CN110760541B - 用中国仓鼠卵巢细胞表达外源蛋白时信号肽的选择方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用中国仓鼠卵巢细胞表达外源蛋白时信号肽的选择方法及应用，属于生物技术领域。本发明采用信息分析技术，对29种在CHO细胞中常用的高分泌表达信号肽和外源蛋白串联序列进行分析，最终选择分析结果合适的10种信号肽，通过PCR方法将10种不同的分泌型信号肽与串联表位基因的5’端相连，分别构建了真核表达载体并转染哺乳动物细胞CHO,采用Western blot检测CHO培养基中重组表位蛋白的累积差异,结果证明蛋白累计差异与本方法选择结果相符合，从而证明了所述方法的可行性。

Description

用中国仓鼠卵巢细胞表达外源蛋白时信号肽的选择方法及 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，进一步，涉及信号肽，具体地，涉及一种用中国仓鼠卵巢细胞表达外源蛋白时信号肽的选择方法及应用。
背景技术
中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)是表达药用生物活性大分子的首选，CHO很少分泌自身的内源蛋白，有利于蛋白的纯化。分泌表达是CHO的主要表达途径，但许多蛋白质(细胞因子等)的表达相对较低，增加细胞分泌的能力能显著促进重组蛋白的表达。
在CHO细胞表达分泌性蛋白质过程中，起初会合成由15-30个疏水性氨基酸组成的信号肽，信号肽随后被细胞质中的信号识别颗粒(Signal-Recognition Particle,SRP)所识别，识别后导致蛋白质合成暂停，随后核糖体与内质网膜结合，信号肽依靠其疏水性插入内质网膜腔内,在核糖体结合内质网膜后SRP将会离开，处于暂停状态的蛋白质合成重新开始。而后信号肽酶对信号肽进行切割。一个合适的信号肽有助于提高重组蛋白的表达水平。但是，信号肽和外源蛋白N端相连会发生切割位点的偏移，发生切割目的蛋白氨基酸的可能。
发明内容
为了解决现有技术中的不足，本发明的目的之一在于提供一种用中国仓鼠卵巢细胞表达外源蛋白时信号肽的选择方法，通过该方法可以选择适合外源目的蛋白外分泌表达的信号肽。本发明的目的之二在于提供所信号肽的选择方法在表达O型口蹄疫病毒重组表位蛋白过程中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：
用中国仓鼠卵巢细胞表达外源蛋白时信号肽的选择方法，其特征在于：首先选取能在中国仓鼠卵巢细胞中高分泌表达蛋白的信号肽作为待选择信号肽；将待选择信号肽分别与外源目的蛋白进行串联，获得重组蛋白；通过信号肽分析工具分析重组蛋白的氨基酸序列，选择切割位点分析准确的重组蛋白序列上的信号肽，即为适合外源目的蛋白外分泌表达的信号肽。
作为对上述方案的进一步优化，在所述待选择信号肽与外源目的蛋白进行串联时，在待选择信号肽与外源目的基因之间引入GGSSGG间隔子；通过信号肽分析工具分析后选择切割位点分析准确且落在间隔子上的重组蛋白。
作为对上述方案的更进一步优化，在所述外源目的蛋白含有多个表位时，在每两个相邻的表位之间引入GGSSGG间隔子。
本发明还请求保护所述信号肽的选择方法在中国仓鼠卵巢细胞分泌表达外源目的蛋白中的应用。
进一步地，所述应用是利用所述信号肽选择方法选择适合O型口蹄疫病毒重组表位蛋白表达的信号肽，包括以下步骤：
步骤一、选择O型口蹄疫病毒VP1蛋白的21～60AA、141～160AA和200～213AA作为优势表位；连接三个所述优势表位构建多表位基因表达盒；其中，在连接三个所述优势表位时在每两个相邻的优势表位之间引入GGSSGG间隔子；
步骤二、从已报道的文献中选取能有效分泌表达外源目的基因的信号肽作为待选择信号肽，将待选择信号肽分别与步骤一所得多表位基因表达盒连接，连接时在待选择信号肽和多表位基因表达盒之间分别选用引入GGSSGG间隔子和不引入GGSSGG间隔子两种连接方式，获取重组蛋白；
步骤三、使用信号肽分析工具分析步骤二所得重组蛋白的氨基酸序列，选择切割位点分析准确且落在间隔子上的信号肽，即为适合O型口蹄疫病毒蛋白表达的信号肽。
有益效果：
本发明所述信号肽的选择方法，改变了现有技术中在未知信号肽是否适合的前提下从已有报道中将信号肽直接拿来使用从而导致重组蛋白表达水平低的弊端，首次提出一种信号肽的选择方法，所述方法首先是在现有技术中选择出能在CHO细胞中高分泌表达蛋白的信号肽，将其与外源目的蛋白的表位基因串联后进行分析，通过分析选择出适合外源目的蛋白表达的信号肽，再对其进一步运用，大大提高了工作效率，同时节约成本。
附图说明
图1是信号肽切割位点的信息学分析；其中，2O-1：Erythropoietin信号肽引入间隔子；2O-2：Human trypsinogen-2信号肽引入间隔子；2O-3：Oikosin 1mutant信号肽引入间隔子；2O-4：Azurocidin preproprotein信号肽引入间隔子；2O-5：Ig kappa chain V-III region信号肽引入间隔子；2O-6：Apolipoprotein B-100precursor信号肽引入间隔子；2O-7：Serum albumin preproprotein信号肽引入间隔子；2O-8：UL16-binding protein2preproprotein信号肽引入间隔子；2O-9：scrapie-responsive protein 1precursor信号肽引入间隔子；2O-10：SCGB1D1 isoform 1信号肽引入间隔子；2O:Serum albuminpreproprotein信号肽未引入间隔子；
图2是重组质粒pCI-neo-O的酶切鉴定；其中，M1：DNA标尺(DL10000)；1：2O-1未经酶切；2：2O-1经Xho I及Not I酶切；3：2O-2未经酶切；4：2O-2经Xho I及Not I酶切；5：2O-3未经酶切；6：2O-3经Xho I及Not I酶切；7：2O-4未经酶切；8：2O-4经Xho I及Not I酶切；9：2O-5未经酶切；10：2O-5经Xho I及Not I酶切；11：2O-6未经酶切；12：2O-1经Xho I及Not I酶切；M2：DNA标尺(DL10000)；13：2O-7未经酶切；14：2O-7经Xho I及Not I酶切；15：2O-8未经酶切；16：2O-8经Xho I及Not I酶切；17：2O-9未经酶切；18：2O-9经Xho I及Not I酶切；19：2O-10未经酶切；20：2O-10经Xho I及Not I酶切；21：2O未经酶切；22：2O经Xho I及Not I酶切；23：pCI-neo未经酶切；24：pCI-neo经Xho I及Not I酶切；
图3是pCI-neo-O真核表达载体图谱；其中，KOZAK:KOZAK序列；Signal Peptide：信号肽序列；RE：多表位基因序列；
图4是Western blot检测不同信号肽介导O型口蹄疫病毒重组表位蛋白质水平差异；其中，1：2O-1；2：2O-2；3：2O-3；4：2O-4；5：2O-5；6：2O-6；7：2O-7；8：2O-8；9：pCI-neo；10：2O-9；11：2O-10；12：2O；13：转染空质粒pCI-neo培养基上清。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1信号肽切割位点的信息学分析
选择O型口蹄疫(Gen Bank:QDJ95689.1)VP1蛋白的21～60AA、141～160AA和200～213AA作为优势表位，合理地连接它们以构建多表位基因表达盒。为了在两个相邻表位连接后防止新表位的形成，在表位之间引入GGSSGG间隔子序列以确保靶标抗原位的正确性。从已报道的文献中选取能有效分泌表达外源蛋白的信号肽其核苷酸序列如表1所示，并将它们与多表位基因表达盒连接。分别在信号肽和多表位基因表达盒之间引入GGSSGG间隔子和不引入GGSSGG间隔子，使用分析工具(http://www.detaibio.com/tools/signal-peptide.html)分析重组蛋白氨基酸序列(C,S,Y三条线相交代表切割位点准确，交点处氨基酸为切割位点)，选择切割位点分析准确且落在间隔子上的信号肽。结果如图1所示。最终选出10种信号肽，如序列表2所示。
实施例2 pCI-neo-O真核表达载体的构建
1、多表位基因表达盒的合成
根据O型FMDV(Gen Bank:QDJ95689.1)的基因序列，分别选取O型FMDV VP1上的21～60AA、141～160AA和200～213AA作为优势表位且每个表位进行两个重复串联，通过linker序列GGSSGG连接起来，形成新的表位盒，其序列如SEQ ID：01所示。并将该串联表位盒的基因序列送苏州金唯智生物科技有限公司合成。
2、信号肽与多表位基因表达盒连接
采用PCR的方法将选出的10种不同分泌型信号肽分别与已合成的多表位基因表达盒串联，其中Serum albumin preproprotein-F1和Serum albumin preproprotein-F2信号肽相同，但Serum albumin preproprotein-F2不含GGSSGG间隔子序列。将kozak序列(GCCACC)引入上游引物5'末端的信号肽序列前，以提高真核基因的翻译效率，并将Xho I和Not I限制性核酸内切酶位点分别插入到上游和下游引物的5'末端。引物序列如表3所示。
3、重组表位蛋白基因插入载体
将pCI-neo载体与PCR产物Xho I和Not I限制性核酸内切酶进行双酶切，37℃酶切3h之后进行琼脂糖凝胶电泳回收目的基因片段，具体步骤参照试剂盒说明书。将回收产物，用T4连接酶16℃连接过夜，将连接产物转化DH5α感受态细胞，提取质粒用Xho I和Not I酶切鉴定，结果如图2所示，在700bp左右出现特异性条带。并送北京奥科生物科技有限公司测序。对测序正确的质粒，重新去内毒素提取重组质粒，用作后续转染实验。质粒图谱如图3所示。
实施例3重组蛋白累积分析
1、重组质粒转染CHO细胞
按照Lipofectamine 3000试剂盒说明书将pCI-neo-O重组质粒转染CHO细胞。转染8h后，更换含有10％血清的高糖DMEM培养基，继续培养。
2、Western blot鉴定CHO细胞培养基中重组表位蛋白累积
转染后48h收集CHO细胞培养基，与PMSF混合使终浓度为0.001mol/L，以800r/min离心5min以除去细胞碎片，取上清液进行BCA蛋白质定量。以总蛋白质量为60μg，通过SDS-PAGE转移至NC膜。5％脱脂乳在室温下封闭2h，加入兔抗O型口蹄疫病毒血清，4℃下孵育过夜；5min/次用PBST洗涤5次，加入HRP标记的山羊抗兔二抗，室温下孵育1h；5min/次用PBST洗涤5次，将适量的ECL显色溶液加入到膜中以显色。结果如图4所示，SCGB1D1 isoform信号肽(2O-10)介导的O型口蹄疫病毒重组表位蛋白质水平明显高于其他9种,其中Erythropoietin信号肽介导的O型口蹄疫病毒重组表位蛋白质水平极低(2O-1)。Serumalbumin preproprotein信号肽和重组表位串联，引入GGSSGG间隔子切割位点不准确(2O-7)，不引入GGSSGG间隔子切割位点准确(2O)，在信号肽性质相同的情况下切割位点准确的O型口蹄疫病毒重组表位蛋白质水平明显高于切割位点不准确的重组串联表位蛋白质水平。同信号肽选择方法相吻合，即在CHO中表达外源蛋白时，不仅要选择在CHO细胞中高分泌表达蛋白的信号肽，同时将信号肽与外源蛋白的N末端连接后进行分析，选择切割位点准确的信号肽。
本发明选取29种在CHO中常用的信号肽，通过信息学分析信号肽O型口蹄疫病毒重组表位蛋白的氨基酸序列，选择切割位点合适的组合初步筛选出10种信号肽，通过不同串联方式构建11种真核表达载体，转染CHO细胞，在此基础上比较培养基中O型口蹄疫病毒重组表位蛋白累积水平差异，验证10种信号肽及串联方式对CHO细胞分泌O型口蹄疫病毒重组表位蛋白的影响，研究结果表明,不同的分泌型信号肽明显改变O型口蹄疫病毒重组表位蛋白在CHO培养基中的累积，蛋白累计差异与本方法选择结果相符合。
表1：29种能有效分泌表达外源蛋白的信号肽
Figure BDA0002255585090000051
Figure BDA0002255585090000061
表2：选择出的10中适合口蹄疫病毒蛋白表达的信号肽
Figure BDA0002255585090000062
表3：引物序列表
Figure BDA0002255585090000071
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 用中国仓鼠卵巢细胞表达外源蛋白时信号肽的选择方法及应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 184
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Val Ser Phe Ile Leu
1 5 10 15
Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Gln Thr Asn Val Leu Asp
20 25 30
Leu Met Gln Thr Pro Ala His Thr Gly Gly Ser Ser Gly Gly Glu Thr
35 40 45
Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Val Ser Phe Ile Leu Asp Arg
50 55 60
Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Gln Thr Asn Val Leu Asp Leu Met
65 70 75 80
Gln Thr Pro Ala His Thr Gly Gly Ser Ser Gly Gly Val Pro Asn Val
85 90 95
Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro
100 105 110
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Val Pro Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val
115 120 125
Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Gly Gly Ser Ser Gly Gly
130 135 140
Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Leu Leu Gly Gly
145 150 155 160
Ser Ser Gly Gly Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln
165 170 175
Leu Leu His His His His His His
180

Claims (3)

1.用中国仓鼠卵巢细胞表达外源蛋白时信号肽的选择方法，其特征在于：首先选取能在中国仓鼠卵巢细胞中高分泌表达蛋白的信号肽作为待选择信号肽；将待选择信号肽分别与外源目的蛋白进行串联，在待选择信号肽与外源目的基因之间引入GGSSGG间隔子和不引入GGSSGG间隔子，获得重组蛋白；通过信号肽分析工具分析重组蛋白的氨基酸序列，选择切割位点分析准确且落在间隔子上的重组蛋白序列上的信号肽，即为适合外源目的蛋白外分泌表达的信号肽；
所述外源蛋白是指Gen Bank：QDJ95689.1的O型口蹄疫病毒VP1蛋白的21~60AA、141~160AA和200~213AA。
2.根据权利要求1所述的用中国仓鼠卵巢细胞表达外源蛋白时信号肽的选择方法，其特征在于：在所述外源目的蛋白含有多个表位时，在每两个相邻的表位之间引入GGSSGG间隔子。
3.权利要求1-2任意一种所述的信号肽的选择方法在中国仓鼠卵巢细胞分泌表达O型口蹄疫病毒重组表位蛋白中的应用，其特征在于：所述应用是利用所述信号肽的选择方法选择适合O型口蹄疫病毒重组表位蛋白表达的信号肽，包括以下步骤：
步骤一、选择Gen Bank：QDJ95689.1的O型口蹄疫病毒VP1蛋白的21~60AA、141~160AA和200~213AA作为优势表位；连接三个所述优势表位构建多表位基因表达盒；其中，在连接三个所述优势表位时在每两个相邻的优势表位之间引入GGSSGG间隔子；
步骤二、从已报道的文献中选取能有效分泌表达外源目的基因的信号肽作为待选择信号肽，将待选择信号肽分别与步骤一所得多表位基因表达盒连接，连接时在待选择信号肽和多表位基因表达盒之间分别选用引入GGSSGG间隔子和不引入GGSSGG间隔子两种连接方式，获取重组蛋白；
步骤三、使用信号肽分析工具分析步骤二所得重组蛋白的氨基酸序列，选择切割位点分析准确且落在间隔子上的信号肽，即为适合O型口蹄疫病毒蛋白表达的信号肽。
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"猪Ｏ型FMDV重组多表位抗原基因的克隆表达及免疫学鉴定";高明 等;《甘肃农业大学学报》;20170228;第52卷(第1期);第2页左栏第1段，第3页左栏第3段 *
徐栋生 等."信号肽对肝细胞生长因子HGF在CHO中表达及分泌的影响".《中国细胞生物学学报》.2016,第38卷(第12期), *

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