CN107709355A - 单链cd40受体激动剂蛋白 - Google Patents

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Abstract

本文提供了特异性CD40受体激动剂蛋白、编码其的核酸和治疗具有CD40L相关性疾病或病症的患者的方法。在本文中所提供的CD40受体激动剂蛋白包含三个可溶性CD40L结构域和Fc片段。所述CD40受体激动剂蛋白是基本上非聚集性的，并且适合于治疗性、诊断性和/或研究性应用。

Description

单链CD40受体激动剂蛋白
发明领域
本发明提供了包含三个可溶性CD40L结构域和Fc片段的特异性CD40受体激动剂蛋白、编码所述CD40受体激动剂蛋白的核酸分子以及其用途。所述CD40受体激动剂蛋白是基本上非聚集性的，并且适合于治疗性、诊断性和/或研究性应用。
发明背景
已知TNF超家族(TNFSF)细胞因子的三聚化对于有效的受体结合和激活来说是必需的。但是，难以从重组的单体单元来制备TNF超家族细胞因子的三聚体复合物。
WO 01/49866和WO 02/09055公开了重组融合蛋白，其包含TNF细胞因子和多聚化组分，特别是来自C1q蛋白质家族的蛋白质或胶原凝素。但是，这些融合蛋白的缺点是，该三聚化结构域通常具有大的分子量，和/或三聚化是相当低效的。
Schneider等人(J Exp Med 187(1989),1205-1213)描述了，通过位于N-末端处的稳定化基元来使TNF细胞因子的三聚体稳定化。在CD95L中，受体结合结构域三聚体的稳定化据推测由位于细胞质膜附近的N-末端氨基酸结构域引起。
Shiraishi等人(Biochem Biophys Res Commun 322(2004),197-202)描述了，可以通过位于N-末端处的人工α-螺旋性卷曲螺旋(亮氨酸拉链)基元来使CD95L的受体结合结构域稳定化。但是，发现几乎不能预测多肽链的相互定向，例如平行或反平行定向。进一步，难以确定在卷曲螺旋拉链基元中的七残基重复序列的最佳数目。另外，卷曲螺旋结构具有在改变pH和/或离子强度后形成大分子聚集体的倾向。
WO 01/25277涉及与细胞受体的细胞外配体结合结构域相结合的单链寡聚多肽，其中所述多肽包含至少三个受体结合位点，所述受体结合位点中的至少一个能够与所述细胞受体的配体结合结构域相结合和至少一个不能够与所述细胞受体的配体结合结构域有效地结合，由此所述单链寡聚多肽能够与所述受体相结合，但是不能够激活所述受体。例如，单体源自TNF家族的细胞因子配体，特别地源自TNF-α。
WO 2005/103077公开了单链融合多肽，其包含至少三个TNF家族配体成员单体和至少两个将TNF配体家族成员单体相互连接的肽连接体。但是，最近的实验已显示，这些单链融合多肽显示出不希望的聚集。
WO 2010/010051公开了单链融合多肽，其包含三个可溶性TNF家族细胞因子结构域和至少两个肽连接体。所描述的融合多肽是基本上非聚集性的。
最近的研究已显示，目前在临床上进行探查的抗-CD40-mAb的F(ab`)2-片段在没有进一步交联的情况下不是激动性的。(参见Vonderheide,R.H.和M.J.Glennie(2013)."Agonistic CD40 antibodies and cancer therapy."Clin Cancer Res 19(5):1035-1043)。
在本领域中对于这样的新型CD40受体激动剂存在需要，所述新型CD40受体激动剂展现出高的生物学活性(不依赖于基于Fc-γ-R的体内交联)、高的稳定性，并且允许有效的重组制备。
发明简述
本发明提供了特异性CD40受体激动剂蛋白，其模拟体内CD40:CD40L相互作用，展现出低的蛋白质水解降解，并且延长体内半寿期。
本发明的CD40受体激动剂蛋白通常包含：(i)第一可溶性CD40L细胞因子结构域；(ii)第一肽连接体；(iii)第二可溶性CD40L结构域；(iv)第二肽连接体；(v)第三可溶性CD40L结构域；(vi)第三肽连接体(例如，铰链连接体)；和(vii)抗体Fc片段。
在一个实施方案中，所述抗体Fc片段(vi)位于所述第一CD40L结构域(i)的N-末端和/或所述第三CD40L结构域(v)的C-末端。在另一个实施方案中，所述抗体Fc片段位于所述第三CD40L结构域(v)的C-末端。在一个实施方案中，所述多肽是基本上非聚集性的。在另一个实施方案中，所述第二和/或第三可溶性CD40L结构域为在N-末端处缩短的结构域，其任选地包含氨基酸序列突变。
在一个实施方案中，所述可溶性CD40L结构域中的至少一个，特别是所述可溶性CD40L结构域(iii)和(v)中的至少一个，为具有这样的N-末端序列的可溶性CD40L结构域，所述N-末端序列在人CD40L的氨基酸Gln121或Ile122处开始，并且其中Gln121可以被中性氨基酸例如Ser或Gly替代。在另一个实施方案中，所述可溶性CD40L结构域中的至少一个，特别是所述可溶性CD40L结构域(iii)和(v)中的至少一个，为具有选自下列的N-末端序列的可溶性CD40L结构域：(a)Gln121-Ile122；和(b)(Gly/Ser)121-Ile122。在一个实施方案中，所述可溶性CD40L结构域以人CD40L的氨基酸Leu261结束，和/或任选地在位置E129、A130、S132、K133、T134、E142、Y145、Y146、C178、C194、R200、F201、C218、Q220、N240处包含一个或多个突变。在一个实施方案中，所述可溶性CD40L结构域(i)、(iii)和(v)包含根据SEQID NO:1的人CD40L的氨基酸Gln121-Leu261。
在一个实施方案中，所述第一和第二肽连接体(ii)和(iv)独立地具有3-8个氨基酸的长度，特别地3、4、5、6、7或8个氨基酸的长度，并且优选地为甘氨酸/丝氨酸连接体，其任选地包含可以被糖基化的天冬酰胺残基。在一个实施方案中，所述第一和第二肽连接体(ii)和(iv)由根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。在另一个实施方案中，所述多肽另外还包含N-末端信号肽结构域，例如SEQ ID NO:17的信号肽结构域，其可以包含蛋白酶切割位点，和/或所述多肽另外还包含C-末端元件，其可以包含和/或连接至识别/纯化结构域，例如根据SEQ ID NO:18的附着至丝氨酸连接体的Strep-标签。
在一个实施方案中，所述抗体Fc片段(vii)通过铰链连接体，优选地SEQ ID NO:16的铰链连接体，而融合至所述可溶性CD40L结构域(i)和/或(v)。在另一个实施方案中，所述抗体Fc片段(vii)由在SEQ ID NO:13或14中所显示的氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，本发明的单链融合多肽包含从由SEQ ID NO:15和25-35组成的组中选择的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供了CD40受体激动剂蛋白，其包含两个各自具有SEQID NO:27中所示的氨基酸序列的单链融合多肽。在一个实施方案中，所述两个多肽通过在每个多肽的半胱氨酸残基453、459和462之间所形成的三个链间二硫键而共价连接。
在一个实施方案中，在成熟多肽SEQ ID NO:27、28、29、30、32或34的位置147和296处的天冬酰胺残基中的一个或多个被N-糖基化。在另一个实施方案中，在所述多肽的位置147和296处的天冬酰胺残基均被N-糖基化。
在另一个实施方案中，所述多肽进一步进行了翻译后修饰。在另一个实施方案中，所述翻译后修饰包括将N-末端谷氨酰胺修饰为焦谷氨酸。
在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含在本文中所公开的CD40受体激动剂蛋白，以及一种或多种在药学上可接受的载料、稀释剂、赋形剂和/或助剂。
在另一个方面，本发明提供了编码所述CD40受体激动剂蛋白的核酸分子。在另一个实施方案中，本发明提供了包含所述核酸分子的表达载体。在另一个实施方案中，本发明提供了包含所述核酸分子的细胞。在一个进一步的实施方案中，所述细胞为真核细胞。在另一个实施方案中，所述细胞为哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，所述细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在其他实施方案中，所述细胞选自由CHO-DBX11、CHO-DG44、CHO-S和CHO-K1细胞组成的组。在其他实施方案中，所述细胞选自由Vero、BHK、HeLa、COS、MDCK、HEK-293、NIH-3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20、T47D、NS0、CRL7030、HsS78Bst、PER.C6、SP2/0-Agl4和杂交瘤细胞组成的组。
在另一个方面，本发明提供了治疗具有CD40L相关性疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的所述CD40受体激动剂蛋白。在一个实施方案中，单独施用所述CD40受体激动剂蛋白。在另一个实施方案中，在施用第二种试剂之前、同时或之后施用所述CD40受体激动剂蛋白。在另一个实施方案中，所述疾病或病症选自由下列各项组成的组：肿瘤、感染性疾病、炎性疾病、代谢疾病、自身免疫性病症、变性疾病、凋亡相关性疾病和移植排斥。在一个实施方案中，所述肿瘤为实体肿瘤。在一个实施方案中，所述肿瘤产生自由肉瘤、食管癌和胃癌组成的癌症组。在另一个实施方案中，所述肿瘤产生自尤因肉瘤或纤维肉瘤。在另一个实施方案中，所述肿瘤产生自由非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈癌和小细胞肺癌(SCLC)组成的癌症组。在另一个实施方案中，所述肿瘤为淋巴肿瘤。在一个实施方案中，所述肿瘤为血液肿瘤。在另一个实施方案中，所述肿瘤产生自非霍奇金淋巴瘤、白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、慢性粒细胞白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)或多毛细胞白血病。在另一个实施方案中，所述自身免疫性病症为类风湿性疾病、关节炎性疾病或者类风湿性和关节炎性疾病。在一个进一步的实施方案中，所述疾病或病症为类风湿性关节炎。在另一个实施方案中，所述变性疾病为神经变性疾病。在一个进一步的实施方案中，所述神经变性疾病为多发性硬化。
在一个实施方案中，所述第二种试剂为化学治疗剂、放射治疗剂或生物学试剂。在一个实施方案中，所述第二种试剂选自由Duvelisib、Ibrutinib、Navitoclax和Venetoclax组成的组。在另一个实施方案中，所述第二种试剂为凋亡试剂。在一个实施方案中，所述凋亡性第二种试剂选自由硼替佐米、氮杂胞苷、达沙替尼和吉非替尼组成的组。在一个特别的实施方案中，在本文中所公开的药物组合物通过静脉内或皮下施用来施用给患者。在其他实施方案中，所公开的药物组合物通过下列方式来施用给患者：口服、肠胃外、肌内、关节内、支气管内，腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈管内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮施用。
在一个实施方案中，所述CD40受体激动剂蛋白作为单次推注进行施用。在另一个实施方案中，所述CD40受体激动剂蛋白可以以几个分开的剂量进行施用。所述CD40受体激动剂蛋白可以以大约0.1-100mg/kg进行施用。在一个实施方案中，所述CD40受体激动剂蛋白可以以从由下列各项组成的组中选择的剂量进行施用：大约0.1-0.5、0.1-1、0.1-10、0.1-20、0.1-50、0.1-75、1-10、1-15、1-7.5、1.25-15、1.25-7.5、2.5-7.5、2.5-15、5-15、5-7.5、1-20、1-50、7-75、1-100、5-10、5-15、5-20、5-25、5-50、5-75、10-20、10-50、10-75和10-100mg/kg。在其他实施方案中，所述CD40受体激动剂蛋白以大约0.1-100mg/ml存在于药物组合物中。在一个实施方案中，所述CD40受体激动剂蛋白以从由下列各项组成的组中选择的量存在于药物组合物中：大约0.1-0.5、0.1-1、0.1-10、0.1-20、0.1-50、0.1-75、1-10、1-20、1-50、1-75、1-100、5-10、5-15、5-20、5-25、5-50、5-75、10-20、10-50、10-75或10-100mg/ml。在其他实施方案中，将治疗有效量的CD40受体激动剂蛋白施用给受试者。在另一个实施方案中，将预防有效量的CD40受体激动剂蛋白施用给受试者。
附图描述
图1：包含三个CD40L结构域的单链融合多肽的结构域结构。I、II、III：可溶性CD40L结构域。
图2：显示了CD40L的总体结构的示意图。
■■■细胞膜，N-末端位于细胞内，
1.受体结合结构域(RBD)的反平行β-折叠，
2.RBD和细胞膜的界面，
3.蛋白酶切割位点。
图3：包含额外的Fab抗体片段的单链融合多肽。
图4：通过三个二硫桥来进行的两个在C-末端处融合的scFc融合多肽的二聚化。
图5：六价的scCD 40L-RBD-FC融合蛋白“蛋白质A”、“蛋白质B”和“蛋白质C”的分析型SEC的色谱图。
图6：在非还原和还原条件下，表达出的蛋白质“蛋白质A”、“蛋白质B”和“蛋白质C”的SDS-Page凝胶电泳。泳道1：蛋白质A，非还原的；泳道2：蛋白质A，还原的；泳道3：分子量标准参照物；泳道4：蛋白质B，非还原的；泳道5：蛋白质B，还原的；泳道6：空白；泳道7：蛋白质C，非还原的；泳道8：蛋白质C，还原的。
图7：将表达CD40的Ramos B细胞与蛋白质X(c)、蛋白质A(d)、蛋白质B(e)或蛋白质C(f)一起进行温育，并且将结合活性以荧光单位进行显示。(a)是仅细胞。(b)是仅与经荧光标记的抗体一起进行温育的细胞。
图8：将表达CD40的Ramos B细胞与1μg/ml蛋白质X(b)、10μg/ml蛋白质X(c)、1μg/ml蛋白质A(d)或10μg/ml蛋白质A(e)一起进行温育，并且将结合活性以相对于(a)(其未与任何CD40受体激动剂一起进行温育)进行标准化的CD86表达来进行显示。
图9：将2ml的血液与1μg/ml蛋白质X(b)、50μg/ml蛋白质X(c)、1μg/ml蛋白质A(d)或50μg/ml蛋白质A(e)一起进行温育。测定CD83-阳性细胞的百分比，并且将其相对于对照样品(a)(其未与CD40受体激动剂一起进行温育)进行标准化。
图10：本发明的六价的单链CD40受体激动剂融合蛋白的示意性图示。在其中铰链-链间二硫键(4)被还原并且共价的链间连接被打断的“开放Fc-构象过渡”期间，存在于内表面区域上的CH2-碳水化合物(5)通常在空间上保护CH2-亚结构域(2)免于蛋白酶影响。这使得CH2-解离以及内表面区域和上部铰链赖氨酸K223(6)暴露于蛋白酶成为可能。在“开放阶段”中二聚体缔合保持完整，这归因于CH3结构域(3)相互间的高的亲和力。(1)scCD40L-RBD；(2)CH2结构域；(3)CH3结构域；(4)铰链-半胱氨酸(左侧：被氧化为二硫桥；右侧：具有游离的硫羟基的还原阶段)；(5)附着至N297位置(EU-编号)的CH2-碳水化合物；(6)上部铰链赖氨酸(K223)。
发明详述
发明人已发现，将单链CD40L受体结合结构域融合至抗体衍生二聚化结构域导致六价的CD40受体激动剂，从而提供了与有良好的稳定性相组合的高的生物学活性。因此，提供了这样的单链融合多肽，其包含至少三个通过两个肽连接体相连接的可溶性CD40L结构域以及在N-末端处和/或在C-末端处的抗体衍生二聚化结构域。
优选地，所述单链融合多肽是非聚集性的。术语“非聚集性的”是指制备物中的单体含量为≥50％，优选地≥70％，和更优选地≥90％。单体含量与聚集体含量的比例可以通过使用大小排阻层析(SEC)检查聚集体形成的量来进行测定。关于聚集的稳定性可以在不同的储存条件下(例如在4℃或25℃下)在确定的时间段(例如从几天至数天、至数周和至数月)后通过SEC来进行测定。对于融合蛋白，为了被归类为基本上非聚集性的，优选的是，在4℃或25℃下储存数天(例如10天)，更优选地数周(例如2、3或4周)，和最优选地在数月(例如2或3个月)的时间段后，“单体”含量是如上面所定义的。关于在FC-融合蛋白的情况下的“单体”的定义，两条多肽链的装配由FC-部分来驱动并且所得的经装配的蛋白质的功能单元由两条链组成。在Fc-融合蛋白的情况下，该单元被定义为“单体”，而不管其是经二聚化的单链融合多肽。
所述单链融合多肽可以包含可以位于其N-末端和/或C-末端处的额外的结构域。关于额外的融合结构域的实例为例如N-末端信号肽结构域(其可以包含蛋白酶切割位点)或C-末端元件(其可以包含和/或连接至识别/纯化结构域)。根据一个优选的实施方案，所述融合多肽在其C-末端处包含通过连接体进行融合的Strep-标签。包括短的丝氨酸连接体的示例性的Strep-标签显示在SEQ ID NO:18中。
本发明的CD40受体激动剂蛋白包含三个源自CD40L的可溶性结构域。优选地，那些可溶性结构域源自哺乳动物(特别是人)的CD40L，包括其等位变体和/或衍生物。所述可溶性结构域包含CD40L的细胞外部分，其包括没有位于膜内的结构域的受体结合结构域。像TNF超家族的其他蛋白质一样，CD40L通过15-30个氨基酸的N-末端部分(所谓的“柄”区)而锚定至膜。“柄”区对于三聚化做出贡献，并且提供一定的与细胞膜的距离。但是，“柄”区不是受体结合结构域(RBD)的一部分。
重要的是，RBD以其N-末端和C-末端氨基酸的特殊定位为特征。所述氨基酸紧密相邻并且位于三聚体的轴的中心。RBD的第一个N-末端氨基酸与RBD的C-末端氨基酸一起形成反平行β-链(图2)。
因此，RBD的反平行β-链形成与细胞膜的界面，其通过“柄”区的氨基酸而连接至细胞膜或锚定在细胞膜内。高度优选的是，所述CD40受体激动剂蛋白的可溶性CD40L结构域包含CD40L的受体结合结构域，其没有任何来自“柄”区的氨基酸。否则，将会需要长的将可溶性结构域之一的C-末端与下一个可溶性结构域的N-末端相连接的连接体来弥补下一个可溶性结构域的N-末端“柄”区，后者可以导致不稳定性和/或聚集体形成。
此类可溶性结构域的一个进一步的优点是，RBD的N-末端和C-末端氨基酸对于任何抗药物抗体来说不是可接近的。优选地，所述单链融合多肽能够形成有序的三聚体结构，其包含至少一个对于各自CD40L受体的功能性结合位点。
所述CD40受体激动剂蛋白包含三个功能性CD40受体结合位点，即能够与CD40受体形成复合物的氨基酸序列。因此，所述可溶性结构域能够与相应的CD40受体相结合。在一个实施方案中，所述可溶性结构域中的至少一个能够激活受体，由此可以影响凋亡和/或增生活性。在一个进一步的实施方案中，所述可溶性结构域中的一个或多个由于不能够激活受体而被选择。
所述可溶性CD40L结构域可以源自在SEQ ID NO:1中所显示的人CD40L。优选地，所述可溶性CD40L结构域源自人CD40L，特别地从氨基酸121或122开始，并且特别地包含SEQID NO:1的氨基酸121-261或122-261。任选地，SEQ ID NO:1的氨基酸Gln121可以被不带电荷的氨基酸例如Ser或Gly替代。
表1：野生型人CD40L蛋白的序列
如上面所指出的，所述可溶性CD40L结构域可以包含在SEQ ID NO:1中所指出的野生型序列。但是，应当注意，可能的是，在这些可溶性结构域中的一个或多个之中引入突变，例如改变(例如增加或降低)所述可溶性结构域的结合特性的突变。在一个实施方案中，可以选择不能与相应的细胞因子受体相结合的可溶性结构域。
在本发明的一个进一步的实施方案中，所述可溶性CD40L结构域(i)包含CD40L或其受体结合结构域的突变体，其导致CD40受体的降低的亲和力和/或降低的激活。
突变体的结合和/或活性可以例如通过在An等人(2011,J Biol Chem 286(13):11226-11235)；Singh等人(1998,Protein Sci 7(5):1124-1135)；Kim等人,J Biol Chem286(13):11226-11235；或Singh等人,(1998).Protein Sci 7(5):1124-1135中所描述的测定法来进行测定。
突变体可以通过任何技术来产生并且是技术人员已知的。置换可以影响在本文中所描述的CD40L例如人CD40L(例如，SEQ ID NO:1)或其受体结合结构域的至少一个氨基酸。在这方面，优选的置换影响SEQ ID NO:1的人CD40L的下列氨基酸中的至少一个：E129、S132、T134、E142、Y145、Y146、R200、F201、Q220，例如E129G、S132E、S132N、T134E、T134N、E142G、E142S、Y145S、Y146S、R200S、Q220E和Q220S，特别是E129G和E142G。
氨基酸置换可以影响CD40L(例如，人CD40L)与或对于CD40结合或由CD40诱导的信号传导的结合和/或活性。CD40的结合和/或活性可以被正面地影响，即受体的更强的、更高选择性的或更特异性的结合和/或更多的激活。备选地，CD40的结合和/或活性可以被负面地影响，即受体的更弱的、更低选择性的或更不特异性的结合和/或更少的激活或没有激活。
影响CD40的结合和/或激活的本发明的具有氨基酸置换的CD40L的突变体的实例可以例如在An等人(参见上面)的图1中找到。
因此，一个实施方案为在本文中所描述的CD40受体激动剂蛋白，其中所述可溶性结构域中的至少一个包含CD40L或其受体结合结构域的突变体，其以比野生型CD40L低的程度结合和/或激活CD40。
显示出降低的由CD40L诱导的受体聚集和/或降低的信号传导的CD40L的突变体的进一步的实例为S132E和T134E。
一个实施方案为在本文中所描述的CD40受体激动剂蛋白，其中将至少一个人工N-糖基化共有位点引入到由E129-S136所限定的序列区域中，从而导致降低的受体聚集和/或降低的信号传导。导致在该区域中的人工N-糖基化共有位点的CD40L的突变体的实例为E129N、A130N、S132N、K133N和T134N。
在本发明的一个进一步的实施方案中，所述可溶性CD40L结构域(i)、(iii)和(v)中的一个或多个可以包含CD40L或其受体结合结构域的突变体，其导致降低的自聚集和/或延长的体内稳定性。在这方面，优选的置换影响SEQ ID NO:1的人CD40L的下列氨基酸中的至少一个：C178、C194、C218、N240；例如C178(A、S、G)、C194(A、S、G)、F201(G、S、T、D)、C218(A、S、G)和N240(E、S、D、T)。每个CD40L结构域的突变可以是相同的或不同的。
本发明的单链融合分子包含三个可溶性CD40L结构域，即组分(i)、(iii)和(v)。如果所述第二和/或第三可溶性CD40L结构域为在N-末端处缩短的结构域(其任选地包含氨基酸序列突变)，那么单链CD40L融合多肽针对聚集的稳定性得到增强。因此，优选地，所述第二和第三可溶性CD40L结构域两者均为在N-末端处缩短的结构域，其任选地在N-末端区域中，优选地在可溶性CD40L结构域的N-末端的前五个氨基酸之内包含氨基酸序列突变。这些突变可以包括碱性氨基酸被中性氨基酸(特别是丝氨酸或甘氨酸)替代。
与之相反，所述第一可溶性CD40L结构域的选择不是如此关键的。在此，可以使用具有全长N-末端序列的可溶性结构域。但是，应当注意的是，所述第一可溶性CD40L结构域也可以具有在N-末端处缩短的和任选地经突变的序列。
在本发明的一个进一步的优选实施方案中，所述可溶性CD40L结构域(i)、(iii)和(v)为可溶性人CD40L结构域。所述第一可溶性CD40L结构域(i)可以选自天然的、缩短的和/或经突变的序列。因此，所述第一可溶性CD40L结构域(i)具有这样的N-末端序列，所述N-末端序列可以在人CD40L的氨基酸Gln121或Ile122处开始，并且其中Gln121可以被中性氨基酸例如Ser或Gly替代。所述第二和第三可溶性CD40L结构域(iii)和(v)具有这样的缩短的N-末端序列，所述缩短的N-末端序列优选地以人CD40L的氨基酸Gln120或Ile122开始，并且其中Gln121可以被另一氨基酸例如Ser或Gly替代。
优选地，所述可溶性CD40L结构域(iii)和(v)的N-末端序列选自：
(a)Gln121或Ile122，
(b)(Gly/Ser)121。
所述可溶性CD40L结构域优选地以人CD40L的氨基酸Leu261结束。在某些实施方案中，所述CD40L结构域可以包含上面所描述的内部突变。
所述CD40受体激动剂蛋白的组分(ii)和(iv)分别为位于组分(i)和(iii)或者(iii)和(v)之间的肽连接体元件。所述柔性连接体元件具有3-8个氨基酸的长度，特别地3、4、5、6、7或8个氨基酸的长度。所述连接体元件优选地为甘氨酸/丝氨酸连接体，即基本上由氨基酸甘氨酸和丝氨酸组成的肽连接体。在所述可溶性细胞因子结构域以S或G(N-末端)开始的情况下，所述连接体在该S或G之前结束。
应当注意的是，连接体(ii)和连接体(iv)不需要具有相同的长度。为了降低潜在的免疫原性，使用较短的连接体可以是优选的。另外，结果发现较短的连接体导致具有降低的形成聚集体的倾向的单链分子。然而，比在此所公开的连接体长很多的连接体可以展现出不利的聚集特性。
如果希望，所述连接体可以包含可以形成糖基化位点Asn-Xaa-Ser的天冬酰胺残基。在某些实施方案中，所述连接体之一，例如连接体(ii)或连接体(iv)，包含糖基化位点。在其他实施方案中，连接体(ii)和连接体(iv)两者均包含糖基化位点。为了增加所述CD40L激动剂蛋白的溶解度和/或为了降低潜在的免疫原性，可以优选的是，连接体(ii)或连接体(iv)或者两者包含糖基化位点。
优选的连接体序列显示在表2中。优选的连接体为GSGSGNGS(SEQ ID NO:2)。
表2：连接体序列的实例
SEQ ID NO 序列
2 GSGSGNGS
3 GSGSGSGS
4 GGSGSGSG
5 GGSGSG
6 GGSG
7 GGSGNGSG
8 GGNGSGSG
9 GGNGSG
10 GSGSGS
11 GSGS
12 GSG
所述CD40受体激动剂蛋白另外还包含抗体Fc片段结构域，其可以位于所述第一CD40L结构域(i)的N-末端和/或所述第三CD40L结构域(v)的C-末端。优选地，所述抗体Fc片段结构域包含降低的在体内与Fc-γ-R受体相互作用的能力。优选地，所述抗体Fc片段结构域包含在SEQ ID NO:13或14中所显示的氨基酸序列或者由在SEQ ID NO:13或14中所显示的氨基酸序列组成。Fc片段结构域的实例显示在表3中。
表3：Fc片段结构域的实例
糖基化作用位点的总数目和碳水化合物在三维方面的独个位置影响CD40受体激动剂蛋白的体内稳定性。进一步地，碳水化合物识别依赖于末端糖的局部密度、碳水化合物树的支化和碳水化合物物质的相对位置。
CH2-结构域碳水化合物的消除是必需的，以便避免基于Fc-受体的体内交联和潜在的基于CD40L-受体超簇聚的毒性。进一步地，经部分降解的碳水化合物通过由凝集素驱动的机制来减少CD40受体激动剂蛋白的体内半寿期。通过减少在所述分子上的糖基化位点的总数目，所得的化合物较不易受到这些机制影响，从而增加半寿期。因此，在一个实施方案中，通过消除CH2-糖基化作用位点来减少在本发明的CD40受体激动剂蛋白上的糖基化作用位点的总数目，从而导致包含SEQ ID NO:15(蛋白质A)的N297S等价突变(按照EU编号系统)(其产生无糖基-CH2结构域)的CD40受体激动剂蛋白。
在其中铰链-链间二硫键被还原并且共价的链间连接被打断的“开放Fc-构象过渡”期间，存在于内表面区域上的CH2-糖基化作用位点通常保护该亚结构域免于蛋白酶影响(图10)。这使得CH2-解离以及内表面区域暴露于蛋白酶成为可能。
因此，包含SEQ ID NO:15(蛋白质A)的N297S等价突变(按照EU编号系统)(其产生无糖基-CH2)的CD40受体激动剂蛋白可能比具有野生型CH2糖基化的等价结构在蛋白质水解方面更不稳定。这将会影响在USP/DSP/储存(其中宿主细胞蛋白酶是存在的并且具有对于该结构的长期接近)期间化合物的稳定性。因此，在某些实施方案中，所述CD40受体激动剂缺乏CH2糖基化作用位点，但在每个多肽链的连接体序列(例如，GSGSGNGS，SEQ ID NO:2)中包含糖基化作用位点。在某些示例性的实施方案中，所述CD40受体激动剂包含五个糖基化作用位点/多肽链，因而在二聚体中总共十个糖基化作用位点。
根据本发明的一个优选的实施方案，所述抗体Fc片段结构域通过铰链-连接体元件来进行融合。所述铰链-连接体元件具有10-30个氨基酸的长度，特别地15-25个氨基酸的长度，例如22个氨基酸的长度。所述铰链-连接体元件优选地包含免疫球蛋白的铰链区序列，其在本文中称为“Ig铰链区”。术语“Ig铰链区”意指任何包含这样的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与天然出现的Ig铰链区序列(其包括半胱氨酸残基，在所述半胱氨酸残基处二硫键将免疫球蛋白的两条重链连接在一起)的一部分共享序列同一性或相似性。
铰链区的衍生物和类似物可以通过突变来获得。在本文中所提及的衍生物或类似物为包含这样的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与野生型蛋白质(或天然出现的蛋白质)的全长序列共享序列同一性或相似性，除了它具有一个或多个归因于缺失、插入和/或置换的氨基酸序列差异之外。但是，根据本发明，术语“铰链-连接体”并不限于那些包含Ig铰链区或其衍生物的连接体，而是涉及任何对于允许由该铰链-连接体元件所附着的结构域达到在生物学上有活性的构象来说足够长的连接体。
在独个CD40受体激动剂蛋白中具有开放Fc-构象的分子的数目取决于存在于铰链区中的链间二硫键的数目。因此，在一个实施方案中，将第三个半胱氨酸引入到本发明的CD40受体激动剂蛋白的铰链区中以便改善消除CH2-糖基化作用位点的影响。
使六价的CD40受体激动剂蛋白的同二聚体稳定化的铰链区的链间二硫化物连接还将会受到CD40L子序列的游离的硫羟基团(总共六个/二聚体)的影响。这也导致前面提及的开放FC-构象，其归因于由制备物的内源性游离硫羟基所造成的该结构的铰链二硫桥的自还原。因此，预期包含六个游离的硫羟基的单链CD40L-FC融合蛋白在制备和储存期间是较不稳定的，当出现长期暴露于氧和蛋白酶时。
因此，为了使得六价的CD40受体激动剂的制备成为可能，优选地将C194残基突变为不影响受体结合的不同的氨基酸。
进一步地，本发明的CD40受体激动剂蛋白另外还包含上部铰链赖氨酸至甘氨酸的突变，以减少在该位点处的蛋白质水解加工。因此，在一个实施方案中，本发明的CD40受体激动剂蛋白另外还包含上部铰链赖氨酸(K223，按照EU编号系统)至甘氨酸的突变以减少在该位点处的蛋白质水解加工，由此提高该融合蛋白的整体稳定性。将在铰链区内的上面提及的第三个半胱氨酸(C225，按照EU编号系统)的引入与上面提及的赖氨酸至甘氨酸的突变(K223G，按照EU编号系统)相组合导致本发明的经整体稳定化的CD40受体激动剂蛋白。
特别优选的铰链-连接体元件包含在SEQ ID NO:16中所显示的氨基酸序列或由在SEQ ID NO:16中所显示的氨基酸序列组成(表4)，所述在SEQ ID NO:16中所显示的氨基酸序列包括前面提及的半胱氨酸C225和赖氨酸至甘氨酸的突变K223G。
所述CD40受体激动剂蛋白另外还可以包含N-末端信号肽结构域，其允许在合适的宿主细胞中的加工，例如细胞外分泌。优选地，所述N-末端信号肽结构域包含蛋白酶切割位点，例如信号肽酶切割位点，并因此可以在表达之后或期间被去除以获得成熟的蛋白质。特别优选的N-末端信号肽结构域包含在SEQ ID NO:17中所显示的氨基酸序列(表4)。
进一步地，所述CD40受体激动剂蛋白另外还可以包含具有例如1-50，优选地10-30个氨基酸的长度的C-末端元件，其可以包括或连接至识别/纯化结构域，例如FLAG结构域、Strep-标签或Strep-标签II结构域和/或poly-His结构域。根据一个特别优选的实施方案，所述融合多肽包含在SEQ ID NO:18中所显示的通过短丝氨酸连接体而融合至C-末端的Strep-标签(表4)。
示例性的铰链-连接体元件(SEQ ID NO:16、19-24)、N-末端信号肽结构域(SEQ IDNO:17)和丝氨酸连接体-Strep标签(SEQ ID NO:18)显示在表4中。
表4：示例性的结构域和连接体
SEQ ID NO 序列
16 GSGSSSSSSSSGSCDKTHTCPPC
17 METDTLLVFVLLVWVPAGNG
18 SSSSSSAWSHPQFEK
19 GSGSSSSSSGSCDKTHTCPPC
20 GSGSSSSSSSGSCDKTHTCPPC
21 GSGSSSSSGSCDKTHTCPPC
22 GSGSSSGSCDKTHTCPPC
23 GSGSSSGSCDKTHTCPPCGS
24 GSGSSSGSCDKTHTCPPCGSGS
在本发明的一个实施方案中，所述融合多肽包含三个通过SEQ ID NO:2的肽连接体元件相融合的可溶性CD40L结构域。所述第一可溶性CD40L结构域(i)由根据SEQ ID NO:1的人CD40L的氨基酸121-261组成，并且所述可溶性CD40L结构域(iii)和(v)由根据SEQ IDNO:1的人CD40L的氨基酸121-261组成。
另外，所述融合多肽包含根据SEQ ID NO:13的抗体Fc片段结构域，其通过根据SEQID NO:16的铰链-连接体而融合至所述可溶性CD40L结构域(v)的C-末端。令人惊讶地，发明人发现，该特别的融合多肽提供了经改进的生物学活性，并且是特别稳定的。本发明的CD40受体激动剂蛋白的一个示例性实施方案的氨基酸序列示出在SEQ ID NO:27中。
进一步地，所述融合多肽可以包含N-末端信号肽结构域，例如根据SEQ ID NO:17的信号肽结构域。本发明的CD40受体激动剂蛋白的一个特别的实例显示在SEQ ID NO:25中。
根据另一个优选的实施方案，所述融合多肽另外还可以包含在SEQ ID NO:18中所显示的通过短丝氨酸连接体而融合至本发明的多肽的C-末端Strep-标签。根据本发明的这一方面，所述Fc片段优选地由在SEQ ID NO:13或14中所显示的氨基酸序列组成。进一步地，所述Fc片段可以由更短的Fc片段(其例如包括SEQ ID NO:13的氨基酸1-217)组成。包含C-末端Strep-标签的融合多肽的特别优选的实例显示在SEQ ID NO:15(蛋白质A)中。
示例性的CD40受体激动剂蛋白显示在SEQ ID NO:15、25和26中，每一个包含N-末端信号肽结构域。所述信号肽结构域包括氨基酸1-20。在每种情况下，成熟蛋白质以氨基酸21开始。本发明的成熟的示例性的CD40受体激动剂蛋白(没有信号肽)示出在SEQ ID NO:27-30、32和34中。上面所描述的示例性的CD40受体激动剂蛋白显示在表5中。
根据本发明的一个实施方案，所述单链CD40L融合多肽结构域包含三个通过SEQID NO:2的肽连接体元件相融合的可溶性CD40L结构域。所述可溶性CD40L结构域(i)、(iii)和(v)各自由具有C194S突变的根据SEQ ID NO:1的人CD40L的氨基酸121-261组成。包含前面提及的CD40L 121-261C194S突变蛋白的该单链CD40L多肽显示在SEQ ID NO:36中，其非常适合于产生具有相比于野生型而言经提高的稳定性的在N-末端或C-末端处的融合蛋白。在一个优选的实施方案中，根据SEQ ID NO:13的抗体Fc片段结构域通过根据SEQ ID NO:16的铰链连接体而融合至SEQ ID NO:36的可溶性CD40L结构域(v)的C-末端。
SEQ ID NO:27中所示的CD40受体激动剂具有减少的糖基化位点的总数目(在CH2区中的N297S突变提供了无糖基化的CH2结构域)、增加的在铰链区中的链间二硫键的数目和上部铰链赖氨酸至甘氨酸的突变。这些改变提供了在潜在的降解和CD40L受体超簇聚(连同相伴随的毒性一起)方面的降低。在一些实施方案中，N-末端谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸(Liu等人,2011,J.Biol.Chem.286:11211-11217)。
表5：示例性的CD40受体激动剂蛋白
本发明的一个进一步的方面涉及编码在本文中所描述的CD40受体激动剂蛋白的核酸分子。所述核酸分子可以为DNA分子，例如双链或单链DNA分子，或者RNA分子。所述核酸分子可以编码所述CD40受体激动剂蛋白或其前体，例如所述CD40受体激动剂蛋白的原形式或前原形式，其可以包含信号序列或者其他用于分泌或纯化的异源氨基酸部分(其优选地位于所述CD40受体激动剂蛋白的N-末端和/或C-末端处)。所述异源氨基酸部分可以通过蛋白酶切割位点(例如凝血因子X3、凝血酶或IgA蛋白酶切割位点)而连接至所述第一和/或第二结构域。本发明的核酸序列的一个特别的实例显示在表6中，作为SEQ ID NO:37。该核酸分子编码SEQ ID NO:25的融合多肽。
表6：示例性的CD40受体激动剂蛋白的核酸序列
可以将所述核酸分子可操作地连接至表达控制序列，例如允许所述核酸分子在所希望的宿主细胞中表达的表达控制序列。所述核酸分子可以位于载体(例如质粒、噬菌体、病毒载体、染色体整合载体等)上。合适的表达控制序列和载体的实例例如由Sambrook等人(1989)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press和Ausubel等人(1989),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons或者其更近期的版本进行了描述。
各种表达载体/宿主细胞系统可以用于表达编码本发明的CD40受体激动剂蛋白的核酸序列。合适的宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如细菌，例如大肠杆菌(E.coli)，真核宿主细胞例如酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或动物细胞，优选地哺乳动物细胞，和更优选地人细胞。进一步地，本发明涉及用上面所描述的核酸分子转化或转染的非人生物。这样的转基因生物可以通过已知的基因转移方法(包括同源重组)来产生。
本发明的一个进一步的方面涉及药物组合物或诊断组合物，其包含至少一种CD40受体激动剂蛋白、编码其的各自的核酸或者经转化或经转染的细胞(所有均描述在本文中)作为活性试剂。
在本文中所使用的术语“CD40L相关性疾病或病症”为任何可以通过添加CD40受体激动剂来改善的疾病或病症。至少一种CD40受体激动剂蛋白、编码其的各自的核酸或者经转化或经转染的细胞(所有均描述在本文中)可以在疗法中进行使用，例如在由CD40L功能障碍所引起的、与CD40L功能障碍相关的和/或伴随有CD40L功能障碍的病症的预防和/或治疗中进行使用，所述病症特别地为增生性病症，例如肿瘤，例如实体或淋巴肿瘤；感染性疾病；炎性疾病；代谢疾病；自身免疫性病症，例如类风湿性和/或关节炎性疾病；变性疾病，例如神经变性疾病，例如多发性硬化；凋亡相关性疾病；或移植排斥。
在本文中所使用的术语“CD40L功能障碍”被理解为任何偏离CD40L的正常功能或表达的CD40L的功能或表达，例如相比于CD40L的正常生理表达水平而言，CD40L基因或蛋白质的过表达，减少的或取消的CD40L基因或蛋白质的表达；相比于CD40L的正常生理活性或结合而言，增加的CD40L的活性，减少的或取消的CD40L的活性，增加的CD40L与任何结合伙伴(例如与受体，特别是CD40L受体，或另一细胞因子分子)的结合，减少的或取消的与任何结合伙伴(例如与受体，特别是CD40L受体，或另一细胞因子分子)的结合。
在各种实施方案中，提供了用于诊断和/或治疗罹患可以通过靶向CD40L受体来进行诊断和/或治疗的病症的人受试者的方法，所述方法包括向所述人受试者施用在本文中所公开的CD40受体激动剂蛋白，从而在所述人受试者中对于所述靶标的活性的效应是激动性的，一个或多个症状得到减轻，和/或实现治疗。在本文中所提供的CD40受体激动剂蛋白可以用于诊断和/或治疗罹患原发性和转移性癌症的人，所述癌症包括乳腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌(例如，小细胞肺癌“SCLC”和非小细胞肺癌“NSCLC”)、口咽癌、咽下部癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、胆囊和胆管癌、小肠癌、泌尿道癌(包括肾癌、膀胱癌和尿路上皮癌)、女性生殖道癌(包括宫颈癌、子宫癌和卵巢癌，以及绒毛膜癌和妊娠滋养层成瘤性疾病)、男性生殖道癌(包括前列腺、精囊、睾丸和生殖细胞肿瘤)、内分泌腺癌(包括甲状腺癌、肾上腺癌和脑垂体癌)和皮肤癌，以及血管瘤，黑素瘤，肉瘤(包括产生自骨和软组织的那些，以及卡波西肉瘤)，脑、神经、眼睛和脑脊膜的肿瘤(包括星形细胞瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、神经母细胞瘤、神经鞘瘤和脑脊膜瘤)，产生自造血系统恶性病、急性白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、慢性粒细胞白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多毛细胞白血病、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、DLBCL、滤泡型淋巴瘤、造血系统恶性病、卡波西肉瘤、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增多病、恶性黑素瘤、多发性骨髓瘤、副癌综合征/恶性高钙血症的肿瘤，或者实体肿瘤。
提供了包含在本文中所公开的CD40受体激动剂蛋白和在药学上可接受的载料的药物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物包含至少一种额外的用于治疗病症的治疗试剂。例如，所述额外的试剂可以是治疗试剂、化学治疗剂、成像试剂、细胞毒性试剂、血管发生抑制剂、激酶抑制剂(包括但不限于，KDR和TIE-2抑制剂)、共刺激分子调节剂或免疫检查点抑制剂(包括但不限于，抗-B7.1、抗-B7.2、抗-B7.3、抗-B7.4、抗-CD28、抗-B7RP1、CTLA4-Ig、抗-CTLA-4、抗-PD-1、抗-PD-L1、抗-PD-L2、抗-ICOS、抗-LAG-3、抗-Tim3、抗-VISTA、抗-HVEM、抗-BTLA，LIGHT融合蛋白、抗-CD137、抗-CD137L、抗-OX40、抗-OX40L、抗-CD70、抗-CD27、抗-GAL9、抗-A2AR、抗-KIR、抗-IDO-1、抗-CD20)、树突细胞/抗原呈递细胞调节剂(包括但不限于，抗-CD40抗体、抗-CD40L、抗-DC-SIGN、抗-Dectin-1、抗-CD301、抗-CD303、抗-CD123、抗-CD207、抗-DNGR1、抗-CD205、抗-DCIR、抗-CD206、抗-ILT7)，Toll-样受体的调节剂(包括但不限于，抗-TLR-1、抗-TLR-2、抗-TLR-3、抗-TLR-4、抗-TLR-4、抗-TLR-5、抗-TLR-6、抗-TLR-7、抗-TLR-8、抗-TLR-9)、粘附分子阻断剂(包括但不限于，抗-LFA-1抗体、抗-E/L选择蛋白抗体、小分子抑制剂)、抗细胞因子抗体或其功能片段(包括但不限于，抗-IL-18，抗-TNF或抗-IL-6/细胞因子受体抗体)、双特异性重定向T细胞或NK细胞细胞毒性(包括但不限于，)、基于嵌合T细胞受体(CAR-T)的疗法、基于T细胞受体(TCR)的疗法、治疗性癌症疫苗、氨甲蝶呤、环孢菌素、雷帕霉素、FK506、可检测的标记或报告物、TNF拮抗剂、抗风湿药、肌肉松弛药、麻醉品、非类固醇抗炎药(NSAID)、镇痛药、麻醉剂、镇静药、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗微生物剂、抗银屑病药、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、促红细胞生成素、免疫接种、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁药、抗精神病药、兴奋剂、哮喘药疗法、β激动剂、吸入式类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
在一个实施方案中，在治疗癌症或者预防或抑制从在本文中所描述的肿瘤进行转移的方法中，所述CD40受体激动剂蛋白可以单独地或者与一种或多种额外的试剂(例如化学治疗剂、放射疗法试剂或生物学试剂)相组合地进行使用。在一些实施方案中，所述试剂可以包括下列：13-顺-视黄酸；2-CdA；2-氯脱氧腺苷；5-氮杂胞苷；5-氟尿嘧啶；5-FU；6-巯基嘌呤；6-MP；6-TG；6-硫代鸟嘌呤；Abraxane；放线菌素-D； Ala-阿地白介素；阿仑珠单抗；ALIMTA；阿利维A酸；Alkaban-全反式视黄酸；α干扰素；六甲蜜胺；甲氨蝶呤；氨磷汀；氨鲁米特；阿那格雷；阿那曲唑；阿糖胞苷；Ara- 三氧化二砷；ArzerraTM；天冬酰胺酶；ATRA；氮杂胞苷；BCG；BCNU；苯达莫司汀；贝伐珠单抗；贝沙罗汀；比卡鲁胺；BiCNU；博来霉素；硼替佐米；白消安；C225；亚叶酸钙；喜树碱-11；卡培他滨CaracTM；卡铂；卡莫司汀；卡莫司汀糯米纸囊剂；CC-5013；CCI-779；CCNU；CDDP；CeeNU；西妥昔单抗；苯丁酸氮芥；顺铂；嗜橙菌因子；克拉屈滨；可的松；CPT-11；环磷酰胺；阿糖胞苷；阿糖胞苷脂质体；Cytosar-达卡巴嗪；Dacogen；更生霉素；达贝泊汀α；达沙替尼；道诺霉素；柔红霉素；盐酸柔红霉素；柔红霉素脂质体；Decadron；地西他滨；Delta-地尼白介素；Diftitox；DepoCytTM；地塞米松；醋酸地塞米松；地塞米松磷酸钠；Dexasone；右雷佐生；DHAD；DIC；Diodex；多西他赛；多柔比星；多柔比星脂质体；DroxiaTM；DTIC；DTIC-Duvelisib；EligardTM；EllenceTM；EloxatinTM；表柔比星；阿法依泊汀；爱比妥；厄洛替尼；欧文氏菌属L-天冬酰胺酶；雌莫司汀；Ethyol依托泊苷；磷酸依托泊苷；依维莫司；依西美坦；非格司亭；氟尿苷；氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟尿嘧啶(霜剂)；氟甲睾酮；氟他胺；亚叶酸；氟维司群；吉非替尼；吉西他滨；吉妥珠单抗奥佐米星；健择；GleevecTM；糯米纸囊剂；GM-CSF；戈舍瑞林；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(G-MCSF)；Hexadrol；六甲基蜜胺；HMM；Hydrocort氢化可的松；氢化可的松磷酸钠；氢化可的松琥珀酸钠；磷酸氢化可的松；羟基脲；依鲁替尼(Ibrutinib)；伊莫单抗(Ibritumomab)；替伊莫单抗；伊达比星干扰素-α；干扰素-α-2b(PEG缀合物)；异环磷酰胺；白介素-11(IL-11)；白介素-2(IL-2)；甲磺酸伊马替尼；达卡巴嗪；Intron伊匹木单抗；伊立替康；异维A酸；伊沙匹隆；IxempraTM；Kidrolase(t)拉帕替尼；L-天冬酰胺酶；LCR；来那度胺；来曲唑；亚叶酸；留可然；LeukineTM；亮丙立德；长春新碱；LeustatinTM；Lirilumab；脂质体Ara-C；Liquid洛莫司汀；L-PAM；美法仑；LupronMaxidex；氮芥；盐酸氮芥；甲地孕酮；醋酸甲地孕酮；MEK抑制剂；美法仑；巯基嘌呤；美司钠；MesnexTM；氨甲蝶呤；氨甲蝶呤钠；甲泼尼龙；丝裂霉素；丝裂霉素-C；米托蒽醌M-MTC；MTX；氮芥；MylocelTM；Navitoclax；奈拉滨；NeulastaTM； 尼洛替尼；尼鲁米特；氮芥纳武单抗(Nivolumab)；Nplate；奥曲肽；醋酸奥曲肽；奥法木单抗；OnxalTM；奥普瑞白介素；奥沙利铂；紫杉醇；蛋白质结合型紫杉醇；帕米膦酸盐；帕尼单抗； 帕唑帕尼；PEG干扰素；培门冬酶；培非司亭；PEG-INTRONTM；PEG-L-天冬酰胺酶；培美曲塞；Pembrolizumab；喷司他丁；培妥珠单抗；苯丙氨酸氮芥；Pidilizumab；Platinol-泼尼松龙；泼尼松；丙卡巴肼；具有卡莫司汀的Prolifeprospan 20植入物；BRAF抑制剂；雷洛昔芬； 利妥昔单抗；罗米司亭(Romiplostim)；盐酸红比霉素；Sandostatin沙格司亭；Solu-Solu-索拉非尼；SPRYCELTM；STI-571；STIVAGRATM；链佐星；SU11248；舒尼替尼；他莫昔芬替莫唑胺坦罗莫司；替尼泊苷；TESPA；沙利度胺； 硫代鸟嘌呤；硫代鸟嘌呤硫代磷酰胺；塞替派；托泊替康；托瑞米芬；托西莫单抗；曲妥珠单抗；曲美木单抗(Tremelimumab)；维A酸；TrexallTM；TSPA；Urelumab；VCR；VectibixTM；Venetoclax；ViadurTM；长春碱；硫酸长春碱；Vincasar长春新碱；长春瑞滨；酒石酸长春瑞滨；VLB；VM-26；伏林司他；Votrient；VP-16； ZevalinTM；唑来膦酸；Zolinza；或和/或任何靶向相似途径的未在此特别列出的其他试剂。
当使用两种或更多种物质或成分作为联合治疗方案的一部分时，它们可以通过相同的施用途径或通过不同的施用途径，在基本上相同的时间或在不同的时间(例如基本上同时地、连续地或按照交替的方案)进行施用。当将物质或成分通过相同的施用途径同时地进行施用时，可以将它们作为不同的药物制剂或组合物或者作为组合的药物制剂或组合物的一部分来进行施用，正如对于技术人员来说将会是清楚的那样。
此外，当使用两种或更多种活性物质或成分作为联合治疗方案的一部分时，所述物质或成分中的每一种可以以相同的量并且按照当所述化合物或成分以其自身使用时所采用的相同的方案进行施用，并且这样的联合使用可以或可以不导致协同效应。但是，当所述两种或更多种活性物质或成分的联合使用导致协同效应时，也可能的是，减少一种、多于一种或所有待施用的物质或成分的量，同时仍然实现所希望的治疗作用。这例如对于避免、限制或减少任何与所述物质或成分中的一种或多种的使用(当它们以其平常量进行使用时)相关联的不希望的副作用而同时仍然获得所希望的药学或治疗效果来说可以是有用的。
根据本发明所使用的治疗方案的功效可以以任何对于所牵涉的疾病或病症来说本身已知的方式来进行测定和/或追踪，正如对于临床医生来说将会是清楚的那样。当合适时和基于个案，临床医生也将会能够改变或修改具体的治疗方案，以便实现所希望的治疗效果，避免、限制或减少不希望的副作用，和/或在一方面实现所希望的治疗效果和另一方面避免、限制或减少不希望的副作用之间实现适当的平衡。
通常，将会遵循治疗方案直至实现所希望的治疗效果和/或经过维持所希望的治疗效果的时间长度。再次，这可以由临床医生来决定。
在各种实施方案中，在本文中提供了药物组合物，其包含一种或多种CD40受体激动剂蛋白，单独地或者与预防试剂、治疗试剂和/或在药学上可接受的载料相组合地。在各种实施方案中，在本文中所公开的药物组合物的用途的非限制性实例包括，诊断、检测和/或监测病症，预防、治疗、管理和/或改善病症或者其一种或多种症状，和/或用于研究。药物组合物的配制(单独地或者与预防试剂、治疗试剂和/或在药学上可接受的载料相组合地)是本领域技术人员已知的(美国专利公开号20090311253 A1)。
在各种实施方案中，药物制剂可以包含一种或多种氨基酸，一种或多种多糖和/或聚山梨醇酯，和以大约0.1至100mg/ml(包括端点)(例如，0.1-10、1-10、0.1-50、1-50、1-100、10-100、25-100、25-50或50-100mg/ml)的浓度存在的CD40受体激动剂蛋白，其中所述制剂处于大约5.0至7.0的pH(包括端点)(例如，大约5.0-6.0、5.5-6.0、5.0-6.5、5.5-6.5或6.0-7.0的pH)。在一个实施方案中，在所述制剂中的至少一种氨基酸为组氨酸，并且以大约10-20mM、10-15mM、15-20mM或大约15mM的浓度存在。在一个实施方案中，在所述制剂中的至少一种多糖为蔗糖，并且以大约0-8.0％(重量/体积；w/v)的浓度存在。在一个实施方案，在所述制剂中的聚山梨醇酯为聚山梨醇酯80，并且处于大约0-0.06％w/v的浓度。在一个实施方案中，在所述制剂中的至少一种氨基酸为精氨酸，并且以大约0-1.5％w/v(例如，0.5-1.5、1.0-1.5或0.5-1.0w/v)的浓度存在。在一个实施方案中，所述CD40受体激动剂蛋白以大约0.1-100mg/ml(例如，大约1-100mg/ml，或大约1-15mg/ml，或大约1-7.5mg/ml，或大约2.5-7.5mg/ml，或大约5-7.5mg/ml，或大约25-100mg/ml，或大约20-60mg/ml，或大约25-50mg/ml，或大约25mg/ml，或大约50mg/ml，或大约0.1-60mg/ml，或大约0.1-25mg/ml，或大约1.0-60mg/ml，或大约0.5-60mg/ml，或大约0.1-2.0mg/ml，或大约0.5-2.0mg/ml，或大约1-5mg/ml，或大约1-7.5mg/ml，或大约1-15mg/ml，或大约0.5mg/ml，或大约1.0mg/ml)的浓度存在于所述制剂中。
如在本文中所使用的，短语“有效量”意指这样的CD40L激动剂蛋白的量，其导致在一个或多个与CD40L功能障碍或者与CD40L相关性疾病或病症相关联的参数方面的可检测的改进(例如，离基线至少大约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或更多)。
在各种实施方案中，所述药物制剂为水性制剂、冻干制剂或经冻干并再水化的制剂。在一个实施方案中，水化溶液为右旋糖和/或盐水(例如，浓度为大约5％w/v的右旋糖和/或浓度为大约0.9％w/v的盐水)。在一个实施方案中，所述药物制剂包含大约15mM的组氨酸，大约0.03％(w/v)的聚山梨醇酯80，大约4％(w/v)的蔗糖，和大约0.1-25mg/ml的CD40受体激动剂蛋白，或大约1-15mg/ml的CD40受体激动剂蛋白，并且处于大约6的pH。在一个实施方案中，所述制剂进一步包含至少一种额外的试剂。
在各种实施方案中，使用这样的制剂，其包含大约25mg/ml的CD40受体激动剂蛋白，大约15mM的组氨酸，0.03％的聚山梨醇酯80(重量/体积，w/v)，4.0％的蔗糖(w/v)，和大约6.0的pH。在一些实施方案中，所述制剂不包含精氨酸。在一些实施方案中，所述制剂出人意料地展现出经改进的冻融稳定性、液体制剂稳定性和/或冻干制剂稳定性，相比于包含其他组分或浓度的其他制剂而言。
施用在本文中所提供的治疗试剂的方法包括但不限于，口服施用、肠胃外施用(例如，真皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下)、硬膜外施用、肿瘤内施用、粘膜施用(例如，鼻内和口部途径)和肺部施用(例如，用吸入器或喷雾器进行施用的气溶胶化化合物)。用于特定施用途径的药物组合物的配制以及对于各种施用方法来说所需要的材料和技术是可得的并且是本领域技术人员已知的(美国专利公开号20090311253 A1)。
在各种实施方案中，可以调整给药方案以提供最佳的所希望的应答(例如，治疗性或预防性应答)。例如，可以施用单次推注，可以在一段时间内施用数个分开的剂量，或者可以按比例地减少或增加剂量(按照由治疗情形的紧急事件所指示的)。在一些实施方案中，将肠胃外组合物配制成剂量单位形式，以为了施用的方便和剂量的一致性。术语“剂量单位形式”是指适合作为用于待治疗的哺乳动物受试者的单一剂量的在物理上分离的单位，其中每个单位包含经计算能产生所希望的治疗效果的预先确定量的活性化合物，以及与之相联合的所需要的药学载料。
关于在本文中所提供的CD40受体激动剂蛋白的治疗或预防有效量的示例性而非限制性的范围为大约0.1-100mg/kg(例如，大约0.1-0.5、0.1-1、0.1-10、0.1-20、0.1-50、0.1-75、1-10、1-15、1-7.5、1.25-15、1.25-7.5、2.5-7.5、2.5-15、5-15、5-7.5、1-20、1-50、7-75、1-100、5-10、5-15、5-20、5-25、5-50、5-75、10-20、10-50、10-75或10-100mg/kg，或任何居间的浓度)。在一些实施方案中，所述CD40受体激动剂蛋白以治疗有效浓度，例如大约0.1-100mg/ml的浓度(例如，大约0.1-0.5、0.1-1、0.1-10、0.1-20、0.1-50、0.1-75、1-10、1-20、1-50、1-75、1-100、5-10、5-15、5-20、5-25、5-50、5-75、10-20、10-50、10-75或10-100mg/ml，或任何居间的浓度)存在于药物组合物中。注意，剂量值可以随着待减轻的状况的类型和/或严重度而变化。需进一步理解的是，对于任何具体的受试者，可以根据个体需要和/或施行或监督组合物施用的人员的专业判断，随时间调整特定的给药方案；并且在本文中所列出的剂量范围仅是示例性的而并不意图限制所要求保护的组合物的范围或实施。
实施例
实施例1：CD40受体激动剂蛋白的制备
1.1多肽结构
A)氨基酸Met1-Gly20
Ig-κ-信号肽，在氨基酸Gly20之后为假定的信号肽酶切割位点。
B)氨基酸Gln21-Leu161
人CD40L配体(CD40L，SEQ ID NO:1的氨基酸121-261)的第一可溶性细胞因子结构域。
C)氨基酸Gly162-Ser169
SEQ ID NO:2的第一肽连接体元件。
D)氨基酸Gln170-Leu310
人CD40L配体(CD40L，SEQ ID NO:1的氨基酸121-261)的第二可溶性细胞因子结构域。
E)氨基酸Gly311-Ser318
SEQ ID NO:2的第二肽连接体元件。
F)氨基酸Gln319-Leu459
人CD40L配体(CD40L，SEQ ID NO:1的氨基酸121-261)的第三可溶性细胞因子结构域。
G)氨基酸Gly460-Cys482
SEQ ID NO:16的铰链-连接体元件。
H)氨基酸Pro483-Lys700
SEQ ID NO:13的抗体Fc片段结构域。
上面的CD40受体激动剂蛋白显示在SEQ ID NO:25中。
所指出的连接体可以被其他优选的连接体(例如在SEQ ID NO:3-12中所显示的连接体)替代。
所指出的铰链-连接体元件可以被其他优选的铰链-连接体(例如在SEQ ID NO:19和20中所显示的铰链-连接体)替代。
应当注意的是，所述第一和第二肽连接体不需要是相同的。
所述信号肽序列(A)可以被任何其他合适的信号肽序列(例如哺乳动物信号肽序列)替代。
1.2编码多肽的基因盒
可以鉴于用于在合适的宿主细胞(例如，昆虫细胞或哺乳动物细胞)中的表达的其密码子使用来对合成的基因进行优化。优选的核酸序列显示在SEQ ID NO:37中。
实施例2：表达和纯化
2.1融合多肽的克隆、表达和纯化
在两种不同的真核宿主细胞中重组表达上面提及的融合蛋白：
关于上面提及的CD40受体激动剂融合蛋白的初始分析，用包含关于融合多肽的表达盒和合适的选择标记(例如，包含杀稻瘟素、嘌呤霉素或潮霉素抗性基因的功能性表达盒)的质粒瞬时转染在补充有10％FBS、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM+GlutaMAX(GibCo)中生长的Hek293T细胞。在需要多条多肽链来达到最终产物的那些情况下，在转染期间将所述表达盒组合在一个质粒上或安置在不同的质粒上。在转染后三天收获包含重组融合多肽的细胞培养物上清液，并且通过以300×g进行离心和随后经过0.22μm无菌过滤器进行过滤来进行澄清。
关于待体内使用的CD40受体激动剂融合蛋白的较大规模的表达，将编码前面提及的蛋白质的合成的DNA盒插入到真核表达载体中，所述真核表达载体包含合适的选择标记(例如，含杀稻瘟素、嘌呤霉素或潮霉素抗性基因的功能性表达盒)和适合于提高在宿主细胞基因组内的在转录上有活性的插入位点的数目的遗传元件。将序列经验证的表达载体通过电穿孔引入到适应悬浮的中国仓鼠卵巢细胞(CHO-S，Invitrogen)中。在转染后三天，向经转染的细胞施加合适的选择压力。通过随后的在选择压力下进行的培养来回收携带源自载体的抗性基因的存活细胞。在所选择的细胞汇集物在定轨摇床培养箱(100rpm，50mm摇动行程)中在37℃和7％CO2气氛下在化学成分确定的培养基(PowerCHO2-CD，Lonza)中稳定生长后，通过ELISA测定法来分析独个上清液(检测上面提及的蛋白质)，并且在蛋白质产生之前在摇瓶中扩展具有最高比生产率的细胞汇集物(定轨摇床，100rpm，摇动行程50mm)。
关于实验室规模的蛋白质产生，将独个细胞汇集物在Wave生物反应器20/50EHT(GE-Healthcare)中在37℃和7％CO2气氛下在化学成分确定的培养基(PowerCHO2-CD，Lonza)中培养7-12天。基础培养基是补充有4mM Glutamax的PowerCHO2-CD。Wave培养以0.3-0.4×10e6细胞/ml的活细胞浓度和下面的设置(对于五升或十升袋子)开始：摇动频率18rpm，摇动角度7°，气流0.2-0.3L/分钟，7％CO2，36.5℃。在Wave运行期间，用PowerFeed A(Lonza)给细胞培养物进行两次补料，通常在第2天(20％补料)和第5天(30％补料)。在第二次补料后，将摇动频率增加至22rpm，以及将摇动角度增加至8°。
该生物反应器通过在第7天至第12天进行收获，当细胞生存力下降至低于80％时。首先，使用手动深度过滤系统(Millipore Millistak Pod，MC0HC 0.054m2)来使培养物上清液澄清。对于加有Strep标签的蛋白质，添加抗生物素蛋白至0.5mg/L的最终浓度。最后，使用瓶顶过滤器(0.22μm，PES，Corning)来无菌过滤包含CD40受体激动剂蛋白的培养物上清液，并储存于2-8℃直至进一步加工。
关于亲和纯化，将Streptactin Sepharose装填到柱子(凝胶床1ml)中，用15ml缓冲液W(100mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0)或PBS pH 7.4进行平衡，并且将细胞培养物上清液以4ml/分钟的流速施加到柱子上。随后，用15ml缓冲液W洗涤柱子，并且通过添加7×1ml缓冲液E(100mM Tris HCl，150mM NaCl，2.5mM脱硫生物素，pH 8.0)来逐步洗脱所结合的多肽。备选地，可以将包含2.5mM脱硫生物素的PBS pH 7.4用于该步骤。
作为基于Streptactin Sepharose的方法的备选方案，采用具有固定化的A蛋白作为亲和配体的柱子和Akta层析系统(GE-Healthcare)来进行亲和纯化。选择对于所述融合蛋白的FC-结构域具有高亲和力的固相材料：MABSelect SureTM(GE Healthcare)。简而言之，将经澄清的细胞培养物上清液加载在于洗涤缓冲液-1(20mM Pi，95mM NaCl，pH7.2)中进行平衡的HiTrap MabSelectSure柱(CV＝5ml)上，不超过10mg融合蛋白/ml柱床的载量。将柱子用十个柱体积(10CV)的上面提及的平衡缓冲液进行洗涤，随后用四个柱体积(4CV)的洗涤缓冲液-2(20mM Pi，95mM NaCl，pH 8.0)进行洗涤，以除去宿主细胞蛋白质和宿主细胞DNA。然后，将柱子用洗脱缓冲液(20mM Pi，95mM NaCl，pH 3.5)进行洗脱，并且将洗出液收集成直至十个级分，其中每个级分具有等于柱床体积(5ml)的体积。将每个级分用等体积的上面提及的洗涤缓冲液-2进行中和。将线速度设置在150cm/小时并且在上面提及的亲和层析方法期间保持恒定。
对洗出液级分的蛋白质量进行定量，并且将峰级分通过超滤来进行浓缩并通过大小排阻层析(SEC)来进一步进行纯化。
SEC在Superdex 200 10/300GL或HiLoad 26/60柱上通过使用Akta层析系统(GE-Healthcare)来进行。用磷酸盐缓冲盐水来平衡柱子，并且将经浓缩的经亲和纯化的多肽加载到SEC柱上，其中样品体积不超过柱体积的2％(v/v)。在Superdex 200 10/300GL柱(GEHealthcare)的情况下，应用0.5ml/分钟的流速。在HiLoad 26/60Superdex200柱的情况下，应用2.5ml/分钟的流速。所述多肽的洗脱特性谱通过在280nm处的吸光度来进行监测。
六价的scCD 40L-RBD-FC融合蛋白“蛋白质A”、“蛋白质B”和“蛋白质C”的分析型SEC的色谱图显示在图5中。
关于测定经纯化的融合多肽在天然条件下的表观分子量，用具有已知分子量的标准蛋白质加载Superdex 200柱。基于标准蛋白质的洗脱体积，绘制校准曲线并测定经纯化的融合多肽的表观分子量。包含FC-结构域的CD40受体激动剂融合蛋白典型地以大约160-180kDa的表观分子量从Superdex200柱上洗脱出来，这证实了通过Fc结构域的成熟CD40受体激动剂融合多肽的同二聚化。
实施例3：从蛋白质A、B和C表达的二聚体蛋白质的SDS-PAGE结果
表达出蛋白质A、B和C并按照实施例1和2来进行纯化。将这三种经纯化的蛋白质不进行还原(泳道1、4和7)或用二硫苏糖醇进行还原(泳道2、5、8)，并且在4-12％bis-tris中进行SDS-Page凝胶电泳。结果显示在图6中。泳道1显示，在非还原条件下，“蛋白质A”表达出的蛋白质具有单体(85kDa)和二聚体(170kDa)两个条带，这表明了由在所述多肽自身内存在的内源性游离硫羟基所造成的链间铰链二硫化物的自还原。相反地，泳道4和7显示，在非还原条件下，“蛋白质B”和“蛋白质C”表达出的蛋白质只具有二聚体(170kDa)条带，这表明了所述多肽自身没有自还原特性，从而使得铰链区的链间二硫桥保持完整。
实施例4：三价的对照蛋白质
为了在六价的CD40受体激动剂融合蛋白与用噬菌体RB69-FOLDON进行稳定化的三价的CD40之间比较相对结合，在CHO-S细胞中表达蛋白质X(SEQ ID NO:38)并且如在前面部分中描述的那样进行纯化。将经SEC纯化的蛋白质在下面的实施例中用作对照。蛋白质X(SEQ ID NO:38)的序列显示在表7中。蛋白质X的氨基酸1-20表示信号肽，并且成熟蛋白质以氨基酸Gln21开始。该蛋白质由三个相同的多肽组成，每个多肽包含一个可溶性CD40L结构域(SEQ ID NO:1的Q121-L261)，该装配通过用柔性连接体融合至CD40L的C-末端的噬菌体RB69fibritin的三聚化结构域来进行稳定化。
表7：包括信号肽的三价的对照蛋白质
实施例5：细胞测定法
5A.细胞结合测定法，以证明CD40受体激动剂与在Ramos B细胞表面上的其天然受体CD40的结合
为了补足我们通过使用石英晶体微量天平(QCM)而获得的关于CD40受体激动剂的亲和力数据，我们想要调查我们的CD40受体激动剂是否可以结合在细胞表面上的其天然受体。由于B细胞依赖于CD40信号传导来进行完全激活，因而我们使用了人B细胞系Ramos用于该测定法。已知Ramos细胞在其表面表达CD40，并且在与CD40受体激动剂一起温育后，可以想象能够用抗体检测与我们的CD40受体激动剂相偶联的C-末端StrepTag II。然后，该抗体则可以用荧光抗体来进行检测，并且可以在流式细胞仪上分析细胞。
将在其表面上表达CD40的Ramos B细胞与蛋白质X(c)、蛋白质A(d)、蛋白质B(e)或蛋白质C(f)一起在冰上温育30分钟以允许受体-配体缔合。用冰冷的洗涤缓冲液洗涤细胞，随后将其与多克隆兔抗-StrepTagII抗体一起在冰上温育30分钟以检测啮合在细胞表面上的CD40受体激动剂。通过向染色和洗涤缓冲液中添加1％人IgG(Gamunex)来封闭Fc-受体。用冰冷的洗涤缓冲液再次洗涤细胞，随后将其与多克隆的经Alexa488标记的山羊抗兔抗体一起在冰上和在黑暗中温育20分钟。随后，通过用冰冷的PBS进行洗涤来对细胞进行加工以用于流式细胞术。在Guava Easycyte流式细胞仪上分析细胞，并且获取在绿色波道中的荧光。最后，使用FlowJo软件，通过对活细胞进行门控和分析在该门内的Alexa488-荧光，从原始流式细胞术数据获得平均荧光单位。仅细胞(a)和仅与山羊抗兔二抗一起进行温育的细胞(b)充当对照。
如可以在图7中看到的，当与仅细胞或者仅与荧光二抗一起进行温育的细胞相比较时，所有CD40受体激动剂均导致细胞的荧光的显著上升。在该测定法中，蛋白质B产生了最高的荧光信号，这表明蛋白质B(e)更好地与Ramos细胞相结合。在蛋白质B的信号强度之后是蛋白质A(d)和蛋白质X(c)，而蛋白质C(f)提供了最弱的信号。综合考虑，可以假定所有的CD40受体激动剂在体外在细胞背景下均结合其天然受体，其中蛋白质B是最好的结合者。
5B.在B细胞上的CD86上调，其作为由CD40受体激动剂触发的CD40信号传导的读出
CD86是在人B细胞上的激活标志物，并且它是在T细胞上的关于CD28和CTLA-4的配体。经常使用CD86表面表达作为用于描述B细胞的激活状态的手段。由于B细胞需要数个信号用于完全激活(包括B细胞受体和CD40连接)，因而我们想知道CD40受体激动剂是否可以导致CD86表面表达上调。
为了该目的，将Ramos B细胞与1μg/ml蛋白质X(b)、10μg/ml蛋白质X(c)、1μg/ml蛋白质A(d)或10μg/ml蛋白质A(e)一起在24-孔平板中在37℃和5％CO2下温育过夜。未处理的细胞充当对照(a)。次日，将所有样品与经PE标记的抗人CD86抗体一起在冰上和在黑暗中温育30分钟。通过向染色和洗涤缓冲液中添加1％人IgG(Gamunex)来封闭Fc-受体。随后，对样品进行加工以用于在Guava Easycyte流式细胞仪上的流式细胞术。最后，使用FlowJo软件，通过对活细胞进行门控和分析在该门内的PE-荧光，从原始流式细胞术数据获得平均荧光单位。使用平均荧光值来表示CD86表面水平，并且将值相对于未与CD40受体激动剂一起进行温育的对照样品(a)进行标准化。
如可以在图8中观察到的，所有CD40受体激动剂均导致CD86表面表达的增加，这表明所有化合物均触发CD40信号传导。重要的是，该增加是剂量依赖性的，当比较柱状物b和c或者d和e(分别为1μg/ml对10μg/ml的相同化合物)时。另外，CD86上调对于六价的蛋白质A来说是更强的。这暗示了相比于仅三价的蛋白质X而言明显的亲和力效应。所述结果表明，在此所使用的CD40受体激动剂以剂量依赖性方式具有生物学活性。
5C.全血测定法，以显示与由CD40受体激动剂导致的CD83上调相伴随的免疫细胞刺激
CD83是表面分子，其在人免疫细胞的增殖和成熟过程期间被上调。CD83主要在树突细胞和T细胞上被发现，并且它可以用作关于免疫细胞刺激的标志物。如由Chowdhury等人(Cancer Immunology Research,2013,doi:10.1158/2326-6066.CIR-13-0070)所显示的，CD83上调可以用作用于通过抗体来研究在CD40连接后的免疫细胞激活的手段。因此，我们想知道我们的CD40受体激动剂是否在采用全血的测定法中也可以导致CD83上调。
为了该目的，在EDTA管中从健康供者收集全血。将2ml的血液与1μg/ml蛋白质X(b)、50μg/ml蛋白质X(c)、1μg/ml蛋白质A(d)或50μg/ml蛋白质A(e)一起在24-孔平板中在37℃和5％CO2下温育4小时。未处理的血液充当对照(a)。在4小时后，将所有样品与经PerCP/Cy5.5标记的抗人CD83抗体一起在室温下和在黑暗中温育20分钟。随后，通过进行固定和按照制造商的说明书使用BD FACS裂解溶液进行红细胞裂解来对样品进行加工以用于流式细胞术。将样品在Guava Easycyte流式细胞仪上进行分析，并且基于其散射特性谱来对细胞群体(粒细胞、淋巴细胞和单核细胞)进行门控。对于每个细胞群体获取在远红外波道中的荧光，并且使用FlowJo软件来进行分析。测定CD83-阳性细胞的百分比，并且相对于未与CD40受体激动剂一起进行温育的对照样品进行标准化。
如可以在图9中观察到的，当与未处理的血液细胞(a)相比较时，蛋白质X和蛋白质A均导致新的CD83-阳性群体的产生。对于所有所分析的细胞群体(淋巴细胞、单核细胞和粒细胞)均出现了该新的CD83-阳性群体，并且在淋巴细胞的情况下是最突出的。重要的是，CD83-阳性细胞的百分比份额是剂量依赖性的，当比较柱状物b和c或者d和e(分别为1μg/ml对50μg/ml的相同化合物)时。另外，CD83-阳性群体的大小对于六价的蛋白质A来说是更强的，当将相同的剂量与蛋白质X进行比较时。所述结果显示了相比于三价的蛋白质X而言六价的蛋白质A的明显的亲和力效应。所述结果还显示，在使用新鲜的人血液的情况下，在此所使用的CD40受体激动剂以剂量依赖性方式具有生物学活性。
实施例6：对固定化的CD40受体的体外结合测定法
基于用自动化生物传感器系统(Attana A100)所测定的动力学结合数据(kon和koff)来计算CD40L的三价构建体(例如，蛋白质X)和CD40L的六价构建体(例如，蛋白质A、蛋白质B和蛋白质C)与CD40的平衡结合常数(KD)。A100允许基于石英晶体微量天平(QCM)技术来实时调查分子相互作用。
为了该目的，将购买自Enzo的人CD40-Fc(目录编号：ALX-522-016-C050)固定化在经羧基活化的QCM-芯片上。以1、5和10μg/ml的浓度，将三聚体的和六聚体的CD40L-构建体用作可溶性分析物。分析结合(kon)和解离(koff)。实时测量和所计算出的其KD揭示了在所有六价的蛋白质A、B和C中的相当的结合活性，但是六价的蛋白质具有比三价的蛋白质X优异的结合。
表8：下述化合物的结合强度
化合物 Kon Koff KD[mol]
蛋白质X 9.87e4 8.93e-4 9.05e-9
蛋白质A 1.75e6 2.92e-4 1.67e-10
蛋白质B 1.91e6 2.90e-4 1.52e-10
蛋白质C 1.82e6 3.21e-4 1.76e-10
实施例7：半寿期测定
蛋白质A/蛋白质B/蛋白质C这些分子各自由两个通过三个链间二硫键而共价连接的多肽构成，并且均包含在Fc区的位置297(按照EU索引)处的N297S突变，这导致CH2结构域的无糖基化。将可溶性CD40L结构域的外表面半胱氨酸突变为丝氨酸(在SEQ ID NO:1中所显示的CD40L的C194等价位置)，这导致相比于SEQ ID NO:15(蛋白质A)而言具有C94S、C243S、C392S的SEQ ID NO:31(蛋白质B)。备选地，将可溶性CD40L结构域的外表面半胱氨酸突变为丙氨酸(在SEQ ID NO:1中所显示的CD40L的C194等价位置)，这导致相比于SEQ IDNO:15(蛋白质A)而言具有C94A、C243A、C392A的SEQ ID NO:35(蛋白质C)。就由这些改变所引入的效应来评定所得的FC-融合蛋白的半寿期。
以单次静脉内快速浓注，用1.0mg/kg的每种化合物(蛋白质A/蛋白质B/蛋白质C)来处理雌性NMRI小鼠。在施用之前(剂量前)和直至在测试项目实施后312小时，收集全血。制备血清，并且将样品储存于-80℃直至测定血清浓度。
在小鼠血清中蛋白质A/蛋白质B/蛋白质C浓度的定量用ELISA测定法来进行，其中检测在表7中所显示的独个CD40激动剂。将平板用CD40-Fc进行包被。然后，通过采用StrepTactin-HRP经由其Strep-标签来检测与其受体CD40特异性地结合的CD40-配体构建体。通过使用蛋白质A或蛋白质B或蛋白质C作为校准和对照样品来进行ELISA测定法。通过使用5-参数拟合，将所测量得到的标准浓度的数据用于产生校准曲线。这使得测定在各自小鼠血清样品中的未知的蛋白质A或蛋白质B或蛋白质C浓度成为可能。
通过使用平均血清浓度和用于非房室药物代谢动力学数据分析的药物代谢动力学评价程序PK Solutions 2.0版本(Summit Research Services,Montrose,CO)来计算药物代谢动力学参数。PK Solutions是自动化的、基于Excel的应用程序，其由从在静脉内或血管外施用途径后例如生物学样品的分析中获得的浓度-时间数据来计算药物代谢动力学参数。PK Solutions在没有假设任何特定的房室模型的情况下来计算结果。
来自药物代谢动力学评价的结果概括在表9中。
表9：在NMRI-小鼠中的探索性PK研究的结果：
1mg/kg的蛋白质A/蛋白质B/蛋白质C的单次静脉内剂量
蛋白质A 蛋白质B 蛋白质C
tmax(小时) 0.083 0.083 0.083
Cmax(μg/ml) 8.22 10.23 9.74
tlast(小时) 192 312 144
Clast(μg/ml) 0.286 0.122 0.242
t1/2E(小时) 70.85 79.25 60.46
t1/2E(天) 2.95 3.30 2.52
AUC0-t(μg*小时/ml) 178 273 134
AUC0-inf(μg*小时/ml) 222 287 155
所述结果显示，包含具有C194S突变的Q121-L261子序列的蛋白质B具有相比于野生型蛋白质(蛋白质A)或包含C194A突变蛋白的蛋白质C而言延长的体内稳定性。
实施例8：稳定性/聚集测试(预言性实施例)
单体和聚集体的含量通过在实施例2中所描述的分析型SEC来进行测定。为了该特别的目的，所述分析在处于生理pH下的包含生理盐浓度的缓冲液(例如，0.9％NaCl,pH7.4；PBS pH 7.4)中进行。典型的聚集分析在Superdex200柱(GE Healthcare)上来进行。该柱分开在10至800kDa的范围内的蛋白质。
为了测定在天然条件下经纯化的融合多肽的表观分子量，向Superdex 200柱加载具有已知分子量的标准蛋白质。基于标准蛋白质的洗脱体积来绘制校准曲线，并且基于洗脱体积来计算具有未知分子量的经纯化的融合蛋白的表观分子量。
可溶性的非聚集的蛋白质的SEC分析典型地在确定的洗脱体积处显示出清晰可辨的单个蛋白质峰(以在280nm处的OD或在214nm处的OD所测量的)。该洗脱体积相应于特定蛋白质的表观天然分子量。关于在FC-融合蛋白的情况下的“单体”的定义，两条多肽链的装配由该蛋白质的FC-部分来驱动并且功能单元为由两条链组成的蛋白质。在Fc-融合蛋白的情况下，包含两条经FC连接的多肽链的该单元被定义为“单体”，而不管其是经二聚化的单链融合多肽。
如果蛋白质聚集出现，那么SEC分析就会显示出具有较低保留体积的额外的蛋白质峰。蛋白质寡聚体潜在地充当聚集种子，并且高含量的寡聚体潜在地导致蛋白质的聚集。具有大的分子量的寡聚体以及聚集体在Superdex200的空体积中洗脱并且无法通过SEC就其天然分子量进行分析。
CD40受体激动剂融合蛋白的经纯化的制备物应当优选地包含仅确定的单体蛋白质和仅非常低量的寡聚蛋白质。基于SEC分析通过计算分别关于确定的单体和寡聚体/聚集体级分的OD280图的峰面积来测定特定的CD40受体激动剂融合蛋白制备物的聚集/寡聚化的程度。基于总峰面积，如下来计算确定的单体蛋白质的百分比：
单体含量[％]＝([单体蛋白质的峰面积]/[总峰面积])×100
关于在本文本中所使用的可溶性蛋白质的定义描述了在处于生理pH下的具有生理盐浓度的缓冲液中的经纯化的CD40受体激动剂蛋白的蛋白质制备物，其在从0.2至10.0mg/ml的典型蛋白质浓度范围内包含>90％的确定的可溶性蛋白质含量。
实施例9：由CD40受体激动剂触发的CD40信号传导增加在M2-极化的巨噬细胞上的激活标志物的表达
M2-样巨噬细胞以激活标志物/T细胞激活分子(例如，CD83、CD86和HLA)的低表达以及免疫调节分子(例如，IL-10)的高表达为特征。因为这个原因，所以M2-样巨噬细胞经常被称为是促肿瘤的，与“抗肿瘤”M1-样巨噬细胞相反。我们决定测试用蛋白质B(SEQ ID NO:31)进行的处理是否可以在正常M2-极化条件下增加M1-样巨噬细胞的发育。为了达到这一点，按照制造商的说明书通过使用Ficoll-Hypaque(Sigma)从获得自健康志愿者的血沉棕黄层中分离和纯化出人外周血单核细胞(PBMC)。通过在37℃下在12-孔平板中在培养基(RPMI)中培养PBMC 2小时来分离出单核细胞。将单核细胞在M2-极化条件(IL-4(50ng/ml)和IL-10(50ng/ml))下或者在单独的培养基中温育3天。在该温育期期间，向一半的孔中添加蛋白质B(50ng/ml)或培养基对照。在第3天，将细胞悬浮液用包括CD206、CD163、CD86、CD83、HLA-DR和CD4的单克隆抗体混合物(BioLegend、eBioscience或BD Biosciences)进行染色。按照制造商的说明书将DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐)(ThermoFisher)用于从该分析中排除死细胞。使用Guava easyCyte 12流式细胞仪(Merck Millipore)来分析细胞。检查抗体品质，并且使用同种型对照来进行门控。将Tree Star FlowJo和GuavaInCyte软件用于流式细胞术数据的分析。通过使用门和中值荧光强度(MFI)来对表达进行定量。用IL-4和IL-10进行的处理(M2-极化的巨噬细胞)增加了在单核细胞上CD206和CD163(M2-样巨噬细胞的经典标志物)的表达(参见表10)。相反地，用蛋白质B进行的同时处理使CD206和CD163表达从37％降低至22％。CD86(B7.2)是经典的T细胞共刺激分子和CD28的结合伙伴，而CD83是抗原呈递细胞成熟的标志物。重要的是，蛋白质B处理使CD86和CD83的共表达从5％增加至20％，相比于单独的IL-4/IL-10而言。另外，HLA-DR,DP的表达在蛋白质B处理后是更高的，94至162(MFI)，相比于单独的IL-4/IL-10而言。这些结果证明，蛋白质B处理增加M2-极化的巨噬细胞的激活状态并且使它们成为更强有力的抗原呈递细胞。
表10：M2-极化条件：IL-4(50ng/ml)和IL-10(50ng/ml)，三天
实施例10：经CD40受体激动剂进行处理的M2-极化的巨噬细胞是在同种异体共培养系统中对于幼稚CD4+T细胞激活来说更强有力的抗原呈递细胞
M2-样巨噬细胞以由于HLA和共刺激分子(例如，CD86)的低表达而引起的弱的刺激T细胞应答的能力为特征。我们想要测试用蛋白质B进行的处理是否可以增加M2-样巨噬细胞的效能。为了测试这一点，如上面所描述的那样用IL-10和IL-4(各50ng/ml)产生M2-样巨噬细胞。按照制造商的说明书通过使用幼稚CD4+T细胞分离试剂盒II(Miltenyi)从来自第二(同种异体的)供者的PBMC中分离出幼稚CD4+T细胞。按照制造商的说明书用CellTraceCFSE细胞增殖试剂盒(ThermoFisher)对T细胞进行标记。以“10个淋巴细胞:1个单核细胞”的比例向幼稚CD4+T细胞添加处理了3天的单核细胞。3天后分别通过使用CFSE和前向散射(FSC)来测量T细胞增殖和爆长(blasting)(在细胞分裂之前的生长)。只有2％的在单独的培养基中进行温育的T细胞显示出增殖(CFSE稀释)或爆长(增加的FSC)的证据(参见表11)。相反地，23％的与未刺激的同种异体单核细胞一起进行温育的T细胞显示出激活的证据。T细胞与M2-极化的巨噬细胞一起进行的温育使T细胞应答降低至16％。令人感兴趣的是，向M2-极化条件添加蛋白质B增加了同种异体巨噬细胞的效能，并且31％的T细胞作出应答。该数据证明，在正常M2-极化条件下用AGP1233对单核细胞进行的处理导致更强有力的抗原呈递细胞。
表11：M2-极化条件：IL-4(50ng/ml)和IL-10(50ng/ml)，3天
实施例11：由六价的CD40受体激动剂触发的CD40信号传导在增加激活标志物的表达方面是最有效的，并且减少在与经纯化的人单核细胞一起进行培养后M2-样巨噬细胞的发育
为了测试受体簇聚和下游信号传导的效力，我们将本发明的六价的激动剂“蛋白质B”与两个代表本领域中已知的常见工程学构思的同三聚体的三价的CD40受体激动剂进行了比较，其中蛋白质X2(SEQ ID NO:39)表示同三聚体的未稳定化的CD40L-RBD本身，和蛋白质X(SEQ ID NO:38)表示通过C-末端的所融合的源自噬菌体RB69的三聚化支架来进行稳定化的同三聚体的CD40L-RBD。由于我们已显示产出性的CD40受体信号传导导致激活标志物的上调和M1-样巨噬细胞发育的增加，因此我们如上面所描述的那样从血沉棕黄层中纯化出人单核细胞。将经纯化的单核细胞在补充有三种不同浓度(10、100和1000ng/mL)的三种不同构建体(参见表12)的培养基中温育3天，并且通过流式细胞术就激活和表型标记物的表达来对细胞进行分析。用所有三种浓度的六价的蛋白质B进行的处理均产生了相比于对照而言在CD86表达(以MFI和阳性百分比两者来表示)方面的剂量依赖性增加。相反地，三价的蛋白质X2浓度中没有一个显示出相比于对照而言的差异。在经RB69-支架稳定化的三价的蛋白质X的情况下，仅最高浓度产生CD86表达的轻微增加。另外，用HLA-DR,DP表达看到相同的化合物和剂量效应，这确认了即使低剂量的六价构建体对于受体簇聚和产出性信号传导来说也是足够的，而三价构建体不显示活性或在非常高的浓度下显示出低活性。最后，在培养基中大约20％的单核细胞通常在3天中上调CD206和CD163表达，这是M2-样巨噬细胞发育的指示。用所有三种浓度的六价的蛋白质B进行的处理均使这降低至小于3％。与激活标志物数据相一致，仅高浓度的三价的蛋白质X显示出M2-样巨噬细胞发育的降低。综合考虑，所述数据证明了本发明的蛋白质B的优异的生物学活性。
表12：在所示条件下将单核细胞培养3天
本发明进一步涉及下列项目1-22：
1.CD40受体激动剂蛋白，其包含具有从由SEQ ID NO:15和25-35组成的组中选择的氨基酸序列的多肽。
2.CD40受体激动剂蛋白，其包含两个各自具有SEQ ID NO:27、28、29、30、32或34中所示的氨基酸序列的多肽。
3.项目2的CD40受体激动剂蛋白，其中所述两个多肽通过在每个多肽的半胱氨酸残基453、459和462之间所形成的三个链间二硫键而共价连接。
4.项目2或3的CD40受体激动剂蛋白，其中在所述多肽的位置147和296处的天冬酰胺残基中的一个或多个被N-糖基化。
5.项目2或3的CD40受体激动剂蛋白，其中在所述多肽的位置147和296处的天冬酰胺残基均被N-糖基化。
6.项目1-5的CD40受体激动剂蛋白，其中所述多肽进一步进行了翻译后修饰。
7.项目6的CD40受体激动剂蛋白，其中所述翻译后修饰包括N-末端的谷氨酰胺至焦谷氨酸的修饰。
8.药物组合物，其包含项目1-7中任一项的CD40受体激动剂蛋白，以及一种或多种在药学上可接受的载料、稀释剂、赋形剂和/或助剂。
9.编码项目1的CD40受体激动剂蛋白的核酸分子。
10.包含项目9的核酸分子的表达载体。
11.包含项目9的核酸分子的细胞。
12.项目11的细胞，其是真核细胞。
13.项目11的细胞，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
14.项目11的细胞，其中所述细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
15.治疗具有CD40L相关性疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的项目1-7中任一项的CD40受体激动剂蛋白。
16.项目15的方法，其中所述疾病或病症选自由肿瘤、感染性疾病、炎性疾病、代谢疾病、自身免疫性病症、变性疾病、凋亡相关性疾病和移植排斥组成的组。
17.项目16的方法，其中所述肿瘤为实体肿瘤。
18.项目16的方法，其中所述肿瘤为淋巴肿瘤。
19.项目16的方法，其中所述自身免疫性病症为类风湿性疾病、关节炎性疾病或者类风湿性和关节炎性疾病。
20.项目16的方法，其中所述疾病或病症为类风湿性关节炎。
21.项目16的方法，其中所述变性疾病为神经变性疾病。
22.项目21的方法，其中所述神经变性疾病为多发性硬化。
 序列表
<110> Apogenix AG
<120> 单链CD40受体激动剂蛋白
<130> SCCD40L-PCT
<141> 2016-05-04
<160> 39
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 261
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> "wt CD40L"
<220>
<223> wt CD40L
<400> 1
Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
20 25 30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
35 40 45
Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val
50 55 60
Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys
85 90 95
Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu
100 105 110
Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser
115 120 125
Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly
130 135 140
Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln
145 150 155 160
Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr
165 170 175
Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser
180 185 190
Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala
195 200 205
Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His
210 215 220
Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe
245 250 255
Gly Leu Leu Lys Leu
260
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "连接体序列"
<220>
<223> 连接体序列
<400> 2
Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "连接体序列"
<220>
<223> 连接体序列
<400> 3
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "连接体序列"
<220>
<223> 连接体序列
<400> 4
Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "连接体序列"
<220>
<223> 连接体序列
<400> 5
Gly Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 6
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "连接体序列"
<220>
<223> 连接体序列
<400> 6
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "连接体序列"
<220>
<223> 连接体序列
<400> 7
Gly Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "连接体序列"
<220>
<223> 连接体序列
<400> 8
Gly Gly Asn Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "连接体序列"
<220>
<223> 连接体序列
<400> 9
Gly Gly Asn Gly Ser Gly
1 5
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "连接体序列"
<220>
<223> 连接体序列
<400> 10
Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 11
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "连接体序列"
<220>
<223> 连接体序列
<400> 11
Gly Ser Gly Ser
1
<210> 12
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "连接体序列"
<220>
<223> 连接体序列
<400> 12
Gly Ser Gly
1
<210> 13
<211> 218
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> "抗体Fc片段"
<220>
<223> 抗体Fc片段
<400> 13
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Glu Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
85 90 95
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
100 105 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
115 120 125
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
180 185 190
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 14
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> "抗体Fc片段"
<220>
<223> 抗体Fc片段
<400> 14
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 15
<211> 714
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> "蛋白质A"
<220>
<223> 蛋白质A
<400> 15
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Val Phe Val Leu Leu Val Trp Val Pro
1 5 10 15
Ala Gly Asn Gly Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser
20 25 30
Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met
35 40 45
Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys
50 55 60
Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn
65 70 75 80
Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys
85 90 95
Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His
100 105 110
Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val
115 120 125
Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro
130 135 140
Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys
145 150 155 160
Leu Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gln Ile Ala Ala His Val Ile
165 170 175
Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys
180 185 190
Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys
195 200 205
Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val
210 215 220
Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala
225 230 235 240
Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg
245 250 255
Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile
260 265 270
His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val
275 280 285
Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser
290 295 300
Phe Gly Leu Leu Lys Leu Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gln Ile
305 310 315 320
Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu
325 330 335
Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr
340 345 350
Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr
355 360 365
Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln
370 375 380
Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu
385 390 395 400
Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys
405 410 415
Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly
420 425 430
Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly
435 440 445
Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu Gly Ser Gly Ser Ser
450 455 460
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
465 470 475 480
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
485 490 495
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
500 505 510
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
515 520 525
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
530 535 540
Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
545 550 555 560
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
565 570 575
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
580 585 590
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
595 600 605
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
610 615 620
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
625 630 635 640
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
645 650 655
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
660 665 670
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
675 680 685
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ser Ser Ser Ser Ser
690 695 700
Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
705 710
<210> 16
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "铰链连接体变体"
<220>
<223> 铰链连接体变体
<400> 16
Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys
1 5 10 15
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
20
<210> 17
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "信号肽"
<220>
<223> 信号肽
<400> 17
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Val Phe Val Leu Leu Val Trp Val Pro
1 5 10 15
Ala Gly Asn Gly
20
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "具有strep标签的丝氨酸连接体"
<220>
<223> 具有strep标签的丝氨酸连接体
<400> 18
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5 10 15
<210> 19
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "铰链连接体变体"
<220>
<223> 铰链连接体变体
<400> 19
Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His
1 5 10 15
Thr Cys Pro Pro Cys
20
<210> 20
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "铰链连接体变体"
<220>
<223> 铰链连接体变体
<400> 20
Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr
1 5 10 15
His Thr Cys Pro Pro Cys
20
<210> 21
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "铰链连接体变体"
<220>
<223> 铰链连接体变体
<400> 21
Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Cys
20
<210> 22
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "铰链连接体变体"
<220>
<223> 铰链连接体变体
<400> 22
Gly Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1 5 10 15
Pro Cys
<210> 23
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "铰链连接体变体"
<220>
<223> 铰链连接体变体
<400> 23
Gly Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1 5 10 15
Pro Cys Gly Ser
20
<210> 24
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "铰链连接体变体"
<220>
<223> 铰链连接体变体
<400> 24
Gly Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1 5 10 15
Pro Cys Gly Ser Gly Ser
20
<210> 25
<211> 700
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "蛋白质A，没有strep标签"
<220>
<223> 蛋白质A，没有strep标签
<400> 25
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Val Phe Val Leu Leu Val Trp Val Pro
1 5 10 15
Ala Gly Asn Gly Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser
20 25 30
Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met
35 40 45
Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys
50 55 60
Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn
65 70 75 80
Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys
85 90 95
Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His
100 105 110
Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val
115 120 125
Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro
130 135 140
Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys
145 150 155 160
Leu Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gln Ile Ala Ala His Val Ile
165 170 175
Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys
180 185 190
Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys
195 200 205
Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val
210 215 220
Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala
225 230 235 240
Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg
245 250 255
Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile
260 265 270
His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val
275 280 285
Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser
290 295 300
Phe Gly Leu Leu Lys Leu Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gln Ile
305 310 315 320
Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu
325 330 335
Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr
340 345 350
Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr
355 360 365
Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln
370 375 380
Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu
385 390 395 400
Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys
405 410 415
Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly
420 425 430
Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly
435 440 445
Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu Gly Ser Gly Ser Ser
450 455 460
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
465 470 475 480
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
485 490 495
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
500 505 510
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
515 520 525
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
530 535 540
Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
545 550 555 560
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
565 570 575
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
580 585 590
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
595 600 605
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
610 615 620
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
625 630 635 640
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
645 650 655
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
660 665 670
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
675 680 685
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
690 695 700
<210> 26
<211> 699
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "与SEQ ID 14的Fc相融合的CD40L-wt"
<220>
<223> 与SEQ ID 14的Fc相融合的CD40L-wt
<400> 26
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Val Phe Val Leu Leu Val Trp Val Pro
1 5 10 15
Ala Gly Asn Gly Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser
20 25 30
Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met
35 40 45
Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys
50 55 60
Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn
65 70 75 80
Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys
85 90 95
Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His
100 105 110
Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val
115 120 125
Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro
130 135 140
Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys
145 150 155 160
Leu Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gln Ile Ala Ala His Val Ile
165 170 175
Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys
180 185 190
Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys
195 200 205
Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val
210 215 220
Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala
225 230 235 240
Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg
245 250 255
Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile
260 265 270
His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val
275 280 285
Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser
290 295 300
Phe Gly Leu Leu Lys Leu Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gln Ile
305 310 315 320
Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu
325 330 335
Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr
340 345 350
Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr
355 360 365
Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln
370 375 380
Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu
385 390 395 400
Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys
405 410 415
Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly
420 425 430
Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly
435 440 445
Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu Gly Ser Gly Ser Ser
450 455 460
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
465 470 475 480
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
485 490 495
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
500 505 510
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
515 520 525
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
530 535 540
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
545 550 555 560
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
565 570 575
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
580 585 590
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
595 600 605
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
610 615 620
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
625 630 635 640
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
645 650 655
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
660 665 670
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
675 680 685
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
690 695
<210> 27
<211> 680
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "CD40L-wt + Seq 13，没有信号肽，没有Strep标签"
<220>
<223> CD40L-wt + Seq 13，没有信号肽，没有Strep标签
<400> 27
Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser
1 5 10 15
Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu
20 25 30
Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu
35 40 45
Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser
50 55 60
Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg
65 70 75 80
Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys
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<220>
<223> "融合蛋白变体"
<220>
<223> 融合蛋白变体
<400> 28
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<220>
<223> "融合蛋白变体"
<220>
<223> 融合蛋白变体
<400> 29
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<210> 30
<211> 693
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "融合蛋白变体"
<220>
<223> 融合蛋白变体
<400> 30
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<220>
<223> 蛋白质B
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<211> 694
<212> PRT
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<220>
<223> "蛋白质B，没有信号肽"
<220>
<223> 蛋白质B，没有信号肽
<400> 32
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Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr
420 425 430
Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser
435 440 445
Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
450 455 460
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
465 470 475 480
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
485 490 495
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
500 505 510
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
515 520 525
Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
530 535 540
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
545 550 555 560
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
565 570 575
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
580 585 590
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
595 600 605
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
610 615 620
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
625 630 635 640
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
645 650 655
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
660 665 670
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Trp Ser
675 680 685
His Pro Gln Phe Glu Lys
690
<210> 33
<211> 700
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "蛋白质B，没有Strep标签"
<220>
<223> 蛋白质B，没有Strep标签
<400> 33
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Val Phe Val Leu Leu Val Trp Val Pro
1 5 10 15
Ala Gly Asn Gly Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser
20 25 30
Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met
35 40 45
Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys
50 55 60
Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn
65 70 75 80
Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Ser Leu Lys
85 90 95
Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His
100 105 110
Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val
115 120 125
Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro
130 135 140
Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys
145 150 155 160
Leu Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gln Ile Ala Ala His Val Ile
165 170 175
Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys
180 185 190
Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys
195 200 205
Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val
210 215 220
Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala
225 230 235 240
Ser Leu Ser Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg
245 250 255
Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile
260 265 270
His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val
275 280 285
Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser
290 295 300
Phe Gly Leu Leu Lys Leu Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gln Ile
305 310 315 320
Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu
325 330 335
Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr
340 345 350
Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr
355 360 365
Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln
370 375 380
Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Ser Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu
385 390 395 400
Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys
405 410 415
Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly
420 425 430
Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly
435 440 445
Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu Gly Ser Gly Ser Ser
450 455 460
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
465 470 475 480
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
485 490 495
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
500 505 510
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
515 520 525
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
530 535 540
Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
545 550 555 560
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
565 570 575
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
580 585 590
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
595 600 605
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
610 615 620
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
625 630 635 640
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
645 650 655
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
660 665 670
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
675 680 685
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
690 695 700
<210> 34
<211> 680
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "蛋白质B，没有信号肽，没有Strep标签"
<220>
<223> 蛋白质B，没有信号肽，没有Strep标签
<400> 34
Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser
1 5 10 15
Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu
20 25 30
Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu
35 40 45
Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser
50 55 60
Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Ser Leu Lys Ser Pro Gly Arg
65 70 75 80
Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys
85 90 95
Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln
100 105 110
Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser
115 120 125
His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu Gly Ser Gly
130 135 140
Ser Gly Asn Gly Ser Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser
145 150 155 160
Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr
165 170 175
Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val
180 185 190
Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser
195 200 205
Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr
225 230 235 240
His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly
245 250 255
Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp
260 265 270
Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu
275 280 285
Lys Leu Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gln Ile Ala Ala His Val
290 295 300
Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu
305 310 315 320
Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly
325 330 335
Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln
340 345 350
Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile
355 360 365
Ala Ser Leu Ser Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu
370 375 380
Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser
385 390 395 400
Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe
405 410 415
Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr
420 425 430
Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser
435 440 445
Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
450 455 460
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
465 470 475 480
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
485 490 495
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
500 505 510
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
515 520 525
Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
530 535 540
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
545 550 555 560
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
565 570 575
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
580 585 590
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
595 600 605
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
610 615 620
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
625 630 635 640
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
645 650 655
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
660 665 670
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
675 680
<210> 35
<211> 714
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "蛋白质C"
<220>
<223> 蛋白质C
<400> 35
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Val Phe Val Leu Leu Val Trp Val Pro
1 5 10 15
Ala Gly Asn Gly Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser
20 25 30
Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met
35 40 45
Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys
50 55 60
Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn
65 70 75 80
Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Ala Leu Lys
85 90 95
Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His
100 105 110
Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val
115 120 125
Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro
130 135 140
Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys
145 150 155 160
Leu Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gln Ile Ala Ala His Val Ile
165 170 175
Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys
180 185 190
Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys
195 200 205
Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val
210 215 220
Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala
225 230 235 240
Ser Leu Ala Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg
245 250 255
Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile
260 265 270
His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val
275 280 285
Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser
290 295 300
Phe Gly Leu Leu Lys Leu Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gln Ile
305 310 315 320
Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu
325 330 335
Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr
340 345 350
Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr
355 360 365
Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln
370 375 380
Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Ala Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu
385 390 395 400
Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys
405 410 415
Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly
420 425 430
Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly
435 440 445
Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu Gly Ser Gly Ser Ser
450 455 460
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
465 470 475 480
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
485 490 495
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
500 505 510
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
515 520 525
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
530 535 540
Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
545 550 555 560
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
565 570 575
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
580 585 590
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
595 600 605
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
610 615 620
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
625 630 635 640
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
645 650 655
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
660 665 670
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
675 680 685
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ser Ser Ser Ser Ser
690 695 700
Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
705 710
<210> 36
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "融合蛋白变体"
<220>
<223> 融合蛋白变体
<400> 36
Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser
1 5 10 15
Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu
20 25 30
Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu
35 40 45
Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser
50 55 60
Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Ser Leu Lys Ser Pro Gly Arg
65 70 75 80
Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys
85 90 95
Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln
100 105 110
Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser
115 120 125
His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu Gly Ser Gly
130 135 140
Ser Gly Asn Gly Ser Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser
145 150 155 160
Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr
165 170 175
Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val
180 185 190
Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser
195 200 205
Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr
225 230 235 240
His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly
245 250 255
Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp
260 265 270
Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu
275 280 285
Lys Leu Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gln Ile Ala Ala His Val
290 295 300
Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu
305 310 315 320
Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly
325 330 335
Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln
340 345 350
Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile
355 360 365
Ala Ser Leu Ser Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu
370 375 380
Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser
385 390 395 400
Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe
405 410 415
Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr
420 425 430
Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu
435
<210> 37
<211> 2147
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> "编码融合蛋白质的DNA序列"
<220>
<223> 编码融合蛋白质的DNA序列
<400> 37
aagctttagg gataacaggg taatagccgc caccatggag actgacaccc tgctggtgtt 60
cgtgctgctg gtctgggtgc ctgcaggaaa tggacagatc gcagctcatg tgataagtga 120
ggcaagctcg aagacgacta gcgtattgca gtgggcagag aaggggtact acaccatgtc 180
caacaacctc gtcacgctgg agaacggcaa acagctcacc gtcaagcgac agggcctgta 240
ctacatctac gcacaagtca ccttctgttc taaccgagag gcttccagtc aagcaccctt 300
cattgcttcc ctgtgcctga aatcccctgg tcgattcgag aggatactgc tcagggcagc 360
taacactcac tccagtgcta agccttgcgg tcagcagagt atccacctcg gcggcgtatt 420
cgagctgcaa ccaggagctt ccgtctttgt gaacgtgact gacccttctc aagtctctca 480
cggaacagga ttcacctctt tcgggctcct aaagctgggt tccggaagcg gtaatggtag 540
tcaaatcgct gcccatgtaa tttccgaggc ttcgtcaaag actacgtctg ttctacaatg 600
ggccgagaaa ggctactata ccatgtcaaa taatctcgtc actcttgaga acgggaagca 660
gcttaccgtt aaacgtcagg gactttacta catttatgcc caagtcactt tctgctcaaa 720
tcgagaggca agctcccaag caccgttcat agcatcactc tgcctcaagt cccctggaag 780
gtttgaacga atactactta gggccgctaa tacacattcg agtgcaaagc cttgcggaca 840
gcaaagcatt catttaggtg gagtcttcga gcttcaacca ggagcctctg tattcgtcaa 900
cgtaacggac ccatcgcaag tatcccacgg cactggtttc acctcattcg gtttgctgaa 960
gttaggaagc ggcagtggaa acggttccca aatagctgcc catgtcatct cggaagcctc 1020
aagcaagacg acaagtgtct tgcaatgggc cgaaaagggt tattatacta tgtctaataa 1080
cctagtgacc ctagagaacg gtaaacaact tactgttaag cgccagggac tttattatat 1140
atatgctcag gtaacattct gctcgaatcg ggaagcatct tcacaggctc cttttatcgc 1200
tagtttatgt ctgaagagcc ccggacgatt tgagaggata ttgcttagag ccgcgaatac 1260
acacagttca gccaaacctt gtggacaaca gagtattcac ttaggtggcg tgtttgaatt 1320
acaaccaggg gcatcagtgt tcgtaaacgt aacagatccc agtcaggtct cgcacgggac 1380
gggatttact tcctttggtt tgctgaaatt aggctcggga tcctcgagtt catcgtcctc 1440
atccggctca tgtgataaga cccacacctg ccctccctgt cctgcccctg agctgctggg 1500
cggaccttct gtgttcctgt tcccccccaa gcctaaggac accctgatga tctccaggac 1560
ccctgaggtg acctgtgtgg tggtggacgt gtctcacgaa gatcccgagg tgaagttcaa 1620
ctggtacgtg gacggcgtgg aggtccacaa cgccaagacc aagcctaggg aggagcagta 1680
cagctccacc taccgggtgg tgtctgtgct gaccgtgctg caccaggatt ggctgaacgg 1740
aaaggagtat aagtgtaagg tctccaacaa ggccctgcct gcccccatcg agaaaaccat 1800
ctccaaggcc aagggccagc ctcgggagcc tcaggtgtac accctgcctc ctagcaggga 1860
ggagatgacc aagaaccagg tgtccctgac ctgtctggtg aagggcttct acccttccga 1920
tatcgccgtg gagtgggagt ctaatggcca gcccgagaac aactacaaga ccacccctcc 1980
tgtgctggac tctgacggct ccttcttcct gtactccaag ctgaccgtgg acaagtccag 2040
atggcagcag ggcaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac gaggccctgc acaatcacta 2100
cacccagaag tccctgtctc tgagtccggg caaataatag gcgcgcc 2147
<210> 38
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "蛋白质X (三价的对照蛋白质，包括信号肽和Strep标签)"
<220>
<223> 蛋白质X (三价的对照蛋白质，包括信号肽和Strep标签)
<400> 38
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Val Phe Val Leu Leu Val Trp Val Pro
1 5 10 15
Ala Gly Asn Gly Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser
20 25 30
Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met
35 40 45
Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys
50 55 60
Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn
65 70 75 80
Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys
85 90 95
Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His
100 105 110
Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val
115 120 125
Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro
130 135 140
Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys
145 150 155 160
Leu Gly Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Tyr
165 170 175
Ile Glu Asp Ala Pro Ser Asp Gly Lys Phe Tyr Val Arg Lys Asp Gly
180 185 190
Ala Trp Val Glu Leu Pro Thr Ala Ser Gly Pro Ser Ser Ser Ser Ser
195 200 205
Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
210 215
<210> 39
<211> 177
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "蛋白质X2 (三价的对照蛋白质，包括信号肽和Strep标签)"
<220>
<223> 蛋白质X2 (三价的对照蛋白质，包括信号肽和Strep标签)
<400> 39
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Val Phe Val Leu Leu Val Trp Val Pro
1 5 10 15
Ala Gly Asn Gly Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser
20 25 30
Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met
35 40 45
Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys
50 55 60
Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn
65 70 75 80
Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys
85 90 95
Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His
100 105 110
Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val
115 120 125
Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro
130 135 140
Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys
145 150 155 160
Leu Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
165 170 175
Lys

Claims (27)

1.CD40受体激动剂蛋白，其包含单链融合多肽，所述单链融合多肽包含：
(i)第一可溶性CD40L结构域，
(ii)第一肽连接体，
(iii)第二可溶性CD40L结构域，
(iv)第二肽连接体，和
(v)第三可溶性CD40L结构域，和
(vi)抗体Fc片段，其优选地由在SEQ ID NO:13或14或者SEQ ID NO:13或14的氨基酸1-217中所显示的氨基酸序列组成。
2.权利要求1的CD40受体激动剂蛋白，其中所述抗体Fc片段(vi)位于所述第一CD40L结构域(i)的N-末端和/或所述第三CD40L结构域(v)的C-末端。
3.权利要求1或2的CD40受体激动剂蛋白，其中所述抗体Fc片段位于所述第三CD40L结构域(v)的C-末端。
4.权利要求1-3中任一项的CD40受体激动剂蛋白，其是基本上非聚集性的。
5.权利要求1-4中任一项的CD40受体激动剂蛋白，其中所述第二和/或第三可溶性CD40L结构域为在N-末端处缩短的结构域，其任选地包含氨基酸序列突变。
6.权利要求1-4中任一项的CD40受体激动剂蛋白，其中所述可溶性CD40L结构域中的至少一个，特别是所述可溶性CD40L结构域(iii)和(v)中的至少一个，为具有这样的N-末端序列的可溶性CD40L结构域，所述N-末端序列以根据SEQ ID NO:1的人CD40L的氨基酸Gln121或Ile122开始，并且其中Gln121可以被中性氨基酸例如Ser或Gly替代。
7.权利要求6的CD40受体激动剂蛋白，其中所述可溶性CD40L结构域中的至少一个，特别是所述可溶性CD40L结构域(iii)和(v)中的至少一个，为具有选自下列的N-末端序列的可溶性CD40L结构域：
(a)Gln121或Ile122，和
(b)(Gly/Ser)121。
8.权利要求6或7的CD40受体激动剂蛋白，其中所述可溶性CD40L结构域以根据SEQ IDNO:1的人CD40L的氨基酸Leu261结束，和/或任选地在位置E129、A130、S132、K133、T134、E142、Y145、Y146、C178、C194、R200、F201、C218、Q220或N240处包含突变。
9.权利要求6-8中任一项的CD40受体激动剂蛋白，其中所述可溶性CD40L结构域(i)、(iii)和(v)由根据SEQ ID NO:1的人CD40L的氨基酸121-261组成。
10.前述权利要求中任一项的CD40受体激动剂蛋白，其中所述第一和第二肽连接体(ii)和(iv)独立地具有3-8个氨基酸的长度，特别地3、4、5、6、7或8个氨基酸的长度，并且优选地为甘氨酸/丝氨酸连接体，其任选地包含可以被糖基化的天冬酰胺残基。
11.权利要求10的CD40受体激动剂蛋白，其中所述第一和第二肽连接体(ii)和(iv)由根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
12.前述权利要求中任一项的CD40受体激动剂蛋白，所述CD40受体激动剂蛋白另外还包含N-末端信号肽结构域，例如SEQ ID NO:17的信号肽结构域，其可以包含蛋白酶切割位点，和/或所述CD40受体激动剂蛋白另外还包含C-末端元件，其可以包含和/或连接至识别/纯化结构域，例如根据SEQ ID NO:18的Strep-标签。
13.前述权利要求中任一项的CD40受体激动剂蛋白，其中所述抗体Fc片段(vi)通过铰链连接体，优选地SEQ ID NO:16和19-24中任一个的铰链连接体，而融合至所述可溶性CD40L结构域(i)和/或(v)。
14.前述权利要求中任一项的CD40受体激动剂蛋白，其中所述抗体Fc片段(vi)由在SEQID NO:13或14或者SEQ ID NO:13或14的氨基酸1-217中所显示的氨基酸序列组成。
15.前述权利要求中任一项的CD40受体激动剂蛋白，其包含SEQ ID NO:15和25-35中任一个的氨基酸序列。
16.前述权利要求中任一项的CD40受体激动剂蛋白，其包含两个各自具有SEQ ID NO:27、28、29、30、32或34中所示的氨基酸序列的多肽。
17.权利要求16的CD40受体激动剂蛋白，其中所述两个各自包含SEQ ID NO:27、28、29、30、32或34中所示的氨基酸序列的多肽通过在每个多肽的半胱氨酸残基453、459和462之间所形成的三个链间二硫键而共价连接。
18.权利要求16或17的CD40受体激动剂蛋白，其中在所述多肽的位置147和296处的天冬酰胺残基中的一个或多个被N-糖基化。
19.权利要求18的CD40受体激动剂蛋白，其中在所述多肽的位置147和296处的天冬酰胺残基均被N-糖基化。
20.前述权利要求中任一项的CD40受体激动剂蛋白，其中所述多肽进一步进行了翻译后修饰。
21.权利要求20的CD40受体激动剂蛋白，其中所述翻译后修饰包括N-末端的谷氨酰胺至焦谷氨酸的修饰。
22.编码权利要求1-21中任一项的CD40受体激动剂蛋白的核酸分子，其优选地与表达控制序列可操作地连接。
23.包含权利要求22的核酸分子的表达载体。
24.用权利要求22的核酸分子或权利要求23的载体转化或转染的细胞或非人生物，其中所述细胞为例如原核细胞或真核细胞，优选地哺乳动物细胞，或更优选地人细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
25.药物组合物或诊断组合物，其包含权利要求1-21中任一项的CD40受体激动剂蛋白、权利要求22的核酸分子或权利要求23的载体作为活性试剂。
26.根据权利要求25的药物组合物或诊断组合物，其进一步包含一种或多种在药学上可接受的载料、稀释剂、赋形剂和/或助剂。
27.根据权利要求25或26的药物组合物，其用于在疗法中进行使用，更特别地用于在由CD40L功能障碍所引起的、与CD40L功能障碍相关的和/或伴随有CD40L功能障碍的病症的预防和/或治疗中进行使用，所述病症特别地为增生性病症，例如肿瘤，例如实体或淋巴肿瘤；感染性疾病；炎性疾病；代谢疾病；自身免疫性病症，例如类风湿性和/或关节炎性疾病；变性疾病，例如神经变性疾病，例如多发性硬化；凋亡相关性疾病；或移植排斥。
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