CN103328649B - 用于改善重组酶及其它蛋白的蛋白表达和分泌的新的信号序列 - Google Patents
用于改善重组酶及其它蛋白的蛋白表达和分泌的新的信号序列 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103328649B CN103328649B CN201180065369.5A CN201180065369A CN103328649B CN 103328649 B CN103328649 B CN 103328649B CN 201180065369 A CN201180065369 A CN 201180065369A CN 103328649 B CN103328649 B CN 103328649B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- signal sequence
- bip
- polypeptide
- seqidno
- igf
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 title claims abstract description 136
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 131
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 128
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims description 44
- 230000028327 secretion Effects 0.000 title description 23
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 title description 5
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 title description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 66
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 64
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 64
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 64
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 56
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 56
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 claims abstract description 52
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 37
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 94
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 64
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 claims description 52
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 claims description 51
- 101001076292 Homo sapiens Insulin-like growth factor II Proteins 0.000 claims description 41
- 102100025947 Insulin-like growth factor II Human genes 0.000 claims description 41
- 229940068935 insulin-like growth factor 2 Drugs 0.000 claims description 41
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 claims description 36
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 claims description 36
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 35
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 32
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 22
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 22
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 claims description 21
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 20
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 20
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 20
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 20
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 20
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 19
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 17
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 14
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 7
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 6
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 230000029142 excretion Effects 0.000 claims description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 33
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 28
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 25
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 19
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 18
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 13
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 102100026277 Alpha-galactosidase A Human genes 0.000 description 7
- 108010051611 Signal Recognition Particle Proteins 0.000 description 7
- 102000013598 Signal recognition particle Human genes 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 230000007398 protein translocation Effects 0.000 description 7
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 7
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 5
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 5
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 5
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- 101710194180 Alcohol oxidase 1 Proteins 0.000 description 4
- 102100024295 Maltase-glucoamylase Human genes 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 3
- 101100476756 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) sec-61 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 241000631463 Saara Species 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 3
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- -1 Bip Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 102100036717 Growth hormone variant Human genes 0.000 description 2
- 101710191157 Growth hormone variant Proteins 0.000 description 2
- 101000616112 Homo sapiens Stress-associated endoplasmic reticulum protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 101150083515 RPL17 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000002278 Ribosomal Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010000605 Ribosomal Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 2
- 108050007673 Somatotropin Proteins 0.000 description 2
- 102100021813 Stress-associated endoplasmic reticulum protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 108010056891 Calnexin Proteins 0.000 description 1
- 102100021868 Calnexin Human genes 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 108700041152 Endoplasmic Reticulum Chaperone BiP Proteins 0.000 description 1
- 102100021451 Endoplasmic reticulum chaperone BiP Human genes 0.000 description 1
- 108010042546 GCGGCCGC-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 101000997662 Homo sapiens Lysosomal acid glucosylceramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 101710169105 Minor spike protein Proteins 0.000 description 1
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 1
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000010001 cellular homeostasis Effects 0.000 description 1
- 230000004640 cellular pathway Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 230000004637 cellular stress Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 229950004152 insulin human Drugs 0.000 description 1
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 108010045758 lysosomal proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000002824 peroxisome Anatomy 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 108010000633 signal peptide receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000001117 sulphuric acid Substances 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical class OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0002—Antibodies with enzymatic activity, e.g. abzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01022—Alpha-galactosidase (3.2.1.22)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01045—Glucosylceramidase (3.2.1.45), i.e. beta-glucocerebrosidase
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明公开了人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的多肽信号序列。本发明还公开了融合蛋白，所述融合蛋白包括与异源多肽操作性连接的人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段。本发明还公开了蛋白表达载体，所述载体包括与第一DNA序列和第二DNA序列操作性连接的启动子，所述第一DNA序列编码包括人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的信号序列，所述第二DNA序列编码异源多肽，所述第二DNA序列在框架内与所述第一DNA序列融合。本发明进一步公开了一种生产多肽的方法，所述方法包括表达融合蛋白，所述融合蛋白包括人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的多肽信号序列，所述序列与异源多肽操作性连接，和回收所述异源多肽。
Description
交叉引用美国相关专利申请
本申请要求2010年11月22日提交的美国临时专利申请号61/415,926的优先权，其通过引用整体并入本发明。
技术领域
用于治疗和其它用途的重组酶和其它蛋白的表达和分泌。
背景技术
在真核生物中，几乎所有蛋白的蛋白合成均是在细胞质中通过称为核糖体的巨型蛋白复合物开始的。多种蛋白在细胞质中完成其合成和折叠并留在其中发挥功能。但是，多种其它的蛋白从细胞质中输出并进入内质网(ER)，在那里其获得所需的翻译后修饰(例如，二硫键、糖基化等)，以便使其获得适当的蛋白结构和生物活性，然后将其输出到目的细胞位置(例如，高尔基体、过氧化物酶体和溶酶体蛋白)或细胞表面(例如，受体、离子通道等)或分泌出细胞(例如，抗体、凝血因子、激素等)。输出细胞质的蛋白与细胞质内的蛋白不同，区别在于在氨基(N-)末端具有称为信号序列的特定蛋白元件。
信号序列(也称为信号肽)不具有一致的氨基酸序列或长度，但是一般在N-末端含有起始的15-40个残基，其中7-20个连续的疏水氨基酸残基形成α-螺旋二级结构，所述二级结构的两侧通常为带电残基。信号序列在细胞质中被称为信号识别颗粒(SRP)的特定多亚基蛋白：RNA复合物所识别，SRP将这些新生蛋白引导至ER膜内称为转位子的特定孔，在那里这些蛋白穿过ER膜转运至ER腔——这一过程被称为蛋白转位。
在哺乳动物中，蛋白转位与蛋白合成同时发生(即，共翻译)，但是在其它真核生物中(例如，酵母)，这一过程可以是共翻译或在翻译后。在细菌中信号序列介导的蛋白转位也用于引导蛋白从细胞质中输出并进入周质。在哺乳动物中，信号序列从核糖体中出来时被SRP识别，这暂时中止了蛋白翻译以允许整个SRP-新生蛋白-核糖体复合物通过相关的SRP受体定位至转位子。在释放SRP且核糖体-新生蛋白复合物适当地停靠在转位子后，蛋白合成重新开始。
大多数酶和其它蛋白治疗剂是由重组技术生产的，把该技术设计成将这些重组蛋白分泌出细胞，分泌到细胞培养基中以简化后续的纯化。因此，这些重组酶和其它蛋白必须利用信号序列和这个相同的细胞途径用于分泌。因此，大规模生产这些蛋白需要信号序列能够介导有效的ER定位和蛋白转位穿过ER膜。然而，在促进ER定位和转位上，信号序列的效果不尽相同。据信，SRP迅速和有效地识别信号序列，但是随后的ER定位和转位步骤在不同蛋白之间差异很大。由于信号序列被识别两次，第一次是由SRP识别以将新生蛋白-核糖体复合物定位至ER，随后由转位子蛋白(即，Sec61蛋白)和其它转位子相关ER蛋白识别以启动转位，因而这两者均为调控的潜在位点。已证明后一个步骤更加迫切并且效率更低，因而其在这一过程中是主要瓶颈。令人惊讶的是，在促进蛋白转位方面大部分信号序列在本质上是低效的。所以，很多ER定位的新生蛋白-核糖体复合物从ER膜上解离，蛋白合成失败，从而降低其蛋白表达和分泌。
发明概述
本发明提供了多肽信号序列，其包括人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段。
本发明还提供了融合蛋白，其包括与异源多肽操作性连接的人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段。
本发明进一步提供了蛋白表达载体，其包括与第一DNA序列操作性连接的启动子，其中所述第一DNA序列编码人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段多肽信号序列，和第二DNA序列，所述第二DNA序列在框架内与所述第一DNA序列融合，其中所述第二DNA序列编码异源多肽。
本发明还提供了生产多肽的方法，其包括表达融合蛋白，所述融合蛋白包括源于人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的多肽信号序列，所述序列与异源多肽操作性连接，和回收所述异源多肽。
本发明还提供了生产多肽的方法，其包括表达融合蛋白，所述融合蛋白包括人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段多肽信号序列，所述信号序列与异源多肽操作性连接，和回收所述异源多肽。
本发明进一步提供了蛋白表达载体，其包括与第一DNA序列操作性连接的启动子，其中所述第一DNA序列编码包含人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的多肽信号序列和第二DNA序列，所述第二DNA序列在框架内与所述第一DNA序列融合，其中所述第二DNA序列编码异源多肽。
本发明还提供了增加蛋白表达的方法，其包括表达融合蛋白，所述融合蛋白包括人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段和异源蛋白，和回收所述异源蛋白。
本公开的发明还提供了增加蛋白分泌的方法，其包括表达融合蛋白，所述融合蛋白包括人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段和异源蛋白，和回收所述异源蛋白。
附图概述
当结合附图考虑时，通过对本发明的下述详细描述，本发明的前述和其它方面是显而易见的。出于解释本发明的目的，在附图中所示的均为优选的实施方式，但是将理解本发明不限于所公开的特定方式。附图并不一定是按照比例尺绘制的。在附图中：
图1显示了在约72小时时间段内，信号序列对重组野生型人酸性β-葡萄糖脑苷脂酶的表达和分泌的功能效应。
图2显示了在约63小时时间段内，在高细胞密度和营养耗竭条件下重组野生型人酸性β-葡萄糖脑苷脂酶被优先表达和分泌。
图3显示了在约43小时时间段内，信号序列对重组野生型人酸性α-葡萄糖苷酶的表达和分泌的功能效应。
发明详述
本发明所使用的“异源多肽”是任何多肽但不是人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段。
本发明所使用的“Bip”是免疫球蛋白重链结合蛋白的缩写。
适宜的多肽信号序列可以包括人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段。包括人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的多肽信号序列可以包括SEQIDNO：20、SEQIDNO：21、SEQIDNO：22或SEQIDNO：23所示的氨基酸序列。
适宜的融合蛋白可以包括与异源多肽操作性连接的人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段。该融合蛋白的特征可以在于在细胞培养中表达增加。细胞培养也可以是非最佳细胞培养条件。非最佳细胞培养条件可以是高细胞密度和营养耗竭。具有人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的其它适宜的融合蛋白可以包括SEQIDNO：20，、SEQIDNO：21、SEQIDNO：22或SEQIDNO：23所示的氨基酸序列。所有这些融合蛋白的特征亦均可以在于在细胞培养中表达增加。细胞培养也可以是非最佳细胞培养条件。非最佳细胞培养条件可以是高细胞密度和营养耗竭。异源多肽可以是一种或多种酶、一种或多种生物反应调节剂、一种或多种毒素、一种或多种抗体、一种或多种异源多肽片段或其任意组合。异源多肽可以是酸性β-葡萄糖脑苷脂酶。异源多肽还可以是酸性α-半乳糖苷酶。异源多肽还可以是酸性α-葡萄糖苷酶。异源多肽还可以是胰岛素原。异源多肽还可以是胰岛素样生长激素-2(IGF-2)。异源多肽还可以是干扰素。异源多肽还可以是治疗性抗体。异源多肽还可以是胰岛素样生长激素-1(IGF-1)。
具有人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的其它适宜的融合蛋白可以包括SEQIDNO：20、SEQIDNO：21、SEQIDNO：22或SEQIDNO：23所示的氨基酸序列，并且异源多肽可以包括β-葡萄糖脑苷脂酶。与野生型β-葡萄糖脑苷脂酶(具有天然β-葡萄糖脑苷脂酶信号序列的β-葡萄糖脑苷脂酶)相比，那些融合蛋白的特征可以在于在细胞培养中表达增加。在细胞培养中表达增加可以通过在为期约3天的时间段内检测β-葡萄糖脑苷脂酶活性来测定。细胞培养也可以是非最佳细胞培养条件。非最佳细胞培养条件可以是高细胞密度和营养耗竭。在高细胞密度和营养耗竭条件下的细胞培养中表达增加可以通过在为期约3天的时间段内检测β-葡萄糖脑苷脂酶活性来测定。
具有人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的其它适宜的融合蛋白可以包括SEQIDNO：20、SEQIDNO：21、SEQIDNO：22或SEQIDNO：23所示的氨基酸序列，并且异源多肽可以包括α-半乳糖苷酶。与野生型α-半乳糖苷酶(具有天然α-半乳糖苷酶信号序列的α-半乳糖苷酶)相比，那些融合蛋白的特征可以在于在细胞培养中表达增加。在细胞培养中表达增加可以通过在为期约3天的时间段内检测α-半乳糖苷酶活性来测定。细胞培养也可以是非最佳细胞培养条件。非最佳细胞培养条件可以是高细胞密度和营养耗竭。在高细胞密度和营养耗竭条件下的细胞培养中表达增加可以通过在为期约3天的时间段内检测α-半乳糖苷酶活性来测定。
具有人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的其它适宜的融合蛋白可以包括SEQIDNO：20、SEQIDNO：21、SEQIDNO：22或SEQIDNO：23所示的氨基酸序列，并且异源多肽可以包括酸性α-葡萄糖苷酶。与野生型酸性α-葡萄糖苷酶(具有天然酸性α-葡萄糖苷酶信号序列的酸性α-葡萄糖苷酶)相比，那些融合蛋白的特征可以在于在细胞培养中表达增加的特征。在细胞培养中表达增加可以通过在为期约3天的时间段内检测酸性α-葡萄糖苷酶活性测定。细胞培养也可以是非最佳细胞培养条件。非最佳细胞培养条件可以是高细胞密度和营养耗竭。在高细胞密度和营养耗竭条件下的细胞培养中表达增加可以通过在为期约3天的时间段内检测酸性α-葡萄糖苷酶活性来测定。
具有人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的其它适宜的融合蛋白可以包括SEQIDNO：20、SEQIDNO：21、SEQIDNO：22或SEQIDNO：23所示的氨基酸序列，并且异源多肽可以包括胰岛素原。与野生型胰岛素原(具有天然胰岛素原信号序列的胰岛素原)相比，那些融合蛋白的特征可以在于在细胞培养中表达增加的特征。在细胞培养中表达增加可以通过在为期约3天的时间段内检测胰岛素原活性测定。细胞培养也可以是非最佳细胞培养条件。非最佳细胞培养条件可以是高细胞密度和营养耗竭。在高细胞密度和营养耗竭条件下的细胞培养中表达增加可以通过在为期约3天的时间段内检测胰岛素原活性来测定。
具有人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的其它适宜的融合蛋白可以包括SEQIDNO：20、SEQIDNO：21、SEQIDNO：22或SEQIDNO：23所示的氨基酸序列，并且异源多肽可以包括胰岛素样生长激素-2(IGF-2)。与野生型胰岛素样生长激素-2(IGF-2)(具有天然胰岛素样生长激素-2(IGF-2)信号序列的胰岛素样生长激素-2(IGF-2))相比，那些融合蛋白的特征可以在于在细胞培养中表达增加。在细胞培养中表达增加可以通过在为期约3天的时间段内检测胰岛素样生长激素-2(IGF-2)活性测定。细胞培养也可以是非最佳细胞培养条件。非最佳细胞培养条件可以是高细胞密度和营养耗竭。在高细胞密度和营养耗竭条件下的细胞培养中表达增加可以通过在为期3天的时间段内检测胰岛素样生长激素-2(IGF-2)活性来测定。
具有人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的其它适宜的融合蛋白可以包括SEQIDNO：20、SEQIDNO：21、SEQIDNO：22或SEQIDNO：23所示的氨基酸序列，并且异源多肽可以包括干扰素。与野生型干扰素(具有天然干扰素信号序列的干扰素)相比，那些融合蛋白的特征可以在于在细胞培养中表达增加。在细胞培养中表达增加可以通过在为期约3天的时间段内检测干扰素活性测定。细胞培养也可以是非最佳细胞培养条件。非最佳细胞培养条件可以是高细胞密度和营养耗竭。在高细胞密度和营养耗竭条件下的细胞培养中表达增加可以通过在为期约3天的时间段内检测干扰素活性来测定。
具有人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的其它适宜的融合蛋白可以包括SEQIDNO：20、SEQIDNO：21、SEQIDNO：22或SEQIDNO：23所示的氨基酸序列，并且异源多肽可以包括治疗性抗体。与野生型治疗性抗体(具有天然治疗性抗体信号序列的治疗性抗体)相比，那些融合蛋白的特征可以在于在细胞培养中表达增加。在细胞培养中表达增加可以通过在为期约3天的时间段内检测治疗性抗体活性测定。细胞培养也可以是非最佳细胞培养条件。非最佳细胞培养条件可以是高细胞密度和营养耗竭。在高细胞密度和营养耗竭条件下的细胞培养中表达增加可以通过在为期约3天的时间段内检测治疗性抗体活性来测定。
具有人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的其它适宜的融合蛋白可以包括SEQIDNO：20、SEQIDNO：21、SEQIDNO：22或SEQIDNO：23所示的氨基酸序列，并且异源多肽可以包括胰岛素样生长激素-1(IGF-1)。与野生型胰岛素样生长激素-1(IGF-1)(具有天然胰岛素样生长激素-1(IGF-1)信号序列的胰岛素样生长激素-1(IGF-1))相比，那些融合蛋白的特征可以在于在细胞培养中表达增加的特征。在细胞培养中表达增加可以通过在为期约3天的时间段内检测胰岛素样生长激素-1(IGF-1)活性测定。细胞培养也可以是非最佳细胞培养条件。非最佳细胞培养条件可以是高细胞密度和营养耗竭。在高细胞密度和营养耗竭条件下的细胞培养中表达增加可以通过在为期约3天的时间段内检测胰岛素样生长激素-1(IGF-1)活性来测定。
适宜的蛋白表达载体可以包括与第一DNA序列操作性连接的启动子和编码异源多肽的第二DNA序列，其中所述第一DNA序列编码包含人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的多肽信号序列，所述第二DNA序列在框架内与所述第一DNA序列融合。所述多肽信号序列包括人免疫球蛋白重链连接蛋白(Bip)的经修饰的片段，所述多肽信号序列可以包括SEQIDNO：20、SEQIDNO：21、SEQIDNO：22或SEQIDNO：23所示的氨基酸序列。第二DNA序列可以编码β-葡萄糖脑苷脂酶。
适宜的蛋白表达载体可以包括与第一DNA序列操作性连接的启动子和编码异源多肽的第二DNA序列，所述第一DNA序列编码含有人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的多肽信号序列，所述第二DNA序列在框架内与所述第一DNA序列融合。所述多肽信号序列包括人免疫球蛋白重链连接蛋白(Bip)的经修饰的片段，所述多肽信号序列可以包括SEQIDNO：20、SEQIDNO：21、SEQIDNO：22或SEQIDNO：23所示的氨基酸序列。第二DNA序列可以编码酸性α-葡萄糖苷酶。
适宜的蛋白表达载体可以包括与第一DNA序列操作性连接的启动子和编码异源多肽的第二DNA序列，所述第一DNA序列编码含有人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段的多肽信号序列，所述第二DNA序列在框架内与所述第一DNA序列融合。所述多肽信号序列包括人免疫球蛋白重链连接蛋白(Bip)的经修饰的片段，所述多肽信号序列可以包括SEQIDNO：20、SEQIDNO：21、SEQIDNO：22或SEQIDNO：23所示的氨基酸序列。第二DNA序列可以编码其他异源蛋白，如α-半乳糖苷酶。异源多肽还可以是胰岛素原。异源多肽还可以是胰岛素样生长激素-2(IGF-2)或胰岛素样生长激素-1(IGF-1)。异源多肽还可以是干扰素。异源多肽还可以是治疗性抗体。异源多肽还可以是任意分泌出细胞的其它蛋白。
生产多肽的适宜方法可以包括表达融合蛋白，所述融合蛋白具有人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段，所述片段与异源多肽操作性连接，并且回收所述异源多肽。生产多肽的方法可以在培养的细胞中进行。培养的细胞可以是酵母细胞或哺乳动物细胞。生产多肽的方法可以在转基因系统中进行。转基因系统可以包括牛、山羊、绵羊、兔或其任意组合。从转基因系统中的回收可以从牛奶中。转基因系统还可以包括鸡。从转基因系统中的回收可以从蛋中。
制备蛋白表达载体的适宜方法可以包括，将启动子与编码多肽信号序列的第一DNA序列操作性连接，所述多肽信号序列包括人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段，以及在框架内将第二DNA序列与所述第一DNA序列融合，其中所述第二DNA序列编码异源多肽。制备蛋白表达载体的方法还可以具有第一DNA序列，其编码SEQIDNO：20、SEQIDNO：21、SEQIDNO：22或SEQIDNO：23所示的氨基酸序列。制备蛋白表达载体的方法还可以具有第二DNA序列，其编码酸性β-葡萄糖脑苷脂酶、酸性α-半乳糖苷酶、酸性α-葡萄糖苷酶、胰岛素原、胰岛素样生长激素-2(IGF-2)、干扰素、治疗性抗体或胰岛素样生长激素-1(IGF-1)或其它分泌出细胞的蛋白。
增加蛋白表达的适宜方法可以包括表达融合蛋白，所述融合蛋白包括人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段和异源蛋白，和回收所述异源蛋白。
增加蛋白分泌的适宜方法可以包括表达融合蛋白，所述融合蛋白包括人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段和异源蛋白，和回收所述异源蛋白。
实施例1
试剂
野生型人β-葡萄糖脑苷脂酶(“GlcCerase”)cDNA(NM_000157.3)、野生型酸性α-半乳糖苷酶A(GLA)cDNA(NM_000169.2)、野生型人酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)cDNA(NM_000152.2)和野生型人胰岛素样生长因子-2(IGF-2)cDNA(NM_000612.4)均购自OrigeneTM(Rockville，MD)，而所有寡核苷酸引物和合成的微基因来自IntegratedDNATechnologiesTM(IDTTM；Coralville，IA)。pEF6/V5-HisA哺乳动物表达载体、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)和其它组织培养试剂均来自InvitrogenTM(Carlsbad，CA)。限制性核酸内切酶、Phusion-HFDNA聚合酶TM、T4DNA连接酶、Antarctic磷酸酶、化学感受态大肠杆菌(DH5α细胞)均购自NewEnglandBiolabsTM(Ipswich，MA)。不同糖苷酶的荧光底物购自ResearchProductsInternationalTM(Mt.Prospect，IL)，DNA凝胶提取和微量制备DNA试剂盒来自QIAGENTM(Valencia，CA)，PureYieldMaxiprepDNATM试剂盒来自PromegaTM(Madison，WI)。除非另有说明，否则化学试剂来自SigmaTM(St.Louis，MO)，Fugene-HDTM转染试剂来自RocheTM(Indianapolis，IN)，经T-抗原转化的人胚肾细胞(HEK293T)来自ATCCTM。
质粒构建
构建编码不同模型蛋白的DNA质粒，所述模型蛋白含有天然信号序列或被经修饰的人Bip信号序列所替代，以评估这些信号序列对待测蛋白表达和分泌的作用。
为了评估人酸性β-葡萄糖脑苷脂酶(GlcCerase，EC3.2.1.45)，构建若干不同的DNA质粒以编码具有其天然信号序列或人Bip信号序列或经修饰的Bip信号序列的野生型GlcCerase。为产生具有其天然信号序列的野生型人GlcCerase，通过Phusion-HFDNA聚合酶TM使用引物1&2(表I)和GlcCerasecDNA克隆(NM_000157.3，Origene)利用PCR扩增整个人GlcCerasecDNA。构建引物1，其含有5’BglII和内在的EcoRI限制性酶切位点，其后紧邻天然GlcCeraseKozak序列，而引物2，其含有3’NheI和NotI限制性酶切位点，其紧随终止密码子，以使得PCR产物能够克隆至哺乳动物表达载体。从1％(w/v)的琼脂糖制备凝胶上分离和切取～1.6千碱基(kb)的PCR产物(A)，并使用QIAGENTM凝胶提取试剂盒TM分离。随后使用限制性核酸内切酶BglII和NotI在37℃下将PCR产物A消化过夜，再次纯化并使用T4DNA连接酶使其与pEF6/V5-HisA哺乳动物表达载体(InvitrogenTM)连接，所述表达载体预先已使用BamHI和NotI消化且使用Antarctic磷酸酶去磷酸化。在引物1中引入BglII限制性酶切位点，以使得BglII-消化的GlcCerasePCR产物连接到pEF6/V5-HisA载体的相容BamHI位点处，并除去在多克隆位点内的BamHI限制性酶切位点，此后将这个经修饰的表达载体称为pEF6’。称为pHD101的该DNA构建体用于转化化学感受态大肠杆菌细胞，扩增各氨苄西林抗性细菌菌落，并分别使用EcoRI&NheI和用BamHI通过消化反应进行筛选。通过DNA测序对来自克隆4的正确质粒DNA(称为pHD101.4)进行进一步确证，并选用于野生型GlcCerase的表达。使用pHD101.4来构建其它编码野生型GlcCerase的质粒，所述野生型GlcCerase具有人Bip信号序列或具有该Bip信号序列的经修饰的版本而非天然GlcCerase信号序列。简言之，构建(并由IntegratedDNATechnologiesTM，IDTTM合成)双链DNA微基因(在表II中称为微基因1)，其含有来自酵母醇氧化酶1(AOX1)基因的天然Kozak序列、整个的18-残基天然人Bip信号序列(包括其成熟信号肽识别序列：Ser-Ala-Ala-Arg-Ala；SAARA(SEQIDNO：24))基因和成熟野生型人GlcCerase(核苷酸118-490)的N-末端123个氨基酸残基。微基因1还含有在AOX1Kozak序列之前的5’EcoRI限制性酶切位点，和在3’末端的GlcCerase基因中的天然NcoI位点，从而使其能够克隆至pHD101.4中，将天然GlcCerase信号序列替换成人Bip信号序列。而且，这一策略能够构建用于在哺乳动物或酵母系统中表达野生型GlcCerase(具有Bip信号序列)的DNA质粒(在诱导型AOX1启动子的控制下)。在这种和其它融合蛋白的设计中，利用SignalP4.0TM分析程序来预测Bip信号序列是否将从待测蛋白上裂解。
根据需要在构建体中添加额外的氨基酸残基以便于信号序列的裂解，仅选择预计具有适宜信号序列裂解作用的序列产生这些融合的待测蛋白。对于在哺乳动物系统中的表达，使用引物3&4和微基因1DNA模板，通过PCR合成含有天然人BipKozak序列的Bip-GlcCeraseDNA片段。从1％(w/v)的琼脂糖制备凝胶上分离和切取～440bp的PCR产物(B)，并使用QIAGEN凝胶提取试剂盒分离。如上文所述，使用限制性核酸内切酶EcoRI和NcoI将PCR产物B消化过夜，再次纯化，并与NcoI→NotIDNA片段和～5.8kbEcoRI→NotIpEF6’载体的DNA片段连接，所述NcoI→NotIDNA片段来自pHD101.4，且编码成熟野生型GlcCerase(缺乏天然GlcCerase信号序列)的氨基酸残基124-497。该DNA构建体被称为pHD201，使用EcoRI-XbaI通过限制性消化对其进行验证，通过DNA测序确定正确的克隆(pHD201.2)，随后使用其评估人Bip信号序列对野生型GlcCerase表达和分泌的作用。类似地，通过IDTTM构建和合成Bip信号序列的经修饰的版本(微基因2)，其含有来自AOX1酵母基因的天然Kozak序列、天然人Bip信号序列的前13个残基，然后接氨基酸残基4-13的重复、天然Bip信号肽酶识别序列(残基14-18)和成熟野生型人GlcCerase(核苷酸118-490)的N-末端的123个残基。对Bip信号序列进行的该修饰(称为经修饰的Bip信号序列-1)扩大了疏水性结构域，使得其跨过整个ER膜并将信号序列由18延长至28个残基。对于在哺乳动物系统中的表达，使用引物3&4和微基因2DNA模板，通过PCR合成含天然人BipKozak序列片段的经修饰的Bip信号序列-1-GlcCeraseDNA。如上文所述，从1％(w/v)的琼脂糖制备凝胶上分离～470bp的PCR产物(C)，使用EcoRI和NcoI消化，再次纯化并与NcoI→NotIDNA片段和～5.8kbEcoRI→NotIpEF6’载体DNA片段连接，所述NcoI→NotIDNA片段来自pHD101.4，并编码成熟野生型GlcCerase(缺乏天然GlcCerase信号序列)的氨基酸残基124-497。该DNA构建体被称为pHD204，使用EcoRI和XbaI通过限制性消化对其进行验证，通过DNA测序确定正确的克隆(pHD204.1)，随后使用其评估该经修饰的Bip信号序列对野生型GlcCerase表达和分泌的作用。
本发明中使用的用于制备DNA构建体的引物汇总于表1。
表1
a在天然GlcCeraseKozak保守序列(加下划线的)中的ATG起始密码子以粗体表示。限制性核酸内切酶识别序列以斜体表示。
b终止密码子以粗斜体表示。
c在天然人BipKozak保守序列(加下划线的)中的ATG起始密码子以粗体表示。限制性核酸内切酶识别序列以斜体表示。
d使用5’“P”符号表示磷酸化的引物。
随后将经修饰的Bip信号-1连接到其它蛋白，以评估对它们的表达和分泌的作用。简言之，构建微基因3(表II)，其含有天然人Bip信号序列的前13个残基，后接氨基酸残基4-13的重复和天然Bip信号肽酶识别序列的残基14-17。微基因3含有来自人Bip的天然Kozak序列，以及5’EcoRI和3’StuI和NotI限制性酶切位点。之所以将StuI引入微基因3，是因为该限制性酶在AGG(精氨酸密码子，Arg；R)后产生平头3’末端，所述AGG可以作为天然Bip信号肽酶裂解序列的残基17处的天然Arg。因此，可以将任何蛋白连接至该经修饰的Bip信号序列片段，只要将额外的丙氨酸添加到该蛋白的N末端，以完成天然SAARA(SEQIDNO：24)信号肽酶识别序列。
Bip和经修饰的Bip信号序列的微基因的DNA核苷酸序列汇总于表2。
表2
＊微基因1(天然人Bip-GlcCerase)SEQIDNO：13：
acaagctctccctggtggccgcgatgctgctgctgctcagcgcggcgcgggccgcccgcccctgcatccctaaaagcttcggctacagctcggtggtgtgtgtctgcaatgccacatactgtgactcctttgaccccccgacctttcctgcccttggtaccttcagccgctatgagagtacacgcagtgggcgacggatggagctgagtatggggcccatccaggctaatcacacgggcacaggcctgctactgaccctgcagccagaacagaagttccagaaagtgaagggatttggaggggccatgacagatgctgctgctctcaacatccttgccctgtcaccccctgcccaaaatttgctacttaaatcgtacttctctgaagaaggaatcggatataacatcatccgggtac
微基因2(经修饰的Bip信号序列-1-GlcCerase)SEQIDNO：14：
acaagctctccctggtggccgcgatgctgctgctgctcagcctggtggccgcgatgctgctgctgctcagcgcggcgcgggccgcccgcccctgcatccctaaaagcttcggctacagctcggtggtgtgtgtctgcaatgccacatactgtgactcctttgaccccccgacctttcctgcccttggtaccttcagccgctatgagagtacacgcagtgggcgacggatggagctgagtatggggcccatccaggctaatcacacgggcacaggcctgctactgaccctgcagccagaacagaagttccagaaagtgaagggatttggaggggccatgacagatgctgctgctctcaacatccttgccctgtcaccccctgcccaaaatttgctacttaaatcgtacttctctgaagaaggaatcggatataacatcatccgggtac
微基因3(经修饰的Bip信号序列-1)SEQIDNO：15：
acaagctctccctggtggccgcgatgctgctgctgctcagcctggtggccgcgatgctgctgctgctcagcgcggcg
微基因4(经修饰的Bip信号序列-2)SEQIDNO：16：
gctggaagctctccctggtggccgcgatgctgctgctgctctgggtggcactgctgctgctcagcgcggcg
微基因5(经修饰的Bip信号序列-3)SEQIDNO17：
gctggaagctctccctggtggccgcgatgctgctgctgctctccctggtggccctgctgctgctcagcgcggcg
微基因6(经修饰的Bip信号序列-4)SEQIDNO18：
gctggaagctctccctggtggccgcgatgctgctgctgctcgcactggtggccctgctgctgctcagcgcggcg
*ATG起始密码子以粗体表示，而Kozak保守序列用下划线表示。限制性核酸内切酶识别序列以斜体表示。
为评估酸性α-半乳糖苷酶A(GLA，EC3.2.1.22)，使用引物5&6和GLAcDNA克隆(NM_000169.2，OrigeneTM)模板DNA，通过PCR扩增具有天然信号序列的野生型酶。从琼脂糖制备凝胶上分离该～1.3kb的PCR产物，使用EcoRI和NcoI消化，并连接至EcoRI-NotI消化、去磷酸化的pEF6’。将该DNA构建体称为pHD214，并用于评估GLA的表达。为构建具有经修饰的Bip信号序列-1的GLA，使用引物6&7和GLAcDNA克隆模板DNA，通过PCR合成成熟的GLA酶。如前文所述，使用NotI消化该～1.2kbPCR产物(D)，将其从琼脂糖制备凝胶中分离并连接至EcoRI→StuI微基因3DNA片段和EcoRI→NotI-消化pEF6’载体。该DNA构建体被称为pHD215，用于评估该经修饰的Bip信号序列对野生型GLA表达和分泌的作用。
为评估酸性α-葡萄糖苷酶(GAA，EC3.2.1.0)，使用引物8&9和GAAcDNA克隆(NM_000152.2，Origene)模板DNA通过PCR扩增完整的野生型GAA酶(具有其天然信号序列)。从琼脂糖制备凝胶上分离该～3kb的PCR产物(E)，使用EcoRI和NcoI消化，并连接至EcoRI-NotI消化、去磷酸化的pEF6’。将该DNA构建体称为pHD217并用于评估具有其天然信号序列的GAA的表达。由于使用多个成熟酶之前的前-序列表达GAA(Morelandetal.，2005)，因而合成出具有不同长度的GAA蛋白并连接至经修饰的Bip信号序列-1以供检测。使用引物9&10，通过PCR合成缺乏其天然信号序列但含有残基24-952的GAADNA片段。从琼脂糖制备凝胶上分离该～3kb的PCR产物(F)，使用NcoI消化，并连接至EcoRI→StuI微基因3DNA片段和EcoRI→NotI-消化的pEF6’载体。该DNA构建体含有经修饰的Bip信号序列-1和GAA(24-952)，将其称为pHD218。类似地，使用引物9&11，通过PCR合成缺乏其天然信号序列但含有残基57-952的GAADNA片段。如前文所述，从琼脂糖制备凝胶上分离该～2.9kb的PCR产物(G)，使用NotI消化，并连接至EcoRI→StuI微基因3DNA片段和EcoRI-NotI-消化的pEF6’载体。该DNA构建体含有经修饰的Bip信号序列-1和GAA(57-952)，将其称为pHD219。使用引物9&12，通过PCR合成缺乏其天然信号序列但含有残基78-952的GAADNA片段。从琼脂糖制备凝胶上分离该～2.8kb的PCR产物(H)，使用NotI消化，并连接至EcoRI→StuI微基因3DNA片段和EcoRI→NotI-消化的pEF6’载体。该DNA构建体含有经修饰的Bip信号序列-1和GAA(78-952)，将其称为pHD220。因此，可以使用DNA构建体pHD217-220详细检测该经修饰的Bip信号序列-1及其前-序列对GAA表达和分泌的作用。
设计衍生自经修饰的Bip信号序列-1的其它经修饰的Bip信号序列(表III)，并评估这些额外的修饰能否进一步改善蛋白的表达和分泌。这些修饰包括使用单一的色氨酸残基替代位置14&15的丝氨酸和亮氨酸残基并且删除在疏水性结构域内的位置18&19的丙氨酸和甲硫氨酸残基(称为经修饰的Bip信号序列-2)，删除疏水性结构域内的位置18&19的丙氨酸和甲硫氨酸残基(称为经修饰的Bip信号序列-3)，以及使用丙氨酸替代位置14的丝氨酸残基和删除在疏水性结构域内的位置18&19的丙氨酸和甲硫氨酸残基(称为经修饰的Bip信号序列-4)。这些修饰旨在增加疏水性结构域的疏水性，其可以进一步增强这些信号序列与关键核糖体和ER转位子蛋白之间的相互作用，并形成更有效的信号肽酶裂解位点，以改善重组蛋白的蛋白转位和分泌。
还将对其它待测蛋白包括人胰岛素、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、抗体、干扰素、载脂蛋白等进行评估，以确定这些经修饰的Bip信号序列是否将改善其表达和分泌。
经修饰的Bip信号序列的氨基酸序列汇总于表3。
表3
d天然Bip信号肽酶裂解序列(SAARA)(SEQIDNO：24)以下划线表示。
e在各经修饰的Bip信号序列中，对Bip信号序列的特定修饰以粗体表示。
实施例3
待测蛋白的瞬时表达
对于瞬时转染实验，使用添加了10％FBS的1mlDMEM培养基将HEK293T细胞接种于12-孔组织培养板，在37℃和5％CO2的气体环境下培养。当HEK293T细胞达到70-100％汇合时，将已消耗的培养基更换为1ml新鲜的DMEM/10％FBS培养基，并按照生产厂商提供的方案，使用1μg各待测蛋白的质粒DNA或PBS(假-转染阴性对照)和3μlFugeneTM-HD转染试剂对各孔进行转染。将转染细胞孵育24-72小时，每日通过酶活性检测和/或Western印迹和ELISA对各重组酶的表达(分泌至培养基)进行检测。
实施例4
酶活性检测
使用来自瞬时转染实验24、48或约72小时后的条件培养基和4-甲基伞形酮-β-D-吡喃葡萄糖苷(4-MU-β-Glc)荧光底物，通过酶活性实验对表达和分泌至细胞培养基中的重组人酸性β-葡萄糖脑苷脂酶(GlcCerase)进行评估。简言之，在指定的时间点从各样品中收集20μl条件培养基，在0.5ml微量离心管中使用80μlMcIlvane缓冲液(MI缓冲液：50mM柠檬酸钠/磷酸钠(pH5.2)/0.25％(v/v)TritonX-100/0.25％(w/v)牛黄胆酸钠)对其进行稀释。将25μl各稀释样品加入96孔黑色透明底板的各孔中(三复管)，并使用多道移液器加入50μl6mM的4-MU-β-Glc底物(在MI缓冲液中制备)。然后使用封带将板密封并在37℃孵育1小时。通过加入125μl0.1M的NaOH终止酶反应，在荧光板酶标仪上分别使用355nm激发和460nm发射波长读取释放的4-MU荧光。将假-转染样品的4-MU荧光作为“背景”对照并从所有GlcCerase样品中扣除。
使用来自瞬时转染实验24、48或72小时后的条件培养基和4-甲基伞形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-MU-α-Glc)荧光底物，通过酶活性实验对表达和分泌的重组人酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)进行评估。具体地，在指定的时间点从各样品中收集20μl条件培养基，在0.5ml微量离心管中使用80μl50mM的醋酸盐缓冲液(pH4.0)对其进行稀释。将25μl各稀释样品加入96孔黑色透明底板的各孔中(三复管)，并使用多道移液器加入50μl6mM的4-MU-α-Glc底物(在50mM醋酸盐缓冲液中制备，pH4.0)。然后使用封带将板密封并在37℃孵育1小时。通过加入125μl0.1M的NaOH终止酶反应，在荧光板酶标仪上分别使用355nm激发和460nm发射波长读取释放的4-MU荧光。将假-转染样品的4-MU荧光作为“背景”对照并从所有GAA样品中扣除。
使用来自瞬时转染实验24、48或72小时后的条件培养基和4-甲基伞形酮-α-D-半乳糖苷(4-MU-α-Gal)荧光底物，通过酶活性实验对表达和分泌的重组人酸性α-半乳糖苷酶(GLA)进行评估。具体地，在指定的时间点从各样品中收集20μl条件培养基，在0.5ml微量离心管中使用80μl50mM的柠檬酸钠/磷酸钠缓冲液(pH4.6)对其进行稀释。将25μl各稀释样品加入96孔黑色透明底板的各孔中(三复管)，并使用多道移液器加入50μl8mM的4-MU-α-Gal底物(在50mM柠檬酸钠/磷酸钠缓冲液中制备，pH4.6)。使用封带将板密封并在37℃孵育1小时。通过加入125μl0.1M的NaOH终止酶反应，在荧光板酶标仪上分别使用355nm激发和460nm发射波长读取释放的4-MU荧光。将假-转染样品的4-MU荧光作为“背景”对照并从所有GLA样品中扣除。
实施例5
已知某些蛋白天然表达水平就非常高，而另一些则表达较低。尽管mRNA的丰度和稳定性是转录水平的重要因素，而转录水平又影响蛋白表达，但是越来越明确地认识到信号序列也对蛋白水平起着关键作用并且有助于这种不同蛋白的表达。人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)具有特定特性，其特别有利于开发优越的信号序列以改善重组蛋白的表达和分泌。制备一种经修饰的Bip信号序列并将其与模型蛋白连接，以确定这种非天然的信号序列是否能够改善模型蛋白的蛋白表达和分泌。特别地，延长疏水性的核以形成更长的α-螺旋结构。预计在经修饰的Bip信号序列-1中疏水性结构域的延长具有若干优势。首先，经修饰的(更长的)疏水性结构域将形成更长的α-螺旋并跨越整个核糖体出口通道，这样核糖体蛋白Rpl17可以容易地对其进行识别，以促进其与其它关键ER蛋白如Sec61亚基，和RAMP4更好地发生相互作用。其次，更长的α-螺旋疏水性结构域可以使该经修饰的Bip信号序列能够与关键转位子蛋白如TRAM和Sec61亚基发生相互作用，以辅助新生成的多肽在转位子孔处的有效定位，以促进必要的蛋白转位-感受态循环定位。第三，更长的α-螺旋疏水性结构域可以使该经修饰的Bip信号序列能够更有效地移出水溶性转位子孔，并进入脂质双分子层，这样使其能够以更快的速率被信号肽酶裂解。第四，经修饰的Bip信号序列可以以更快速率离开转位子，以使得重组蛋白在其合成期间能够与其它重要蛋白如寡糖转移酶、ER伴侣蛋白如Bip、蛋白二硫键异构酶和钙联蛋白更早发生相互作用，以改善蛋白的折叠。任何或所有这些潜在的益处会改善蛋白的表达、折叠和输出细胞的速率。
可以进行其它修饰，包括在延长的疏水性结构域的两侧区域添加带电的残基，以进一步增强其疏水性和辅助信号序列在转位子的正确定位。这些修饰旨在增强信号序列与某些核糖体蛋白特别是Rpl17之间的相互作用，其将依次增强与转位子蛋白Sec61β、RAMP4和TRAM的相互作用，以改善蛋白转位、蛋白表达和分泌。
生产编码野生型人GlcCerase的若干不同的DNA构建体，所述构建体含有天然GlcCerase信号序列(WTGlcCerase)或人Bip信号序列(CBP201GlcCerase)或新型经修饰的Bip信号序列-1(CBP204GlcCerase)。通过在～80％汇合的人细胞系(HEK293T)中的瞬时表达实验，对这些构建体(1μg)进行检测。在72-小时时间段内每日一次收集条件细胞培养基(20μl)，并使用4-MU-β-葡萄糖荧光底物检测GlcCerase酶活性以评估信号序列对GlcCerase表达和分泌的作用。如图1所示，这两个信号序列均能够促进GlcCerase表达和分泌至细胞培养基。但是，在转染后72小时，观察到设计的经修饰的Bip信号序列-1(在CBP204GlcCerase中)产生的GlcCerase活性比WTGlcCerase高2倍。在假-转染(空载体)阴性对照中可见基础活性，且已确证是重组GlcCerase的表达引起了酶活性的增加。多次转染实验(n＞3)确证了新型信号序列增加GlcCerase的表达和分泌。
实施例6
蛋白合成受到可获得的营养成分(即，ATP、氨基酸、碳水化合物等)以及其它必需细胞成分(例如，启动和延伸因子、tRNA、蛋白伴侣等)的较大影响。前者能够在再补给过程中通过细胞培养基来增加或补充，后者的成分被限制在细胞内并且不能在蛋白生产过程中补充。这些关键成分的耗竭导致显著的细胞应激，对于大多数蛋白而言，这导致新的蛋白合成减少甚至暂停。有趣的是，在该应激期间，作为自适应细胞应答的一部分，某些蛋白的表达维持且实际上增加，以帮助细胞返回稳态。尚不完全清楚细胞蛋白合成机制是如何区分这些选定的蛋白以使其能够优先表达，但是据信信号序列在这一过程中发挥了重要作用。由于Bip是一种重要的ER伴侣蛋白，其在应激期间保持表达以辅助重新建立细胞稳态，因而我们预计这种经修饰的Bip信号序列将能够在其它蛋白的表达减少或抑制的条件下维持异源重组蛋白的优先表达。为验证这一假设，我们使用WTGlcCerase和CBP204GlcCerase在高细胞密度(～100％融合)的条件下转染HEK293T细胞培养物，并且在63小时时间段内监测其表达和分泌。而且，在实验期间不更换细胞培养基以耗竭营养成分(在实验的末期，以模拟在批处理期间再补给之前的低营养成分期)，以确定WTGlcCerase和CBP204GlcCerase的表达是否随营养成分的耗竭而改变。
我们的结果如图2所示：在这些实验条件下经过63小时时间段以后，含有经修饰的Bip信号序列-1的CBP204GlcCerase的表达要好于含有其天然信号序列的WTGlcCerase。在经过24小时、48小时和63小时后，CBP204GlcCerase的水平分别比WTGlcCerase高1.9倍、2.1倍和2.5倍。当外推至72小时时，CBP204GlcCerase将比WTGlcCerase高3.3倍。重要的是，之后的每天CBP204GlcCerase的表达维持在接近恒定的比率，而其分泌的蛋白加倍。而与之相反的是，在稍后的时间点WTGlcCerase的表达率显著放缓。当比较这两种酶的表达曲线的形状时这种差异是最明显的——CBP204GlcCerase是接近线性的曲线和WTGlcCerase是非线性曲线，因为在稍后的时间点其表达率趋于平缓。这些数据显示CBP204GlcCerase和WTGlcCerase的表达存在差异，其可能与对营养成分耗竭的应答相关，并且随着孵育时间的延长这种差异将进一步增加。由于CBP204GlcCerase和WTGlcCerase之间仅有的差异在于信号序列，因而这些数据支持在非最佳细胞培养条件下经修饰的Bip信号序列-1能够优先表达的假设。
实施例7
为检测经修饰的信号序列-1对不同模型蛋白表达和分泌的作用，构建编码野生型人酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)的DNA质粒，其含有其天然GAA信号序列(WTGAA)或者经设计的Bip信号序列-1和GAA的氨基酸残基24-952(称为CBP218GAA)。在～2天的时间段内通过在HEK293T中的瞬时表达，对这些DNA构建体进行检测以直接比较这些信号序列对野生型GAA表达和分泌的作用。如图3所示，在转染43小时后，CBP218GAA在培养基中分泌的GAA活性比WTGAA高2.5倍。在假-转染(空载体)阴性对照中可见基础活性，且已确证在培养基中所观察到的酶活性是重组GAA表达的结果。由于CBP218GAA和WTGAA之间的差异仅在于信号序列不同，所以这些结果显示在相同的实验条件下经修饰的Bip信号序列-1(在CBP218GAA中)显著增加GAA的表达和分泌。
实施例8
Western印迹和ELISA检测
将通过Western印迹分析对待测蛋白的表达和分泌进行评估。简言之，收集瞬时转染实验24、48或72小时后的条件细胞培养基，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并在随后转移至硝酸纤维素膜。使用含4％(w/v)脱脂奶粉的TRIS-缓冲盐/0.1％(v/v)吐温-20(TBST)在室温下振荡封闭膜1小时。然后使用经4％(w/v)脱脂奶粉TBST适当稀释(例如，1∶5000)的一抗(例如，兔抗-人IGF-2)在室温下振荡孵育膜1小时或4℃过夜。然后在室温下使用TBST振荡洗涤印迹超过1小时，期间需多次更换缓冲液。然后使用经4％(w/v)脱脂奶粉TBST适当稀释(例如，1∶20,000)的酶联二抗(例如，辣根过氧化物酶偶联的山羊抗-兔抗体)在室温下振荡孵育印迹1小时。然后在室温下使用TBST振荡洗涤印迹超过1小时，期间需多次更换缓冲液。然后使用化学发光底物在室温下孵育印迹5min，并通过成像系统或通过胶片成像以评估待测蛋白的表达水平。
类似地，可以通过酶联免疫吸附试验(ELISA)对待测蛋白的表达进行评估。简言之，使用50μl在TRIS-缓冲盐(TBS)中的蛋白浓度为5μg/ml的一抗(例如，兔抗-人IGF-2)包被96-孔免疫吸附板。然后使用200μl含4％(w/v)脱脂奶粉的TBST在室温下将这些板封闭1小时。收集瞬时转染实验后24、48或72小时的条件细胞培养基，并于室温下在这些板中孵育1小时。然后在室温下使用200μlTBST将这些板振荡洗涤超过1小时，期间需多次更换缓冲液。然后使用经TBST适当稀释(例如，1∶20,000)的酶联二抗(例如，辣根过氧化物酶偶联的山羊抗-兔抗体)在室温下孵育这些板1小时。然后在室温下使用TBST洗涤这些板超过1小时，期间需多次更换缓冲液。然后使用显色底物(例如，3，3′，5，5′-四甲基联苯胺，TMB)在室温下孵育这些板5-15min，并使用0.1M硫酸终止反应，在酶标仪上于适当波长下(例如，450nm)读数，以评估待测蛋白的表达。
Claims (31)
1.一种多肽信号序列，所述多肽信号序列由人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段组成，其中所述人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段选自下组：SEQIDNO：20所示的氨基酸序列、SEQIDNO：21所示的氨基酸序列、SEQIDNO：22所示的氨基酸序列和SEQIDNO：23所示的氨基酸序列。
2.一种融合蛋白，所述融合蛋白包括与异源多肽操作性连接的权利要求1的人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段作为多肽信号序列，所述异源多肽选自下组：酸性β-葡萄糖脑苷脂酶、酸性α-半乳糖苷酶、酸性α-葡萄糖苷酶、胰岛素原、胰岛素样生长激素-2(IGF-2)、干扰素、治疗性抗体和胰岛素样生长激素-1(IGF-1)。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白在细胞培养中表达增加。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述细胞培养为在非最佳细胞培养条件下。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述非最佳细胞培养条件为高细胞密度和营养耗竭。
6.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中所述人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段多肽信号序列是SEQIDNO：20所示的氨基酸序列，且所述异源多肽是下述中的一种或多种：酸性β-葡萄糖脑苷脂酶、酸性α-半乳糖苷酶、酸性α-葡萄糖苷酶、胰岛素原、胰岛素样生长激素-2(IGF-2)、干扰素、治疗性抗体和胰岛素样生长激素-1(IGF-1)。
7.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中所述人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段多肽信号序列是SEQIDNO：21所示的氨基酸序列，且所述异源多肽是下述中的一种或多种：酸性β-葡萄糖脑苷脂酶、酸性α-半乳糖苷酶、酸性α-葡萄糖苷酶、胰岛素原、胰岛素样生长激素-2(IGF-2)、干扰素、治疗性抗体或胰岛素样生长激素-1(IGF-1)。
8.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中所述人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段多肽信号序列是SEQIDNO：22所示氨基酸序列，且所述异源多肽是下述中的一种或多种：酸性β-葡萄糖脑苷脂酶、酸性α-半乳糖苷酶、酸性α-葡萄糖苷酶、胰岛素原、胰岛素样生长激素-2(IGF-2)、干扰素、治疗性抗体或胰岛素样生长激素-1(IGF-1)。
9.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中所述人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段多肽信号序列是SEQIDNO：23所示的氨基酸序列，且所述异源多肽是下述中的一种或多种：酸性β-葡萄糖脑苷脂酶、酸性α-半乳糖苷酶、酸性α-葡萄糖苷酶、胰岛素原、胰岛素样生长激素-2(IGF-2)、干扰素、治疗性抗体或胰岛素样生长激素-1(IGF-1)。
10.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述在细胞培养中表达增加是通过在为期3天的时间段内检测酶活性来测定。
11.一种蛋白表达载体，所述载体包括：(a)与第一DNA序列操作性连接的启动子，其中所述第一DNA序列编码权利要求1的人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段作为多肽信号序列，和(b)第二DNA序列，所述第二DNA序列在框架内与所述第一DNA序列融合，其中所述第二DNA序列编码异源多肽，所述异源多肽选自下组：酸性β-葡萄糖脑苷脂酶、酸性α-半乳糖苷酶、酸性α-葡萄糖苷酶、胰岛素原、胰岛素样生长激素-2(IGF-2)、干扰素、治疗性抗体和胰岛素样生长激素-1(IGF-1)。
12.根据权利要求11所述的蛋白表达载体，其中所述第一DNA序列编码人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段多肽信号序列，所述多肽信号序列是SEQIDNO：20所示的氨基酸序列。
13.根据权利要求11所述的蛋白表达载体，其中所述第一DNA序列编码人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段多肽信号序列，所述多肽信号序列是SEQIDNO：21所示的氨基酸序列。
14.根据权利要求11所述的蛋白表达载体，其中所述第一DNA序列编码人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段多肽信号序列，所述多肽信号序列是SEQIDNO：22的氨基酸序列。
15.根据权利要求11所述的蛋白表达载体，其中所述第一DNA序列编码人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段多肽信号序列，所述多肽信号序列是SEQIDNO：23的氨基酸序列。
16.一种生产多肽的方法，所述方法包括：
(a)表达融合蛋白，所述蛋白包括权利要求1的人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段作为多肽信号序列，所述多肽信号序列与异源多肽操作性连接，所述异源多肽选自下组：酸性β-葡萄糖脑苷脂酶、酸性α-半乳糖苷酶、酸性α-葡萄糖苷酶、胰岛素原、胰岛素样生长激素-2(IGF-2)、干扰素、治疗性抗体和胰岛素样生长激素-1(IGF-1)；和
(b)回收所述异源多肽。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述生产在培养的细胞中进行。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述培养的细胞包括酵母细胞。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述培养的细胞包括哺乳动物细胞。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述生产在转基因系统中进行。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述转基因系统包括牛、山羊、绵羊、兔、或其任意组合。
22.根据权利要求21所述的方法，其中回收是从牛奶中回收。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述转基因系统包括鸡。
24.根据权利要求23所述的方法，其中回收是从蛋中回收。
25.一种制备蛋白表达载体的方法，所述方法包括：
(a)将启动子与第一DNA序列操作性连接，所述第一DNA序列编码权利要求1的人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段作为多肽信号序列，和
(b)在框架内将第二DNA序列与所述第一DNA序列融合，其中所述第二DNA序列编码异源多肽，所述异源多肽选自下组：酸性β-葡萄糖脑苷脂酶、酸性α-半乳糖苷酶、酸性α-葡萄糖苷酶、胰岛素原、胰岛素样生长激素-2(IGF-2)、干扰素、治疗性抗体和胰岛素样生长激素-1(IGF-1)。
26.根据权利要求25所述的制备蛋白表达载体的方法，其中所述第一DNA序列编码多肽信号序列，所述多肽信号序列是SEQIDNO：20所示的氨基酸序列。
27.根据权利要求25所述的制备蛋白表达载体的方法，其中所述第一DNA序列编码多肽信号序列，所述多肽信号序列是SEQIDNO：21所示的氨基酸序列。
28.根据权利要求25所述的制备蛋白表达载体的方法，其中所述第一DNA序列编码多肽信号序列，所述多肽信号序列是SEQIDNO：22所示的氨基酸序列。
29.根据权利要求25所述的制备蛋白表达载体的方法，其中所述第一DNA序列编码多肽信号序列，所述多肽信号序列是SEQIDNO：23所示的氨基酸序列。
30.一种增加蛋白表达的方法，所述方法包括：
(a)表达融合蛋白，所述融合蛋白包括权利要求1的人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段和异源蛋白，所述异源蛋白选自下组：酸性β-葡萄糖脑苷脂酶、酸性α-半乳糖苷酶、酸性α-葡萄糖苷酶、胰岛素原、胰岛素样生长激素-2(IGF-2)、干扰素、治疗性抗体和胰岛素样生长激素-1(IGF-1)，和
(b)回收所述异源蛋白。
31.一种增加蛋白分泌的方法，所述方法包括：
(a)表达融合蛋白，所述融合蛋白包括权利要求1的人免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的经修饰的片段和异源蛋白，所述异源蛋白选自下组：酸性β-葡萄糖脑苷脂酶、酸性α-半乳糖苷酶、酸性α-葡萄糖苷酶、胰岛素原、胰岛素样生长激素-2(IGF-2)、干扰素、治疗性抗体和胰岛素样生长激素-1(IGF-1)，和
(b)回收所述异源蛋白。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US41592610P | 2010-11-22 | 2010-11-22 | |
| US61/415,926 | 2010-11-22 | ||
| PCT/US2011/061862 WO2012071422A2 (en) | 2010-11-22 | 2011-11-22 | Novel signal sequences to improve protein expressions and secretion of recombinant enzymes and other proteins |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103328649A CN103328649A (zh) | 2013-09-25 |
| CN103328649B true CN103328649B (zh) | 2016-06-22 |
Family
ID=46146394
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201180065369.5A Active CN103328649B (zh) | 2010-11-22 | 2011-11-22 | 用于改善重组酶及其它蛋白的蛋白表达和分泌的新的信号序列 |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9279007B2 (zh) |
| EP (2) | EP2643468B1 (zh) |
| JP (1) | JP2014503198A (zh) |
| KR (2) | KR101984318B1 (zh) |
| CN (1) | CN103328649B (zh) |
| BR (1) | BR112013012671B1 (zh) |
| CA (1) | CA2818689C (zh) |
| CY (1) | CY1121049T1 (zh) |
| DK (2) | DK2643468T3 (zh) |
| ES (2) | ES2687415T3 (zh) |
| HR (1) | HRP20181315T1 (zh) |
| HU (1) | HUE039070T2 (zh) |
| LT (1) | LT2643468T (zh) |
| PL (1) | PL2643468T3 (zh) |
| PT (1) | PT2643468T (zh) |
| RS (1) | RS57601B1 (zh) |
| SI (1) | SI2643468T1 (zh) |
| WO (1) | WO2012071422A2 (zh) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2763526T3 (es) * | 2014-07-03 | 2020-05-29 | Hoffmann La Roche | Sistemas de expresión de polipéptidos |
| US11446398B2 (en) | 2016-04-11 | 2022-09-20 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Regulated biocircuit systems |
| BR112019025888A2 (pt) | 2017-06-07 | 2020-06-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | polinucleotídeo que codifica uma proteína terapêutica multidomínio, vetor de terapia gênica, proteína terapêutica multidomínio recombinante, método de expressão, métodos para reduzir o acúmulo de glicogênio em um tecido em um paciente em necessidade, para reduzir o acúmulo de glicogênio em um tecido em um paciente em necessidade epara tratar a deficiência enzimática em um paciente em necessidade e/ou tolerar o paciente à enzima para a qual é deficiente, anticorpo anti-cd63 ou fragmento de ligação a antígeno, e, composição farmacêutica |
| JP2021505135A (ja) * | 2017-11-30 | 2021-02-18 | アミカス セラピューティックス インコーポレイテッド | Ｃｄｋｌ５発現変異体及びｃｄｋｌ５融合タンパク質 |
| BR112020021962A2 (pt) | 2018-04-30 | 2021-01-26 | Amicus Therapeutics, Inc. | construtos para terapia gênica e métodos de uso |
| US20220403001A1 (en) | 2018-06-12 | 2022-12-22 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy |
| CA3115944A1 (en) | 2018-10-10 | 2020-04-16 | Amicus Therapeutics, Inc. | Disulfide bond stabilized polypeptide compositions and methods of use |
| US20210386788A1 (en) | 2018-10-24 | 2021-12-16 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Er tunable protein regulation |
| CN113454227A (zh) * | 2018-12-19 | 2021-09-28 | 维萨梅布有限公司 | 编码蛋白质的rna |
| CA3132840A1 (en) | 2019-03-08 | 2020-09-17 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Human carbonic anhydrase 2 compositions and methods for tunable regulation |
| US20220267398A1 (en) | 2019-06-12 | 2022-08-25 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Ca2 compositions and methods for tunable regulation |
| AU2020290522A1 (en) | 2019-06-12 | 2022-01-20 | Obsidian Therapeutics, Inc. | CA2 compositions and methods for tunable regulation |
| WO2021046451A1 (en) | 2019-09-06 | 2021-03-11 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for dhfr tunable protein regulation |
| CN112342247B (zh) * | 2020-11-10 | 2022-03-11 | 江苏科技大学 | 一种提高家蚕细胞表达外源蛋白分泌率的方法 |
| US20230414785A1 (en) | 2020-12-01 | 2023-12-28 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and uses thereof for treatment of angelman syndrome |
| WO2023086939A1 (en) | 2021-11-12 | 2023-05-19 | Amicus Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for treating mucopolysaccharidosis iiia |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2352286C (en) * | 1998-11-24 | 2011-07-12 | Bristol-Myers Squibb Company | Intracellular targeted delivery of compounds by 70 kd heat shock protein |
| EP1689766B1 (en) * | 2003-11-06 | 2012-04-25 | Danisco US Inc. | Expression in filamentous fungi of protease inhibitors and variants thereof |
| EP2007885B1 (en) * | 2006-04-11 | 2010-07-21 | CSL Behring GmbH | Method of increasing the in vivo recovery of therapeutic polypeptides |
-
2011
- 2011-11-22 PL PL11843849T patent/PL2643468T3/pl unknown
- 2011-11-22 SI SI201131554T patent/SI2643468T1/sl unknown
- 2011-11-22 RS RS20180986A patent/RS57601B1/sr unknown
- 2011-11-22 EP EP11843849.8A patent/EP2643468B1/en active Active
- 2011-11-22 ES ES11843849.8T patent/ES2687415T3/es active Active
- 2011-11-22 CN CN201180065369.5A patent/CN103328649B/zh active Active
- 2011-11-22 EP EP18181451.8A patent/EP3461905B1/en active Active
- 2011-11-22 LT LTEP11843849.8T patent/LT2643468T/lt unknown
- 2011-11-22 DK DK11843849.8T patent/DK2643468T3/en active
- 2011-11-22 BR BR112013012671-0A patent/BR112013012671B1/pt active IP Right Grant
- 2011-11-22 CA CA2818689A patent/CA2818689C/en active Active
- 2011-11-22 ES ES18181451T patent/ES2829199T3/es active Active
- 2011-11-22 KR KR1020137016110A patent/KR101984318B1/ko active IP Right Grant
- 2011-11-22 PT PT11843849T patent/PT2643468T/pt unknown
- 2011-11-22 WO PCT/US2011/061862 patent/WO2012071422A2/en active Application Filing
- 2011-11-22 JP JP2013541026A patent/JP2014503198A/ja not_active Withdrawn
- 2011-11-22 KR KR1020197015057A patent/KR20190060888A/ko not_active IP Right Cessation
- 2011-11-22 HU HUE11843849A patent/HUE039070T2/hu unknown
- 2011-11-22 DK DK18181451.8T patent/DK3461905T3/da active
- 2011-11-22 US US13/988,946 patent/US9279007B2/en active Active
-
2018
- 2018-08-14 HR HRP20181315TT patent/HRP20181315T1/hr unknown
- 2018-09-12 CY CY181100941T patent/CY1121049T1/el unknown
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Aspirin and salicylate bind to immunoglobulin heavy chain binding protein (Bip) and inhibits its ATPase activity in human fibroblasts;Deng 等;《FASEB J》;20011130;第15卷(第13期);第2463-2470页 * |
| Targeting to the endoplasmic reticulum improves the folding of recombinant human telomerase reverse transcriptase;Wu等;《Protein Expr.purif》;20071130;第56卷(第1期);第8-19页 * |
| 分子伴侣与MHC分子;吴涓涓;《国外医学(免疫学分册)》;20041105;第27卷(第6期);第358-361页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK3461905T3 (da) | 2020-11-02 |
| SI2643468T1 (sl) | 2018-10-30 |
| KR20130121878A (ko) | 2013-11-06 |
| RS57601B1 (sr) | 2018-11-30 |
| CA2818689A1 (en) | 2012-05-31 |
| CA2818689C (en) | 2021-09-21 |
| PL2643468T3 (pl) | 2018-11-30 |
| CY1121049T1 (el) | 2019-12-11 |
| EP2643468A2 (en) | 2013-10-02 |
| BR112013012671B1 (pt) | 2022-03-03 |
| CN103328649A (zh) | 2013-09-25 |
| LT2643468T (lt) | 2018-09-10 |
| HRP20181315T1 (hr) | 2018-10-19 |
| ES2829199T3 (es) | 2021-05-31 |
| BR112013012671A2 (pt) | 2016-10-11 |
| WO2012071422A3 (en) | 2012-08-02 |
| US20140045216A1 (en) | 2014-02-13 |
| HUE039070T2 (hu) | 2018-12-28 |
| EP3461905A1 (en) | 2019-04-03 |
| EP2643468A4 (en) | 2014-12-24 |
| KR20190060888A (ko) | 2019-06-03 |
| ES2687415T3 (es) | 2018-10-25 |
| JP2014503198A (ja) | 2014-02-13 |
| EP2643468B1 (en) | 2018-07-04 |
| US9279007B2 (en) | 2016-03-08 |
| EP3461905B1 (en) | 2020-08-05 |
| PT2643468T (pt) | 2018-10-11 |
| KR101984318B1 (ko) | 2019-05-31 |
| DK2643468T3 (en) | 2018-09-24 |
| WO2012071422A2 (en) | 2012-05-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103328649B (zh) | 用于改善重组酶及其它蛋白的蛋白表达和分泌的新的信号序列 | |
| CA2568788A1 (en) | Production of polypeptides by improved secretion | |
| BR112014004830B1 (pt) | Célula de levedura geneticamente modificada, seu uso e método para produzir uma proteína ou polipeptídio recombinante de interesse | |
| CN111542615B (zh) | 蛋白质的制造方法 | |
| CA2589164A1 (en) | Production of proteins | |
| CN107810271B (zh) | 用于在植物细胞中生产具有改变的糖基化模式的多肽的组合物和方法 | |
| KR20190002363A (ko) | 콜라겐을 생산하기 위한 효모 균주 및 방법 | |
| CN113423836A (zh) | 重组宿主细胞中碳源调节的蛋白的产生 | |
| KR20210032972A (ko) | 전사인자를 사용하여 단백질 발현을 증가시키는 수단 및 방법 | |
| Bae et al. | A novel fusion partner for enhanced secretion of recombinant proteins in Saccharomyces cerevisiae | |
| CN107779474A (zh) | 一个表达乳头瘤病毒hpv16的e6和e7自剪切慢病毒载体 | |
| CN110760541A (zh) | 用中国仓鼠卵巢细胞表达外源蛋白时信号肽的选择方法及应用 | |
| Koller et al. | Recombinant Streptomyces lividans secretes a fusion protein of tendamistat and proinsulin | |
| US20130244265A1 (en) | Secretion of recombinant polypeptides in the extracellular medium of diatoms | |
| CN106029688A (zh) | 交配因子α原肽变体 | |
| Matsui et al. | High-efficiency secretory production of peroxidase C1a using vesicular transport engineering in transgenic tobacco | |
| Eskridge et al. | The NH2 terminus of preproinsulin directs the translocation and glycosylation of a bacterial cytoplasmic protein by mammalian microsomal membranes. | |
| US20210230608A1 (en) | Gycomodule motifs and uses thereof | |
| Lei Lei et al. | Prokaryotic expression of mouse Sox2 gene and preparation of its polyclonal antibody. | |
| CN114026239A (zh) | Mut-甲醇营养型酵母 | |
| CN117867007A (zh) | 一种合成人源乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母的构建方法与应用 | |
| CN115029404A (zh) | 用于lpp单基因敲除或突变的大肠杆菌高效分泌表达短肽类蛋白的发酵培养基及应用 | |
| CN117604037A (zh) | 一种利用家蚕生产重组索马甜蛋白的方法 | |
| CN116083475A (zh) | 一种在毕赤酵母中表达人igf-1或其类似物lr3 igf-1的方法 | |
| CN107723290A (zh) | 一种重组人卵细胞透明带zp3蛋白及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: new jersey Applicant after: Amicus Therapeutics Inc. Address before: American Pennsylvania Applicant before: Callidus Biopharma Inc |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: CALLIDUS BIOPHARMA INC. TO: AMICUS THERAPEUTICS INC. |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |