方式1或A1至A3中任一项或根据本文提供的任何其它实施方式的CAR，其中条件活性ASTR在肿瘤微环境和/或体外肿瘤替代测定条件中相对于相应的生理条件表现出与抗原结合的增加，其中肿瘤微环境和/或体外肿瘤替代测定条件选自缺氧，酸性pH，较高浓度的乳酸，较高浓度的透明质酸，较高浓度的白蛋白，较高浓度的腺苷，较高浓度的R-2-羟基戊二酸，和较低的营养利用度。
实施方式A5.除非另有明确说明，否则实施方式A1至A4中任一项或根据本文提供的任何其它实施方式的CAR，其中条件活性ASTR在pH 6.7下与pH 7.4相比表现出对抗原结合的增加(或更高)。
实施方式A6.除非另有明确说明，否则实施方式1或A1至A5中任一项或根据本文提供的任何其它实施方式的CAR，其中细胞内活化结构域是人CD3Z活化结构域，人CD3D活化结构域，人CD3E活化结构域，人CD3G活化结构域，人CD28活化结构域，人CD79A活化结构域，人DAP10活化结构域，人DAP12活化结构域，人FCER1G活化结构域，人CD137活化结构域或人ZAP70活化结构域。
实施方式A7.除非另有明确说明，否则实施方式1或A1至A6中任一项或根据本文提供的任何其它实施方式的CAR，其还包含与细胞内活化结构域具有不同氨基酸序列的第一，第二，第三或第四共刺激结构域。
实施方式A8.除非另有明确说明，否则实施方式A7或根据本文提供的任何其它实施方式的CAR，其中第一，第二，第三和/或第四共刺激结构域包含4-lBB(CD137)，B7-H3，CD2，CD7，CD27，CD28，CD28缺失用于Lck结合(ICΔ)，ICOS，OX40，BTLA，CD27，CD30，CD40，GITR，HVEM，LFA-1，LIGHT，NKG2C，PD-1，TILR2，TILR4，TILR7，TILR9，Fc受体γ链，Fc受体ε链或与CD83特异性结合的配体的共刺激结构域。
实施方式A9.除非另有明确说明，否则实施方式A7或根据本文提供的任何其它实施方式的CAR，其中第一共刺激结构域保留共刺激活性并且是人CD137共刺激结构域，人CD28共刺激结构域，人ICA共刺激结构域，人ICOS共刺激结构域，人OX40共刺激结构域，人BTLA共刺激结构域，人CD27共刺激结构域，人CD30共刺激结构域，人GITR共刺激结构域，或人HVEM共刺激结构域。
实施方式B1.一种非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒，其包含逆转录病毒基因组，所述逆转录病毒基因组包含与在T细胞和/或NK细胞中有活性的启动子可操作地连接的一个或多个核酸序列，其中一个或多个核酸序列编码除非另有明确说明，否则实施方式1或A1至A9中任一项或本文提供的任何其它实施方式的CAR。
实施方式B2.一种分离的重组T细胞或NK细胞，其用实施方式B1的非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒遗传修饰。
实施方式B3.一种分离的重组T细胞，其用实施方式B1的非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒遗传修饰。
实施方式B4.包含实施方式B1的非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒和T细胞和/或NK细胞的反应混合物。
实施方式B5.包含实施方式B1的非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒和T细胞的反应混合物。
实施方式C1.一种分离的(例如重组或遗传修饰的)T细胞或NK细胞，其包含基因组，所述基因组含有与在T细胞和/或NK细胞中有活性的启动子可操作地连接一个或多个核酸序列(例如两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个，或六个或更多个核酸序列)，其中一个或多个(或两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个，或六个或更多个)核酸序列编码除非另有明确说明，否则本文提供的实施方式1或A1至A8中任一项或任何其它实施方式的CAR。
实施方式C2.实施方式C1的分离的(例如重组或遗传修饰的)T细胞或NK细胞，其中分离的细胞是T细胞。
实施方式C3.一种分离的(例如重组或遗传修饰的)T细胞或NK细胞(在某些说明性实施方式中，T细胞)，其包含与在T细胞和/或NK细胞中有活性的启动子可操作地连接的一个或多个核酸序列，其中一个或多个更多的核酸序列编码用于结合Axl或Ror2的嵌合抗原受体(CAR)，包括：
a)条件活性抗原特异性靶向区(ASTR)，在pH 6.7下与pH 7.4相比与Axl或Ror2的结合增加；
b)跨膜结构域；和
c)细胞内活化结构域。
实施方式D1.一种使T细胞和/或NK细胞与靶哺乳动物细胞结合的方法，其包括在pH小于7.4的微环境中使靶哺乳动物细胞与T细胞和/或NK细胞接触(例如小于5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8或6.9，或在5.8-7.0的范围内，在说明性实施方式中是在6.0-6.8的范围内，在6.1至6.9的范围内，在6.2至6.8的范围内，或在范围低端为6.0，6.1，6.2，6.3，6.4和6.5与范围高端为6.6，6.7，6.8和6.9之间)，其中T细胞和/或NK细胞表达除非另有明确说明，否则实施方式1或A1至A8中任一项或本文提供的任何其它实施方式的CAR，并且靶哺乳动物细胞表达Axl和/或Ror2。
实施方式D2.一种使T细胞或NK细胞与靶哺乳动物细胞结合的方法，其包括在pH小于7.4的微环境中使靶哺乳动物细胞与T细胞和/或NK细胞接触(例如小于5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8或6.9，或在5.8-7.0的范围内，在说明性实施方式中是在6.0-6.8的范围内，在6.2至6.8的范围内，或在范围低端为6.0，6.1，6.2，6.3，6.4和6.5与范围高端为6.6，6.7，6.8和6.9之间)，其中靶哺乳动物细胞表达Axl或Ror2，并且其中T细胞或NK细胞分别表达用于结合Axl或Ror2的嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR包含：
a)条件活性抗原特异性靶向区(ASTR)，在pH 6.7下与pH 7.4相比与Axl或Ror2的结合增加；
b)跨膜结构域；和
c)细胞内活化结构域。
实施方式D3.实施方式D1至D3中任一项的方法，其中该结合活化T细胞和/或NK细胞。
实施方式D4.一种活化T细胞或NK细胞的方法，包括在pH小于7.4的微环境中使靶哺乳动物细胞与T细胞和/或NK细胞接触(例如小于5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8或6.9，或在5.8-7.0的范围内，在说明性实施方式中是在6.0-6.8的范围内，在6.2至6.8的范围内，或在范围低端为6.0，6.1，6.2，6.3，6.4和6.5与范围高端为6.6，6.7，6.8和6.9之间)，其中靶哺乳动物细胞表达Axl或Ror2，并且其中T细胞或NK细胞分别表达用于结合Axl或Ror2的嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR包含：
a)条件活性抗原特异性靶向区(ASTR)，在pH 6.7下与pH 7.4相比与Axl或Ror2的结合增加；
b)跨膜结构域；和
c)细胞内活化结构域。
实施方式D5.实施方式D5的方法，其中CAR是在另一个实施方式中提供的任何CAR。在非限制性说明性实例中是实施方式1或A1至A8。
实施方式D6.实施方式D5的方法，其中CAR是实施方式1或A1至A8中任一项提供的CAR。
实施方式D7.实施方式D3至D6中任一项的方法，其中活化包括增加细胞因子的表达和/或产生和/或分泌。
实施方式D8.实施方式D3至D7中任一项的方法，其中在活化后，T细胞和/或NK细胞增加IL-2或IFN-γ的表达。
实施方式D9.实施方式D8的方法，其中与接触前T细胞或NK细胞产生的IL-2或IFN-γ的量相比，该IL-2或IFN-γ的表达增加至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少40％，至少50％，至少75％，至少2倍，至少2.5倍，至少5倍，至少10倍或超过10倍。
实施方式D10.实施方式D8的方法，其中与接触前T细胞或NK细胞分泌的IL-2或IFN-γ的量相比，该IL-2或IFN-γ的表达增加至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少40％，至少50％，至少75％，至少2倍，至少2.5倍，至少5倍，至少10倍或超过10倍。
实施方式D11.实施方式D3至D7中任一项的方法，其中在活化后，与接触前T细胞或NK细胞的细胞毒活性相比，T细胞或NK细胞的细胞毒活性增加至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少40％，至少50％，至少75％，至少2倍，至少2.5倍，至少5倍，至少10倍或超过10倍。
实施方式D12.实施方式D1至D11中任一项的方法，其中在活化T细胞或NK细胞后裂解靶哺乳动物细胞。
实施方式D13.实施方式D1至D12中任一项的方法，其还包括在接触之前，用实施方式B1或B2中任一项的非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒转导T细胞或NK细胞来遗传修饰T细胞或NK细胞以表达CAR。
实施方式D14.实施方式D13的方法，其中转导是离体进行的。
实施方式D15.实施方式D1至D14中任一项的方法，其还包括将微环境的pH增加至达到或高于7.0(例如高于7.1，7.2或7.3)的pH，从而降低T细胞或NK细胞的活化。
实施方式D16.实施方式D1至D14中任一项的方法，还包括将微环境的pH增加至达到或高于7.0(例如高于7.1，7.2或7.3)的pH，从而使T细胞或NK细胞失活。
实施方式D17.实施方式D1至D16中任一项的方法，其中微环境是肿瘤。
实施方式D18.权利要求D17的方法，其中肿瘤在人受试者中。
实施方式D19.实施方式D1至D16中任一项的方法，其中微环境是体外或离体的。
实施方式E1.一种遗传修饰淋巴细胞的方法，其包括使T细胞和/或NK细胞与非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒接触，所述重组逆转录病毒颗粒在其基因组中包含多核苷酸，所述多核苷酸包含与在T细胞和/或NK细胞中有活性的启动子可操作地连接的一个或多个核酸序列(例如两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个，或六个或更多个核酸序列)，其中一个或多个(或两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个，或六个或更多个核酸序列编码除非另有明确说明，否则实施方式1或A1至A8中任一项或本文提供的任何其它实施方式的嵌合抗原受体，其中所述接触促进通过非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒转导T细胞/或NK细胞，从而产生遗传修饰的T细胞和/或NK细胞。
实施方式F1.一种用于遗传修饰淋巴细胞的方法的非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒，其中非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒在其基因组中包含多核苷酸，所述多核苷酸包含与在T细胞和/或NK细胞中有活性的启动子可操作地连接的一个或多个核酸序列(例如两个或多个，三个或更多，四个或多于，五个或更多个，或六个或更多个核酸序列)，其中一个或多个(或两个或更多，三个或更多，四个或更多，五个或更多个，或六个或更多个核酸序列编码除非另有明确说明，否则实施方式1或A1至A8中任一项或本文提供的任何其它实施方式的嵌合抗原受体，其中该方法包括使T细胞和/或NK细胞接触，并且所述接触促进通过非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒转导T细胞和/或NK细胞，从而产生遗传修饰的T细胞和/或NK细胞。
实施方式G1.一种用于遗传修饰T细胞和/或NK细胞以治疗肿瘤生长的方法的非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒，其中该方法包括使T细胞和/或NK细胞与非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒接触，所述非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒在其基因组中包含多核苷酸，所述多核苷酸包含与在T细胞和/或NK细胞中有活性的启动子可操作地连接的一个或多个核酸序列(例如两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个，或六个或更多个核酸序列)，其中一个或多个(或两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个，或六个或更多个)核酸序列编码除非另有明确说明，否则实施方式1或A1至A8中任一项或本文提供的任何其它实施方式的嵌合抗原受体，其中所述接触促进通过非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒转导T细胞和/或NK细胞，从而产生遗传修饰的T细胞和/或NK细胞。
实施方式H1.非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒在制备用于遗传修饰T细胞和/或NK细胞的试剂盒中的用途，其中试剂盒的使用包括使T细胞和/或NK细胞与非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒接触，所述非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒在其基因组中包含多核苷酸，所述多核苷酸包含与在T细胞和/或NK细胞中有活性的启动子可操作地连接的一个或多个核酸序列(例如两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个，或六个或更多个核酸序列)，其中一个或多个(或两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个，或六个或更多个)核酸序列编码除非另有明确说明，否则实施方式1或A1至A8中任一项或本文提供的任何其它实施方式的嵌合抗原受体，其中所述接触促进通过非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒转导T细胞和/或NK细胞，从而产生遗传修饰的T细胞和/或NK细胞。
实施方式I1.一种含有非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒的商业容器及其使用说明书，其中非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒在其基因组中包含多核苷酸，所述多核苷酸包含与在T细胞和/或NK细胞中有活性的启动子可操作地连接的一个或多个核酸序列(例如两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个，或六个或更多个核酸序列)，其中一个或多个(或两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个，或六个或更多个)核酸序列编码除非另有明确说明，否则实施方式1或A1至A8中任一项或本文提供的任何其它实施方式的嵌合抗原受体。
实施方式J1.包含含有非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒的容器的试剂盒及其使用说明书，其中说明书指导了使T细胞和/或NK细胞与靶哺乳动物细胞结合的方法，该方法包括：
a)用非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒转导T细胞和/或NK细胞，所述非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒在其基因组中包含多核苷酸，所述多核苷酸包含与在T细胞和/或NK细胞中有活性的启动子可操作地连接的一个或多个核酸序列(例如两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个，或六个或更多个核酸序列)，其中一个或多个(或两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个，或六个或更多个)核酸序列编码除非另有明确说明，否则实施方式1或A1至A8中任一项或本文提供的任何其它实施方式的CAR；和
b)在pH小于7.4的微环境中使靶哺乳动物细胞与转导的T细胞和/或NK细胞接触(例如小于5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8或6.9，或在5.8-7.0的范围内，常见的是在6.0-6.8的范围内，在6.2至6.8的范围内，或在范围低端为6.0，6.1，6.2，6.3，6.4和6.5与范围高端为6.6，6.7，6.8和6.9之间)，其中T细胞和/或NK细胞表达实施方式1或A1至A8中任一项的CAR，并且靶哺乳动物细胞表达Axl和/或Ror2。
实施方式K1.一种用于活化T细胞和/或NK细胞的方法，其包括在pH小于7.4的微环境中使靶哺乳动物细胞与转导的T细胞和/或NK细胞接触(例如小于5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8或6.9，或在5.8-7.0的范围内，常见的是在6.0-6.8的范围内，在6.2至6.8的范围内，或在范围低端为6.0，6.1，6.2，6.3，6.4和6.5与范围高端为6.6，6.7，6.8和6.9之间)，其中T细胞和/或NK细胞表达除非另有明确说明，否则本文提供的实施方式1或A1至A8中任一项或本文提供的任何其它实施方式的嵌合抗原受体，并且靶哺乳动物细胞表达Axl和/或Ror2。
实施方式K2.实施方式K1的方法，其还包括在接触之前，用实施方式B1或B2中任一项的非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒转导T细胞和/或NK细胞。
实施方式K3.实施方式K1的方法，其中在活化后，T细胞和/或NK细胞诱导细胞因子的表达和/或产生和/或分泌。
实施方式K4.实施方式K3的方法，其中细胞因子选自由IL-2或IFN-γ组成的组。
实施方式L1.一种诱导T细胞和/或NK细胞中细胞因子的表达和/或产生和/或诱导T细胞和/或NK细胞分泌细胞因子的方法，其包括在pH小于7.4的微环境中使靶哺乳动物细胞与转导的T细胞和/或NK细胞接触(例如小于5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8或6.9，或在5.8-7.0的范围内，常见的是在6.0-6.8的范围内，在6.2至6.8的范围内，或在范围低端为6.0，6.1，6.2，6.3，6.4和6.5与范围高端为6.6，6.7，6.8和6.9之间)，其中T细胞和/或NK细胞表达除非另有明确说明，否则本文提供的实施方式1或A1至A8中任一项或本文提供的任何其它实施方式的嵌合抗原受体，并且靶哺乳动物细胞表达Axl和/或Ror2。
实施方式L2.实施方式L1的方法，其还包括在接触之前，用实施方式B1或B2中任一项的非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒转导T细胞和/或NK细胞。
实施方式M1.一种分离的核酸，其编码用于结合Axl或Ror2的除非另有明确说明，否则根据实施方式1或A1至A8中任一项或本文提供的任何其它实施方式的嵌合抗原受体。
实施方式M2.实施方式M1的分离的核酸，其中核酸还包含在T细胞和/或NK细胞中有活性的启动子，并且其中编码CAR的核酸序列与启动子可操作地连接。
实施方式M3.实施方式M2的分离的核酸，其中分离的核酸序列进一步编码识别结构域。
实施方式M4.实施方式M3的分离的核酸，其中编码识别结构域的核酸通过核糖体跳跃序列与编码CAR的核酸分离。
实施方式M5.实施方式M4的分离的核酸，其中核糖体跳跃序列是2A-1。
实施方式M6.一种非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒，其包含实施方式M1至M5的任何核酸。
实施方式M7.实施方式M6的非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒，其中非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒是慢病毒颗粒。
实施方式N1.一种表达载体，其包含编码除非另有明确说明，否则根据实施方式1或A1至A8中任一项或本文提供的任何其它实施方式的嵌合抗原受体的核酸，其可操作地连接于启动子。
实施方式O1.用实施方式N1的任一种表达载体感染的哺乳动物细胞。
实施方式P1.一种哺乳动物细胞，其表达除非另有明确说明，否则实施方式1或A1至A8或本文提供的任何其它实施方式的任何嵌合抗原受体。
实施方式Q1.一种制备包含用于条件结合Axl或Ror2的嵌合抗原受体(CAR)的条件活化细胞的方法，其中该方法包括用表达载体遗传修饰哺乳动物细胞，所述表达载体包含与编码CAR的核苷酸序列可操作地连接的启动子，其中CAR包括：
a)条件活性抗原特异性靶向区域(ASTR)，其在肿瘤环境和/或体外肿瘤替代测定条件下与正常生理环境相比表现出活性增加，其中ASTR结合Axl或Ror2；
b)跨膜结构域；和
c)细胞内活化结构域。
实施方式R1.一种用于治疗受试者癌症的方法，其包括以下步骤：
a)将包含编码除非另有明确说明，否则实施方式1或A1至A8中任一项或本文提供的任何其它实施方式的任何CAR的核酸的表达载体引入从受试者获得的细胞毒性细胞中以产生经遗传修饰的细胞毒性细胞；和
b)将遗传修饰的细胞毒性细胞施用于受试者。
实施方式S1.一种制备包含用于条件结合Axl或Ror2的嵌合抗原受体(CAR)条件活化T细胞和/或NK细胞的离体方法，其中该方法包括：
a)富集外周血单核细胞(PBMC)以从分离血液分离包含T细胞和/或NK细胞的PBMC；
b)在有效条件下活化富集的PBMC的T细胞和/或NK细胞；
c)在有效条件下用非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒转导活化的T细胞和/或NK细胞，从而产生经遗传修饰的T细胞和/或NK细胞，其中非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒各自包含含有与在T细胞和/或NK细胞中有活性的启动子可操作地连接的一个或多个核酸序列的逆转录病毒基因组，其中一个或多个核酸序列的第一核酸序列编码除非另有明确说明，否则实施方式1或A1至A8中任一项或本文提供的任何其它实施方式的CAR；和
d)扩增经遗传修饰的T细胞和/或NK细胞，从而制备条件活化的T细胞和/或NK细胞。
实施方式T1.通过实施方式D3，E1，K2，Q1，R1或S1中任一项的方法产生的经修饰的T细胞。
实施方式U1.通过权利要求实施方式D3，E1，K2，Q1，R1或S1中任一项的方法产生的经修饰的NK细胞。
在本文包括嵌合抗原受体(CAR)的任何实施方式中，抗原特异性靶向区(ASTR)可选自抗体，抗原，配体，配体的受体结合结构域，受体，受体的配体结合结构域和亲和体。在本文包括CAR的任何实施方式中，ASTR可以是选自全长抗体，单链抗体，Fab片段，Fab'片段，(Fab')2片段，Fv片段和二价单链抗体或双抗体的抗体。在本文包括CAR的任何实施方式中，ASTR可包括来自抗体的重链和轻链。在本文包括具有ASTR的CAR的任何实施方式中，所述ASTR包含抗体，抗体可以是具有重链和轻链的单链可变片段。在本文包括具有ASTR的CAR的任何实施方式中，所述ASTR包含来自抗体的重链和轻链，重链和轻链可以通过接头分开，并且接头可以长度的范围低端为3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸，以及长度的范围高端为20，25，30，40，50，60，70，80，90，100，125，150，175或200个氨基酸之间。在一些实施方式中，ASTR可以是包含重链和轻链的单链可变片段，其中重链和轻链通过接头分开，其中接头长度为6至100个氨基酸。在本文包括具有ASTR的CAR的任何实施方式中，所述ASTR包括含有重链和轻链的单链可变片段，重链和轻链可以通过接头分开，并且接头长度可以为6至100个氨基酸，ASTR可包括条件活性抗体重链或条件活性抗体轻链，抗体重链或抗体轻链中的另一个可为野生型。
在本文包括具有ASTR的CAR的任何实施方式中，所述ASTR包括来自抗体的重链和轻链，重链可位于嵌合抗原受体上轻链的N末端，或轻链可位于嵌合抗原受体上重链的N末端。在本文包括具有ASTR的CAR的任何实施方式中，所述ASTR包含来自抗体的重链和轻链，重链和轻链可以来自条件活性抗体。在本文包括CAR的任何实施方式中，CAR可包括双特异性ASTR。在本文包括CAR的任何实施方式中，ASTR可以是条件活性ASTR。在本文包括具有条件活性ASTR的CAR的任何实施方式中，条件活性ASTR可以在肿瘤微环境和/或体外肿瘤替代测定条件中相对于相应的生理条件表现出与抗原结合的增加，其中肿瘤微环境和/或体外肿瘤替代测定条件可选自缺氧，酸性pH，较高浓度的乳酸，较高浓度的透明质酸，较高浓度的白蛋白，较高浓度的腺苷，较高浓度的R-2-羟基戊二酸，和较低的养分利用度。在本文包括具有条件活性ASTR的CAR的任何实施方式中，条件活性ASTR在pH 6.7下与pH 7.4相比可表现出对抗原结合的增加。在本文包括具有条件活性ASTR的CAR的任何实施方式中，条件活性ASTR在pH 6.0(代替或除pH 6.7之外)与pH7.4相比可以表现出对抗原结合的增加。
在本文包括CAR的任何实施方式中，ASTR可以与Axl结合。在本文包括具有与Axl结合的ASTR的CAR的任何实施方式中，ASTR可以与包含SEQ ID NO：79的抗体重链和SEQ IDNO：80的抗体轻链的抗体结合Axl的相同表位。
在本文包括具有与Axl结合的ASTR的CAR的任何实施方式中，并且在说明性实施方式中是与包含SEQ ID NO：79的抗体重链和SEQ ID NO：80的抗体轻链的抗体结合Axl的相同表位，ASTR可包括含有三个具有H1，H2和H3序列的互补决定区的抗体重链可变区，其中：a)H1序列是X1GX2TMN(SEQ ID NO：87)；b)H2序列是LIKPSNGGTSYNQKFKG(SEQ ID NO：88)；和c)H3序列是GX3YX4SYX5AMDY(SEQ ID NO：89)，其中X1为T或W；X2是H或A；X3是H或D；X4是E或H；并且X5是E或F。在本文包括具有与Axl结合的ASTR的CAR的任何实施方式中，并且在说明性实施方式中是与包含SEQ ID NO：79的抗体重链和SEQ ID NO：80的抗体轻链的抗体结合Axl的相同表位，ASTR可包括含有三个具有L1，L2和L3序列的互补决定区的抗体轻链可变区，其中：d)L1序列是KASQDVX6SAVA(SEQ ID NO：90)；e)L2序列是WX7X8TRX9T(SEQ ID NO：91)；和f)L3序列是QEHFSX10PLX11(SEQ ID NO：92)，其中X6为S或V；X7是A或Q；X8是S或D；X9是H或D；X10是T或P；并且X11是T或R。在本文包括具有与Axl结合的ASTR的CAR的任何实施方式中，并且在说明性实施方式中是与包含SEQ ID NO：79的抗体重链和SEQ ID NO：80的抗体轻链的抗体结合Axl的相同表位，ASTR可包括含有三个具有H1，H2和H3序列的互补决定区的抗体重链可变区，其中：a)H1序列是X1GX2X3MX4(SEQ ID NO：134)；b)H2序列是LIKX5SNGGTX6YNQKFKG(SEQ ID NO：135)；和c)H3序列是GX7X8X9X10X11X12X13X14DYX15X16(SEQ ID NO：136)，其中X1为T，A或W；X2是H或A；X3是T或I；X4是N或I；X5是P或N；X6是S，I或T；X7是H，D，E，P，R或W；X8是Y或N；X9是E，A，D，F，G，H，I，L，M，N，R，V或Y；X10是S，D，M，N或Q；X11是Y，C，E或P；X12是F，E，N，S，T或V；X13是A，D，G，L或Y；X14是M，E或F；X15是W，A，D，H，L，N，P，R或T；并且X16是G或H。在本文包括具有与Axl结合的ASTR的CAR的任何实施方式中，并且在说明性实施方式中是与包含SEQ IDNO：79的抗体重链和SEQ ID NO：80的抗体轻链的抗体结合Axl的相同表位，ASTR可包括含有三个具有L1，L2和L3序列的互补决定区的抗体轻链可变区，其中：d)L1序列是KASQDX17X18SX19VX20(SEQ ID NO：137)；e)L2序列是X21X22X23TRX24T(SEQ ID NO：138)；和f)L3序列是QEX25X26SX27X28X29X30(SEQ ID NO：139)，其中X17为V，D，G，N或W；X18是S或V；X19是A，L或M；X20是A，D，N或Q；X21是W或F；X22是A，I，N，P或Q；X23是S或D；X24是H或D；X25是H，C，F，I，L，Q，S，T，V或Y；X26是F，C，D，E，G，N或S；X27是T，C或P；X28是P，A，C，D，E，H，K，S，T，V或W；X29是L，G或R；并且X30是T，I或R。在本文包括具有与Axl结合并且包含轻链可变区的ASTR的CAR的任何实施方式中，轻链可变区可以选自SEQ ID NO：108-111。在本文包括具有结合Ax1并包含重链可变区的ASTR的CAR的任何实施方式中，重链可变区可选自SEQ ID NO：112-114。
在本文包括与Axl结合的CAB-CAR的任何实施方式中，重链可以在轻链的N末端。在这些实施方式中，ASTR可包括SEQ ID NO：128，SEQ ID NO：129或SEQ ID NO：159的氨基酸序列。
在本文包括与Axl结合的CAB-CAR的任何实施方式中，轻链可以在重链的N末端。在这些实施方式中，ASTR可包含SEQ ID NO：160或SEQ ID NO：161的氨基酸序列。
在本文包括CAR的任何实施方式中，ASTR可与Ror2结合。在本文包括具有结合Ror2的ASTR的CAR的任何实施方式中，ASTR可以与包含SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：83的抗体重链和SEQ ID NO：84的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，和/或ASTR可以与包含SEQ IDNO：151的抗体重链和SEQ ID NO：152的抗体轻链的单链可变抗体片段结合Ror2的相同表位。在本文包括具有结合Ror2的ASTR的CAR的任何实施方式中，ASTR可包括具有三个互补决定区的重链可变区，所述互补决定区具有H1，H2和H3序列，其中：a)H1序列是GYTX1TEX2TX3H(SEQ ID NO：95)或X4GYSITTGYYWN(SEQ ID NO：96)；b)H2序列是GX5NX6NNGGTGYNQKFKG(SEQID NO：97)或YITYDGSKNYNPSLKN(SEQ ID NO：98)；和c)H3序列是GSLYSYGNSYFDY(SEQ IDNO：99)或FEGVWX7GLDY(SEQ ID NO：100)，其中X1为F或E；X2为Y或D，X3为M或D；X4是T或S；X5是E或I；X6是T或D；并且X7是Y或G。在本文包括具有结合Ror2的ASTR的CAR的任何实施方式中，并且在说明性实施方式中是与包含SEQ ID NO：151的抗体重链和SEQ ID NO：152的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，ASTR可包括具有三个互补决定区的重链可变区，所述互补决定区具有H1，H2和H3序列，其中：a)H1序列是GYTX1TEX2TX3H(SEQ ID NO：95)；b)H2序列是GX5NX6NNGGTGYNQKFKG(SEQ ID NO：97)；和c)H3序列是GSLYSYGNSYFDY(SEQ ID NO：99)，其中X1为F或E；X2为Y或D，X3为M或D；X5是E或I；X6是T或D。在本文包括具有结合Ror2的ASTR的CAR的任何实施方式中，并且在示例性实施方式中是与包含SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：83的抗体重链和SEQ ID NO：84的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，ASTR可包括具有三个互补决定区的重链可变区，所述互补决定区具有H1，H2和H3序列，其中：a)H1序列是X4GYSITTGYYWN(SEQ ID NO：SEQ ID NO：96)；b)H2序列是YITYDGSKNYNPSLKN(SEQ ID NO：98)；和c)H3序列是FEGVWX7GLDY(SEQ ID NO：100)，其中X4为T或S；并且X7为Y或G。在本文包括具有结合Ror2的ASTR的CAR的任何实施方式中，ASTR可包括具有三个互补决定区的轻链可变区，所述互补决定区具有L1，L2和L3序列，其中：a)L1序列是SATSSX8SYMH(SEQ ID NO：101)或RASESVDRYGNSFIH(SEQ ID NO：102)；b)L2序列是X9TSNLAS(SEQ ID NO：103)或RTYNLES(SEQ ID NO：104)；和c)L3序列是QQRSSYPFT(SEQ ID NO：105)或QQTNEDPWT(SEQ IDNO：106)，其中X8为E或V；并且X9是G或H。在本文包括具有结合Ror2的ASTR的CAR的任何实施方式中，并且在说明性实施方式中是与包含SEQ ID NO：152的抗体重链和SEQ ID NO：152的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，ASTR可包括具有三个互补决定区的轻链可变区，所述互补决定区具有L1，L2和L3序列，其中：a)L1序列是SATSSX8SYMH(SEQ ID NO：101)；b)L2序列是X9TSNLAS(SEQ ID NO：103)；和c)L3序列是QQRSSYPFT(SEQ ID NO：105)，其中X8为E或V；并且X9是G或H。在本文包括具有结合Ror2的ASTR的CAR的任何实施方式中，并且在说明性实施方式中是与包含SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：83的抗体重链和SEQ ID NO：84的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，ASTR可包括具有三个互补决定区的轻链可变区，所述互补决定区具有L1，L2和L3序列，其中：a)L1序列是RASESVDRYGNSFIH(SEQ ID NO：102)；b)L2序列是RTYNLES(SEQ ID NO：104)；和c)L3序列是QQTNEDPWT(SEQ ID NO：106)。
在本文包括具有结合Ror2的ASTR的CAR的任何实施方式中，ASTR可包括包含三个互补决定区的重链可变区，所述互补决定区具有H1，H2和H3序列，其中：a)H1序列是GYTX1TEX2X3X4H(SEQ ID NO：140)或GYSITTGX29YWN(SEQ ID NO：141)；b)H2序列是X5X6X7X8NNGGTGYNQKFKG(SEQ ID NO：142)或YITYDGSX30NYNPSLKN(SEQ ID NO：143)；和c)H3序列是X9X10X11SX12YX13YX14X15SYFX16X17X18(SEQ ID NO：144)或CSX31X32X33X34VX35X36X37LDX38(SEQ ID NO：145)，其中X1是F或E；X2是Y或D；X3是T或C；X4是M，D，E或Y；X5是G或S；X6是I或E；X7是N，C，L或V；X8是T，D或E；X9是A，M或T；X10是R或H；X11是G或E；X12是L或F；X13是S或G；X14是G或D；X15是N或E；X16是D或L；X17是Y，C或T；X18是W或L；X29是Y，E，R或T；X30是K或N；X31为R，G，H，W或Y；X32是F，C，N或Q；X33是E或S；X34是G，E，F，H，M，Q或S；X35是W，A，I，P，Q，T或V；X36是Y，G，N或Q；X37是G，S或T；并且X38是Y或I。在本文包括具有结合Ror2的ASTR的CAR的任何实施方式中，并且在说明性实施方式中是与包含SEQ ID NO：152的抗体重链和SEQ ID NO：152的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，ASTR可包括包含三个互补决定区的重链可变区，所述互补决定区具有H1，H2和H3序列，其中：a)H1序列是GYTX1TEX2X3X4H(SEQ ID NO：140)；b)H2序列是X5X6X7X8NNGGTGYNQKFKG(SEQ ID NO：142)；和c)H3序列是X9X10X11SX12YX13YX14X15SYFX16X1 7X18(SEQ ID NO：144)，其中X1为F或E；X2是Y或D；X3是T或C；X4是M，D，E或Y；X5是G或S；X6是I或E；X7是N，C，L或V；X8是T，D或E；X9是A，M或T；X10是R或H；X11是G或E；X12是L或F；X13是S或G；X14是G或D；X15是N或E；X16是D或L；X17是Y，C或T；并且X18是W或L。在本文包括具有结合Ror2的ASTR的CAR的任何实施方式中，并且在说明性实施方式中是与包含SEQ ID NO：82或SEQ IDNO：83的抗体重链和SEQ ID NO：84的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，ASTR可包括包含三个互补决定区的重链可变区，所述互补决定区具有H1，H2和H3序列，其中：a)H1序列是GYSITTGX29YWN(SEQ ID NO：141)；b)H2序列是YITYDGSX30NYNPSLKN(SEQ ID NO：143)；和c)H3序列是CSX31X32X33X34VX35X36X37LDX38(SEQ ID NO：145)，其中X29为Y，E，R或T；X30是K或N；X31为R，G，H，W或Y；X32是F，C，N或Q；X33是E或S；X34是G，E，F，H，M，Q或S；X35是W，A，I，P，Q，T或V；X36是Y，G，N或Q；X37是G，S或T；并且X38是Y或I。
在本文包括具有结合Ror2的ASTR的CAR的任何实施方式中，ASTR可包括包含三个互补决定区的轻链可变区，所述互补决定区具有L1，L2和L3序列，其中：a)L1序列是SATSSX19X20X21MX22(SEQ ID NO：146)或RASESVDRYGNSX39IH(SEQ ID NO：147)；b)L2序列是X23TSNLAS(SEQ ID NO：148)或X40TYX41LES(SEQ ID NO：149)；和c)L3序列是QX24X25SX26YPFX27X28(SEQ ID NO：150)或QQX42NX43DPX44TX45(SEQ ID NO：85)，其中X19为V或E；X20是S或D；X21是Y，C或D；X22是H，G或L；X23是G，C，H或P；X24是Q或E；X25是R或H；X26是S，D，G，I，Q或V；X27是T或D；X28是F，D或E；X39是F，S或T；X40是R，C，D，E或W；X41是N或D；X42是T，I或P；X43是E或V；X44是W或T；并且X45是F或T。在本文包括具有结合Ror2的ASTR的CAR的任何实施方式中，并且在说明性实施方式中是与包含SEQ ID NO151的抗体重链和SEQ ID NO：152的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，ASTR可包括包含三个互补决定区轻链可变区，所述互补决定区具有L1，L2和L3序列，其中：a)L1序列是SATSSX19X20X21MX22(SEQ ID NO：146)；b)L2序列是X23TSNLAS(SEQ ID NO：148)；和c)L3序列是QX24X25SX26YPFX27X28(SEQ ID NO：150)，其中X19为V或E；X20是S或D；X21是Y，C或D；X22是H，G或L；X23是G，C，H或P；X24是Q或E；X25是R或H；X26是S，D，G，I，Q或V；X27是T或D；并且X28是F，D或E。在本文包括具有结合Ror2的ASTR的CAR的任何实施方式中，并且在说明性实施方式中是与包含SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：83的抗体重链和SEQ ID NO：84的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，ASTR可包括轻链可变区，其包括三个互补决定区，所述互补决定区具有L1，L2和L3序列，其中：a)L1序列是RASESVDRYGNSX39IH(SEQ ID NO：147)；b)L2序列是X40TYX41LES(SEQ ID NO：149)；和c)L3序列是QQX42NX43DPX44TX45(SEQ ID NO：85)，其中X39为F，S或T；X40是R，C，D，E或W；X41是N或D；X42是T，I或P；X43是E或V；X44是W或T；并且X45是F或T。
在本文包括具有结合Ror2的ASTR的CAR的任何实施方式中，在说明性实施方式中是其中ASTR与包含SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：83的抗体重链和SEQ ID NO：84的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，重链可变区可包含SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：120或SEQ ID NO：121的氨基酸序列。
在本文包括具有结合Ror2的ASTR的CAR的任何实施方式中，在说明性实施方式中是其中ASTR与包含SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：83的抗体重链和SEQ ID NO：84的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，重链可变区可包含SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：83.320的氨基酸序列。权利要求2931的嵌合抗原受体，其中ASTR与包含SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：83的抗体重链和SEQ ID NO：84的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，其中轻链可变区包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列。
在本文包括具有结合Ror2的ASTR的CAR的任何实施方式中，在说明性实施方式中是其中ASTR与包含SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：83的抗体重链和SEQ ID NO：84的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，轻链可变区可包含SEQ ID NO：84的氨基酸序列。
在本文包括具有结合Ror2的ASTR的CAR的任何实施方式中，在说明性实施方式中是其中ASTR与包含SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：83的抗体重链和SEQ ID NO：84的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，重链可变区可包含SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：120或SEQ ID NO：121的氨基酸序列。
在本文包括具有结合Ror2的ASTR的CAR的任何实施方式中，在说明性实施方式中是其中ASTR与包含SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：83的抗体重链和SEQ ID NO：84的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，重链可变区可包含SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：83的氨基酸序列。
在本文包括具有结合Ror2的ASTR的CAR的任何实施方式中，在说明性实施方式中是其中ASTR与包含SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：83的抗体重链和SEQ ID NO：84的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，ASTR可包含SEQ ID NO：130，SEQ ID NO：131或SEQ ID NO：132，SEQ ID NO：153，SEQ ID NO：154，SEQ ID NO：157或SEQ ID NO：158的氨基酸序列。
在本文包括具有结合Ror2的ASTR的CAR的任何实施方式中，在说明性实施方式中是其中ASTR与包含SEQ ID NO：151的抗体重链和SEQ ID NO：152的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，轻链可变区可包含SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：122，SEQ ID NO：123，SEQID NO：124或SEQ ID NO：152的氨基酸序列。
在本文包括具有结合Ror2的ASTR的CAR的任何实施方式中，在说明性实施方式中是其中ASTR与包含SEQ ID NO：151的抗体重链和SEQ ID NO：152的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，轻链可变区可包含SEQ ID NO：152的氨基酸序列。
在本文包括具有结合Ror2的ASTR的CAR的任何实施方式中，在说明性实施方式中是其中ASTR与包含SEQ ID NO：151的抗体重链和SEQ ID NO：152的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，重链可变区可包含SEQ ID NO：115，SEQ ID NO：116，SEQ ID NO：117，SEQID NO：118，SEQ ID NO：119或SEQ ID：151的氨基酸序列。
在本文包括具有结合Ror2的ASTR的CAR的任何实施方式中，在说明性实施方式中是其中ASTR与包含SEQ ID NO：151的抗体重链和SEQ ID NO：152的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，重链可变区可包含SEQ ID：151的氨基酸序列。
在本文包括具有结合Ror2的ASTR的CAR的任何实施方式中，在说明性实施方式中是其中ASTR与包含SEQ ID NO：151的抗体重链和SEQ ID NO：152的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，ASTR可包含SEQ ID NO：155或SEQ ID NO：156的氨基酸序列。
在本文包括CAR的任何实施方式中，跨膜结构域可与SEQ ID NO：46的序列具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，与CD8跨膜结构域具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，例如SEQ ID NO：47或75，与CD4跨膜结构域具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，例如SEQ ID NO：48，与CD3ζ跨膜结构域具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，例如SEQ ID NO：49，与CD28跨膜结构域至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，例如SEQ ID NO：50或76，与OX40跨膜结构域具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，例如SEQ ID NO：51，与CD134跨膜结构域具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，或与CD7跨膜结构域具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，例如SEQ ID NO：52，并且当ASTR是CAR的一部分时，条件活性ASTR可以在肿瘤微环境和/或体外肿瘤替代测定条件下相对于相应的生理学条件保持与Ror2或Ax1的结合增加。在本文包括CAR的任何实施方式中，跨膜可以是CD8跨膜结构域或CD28跨膜结构域。在本文包括CAR的任何实施方式中，跨膜结构域可位于ASTR和细胞内活化结构域之间。在本文包括CAR的任何实施方式中，细胞内活化结构域可以保持活化活性并且与CD3Z活化结构域具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％。97％，98％，99％或100％序列同一性，例如SEQ ID NO：11-16，与CD3D活化结构域具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，例如SEQ ID NO：17-19，与CD3E活化结构域具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，例如SEQ ID NO：20-21，与CD3G活化结构域具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，例如SEQ ID NO：22-23，与CD28活化结构域具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，例如SEQ ID NO：35，与CD79A活化结构域具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，例如SEQ ID NO：24-26，与DAP10活化结构域具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，例如SEQ ID NO：34，与DAP12活化结构域具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，例如SEQ ID NO：27-31，与FCER1G活化结构域具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，例如SEQ ID NO：32-33，与CD137活化结构域具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，或与ZAP70活化结构域具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，例如SEQ ID NO：36。
在本文包括CAR的任何实施方式中，CAR还可包括茎结构域。在本文包括CAR的任何实施方式中，CAR还可包括共刺激结构域。在一些实施方式中，CAR可包括茎结构域和共刺激结构域。在一些实施方式中，CAR从氨基末端到羧基末端可包括ASTR，茎结构域，跨膜结构域，共刺激结构域和细胞内活化结构域。
在本文包括具有茎结构域的CAR的任何实施方式中，茎结构域可与本领域已知的任何CD8茎结构域具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，例如SEQ ID NO：125，或与本领域已知的任何CD28茎结构域具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，例如SEQ ID NO：126，并且当ASTR是CAR的一部分时，条件活性抗原特异性靶向区域可以在肿瘤微环境和/或体外肿瘤替代测定条件下相对于相应的生理条件保持与Ror2或Ax1的结合增加。
在本文包括CAR的任何实施方式中，CAR还可包括共刺激结构域。在本文包括具有共刺激结构域的CAR的任何实施方式中，细胞内共刺激结构域可包括DAP10/CD28型信号链或基于免疫受体酪氨酸的含有活化基序(ITAM)的细胞内信号传导多肽。在本文包括具有共刺激结构域的CAR的任何实施方式中，CAR可包括与细胞内活化结构域具有不同氨基酸序列的共刺激结构域。在本文包括具有共刺激结构域的CAR的任何实施方式中，共刺激结构域可以与CD137共刺激结构域具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，例如SEQ ID NO：1，与CD28共刺激结构域具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，例如SEQ ID NO：2，与ICΔ共刺激结构域具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，例如SEQ ID NO：3，与ICOS共刺激结构域具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，例如SEQ ID NO：4，与OX40共刺激结构域具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，例如SEQ ID NO：5，与BTLA共刺激结构域具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，例如SEQ ID NO：7，与CD27共刺激结构域具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，例如SEQ ID NO：6，与CD30共刺激结构域具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，例如SEQ ID NO：8，与GITR共刺激结构域具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，例如SEQ ID NO：9，或与HVEM共刺激结构域具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性，例如SEQ ID NO：10。在本文包括具有共刺激结构域的CAR的任何实施方式中，共刺激结构域可以是CD28共刺激结构域或CD137共刺激结构域。在本文包括具有共刺激结构域的CAR的任何实施方式中，共刺激结构域可以是ICΔ共刺激结构域。在本文包括具有共刺激结构域的CAR的任何实施方式中，共刺激结构域可以是ICΔ共刺激结构域，并且细胞内活化结构域可以是CD3Z活化结构域。在本文包括具有茎结构域和共刺激结构域的CAR的任何实施方式中，茎结构域可以是CD8茎结构域或CD28茎结构域，跨膜结构域可以是CD8跨膜结构域或CD28跨膜结构域，细胞内活化结构域可以是CD3Z活化结构域，并且共刺激结构域可以是CD137共刺激结构域，ICΔ共刺激结构域或CD28共刺激结构域，或共刺激结构域可以包括CD137共刺激结构域和ICΔ共刺激结构域。
在本文包括CAR的任何实施方式中，CAR还可包括识别结构域。在包括具有识别结构域的CAR的任何实施方式中，识别结构域可以在与CAR相同的多肽上表达。在包括在与CAR相同的多肽上具有识别结构域的CAR的任何实施方式中，识别结构域可以在N末端或其附近，例如在N末端的10，20，30，40或50个氨基酸内。在包括在与CAR相同的多肽上具有识别结构域的CAR的任何实施方式中，识别结构域可以在C末端处或附近，例如在C末端的10，20，30，40或50个氨基酸内。在包括在与CAR相同的多肽上具有识别结构域的CAR的任何实施方式中，识别结构域可以在CAR的任何结构域之间，例如在茎和跨膜结构域之间。在本文包括具有识别结构域的CAR的任何实施方式中，可以表达识别结构域，使得其共价连接至CAR，并且识别结构域可以通过切割信号或核糖体跳跃序列与CAR分离。在本文包括具有核糖体跳跃序列的识别结构域的CAR的任何实施方式中，核糖体跳跃序列可以是2A-1，例如SEQ IDNO：77。在本文包括具有识别结构域的CAR的任何实施方式中，识别结构域可以是EGFR的至少10，15，20，25，30，35，40，45或50个连续氨基酸。在包括具有识别结构域的CAR的任何实施方式中，识别结构域可以是FLAG表位(SEQ ID NO：38)。
在本文包括CAR的任何实施方式中，CAR还可包括信号序列。在本文包括具有信号序列的CAR的任何实施方式中，信号序列可以是表位标签，亲和结构域和/或产生可检测信号的多肽。在本文包括具有信号序列的CAR的任何实施方式中，信号序列可以在氨基末端。
在本文包括含有编码CAR的核酸的表达载体的任何实施方式中，表达载体可以进一步包括编码识别结构域的核苷酸。在本文包括含有编码CAR的核酸和编码识别结构域的核苷酸的表达载体的任何实施方式中，编码识别结构域的核苷酸可编码EGFR的至少10，15，20，25，30，35，40，45或50个连续氨基酸。在本文包括含有编码CAR的核酸和编码识别结构域的核苷酸的表达载体的任何实施方式中，编码识别结构域的核苷酸可以通过内部核糖体进入位点与编码CAR的核苷酸分离。在本文包括含有编码CAR的核酸和编码识别结构域的核苷酸的表达载体的任何实施方式中，识别结构域可以表达为进一步包括CAR的单个多肽的一部分，所并且单个多肽上的识别结构域可以通过切割信号或核糖体跳跃序列与CAR分离，所述核糖体跳跃序列可以是2A-1序列，例如SEQ ID NO：77。在本文包括表达载体的任何实施方式中，表达载体可以是病毒载体。在本文包括作为病毒载体的表达载体的任何实施方式中，病毒载体可以是非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒，非复制胜任型重组慢病毒颗粒，痘苗病毒，脊髓灰质炎病毒，腺相关病毒，SV40，a单纯疱疹病毒，γ逆转录病毒，人免疫缺陷病毒，慢病毒或腺病毒。
在本文包括表达CAR的哺乳动物细胞的任何实施方式中，细胞可以是淋巴细胞。在本文包括表达CAR的淋巴细胞的任何实施方式中，淋巴细胞可以是T细胞。在本文包括表达CAR的T细胞的任何实施方式中，T细胞可以是CD4+T细胞或T细胞可以是CD8+T细胞。在本文包括表达CAR的淋巴细胞的任何实施方式中，淋巴细胞可以是优先杀伤肿瘤微环境中抗原表达细胞的细胞毒性细胞，并且淋巴细胞可以包括编码实施方式1或A1至A8的任何CAR的核酸。
在本文包括包含含有非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒的容器的试剂盒及其使用说明书的任何实施方式中，该说明书还可以包括通过将足够量的pH调节药理学试剂引入微环境中以在接触靶哺乳动物细胞后增加微环境的pH，从而影响靶哺乳动物细胞与T细胞和/或NK细胞的结合。在本文包括包含含有非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒的容器的试剂盒及其使用说明书的任何实施方式中，该试剂盒还可包括pH调节药理学试剂。在本文包括包含含有非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒的容器的试剂盒及其使用说明书的任何实施方式中，该说明书可包括将能够表达CAR的T细胞和/或NK细胞在接触前引入受试者的步骤，其中在引入后，包含编码CAR的一个或多个核酸序列的T细胞和/或NK细胞表达CAR并结合在受试者中表达同源抗原的靶哺乳动物细胞。
在本文包括治疗癌症的任何实施方式中，癌症可以是肾细胞癌。在本文包括治疗癌症的任何实施方式中，癌症可以是软组织肉瘤或间皮瘤。在本文包括治疗癌症并且包括具有识别结构域的CAR的任何实施方式中，该方法可以进一步包括在向受试者在施用遗传工程化的细胞毒性细胞后施用针对识别结构域的一定剂量的抗体。在本文包括治疗癌症的任何实施方式中，癌症可以表达Axl，并且CAR可以包括结合Axl的ASTR。在本文包括治疗癌症的任何实施方式中，癌症可以表达Ror2，并且CAR可以包括结合Ror2的ASTR。在本文包括治疗癌症的任何实施方式中，细胞毒性细胞可以是T细胞和/或NK细胞。在本文包括治疗癌症的任何实施方式中，细胞毒性细胞可以是T细胞。在本文包括扩增T细胞和/或NK细胞的任何实施方式中，该方法可以进一步包括在扩增后收获遗传修饰的T细胞和/或NK细胞。在本文包括收获T细胞和/或NK细胞的任何实施方式中，该方法可以进一步包括冷冻保存收获的遗传修饰的T细胞和/或NK细胞。在本文包括冷冻保存T细胞和/或NK细胞的任何实施方式中，可以解冻冷冻保存的遗传修饰的T细胞和NK细胞。在本文包括收获T细胞和/或NK细胞的任何实施方式中，该方法可以进一步包括将收获的遗传修饰的T细胞和/或NK细胞引入受试者。
在本文的实施例1中发现了在pH 6.7下与pH 7.4相比与Ax1的结合增加的示例性条件活性CAR(CAB-CAR)。在说明性实施方式中，CAR或ASTR可以与包含SEQ ID NO：79的抗体重链和SEQ ID NO：80的抗体轻链的单链可变抗体片段结合Axl的相同表位。在此类说明性实施方式的进一步实施方式中，抗Axl CAR或ASTR包含或是单链可变片段(scFv)。在进一步说明性实例中，抗Axl scFv包含在轻链N末端的重链或在重链N末端的轻链。在本文包括CAR的任何实施方式中，并且在说明性实施方式中是与包含SEQ ID NO：79的抗体重链和SEQ IDNO：80的抗体轻链的抗体结合Axl的相同表位，ASTR可包括SEQ ID NO：128，129，159，160或161中的任一个。此外，本文任何实施方式的抗Axl CAR可包括本文提供的任何CAR组分。在某些示例性实施方式中，抗Axl CAR可以包括表1中列出的CAR组分，并且可以是表1中的任何CAR。更通常地，对于本文包括抗Axl CAR的任何实施方式，CAR是CAB-CAR，并且在非限制性说明性实施方式中是可包括例如表1中提供的显示细胞毒活性的任何CAB-CAR组分和CAB-CAR。例如，抗Axl CAB-CAR可包括CD8信号肽，CD8或CD28茎/跨膜结构域，CD137，ICΔ，或ICΔ共刺激结构域和CD137共刺激结构域两者，和/或CD3Z活化结构域。此外，在非限制性说明性实施方式中，本文任何实施方式的示例性CAR包括抗Axl CAR，尤其是抗Axl CAB-CAR，包括在表1中显示条件细胞毒活性的任何抗Axl CAB-CAR。这种说明性CAB-CAR包括表1的F1-2-1，F1-2-2，F1-2-3，F1-2-6，F1-2-8，F1-2-10，F1-2-13，F1-2-14，F1-2-15，F1-2-22或F1-2-23。在包括ASTR的本文的任何实施方式中，ASTR可包括F1-2-1，F1-2-2，F1-2-3，F1-2-6，F1-2-8，F1-2-10，F1-2-13，F1-2-14，F1-2-15F1-2-22，或F1-2-23的ASTR。此外，在非限制性说明性实施方式中，本文任何实施方式的示例性CAR包括抗Axl CAR，尤其是抗AxlCAB-CAR，包括在表1中显示高条件细胞毒活性的任何抗Axl CAB-CAR，这种示例性CAB-CAR包括F1-2-13，F1-2-15，F1-2-22或F1-2-23。因此，在本文包括ASTR的任何实施方式中，ASTR可包括F1-2-1，F1-2-2，F1-2-3，F1-2-6，F1-2-8，F1-2-10，F1-2-13，F1-2-14，F1-2-15，F1-2-22或F1-2-23的ASTR。
在本文的实施例1中发现了在pH 6.7下与pH 7.4相比与Ror2的结合增加的示例性条件活性CAR(CAB-CAR)。在说明性实施方式中，CAR或ASTR可以与包含SEQ ID NO：82或SEQID NO：83的抗体重链和SEQ ID NO：84的抗体轻链的单链可变抗体片段结合Ror2的相同表位，或CAR或ASTR可以与包含SEQ ID NO：151的抗体重链和SEQ ID NO：152的抗体轻链的单链可变抗体片段结合Ror2的相同表位。在此类说明性实施方式的进一步实施方式中，抗Ror2CAR或ASTR包含或是单链可变片段(scFv)，并且在进一步说明性实例中，包含重链N末端的轻链，或包含轻链N末端的重链。在本文包括CAR或ASTR的任何实施方式中，并且在说明性实施方式中是与包含SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：83的抗体重链和SEQ ID NO：84的抗体轻链的单链可变抗体片段结合Ror2的相同表位，或与包含SEQ ID NO：151的抗体重链和SEQID NO：152的抗体轻链的单链可变抗体片段结合Ror2的相同表位，ASTR可包括SEQ ID NO：130-132或153-158中的任一个。此外，本文任何实施方式的抗ROR2CAR可包括本文提供的任何CAR组分。在某些示例性实施方式中，抗Ror2CAR可以包括表2中列出的CAR组分，并且可以是表2中的任何CAR。更通常地，对于本文包括抗Ror2CAR的任何实施方式，CAR是CAB-CAR，并且在非限制性说明性实施方式中是可包括例如表2中提供的显示细胞毒活性的任何CAB-CAR组分和CAB-CAR。例如，抗Ror2 CAB-CAR可包括CD8信号肽，CD8或CD28茎/跨膜结构域，CD137共刺激结构域和/或CD3Z活化结构域。此外，在非限制性说明性实施方式中，本文任何实施方式的示例性CAR包括抗Ror2CAR，尤其是抗Ror2 CAB-CAR，包括在表2中显示条件细胞毒活性的任何抗Ror2 CAB-CAR。这种说明性CAB-CAR包括F1-1-9，F1-1-10，F1-1-11，F1-1-12，F1-1-15，F1-1-17，F1-1-18，F1-1-19，F1-1-20，F1-1-21，F1-1-23，F1-1-25或F1-1-26。在本文包括抗Ror2ASTR的任何实施方式中，ASTR可包括表2的F1-1-9，F1-1-10，F1-1-11，F1-1-12，F1-1-15，F1-1-17，F1-1-18，F1-1-19，F1-1-20，F1-1-21，F1-1-23，F1-1-25，或F1-1-26的ASTR。此外，在非限制性说明性实施方式中，本文任何实施方式的示例性CAR包括抗Ror2CAR，尤其是抗Ror2 CAB-CAR，包括在表2中显示高条件细胞毒活性的任何抗Ror2 CAB-CAR。这种说明性CAB-CAR包括F1-1-11，F1-1-12，F1-1-15，F1-1-17，F1-1-19，F1-1-20或F1-1-23。因此，在本文包括抗Ror2ASTR的任何实施方式中，ASTR可包括F1-1-11，F1-1-12，F1-1-15，F1-1-17，F1-1-19，F1-1-20，F1-1-23的ASTR。
在另一方面，本文提供了用于调节表达条件活性的生物嵌合抗原受体(CAB-CAR)的T细胞或NK细胞与在受试者中表达CAB-CAR的同源抗原的细胞结合的方法，其包括：
a.将包含编码CAB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞引入受试者，其中在引入后，包含编码CAB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞表达CAB-CAR，并且与受试者中表达同源抗原的细胞结合，并且其中同源抗原是Axl多肽或其表位，或Ror2多肽或其表位；和
b.以足够量向受试者施用药理学试剂以增加血液pH和/或组织pH和/或微环境pH，其中施用在引入之前、期间或之后进行，并且其中血液、组织和/或微环境的pH增加调节表达CAB-CAR的T细胞和/或NK细胞与在具有增加pH的血液，组织或微环境中表达同源抗原的细胞的结合。
在另一方面，本文提供了用于减轻受试者的靶内肿瘤外毒性的方法，其包括：
a.将编码条件活性生物嵌合抗原受体(CAB-CAR)的核酸引入受试者的T细胞或NK细胞中，以产生包含编码CAB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞；
b.将包含编码CAB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞引入受试者，其中在引入后，包含编码CAB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞表达CAB-CAR，并且与受试者中表达同源抗原的细胞结合，其中同源抗原是Axl多肽或其表位，或Ror2多肽或其表位；和
c.以足够量向受试者施用药理学试剂以增加血液pH和/或组织pH和/或微环境pH，以调节CAB-CAR与具有增加pH的血液，组织和/或微环境中的其同源抗原的结合，从而减轻受试者的靶内肿瘤外毒性。
在一些实施方式中，核酸可以是载体。在说明性实施方式中，载体是逆转录病毒载体。
在另一方面，本文提供了用于控制T细胞和/或NK细胞与靶哺乳动物细胞的结合的方法，其包括：
a.在微环境中使靶哺乳动物细胞与T细胞和/或NK细胞接触，其中靶哺乳动物细胞表达同源抗原，并且T细胞和/或NK细胞表达条件活性的生物嵌合抗原受体(CAB-CAR)，其在pH 6.7下与pH 7.4相比差异地结合同源抗原，其中同源抗原是Axl多肽或其表位，或Ror2多肽或其表位；和
b.通过以足够量向微环境中引入药理学试剂来增加微环境的pH，从而控制T细胞和/或NK细胞与靶哺乳动物细胞的结合。
另一方面，本文提供了用于体内控制受试者中表达条件活性生物嵌合抗原受体(CAB-CAR)的T细胞和/或NK细胞与靶哺乳动物细胞的结合的方法，其包括通过有效给药方案向受试者施用pH调节药理学试剂，以增加受试者内微环境pH，其中受试者包括表达CAB-CAR的T细胞和/或NK细胞，其中CAB-CAR在pH 6.7下与pH 7.4相比差异地结合其同源抗原，其中同源抗原是Axl多肽或其表位，或Ror2多肽或其表位，其中微环境包括靶哺乳动物细胞，其中靶哺乳动物细胞在其表面上表达同源抗原，并且其中T细胞和/或NK细胞在微环境pH增加之前与之后差异地结合靶哺乳动物细胞，从而体内控制受试者中T细胞和/或NK细胞与靶哺乳动物细胞的结合。
在上文提供的包括药理学试剂和CAB-CAR的任何方面中，CAB-CAR在一个pH下比在不同pH下具有与同源抗原的结合降低。在示例性实施方式中，其中CAB-CAR的差异结合的示例性pH值尚未在最广泛的方面提供，并且替代地用于其它实施方式代替这些方面的那些值，CAB-CAR可以在较高pH下比在较低pH下具有降低的结合。例如，CAB-CAR在高于7.0，7.1，7.2，7.3，7.4或7.5的pH下比在低于6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9或7.0的pH下具有与其同源抗原的结合降低。在其它实施方式中，CAB-CAR可以在较高pH下比在较低pH下具有降低的结合。例如，CAB-CAR在低于6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9或7.0的pH下比在高于7.0，7.1，7.2，7.3，7.4或7.5的pH下具有与其同源抗原的结合降低。在一些说明性实施方式中，CAB-CAR在6.5至6.7的pH下与pH 7.4至7.6相比表现出增加的结合。在其它说明性实施方式中，CAB-CAR在pH 6.7下与pH 7.4相比表现出增加的结合。在其它实施方式中，CAB-CAR在肿瘤的pH中与血液的pH相比表现出增加的结合。在一些实施方式中，CAB-CAR可包括抗原特异性靶向区，茎和细胞内活化结构域。在一些实施方式中，CAB-CAR还可包括共刺激结构域。在一些实施方式中，CAB-CAR可以结合肿瘤相关抗原。
在上文提供的包括药理学试剂和CAB-CAR的任何方面中，微环境的pH可以从低于7.0的pH增加至高于7.0的pH。例如，pH可以从低于6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9或7.0的pH增加至高于7.0，7.1，7.2，7.3或7.4的pH。在一些实施方式中，在引入药理学试剂之前，CAB-CAR可以在增加的pH而不是微环境的pH下与同源抗原结合。在某些实施方式中，pH可以从低于7.0升至pH 7.1至8.0或pH 7.1至7.8或pH 7.2至7.8或pH 7.2至7.6或pH 7.3至7.6或pH7.4至7.8或pH 7.4至7.6。pH的这种增加可以发生少于1，2，4，6，8，12或24小时或超过1，2，4，6，8，12或24小时，这取决于所施用药理学试剂的类型和剂量。在某些实施方式中，施用药理学试剂使得靶组织例如肿瘤中的pH保持在高于7.0，7.1，7.2，7.3，7.4或7.5；或者在范围低端为7.0，7.1，7.2，7.3与范围高端为7.4，7.5，7.6，7.7或7.8之间，例如在至少靶组织(例如肿瘤)微环境的表面，在靶组织(例如肿瘤)微环境的至少一部分中，并且在说明性实施方式中是整个靶组织(例如肿瘤)微环境。
在上文提供的包括药理学试剂和CAB-CAR的任何方面中，微环境可以是体内微环境，例如肿瘤，组织，非肿瘤组织，正常组织，或已经历pH瞬时变化的组织。例如，通常经历pH瞬时变化的组织包括厌氧条件下的肌肉组织或经历运动的肌肉组织或发炎的组织或经历炎症的组织。在包括靶哺乳动物细胞的一些实施方式中，靶哺乳动物细胞可以是肿瘤细胞或非肿瘤细胞或正常细胞。
在上文提供的包括药理学试剂和CAB-CAR的任何方面中，药理学试剂可以是碳酸氢钠，三羟甲基氨基甲烷，碳酸氢钠和碳酸钠的等摩尔高渗溶液，或质子泵抑制剂，例如埃索美拉唑，埃索美拉唑和萘普生，兰索拉唑，奥美拉唑和雷贝拉唑。
在上文提供的包括在包括CAB-CAR和药理学试剂的方法中的非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒的任何实施方式中，包括与在编码CAB-CAR的T细胞和/或NK细胞中有活性的启动子可操作地连接的转录单元的多核苷酸被T细胞和/或NK细胞摄取，使得这样的细胞能够表达CAB-CAR。在说明性实施方式中，T细胞和/或NK细胞将多核苷酸整合到其基因组中。
在上面提供的包括在包括CAB-CAR和药理学试剂的方法中的非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒的任何实施方式中，非复制胜任型逆转录病毒颗粒在其表面上可以包括单克隆抗体批准的生物制剂的识别结构域。例如，识别结构域可包括被识别EGFR或其表位的抗体识别的多肽。
在另一方面，本文提供了用于体内控制受试者中T细胞和/或NK细胞与靶哺乳动物细胞结合的方法中的pH调节药理学试剂，包括通过增加受试者体内微环境pH的有效给药方案将pH调节药理学试剂施用于受试者，其中受试者包括T细胞和/或NK细胞，其中T细胞和/或NK细胞表达条件活性生物制剂嵌合抗原受体(CAB-CAR)，其在pH 6.7下与pH 7.4相比差异地与其同源抗原结合，其中同源抗原是Axl多肽或其表位，或Ror2多肽或其表位，其中T细胞和/或NK细胞表达CAB-CAR，其中微环境包括靶哺乳动物细胞，其中靶哺乳动物细胞在其表面表达同源抗原，并且其中通过施用pH调节药理学试剂使T细胞和/或NK细胞在微环境pH增加之前与之后差异地结合靶哺乳动物细胞，从而体内控制受试者中T细胞和/或NK细胞与靶哺乳动物细胞的结合。
另一方面，本文提供了用于调节表达条件活性的生物嵌合抗原受体(CAB-CAR)的T细胞或NK细胞与在受试者中表达CAB-CAR的同源抗原的细胞结合的方法中的药理学试剂，以用于治疗肿瘤生长，其中该方法包括：
a.将能够表达CAB-CAR的T细胞和/或NK细胞引入受试者，其中同源抗原是Axl多肽或其表位，或Ror2多肽或其表位，其中CAB-CAR与受试者中表达同源抗原的细胞结合，其中在引入后，包含编码CAB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞表达CAB-CAR并与受试者中表达同源抗原的细胞结合；和
b.以足够量向受试者施用药理学试剂以增加血液pH和/或组织pH和/或微环境pH以调节表达CAB-CAR的T细胞和/或NK细胞与在具有增加pH的血液，组织或微环境中表达同源抗原的细胞的结合。
在另一个方面，本文提供了用于减轻受试者的靶内肿瘤外毒性的方法中的药理学试剂，其中该方法包括：
a.将编码条件活性生物嵌合抗原受体(CAB-CAR)的核酸引入受试者的T细胞或NK细胞，以产生能够表达CAB-CAR的T细胞和/或NK细胞；
b.将能够表达CAB-CAR的T细胞和/或NK细胞引入受试者，其中在引入后，包含编码CAB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞表达CAB-CAR并与受试者中表达同源抗原的细胞结合；和
c.以足够量向受试者施用药理学试剂以增加血液pH和/或组织pH和/或微环境pH，以调节CAB-CAR与具有增加pH血液，组织和/或微环境中的同源抗原的结合，其中同源抗原是Axl多肽或其表位，或Ror2多肽或其表位，从而减轻受试者的靶内肿瘤外毒性。
在另一个方面，本文提供了用于控制表达条件活性生物嵌合抗原受体(CAB-CAR)的T细胞和/或NK细胞与靶哺乳动物细胞的结合的方法中的药理学试剂，以用于治疗肿瘤生长，其中该方法包括：
a.在微环境中使靶哺乳动物细胞与表达CAB-CAR的T细胞和/或NK细胞接触，其中靶哺乳动物细胞表达同源抗原，其中同源抗原是Axl多肽或其表位，或Ror2多肽或其表位，并且其中T细胞和/或NK细胞表达在pH 6.7下与pH 7.4相比差异地结合同源抗原的CAB-CAR；和
b.通过将药理学试剂以足够量引入微环境来增加微环境的pH，从而控制表达CAB-CAR的T细胞和/或NK细胞与靶哺乳动物细胞的结合。
另一方面，本文提供了用于体内控制受试者中表达条件活性生物嵌合抗原受体(CAB-CAR)的T细胞和/或NK细胞与靶哺乳动物细胞结合的方法中的药理学试剂，以用于治疗肿瘤生长，其中药理学试剂是pH调节药理学试剂，并且其中该方法包括通过增加受试者内微环境pH的有效给药方案向受试者施用pH调节药理学试剂，其中受试者包括表达CAB-CAR的T细胞和/或NK细胞，其中CAB-CAR在pH 6.7下与pH 7.4相比差异地结合其同源抗原，其中同源抗原是Axl多肽或其表位，或Ror2多肽或其表位，其中微环境包括靶哺乳动物细胞，其中靶哺乳动物细胞在其表面表达同源抗原，并且其中T细胞和/或NK细胞在微环境pH增加之前与之后差异地结合靶哺乳动物细胞。
另一方面，本文提供了用于体内控制受试者中表达条件活性生物嵌合抗原受体(CAB-CAR)的T细胞和/或NK细胞与靶哺乳动物细胞结合的方法中的pH调节药理学试剂，以用于治疗肿瘤生长，其中该方法包括通过增加受试者内微环境pH的有效给药方案向受试者施用pH调节药理学试剂，其中受试者包括表达CAB-CAR的T细胞和/或NK细胞，其中CAB-CAR在pH 6.7下与pH 7.4相比差异地结合其同源抗原，其中同源抗原是Axl多肽或其表位，或Ror2多肽或其表位，其中微环境包括靶哺乳动物细胞，其中靶哺乳动物细胞在其表面表达同源抗原，并且其中通过施用pH调节药理学试剂使T细胞和/或NK细胞在微环境pH增加之前与之后差异地结合靶哺乳动物细胞。
另一方面，本文提供了pH调节药理学试剂在制备用于体内控制受试者中表达条件活性生物嵌合抗原受体(CAB-CAR)的T细胞和/或NK细胞与靶哺乳动物细胞结合的药物中的用途，其中pH调节药理学试剂通过增加受试者内微环境pH的有效给药方案施用于受试者，其中受试者包括T表达CAB-CAR的细胞和/或NK细胞，其中CAB-CAR在pH 6.7下与pH 7.4相比差异地结合其同源抗原，其中同源抗原是Axl多肽或其表位，或Ror2多肽或其表位，其中微环境包括靶哺乳动物细胞，其中靶哺乳动物细胞在其表面表达同源抗原，并且其中通过施用pH调节药理学试剂使T细胞在增加微环境pH值之前与之后差异地结合靶哺乳动物细胞。
在上文提供的包括用于方法和CAB-CAR的pH调节药理学试剂或药理学试剂或包括pH调节药理学试剂和CAB-CAR的用途的任何方面中，CAB-CAR在一个pH下与在不同pH下具有与同源抗原结合的降低。在示例性实施方式中，其中CAB-CAR的差异结合的示例性pH值尚未在最广泛的方面提供，并且替代地用于其它实施方式代替这些方面的那些值，CAB-CAR可以在较高pH下比在较低pH下具有降低的结合。例如，CAB-CAR在高于7.0，7.1，7.2，7.3，7.4或7.5的pH下比在低于6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9或7.0的pH下具有与其同源抗原的结合降低。在其它实施方式中，CAB-CAR可以在较高pH下比在较低pH下具有降低的结合。例如，CAB-CAR在低于6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9或7.0的pH下比在高于7.0，7.1，7.2，7.3，7.4或7.5的pH下具有与其同源抗原的结合降低。在一些说明性实施方式中，CAB-CAR在6.5至6.7的pH下与pH 7.4至7.6相比表现出增加的结合。在其它说明性实施方式中，CAB-CAR在pH 6.7下与pH 7.4相比表现出增加的结合。在其它实施方式中，CAB-CAR在肿瘤的pH中与血液的pH相比表现出增加的结合。在一些实施方式中，CAB-CAR可包括抗原特异性靶向区，茎和细胞内活化结构域。在一些实施方式中，CAB-CAR还可包括共刺激结构域。在一些实施方式中，CAB-CAR可以结合肿瘤相关抗原。
在上文提供的包括用于方法和CAB-CAR的pH调节药理学试剂或药理学试剂或包括pH调节药理学试剂和CAB-CAR的用途的任何方面中，微环境的pH可以从低于7.0的pH增加至高于7.0的pH。例如，pH可以从低于6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9或7.0的pH增加至高于7.0，7.1，7.2，7.3或7.4的pH。在一些实施方式中，在引入药理学试剂之前，CAB-CAR可以在增加的pH而不是微环境的pH下与同源抗原结合。在某些实施方式中，pH可以从低于7.0升至pH7.1至8.0或pH 7.1至7.8或pH 7.2至7.8或pH 7.2至7.6或pH 7.3至7.6或pH 7.4至7.8或pH7.4至7.6。pH的这种增加可以发生少于1，2，4，6，8，12或24小时或超过1，2，4，6，8，12或24小时，这取决于所施用药理学试剂的类型和剂量。在某些实施方式中，施用药理学试剂使得靶组织例如肿瘤中的pH保持在高于7.0，7.1，7.2，7.3，7.4或7.5；或者在范围低端为7.0，7.1，7.2，7.3与范围高端为7.4，7.5，7.6，7.7或7.8之间，例如在至少靶组织(例如肿瘤)微环境的表面，在靶组织(例如肿瘤)微环境的至少一部分中，并且在说明性实施方式中是整个靶组织(例如肿瘤)微环境。
在上文提供的包括用于方法和CAB-CAR的pH调节药理学试剂或药理学试剂或包括pH调节药理学试剂和CAB-CAR的用途的任何方面中，其中同源抗原是Axl多肽或其表位，或Ror2多肽或其表位；微环境可以是体内微环境，例如肿瘤，组织，非肿瘤组织，正常组织或已经历pH瞬时变化的组织。例如，通常经历pH瞬时变化的组织包括厌氧条件下的肌肉组织或经历运动的肌肉组织或发炎的组织或经历炎症的组织。在包括靶哺乳动物细胞的一些实施方式中，靶哺乳动物细胞可以是肿瘤细胞或非肿瘤细胞或正常细胞。
在上文提供的包括用于方法和CAB-CAR的pH调节药理学试剂或药理学试剂或包括pH调节药理学试剂和CAB-CAR的用途的任何方面中，其中同源抗原是Axl多肽或其表位，或Ror2多肽或其表位，药理学试剂可以是碳酸氢钠，三羟甲基氨基甲烷，碳酸氢钠和碳酸钠的等摩尔高渗溶液，或质子泵抑制剂，例如埃索美拉唑，埃索美拉唑和萘普生，兰索拉唑，奥美拉唑和雷贝拉唑。
在上文提供的包括用于方法和CAB-CAR的pH调节药理学试剂或药理学试剂或包括pH调节药理学试剂和CAB-CAR的用途的任何方面中，其中同源抗原是Axl多肽或其表位，或Ror2多肽或其表位，该药理学试剂可用于治疗癌症，肿瘤，肿瘤生长或细胞增殖性疾病的方法中。
在另一个方面，本文提供了包含含有非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒以及其用于治疗肿瘤生长的说明书的容器的试剂盒，其中说明书指导了控制T细胞和/或NK细胞与靶哺乳动物细胞结合的方法，该方法包括：
a.用非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒转导T细胞和/或NK细胞，所述非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒在其基因组中包括条件活性生物嵌合抗原受体(CAB-CAR)，其在pH6.7下与pH 7.4相比差异地结合同源抗原，以产生能够表达CAB-CAR的T细胞和/或NK细胞，其中同源抗原是Axl多肽或其表位，或Ror2多肽或其表位；
b.将能够表达CAB-CAR的T细胞和/或NK细胞引入受试者，其中在引入后，包含编码CAB-CAR的核酸的T细胞和/或NK细胞表达CAB-CAR并与受试者中表达同源抗原的细胞结合；
c.在微环境中使靶哺乳动物细胞与表达CAB-CAR的T细胞和/或NK细胞接触，其中靶哺乳动物细胞表达CAB-CAR的同源抗原，并且T细胞和/或NK细胞表达CAB-CAR；和
d.通过将足够量的pH调节药理学试剂引入微环境来增加微环境的pH，从而影响靶哺乳动物细胞与T细胞和/或NK细胞的结合。
在一些实施方式中，试剂盒可以进一步包括pH调节药理学试剂。
在试剂盒的一些实施方式中，CAB-CAR在一个pH下比在不同pH下具有降低的与Axl多肽或其表位或Ror2多肽或其表位的结合。在示例性实施方式中，其中CAB-CAR的差异结合的示例性pH值尚未在最广泛的方面提供，并且替代地用于其它实施方式代替这些方面的那些值，CAB-CAR可以在较高pH下比在较低pH下具有降低的结合。例如，CAB-CAR在高于7.0，7.1，7.2，7.3，7.4或7.5的pH下比在低于6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9或7.0的pH下具有与其同源抗原的结合降低。在其它实施方式中，CAB-CAR可以在较高pH下比在较低pH下具有降低的结合。例如，CAB-CAR在低于6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9或7.0的pH下比在高于7.0，7.1，7.2，7.3，7.4或7.5的pH下具有与其同源抗原的结合降低。在一些说明性实施方式中，CAB-CAR在6.5至6.7的pH下与pH 7.4至7.6相比表现出增加的结合。在其它说明性实施方式中，CAB-CAR在pH 6.7下与pH 7.4相比表现出增加的结合。在其它实施方式中，CAB-CAR在肿瘤的pH中与血液的pH相比表现出增加的结合。在一些实施方式中，CAB-CAR可包括抗原特异性靶向区，茎和细胞内活化结构域。在一些实施方式中，CAB-CAR还可包括共刺激结构域。在一些实施方式中，CAB-CAR可以结合肿瘤相关抗原。
在试剂盒的一些实施方式中，微环境的pH可以从低于7.0的pH增加至高于7.0的pH。例如，pH可以从低于6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9或7.0的pH增加至高于7.0，7.1，7.2，7.3或7.4的pH。在一些实施方式中，在引入药理学试剂之前，CAB-CAR可以在增加的pH而不是微环境的pH下与同源抗原结合。在某些实施方式中，pH可以从低于7.0升至pH 7.1至8.0或pH7.1至7.8或pH 7.2至7.8或pH 7.2至7.6或pH 7.3至7.6或pH 7.4至7.8或pH 7.4至7.6。pH的这种增加可以发生少于1，2，4，6，8，12或24小时或超过1，2，4，6，8，12或24小时，这取决于所施用药理学试剂的类型和剂量。在某些实施方式中，施用药理学试剂使得靶组织例如肿瘤中的pH保持在高于7.0，7.1，7.2，7.3，7.4或7.5；或者在范围低端为7.0，7.1，7.2，7.3与范围高端为7.4，7.5，7.6，7.7或7.8之间，例如在至少靶组织(例如肿瘤)微环境的表面，在靶组织(例如肿瘤)微环境的至少一部分中，并且在说明性实施方式中是整个靶组织(例如肿瘤)微环境。在一些实施方式中，微环境可以是体内微环境，例如肿瘤，组织，非肿瘤组织，正常组织或已经历pH瞬时变化的组织。例如，通常经历pH瞬时变化的组织包括厌氧条件下的肌肉组织或经历运动的肌肉组织或发炎的组织或经历炎症的组织。在包括靶哺乳动物细胞的一些实施方式中，靶哺乳动物细胞可以是肿瘤细胞或非肿瘤细胞或正常细胞。
在试剂盒的一些实施方式中，药理学试剂可以是碳酸氢钠，三羟甲基氨基甲烷，碳酸氢钠和碳酸钠的等摩尔高渗溶液，或质子泵抑制剂，例如埃索美拉唑，埃索美拉唑和萘普生，兰索拉唑，奥美拉唑，和雷贝拉唑。
如上所述，CAB-CAR结合的同源抗原可以是Axl多肽或其表位或Ror2多肽或其表位。在一些实施方式中，同源抗原可以是与Axl多肽或其表位或Ror2多肽或其表位的至少10，15，20个或所有氨基酸的区段具有至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的多肽。如本文所公开的，能够结合Axl多肽或其表位或Ror2多肽或其表位的CAB-CAR通常在pH 6.7下比pH 7.4具有更高的与其同源抗原结合的结合亲和力。
技术人员将认识到，当说明书涉及“Axl CAB”或“Axl CAB-CAR”时，“Axl”是指识别Axl或其表位的ASTR。类似地，技术人员将认识到，当说明书涉及“Ror2 CAB”或“Ror2 CAB-CAR”时，“Ror2”是指识别Ror2或其表位的ASTR。
本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，不应被解释为以任何方式限制所描述的主题。
实施例
提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人认为的范围，也不打算表示以下实验是全部或唯一进行的实验。已经努力确保关于所使用数字(例如量、温度等)的准确性，但是应该考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。可以使用标准缩写，例如bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌内；i.p.，腹膜内；s.c.，皮下；和i.v.，静脉注射等。
实施例1：用于靶向AXL和ROR2的嵌合抗原受体的产生和分析
该实施例说明了制备和使用本发明某些实施方式的条件活性CAR的方法。获得编码靶向Axl和Ror2的条件活性ASTR的核酸，并用于产生编码条件活性CAR的慢病毒表达载体。用含有这些表达载体的慢病毒转导T细胞，并在针对靶细胞的各种体外肿瘤替代测定中测试转导的细胞。
产生表达条件活性CAR的慢病毒表达载体
获得编码靶向Axl的条件活性ASTR的核酸(含有SEQ ID NO：79和80的scFv构建体)和编码靶向Ror2的条件活性ASTR的3种核酸(含有SEQ ID NO：83和84的scFv构建体，含有SEQ ID NO：82和84的scFv构建体，和含有SEQ ID NO：151和152的scFv构建体)。本文的详细描述提供了制备条件活性ASTR(有时称为条件活性生物制剂(CAB))的方法，包括通过进化和选择用于制备所得CAB的抗体片段来制备CAB的方法。对序列进行了少量修饰，包括在人细胞中表达的密码子优化和剪接供体和受体位点的去除。将单链抗体的重链(SEQ ID NO：79，83和82)和单链抗体的轻链(SEQ ID NO：80和84)通过各种长度的接头(SEQ ID NO：53，54和55)连接并将其与其它结构域一起掺入慢病毒表达载体中以制备表1和2中列出的候选CAR。
生产慢病毒
通过用慢病毒表达载体瞬时转染293T细胞(Lenti-X 293T，Clontech)来产生慢病毒。通过在Freestyle293表达培养基(Thermo Fisher Scientific)中连续生长使细胞适应悬浮培养。使用溶解在弱酸中的PEI(Polysciences)转染悬浮细胞。将细胞(30mL)在125mLErlenmeyer烧瓶中培养至1×106个细胞/mL。
将质粒DNA在1.5ml Opti-MEM培养基中稀释30mL细胞。总DNA(1μg/mL培养物体积)是具有以下摩尔比的4种质粒的混合物：2x基因组质粒，1x Rev-含质粒，1x含VSVg的质粒和1x含Gagpol的质粒。另外，将PEI在1.5ml Opti-MEM中稀释至2μg/mL(培养体积，与DNA的比例为2：1)。室温温育5分钟后，将两种溶液充分混合并在室温下再温育20分钟。将最终体积(3ml)加入细胞中。然后将细胞在37℃下温育72小时，其中以120rpm旋转并具有5-8％CO2。
72小时后，通过以1000g离心10分钟收获上清液。将上清液倒入新管中，加入PEG溶液(PEG-IT，System Biosciences)中的1/4上清液体积。通过在4℃温育过夜，然后在4℃下以1500g离心20分钟沉淀病毒。除去上清液，将病毒重悬于1：100体积的Ex-Vivo15培养基中。通过HT1080细胞的GFP或通过Jurkat细胞的eTAG表达来滴定病毒。
Axl和Ror2的T细胞转导/扩增
在用于T细胞转导和扩增的初始方法中，从All Cells(Allcells，PB009-1F)获得Pan-T细胞。如上所述制备抗Axl CAB-CAR和抗ROR2 CAB-CAR非复制胜任型重组慢病毒颗粒。在慢病毒转导前两天，将细胞解冻并在人T细胞培养基中培养，其由X-VIVO15(Lonza#04-418Q)，5％人AB血清(Valley Biomedical Inc.，#HP1022)和10mM N-乙酰基L-半胱氨酸(Sigma-Aldrich#A9165)组成。加入重组人IL-2(R&D202-IL-010)至终浓度为100IU/mL。在病毒转导前24小时，将原代人T细胞以0.5×106个细胞/孔接种到12孔板中，并使用Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Thermo#11131D)以1：3细胞：珠子比活化。在转导当天，将慢病毒颗粒溶液以Axl为MOI 5和Ror2为MOI 20加入孔中。将转导的T细胞在人T细胞培养基中维持在～106/mL 3天，然后转移到含有30mL/孔的含IL-2的人T细胞培养基的6孔G-Rex中。在进行实验之前培养细胞至少10天，并且每隔一天加入IL-2。
用略微修改的转导和扩增条件进行某些后续实验。在指出的情况下，代替来自AllCells的Pan T细胞，根据制造商的说明，通过使用Ficoll-Paque (GEHealthcare Life Sciences)的密度梯度离心从血沉棕黄层(San Diego Blood Bank)富集T细胞，然后裂解红细胞。为了研究人肾细胞系Caki-1和HEK293的条件CAR依赖性杀伤，在扩增之前使用EasySep Human CD56阳性选择试剂盒II(干细胞技术#17855)从转导的Pan T细胞(AllCells)中去除CD56+细胞。
ECTAG表达的FACS分析
转导后8天收集转导的原代T细胞(0.5×106个)，洗涤并重悬于FACS缓冲液(PBS+2％FBS+0.1％叠氮化钠)中。细胞用含有0.9μg/ml生物素化西妥昔单抗(Promab)的100μLFACS缓冲液在冰上染色30分钟。用FACS缓冲液洗涤染色的细胞，并用链霉抗生物素蛋白PE(eBioscience，12-4317-87,0.2mg/ml)，CD3-BV421(Biolegend，317344)，CD4-PE-Dazzle594(Biolegend，300548)和CD8-BV570(Biolegend，301038)在冰上染色30分钟。将细胞在FACS缓冲液中洗涤两次，固定在FACS缓冲液和BD Cytofix(BD#554655)的1：1混合物中，用Novocyte(ACEA)处理，并用NovoExpress软件(ACEA)分析所得数据。
实时细胞杀伤试验
通过xCELLigence System(ACEA)测量转导的T细胞的细胞毒活性。简言之，如上制备转导的原代T细胞(效应细胞)，冷冻储存，解冻并在含有100IU/ML IL-2的人T细胞培养基中静置2天。靶细胞包括CHO细胞(ATCC)和稳定转染以表达人Axl(CHO-Axl)或ROR2(CHO-ROR2)的CHO细胞，或在其它实验中是分别通过FACS测试Axl和ROR2为阳性的人肾细胞癌系Caki-1(来源)和HEK293(Lenti-X 293T，Clontech)。在实验前一天将靶细胞以20K细胞/孔接种到E-平板上，其中含有40mM HEPES和PIPES的人T细胞培养基在pH 6.7和7.4或在pH6.3至pH 7.4以0.1个pH增量的pH范围。在测定当天，将静置的效应细胞加入到实验孔中，效应细胞/靶细胞比(E/T)为3：1,，1：1，在某些情况下是0.3：1。在添加效应细胞后，每5分钟进行阻抗读数达大约40小时，并且阻抗报告为细胞指数(CI)。如下计算特异性细胞溶解的百分比((CI靶+对照病毒转导的效应T细胞)-(用针对Ax1或Ror2的CAR转导的CI靶+效应T细胞)/(CI靶+对照病毒转导的效应T细胞)×100。
结果
通过将条件活性单链抗体的重链和轻链与其它CAR结构域和eTag结构域一起掺入慢病毒表达载体，制备用于结合Axl或Ror2的嵌合抗原受体(CAR)(有时称为(CAB-CAR))，其在肿瘤环境的降低pH下与正常组织相比具有增加的活性。制备和测试的野生型对照CARS和条件活性(CAB)CAR包括表1(Axl)和表2(Ror2)中所示的不同CAR模块/组分的各种组合，而表3中提供了更详细的序列信息。表1和表2中显示了从氨基端到羧基端的模块的各种组合。这些模块包括CD8信号序列肽(“sp”)(P1)(SEQ ID NO：74)；Axl CAB VH(SEQ ID NO：79)，Axl CAB VL(SEQ ID NO：80)，Axl VH(SEQ ID NO：93)，Axl VL(SEQ)ID NO：94)，Ror2VH(SEQID NO：107)，Ror2VL(SEQ ID NO：84)，Ror2 CAB VL(SEQ ID NO：152)Ror2 CAB1VH(SEQ IDNO：82)，Ror2 CAB2VH(SEQ ID NO：83)，Ror2 CAB3VH(SEQ ID NO：151)(P2)和(P4)；接头1(SEQ ID NO：53)，接头2(SEQ ID NO：54)或接头3(SEQ ID NO：55)(P3)；来自CD8(SEQ IDNO：75)或CD28(SEQ ID NO：76)(P5)的茎/铰链和跨膜结构域；来自CD137(SEQ ID NO：1)，CD28(SEQ ID NO：2)，ICΔ(SEQ ID NO：3)或ICΔ和CD137两者(SEQ ID NO：133)(P6)的共刺激结构域；来自CD3Z的活化结构域(SEQ ID NO：13)(P7)；2A-1核糖体跳跃序列(SEQ ID NO：77)(P8)；eTAG(SEQ ID NO：78)(P9)。
用表达表1和表2的候选CAR的重组慢病毒颗粒转导原代T细胞，并通过使用FACS测定表达eTag的细胞百分比来确定转染细胞百分比。如图1中代表性的Axl CAR所示，用编码候选CAR的重组慢病毒颗粒成功转导原代T细胞。
在pH 7.4(生理pH)或pH 6.7(替代肿瘤测定条件)下分析候选CAR针对表达Axl或Ror2的靶细胞的细胞毒活性。如下面更详细解释的，许多候选CAR在pH 6.7下比pH 7.4更有效地裂解靶细胞。在包含完全野生型重链和轻链的对照CAR中未检测到CAB活性(即在生理条件下鉴定并且未进一步进化的VH和VL链两者)。
在与Axl相关的某些初始实验中，使用第一条件活性重链和第一条件活性轻链测试十八种抗Axl CAB-CAR(F1-2-1至F1-2-18)，它们分别从野生型重链和轻链两者进化而来。如表1所示，最初测试的18种抗AXL CAB-CAR中的9种具有可检测的细胞毒活性(在表中表示为“CAB活性”)。没有仅具有野生型ASTR抗体重链和轻链的测试CAB-CAR具有条件活性(在表1中鉴定为“Axl VH”和“Axl VL”(F1-2-19，F1-2-20))。在使用上文提供的相同转导和扩增条件的后续实验中，包含不同共刺激结构域的抗Axl CAB-CAR表现出条件细胞毒活性(F1-2-22和F1-2-23)。
在与Ror2相关的某些初始实验中，分析了针对两种不同表位的条件活性ASTR。关于针对表位1的Ror2CAB-CAR(F1-1-9至F1-1-24)，最初测试的16种抗Ror2 CAB-CAR中的11种具有条件细胞毒活性(表2)。关于针对表位2的Ror2 CAB-CAR，在初始实验中表现出杀伤活性的六种抗Ror2 CAB-CAR的两种(F1-1-25和F1-1-26)具有条件细胞毒活性(表2)。没有仅具有野生型ASTR抗体重链和轻链的测试CAB-CAR在这些杀伤试验中具有条件活性(在表2中鉴定为“Ror2VH”和“Ror2VL”(F1-1-1至F1-1-8))。
总之，制备和测试的许多候选CAB-CAR在pH 6.7下比在pH 7.4下具有对靶细胞更高的细胞毒活性。在pH 6.7下比在pH 7.4下更有效裂解靶细胞的示例性CAB-CAR包括CAB-CAR F1-2-3，其包括抗Axl ASTR(SEQ ID NO：159)，CAB-CAR F1-2-8，其包括抗Axl ASTR(SEQ ID NO：160)，CAB-CAR F1-2-10，其包括抗Axl ASTR(SEQ ID NO：161)，CAB-CAR F1-2-13，其包括抗Axl ASTR(SEQ ID NO：129)，CAB-CAR F1-2-15，其包括抗Axl ASTR(SEQ IDNO：128)，CAB-CAR F1-1-9，其包括抗Ror2ASTR(SEQ ID NO：157)，CAB-CAR F-1-11，其包括抗Ror2ASTR(SEQ ID NO：153)，CAB-CAR F-1-15，其包括抗Ror2ASTR(SEQ ID NO：132)，CAB-CAR F-1-17，其包括抗Ror2ASTR(SEQ ID NO：154)，CAB-CAR F-1-19，其包括抗Ror2ASTR(SEQ ID NO：130)，CAB-CAR F1-1-21，其包括抗Ror2ASTR(SEQ ID NO：158)，CAB-CAR F1-1-23，其包括抗Ror2ASTR(SEQ ID NO：131)，CAB-CAR F-1-25，其包括抗Ror2ASTR(SEQ ID NO：155)和CAB-CAR F-1-26，其包括抗Ror2ASTR(SEQ ID NO：156)。ASTR均包括VH或VL的至少一个模块，其在生理条件下鉴定并进一步进化。
图2B-2F显示了对于一些针对Ax1的更具条件活性的CAB-CAR相对于具有非条件活性的野生型ASTR的对照CAR，CHO-Axl肿瘤随时间的代表性体外杀伤(图2A)。在图2A和2B中使用3：1比例的效应细胞与靶细胞。在图2C-2F中使用1：1比例的效应物与靶标。类似地，图3B-3J显示了对于一些针对Ror2的更有条件活性的CAB-CAR相对于具有非条件活性的野生型ASTR的对照CAR，以3：1比例的效应物与靶细胞的CHO-Ror2肿瘤随时间的代表性体外杀伤(图3A)。
一些候选CAR的条件活性在以0.1pH(pH滴定)的pH增量的从7.4至6.7的pH范围内随时间进行分析。如图4A中的CAB-CAR F1-2-13(AXL)和图5A中的CAB-CAR F1-1-15(Ror2)的代表性曲线所示，所有测试的候选CAR(针对Axl和Ror2各自的5个CAB-CAR)包括条件活性ASTR(CAB-CAR)表明pH依赖性杀伤表达其同源抗原的CHO细胞，其在生理学pH上是低的并随着培养物变得更酸性而增加。图4B显示了CAB-CAR F1-2-13的pH依赖性杀伤从pH 7.4至pH7.0增加并且从pH 7.0至pH 6.5始终高。图5B显示了CAB-CAR F1-1-15的pH依赖性杀伤从pH7.4至pH 6.6逐渐增加。
还在不存在这些蛋白的转基因表达的情况下在表达内源水平的Axl和Ror2的人肾细胞上测试候选CAB-CAR的条件杀伤。图6A显示了表达F1-2-15的T细胞对表达Axl的Caki-1细胞的条件杀伤。图6B显示了表达F1-1-15的T细胞对表达Ror2的HEK293细胞的条件杀伤。
因此，本文提供的方法在制备和鉴定针对Axl和Ror2的条件活性CAR方面是有效的，其在体外在T细胞上表达时显示条件杀伤活性。
表1.表达各种抗Axl CAR的T细胞的实时细胞分析结果。
表2.表达各种抗Ror2CAR的T细胞的实时细胞分析结果。
实施例2：消除表达靶细胞的eTAG
西妥昔单抗浓度对消除的影响
通过Ficoll-Paque Premium(GE Healthcare，45-001-751)从健康供体的ACD-外周血中分离PBMC。为了制备靶细胞，用含有与启动子可操作地连接的GFP和eTag的编码区的慢病毒转导PBMC，以表达GFP荧光蛋白和eTag靶。在没有转导的情况下同时活化和扩增的PBMC用作非靶对照细胞。将扩增的靶细胞和非靶对照细胞储存在液氮中的冷冻培养基中直至使用。将来自相同供体的新鲜分离的PBMC用10ng/mL huGM-CSF(R&D Systems，215-GM-010)预刺激过夜，并用作效应细胞。使靶细胞和非靶细胞从冷冻保存中恢复一天，然后在使用前用CT-紫标记非靶标对照细胞。将靶细胞和非靶对照细胞以1：1的比例混合，然后与效应PBMC以50：1效应细胞：靶细胞比例在U-底96孔板中共温育，其中具有不同浓度的西妥昔单抗或同种型对照抗体。温育22小时后，将样品以400g离心5分钟。将沉淀细胞重悬浮于FACS洗涤缓冲液(PBS+2％FBS+0.1％叠氮化钠)中，并在流式细胞术前用等体积的BDCytofix(BD#554655)固定。仅含有靶细胞的对照样品用于设定FACS门控。定量靶细胞和非靶控制细胞的数量。计算存活的靶细胞(GFP+)与非靶对照细胞(CT-紫)的比例，并标准化为没有Ab的样品。消耗百分比计算如下：1-((靶/非靶)/(没有Ab的靶/没有Ab的非靶))。
效应细胞：靶细胞的比例对西妥昔单抗消除的影响
如上所述进行实验，不同之处在于使用的PBMC预先冷冻，并且靶细胞和非靶对照细胞以1：1的比例混合，然后与效应PBMC以50：1，25：1，5：1和1：1效应细胞：靶细胞比例在U-底96孔板中共温育，其中具有1μg/mL西妥昔单抗或同种型对照。
结果
在外周血单核细胞(PBMC)中测试了表达eTag作为消除结构域的有效性。分离PBMC并用包括与启动子可操作连接的eTag的慢病毒载体转导。对照细胞未被转导。用浓度为0-10μg/ml的西妥昔单抗处理细胞，并在所有测试浓度下在西妥昔单抗施用后22小时检测细胞消耗(图7A)。使用1μg/ml西妥昔单抗浓度，在转导的效应(E)与对照(T)细胞的所有比例下观察消耗，随着转导的效应(E)细胞的比例增加，通常消耗增加(图7B)。因此，在PBMC存在下，通过针对eTag的抗体可以有效地消除表达eTag的T细胞。值得注意的是，用FLAG表位进行后续实验，其中FLAG表位表达为位于CD8信号肽和CAB-CAR F1-1-15和F1-2-15的条件活性ASTR之间的CAB-CAR多肽的一部分。虽然在某些情况下这些初始的非优化构建体略微减少，但这些CAB-CAR保留了杀伤表达其同源抗原的靶细胞并引发细胞因子反应的能力。因此，消除结构域可以表达为CAB-CAR的一部分而不破坏其活性。
实施例3.条件活性嵌合抗原受体诱导细胞因子
该实施例证明了靶向Axl或Ror2的条件活性嵌合抗原受体对pH依赖性细胞因子的诱导。在pH 6.7或pH 7.4下将对照CHO细胞或表达Axl(CHO-AXL)或Ror2细胞(CHO-ROR2)的CHO细胞与表达具有抗Axl ASTR(F1-2-15)的CAB-CAR的T细胞或表达具有抗Ror2ASTR(F1-1-15)的CAB-CAR的T细胞共温育后，测量培养基中IL-2和IFN-γ的细胞因子水平。将来自这些共温育的细胞因子水平与阴性和阳性对照中的细胞因子水平进行比较。
通过用编码CAB-CAR F1-1-15(Ror2)，F1-2-15(Axl)或单独eTag(F1-0-01)的慢病毒颗粒转导Pan T细胞(AllCells)预先产生冷冻保存的效应细胞，并如实施例1中所述进行扩增。在第1天，将效应细胞解冻并通过在37℃和5％CO2下在人T细胞培养基中培养使其从冷冻保存中恢复2天，所述人T细胞培养基由X-VIVO15(Lonza#04-418Q)，5％人AB血清(Valley Biomedical Inc.，#HP1022)，10mM N-乙酰基L-半胱氨酸(Sigma-Aldrich#A9165)组成，并补充100IU/ml IL2。在第2天，将3.0x104个CHO，CHO-Ror2或CHO-Axl靶细胞接种在96孔平底组织培养板的孔中的含有40mM HEPES/PIPES的100μl人T细胞培养基中并调节至pH 6.7或pH 7.4，并在37℃和5％CO2下培养过夜。在第3天，将静置的效应细胞以适当的pH在140μl人T细胞培养基中以3：1的效应细胞/靶细胞比例加入到实验孔中。将效应细胞和靶细胞在37℃和5％CO2下共温育过夜，第二天收集上清液，并通过ELISA测定细胞因子水平。每个实验条件一式三份进行。
结果
如图8A-8D所示，用含有编码抗Axl CAB-CAR F-2-15或抗Ror2 CAB-CAR F-1-15的核酸的慢病毒颗粒转导的T细胞被活化以分泌细胞因子以响应于识别分别以pH依赖性方式表达Axl或Ror2的CHO细胞。如图8A所示，当在pH 6.7而不是pH 7.4下培养时，用含有编码抗Axl CAB-CAR F1-2-15的核酸的慢病毒颗粒转导的T细胞分泌IL-2，并且仅在存在表达Axl的CHO细胞时。类似地，如图8B所示，用含有编码抗Axl CAB-CAR F1-2-15的核酸的慢病毒颗粒转导的T细胞在pH 6.7而不是pH 7.4下培养时分泌IFN-γ，并且仅在存在表达Axl的CHO细胞时。如图8C所示，表达抗Ror2 CAB-CAR F-1-15的T细胞在pH 6.7下培养时与pH 7.4相比分泌约2.5倍的IL-2，并且仅在存在表达Ror2的CHO细胞时分泌可观量的IL-2。类似地，如图8D所示，表达抗Ror2 CAB-CAR F-1-15的T细胞在pH 6.7下培养时与pH 7.4相比分泌约2倍的IFN-γ，并且仅在存在表达Ror2的CHO细胞时。包含表达对照EGFR多肽而不是抗Axl或抗Ror2CAB-CAR的效应T细胞的样品不会响应于在任一pH下与任何CHO细胞共培养而增加IL2或IFN-γ的分泌。因此，当在体外在T细胞上表达时，本文鉴定的针对Axl和Ror2的示例性条件活性CAR在暴露于CAR同源抗原时引发从这些T细胞分泌的条件细胞因子。此外，这些实验提供了用于活化表达本文提供的CAB-CAR的T细胞的非限制性示例性体外方法。
实施例4.通过改变pH可以控制表达条件活性生物CAR的T细胞的细胞毒活性。
以下实施例说明了如何通过微环境的pH变化来调节表达CAB-CAR的转导T细胞(也称为效应细胞)的细胞毒活性。在该实施例中，编码能够结合同源抗原Axl(抗Axl)的CAB-CAR的核酸用于产生非复制胜任型重组慢病毒颗粒。用慢病毒颗粒转导Pan T细胞，并在改变培养基的pH之前和之后使用实时细胞分析(RTCA)比较效应细胞的细胞毒活性。
产生CAB-CAR效应T细胞
如实施例1中所述产生编码针对Axl(F1-2-15)的CAB-CAR的慢病毒颗粒和含有eTag(SEQ ID NO：78)但缺乏CAR(F1-0-01)的阴性对照(C1)。这些慢病毒颗粒如实施例1所述的用于转导Pan T细胞(AllCells)并使转导的T细胞扩增10至12天。将这些转导的T细胞冷冻保存，以在以后用作效应细胞。
pH改变细胞毒性测定
使用xCELLigence系统测量通过添加NaHCO3或NaOH在pH改变之前和之后转导的T细胞的细胞毒活性。简而言之，在实验前一天，将靶细胞(用构建体稳定转染以在细胞表面上表达Axl的CHO细胞(CHO-Axl细胞))以10000个细胞/孔接种到96孔E-板(ACEA；SanDiego，CA)中，其中是含有40mM HEPES和40mM PIPES，pH 6.7的X-VIVO 15培养基。将先前用含有编码F1-2-15或C1的核酸(分别为F1-2-15-VP和C1VP)的慢病毒颗粒转导的冷冻保存的效应细胞解冻并在含有100IU/mL IL-2的X-VIVO 15培养基(R&D Systems，Minneapolis，MN)中培养两天。在实验当天，将用F1-2-15-VP或C1VP转导的细胞洗涤并重悬于含有40mMHEPES和40mM PIPES，pH 6.7的X-VIVO15培养基中，然后以效应细胞/靶细胞比(E/T)为1：1加入实验孔中。
每5分钟测量在xCELLigence系统(ACEA)上测量的阻抗读数，并报告为细胞指数(CI)以定量细胞融合作为细胞增殖/细胞裂解的量度。加入效应细胞约3小时后，向孔中加入8μl 7.5％NaHCO3或14μl 0.5M NaOH，其中是含有40mM HEPES和40mM PIPES，pH 6.7的X-VIVO 15培养基，使pH从6.7增加至7.4。加入效应细胞后，阻抗读数持续大约20小时。如下计算特异性细胞溶解的百分比：((CI靶+C1VP转导的效应T细胞)-(CI靶+F1-2-15-VP转导的效应T细胞))/(CI靶+C1VP转导的效应T细胞)×100。
RTCA杀伤试验的HCl转换
使用xCELLigence系统测量通过添加HCl在pH改变之前和之后转导的T细胞的细胞毒活性。简而言之，在实验前一天，将CHO-Axl细胞以10000个细胞/孔接种到96孔E-平板中，其中是含有40mM HEPES和40mM PIPES，pH 7.4的X-VIVO 15培养基。将先前用C1VP或F1-2-15-VP转导的冷冻保存的效应细胞解冻并在含有100IU/mL IL-2的X-VIVO15培养基中培养两天。在实验当天，将用F1-2-15-VP或C1VP转导的细胞洗涤并重悬浮于含有40mM HEPES和40mM PIPES，pH 7.4的X-VIVO 15培养基中，然后以效应细胞/靶细胞比(E/T)为1：1加入实验孔中。
每5分钟进行阻抗读数并报告为细胞指数(CI)。加入效应细胞约3小时后，将8μl1MHCl加入孔中，其中是含有40mM HEPES和40mM PIPES，pH 7.4的X-VIVO 15培养基，使pH从7.4转换至6.7。加入效应细胞后，阻抗读数持续大约20小时。如下计算特异性细胞溶解的百分比((CI靶+C1VP转导的效应T细胞)-(CI靶+F1-2-15-VP转导的效应T细胞))/(CI靶C1VP)×100。
结果
能够在降低pH下具有增加的与活性同源抗原Ax1结合的CAB-CAR的细胞毒活性在pH 6.7和pH 7.4下进行比较。用含有编码F1-2-15的核酸(抗Axl CAB-CAR)的慢病毒颗粒转导的T细胞用于杀伤表达Axl的CHO细胞，然后增加pH以确定细胞毒活性是否可以受pH变化抑制。如图9A和9B所示，向活性CAR-T细胞的微环境中加入NaHCO3或NaOH以增加培养基的pH，抑制了表达CAB-CAR的T细胞的细胞毒活性。这些结果表明，表达活性CAB-CAR的T细胞可以杀伤靶表达细胞，然后通过增加微环境的pH可以抑制这种杀伤活性。
还测定了表达CAB-CAR的T细胞的细胞毒活性通过pH变化而活化的能力。如图9C所示，表达抗Axl CAB-CAR的T细胞对CHO-Axl细胞的细胞毒活性在pH 7.4时较低，并且通过加入HCl以降低微环境的pH而增加。
当使用F1-2-22(针对Axl的CAB-CAR)和F1-1-15(针对Ror2的CAB-CAR)重复这些实验时，获得了类似的结果。累积地，这些结果证明表达CAB-CAR的T细胞的细胞毒活性可以通过微环境中pH的变化来调节，如通过降低pH增加后的细胞毒活性和增加pH降低后的细胞毒活性两者。在该非限制性实例中，pH从pH 6.7增加和从7.4降低。
实施例5.碳酸氢盐施用可以增加小鼠肿瘤微环境的pH值。
以下实施例证明了体内肿瘤微环境的pH可以通过施用药理学试剂来调节。在该实施例中，药理学试剂是碳酸氢钠，肿瘤微环境是小鼠中的CHO异种移植肿瘤。该实例包括在体内和离体两者测量肿瘤微环境pH的两种方法。
大多数实体瘤的细胞外微环境是酸性的，pH通常在6.5和6.9之间。相反，正常组织pH是碱性的，pH通常在7.2和7.5之间。然而，直接测量肿瘤微环境的体内pH可能是困难的。幸运的是，组织蛋白酶的相对蛋白酶活性在较低pH下较高且在较高pH下较低。因此，肿瘤内组织蛋白酶活性的测量可以作为肿瘤微环境pH的替代指标。为了测量组织蛋白酶B，L，S，K，V和D的体内活性，使用近红外ProSense 750FAST探针(PerkinElmer)。为了进一步证实通过施用碳酸氢钠调节肿瘤微环境中的pH，用酚红处理切除的肿瘤并记录颜色。酚红是pH指示剂，其经历pH依赖性颜色转变。酚红钠盐广泛用于细胞培养基中以鉴定pH值。酚红溶液在pH6.4或更低时呈黄色，在pH 7.0附近呈橙色，在pH 7.4附近呈红色，且在pH 7.8以上呈紫色。
根据Institutional Animal Care and Use Committee批准的方案处理小鼠。在12-14周龄雌性NOD-PrkdcscidI12rgtm1/Begen(B-NSG)小鼠(Beijing Biocytogen Co.Ltd.)的后胁腹中建立皮下(sc)中国仓鼠卵巢(CHO)肿瘤异种移植物。简言之，将培养的CHO细胞(ATCC，Manassas，VA)在DPBS(Thermo Fisher)中洗涤，计数，重悬于冷DPBS中并与适当体积的Matrigel ECM(Corning；终浓度5mg/mL)混合，浓度为冰上1.5x106个细胞/200μl。
在注射之前使用标准批准的具有脱毛(Nair)的麻醉制备动物用于注射。将ECM中的200μl细胞悬浮液皮下注射到小鼠的后侧腹中。一旦肿瘤可触及，使用卡尺每周2次测量肿瘤。使用以下等式计算肿瘤体积：(最长直径*最短直径2)/2。当平均肿瘤体积达到200mm3时，将小鼠随机分配到各自的处理组。
在施用碳酸氢盐前两天，将B-NSG小鼠的饮用水从酸性改变为常规pH高压灭菌的纯净水。第二天，通过100μl尾静脉注射将750ProSense FAST探针施用于6只携带CHO-异种移植肿瘤的小鼠(4nmol ProSense 750FAST探针/100μl PBS)。另一组携带CHO-异种移植肿瘤的小鼠未经处理。第二天，施用碳酸氢钠，并使用Caliper IVIS Lumina XR进行用ProSense 750FAST探针处理的小鼠的成像。简言之，使用在O2载气中的3％O2 2L/min异氟烷以2L/min麻醉小鼠，然后在成像期间向鼻锥体提供1.5％异氟烷给麻醉的小鼠。图像采集包括对近红外探针(745/810nm激发/发射波长)的5秒曝光。将荧光图像覆盖在小鼠的正常光图像上。在施用PBS(对照)或碳酸氢钠之前获得时间0(处理前)图像。然后通过腹膜内注射(ip)向小鼠施用1ml/小鼠PBS(对照，ThermoFisher)或1ml/小鼠1M碳酸氢钠(ShanghaiExperiment Reagent Co.，LTD)。然后在施用PBS或碳酸氢盐后30分钟对小鼠成像。将收集的荧光图像调整为具有相同的最小值，最大值和阈值。在该研究中将光子计数定义为相对荧光单位(RFU)。通过将每个小鼠中30分钟时间点的光子计数标准化到处理前时间点(时间0；100％)来计算RFU。由于在处理前时间0时每只小鼠的荧光值之间的可变性，在不同时间点观察到的荧光强度值仅标准化为个体小鼠而不是平均处理前值。
在实验的单独臂中，在腹膜内施用PBS或碳酸氢钠后1.5小时，通过颈脱位使6只未接受NIR组织蛋白酶探针的小鼠安乐死。从每只小鼠切下CHO异种移植肿瘤。用手术刀将异种移植肿瘤分成两半并置于培养皿上。然后使用手术刀重复切割/切片肿瘤组织的一半。分别向每个肿瘤半滴加水或0.05％酚红溶液(50mg酚红/100ml水)。记录颜色，并且一旦移除肿瘤异种移植物样品，拍摄处理的肿瘤异种移植物和保留在培养皿上的酚红溶液的图像。
结果
图10显示了在施用PBS(对照；n＝3)或碳酸氢盐(n＝3)之前和之后，在携带CHO-异种移植肿瘤的小鼠中瘤内组织蛋白酶活性的RFU结果(平均值与SEM)。这些结果表明，施用碳酸氢钠可以增加体内肿瘤微环境的pH，如通过ip碳酸氢钠施用后观察到的组织蛋白酶活性降低所证明。
使用从碳酸氢钠处理的小鼠(n＝3)切除的肿瘤组织相对于PBS处理的小鼠(n＝3)观察到酚红指示剂从黄色/橙色到红色的颜色变化。这些结果支持在ip施用后所施用碳酸氢钠增加了体内肿瘤微环境的pH，如酚红指示剂从黄色/橙色到红色的颜色变化所证明。
实施例6.ROR2和AXL的CAB-CAR对体内肿瘤的靶向依赖性杀伤。
进行的实验证明在体外测定中具有针对Axl或Ror2表达细胞的条件细胞毒活性的CAB-CAR在体内具有针对Axl或Ror2表达肿瘤细胞的细胞毒活性。选择使用NSG或NOD Scidγ小鼠的异种移植物模型，其与抗人scFv靶标不反应，作为探测CAB-CAR的特异性和功效的机制。NSG是缺乏成熟T细胞，NK细胞和B细胞的小鼠品系，并且是迄今为止描述的免疫缺陷最多的品种之一。去除这些细胞组分对于使人外周血衍生的单核细胞能够在没有来自宿主的先天、体液或适应性免疫反应的情况下移植是必需的。通常仅在人体中进行放射或淋巴细胞化学治疗后才能实现稳态细胞因子的浓度，这是由于缺乏鼠细胞外常见γ链，这使得过继转移的人细胞能够接受这些细胞因子。同时，这些动物也可用于移植肿瘤异种移植物靶标以检查CAR杀伤靶向表达肿瘤的功效。虽然效应细胞产物中异种反应性T细胞受体抗原的存在最终会引起移植物抗宿主病，但这些模型能够对动物药理学和急性耐受性进行短期评估。
将稳定转染以表达人ROR2(CHO-ROR2)或人Axl(CHO-Axl)的亲本中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和转基因CHO细胞用于产生均一靶肿瘤以确定CAB-CAR效应细胞杀伤表达同源抗原的肿瘤的特异性和功效。由于所有3种细胞系具有相同的异种反应性人白细胞抗原(HLA)和其它非特异性抗原，因此可以检查CAB-CAR细胞对肿瘤微环境中肿瘤靶标的特异性，而不考虑供体淋巴细胞的HLA反应性的变化，并靶向肿瘤细胞。在与Matrigel人工基底膜组合皮下施用于NSG小鼠后，亲本和转基因CHO变体迅速生长，具有播散恶性。
根据制造商的说明，通过使用在Sepax 2 S-100装置上的CS-900.2试剂盒(BioSafe；1008)用Ficoll-PacqueTM(General Electric)进行密度梯度离心，在具有知情同意的情况下从健康志愿者的ACD-外周血中分离PBMC(Biosafe；14000)。将5.0×107个活的PBMC接种在1L G-Rex(Wilson-Wolf)中，用补充有100IU/ml(IL-2)(Novoprotein)，10ng/ml(IL-7)(Novoprotein)和50ng/ml抗CD3抗体(OKT3，Novoprotein)的Complete OpTmizerTMCTSTM T细胞扩增SFM将体积调至100ml，以活化PBMC用于病毒转导。在37℃和5％CO2温育过夜后，将编码如实施例1中所述制备的CAR构建体的慢病毒颗粒直接加入到活化的PBMC中，并在37℃和5％CO2下温育过夜。第二天，使用补充有10mM NAC的Complete OpTmizerTM CTSTMT细胞扩增SFM将每个G-Rex的培养基体积调至1L。另外，在第2天和之后每48小时向每个孔中加入100IU/ml的IL-2(Novoprotein)和10ng/ml的IL-7(Novoprotein)。在收获细胞之前，使细胞从原始血液收集(第0天)扩增至第12天。
为了检查针对ROR2的CAB-CAR，在冰上将12-14周龄的雌性NOD-PrkdcscidI12rgtm1/Begen(B-NSG)小鼠(Beijing Biocytogen Co.Ltd.)皮下接种在Matrigel ECM中浓度为1.5×106个细胞/200μl的亲本CHO细胞或CHO-ROR2细胞，如实施例5中所述。小鼠通过尾静脉注射使用上段提供的细胞处理方案制备的用含有编码F1-1-15(n＝6)或F1-0-01(n＝6)(参见实施例1和3的构建体细节)的核酸的慢病毒颗粒所转导的4×106个T细胞，或PBS(n＝6)而静脉注射(IV)给药，当肿瘤达到>200mm3时模拟重肿瘤负荷治疗。使用卡尺每周测量3次肿瘤，并使用以下等式计算肿瘤体积：(最长直径*最短直径2)/2。在第13天所有动物都达到肿瘤负荷的尸检指南。
为了检查针对AXL的CAB-CAR，在冰上将7-9周龄的雌性B-NSG小鼠皮下接种在Matrigel ECM中浓度为1.5×106个细胞/200μl的亲本CHO细胞或CHO-AXL细胞(终浓度5mg/ml)，如实施例5中所述。当肿瘤达到>100mm3时，开始进行效应细胞的IV或肿瘤内(IT)施用以模拟重肿瘤负荷治疗。第一组小鼠通过尾静脉注射使用上段提供的细胞处理方案制备的含有编码F1-2-15(n＝6)，F1-2-22(n＝6)或F1-0-01(n＝6)(参见实施例1和3的构建体细节)的核酸的慢病毒颗粒所转导的8×106个T细胞，或PBS(n＝6)而IV给药。第二组小鼠用含有编码F1-2-15(n＝6)，F1-2-22(n＝6)或F1-0-01(n＝6)的核酸的慢病毒颗粒所转导的8×106个T细胞，或PBS(n＝6)IT给药。第三组小鼠通过尾静脉注射用含有编码F1-2-15(n＝6)，F1-2-22(n＝6)或F1-0-01(n＝6)的核酸的慢病毒颗粒所转导的8×106个T细胞，或用PBS(n＝6)而IV给药，并且小鼠在前3天每天在远离肿瘤的对侧皮下部位接受皮下注射IL-2(50KIU)。使用卡尺每周测量3次肿瘤，并使用以下等式计算肿瘤体积：(最长直径*最短直径2)/2。所有动物均被实施为与肿瘤负荷的尸检指南一致。
结果
使用表达Ror2，Axl或两者的移植肿瘤细胞在小鼠模型中测试实施例1中公开的一些代表性CAB-CAR的体内肿瘤细胞杀伤活性。关于抗Ror2 CAB-CAR，如图11A所示，与PBS对照或仅E-Tag的慢病毒转导的T细胞相比，用含有编码F1-1-15的核酸的慢病毒颗粒转导的4×106个T细胞IV给药小鼠对ROR2阴性肿瘤生长没有影响(F1-0-01)。相反，如图11B所示，将相同细胞制剂IV给药人Ror2表达肿瘤显示出F1-1-15对仅Ror2阳性肿瘤的显著肿瘤抑制。这些数据表明肿瘤微环境在该移植的肿瘤小鼠模型中在体内复制，并且表达本文提供的示例性抗Ror2 CAB-CAR的遗传修饰的T细胞能够进入实体瘤并且在体内驱动靶细胞杀伤，尽管靶移植肿瘤细胞具有快速倍增时间。
关于抗Axl CAB-CAR，如图12A所示，与PBS对照或仅E-Tag的慢病毒转导的T细胞相比，用含有编码F1-2-15或F1-2-22的核酸的慢病毒颗粒转导的8×106个T细胞肿瘤内(IT)给药小鼠对Axl阴性肿瘤生长没有影响。相反，如图12所示，将相同细胞制剂IT给药表达人Axl的肿瘤显示出F1-2-15和F1-2-22对Axl阳性肿瘤的显著肿瘤抑制。虽然与表达F1-1-15的细胞杀伤表达Ror2的肿瘤的能力相比，表达F1-2-15或F1-2-22的细胞在表达Axl的肿瘤的体外杀伤试验中是等效的，IV给药后与局部注射相比下体内肿瘤生长抑制随时间不是持续的(图13A对照与图13B对比)。与没有IL-2的IV给药相比，将全身性IL-2施用于动物3天(图14A对照与图14B)导致改善的抗肿瘤活性。这些数据表明肿瘤微环境在该移植的肿瘤小鼠模型中再次在体内复制，并且表达示例性抗Ror2 CAB-CAR F1-2-15和F1-2-22的遗传修饰的T细胞能够进入实体瘤并且在体内驱动靶细胞杀伤，尽管靶移植肿瘤细胞具有快速倍增时间。此外，使用本文提供的示例性抗Ror2和抗Axl CAB-CAR的这些实验证明，这种CAB-CAR在活化表达这些CAB-CAR的T细胞的体内方法中是有效的。
本领域技术人员可以在本公开的范围和精神内设计出许多修改和其它实施例。实际上，本领域技术人员可以在不改变本公开的基本方面的情况下对所描述的材料、方法、附图、实验、示例和实施方式进行变化。任何公开的实施方式可以与任何其它公开的实施方式组合使用。
在一些情况下，已经参考特定实施方式描述了一些概念。然而，本领域普通技术人员认识到，在不脱离如下面的权利要求所阐述的本发明的范围的情况下，可以进行各种修改和改变。因此，说明书和附图应被视为说明性的而非限制性的，并且所有这些修改旨在包括在本发明的范围内。
表3.SEQ ID NO的序列。
序列表
<110> F1肿瘤医学公司
<120> 针对AXL或ROR2的嵌合抗原受体及其使用方法
<130> F1.002.WO.01
<150> 62/447,898
<151> 2017-01-18
<150> 62/467,059
<151> 2017-03-03
<150> 62/530,193
<151> 2017-07-08
<160> 161
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD137共刺激结构域
<400> 1
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 2
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD28共刺激结构域
<400> 2
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 3
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的ICΔ共刺激结构域
<400> 3
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Ala Tyr Ala Ala
20 25 30
Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 4
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的ICOS共刺激结构域
<400> 4
Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr
1 5 10 15
Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg Leu Thr Asp
20 25 30
Val Thr Leu
35
<210> 5
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的OX40共刺激结构域
<400> 5
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
20 25 30
Thr Leu Ala Lys Ile
35
<210> 6
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD27共刺激结构域
<400> 6
His Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu
1 5 10 15
Pro Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser
20 25 30
Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser
35 40 45
Pro
<210> 7
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的BLTA共刺激结构域
<400> 7
Cys Cys Leu Arg Arg His Gln Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr
1 5 10 15
Ala Gly Arg Glu Ile Asn Leu Val Asp Ala His Leu Lys Ser Glu Gln
20 25 30
Thr Glu Ala Ser Thr Arg Gln Asn Ser Gln Val Leu Leu Ser Glu Thr
35 40 45
Gly Ile Tyr Asp Asn Asp Pro Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln Glu Gly
50 55 60
Ser Glu Val Tyr Ser Asn Pro Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly Ile
65 70 75 80
Val Tyr Ala Ser Leu Asn His Ser Val Ile Gly Pro Asn Ser Arg Leu
85 90 95
Ala Arg Asn Val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val
100 105 110
Arg Ser
<210> 8
<211> 187
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD30共刺激结构域
<400> 8
Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln Lys Leu His Leu Cys Tyr
1 5 10 15
Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg Pro
20 25 30
Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu Pro
35 40 45
Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln Pro Leu Met Glu Thr Cys
50 55 60
His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp Ala
65 70 75 80
Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro Arg
85 90 95
Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile Met
100 105 110
Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro Glu
115 120 125
Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu Leu
130 135 140
Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro Pro
145 150 155 160
Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly Lys
165 170 175
Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys
180 185
<210> 9
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的GITR共刺激结构域
<400> 9
His Ile Trp Gln Leu Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro Arg Glu Thr Gln
1 5 10 15
Leu Leu Leu Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Arg Ser Cys Gln
20 25 30
Phe Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys Gly Arg
35 40 45
Leu Gly Asp Leu Trp Val
50
<210> 10
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的HVEM共刺激结构域
<400> 10
Cys Val Lys Arg Arg Lys Pro Arg Gly Asp Val Val Lys Val Ile Val
1 5 10 15
Ser Val Gln Arg Lys Arg Gln Glu Ala Glu Gly Glu Ala Thr Val Ile
20 25 30
Glu Ala Leu Gln Ala Pro Pro Asp Val Thr Thr Val Ala Val Glu Glu
35 40 45
Thr Ile Pro Ser Phe Thr Gly Arg Ser Pro Asn His
50 55 60
<210> 11
<211> 163
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD3Z同种型1活化结构域
<400> 11
Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu
1 5 10 15
Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys
20 25 30
Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala
35 40 45
Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
50 55 60
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
65 70 75 80
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
85 90 95
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
100 105 110
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
115 120 125
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
130 135 140
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
145 150 155 160
Pro Pro Arg
<210> 12
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD3Z同种型2活化结构域
<400> 12
Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu
1 5 10 15
Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys
20 25 30
Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala
35 40 45
Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
50 55 60
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
65 70 75 80
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
85 90 95
Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
100 105 110
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
115 120 125
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
130 135 140
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
145 150 155 160
Leu Pro Pro Arg
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD3Z 3活化结构域
<400> 13
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 14
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD3Z 4活化结构域
<400> 14
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
1 5 10 15
Val Leu Asp Lys Arg
20
<210> 15
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD3Z 5活化结构域
<400> 15
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
1 5 10 15
Ser Glu Ile Gly Met Lys
20
<210> 16
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD3Z 6活化结构域
<400> 16
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
1 5 10 15
Ala Leu His Met Gln
20
<210> 17
<211> 171
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD3D 1活化结构域
<400> 17
Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu
1 5 10 15
Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg
20 25 30
Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val
35 40 45
Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile
50 55 60
Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys
65 70 75 80
Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys
85 90 95
Val Glu Leu Asp Pro Ala Thr Val Ala Gly Ile Ile Val Thr Asp Val
100 105 110
Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Phe Cys Phe Ala Gly His
115 120 125
Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu Leu Arg
130 135 140
Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr
145 150 155 160
Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys
165 170
<210> 18
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD3D 2活化结构域
<400> 18
Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu
1 5 10 15
Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg
20 25 30
Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val
35 40 45
Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile
50 55 60
Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys
65 70 75 80
Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Thr Ala Asp Thr Gln
85 90 95
Ala Leu Leu Arg Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp
100 105 110
Asp Ala Gln Tyr Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys
115 120 125
<210> 19
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD3D 3活化结构域
<400> 19
Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr Ser
1 5 10 15
His Leu Gly Gly Asn
20
<210> 20
<211> 206
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD3E 1活化结构域
<400> 20
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys
50 55 60
Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp
65 70 75 80
His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr
85 90 95
Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu
100 105 110
Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Met Ser
115 120 125
Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu Leu
130 135 140
Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro
145 150 155 160
Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys
165 170 175
Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys
180 185 190
Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195 200 205
<210> 21
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD3E 2活化结构域
<400> 21
Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser
1 5 10 15
Gly Leu Asn Gln Arg
20
<210> 22
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD3G 1活化结构域
<400> 22
Met Glu Gln Gly Lys Gly Leu Ala Val Leu Ile Leu Ala Ile Ile Leu
1 5 10 15
Leu Gln Gly Thr Leu Ala Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys
20 25 30
Val Tyr Asp Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala
35 40 45
Glu Ala Lys Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe
50 55 60
Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp
65 70 75 80
Pro Arg Gly Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro
85 90 95
Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala
100 105 110
Ala Thr Ile Ser Gly Phe Leu Phe Ala Glu Ile Val Ser Ile Phe Val
115 120 125
Leu Ala Val Gly Val Tyr Phe Ile Ala Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln
130 135 140
Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr
145 150 155 160
Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly
165 170 175
Asn Gln Leu Arg Arg Asn
180
<210> 23
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD3G 2活化结构域
<400> 23
Asp Gln Leu Tyr Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Ser
1 5 10 15
His Leu Gln Gly Asn
20
<210> 24
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD79A 1活化结构域
<400> 24
Met Pro Gly Gly Pro Gly Val Leu Gln Ala Leu Pro Ala Thr Ile Phe
1 5 10 15
Leu Leu Phe Leu Leu Ser Ala Val Tyr Leu Gly Pro Gly Cys Gln Ala
20 25 30
Leu Trp Met His Lys Val Pro Ala Ser Leu Met Val Ser Leu Gly Glu
35 40 45
Asp Ala His Phe Gln Cys Pro His Asn Ser Ser Asn Asn Ala Asn Val
50 55 60
Thr Trp Trp Arg Val Leu His Gly Asn Tyr Thr Trp Pro Pro Glu Phe
65 70 75 80
Leu Gly Pro Gly Glu Asp Pro Asn Gly Thr Leu Ile Ile Gln Asn Val
85 90 95
Asn Lys Ser His Gly Gly Ile Tyr Val Cys Arg Val Gln Glu Gly Asn
100 105 110
Glu Ser Tyr Gln Gln Ser Cys Gly Thr Tyr Leu Arg Val Arg Gln Pro
115 120 125
Pro Pro Arg Pro Phe Leu Asp Met Gly Glu Gly Thr Lys Asn Arg Ile
130 135 140
Ile Thr Ala Glu Gly Ile Ile Leu Leu Phe Cys Ala Val Val Pro Gly
145 150 155 160
Thr Leu Leu Leu Phe Arg Lys Arg Trp Gln Asn Glu Lys Leu Gly Leu
165 170 175
Asp Ala Gly Asp Glu Tyr Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn
180 185 190
Leu Asp Asp Cys Ser Met Tyr Glu Asp Ile Ser Arg Gly Leu Gln Gly
195 200 205
Thr Tyr Gln Asp Val Gly Ser Leu Asn Ile Gly Asp Val Gln Leu Glu
210 215 220
Lys Pro
225
<210> 25
<211> 188
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD79A 2活化结构域
<400> 25
Met Pro Gly Gly Pro Gly Val Leu Gln Ala Leu Pro Ala Thr Ile Phe
1 5 10 15
Leu Leu Phe Leu Leu Ser Ala Val Tyr Leu Gly Pro Gly Cys Gln Ala
20 25 30
Leu Trp Met His Lys Val Pro Ala Ser Leu Met Val Ser Leu Gly Glu
35 40 45
Asp Ala His Phe Gln Cys Pro His Asn Ser Ser Asn Asn Ala Asn Val
50 55 60
Thr Trp Trp Arg Val Leu His Gly Asn Tyr Thr Trp Pro Pro Glu Phe
65 70 75 80
Leu Gly Pro Gly Glu Asp Pro Asn Glu Pro Pro Pro Arg Pro Phe Leu
85 90 95
Asp Met Gly Glu Gly Thr Lys Asn Arg Ile Ile Thr Ala Glu Gly Ile
100 105 110
Ile Leu Leu Phe Cys Ala Val Val Pro Gly Thr Leu Leu Leu Phe Arg
115 120 125
Lys Arg Trp Gln Asn Glu Lys Leu Gly Leu Asp Ala Gly Asp Glu Tyr
130 135 140
Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn Leu Asp Asp Cys Ser Met
145 150 155 160
Tyr Glu Asp Ile Ser Arg Gly Leu Gln Gly Thr Tyr Gln Asp Val Gly
165 170 175
Ser Leu Asn Ile Gly Asp Val Gln Leu Glu Lys Pro
180 185
<210> 26
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD79A 3活化结构域
<400> 26
Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn Leu Asp Asp Cys Ser Met Tyr Glu
1 5 10 15
Asp Ile Ser Arg Gly
20
<210> 27
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的DAP12 1活化结构域
<400> 27
Met Gly Gly Leu Glu Pro Cys Ser Arg Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ala Val Ser Gly Leu Arg Pro Val Gln Ala Gln Ala Gln Ser Asp
20 25 30
Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met
35 40 45
Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu Ala Val Tyr Phe Leu
50 55 60
Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg
65 70 75 80
Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly
85 90 95
Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr
100 105 110
Lys
<210> 28
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的DAP12 2活化结构域
<400> 28
Met Gly Gly Leu Glu Pro Cys Ser Arg Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ala Val Ser Gly Leu Arg Pro Val Gln Ala Gln Ala Gln Ser Asp
20 25 30
Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met
35 40 45
Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu Ala Val Tyr Phe Leu
50 55 60
Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Thr Arg Lys
65 70 75 80
Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly Gln
85 90 95
Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln
100 105
<210> 29
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的DAP12 3活化结构域
<400> 29
Met Gly Gly Leu Glu Pro Cys Ser Arg Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ala Val Ser Asp Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu
20 25 30
Ala Gly Ile Val Met Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu
35 40 45
Ala Val Tyr Phe Leu Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala
50 55 60
Glu Ala Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr
65 70 75 80
Gln Glu Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr
85 90 95
Gln Arg Pro Tyr Tyr Lys
100
<210> 30
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的DAP12 4活化结构域
<400> 30
Met Gly Gly Leu Glu Pro Cys Ser Arg Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ala Val Ser Asp Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu
20 25 30
Ala Gly Ile Val Met Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu
35 40 45
Ala Val Tyr Phe Leu Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala
50 55 60
Glu Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln
65 70 75 80
Glu Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln
85 90 95
Arg Pro Tyr Tyr Lys
100
<210> 31
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的DAP12 5活化结构域
<400> 31
Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser
1 5 10 15
Asp Leu Asn Thr Gln
20
<210> 32
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的FCERlG 1活化结构域
<400> 32
Met Ile Pro Ala Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Glu Gln Ala
1 5 10 15
Ala Ala Leu Gly Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu Asp Ala Ile Leu
20 25 30
Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu Tyr Cys Arg Leu Lys Ile
35 40 45
Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser Asp Gly Val
50 55 60
Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys
65 70 75 80
His Glu Lys Pro Pro Gln
85
<210> 33
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的FCERlG 2活化结构域
<400> 33
Asp Gly Val Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Lys His Glu
20
<210> 34
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的DAP10活化结构域
<400> 34
Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met
1 5 10 15
Pro Gly Arg Gly
20
<210> 35
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD28活化结构域
<400> 35
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
20 25 30
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
35 40 45
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
50 55 60
Ala Tyr Arg Ser
65
<210> 36
<211> 619
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的ZAP70活化结构域
<400> 36
Met Pro Asp Pro Ala Ala His Leu Pro Phe Phe Tyr Gly Ser Ile Ser
1 5 10 15
Arg Ala Glu Ala Glu Glu His Leu Lys Leu Ala Gly Met Ala Asp Gly
20 25 30
Leu Phe Leu Leu Arg Gln Cys Leu Arg Ser Leu Gly Gly Tyr Val Leu
35 40 45
Ser Leu Val His Asp Val Arg Phe His His Phe Pro Ile Glu Arg Gln
50 55 60
Leu Asn Gly Thr Tyr Ala Ile Ala Gly Gly Lys Ala His Cys Gly Pro
65 70 75 80
Ala Glu Leu Cys Glu Phe Tyr Ser Arg Asp Pro Asp Gly Leu Pro Cys
85 90 95
Asn Leu Arg Lys Pro Cys Asn Arg Pro Ser Gly Leu Glu Pro Gln Pro
100 105 110
Gly Val Phe Asp Cys Leu Arg Asp Ala Met Val Arg Asp Tyr Val Arg
115 120 125
Gln Thr Trp Lys Leu Glu Gly Glu Ala Leu Glu Gln Ala Ile Ile Ser
130 135 140
Gln Ala Pro Gln Val Glu Lys Leu Ile Ala Thr Thr Ala His Glu Arg
145 150 155 160
Met Pro Trp Tyr His Ser Ser Leu Thr Arg Glu Glu Ala Glu Arg Lys
165 170 175
Leu Tyr Ser Gly Ala Gln Thr Asp Gly Lys Phe Leu Leu Arg Pro Arg
180 185 190
Lys Glu Gln Gly Thr Tyr Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Gly Lys Thr Val
195 200 205
Tyr His Tyr Leu Ile Ser Gln Asp Lys Ala Gly Lys Tyr Cys Ile Pro
210 215 220
Glu Gly Thr Lys Phe Asp Thr Leu Trp Gln Leu Val Glu Tyr Leu Lys
225 230 235 240
Leu Lys Ala Asp Gly Leu Ile Tyr Cys Leu Lys Glu Ala Cys Pro Asn
245 250 255
Ser Ser Ala Ser Asn Ala Ser Gly Ala Ala Ala Pro Thr Leu Pro Ala
260 265 270
His Pro Ser Thr Leu Thr His Pro Gln Arg Arg Ile Asp Thr Leu Asn
275 280 285
Ser Asp Gly Tyr Thr Pro Glu Pro Ala Arg Ile Thr Ser Pro Asp Lys
290 295 300
Pro Arg Pro Met Pro Met Asp Thr Ser Val Tyr Glu Ser Pro Tyr Ser
305 310 315 320
Asp Pro Glu Glu Leu Lys Asp Lys Lys Leu Phe Leu Lys Arg Asp Asn
325 330 335
Leu Leu Ile Ala Asp Ile Glu Leu Gly Cys Gly Asn Phe Gly Ser Val
340 345 350
Arg Gln Gly Val Tyr Arg Met Arg Lys Lys Gln Ile Asp Val Ala Ile
355 360 365
Lys Val Leu Lys Gln Gly Thr Glu Lys Ala Asp Thr Glu Glu Met Met
370 375 380
Arg Glu Ala Gln Ile Met His Gln Leu Asp Asn Pro Tyr Ile Val Arg
385 390 395 400
Leu Ile Gly Val Cys Gln Ala Glu Ala Leu Met Leu Val Met Glu Met
405 410 415
Ala Gly Gly Gly Pro Leu His Lys Phe Leu Val Gly Lys Arg Glu Glu
420 425 430
Ile Pro Val Ser Asn Val Ala Glu Leu Leu His Gln Val Ser Met Gly
435 440 445
Met Lys Tyr Leu Glu Glu Lys Asn Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala
450 455 460
Arg Asn Val Leu Leu Val Asn Arg His Tyr Ala Lys Ile Ser Asp Phe
465 470 475 480
Gly Leu Ser Lys Ala Leu Gly Ala Asp Asp Ser Tyr Tyr Thr Ala Arg
485 490 495
Ser Ala Gly Lys Trp Pro Leu Lys Trp Tyr Ala Pro Glu Cys Ile Asn
500 505 510
Phe Arg Lys Phe Ser Ser Arg Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr
515 520 525
Met Trp Glu Ala Leu Ser Tyr Gly Gln Lys Pro Tyr Lys Lys Met Lys
530 535 540
Gly Pro Glu Val Met Ala Phe Ile Glu Gln Gly Lys Arg Met Glu Cys
545 550 555 560
Pro Pro Glu Cys Pro Pro Glu Leu Tyr Ala Leu Met Ser Asp Cys Trp
565 570 575
Ile Tyr Lys Trp Glu Asp Arg Pro Asp Phe Leu Thr Val Glu Gln Arg
580 585 590
Met Arg Ala Cys Tyr Tyr Ser Leu Ala Ser Lys Val Glu Gly Pro Pro
595 600 605
Gly Ser Thr Gln Lys Ala Glu Ala Ala Cys Ala
610 615
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的HA表位
<400> 37
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的FLAG表位
<400> 38
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的c-myc表位
<400> 39
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的His5亲合体
<400> 40
His His His His His
1 5
<210> 41
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的HisX6亲合体
<400> 41
His His His His His His
1 5
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Strep Tag亲合体
<400> 42
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的RYIRS亲合体
<400> 43
Arg Tyr Ile Arg Ser
1 5
<210> 44
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的FHHT亲合体
<400> 44
Phe His His Thr
1
<210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的亲合体
<400> 45
Trp Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Cys Cys Arg Glu Cys Cys Ala Arg
1 5 10 15
Ala
<210> 46
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD8α跨膜结构域
<400> 46
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 47
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD8β跨膜结构域
<400> 47
Leu Gly Leu Leu Val Ala Gly Val Leu Val Leu Leu Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Val Ala Ile His Leu Cys Cys
20
<210> 48
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD4跨膜结构域
<400> 48
Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly
1 5 10 15
Leu Gly Ile Phe Phe Cys Val Arg Cys
20 25
<210> 49
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD3ζ跨膜结构域
<400> 49
Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu
1 5 10 15
Thr Ala Leu Phe Leu Arg Val
20
<210> 50
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD28跨膜结构域
<400> 50
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 51
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的OX40跨膜结构域
<400> 51
Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu Gly Pro
1 5 10 15
Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu
20 25
<210> 52
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD7 跨膜结构域
<400> 52
Ala Leu Pro Ala Ala Leu Ala Val Ile Ser Phe Leu Leu Gly Leu Gly
1 5 10 15
Leu Gly Val Ala Cys Val Leu Ala
20
<210> 53
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的接头1
<400> 53
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 54
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的接头2
<400> 54
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 55
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的接头3
<400> 55
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 56
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的接头4
<400> 56
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 57
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的接头5
<400> 57
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 58
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的接头6
<400> 58
Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 59
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的接头7
<400> 59
Gly Ser Gly Gly Gly
1 5
<210> 60
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的接头8
<400> 60
Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 61
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的接头9
<400> 61
Gly Ser Ser Ser Gly
1 5
<210> 62
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的铰链1
<400> 62
Cys Pro Pro Cys
1
<210> 63
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的铰链2
<400> 63
Asp Lys Thr His Thr
1 5
<210> 64
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的铰链3
<400> 64
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
1 5 10 15
<210> 65
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的铰链4
<400> 65
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr
1 5 10
<210> 66
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的铰链5
<400> 66
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1 5 10
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的铰链6
<400> 67
Lys Cys Cys Val Asp Cys Pro
1 5
<210> 68
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的铰链7
<400> 68
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 69
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的铰链8
<400> 69
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 70
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的铰链9
<400> 70
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 71
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的铰链10
<400> 71
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys
1 5 10 15
Pro
<210> 72
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的铰链11
<400> 72
Ser Pro Asn Met Val Pro His Ala His His Ala Gln
1 5 10
<210> 73
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的铰链12
<400> 73
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 74
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD8信号肽
<400> 74
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 75
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD8茎-TM
<400> 75
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys
65
<210> 76
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD28茎-TM
<400> 76
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val
65
<210> 77
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的2A-1切割信号
<400> 77
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 78
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的eTAG消除结构域
<400> 78
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
325 330 335
Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
340 345 350
Ile Gly Leu Phe Met
355
<210> 79
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Axl 4007V VH 条件活性scFv
<400> 79
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Trp Gly Ala
20 25 30
Thr Met Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala His Gly His Tyr Glu Ser Tyr Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 80
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Axl 4007V VL 条件活性scFv
<400> 80
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Val Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Gln Asp Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu His Phe Ser Pro Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 81
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 VL 4 条件活性scFv
<400> 81
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 82
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 R98H VH 条件活性scFv
<400> 82
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Lys Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser His Phe Glu Gly Val Trp Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 83
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 Y33E VH 条件活性scFv
<400> 83
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Gly
20 25 30
Glu Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Lys Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Phe Glu Gly Val Trp Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 84
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 VL 条件活性scFv
<400> 84
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Arg Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Tyr Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 85
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 L3 4 条件活性scFv
<220>
<221> X是T, I或P
<222> (3)..(3)
<220>
<221> X是E或V
<222> (5)..(5)
<220>
<221> X是F或T
<222> (8)..(8)
<220>
<221> X是F或T
<222> (10)..(10)
<400> 85
Gln Gln Xaa Asn Xaa Asp Pro Xaa Thr Xaa
1 5 10
<210> 86
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 VL 5 条件活性scFv
<400> 86
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Arg Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Tyr Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Thr Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 87
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Axl H1 1 条件活性scFv
<220>
<221> X是T或W
<222> (1)..(1)
<220>
<221> X是H或A
<222> (3)..(3)
<400> 87
Xaa Gly Xaa Thr Met Asn
1 5
<210> 88
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Axl H2 1 条件活性scFv
<400> 88
Leu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 89
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Axl H31 条件活性scFv
<220>
<221> X是H或D
<222> (2)..(2)
<220>
<221> X是E或H
<222> (4)..(4)
<220>
<221> X是E或F
<222> (7)..(7)
<400> 89
Gly Xaa Tyr Xaa Ser Tyr Xaa Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 90
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Axl L1 1 条件活性scFv
<220>
<221> X是S或V
<222> (7)..(7)
<400> 90
Lys Ala Ser Gln Asp Val Xaa Ser Ala Val Ala
1 5 10
<210> 91
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Axl L2 1 条件活性scFv
<220>
<221> X是A或Q
<222> (2)..(2)
<220>
<221> X是S或D
<222> (3)..(3)
<220>
<221> X是H或D
<222> (6)..(6)
<400> 91
Trp Xaa Xaa Thr Arg Xaa Thr
1 5
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Axl L3 1 条件活性scFv
<220>
<221> X是T或P
<222> (6)..(6)
<220>
<221> X是T或R
<222> (9)..(9)
<400> 92
Gln Glu His Phe Ser Xaa Pro Leu Xaa
1 5
<210> 93
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Axl WT VH 条件活性scFv
<400> 93
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His
20 25 30
Thr Met Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala His Gly His Tyr Glu Ser Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 94
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Axl WT VL 条件活性scFv
<400> 94
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu His Phe Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 95
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 H1 1 条件活性scFv
<220>
<221> X是F或E
<222> (4)..(4)
<220>
<221> X是Y或D
<222> (7)..(7)
<220>
<221> X是M或D
<222> (9)..(9)
<400> 95
Gly Tyr Thr Xaa Thr Glu Xaa Thr Xaa His
1 5 10
<210> 96
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 H1 2 条件活性scFv
<220>
<221> X是T或S
<222> (1)..(1)
<400> 96
Xaa Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Gly Tyr Tyr Trp Asn
1 5 10
<210> 97
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 H1 2 条件活性scFv
<220>
<221> X是E或I
<222> (2)..(2)
<220>
<221> X是T或D
<222> (4)..(4)
<400> 97
Gly Xaa Asn Xaa Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 98
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 H2 2 条件活性scFv
<400> 98
Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Lys Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn
1 5 10 15
<210> 99
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 H3 1 条件活性scFv
<400> 99
Gly Ser Leu Tyr Ser Tyr Gly Asn Ser Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 100
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 H3 2 条件活性scFv
<220>
<221> X是Y或G
<222> (6)..(6)
<400> 100
Phe Glu Gly Val Trp Xaa Gly Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 101
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 L1 1 条件活性scFv
<220>
<221> X是E或V
<222> (6)..(6)
<400> 101
Ser Ala Thr Ser Ser Xaa Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 102
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 L1 2 条件活性scFv
<400> 102
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Arg Tyr Gly Asn Ser Phe Ile His
1 5 10 15
<210> 103
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 L2 1 条件活性scFv
<220>
<221> X是G或H
<222> (1)..(1)
<400> 103
Xaa Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 104
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 L2 2 条件活性scFv
<400> 104
Arg Thr Tyr Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 105
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 L3 1 条件活性scFv
<400> 105
Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 106
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 L3 2 条件活性scFv
<400> 106
Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Trp Thr
1 5
<210> 107
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 WT VH 条件活性scFv
<400> 107
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Lys Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Phe Glu Gly Val Trp Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 108
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Axl VL 1 条件活性scFv
<400> 108
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Val Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Gln Asp Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser
50 55 60
<210> 109
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Axl VL 2 条件活性scFv
<400> 109
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Gln Asp Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser
50 55 60
<210> 110
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Axl VL 3 条件活性scFv
<400> 110
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Val Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Gln Asp Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser
50 55 60
<210> 111
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Axl VL 4 条件活性scFv
<400> 111
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Val Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Gln Asp Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser
50 55 60
<210> 112
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Axl VH 1 条件活性scFv
<400> 112
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Ala
20 25 30
Thr Met Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala His Gly His Tyr Glu Ser Tyr Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 113
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Axl VH 2 条件活性scFv
<400> 113
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Trp Gly Ala
20 25 30
Thr Met Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala His Gly His Tyr Glu Ser Tyr Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 114
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Axl VH 3 条件活性scFv
<400> 114
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His
20 25 30
Thr Met Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala His Gly His Tyr Glu Ser Tyr Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 115
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 VH 1 条件活性scFv
<400> 115
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Met Lys Gln Ser His Arg Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Thr Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Leu Tyr Ser Tyr Gly Asn Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 116
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 VH 1 条件活性scFv
<400> 116
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Glu Thr Glu Asp
20 25 30
Thr Asp His Trp Met Lys Gln Ser His Arg Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Glu Asn Asp Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala His Gly Ser Leu Tyr Ser Tyr Gly Asn Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 117
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 VH 3 条件活性scFv
<400> 117
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Thr Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala His Gly Ser Leu Tyr Ser Tyr Gly Asn Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 118
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 VH 4 条件活性scFv
<400> 118
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Thr Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala His Gly Ser Leu Tyr Ser Tyr Gly Asn Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 119
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 VH 5 条件活性scFv
<400> 119
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Thr Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala His Gly Ser Leu Tyr Ser Tyr Gly Asn Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 120
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 VH 6 条件活性scFv
<400> 120
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Ala Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Lys Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Lys Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Phe Glu Gly Val Trp Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 121
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 VH 7 条件活性scFv
<400> 121
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Ala Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Lys Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Lys Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser His Phe Glu Gly Val Trp Gly Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 122
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 VL 1 条件活性scFv
<400> 122
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 123
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 VL 2 条件活性scFv
<400> 123
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Glu Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
His Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 124
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 VL 3 条件活性scFv
<400> 124
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 125
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的野生型CD8茎
<400> 125
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
35 40
<210> 126
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的野生型CD28茎
<400> 126
Phe Cys Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu
1 5 10 15
Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro
20 25 30
Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35 40
<210> 127
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的CD3Z 7活化结构域
<400> 127
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 128
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的来自F1-2-15的scFv
<400> 128
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Trp Gly Ala
20 25 30
Thr Met Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala His Gly His Tyr Glu Ser Tyr Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
130 135 140
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser
145 150 155 160
Gln Asp Val Val Ser Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
165 170 175
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Gln Asp Thr Arg His Thr Gly Val
180 185 190
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu
210 215 220
His Phe Ser Pro Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
225 230 235 240
Lys
<210> 129
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的来自F1-2-13的scFv
<400> 129
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Trp Gly Ala
20 25 30
Thr Met Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala His Gly His Tyr Glu Ser Tyr Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala
145 150 155 160
Ser Gln Asp Val Val Ser Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Gln Asp Thr Arg His Thr Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Glu His Phe Ser Pro Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Ile Lys
<210> 130
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的来自F1-1-19的scFv
<400> 130
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Gly
20 25 30
Glu Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Lys Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Phe Glu Gly Val Trp Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
145 150 155 160
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu
165 170 175
Ser Val Asp Arg Tyr Gly Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys
180 185 190
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Tyr Asn Leu Glu
195 200 205
Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe
210 215 220
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
245 250 255
Val Glu Ile Lys
260
<210> 131
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的来自F1-1-23的scFv
<400> 131
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Arg Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Tyr Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
130 135 140
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser
145 150 155 160
Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Gly Glu Tyr Trp
165 170 175
Asn Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly Tyr
180 185 190
Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Lys Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg
195 200 205
Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu
210 215 220
Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Phe
225 230 235 240
Glu Gly Val Trp Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
245 250 255
Thr Val Ser Ser
260
<210> 132
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的来自F1-1-15的scFv
<400> 132
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Arg Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Tyr Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
130 135 140
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser
145 150 155 160
Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Gly Tyr Tyr Trp
165 170 175
Asn Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly Tyr
180 185 190
Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Lys Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg
195 200 205
Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu
210 215 220
Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser His Phe
225 230 235 240
Glu Gly Val Trp Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
245 250 255
Thr Val Ser Ser
260
<210> 133
<211> 83
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的ICΔ CD137双共刺激结构域
<400> 133
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Ala Tyr Ala Ala
20 25 30
Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
35 40 45
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
50 55 60
Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
65 70 75 80
Cys Glu Leu
<210> 134
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Axl H1 2 条件活性scFv
<220>
<221> X是T, A或W
<222> (1)..(1)
<220>
<221> X是H或A
<222> (3)..(3)
<220>
<221> X是T或I
<222> (4)..(4)
<220>
<221> X是N或I
<222> (6)..(6)
<400> 134
Xaa Gly Xaa Xaa Met Xaa
1 5
<210> 135
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Axl H1 2 条件活性scFv
<220>
<221> X是P或N
<222> (4)..(4)
<220>
<221> X是S, I或T
<222> (10)..(10)
<400> 135
Leu Ile Lys Xaa Ser Asn Gly Gly Thr Xaa Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 136
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Axl H3 2 条件活性scFv
<220>
<221> X是H, D, E, P, R或W
<222> (2)..(2)
<220>
<221> X是Y或N
<222> (3)..(3)
<220>
<221> X是E, A, D, F, G, H, I, L, M, N, R, V或Y
<222> (4)..(4)
<220>
<221> X是S, D, M, N或Q
<222> (5)..(5)
<220>
<221> X是Y, C, E或P
<222> (6)..(6)
<220>
<221> X是F, E, N, S, T或V
<222> (7)..(7)
<220>
<221> X是A, D, G, L或Y
<222> (8)..(8)
<220>
<221> X是M, E或F
<222> (9)..(9)
<220>
<221> X是W, A, D, H, L, N, P, R或T
<222> (12)..(12)
<220>
<221> X是G或H
<222> (13)..(13)
<400> 136
Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Xaa Xaa
1 5 10
<210> 137
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Axl L1 2 条件活性scFv
<220>
<221> X是V, D, G, N或W
<222> (6)..(6)
<220>
<221> X是S或V
<222> (7)..(7)
<220>
<221> X是A, L或M
<222> (9)..(9)
<220>
<221> X是A, D, N或Q
<222> (11)..(11)
<400> 137
Lys Ala Ser Gln Asp Xaa Xaa Ser Xaa Val Xaa
1 5 10
<210> 138
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Axl L2 2 条件活性scFv
<220>
<221> X是W或F
<222> (1)..(1)
<220>
<221> X是A, I, N, P或Q
<222> (2)..(2)
<220>
<221> X是S或D
<222> (3)..(3)
<220>
<221> X是H或D
<222> (6)..(6)
<400> 138
Xaa Xaa Xaa Thr Arg Xaa Thr
1 5
<210> 139
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Axl L2 2 条件活性scFv
<220>
<221> X是H, C, F, I, L, Q, S, T, V或Y
<222> (3)..(3)
<220>
<221> X是F, C, D, E, G, N或S
<222> (4)..(4)
<220>
<221> X是T, C或P
<222> (6)..(6)
<220>
<221> X是P, A, C, D, E, H, K, S, T, V或W
<222> (7)..(7)
<220>
<221> X是L, G或R
<222> (8)..(8)
<220>
<221> X是T, I或R
<222> (9)..(9)
<400> 139
Gln Glu Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 140
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 H1 3 条件活性scFv
<220>
<221> X是F或E
<222> (4)..(4)
<220>
<221> X是Y或D
<222> (7)..(7)
<220>
<221> X是T或C
<222> (8)..(8)
<220>
<221> X是M, D, E或Y
<222> (9)..(9)
<400> 140
Gly Tyr Thr Xaa Thr Glu Xaa Xaa Xaa His
1 5 10
<210> 141
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 H1 4 条件活性scFv
<220>
<221> X是Y, E, R或T
<222> (8)..(8)
<400> 141
Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Gly Xaa Tyr Trp Asn
1 5 10
<210> 142
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 H2 3 条件活性scFv
<220>
<221> X是G或S
<222> (1)..(1)
<220>
<221> X是I或E
<222> (2)..(2)
<220>
<221> X是N, C, L或V
<222> (3)..(3)
<220>
<221> X是D或E
<222> (4)..(4)
<220>
<221> X是T, D或E
<222> (4)..(4)
<400> 142
Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 143
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 H2 4 条件活性scFv
<220>
<221> X是K或N
<222> (8)..(8)
<400> 143
Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Xaa Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn
1 5 10 15
<210> 144
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 H3 3 条件活性scFv
<220>
<221> X是A, M或T
<222> (1)..(1)
<220>
<221> X是R或H
<222> (2)..(2)
<220>
<221> X是G或E
<222> (3)..(3)
<220>
<221> X是L或F
<222> (5)..(5)
<220>
<221> X是S或G
<222> (7)..(7)
<220>
<221> X是G或D
<222> (9)..(9)
<220>
<221> X是N或E
<222> (10)..(10)
<220>
<221> X是D或L
<222> (14)..(14)
<220>
<221> X是Y, C或T
<222> (15)..(15)
<220>
<221> X是W或L
<222> (16)..(16)
<400> 144
Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Tyr Xaa Tyr Xaa Xaa Ser Tyr Phe Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
<210> 145
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 H3 4 条件活性scFv
<220>
<221> X是R, G, H, W或Y
<222> (3)..(3)
<220>
<221> X是F, C, N或Q
<222> (4)..(4)
<220>
<221> X是E或S
<222> (5)..(5)
<220>
<221> X是G, E, F, H, M, Q或S
<222> (6)..(6)
<220>
<221> X是W, A, I, P, Q, T或V
<222> (8)..(8)
<220>
<221> X是Y, G, N或Q
<222> (9)..(9)
<220>
<221> X是G, S或T
<222> (10)..(10)
<220>
<221> X是Y或I
<222> (13)..(13)
<400> 145
Cys Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Leu Asp Xaa
1 5 10
<210> 146
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 L1 3 条件活性scFv
<220>
<221> X是V或E
<222> (6)..(6)
<220>
<221> X是S或D
<222> (7)..(7)
<220>
<221> X是Y, C或D
<222> (8)..(8)
<220>
<221> X是H, G或L
<222> (10)..(10)
<400> 146
Ser Ala Thr Ser Ser Xaa Xaa Xaa Met Xaa
1 5 10
<210> 147
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 L1 4 条件活性scFv
<220>
<221> X是F, S或T
<222> (13)..(13)
<400> 147
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Arg Tyr Gly Asn Ser Xaa Ile His
1 5 10 15
<210> 148
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 L2 3 条件活性scFv
<220>
<221> X是G, C, H或P
<222> (1)..(1)
<400> 148
Xaa Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 149
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 L2 4 条件活性scFv
<220>
<221> X是R, C, D, E或W
<222> (1)..(1)
<220>
<221> X是N或D
<222> (4)..(4)
<400> 149
Xaa Thr Tyr Xaa Leu Glu Ser
1 5
<210> 150
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 L3 3 条件活性scFv
<220>
<221> X是Q或E
<222> (2)..(2)
<220>
<221> X是R或H
<222> (3)..(3)
<220>
<221> X是S, D, G, I, Q或V
<222> (5)..(5)
<220>
<221> X是T或D
<222> (9)..(9)
<220>
<221> X是F, D或E
<222> (10)..(10)
<400> 150
Gln Xaa Xaa Ser Xaa Tyr Pro Phe Xaa Xaa
1 5 10
<210> 151
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 CAB3 VH
<400> 151
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Asp Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Leu Tyr Ser Tyr Gly Asn Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 152
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的Ror2 CAB VL
<400> 152
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr
35 40 45
His Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg
50 55 60
<210> 153
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的来自F1-1-11的scFv
<400> 153
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Lys Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser His Phe Glu Gly Val Trp Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
145 150 155 160
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu
165 170 175
Ser Val Asp Arg Tyr Gly Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys
180 185 190
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Tyr Asn Leu Glu
195 200 205
Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe
210 215 220
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
245 250 255
Val Glu Ile Lys
260
<210> 154
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的来自F1-1-17的scFv
<400> 154
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Gly
20 25 30
Glu Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Lys Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Phe Glu Gly Val Trp Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser
130 135 140
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
145 150 155 160
Glu Ser Val Asp Arg Tyr Gly Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Tyr Asn Leu
180 185 190
Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu
195 200 205
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr
210 215 220
Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 155
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的来自F1-1-25的scFv
<400> 155
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr
35 40 45
His Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser
115 120 125
Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys
130 135 140
Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Met His Trp Ile Arg Gln
145 150 155 160
Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Gly Ile Asn Asp Asn Asn
165 170 175
Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
180 185 190
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
195 200 205
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Leu Tyr Ser
210 215 220
Tyr Gly Asn Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser
<210> 156
<211> 258
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的来自F1-1-26的scFv
<400> 156
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr
35 40 45
His Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
130 135 140
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala
145 150 155 160
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Met His Trp Ile Arg Gln Ser
165 170 175
Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Gly Ile Asn Asp Asn Asn Gly
180 185 190
Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
195 200 205
Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
210 215 220
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Leu Tyr Ser Tyr
225 230 235 240
Gly Asn Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
245 250 255
Ser Ser
<210> 157
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的来自F1-1-9的scFv
<400> 157
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Lys Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser His Phe Glu Gly Val Trp Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser
130 135 140
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
145 150 155 160
Glu Ser Val Asp Arg Tyr Gly Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Tyr Asn Leu
180 185 190
Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu
195 200 205
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr
210 215 220
Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 158
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的来自F1-1-21的scFv
<400> 158
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Arg Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Tyr Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
115 120 125
Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Gly Glu Tyr
145 150 155 160
Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly
165 170 175
Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Lys Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn
180 185 190
Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys
195 200 205
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg
210 215 220
Phe Glu Gly Val Trp Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 159
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的来自F1-2-3的scFv
<400> 159
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Trp Gly Ala
20 25 30
Thr Met Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala His Gly His Tyr Glu Ser Tyr Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
145 150 155 160
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser
165 170 175
Gln Asp Val Val Ser Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
180 185 190
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Gln Asp Thr Arg His Thr Gly Val
195 200 205
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
210 215 220
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu
225 230 235 240
His Phe Ser Pro Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
245 250 255
Lys
<210> 160
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的来自F1-2-8的scFv
<400> 160
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Val Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Gln Asp Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu His Phe Ser Pro Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln
115 120 125
Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Thr Val Lys Ile Ser Cys
130 135 140
Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Trp Gly Ala Thr Met Asn Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Lys Pro Ser
165 170 175
Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile
180 185 190
Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu
195 200 205
Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala His Gly His Tyr Glu
210 215 220
Ser Tyr Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 161
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的来自F1-2-10的scFv
<400> 161
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Val Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Gln Asp Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu His Phe Ser Pro Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser
130 135 140
Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys
145 150 155 160
Val Ser Gly Tyr Ser Phe Trp Gly Ala Thr Met Asn Trp Ile Arg Gln
165 170 175
Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Lys Pro Ser Asn
180 185 190
Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser
195 200 205
Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys
210 215 220
Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala His Gly His Tyr Glu Ser
225 230 235 240
Tyr Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
245 250 255
Ser

Claims (71)

1.一种用于结合Axl或Ror2的嵌合抗原受体，其包含：
a)条件活性抗原特异性靶向区(ASTR)，其在pH为6.7下与pH为7.4相比显示出与Axl或Ror2的结合增加；
b)跨膜结构域；和
c)细胞内活化结构域，其中所述跨膜结构域位于所述ASTR和所述细胞内活化结构域之间。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中，所述ASTR结合Axl。
3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其中，所述ASTR与包含SEQ ID NO：79的抗体重链和SEQ ID NO：80的抗体轻链的单链可变抗体片段结合Axl的相同表位。
4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其中，所述ASTR是选自单链抗体、Fab片段、Fab'片段、(Fab')2片段、Fv片段和二价单链抗体或双抗体的抗体。
5.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其中，所述ASTR是包含重链和轻链的单链可变片段。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，与Axl结合的所述ASTR包含抗体重链可变区，所述抗体重链可变区包含具有H1、H2和H3序列的三个互补决定区，其中：
a)所述H1序列是X1GX2TMN(SEQ ID NO：87)；
b)所述H2序列是LIKPSNGGTSYNQKFKG(SEQ ID NO：88)；且
c)所述H3序列是GX3YX4SYX5AMDY(SEQ ID NO：89)，
其中，X1是T或W；X2是H或A；X3是H或D；X4是E或H；并且X5是E或F。
7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体，其中，所述重链可变区包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列。
8.根据权利要求2-6中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述ASTR包含轻链可变区，所述轻链可变区包含具有L1、L2和L3序列的三个互补决定区，其中：
d)所述L1序列是KASQDVX6SAVA(SEQ ID NO：90)；
e)所述L2序列是WX7X8TRX9T(SEQ ID NO：91)；且
f)所述L3序列是QEHFSX10PLX11(SEQ ID NO：92)，
其中，X6是S或V；X7是A或Q；X8是S或D；X9是H或D；X10是T或P；并且X11是T或R。
9.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体，其中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：80的氨基酸序列。
10.根据权利要求9所述的嵌合抗原受体，其中，所述重链可变区包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列。
11.根据权利要求5-10中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述重链和轻链通过接头分开，其中所述接头的长度为6-100个氨基酸。
12.根据权利要求11所述的嵌合抗原受体，其中，所述重链可变区和所述轻链可变区通过接头1(SEQ ID NO：53)、接头2(SEQ ID NO：54)或接头3(SEQ ID NO：55)分开。
13.根据权利要求12所述的嵌合抗原受体，其中，所述重链在所述轻链的N末端。
14.根据权利要求13所述的嵌合抗原受体，其中，所述ASTR包含SEQ ID NO：128、SEQ IDNO：129或SEQ ID NO：159的氨基酸序列。
15.根据权利要求12所述的嵌合抗原受体，其中，所述轻链在所述重链的N末端。
16.根据权利要求15所述的嵌合抗原受体，其中，所述ASTR包含SEQ ID NO：160或SEQID NO：161的氨基酸序列。
17.根据权利要求2至16中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体还包含茎结构域和共刺激结构域。
18.根据权利要求17所述的嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体从氨基末端至羧基末端包含所述ASTR、所述茎结构域、所述跨膜结构域、所述共刺激结构域和所述细胞内活化结构域。
19.根据权利要求18所述的嵌合抗原受体，其中，所述细胞内活化结构域是CD3Z活化结构域，并且其中所述共刺激结构域是ICΔ共刺激结构域、C28共刺激结构域，或包含ICΔ共刺激结构域和CD137共刺激结构域两者。
20.根据权利要求18所述的嵌合抗原受体，其中，所述茎结构域是CD8茎结构域或CD28茎结构域，其中所述跨膜结构域是CD8跨膜结构域或CD28跨膜结构域，其中所述细胞内活化结构域是CD3Z活化结构域，并且其中共刺激结构域是CD137共刺激结构域或ICΔ共刺激结构域。
21.根据权利要求20所述的嵌合抗原受体，其中，所述共刺激结构域是ICΔ共刺激结构域。
22.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中，所述ASTR结合Ror2。
23.根据权利要求22所述的嵌合抗原受体，其中，所述ASTR与包含SEQ ID NO：82或SEQID NO：83的抗体重链和SEQ ID NO：84的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，或者其中所述ASTR与包含SEQ ID NO：151的抗体重链和SEQ ID NO：152的抗体轻链的单链可变抗体片段结合Ror2的相同表位。
24.根据权利要求22所述的嵌合抗原受体，其中，所述ASTR与包含SEQ ID NO：82或SEQID NO：83的抗体重链和SEQ ID NO：84的抗体轻链的单链可变抗体片段结合Ror2的相同表位，或者其中所述ASTR与包含SEQ ID NO：151的抗体重链和SEQ ID NO：152的抗体轻链的单链可变抗体片段结合Ror2的相同表位。
25.根据权利要求23或24所述的嵌合抗原受体，其中，所述ASTR是选自单链抗体、Fab片段、Fab'片段、(Fab')2片段、Fv片段和二价单链抗体或双抗体的抗体。
26.根据权利要求23或24所述的嵌合抗原受体，其中，所述ASTR是包含重链和轻链的单链可变片段。
27.根据权利要求22-26中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，与Ror2结合的所述ASTR包含重链可变区，所述重链可变区包含具有H1、H2和H3序列的三个互补决定区，其中：
a)所述H1序列是GYTX1TEX2TX3H(SEQ ID NO：95)或X4GYSITTGYYWN(SEQ ID NO：96)；
b)所述H2序列是GX5NX6NNGGTGYNQKFKG(SEQ ID NO：97)或YITYDGSKNYNPSLKN(SEQ IDNO：98)；且
c)所述H3序列是GSLYSYGNSYFDY(SEQ ID NO：99)或FEGVWX7GLDY(SEQ ID NO：100)，
其中，X1是F或E；X2是Y或D，X3是M或D；X4是T或S；X5是E或I；X6是T或D；并且X7是Y或G。
28.根据权利要求27所述的嵌合抗原受体，其中，所述ASTR与包含SEQ ID NO：82或SEQID NO：83的抗体重链和SEQ ID NO：84的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，并且其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：83的氨基酸序列。
29.根据权利要求22-28中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述ASTR包含轻链可变区，所述轻链可变区包含具有L1、L2和L3序列的三个互补决定区，其中：
a)所述L1序列是SATSSX8SYMH(SEQ ID NO：101)或RASESVDRYGNSFIH(SEQ ID NO：102)；
b)所述L2序列是X9TSNLAS(SEQ ID NO：103)或RTYNLES(SEQ ID NO：104)；且
c)所述L3序列是QQRSSYPFT(SEQ ID NO：105)或QQTNEDPWT(SEQ ID NO：106)，
其中，X8是E或V；并且X9是G或H。
30.根据权利要求29所述的嵌合抗原受体，其中，所述ASTR包含SEQ ID NO：82或SEQ IDNO：83的抗体重链和SEQ ID NO：84的抗体轻链。
31.根据权利要求29所述的嵌合抗原受体，其中，所述ASTR与包含SEQ ID NO：82或SEQID NO：83的抗体重链和SEQ ID NO：84的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，并且其中所述ASTR包含SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：157或SEQ ID NO：158的氨基酸序列。
32.根据权利要求29所述的嵌合抗原受体，其中，所述ASTR包含SEQ ID NO：151的抗体重链和SEQ ID NO：152的抗体轻链。
33.根据权利要求29所述的嵌合抗原受体，其中，所述ASTR与包含SEQ ID NO：151的抗体重链和SEQ ID NO：152的抗体轻链的抗体结合Ror2的相同表位，并且其中所述ASTR包含SEQ ID NO：155或SEQ ID NO：156的氨基酸序列。
34.根据权利要求22至33中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体还包含茎结构域和共刺激结构域。
35.根据权利要求34所述的嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体从氨基末端至羧基末端包含所述ASTR、所述茎结构域、所述跨膜结构域、所述共刺激结构域和细胞内活化结构域。
36.根据权利要求35所述的嵌合抗原受体，其中，所述茎域是CD8茎结构域或CD28茎结构域，其中所述跨膜结构域是CD8跨膜结构域或CD28跨膜结构域，其中所述细胞内活化结构域是CD3Z活化结构域，并且其中共刺激结构域是CD137共刺激结构域。
37.根据前述权利要求中任一项所述的嵌合抗原受体，其还包含识别结构域。
38.根据权利要求37所述的嵌合抗原受体，其中，所述识别结构域表达为与所述嵌合抗原受体共价连接。
39.根据权利要求38所述的嵌合抗原受体，其中，所述识别结构域被管理机构批准的抗体识别。
40.根据权利要求38或39所述的嵌合抗原受体，其中，所述识别结构域是EGFR的至少20个连续氨基酸。
41.一种分离的重组T细胞或NK细胞，其包含基因组，所述基因组包含与在T细胞和/或NK细胞中有活性的启动子可操作地连接的一个或多个核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列编码根据前述权利要求中任一项所述的用于结合Axl或Ror2的嵌合抗原受体(CAR)。
42.根据权利要求41所述的分离的重组T细胞或NK细胞，其中，所述CAR由与所述启动子可操作地连接的核酸序列编码，并且编码所述CAR的所述核酸序列进一步编码识别结构域，其中编码所述识别结构域的核酸通过核糖体跳跃序列与编码所述CAR的核酸分开。
43.一种用于活化T细胞或NK细胞的方法，其包括在pH小于7.0的微环境中使靶哺乳动物细胞与所述T细胞和/或所述NK细胞接触，其中所述靶哺乳动物细胞表达Axl或Ror2，并且其中所述T细胞或NK细胞分别表达用于结合Axl或Ror2的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含根据权利要求1至40中任一项所述的CAR。
44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述微环境的pH在6.5至6.8之间。
45.根据权利要求44所述的方法，其中，活化包括增加细胞因子的表达和/或产生和/或分泌。
46.根据权利要求45所述的方法，其中，在活化后，所述T细胞增加IL-2或IFN-γ的表达。
47.根据权利要求46所述的方法，其中，与所述接触前由所述T细胞或NK细胞表达的IL-2或IFN-γ的表达相比，IL-2或IFN-γ的表达增加至少2倍。
48.根据权利要求43至47中任一项所述的方法，其中，在活化后，与所述接触前所述T细胞或NK细胞的细胞毒活性相比，所述T细胞或NK细胞的细胞毒活性增加至少2倍。
49.根据权利要求43至48中任一项所述的方法，其中，在所述T细胞或NK细胞活化后裂解所述靶哺乳动物细胞。
50.根据权利要求43至49中任一项所述的方法，其还包括在所述接触之前用在其基因组中编码所述CAR的非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒转导所述T细胞或所述NK细胞，以遗传修饰所述T细胞或NK细胞。
51.根据权利要求50所述的方法，其中，所述转导是离体进行的。
52.根据权利要求43至51中任一项所述的方法，其还包括将所述微环境的pH增加至等于或高于7.0的pH，从而减少所述T细胞或NK细胞的活化。
53.根据权利要求43至52中任一项所述的方法，其中，所述微环境是肿瘤。
54.根据权利要求53所述的方法，其中，所述肿瘤在人受试者中。
55.根据权利要求43至52中任一项所述的方法，其中，所述微环境是体外或离体的。
56.根据权利要求43至55中任一项所述的方法，其中，在所述方法中活化的所述细胞是T细胞。
57.一种制备条件活化的T细胞或NK细胞的方法，所述T细胞或NK细胞包含用于条件结合Axl或Ror2的嵌合抗原受体，其中，所述方法包括用包含与编码根据权利要求1至35中任一项所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列可操作地连接的启动子的表达载体来遗传修饰所述T细胞或NK细胞，其中所述条件结合是在pH为6.7下与pH为7.4相比与Ax1或Ror2的结合增加。
58.一种制备条件活化的T细胞和/或NK细胞的离体方法，所述T细胞或NK细胞包含用于条件结合Axl或Ror2的嵌合抗原受体，其中所述方法包括：
a)富集外周血单核细胞(PBMC)以从分离血液分离包含T细胞和/或NK细胞的PBMC；
b)在有效条件下活化所分离的PBMC的所述T细胞和/或NK细胞；
c)在有效条件下用非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒转导所活化的T细胞和/或NK细胞，从而产生遗传修饰的T细胞和/或NK细胞，其中所述非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒各自包含逆转录病毒基因组，所述逆转录病毒基因组包含与在T细胞和/或NK细胞中有活性的启动子可操作地连接的一个或多个核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列的第一核酸序列编码根据权利要求1至35中任一项所述的嵌合抗原受体；和
d)扩增所遗传修饰的T细胞和/或NK细胞，从而制备所述条件活化的T细胞和/或NK细胞。
59.根据权利要求58所述的方法，其中，所述方法还包括在所述扩增后收获所述遗传修饰的T细胞和/或NK细胞。
60.根据权利要求59所述的方法，其还包括将所收获的遗传修饰的T细胞和/或NK细胞引入受试者。
61.一种修饰的T细胞，其通过根据权利要求58至60中任一项所述的方法产生。
62.一种表达载体，其包含编码根据权利要求1至40中任一项所述的用于结合Axl或Ror2的嵌合抗原受体(CAR)的核酸和在T细胞或NK细胞中有活性的启动子，所述T细胞或NK细胞位于所述表达载体上以促进编码所述CAR的核酸的表达。
63.根据权利要求62所述的表达载体，其中，所述表达载体是非复制胜任型逆转录病毒颗粒。
64.根据权利要求63所述的表达载体，其中，所述表达载体是慢病毒载体。
65.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1至40中任一项所述的用于结合Axl或Ror2的嵌合抗原受体。
66.根据权利要求65所述的分离的核酸，其中，所述核酸还包含在T细胞和/或NK细胞中有活性的启动子，并且其中编码所述CAR的核酸序列与所述启动子可操作地连接。
67.根据权利要求66所述的分离的核酸，其中，所述分离的核酸序列进一步编码识别结构域。
68.根据权利要求67所述的分离的核酸，其中，编码所述识别结构域的核酸通过核糖体跳跃序列与编码所述CAR的核酸分开。
69.根据权利要求68所述的分离的核酸，其中，所述核糖体跳跃序列是2A-1。
70.一种非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒，其包含根据权利要求65至69中任一项所述的核酸。
71.根据权利要求70所述的非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒，其中，所述非复制胜任型重组逆转录病毒颗粒是慢病毒颗粒。
CN201880007323.XA 2017-01-18 2018-01-17 针对axl或ror2的嵌合抗原受体及其使用方法 Pending CN110177808A (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762447898P 2017-01-18 2017-01-18
US62/447,898 2017-01-18
US201762467059P 2017-03-03 2017-03-03
US62/467,059 2017-03-03
US201762530193P 2017-07-08 2017-07-08
US62/530,193 2017-07-08
PCT/US2018/014122 WO2018136570A1 (en) 2017-01-18 2018-01-17 Chimeric antigen receptors against axl or ror2 and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110177808A true CN110177808A (zh) 2019-08-27

Family

ID=61157332

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880007323.XA Pending CN110177808A (zh) 2017-01-18 2018-01-17 针对axl或ror2的嵌合抗原受体及其使用方法

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20190367621A1 (zh)
EP (1) EP3571229A1 (zh)
JP (2) JP7280827B2 (zh)
KR (1) KR20190130559A (zh)
CN (1) CN110177808A (zh)
AU (1) AU2018211081A1 (zh)
BR (1) BR112019014615A2 (zh)
CA (1) CA3049674A1 (zh)
IL (1) IL267902A (zh)
MX (1) MX2019008503A (zh)
SG (2) SG11201906468TA (zh)
TW (1) TW201831505A (zh)
WO (1) WO2018136570A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021249549A1 (zh) * 2019-09-13 2021-12-16 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 一种嵌合抗原受体及其用途
CN114075548A (zh) * 2020-08-13 2022-02-22 广州医科大学附属第二医院 一种靶向axl的car-t细胞及其制备方法和应用
CN115125272A (zh) * 2021-03-29 2022-09-30 复旦大学 一种car-t治疗载体及其构建方法和应用
WO2023083195A1 (zh) * 2021-11-09 2023-05-19 四川大学华西医院 基于gas6构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170260261A1 (en) 2014-08-28 2017-09-14 Bioatla, Llc Conditionally Active Chimeric Antigen Receptors for Modified T-Cells
US11111505B2 (en) 2016-03-19 2021-09-07 Exuma Biotech, Corp. Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulating the activity thereof
WO2020047527A2 (en) * 2018-09-02 2020-03-05 F1 Bioventures, Llc Methods and compositions for genetically modifying lymphocytes in blood or in enriched pbmcs
US11325948B2 (en) 2016-03-19 2022-05-10 Exuma Biotech Corp. Methods and compositions for genetically modifying lymphocytes to express polypeptides comprising the intracellular domain of MPL
HRP20221298T1 (hr) * 2016-05-13 2022-12-23 Bioatla, Inc. Anti-ror2 protutijela, fragmenti protutijela, njihovi imunokonjugati i njihove uporabe
JP7432250B2 (ja) * 2018-09-07 2024-02-16 バイオアトラ インコーポレイテッド 修飾ｔ細胞に対する条件的活性型キメラ抗原受容体
CN111378040B (zh) * 2018-12-29 2021-08-10 深圳大学 检测多种恶性肿瘤细胞的抗体及其应用
CN111378039B (zh) * 2018-12-29 2021-08-24 深圳大学 治疗恶性肿瘤的抗体及其应用
EP3936523A4 (en) * 2019-01-08 2022-09-07 Shenzhen University ANTIBODY DETECTION OF MALIGNANT TUMOR CELLS AND THEIR APPLICATIONS
EP3715368A1 (en) 2019-03-28 2020-09-30 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Chimeric antigen receptors, vectors coding for such receptors and their use in the modification of t cells
WO2020219843A1 (en) * 2019-04-26 2020-10-29 The University Of North Carolina At Chapel Hill Chimeric antigen receptor constructs and their use in car-t cells
CN110317277A (zh) * 2019-07-10 2019-10-11 杭州普科亭生物医药有限公司 嵌合抗原受体及其应用
EP4114400A4 (en) * 2020-03-05 2023-10-18 Exuma Biotech Corp. METHOD AND COMPOSITIONS FOR RELEASING MODIFIED LYMPHOCYTE AGGREGATES

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016142768A1 (en) * 2015-03-10 2016-09-15 Eureka Therapeutics, Inc. Ror2 antibody

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
TW197439B (zh) 1991-04-04 1993-01-01 Ueno Pharmaceutics Applic Res Co Ltd
ES2197145T3 (es) 1991-08-20 2004-01-01 The Government Of The Usa As Represented By The Secretary Of The Deptm. Of Health And Human Services Transferencia de genes mediada por adenovirus al gastrointestinal.
US5283253A (en) 1991-09-23 1994-02-01 Florida State University Furyl or thienyl carbonyl substituted taxanes and pharmaceutical compositions containing them
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
WO1993010076A1 (en) 1991-11-22 1993-05-27 The University Of Mississippi Synthesis and optical resolution of the taxol side chain and related compounds
US5200534A (en) 1992-03-13 1993-04-06 University Of Florida Process for the preparation of taxol and 10-deacetyltaxol
FR2688514A1 (fr) 1992-03-16 1993-09-17 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant.
JPH08500973A (ja) 1992-05-21 1996-02-06 ザ ペン ステイト リサーチ ファウンデーション タキソール、関連タキサン及び他の新規な抗癌／抗ウイルス性化合物原料としてのイチイ培養組織
US5274137A (en) 1992-06-23 1993-12-28 Nicolaou K C Intermediates for preparation of taxols
US5294637A (en) 1992-07-01 1994-03-15 Bristol-Myers Squibb Company Fluoro taxols
US5202448A (en) 1992-08-14 1993-04-13 Napro Biotherapeutics, Inc. Processes of converting taxanes into baccatin III
CA2100808A1 (en) 1992-10-01 1994-04-02 Vittorio Farina Deoxy paclitaxels
FR2696458B1 (fr) 1992-10-05 1994-11-10 Rhone Poulenc Rorer Sa Procédé de préparation de dérivés du taxane.
FR2696464B1 (fr) 1992-10-05 1994-11-10 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveau procédé d'estérification de la baccatine III et de la désacétyl-10 baccatine III.
FR2696463B1 (fr) 1992-10-05 1994-11-25 Rhone Poulenc Rorer Sa Procédé d'obtention de la désacétyl-10 baccatine III.
FR2696462B1 (fr) 1992-10-05 1994-11-25 Rhone Poulenc Rorer Sa Procédé d'obtention de la désacétyl-10 baccatine III.
FR2696461B1 (fr) 1992-10-05 1994-11-10 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux dérivés d'analogues du taxol, leur préparation et les compositions qui les contiennent.
CA2592997A1 (en) 1992-12-03 1994-06-09 Genzyme Corporation Pseudo-adenovirus vectors
US5279949A (en) 1992-12-07 1994-01-18 Board Of Trustees Operating Michigan State University Process for the isolation and purification of taxol and taxanes from Taxus spp
EP0705344B8 (en) 1993-06-24 2006-05-10 Advec Inc. Adenovirus vectors for gene therapy
US5824701A (en) 1993-10-20 1998-10-20 Enzon, Inc. Taxane-based prodrugs
BR9407956A (pt) 1993-10-25 1996-11-26 Canji Inc Composiçao farmacêutica vetor de express o de adenovirus recombinante e kit par reduzir a proliferaçao de células tumorais
US5415869A (en) 1993-11-12 1995-05-16 The Research Foundation Of State University Of New York Taxol formulation
DK0889120T3 (da) 1994-12-09 2002-07-22 Imp College Innovations Ltd Virulensgener i VGC2-regionen af Salmonella
AU3740997A (en) 1996-08-26 1998-03-19 Bristol-Myers Squibb Company Sulfenamide taxane derivatives
WO1998013059A1 (en) 1996-09-27 1998-04-02 Bristol-Myers Squibb Company Hydrolyzable prodrugs for delivery of anticancer drugs to metastatic cells
WO1998022451A1 (fr) 1996-11-19 1998-05-28 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Derives taxol
US5977386A (en) 1996-12-24 1999-11-02 Bristol-Myers Squibb Company 6-thio-substituted paclitaxels
ATE219363T1 (de) 1997-06-20 2002-07-15 Baker Norton Pharma Lösliche prodrugs von paclitaxel
US7288665B1 (en) 1997-08-18 2007-10-30 Florida State University Process for selective derivatization of taxanes
JPH1192468A (ja) 1997-09-17 1999-04-06 Yakult Honsha Co Ltd 新規なタキサン誘導体
JP4153660B2 (ja) 1997-10-08 2008-09-24 株式会社横浜国際バイオ研究所 タキソイド誘導体およびその製造方法
GB0105924D0 (en) 2001-03-09 2001-04-25 Microscience Ltd Promoter
EP1382969A1 (en) 2002-07-17 2004-01-21 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Diagnosis and prevention of cancer cell invasion
CN103275227B (zh) 2007-11-12 2015-02-11 U3制药有限公司 Axl抗体
EP2853544A1 (en) 2007-11-15 2015-04-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Monoclonal antibody capable of binding to anexelekto, and use thereof
CN105132395A (zh) 2009-03-09 2015-12-09 生物蛋白有限公司 Mirac蛋白
WO2011014457A1 (en) 2009-07-27 2011-02-03 Genentech, Inc. Combination treatments
CA2779526C (en) 2009-11-03 2022-12-06 City Of Hope Truncated epiderimal growth factor receptor (egfrt) for transduced t cell selection
MX336001B (es) 2010-06-18 2016-01-07 Genentech Inc Anticuerpos anti-axl y metodos de uso.
ES2677367T3 (es) 2011-06-22 2018-08-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anticuerpos anti-Axl y usos de los mismos
US20140322234A1 (en) 2012-01-03 2014-10-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Analysis and Targeting of ROR2 in Cancer
US11111288B2 (en) * 2014-08-28 2021-09-07 Bioatla, Inc. Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells
US20170260261A1 (en) * 2014-08-28 2017-09-14 Bioatla, Llc Conditionally Active Chimeric Antigen Receptors for Modified T-Cells
ES2690420T3 (es) * 2015-05-28 2018-11-20 Universität Zu Köln Receptor de antígeno quimérico anti-toso y su uso
CN109563164A (zh) * 2016-04-15 2019-04-02 生物蛋白有限公司 抗axl抗体、抗体片段和它们的免疫缀合物以及其用途
AU2017320874B2 (en) * 2016-08-31 2024-03-07 Bioatla, Llc Conditionally active polypeptides and methods of generating them

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016142768A1 (en) * 2015-03-10 2016-09-15 Eureka Therapeutics, Inc. Ror2 antibody

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
E. INTISAR 等: "Adoptive T-cell immunotherapy using chimeric antigen receptor against a novel cancer target Axl", 《HUMAN GENE THERAPY》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021249549A1 (zh) * 2019-09-13 2021-12-16 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 一种嵌合抗原受体及其用途
CN114075548A (zh) * 2020-08-13 2022-02-22 广州医科大学附属第二医院 一种靶向axl的car-t细胞及其制备方法和应用
CN114075548B (zh) * 2020-08-13 2023-11-21 广州医科大学附属第二医院 一种靶向axl的car-t细胞及其制备方法和应用
CN115125272A (zh) * 2021-03-29 2022-09-30 复旦大学 一种car-t治疗载体及其构建方法和应用
CN115125272B (zh) * 2021-03-29 2024-04-19 复旦大学 一种car-t治疗载体及其构建方法和应用
WO2023083195A1 (zh) * 2021-11-09 2023-05-19 四川大学华西医院 基于gas6构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
SG10202107808SA (en) 2021-08-30
JP2020503885A (ja) 2020-02-06
AU2018211081A1 (en) 2019-07-18
MX2019008503A (es) 2019-09-13
WO2018136570A9 (en) 2018-10-04
CA3049674A1 (en) 2018-07-26
KR20190130559A (ko) 2019-11-22
JP7280827B2 (ja) 2023-05-24
BR112019014615A2 (pt) 2020-06-02
US20190367621A1 (en) 2019-12-05
EP3571229A1 (en) 2019-11-27
TW201831505A (zh) 2018-09-01
JP2023052397A (ja) 2023-04-11
IL267902A (en) 2019-09-26
SG11201906468TA (en) 2019-08-27
WO2018136570A1 (en) 2018-07-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110177808A (zh) 针对axl或ror2的嵌合抗原受体及其使用方法
KR102375218B1 (ko) T 세포 수용체 및 이를 사용하는 면역 요법
CN105142677B (zh) 嵌合抗原受体及其使用方法
CN110249046A (zh) 用于过继细胞疗法的工程化细胞的产生
CN110461335A (zh) 用于治疗bcma相关癌症和自身免疫性失调的联合疗法
CN109715668A (zh) 用于使用融合蛋白进行tcr重编程的组合物和方法
CN107995913A (zh) 使用融合蛋白对tcr重编程的组合物和方法
CN107922473A (zh) 用于修饰的t细胞的条件活性嵌合抗原受体
CN110234343A (zh) 用于治疗癌症的经工程改造t细胞
CN105392888A (zh) 使用人源化抗cd19嵌合抗原受体治疗癌症
CN107106670A (zh) 用于修饰的t细胞的方法和组合物
CN110062768A (zh) 表达抗原结合受体和嵌合共刺激受体的免疫细胞
CN109072199A (zh) 靶向Fc受体样5的嵌合抗原受体及其用途
TW201446794A (zh) 利用抗－ｃｄ１２３嵌合抗原受體工程化ｔ細胞之初級人類白血病有效靶向
CN107709355A (zh) 单链cd40受体激动剂蛋白
CN110234756A (zh) 转导和扩增免疫细胞的方法及其用途
CN109069627A (zh) 对foxp3衍生肽特异性的t细胞受体样抗体
US20220306698A1 (en) Methods and compositions for genetically modifying lymphocytes to express polypeptides comprising the intracellular domain of cd79a and cd79b
KR20220070449A (ko) 림프구의 변형 및 전달을 위한 방법 및 조성물
US20190345218A1 (en) Targeted t cells with cytotoxicity toward immunosuppressive cells
CN110494162A (zh) 改良的抗体-偶联t细胞受体构建体及其治疗用途
CN113840911A (zh) 用于在血液中或在富集pbmc中基因修饰淋巴细胞的方法和组合物
CN109929036A (zh) 一种表位特异的抗体筛选方法及所筛选到的抗体
US20230057987A1 (en) Antigen binding proteins specifically binding ct45
JP2024514608A (ja) Ｒａｃ１由来変異エピトープ及びｒａｃ２由来変異エピトープの両方に特異的なｔ細胞受容体

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination