ES2687415T3 - Nuevas secuencias señal para mejorar las expresiones de proteínas y la secreción de enzimas recombinantes y de otras proteínas - Google Patents

Nuevas secuencias señal para mejorar las expresiones de proteínas y la secreción de enzimas recombinantes y de otras proteínas Download PDF

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Abstract

Una secuencia señal polipeptídica, que comprende un fragmento modificado de una proteína de unión a cadena pesada de inmunoglobulina humana (Bip), en la que el fragmento modificado de proteína de unión a cadena pesada de inmunoglobulina humana (Bip) consiste en la secuencia de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23.

Description

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DESCRIPCION
Nuevas secuencias senal para mejorar las expresiones de protemas y la secrecion de enzimas recombinantes y de otras protemas
REFERENCIA CRUZADA DE SOLICITUDES RELACIONADAS
Se reivindica la prioridad para la Solicitud de Patente U.S. provisional n° 61/415.926, presentada el 22 de noviembre de 2010, que se incorpora aqu como referencia y en su totalidad.
CAMPO TECNICO
La expresion y secrecion de enzimas recombinantes y de otras protemas para usos terapeuticos y otros usos. ANTECEDENTES
En eucariotas, la smtesis de protemas para casi todas las protemas comienza en el citoplasma via complejos megaprotemicos denominados ribosomas. Diversas protemas completan su smtesis y se pliegan en el citoplasma, y permanecen allf, donde funcionan. Sin embargo, muchas otras son exportadas fuera del citoplasma y al retmulo endoplasmatico (RE), donde adquieren las modificaciones post-traduccionales necesarias (por ejemplo, enlaces de disulfuro, glicosilacion, etc.) para lograr su estructura proteica apropiada y actividad biologica antes de exportarlas a sus localizaciones celulares pretendidas (por ejemplo, protemas de Golgi, peroxisomicas y lisosomicas) o a la superficie celular (por ejemplo, receptores, canales de iones, etc.), o ser segregadas fuera de las celulas (por ejemplo, anticuerpos, factores de coagulacion, hormonas, etc.). Las protemas destinadas a exportarlas fuera del citoplasma se distinguen de las protemas citoplasmicas por un elemento proteico especializado en el termino amino (N-) denominado la secuencia senal.
Las secuencias senal (tambien denominadas peptidos senal) no tienen ninguna secuencia de aminoacidos de consenso o longitud, pero tfpicamente comprenden los 15-40 restos iniciales en el termino N con 7-20 restos de aminoacidos hidrofobos contiguos que forman una estructura secundaria a-helicoidal que a menudo esta flanqueada por restos cargados. Las secuencias senal se identifican en el citoplasma por un complejo de protema:ARN de multiples subunidades especializado, denominado la partmula de reconocimiento de senal (SRP), que dirige estas protemas nacientes hacia poros especializados dentro de la membrana del RE, denominados translocones, en los que estas protemas son transportadas a traves de la membrana del RE a la luz del RE - un proceso conocido como translocacion proteica.
La translocacion proteica se produce concurrentemente durante la smtesis de protemas (es decir, cotraduccionalmente) en mairnferos, mientras que en otras eucariotas (por ejemplo, levadura) este proceso puede ser co- o post-traduccional. La translocacion proteica mediada por secuencias senal se utiliza tambien en bacterias para dirigir protemas fuera del citoplasma y al periplasma. En mamnferos, las secuencias senal se identifican mediante sRp a medida que emergen de ribosomas que pausan temporalmente la traduccion de protemas para permitir dirigir todo el complejo de SRP-protema naciente-ribosoma hacia translocones via el receptor de SRP asociado. La smtesis proteica se reanuda despues de que se libera la SRP y el complejo de ribosoma-protema naciente esta apropiadamente alojado en el translocon.
La mayona de los tratamientos enzimaticos y otros tratamientos proteicos se producen mediante tecnologfa recombinante que se disena para segregar estas protemas recombinantes fuera de las celulas y en el cultivo celular para simplificar la purificacion aguas abajo. Estas enzimas y otras protemas recombinantes deben utilizar por lo tanto secuencias senal y esta misma ruta celular para la secrecion. La produccion a alto nivel de estas protemas requiere por lo tanto secuencias senal que pueden mediar la seleccion eficiente del RE y la translocacion proteica a traves de la membrana del RE. Sin embargo, las secuencias senal no son equivalentes para facilitar la seleccion del RE y la translocacion. Se cree que la identificacion de secuencias senal mediante SRP se produce rapida y eficientemente, pero las etapas subsiguientes de seleccion del RE y translocacion son muy dispares entre protemas. Debido a que las secuencias senal son reconocidas dos veces, primero por SRP para dirigir el complejo de protema naciente-ribosoma hacia el RE, y subsiguientemente mediante protemas translocones (es decir, protemas Sec61) y otras protemas del RE asociadas a translocones, para iniciar la translocacion, ambos son sitios potenciales para la regulacion. Se ha mostrado que esta ultima etapa es mucho mas restrictiva y menos eficiente, y de este modo, es un cuello de botella importante en este proceso. Sorprendentemente, la mayona de secuencias senal son intrmsecamente ineficientes para facilitar la translocacion proteica. Consiguientemente, muchos complejos de protema naciente-ribosoma dirigidos al RE se disocian de la membrana del RE y la smtesis proteica se aborta, reduciendo de ese modo su expresion y secrecion de protemas.
SUMARIO
La presente invencion proporciona una secuencia senal polipeptfdica, que comprende un fragmento modificado de protema de union a cadena pesada de inmunoglobulina humana (Bip), en la que el fragmento modificado de protema de union a cadena pesada de inmunoglobulina humana (Bip) consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 20; la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 21; la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 22; o la
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secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 23.
La presente invencion tambien proporciona una protema de fusion que comprende esta secuencia senal polipeptidica operablemente enlazada a un polipeptido heterologo.
El polipeptido heterologo puede comprender una o mas enzimas, uno o mas modificadores de la respuesta biologica, una o mas toxinas, uno o mas anticuerpos, uno o mas fragmentos del polipeptido heterologo, o cualquier combinacion de los mismos.
El polipeptido heterologo puede comprender uno o mas de los siguientes: p-glucocerebrosidasa acida, a-glucosidasa acida, proinsulina, hormona 2 del crecimiento similar a insulina (IGF-2), interferon, anticuerpo terapeutico, y una hormona 1 del crecimiento similar a insulina (IGF-1).
La presente invencion tambien proporciona vector de expresion de protemas, que comprende: (a) un promotor enlazado operablemente a una primera secuencia de ADN, en el que dicha primera secuencia de ADN codifica la secuencia senal polipeptfdica, y (b) una segunda secuencia de ADN que esta fusionada en el marco a dicha primera secuencia de ADN, en el que dicha segunda secuencia de ADN codifica un polipeptido heterologo.
La segunda secuencia de ADN puede codificar p-glucocerebrosidasa acida, a-glucosidasa acida, proinsulina, hormona 2 del crecimiento similar a insulina (IGF-2), interferon, anticuerpo terapeutico, o una hormona 1 del crecimiento similar a insulina (IGF-1).
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
Los aspectos anteriores y otros aspectos de la presente invencion son manifiestos a partir de la siguiente descripcion detallada de la invencion cuando se considera junto con los dibujos que se acompanan. Con el fin de ilustrar la invencion, se muestran en los dibujos realizaciones que se prefieren actualmente, entendiendose, sin embargo, que la invencion no esta limitada a los instrumentos espedficos descritos. Los dibujos no estan dibujados necesariamente a escala. En los dibujos:
La Figura 1 muestra el efecto funcional de secuencia senal para la expresion y secrecion de p- glucocerebrosidasa acida humana de tipo salvaje recombinante a lo largo de un penodo de alrededor de 72 horas.
La Figura 2 muestra la expresion y secrecion preferente de p-glucocerebrosidasa acida humana de tipo salvaje recombinante a lo largo de un penodo de alrededor de 63 horas a una densidad celular elevada y sin nutrientes.
La Figura 3 muestra el efecto funcional de secuencias senal para la expresion y secrecion de a-glucosidasa acida humana de tipo salvaje recombinante a lo largo de un penodo de alrededor de 43 horas.
DESCRIPCION DETALLADA DE REALIZACIONES ILUSTRATIVAS
Como se usa aqrn, un “polipeptido heterologo” es cualquier polipeptido que no es un fragmento modificado de protema de union a cadena pesada de inmunoglobulina humana (Bip).
Como se usa aqrn, “Bip” es una abreviatura para protema de union de cadena pesada de inmunoglobulina.
Las secuencias senal polipeptfdicas adecuadas comprenden un fragmento modificado de protema de union a cadena pesada de inmunoglobulina humana (Bip), que consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, o SEQ ID NO: 23.
Las protemas de fusion adecuadas comprenden un fragmento modificado de protema de union a cadena pesada de inmunoglobulina humana (Bip) operablemente enlazado a un polipeptido heterologo. El fragmento modificado de protema de union a cadena pesada de inmunoglobulina humana (Bip) consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 20, SEQ ID nO: 21, SEQ ID NO: 22, o SEQ ID NO: 23. Todas estas protemas de fusion se pueden caracterizar por tener una mayor expresion en cultivo celular. Los cultivos celulares tambien pueden ser en condiciones de cultivo celular no optimas. Las condiciones no optimas de cultivo celular pueden ser densidad celular elevada y sin nutrientes. El polipeptido heterologo puede ser una o mas enzimas, uno o mas modificadores de la respuesta biologica, una o mas toxinas, uno o mas anticuerpos, uno o mas fragmentos del polipeptido heterologo, o cualquier combinacion de los mismos. El polipeptido heterologo puede ser p-glucocerebrosidasa acida. El polipeptido heterologo puede ser tambien a-galactosidasa acida. El polipeptido heterologo puede ser tambien a- glucosidasa acida. El polipeptido heterologo puede ser tambien proinsulina. El polipeptido heterologo puede ser tambien la hormona 2 del crecimiento similar a insulina (IGF-2). El polipeptido heterologo puede ser tambien interferon. El polipeptido heterologo puede ser tambien un anticuerpo terapeutico. El polipeptido heterologo puede ser tambien la hormona 1 del crecimiento similar a insulina (IGF-1).
Otras protemas de fusion adecuadas con el fragmento modificado de protema de union a cadena pesada de
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inmunoglobulina humana (Bip) pueden comprender la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, o SEQ ID NO: 23, y el polipeptido heterologo puede comprender p-glucocerebrosidasa. Esas protemas de fusion se pueden caracterizar por tener una mayor expresion en cultivo celular en comparacion con p- glucocerebrosidasa de tipo salvaje (p-glucocerebrosidasa con la secuencia senal de p-glucocerebrosidasa nativa). La mayor expresion en cultivo celular se puede medir evaluando la actividad de p-glucocerebrosidasa a lo largo de un penodo de alrededor de 3 dfas. El cultivo celular tambien puede ser en condiciones no optimas de cultivo celular. Las condiciones no optimas de cultivo celular pueden ser densidad celular elevada y sin nutrientes. La mayor expresion en cultivo celular con densidad celular elevada y sin nutrientes se puede medir evaluando la actividad de p-glucocerebrosidasa a lo largo de alrededor de un penodo de 3 dfas.
En otras protemas de fusion adecuadas con el fragmento modificado de protema de union a cadena pesada de inmunoglobulina humana (Bip) que consisten en la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, o SEQ ID NO: 23, el polipeptido heterologo puede comprender a-galactosidasa. Esas protemas de fusion se pueden caracterizar por tener una mayor expresion en cultivo celular en comparacion con a-galactosidasa de tipo salvaje (a-galactosidasa con la secuencia senal de a-galactosidasa nativa). La mayor expresion en cultivo celular se puede medir evaluando la actividad de a-galactosidasa a lo largo de un penodo de alrededor de 3 dfas. El cultivo celular tambien puede ser en condiciones no optimas de cultivo celular. Las condiciones no optimas de cultivo celular pueden ser densidad celular elevada y sin nutrientes. La mayor expresion en cultivo celular con densidad celular elevada y sin nutrientes se puede medir evaluando la actividad de a-galactosidasa a lo largo de alrededor de un penodo de 3 dfas.
En otras protemas de fusion adecuadas con el fragmento modificado de protema de union a cadena pesada de inmunoglobulina humana (Bip) que consisten en la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, o SEQ ID NO: 23, el polipeptido heterologo puede comprender a-glucosidasa acida. Esas protemas de fusion se pueden caracterizar por tener una mayor expresion en cultivo celular en comparacion con a-glucosidasa acida de tipo salvaje (a-glucosidasa acida con la secuencia senal de a-glucosidasa acida nativa). La mayor expresion en cultivo celular se puede medir evaluando la actividad de a-glucosidasa acida a lo largo de un penodo de alrededor de 3 dfas. El cultivo celular tambien puede ser en condiciones no optimas de cultivo celular. Las condiciones no optimas de cultivo celular pueden ser densidad celular elevada y sin nutrientes. La mayor expresion en cultivo celular con densidad celular elevada y sin nutrientes se puede medir evaluando la actividad de a- glucosidasa acida a lo largo de alrededor de un penodo de 3 dfas.
En otras protemas de fusion adecuadas con el fragmento modificado de protema de union a cadena pesada de inmunoglobulina humana (Bip) que consisten en la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, o SEQ ID NO: 23, el polipeptido heterologo puede comprender proinsulina. Esas protemas de fusion se pueden caracterizar por tener una mayor expresion en cultivo celular en comparacion con proinsulina de tipo salvaje (proinsulina con la secuencia senal de proinsulina nativa). La mayor expresion en cultivo celular se puede medir evaluando la actividad de proinsulina a lo largo de un penodo de alrededor de 3 dfas. El cultivo celular tambien puede ser en condiciones no optimas de cultivo celular. Las condiciones no optimas de cultivo celular pueden ser densidad celular elevada y sin nutrientes. La mayor expresion en cultivo celular con densidad celular elevada y sin nutrientes se puede medir evaluando la actividad de proinsulina a lo largo de alrededor de un penodo de 3 dfas.
En otras protemas de fusion adecuadas con el fragmento modificado de protema de union a cadena pesada de inmunoglobulina humana (Bip) que consisten en la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, o SEQ ID NO: 23, el polipeptido heterologo puede comprender la hormona 2 del crecimiento similar a insulina (IGF-2). Esas protemas de fusion se pueden caracterizar por tener una mayor expresion en cultivo celular en comparacion con la hormona 2 del crecimiento similar a insulina (IGF-2) de tipo salvaje (la hormona 2 del crecimiento similar a insulina (IGF-2) con la secuencia senal de la hormona 2 del crecimiento similar a insulina (IGF- 2) nativa). La mayor expresion en cultivo celular se puede medir evaluando la actividad de la hormona 2 del crecimiento similar a insulina (IGF-2) a lo largo de un penodo de alrededor de 3 dfas. El cultivo celular tambien puede ser en condiciones no optimas de cultivo celular. Las condiciones no optimas de cultivo celular pueden ser densidad celular elevada y sin nutrientes. La mayor expresion en cultivo celular con densidad celular elevada y sin nutrientes se puede medir evaluando la actividad de la hormona 2 del crecimiento similar a insulina (IGF-2) a lo largo de alrededor de un penodo de 3 dfas.
En otras protemas de fusion adecuadas con el fragmento modificado de protema de union a cadena pesada de inmunoglobulina humana (Bip) que consisten en la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, o SEQ ID NO: 23, el polipeptido heterologo puede comprender interferon. Esas protemas de fusion se pueden caracterizar por tener una mayor expresion en cultivo celular en comparacion con interferon de tipo salvaje (interferon con la secuencia senal de interferon nativa). La mayor expresion en cultivo celular se puede medir evaluando la actividad de interferon a lo largo de un penodo de alrededor de 3 dfas. El cultivo celular tambien puede ser en condiciones no optimas de cultivo celular. Las condiciones no optimas de cultivo celular pueden ser densidad celular elevada y sin nutrientes. La mayor expresion en cultivo celular con densidad celular elevada y sin nutrientes se puede medir evaluando la actividad de interferon a lo largo de alrededor de un penodo de 3 dfas.
En otras protemas de fusion adecuadas con el fragmento modificado de protema de union a cadena pesada de
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inmunoglobulina humana (Bip) que consisten en la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, o SEQ ID NO: 23, el polipeptido heterologo puede comprender un anticuerpo terapeutico. Esas protemas de fusion se pueden caracterizar por tener una mayor expresion en cultivo celular en comparacion con un anticuerpo terapeutico de tipo salvaje (un anticuerpo terapeutico con la secuencia senal de un anticuerpo terapeutico nativa). La mayor expresion en cultivo celular se puede medir evaluando la actividad de un anticuerpo terapeutico a lo largo de un penodo de alrededor de 3 dfas. El cultivo celular tambien puede ser en condiciones no optimas de cultivo celular. Las condiciones no optimas de cultivo celular pueden ser densidad celular elevada y sin nutrientes. La mayor expresion en cultivo celular con densidad celular elevada y sin nutrientes se puede medir evaluando la actividad del anticuerpo terapeutico a lo largo de alrededor de un penodo de 3 dfas.
En otras protemas de fusion adecuadas con el fragmento modificado de protema de union a cadena pesada de inmunoglobulina humana (Bip) que consisten en la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, o SEQ ID NO: 23, el polipeptido heterologo puede comprender hormona 1 del crecimiento similar a insulina (IGF-1). Esas protemas de fusion se pueden caracterizar por tener una mayor expresion en cultivo celular en comparacion con hormona 1 del crecimiento similar a insulina (IGF-1) de tipo salvaje (hormona 1 del crecimiento similar a insulina (IGF-1) con la secuencia senal de hormona 1 del crecimiento similar a insulina (IGF-1) nativa). La mayor expresion en cultivo celular se puede medir evaluando la actividad de hormona 1 del crecimiento similar a insulina (IGF-1) a lo largo de un penodo de alrededor de 3 dfas. El cultivo celular tambien puede ser en condiciones no optimas de cultivo celular. Las condiciones no optimas de cultivo celular pueden ser densidad celular elevada y sin nutrientes. La mayor expresion en cultivo celular con densidad celular elevada y sin nutrientes se puede medir evaluando la actividad de hormona 1 del crecimiento similar a insulina (IGF-1) a lo largo de alrededor de un penodo de 3 dfas.
Un vector de expresion proteica adecuado puede comprender un promotor enlazado operablemente a una primera secuencia de ADN que codifica una secuencia senal polipeptfdica, que comprende un fragmento modificado de protema de union a cadena pesada de inmunoglobulina humana (Bip) que consiste en la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, o SEQ ID NO: 23, y una segunda secuencia de ADN que codifica un polipeptido heterologo, que esta fusionada en el marco a la primera secuencia de ADN. La segunda secuencia de ADN puede codificar p-glucocerebrosidasa.
Un vector de expresion proteica adecuado puede comprender un promotor enlazado operablemente a una primera secuencia de ADN que codifica una secuencia senal polipeptfdica, que comprende un fragmento modificado de protema de union a cadena pesada de inmunoglobulina humana (Bip) que consiste en la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, o SEQ ID NO: 23, y una segunda secuencia de ADN que codifica un polipeptido heterologo, que esta fusionada en el marco a la primera secuencia de ADN. La segunda secuencia de ADN puede codificar a-glucosidasa acida.
Un vector de expresion proteica adecuado puede comprender un promotor enlazado operablemente a una primera secuencia de ADN que codifica una secuencia senal polipeptfdica, que comprende un fragmento modificado de protema de union a cadena pesada de inmunoglobulina humana (Bip) que consiste en la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, o SEQ ID NO: 23, y una segunda secuencia de ADN que codifica un polipeptido heterologo, que esta fusionada en el marco a la primera secuencia de ADN. La segunda secuencia de ADN puede codificar a-galactosidasa acida. El polipeptido heterologo tambien puede ser proinsulina. El polipeptido heterologo tambien puede ser hormona 2 del crecimiento similar a insulina (IGF-2) u hormona 1 del crecimiento similar a insulina (IGF-1). El polipeptido heterologo tambien puede ser interferon. El polipeptido heterologo puede ser tambien un anticuerpo terapeutico. El polipeptido heterologo tambien puede ser cualquier otra protema que se segregue fuera de celulas.
Un metodo adecuado para producir un polipeptido puede comprender expresar una protema de fusion con el fragmento modificado de la protema de union a cadena pesada de inmunoglobulina humana (Bip) enlazada operablemente a un polipeptido heterologo, y recuperar dicho polipeptido heterologo. El metodo para producir un polipeptido se puede llevar a cabo en celulas cultivadas. Las celulas cultivadas pueden ser celulas de levadura o celulas de mamffero. El metodo para producir un polipeptido se puede llevar a cabo en un sistema transgenico. Ese sistema transgenico puede comprender vacas, cabras, ovejas, conejos, o cualquier combinacion de los mismos. La recuperacion desde el sistema transgenico puede ser desde la leche. El sistema transgenico tambien puede comprender pollos. La recuperacion desde el sistema transgenico puede ser a partir de huevos.
Un metodo adecuado para obtener un vector de expresion proteica puede comprender enlazar operablemente un promotor a una primera secuencia de ADN que codifica una secuencia senal polipeptfdica que comprende un fragmento modificado de la protema de union a cadena pesada de inmunoglobulina humana (Bip), y fusionar en el marco una segunda secuencia de ADN que codifica un polipeptido heterologo a la primera secuencia de ADN. El metodo para obtener un vector de expresion proteica tambien puede tener una primera secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, o SEQ ID NO: 23. El metodo para obtener un vector de expresion proteica tambien puede tener una segunda secuencia ADN que codifica p- glucocerebrosidasa acida, a-galactosidasa acida, a-glucosidasa acida, proinsulina, hormona 2 del crecimiento similar a insulina (IGF-2), interferon, anticuerpo terapeutico, o una hormona 1 del crecimiento similar a insulina (IGF- 1), u otras protemas que son segregadas fuera de celulas.
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Un metodo adecuado para incrementar la expresion proteica puede comprender expresar una protema de fusion que comprende un fragmento modificado de una protema de union a cadena pesada de inmunoglobulina humana (Bip) y una protema heterologa, y recuperar la protema heterologa.
Un metodo adecuado para incrementar la secrecion proteica puede comprender expresar una protema de fusion que comprende un fragmento modificado de la protema de union a cadena pesada de inmunoglobulina humana (Bip) y una protema heterologa, y recuperar la protema heterologa.
EJEMPLO 1
Reactivos
El ADNc de p-glucocerebrosidasa (“GlcCerasa”) humana de tipo salvaje (NM_000157.3), el ADNc de a- galactosidasa A acida (GLA) humana de tipo salvaje (NM_000169.2), el ADNc de a-glucosidasa acida (GAA) humana de tipo salvaje (NM_000152.2), y el ADNc del factor 2 de crecimiento similar a insulina (IGF-2) humano de tipo salvaje (NM_000612.4) se adquirieron todos ellos de Origene™ (Rockville, MD), mientras que todos los cebadores oligonucleotfdicos y minigenes sinteticos procedieron de Integrated DNA Technologies™ (IDT™; Coralville, IA). El vector de expresion de mairnferos pEF6/V5-HisA, el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), el suero fetal bovino (FBS), y otros reactivos de cultivo tisular se obtuvieron de Invitrogen™ (Carlsbad, CA). Las endonucleasas de restriccion, Phusion-HF DNA polymerase™, T4 ADN ligasa, fosfatasa antartica, E. coli qmmicamente competente (celulas DH5a) se adquirieron todas ellas de New England Biolabs™ (Ipswich, MA). Los sustratos fluorogenicos para diversas glicosidasas se adquirieron de Research Products International™ (Mt. Prospect, IL), los kits de extraccion en gel de ADN y de ADN Miniprep procedieron de QIAGEN™ (Valencia, CA), el kit PureYield Maxiprep DNA™ procedio de Promega™ (Madison, WI). Excepto que se senale de otro modo, todas las sustancias qmmicas procedieron de Sigma™ (St. Louis, MO), el reactivo de transfeccion Fugene-HD™ procedio de Roche™ (Indianapolis, IN), las celulas de rinon embrionario humano transformadas con el anrtgeno T (HEK293T) procedieron de ATcC™.
EJEMPLO 2
Construccion del plasmido
Se construyeron plasmidos de ADN para codificar diversas protemas modelo que contienen sus secuencias senal nativas o que se reemplazaron por secuencias senal de Bip humana modificadas, para evaluar el efecto de estas secuencias senal sobre la expresion y secrecion de protemas de ensayo.
Para evaluar p-glucocerebrosidasa acida humana (GlcCerasa, EC 3.2.1.45), se construyeron varios plasmidos de ADN diferentes para codificar GlcCerasa de tipo salvaje con su secuencia senal nativa o con la secuencia senal de Bip humana, o una secuencia senal de Bip modificada. Para generar GlcCerasa humana de tipo salvaje con su secuencia senal nativa, el ADNc de GlcCerasa humana completo se amplifico mediante PCR via Phusion-HF DNA polymerase™ usando Cebadores 1 y 2 (Tabla I) y un clon de ADNc de GlcCerasa (NM_000157.3, Origene). El cebador 1 se construyo para contener un sitio de restriccion 5' Bgl II y un sitio de restriccion de EcoRI interno que precedio inmediatamente a la secuencia de Kozak de GlcCerasa nativa, mientras que el cebador 2 contema los sitios de restriccion 3' Nhel y NotI, que sucedieron al codon de parada, para permitir la clonacion del producto de la PCR en vectores de expresion de mai^ero. El producto de la PCR de ~1,6 kilobases (kb) (A) se separo y se corto a partir de gel preparativo de agarosa al 1% (p/v), y se aislo usando el kit de extraccion en gel de QIAgEN™. El producto de la pCr A se digirio subsiguientemente toda la noche con las endonucleasas de restriccion Bgl II y NotI a 37°C, se volvio a purificar y se ligo en el vector de expresion de mai^ero pEF6/V5-HisA (Invitrogen™), que se habfa digerido previamente con BamHI y Not I y desfosforilado con fosfatasa antartica usando T4 ADN ligasa. El sitio de restriccion Bgl II se incorporo en el cebador 1 de manera que la ligacion del producto de la PCR de GlcCerasa digerido con Bgl II en el sitio de BamHI compatible del vector pEF6/V5-HisA elimino el sitio de restriccion de BamHI dentro del sitio de clonacion multiple, y este vector de expresion modificado se denominara aqm en lo sucesivo como pEF6'. Este constructo de ADN, denominado pHD101, se uso para transformar celulas de E. coli qmmicamente competentes, y las colonias bacterianas individuales resistentes a ampicilina se expandieron y se cribaron mediante reacciones de digestion con enzimas de restriccion usando EcoRI y Nhel y con BamHI, respectivamente. Un ADN plasmfdico correcto procedente del clon 4 (denominado pHD101.4) se verifico adicionalmente mediante secuenciacion de ADN, y se escogio para la expresion de GlcCerasa de tipo salvaje. pHD101.4 se uso para construir otros plasmidos que codifican GlcCerasa de tipo salvaje con la secuencia senal de Bip humana o versiones modificadas de esta secuencia senal de Bip en lugar de la secuencia senal de GlcCerasa nativa. De forma breve, se construyo un minigen de ADN bicatenario (denominado minigen 1 en la Tabla II) (y se sintetizo mediante Integrated DNA Technologies™, IDT™) para contener la secuencia de Kozak nativa procedente del gen de alcohol oxidasa 1 (AOX1) de levadura, el gen para toda la secuencia senal de Bip humana nativa de 18 restos (incluyendo su secuencia de reconocimiento de peptidasa senal natural: Ser-Ala-Ala-Arg-Ala; SAARA (SEQ ID NO:24)) y los restos de 123 aminoacidos N-terminales de GlcCerasa humana de tipo salvaje madura (nucleotidos 118-490). El minigen 1 tambien contema un sitio de restriccion de 5' EcoRI, que precedio a la secuencia de Kozak de AOX1, y un sitio de NcoI natural dentro del gen de GlcCerasa en el extremo 3', para permitir la clonacion en pHD101.4 para sustituir la secuencia senal de GlcCerasa nativa por la secuencia senal de Bip humana. Ademas, esta estrategia permite la
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construccion de plasmidos de ADN para la expresion de GlcCerasa de tipo salvaje (con la secuencia senal de Bip) en sistemas de mairnferos o de levaduras (que estan bajo el control del promotor de AOX1 inducible). El diseno de esta y de otras protemas de fusion utilizo el programa de analisis SignalP 4.0™ para predecir si la secuencia senal de Bip sena escindida de la protema de ensayo.
Se anadieron restos de aminoacidos adicionales a los constructos segun sea necesario para facilitar la escision de las secuencias senal, y solamente las secuencias que se predice que tienen una escision de la secuencia senal apropiada se escogieron para generar aquellas protemas de ensayo de fusion. Para la expresion en sistemas de mai^ero, el fragmento de ADN de Bip-GlcCerasa, que contiene la secuencia de Kozak de Bip humana nativa, se sintetizo via PCR usando los Cebadores 3 y 4 y el molde de ADN del minigen 1. Este producto de la PCR de ~440 pb (B) se separo y se corto a partir de gel preparativo de agarosa al 1% (p/v), y se aislo usando el kit de extraccion en gel de QIAGEN. El producto de la PCR B se digirio toda la noche con las endonucleasas de restriccion EcoRI y Nco I, se volvio a purificar y se ligo con el fragmento de ADN NcoI—Not I a partir de pHD101.4 que codifica los restos de aminoacidos 124-497 de GlcCerasa de tipo salvaje madura (que carece de las secuencias senal de GlcCerasa nativa) y el fragmento de ADN del vector EcoRI—Not I pEF6' de ~5,8 kb como se describe previamente. Este constructo de ADN, denominado pHD201, se comprobo mediante digestion con enzimas de restriccion usando EcoRI-Xba I, y un clon correcto (pHD201.2) se verifico mediante secuenciacion de ADN y subsiguientemente se uso para evaluar los efectos de la secuencia senal de Bip humana sobre la expresion y secrecion de GlcCerasa de tipo salvaje. De forma similar, se construyo una version modificada de la secuencia senal de Bip (minigen 2) y se sintetizo mediante IDT™ para que contenga la secuencia de Kozak nativa del gen de levadura de AOX1, los primeros 13 restos de la secuencia senal de Bip humana nativa seguido de una repeticion de restos de aminoacidos 4-13, la secuencia de reconocimiento de peptidasa senal de Bip nativa (restos 14-18) y los 123 restos N-terminales de GlcCerasa humana de tipo salvaje madura (nucleotidos 118-490). Esta modificacion de la secuencia senal de Bip (denominada como secuencia senal de Bip modificada 1) expandio el dominio hidrofobo de manera que abarco toda la membrana del RE y alargo la secuencia senal de 18 a 28 restos. Para la expresion en sistemas de marnffero, la secuencia senal de Bip modificada 1-ADN de GlcCerasa, que contiene el fragmento de la secuencia de Kozak de Bip humana nativa, se sintetizo via PCR usando los Cebadores 3 y 4 y el molde de ADN de minigen 2. Este producto de la PCR de ~470 pb (C) se aislo a partir de gel preparativo de agarosa al 1% (p/v), se digirio con EcoRI y Nco I, se volvio a purificar y se ligo con el fragmento de ADN Nco I—>Not I de pHD101.4 que codifica los restos de aminoacidos 124-497 de GlcCerasa de tipo salvaje madura (que carece de la secuencia senal de GlcCerasa nativa)y el fragmento de ADN del vector EcoRI—Not I pEF6' de ~5,8 kb, como antes. Este constructo de ADN, denominado pHD204, se comprobo mediante digestion con enzimas de restriccion usando EcoRI y Xba I, y se confirmo un clon correcto (pHD204.1) mediante secuenciacion de ADN, y se uso subsiguientemente para evaluar los efectos de esta secuencia senal de Bip modificada sobre la expresion y secrecion de GlcCerasa de tipo salvaje.
Los cebadores usados aqrn para obtener los constructos de ADN se resumen en la Tabla 1.
Tabla 1
Cebador
Hebra Secuencia oligonucleotfdica (5'^3') SEQ ID NO:
1
(+) a ggcaaaatctaaattcgggatagagttttcaagtccttccagag SEQ ID NO: 1
2
(-) b tcgagcggccgcaagctagcttatcactggcgacgccacaggtag SEQ ID NO:2
3
(+) c ccacaaattccaag ata aagctctccctggtggc SEQ ID NO:3
4
(-) ctgg ccatgggtacccggatgatgttatatc SEQ ID NO:4
5
(+) ccacgaattcgacaatgcagctgaggaacc SEQ ID NO:5
6
(-) ctcgaagcggccgcttaaagtaagtcttttaatgacatctgcat SEQ ID NO:6
7
(+) d P-gcactggacaatggattgg SEQ ID NO:7
8
(+) ccacgaattcaaccatgggagtgaggc SEQ ID NO:8
9
(-) ctcgaagcggccgcctaacaccagctgacgagaaac SEQ ID NO:9
10
(+) P-gctgcactcctgggg SEQ ID NO:10
11
(+) P-gctcagcagggagccagc SEQ ID NO:11
12
(+) P-gcagtgcccacacagtg SEQ ID NO:12
a El codon de partida ATG se muestra en el texto en negrita dentro de la secuencia de consenso de Kozak de GlcCerasa nativa (subrayada). Las secuencias de reconocimiento de las endonucleasas de restriccion se muestran
en cursiva.
b El codon de parada esta en cursiva y en negrita.
c El codon de partida ATG se muestra en el texto en negrita dentro de la secuencia de consenso de Kozak de Bip humana nativa (subrayada). Las secuencias de reconocimiento de las endonucleasas de restriccion se muestran en cursiva.
d Los cebadores fosforilados se designan con el simbolo 5’ “P”.
La secuencia senal de Bip modificada 1 se anexo subsiguientemente a otras protemas para evaluar su efecto sobre su expresion y secrecion. De forma breve, se construyo el minigen 3 (Tabla II) para que contenga los primeros 13 restos de la secuencia senal de Bip humana nativa seguido de una repetition de los restos de aminoacidos 4-13 y 5 restos 14-17 de la secuencia de reconocimiento de peptidasa senal de Bip nativa. El minigen 3 contema la secuencia de Kozak nativa procedente de Bip humana, asi como los sitios de restriccion de 5’ EcoRI y 3’ Stu I y Not I. Stu I se incorporo en el minigen 3 debido a que esta enzima de restriccion produce un extremo romo en 3’ tras AGG (codon para arginina, Arg; R), que sirve como la Arg natural en el resto 17 de la secuencia de escision de peptidasa senal de Bip nativa. Por lo tanto, cualquier protema se puede ligar a este fragmento de la secuencia senal 10 de Bip modificada, con la condition de que se anada una alanina adicional a la secuencia proteica en el termino N para completar la secuencia de reconocimiento de peptidasa senal SAARA (SEQ ID NO: 24).
En la Tabla 2 se resumen las secuencias nucleotidicas de ADN de minigenes para las secuencias senal de Bip y Bip modificada.
Tabla 2
* Minigen 1 (Bip humana nativa-GlcCerasa) SEQ ID NO:13:
Secuencia nucleot'idica (hebra sentido, 5' ^ 3’):
acggaa«cgaaacgatgaagctctccctggtggccgcgatgctgctgctgctcagcgcggcgcgggccgcccgcccctgca
tccctaaaagcttcggctacagctcggtggtgtgtgtctgcaatgccacatactgtgactcctttgaccccccgacctttcctgccct
tggtaccttcagccgctatgagagtacacgcagtgggcgacggatggagctgagtatggggcccatccaggctaatcacacgg
gcacaggcctgctactgaccctgcagccagaacagaagttccagaaagtgaagggatttggaggggccatgacagatgctgct
gctctcaacatccttgccctgtcaccccctgcccaaaatttgctacttaaatcgtacttctctgaagaaggaatcggatataacatca
tccgggtacccatggcc
Minigen 2 (secuencia senal de Bip modificada 1-GlcCerasa) SEQ ID NO:14:
Secuencia nucleot'idica (hebra sentido, 5' ^ 3’):
acg^««»cgaaacgatgaagctctccctggtggccgcgatgctgctgctgctcagcctggtggccgcgatgctgctgctgctcagcg
cggcgcgggccgcccgcccctgcatccctaaaagcttcggctacagctcggtggtgtgtgtctgcaatgccacatactgtgact
cctttgaccccccgacctttcctgcccttggtaccttcagccgctatgagagtacacgcagtgggcgacggatggagctgagtat
ggggcccatccaggctaatcacacgggcacaggcctgctactgaccctgcagccagaacagaagttccagaaagtgaaggg
atttggaggggccatgacagatgctgctgctctcaacatccttgccctgtcaccccctgcccaaaatttgctacttaaatcgtacttc
tctgaagaaggaatcggatataacatcatccgggtacccafggcc
Minigen 3 (secuencia senal de Bip modificada 1) SEQ ID NO:15:
Secuencia nucleot'idica (hebra sentido, 5' ^ 3’):
acggflfl«cgcaagatgaagctctccctggtggccgcgatgctgctgctgctcagcctggtggccgcgatgctgctgctgctca gcgcggcg aggcctgcggccgc
Minegen 4 (secuencia senal de Bip modificada 2) SEQ ID NO:16:
Secuencia nucleot'idica (hebra sentido, 5’ ^ 3’):
ggtaccgaaftcgctggcaagatgaagctctccctggtggccgcgatgctgctgctgctctgggtggcactgctgctgctcagc gcggcg aggccttctaga
Minegen 5 (secuencia senal de Bip modificada 3) SEQ ID NO 17:
Secuencia nucleot'idica (hebra sentido, 5’ ^ 3’):
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ggtoccgaaftcgctggcaagatgaagctctccctggtggccgcgatgctgctgctgctctccctggtggccctgctgctgctca gcgcggcg aggccttctaga
Minegen 6 (secuencia senal de Bip modificada 4) SEQ ID NO 18:
Secuencia nucleot'idica (hebra sentido, 5’ ^ 3’):
ggtaccgaaftcgctggcaagatgaagctctccctggtggccgcgatgctgctgctgctcgcactggtggccctgctgctgctc agcgcggcg aggccttctaga
* El codon de partida ATG se muestra en texto en negrita, mientras que la secuencia de consenso de Kozak esta subrayada. Las secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restriction se muestran en cursiva.
Para evaluar a-galactosidasa acida A (GLA, EC 3.2.1.22), la enzima de tipo salvaje con su secuencia senal nativa se amplifico mediante PCR usando los Cebadores 5 y 6 con el ADN molde del clon de ADNc de GLA (NM_000169.2, Origene™). Este producto de la PCR de -1,3 kb se aislo mediante gel preparativo de agarosa, se digirio con EcoRI y Not I, y se ligo al pEF6’ desfosforilado, digerido con EcoRI-Not I. Este constructo de ADN se denomino pHD214, y se uso para evaluar la expresion de GLA. Para construir GLA con la secuencia senal de Bip modificada 1, la enzima GLA madura se sintetizo mediante PCR usando los Cebadores 6 y 7 con el ADN molde del clon de ADNc de GLA. Este producto de la PCR de -1,2 kb (D) se digirio con Not I, se aislo a partir de gel preparativo de agarosa, y se ligo al fragmento de ADN del minigen 3 EcoRI^-Stu I y al vector pEF6’ digerido con EcoRI-Not I, como antes. Este constructo de ADN se denomino pHD215, y se uso para evaluar los efectos de esta secuencia senal de Bip modificada sobre la expresion y secretion de GLA de tipo salvaje.
Para evaluar a-glucosidasa acida (GAA, EC 3.2.1.0), toda la enzima GAA de tipo salvaje (con su secuencia senal nativa) se amplifico mediante PCR usando los Cebadores 8 y 9 con el ADN molde del clon de ADNc de GAA (NM_000152.2, Origene). Este producto de la PCR de -3 kb (E) se aislo mediante gel preparativo de agarosa, se digirio con EcoRI y Not I, y se ligo al pEF6’ desfosforilado, digerido con EcoRI-Not I. Este constructo de ADN se denomino pHD217, y se uso para evaluar la expresion de GAA con su secuencia senal nativa. Puesto que GAA es expresada con multiples prosecuencias que preceden a la enzima madura (Moreland et al., 2005), se sintetizaron protemas de GAA diferentes con longitudes variables y se anexaron a la secuencia senal de Bip modificada 1 para el ensayo. Un fragmento de ADN de GAA, que carece de su secuencia senal nativa pero que contiene los restos 24952, se sintetizo mediante PCR usando los Cebadores 9 y 10. Este producto de la PCR de -3 kb (F) se aislo a partir de gel preparativo de agarosa, y se digirio con Not I y se ligo al fragmento de ADN del minigen 3 EcoRI^Stu I y al vector pEF6’ digerido con EcoRI-Not I. Este constructo de ADN, que contiene la secuencia senal de Bip modificada 1 y GAA (24-952), se denomino pHD218. De forma similar, un fragmento de ADN de GAA, que carece de su secuencia senal nativa pero que contiene los restos 57-952, se sintetizo mediante PCR usando los Cebadores 9 y 11. Este producto de la PCR de -2,9 kb (G) se aislo a partir de gel preparativo de agarosa, y se digirio con Not I y se ligo al fragmento de ADN del minigen 3 EcoRI^Stu I y al vector pEF6’ digerido con EcoRI-Not I, como antes. Este constructo de ADN, que contiene la secuencia senal de Bip modificada 1 y GAA (57-952), se denomino como pHD219. Un fragmento de ADN de GAA, que carece de su secuencia senal nativa pero que contiene los restos 78952, se sintetizo mediante PCR usando los Cebadores 9 y 12. Este producto de la PCR de -2,8 kb (H) se aislo a partir de gel preparativo de agarosa, y se digirio con Not I y se ligo al fragmento de ADN del minigen 3 EcoRI^Stu I y al vector pEF6’ digerido con EcoRI-Not I. Este constructo de ADN, que contiene la secuencia senal de Bip modificada 1 y GAA (78-952), se denomino como pHD220. Los efectos de esta secuencia senal de Bip modificada 1, asi como de las prosecuencias sobre la expresion y secrecion de GAA, se pueden por lo tanto examinar cuidadosamente usando los constructos de ADN pHD217-220.
Se disenaron otras secuencias senal de Bip modificadas (Tabla III), derivadas de la secuencia senal de Bip modificada 1, y se evaluaran para estudiar si estas modificaciones adicionales pueden mejorar adicionalmente la expresion y secrecion proteicas. Estas modificaciones incluyen sustituir los restos de serina y de leucina en las posiciones 14 y 15 por un unico resto de triptofano, y suprimir los restos de alanina y metionina en las posiciones 18 y 19 dentro del dominio hidrofobo (denominado secuencia senal de Bip modificada 2), suprimir los restos de alanina y metionina en las posiciones 18 y 19 dentro del dominio hidrofobo (denominado secuencia senal de Bip modificada 3), y sustituir un resto de serina en la position 14 por alanina y suprimir los restos de alanina y metionina en las posiciones 18 y 19 dentro del dominio hidrofobo (secuencia senal de Bip modificada 4). Estas modificaciones estaban destinadas a incrementar la hidrofobia del dominio hidrofobo, que puede potenciar adicionalmente interacciones de estas secuencias senal con protemas ribosomicas y translocones del RE claves, y crear un sitio de escision de peptidasas senal mas eficiente para mejorar la translocation y secrecion proteicas para protemas recombinantes.
Otras protemas de ensayo, incluyendo insulina humana, factor 2 de crecimiento similar a insulina (IGF-2), anticuerpos, interferones, apolipoprotemas, etc., tambien se evaluaran para determinar si estas secuencias senal de Bip modificadas mejorarian su expresion y secrecion.
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En la Tabla 3 se resumen las secuencias de aminoacidos para las secuencias senal de Bip modificadas.
Tabla 3
Secuencia senal (“s”)
Secuencia de aminoacidos primaria SEQ ID NO:
Native human Bip ss
d MKLSLVAAML LLLSAARA SEQ ID NO:19
Mod. Bip ss-1
e MKLSLVAAML LLLSLVAAMLLLLSAARA SEQ ID NO:20
Mod. Bip ss-2
MKLSLVAAML LLLWVALLLLSAARA SEQ ID NO:21
Mod. Bip ss-3
MKLSLVAAMLLLLSLVALLLLSAARA SEQ ID NO:22
Mod. Bip ss-4
MKLSLVAAML LLLALVALLLLSAARA SEQ ID NO:23
d La secuencia de escision de peptidasas senal de Bip nativa (SAARA) (SEQ ID NO: 24) se muestra en texto subrayado.
e Las modificaciones espedficas para la secuencia senal de Bip se muestran en texto negrita para cada secuencia senal de Bip modificada.
EJEMPLO 3
Expresion transitoria de protemas de ensayo
Para los experimented de expresion transitoria, celulas HEK293T se colocaron en placas de cultivo tisular de 12 pocillos con 1 ml de medio DMEM suplementado con 10% de FBS, y se incubaron a 37°C con una atmosfera de CO2 al 5%. Cuando las celulas HEK293T alcanzaron el 70-100% de confluencia, el medio gastado se sustituyo por 1 ml de medio DMEM/10% de FBS reciente, y cada pocillo se transfecto con 1 |ig de ADN plasirndico para protemas de ensayo individuales o PBS (para un control negativo transfectado de forma simulada) y 3 |il del reactivo de transfeccion Fugene™-HD, segun el protocolo del fabricante. Las celulas transfectadas se incubaron durante 24-72 horas y se comprobaron diariamente para la expresion de la enzima recombinante individual (segregada en el medio) via ensayos de actividad enzimatica y/o mediante transferencia Western y ELISA.
EJEMPLO 4
Ensayos de actividad enzimatica
La expresion y secrecion en el medio de cultivo de p-glucocerebrosidasa acida humana recombinante (GlcCerasa) se evaluo mediante ensayos de actividad enzimatica usando medio acondicionado procedente de experimentos de transfeccion transitoria tras 24, 48 o a alrededor de 72 h, y el sustrato fluorogenico 4-metilumbeliferil-p-D- glucopiranosido (4-MU-p-Glc). De forma breve, se recogieron 20 |il de medios acondicionados procedentes de cada muestra en los puntos de tiempo indicados, y se diluyeron con 80 |il de amortiguador Mcllvane (amortiguador MI: 50 mM de citrato de sodio/fosfato de sodio (pH 5,2)/0,25% (v/v) de Triton X-100/0,25% (p/v) de taurocolato de sodio) en tubos de minicentrifugadora de 0,5 ml. Veinticinco |il de cada muestra diluida se distribuyo en alteuotas en pocillos individuales de placas negras de fondo transparente de 96 pocillos (realizado por triplicado), y se anadieron a cada pocillo 50 |il de sustrato de 4-MU-p-Glc 6 mM (preparado en amortiguador MI) via un pipeteador de multiples canales. Las placas se cerraron entonces hermeticamente con cinta de recubrimiento, y se incubaron a 37°C durante 1 h. Las reacciones enzimaticas se detuvieron anadiendo 125 |il de NaOH 0,1 M, y la fluorescencia de 4-MU liberada se leyo en un lector de placas de fluorescencia usando longitudes de onda de 355 nm de excitacion y 460 nm de emision, respectivamente. La fluorescencia de 4-MU de la muestra transfectada de forma simulada sirvio como el control “de fondo”, y se resto de todas las muestras de GlcCerasa.
La expresion y secrecion de a-glucosidasa acida humana recombinante (GAA) se midieron mediante ensayos de actividad enzimatica usando medio acondicionado procedente de experimentos de transfeccion transitoria tras 24, 48 o 72 h y el sustrato fluorogenico 4-metilumbeliferil-a-D-glucopiranosido (4-MU-a-Glc). Espedficamente, se cosecharon 20 |il de medio acondicionado de cada muestra en los diferentes puntos de tiempo, y se diluyeron con 80 |il de amortiguador de acetato sodico 50 mM (pH 4,0) en tubos de microcentrifugadora de 0,5 ml. Se distribuyeron en forma de alteuotas veinticinco |il de cada muestra diluida en pocillos individuales de placas negras de fondo transparente de 96 pocillos (por triplicado), y se anadieron a cada pocillo via un pipeteador de multiples canales 50 |il de sustrato 4-MU-a-Glc 6 mM (preparado en amortiguador de acetato sodico 50 mM, pH 4,0). Las placas se cerraron entonces hermeticamente con una cinta de recubrimiento, y se incubaron a 37°C durante 1 h. Las reacciones enzimaticas se detuvieron anadiendo 125 |il de NaOH 0,1 M, y la fluorescencia de 4-MU liberada se leyo en un lector de placas de fluorescencia usando longitudes de onda de 355 nm de excitacion y 460 nm de emision, respectivamente. La fluorescencia de 4-MU de la muestra transfectada de forma simulada sirvio como el control de
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“fondo”, y se resto de todas las muestras de GAA.
La expresion y secrecion de a-galactosidasa acida humana recombinante (GLA) se midieron mediante ensayos de actividad enzimatica usando medio acondicionado procedente de experimented de transfeccion transitoria tras 24, 48 o 72 h y el sustrato fluorogenico 4-metilumbeliferil-a-D-glucopiranosido (4-MU-a-Glc). Espedficamente, se cosecharon 20 |il de medio acondicionado de cada muestra en los diferentes puntos de tiempo, y se diluyeron con 80 |il de amortiguador de citrato de sodio/fosfato de sodio 50 mM (pH 4,6) en tubos de microcentrifugadora de 0,5 ml. Se distribuyeron en forma de alteuotas veinticinco |il de cada muestra diluida en pocillos individuales de placas negras de fondo transparente de 96 pocillos (por triplicado), y se anadieron a cada pocillo via un pipeteador de multiples canales 50 |il de sustrato 4-MU-a-Glc 8 mM (preparado en amortiguador de citrato de sodio/fosfato de sodio 50 mM, pH 4,6). Las placas se cerraron entonces hermeticamente con una cinta de recubrimiento, y se incubaron a 37°C durante 1 h. Las reacciones enzimaticas se detuvieron anadiendo 125 |il de NaOH 0,1 M, y la fluorescencia de 4-MU liberada se leyo en un lector de placas de fluorescencia usando longitudes de onda de 355 nm de excitacion y 460 nm de emision, respectivamente. La fluorescencia de 4-MU de la muestra transfectada de forma simulada sirvio como el control de “fondo”, y se resto de todas las muestras de GLA.
EJEMPLO 5
Esta reconocido que ciertas protemas son expresadas de forma natural en niveles muy elevados, mientras que otras apenas son expresadas. Aunque la abundancia y estabilidad del ARNm son factores importantes al nivel transcripcional que pueden afectar a la expresion proteica, cada vez esta mas claro que las secuencias senal tambien desempenan papeles cnticos a nivel proteico, y contribuyen a esta expresion proteica dispar. La protema de union a cadena pesada de inmunoglobulina humana (Bip) tiene caractensticas espedficas que senan particularmente ventajosas para desarrollar secuencias senal superiores para mejorar la expresion y secrecion proteicas para protemas recombinantes. Una vez que se obtuvo una secuencia senal de Bip modificada, se anexo a una protema modelo para determinar si esta secuencia senal no natural mejorana la expresion y secrecion proteicas para la protema modelo. Espedficamente, el nucleo hidrofobo se alargo para formar una estructura de helice a mas larga. Se predice que este alargamiento del dominio hidrofobo en la secuencia senal de Bip modificada 1 tendna varias ventajas. En primer lugar, el primer dominio hidrofobo modificado (el mas largo) formana una helice a mas larga y abarcana todo el tunel de salida ribosomico que se puede identificar por la protema ribosomica Rpl17 para facilitar mejores interacciones con otras protemas claves del RE, tales como las subunidades Sec61, y RAMP4. En segundo lugar, un dominio hidrofobo helicoidal a mas largo puede permitir que esta secuencia senal de Bip modificada interaccione con protemas translocones clave, tales como las subunidades TRAM y Sec61, para ayudar a orientar eficientemente al polipeptido naciente en el poro del translocon para promover la orientacion necesaria del bucle competente para la translocacion proteica. En tercer lugar, un dominio hidrofobo helicoidal a mas largo puede permitir que esta secuencia senal de Bip modificada se mueva fuera del poro del translocon acuoso y hacia el interior de la bicapa lipfdica de forma mas eficiente, de manera que se puede escindir mediante peptidasa senal a una velocidad mas rapida. En cuarto lugar, una secuencia senal de Bip modificada se puede alejar del translocon a una velocidad mas rapida para permitir que la protema recombinante interaccione con otras protemas importantes, tales como oligosacariltransferasa, protemas chaperonas del RE tales como Bip, protema disulfuro isomerasa y calnexina, de forma mas pronto durante su smtesis para mejorar el plegamiento de la protema. Todos y cada uno de estos beneficios potenciales mejorana la velocidad de expresion proteica, el plegamiento y la exportacion fuera de las celulas.
Se pueden hacer otras modificaciones, incluyendo anadir restos cargados a regiones de flanqueo del dominio hidrofobo extendido para potenciar adicionalmente su hidrofobia y ayudar a orientar apropiadamente la secuencia senal en el translocon. Estas modificaciones estan destinadas a potenciar las interacciones de las secuencias senal con ciertas protemas ribosomicas, particularmente Rpl17, que a su vez incrementanan las interacciones con protemas translocones Sec61p, RAMP4 y TRAM para mejorar la translocacion de protemas, la expresion y secrecion de protemas.
Se generaron varios constructos de ADN diferentes, que codifican GlcCerasa de tipo salvaje, para que contengan la secuencia senal de GlcCerasa nativa (WTGlcCerasa) o la secuencia senal de Bip humana (CBP201 GlcCerasa), o la secuencia senal de Bip modificada 1 (CBP204 GlcCerasa) nueva. Estos constructos (1 |ig) se ensayaron mediante experimentos de expresion transitoria en la estirpe celular humana (HEK293T), que estaba en una confluencia del ~80%. El medio de cultivo celular acondicionado (20 |il) se cosecho diariamente durante el transcurso de tiempo de 72 h y se evaluo para determinar la actividad enzimatica de GlcCerasa usando el sustrato fluorogenico 4-MU-p-glucosa para evaluar los efectos de las secuencias senal sobre la expresion y secrecion de GlcCerasa. Como se puede observar en la Figura 1, ambas secuencias senal pueden promover la expresion y secrecion de GlcCerasa en el medio de cultivo celular. Sin embargo, se observo que la secuencia senal de Bip modificada 1 manipulada (en CBP204 GlcCerasa) produce una actividad de GlcCerasa 2 veces superior con respecto a WT GlcCerasa 72 h tras la transfeccion. Se observo actividad basal para el control negativo transfectado de forma simulado (vector vacte), y se confirmo que el incremento de actividad enzimatica resulto de la expresion de GlcCerasa recombinante. Los multiples experimentos de transfeccion (n >3) confirmaron que la nueva secuencia senal incremento la expresion y secrecion de GlcCerasa.
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EJEMPLO 6
La smtesis proteica se ve muy afectada por la disponibilidad de nutrientes (es dedr, ATP, aminoacidos, hidratos de carbono, etc.) as^ como otros componentes celulares esenciales (por ejemplo, factores de iniciacion y de alargamiento, ARNt, chaperonas proteicas, etc.). Los primeros se pueden incrementar o reponer con medio de cultivo celular durante el reabastecimiento, mientras que los ultimos componentes estan limitados en las celulas y no se pueden suplementar durante la produccion de protemas. El agotamiento de estos componentes vitales provoca un estres celular significativo, lo que da como resultado la reduccion o incluso suspension de nueva smtesis proteica para la mayona de las protemas. De forma interesante, la expresion de algunas protemas se mantiene y de hecho aumento durante estos penodos estresantes como parte de una respuesta celular adaptativa para ayudar a las celulas a volver a la homeostasis. No esta completamente claro como estas protemas selectas son distinguidas por la maquinaria de smtesis proteica celular para permitir su expresion preferente, pero se cree que las secuencias senal desempenan un papel importante en este proceso. Puesto que Bip es una protema chaperona del RE importante cuya expresion se mantiene durante este penodo estresante para ayudar a restablecer la homeostasis celular, predecimos que esta secuencia senal de Bip modificada permitina la expresion preferente de la protema recombinante heterologa para que se mantenga en condiciones en las que la expresion de otras protemas se reduce o se suprime. Para probar esta hipotesis, transfectamos cultivos de celulas KEK293T a una densidad celular elevada (~100% confluente) con WT GlcCerasa y CBP204 GlcCerasa, y se monitorizo la expresion y secrecion a lo largo de un penodo de 63 h. Ademas, el medio de cultivo celular no se cambio durante el experimento para agotar nutrientes (durante las ultimas etapas del experimento para imitar penodos de pocos nutrientes durante aplicaciones por lotes antes del reabastecimiento), para determinar si la expresion de WT GlcCerasa y CBP204 GlcCerasa cambia en respuesta al agotamiento de los nutrientes.
Nuestros resultados muestran que, en estas condiciones experimentales, CBP204 GlcCerasa, que contiene la secuencia senal de Bip modificada 1, se expreso mejor que WT GlcCerasa con su secuencia senal nativa a lo largo del penodo de 63 h, como se muestra en la Figura 2. Los niveles de CBP204 GlcCerasa fueron 1,9 veces mayores que WT GlcCerasa tras 24 h, 2,1 veces mayores tras 48 h, y 2,5 veces mayores tras 63 h. Cuando se extrapola a 72 h, CBP204 GlcCerasa sena 3,3 veces mayor que WT GlcCerasa. De forma importante, la expresion de CBP204 GlcCerasa se mantuvo a una velocidad casi constante en la que hubo una duplicacion de la protema segregada despues de cada dfa. Por el contrario, la velocidad de expresion para WT GlcCerasa se ralentizo significativamente en los puntos de tiempo mas tardfos. Esta diferencia fue muy evidente cuando se compara la forma de las curvas de expresion para estas dos enzimas - una curva casi lineal para CBP204 GlcCerasa y una curva no lineal para WT GlcCerasa a medida que la velocidad de expresion se estabilizo en los puntos de tiempo mas tardms. Estos datos muestran la expresion diferencial de CBP204 GlcCerasa y WT GlcCerasa, presumiblemente en respuesta al agotamiento de nutrientes, y esta divergencia se incremental aun mas con incubaciones mas largas. Puesto que la unica diferencia entre CBP204 GlcCerasa y WT GlcCerasa es la secuencia senal, estos datos apoyan la hipotesis de que la secuencia senal de Bip modificada 1 permitio la expresion preferente durante condiciones de cultivo celular no optimas.
EJEMPLO 7
Para estudiar los efectos de la secuencia senal de Bip modificada 1 sobre la expresion y secrecion de una protema modelo diferente, se construyeron plasmidos de ADN para codificar a-glucosidasa acida humana de tipo salvaje (GAA) que contiene su secuencia senal de GAA nativa (WT GAA) o la secuencia senal de Bip 1 manipulada y los restos de aminoacidos 24-952 de GAA (denominado como CBP218 GAA). Estos constructos de ADN se estudiaron mediante expresion transitoria en HEK293T a lo largo de un penodo de ~2 dfas para comparar directamente los efectos de estas secuencias senal sobre la expresion y secrecion de GAA de tipo salvaje. Como se puede observar en la Figura 3, CBP218 GAA tuvo una actividad de GAA segregada 2,5 veces mayor en medio que WT GAA 43 h tras la transfeccion. Se observo actividad basal para el control negativo transfectados de forma simulada (vector vado), y se confirmo que la actividad enzimatica observada en el medio resulto de la expresion de GAA recombinante. Estos resultados muestran que la secuencia senal de Bip modificada 1 (en CBP218 GAA) incremento significativamente la expresion y secrecion de GAA en las mismas condiciones experimentales, puesto que la unica diferencia entre CBP218 GAA y WT GAA es sus secuencias senal respectivas.
EJEMPLO 8
Ensayos de transferencia Western y de ELISA
La expresion y secrecion de protemas de ensayo se evaluaran mediante analisis de transferencia Western. De forma breve, se recogera medio de cultivo celular acondicionado procedente de experimentos de transfeccion transitoria tras 24, 48 o 72 h, y se sometera a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y se transferira subsiguientemente a una membrana de nitrocelulosa. La membrana se bloqueara con 4% (p/v) de leche desnatada en disolucion salina amortiguada con TRIS/0,1% (v/v) de Tween-20 (TBST) durante 1 h a temperatura ambiente con agitacion. La membrana se incubara entonces con el anticuerpo primario (por ejemplo, anti-IGF-2 humano de conejo) que se habfa diluido apropiadamente (por ejemplo, 1:5000) en 4% (p/v) de leche desnatada en TBST durante 1 h a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4°C con agitacion. La mancha se lavara entonces con TBST a temperatura ambiente con agitacion y multiples cambios de amortiguador a lo largo de
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1 h. La mancha se incubara entonces con un anticuerpo secundario enlazado a enzima (por ejemplo, anticuerpos anti-conejo de cabra conjugados con peroxidasa de rabano picante) que se habfa diluido apropiadamente (por ejemplo, 1:20.000) en 4% (p/v) de leche desnatada en TBST durante 1 h a temperatura ambiente con agitacion. La mancha se lavara entonces con TBST a temperatura ambiente con agitacion y multiples cambios de amortiguador a lo largo de 1 h. La mancha se incubara entonces con sustrato quimioluminiscente durante 5 min. a temperatura ambiente, y se visualizara mediante un sistema de formacion de imagenes o mediante pelmula, para evaluar el nivel de expresion de la protema de ensayo.
De forma similar, la expresion de las protemas de ensayo se puede evaluar mediante ensayos inmunosorbentes ligados a enzima (ELISA). De forma breve, placas inmunosorbentes de 96 pocillos se revestiran con 50 |il de anticuerpos primarios (por ejemplo, anti-IGF-2 humano de conejo) a una concentracion de protema de 5 |ig/ml en disolucion salina amortiguada con TRIS (TBS). Estas placas se bloquearan entonces con 200 |il de 4% (p/v) de leche desnatada en TBST durante 1 h a temperatura ambiente. Se recogera medio de cultivo celular acondicionado procedente de experimentos de transfeccion transitoria tras 24, 48 o 72 h, y se incubara en estas placas durante 1 h a temperatura ambiente. Estas placas se lavaran entonces con 200 |il de TBST a temperatura ambiente con agitacion y multiples cambios de amortiguador durante 1 h. Estas placas se incubaran entonces con un anticuerpo secundario enlazado a enzima (por ejemplo, anticuerpos anti-conejo de cabra conjugados con peroxidasa de rabano picante) que se habfa diluido apropiadamente (por ejemplo, 1:20.000) en TBST durante 1 h a temperatura ambiente. Estas placas se lavaran entonces con TBST con multiples cambios de amortiguador a lo largo de 1 h a temperatura ambiente. Estas placas se incubaran entonces con un sustrato colorimetrico (por ejemplo, 3,3',5,5'- tetrametilbencidina, TMB) durante 5-15 min. a temperatura ambiente, y se detendran con acido sulfurico 0,1 M, y se leeran en un lector de placas a una longitud de onda apropiada (por ejemplo, 450 nm) para evaluar la expresion de la protema de ensayo.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> DO, Hung
<120> Nuevas secuencias senal para mejorar las expresiones de protemas y la secrecion de enzimas recombinantes y de otras protemas
<130> CALL-0014
<150> US 61/415,926
<151> 2010-11-22
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 44 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico <400> 1
ggcaagatct gaattcggga tggagttttc aagtccttcc agag 44 <210>2 <211> 45 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico <400> 2
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30
35
tcgagcggcc gcaagctagc ttatcactgg cgacgccaca ggtag 45
<210>3 <211> 34 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico <400> 3
ccacgaattc caagatgaag ctctccctgg tggc 34 <210> 4 <211> 31 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico <400> 4
ctggccatgg gtacccggat gatgttatat c 31 <210> 5 <211> 30 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico <400> 5
ccacgaattc gacaatgcag ctgaggaacc 30
<210>6 <211> 44 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico <400> 6
ctcgaagcgg ccgcttaaag taagtctttt aatgacatct gcat 44 <210>7 <211> 19 <212> ADN
5
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35
<220>
<223> Cebador sintetico <220>
<221> caractenstica diversa <223> Cebador fosforilado <400>7
gcactggaca atggattgg 19 <210>8 <211> 27 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico <400> 8
ccacgaattc aaccatggga gtgaggc 27 <210>9 <211> 36 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico <400> 9
ctcgaagcgg ccgcctaaca ccagctgacg agaaac 36
<210> 10 <211> 15 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico <220>
<221> caractenstica diversa <223> Cebador fosforilado <400> 10
gctgcactcc tgggg 15
<210> 11 <211> 18 <212>ADN
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15
20
25
<223> Cebador sintetico <220>
<221> caracteristica diversa <223> Cebador fosforilado <400> 11
gctcagcagg gagccagc 18 <210> 12 <211> 17 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador sintetico <220>
<221> caracteristica diversa <223> Cebador fosforilado <400> 12
gcagtgccca cacagtg 17
<210> 13
<211> 441
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> caracteristica diversa
<223> Minigen 1 (Bip humana nativa-GIcCerasa)
<400> 13

acggaattcg aaacgatgaa gctctccctg gtggccgcga tgctgctgct gctcagcgcg 60

gcgcgggccg cccgcccctg catccctaaa agcttcggct acagctcggt ggtgtgtgtc 120

tgcaatgcca catactgtga ctcctttgac cccccgacct ttcctgccct tggtaccttc 180

agccgctatg agagtacacg cagtgggcga cggatggagc tgagtatggg gcccatccag 240

gctaatcaca cgggcacagg cctgctactg accctgcagc cagaacagaa gttccagaaa 300

gtgaagggat ttggaggggc catgacagat gctgctgctc tcaacatcct tgccctgtca 360

ccccctgccc aaaatttgct acttaaatcg tacttctctg aagaaggaat cggatataac 420

atcatccggg tacccatggc c 441
5
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15
20
25
<211>471 <212> ADN
<223> Minigen 2 (secuencia <400> 14
acggaattcg aaacgatgaa gtggccgcga tgctgctgct agcttcggct acagctcggt cccccgacct ttcctgccct cggatggagc tgagtatggg accctgcagc cagaacagaa gctgctgctc tcaacatcct tacttctctg aagaaggaat <210> 15 <211> 106 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Minigen 3 (secuencia <400> 15
acggaattcg caagatgaag tggccgcgat gctgctgctg <210> 16 <211> 102 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Minigen 4 (secuencia <400> 16
ggtaccgaat tcgctggcaa tgggtggcac tgctgctgct <210> 17 <211> 105 <212> ADN
senal de Bip modificada 1-GlcCerasa)
gctctccctg
gtggccgcga tgctgctgct gctcagcctg 60
gctcagcgcg
gcgcgggccg cccgcccctg catccctaaa 120
ggtgtgtgtc
tgcaatgcca catactgtga ctcctttgac 180
tggtaccttc
agccgctatg agagtacacg cagtgggcga 240
gcccatccag
gctaatcaca cgggcacagg cctgctactg 300
gttccagaaa
gtgaagggat ttggaggggc catgacagat 360
tgccctgtca
ccccctgccc aaaatttgct acttaaatcg 420
cggatataac
atcatccggg tacccatggc c 471
senal de Bip modificada 1)
ctctccctgg tggccgcgat gctgctgctg ctcagcctgg ctcagcgcgg cgaggcctgc ggccgc
60
106
senal de Bip modificada 2)
gatgaagctc tccctggtgg ccgcgatgct gctgctgctc 60
cagcgcggcg aggccttcta ga 102
5
10
15
20
25
30
<223> Minigen 5 (secuencia senal de Bip modificada 3)
<400> 17
ggtaccgaat tcgctggcaa gatgaagctc tccctggtgg ccgcgatgct gctgctgctc
tccctggtgg ccctgctgct gctcagcgcg gcgaggcctt ctaga
<210> 18 <211> 105 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Minigen 6 (secuencia senal de Bip modificada 4)
<400> 18
ggtaccgaat tcgctggcaa gatgaagctc tccctggtgg ccgcgatgct gctgctgctc
gcactggtgg ccctgctgct gctcagcgcg gcgaggcctt ctaga
<210> 19
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> caracteristica diversa
<223> Secuencia senal de Bip humana nativa
<400> 19
Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala 15 10 15
Arg Ala
<210> 20 <211> 28 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> ss-1 de Bip modificada <400> 20
Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Leu Val 15 10 15
Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala Arg Ala 20 25
60
105
60
105
5
10
15
20
25
30
<211> 25 <212> PRT
<223> ss-2 de Bip modificada <400> 21
Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ala 15 10 15
Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala Arg Ala 20 25
<210> 22 <211> 26 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> ss-3 de Bip modificada <400> 22
Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Leu Val 15 10 15
Ala Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala Arg Ala 20 25
<210> 23 <211> 27 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> ss-4 de Bip modificada <400> 23
Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ala Leu Val 15 10 15
Ala Leu Leu Leu Leu Arg Ser Ala Ala Arg Ala 20 25
<210> 24
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Secuencia de reconocimiento de peptidasa senal para Bip nativa humana <400> 24
Ser Ala Ala Arg Ala 1 5
5

Claims (5)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una secuencia senal polipeptidica, que comprende un fragmento modificado de una protema de union a cadena pesada de inmunoglobulina humana (Bip), en la que el fragmento modificado de protema de union a cadena pesada de inmunoglobulina humana (Bip) consiste en la secuencia de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 20; la
    5 secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 21; la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 22; o la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 23.
  2. 2. Una protema de fusion que comprende una secuencia senal polipeptfdica segun la reivindicacion 1, operablemente enlazada a un polipeptido heterologo.
  3. 3. La protema de fusion de la reivindicacion 2, en la que el polipeptido heterologo comprende una o mas enzimas, 10 uno o mas modificadores de la respuesta biologica, una o mas toxinas, uno o mas anticuerpos, uno o mas
    fragmentos del polipeptido heterologo, o cualquier combinacion de los mismos.
  4. 4. La protema de fusion de la reivindicacion 2, en la que el polipeptido heterologo comprende uno o mas de los siguientes: p-glucocerebrosidasa acida, a-glucosidasa acida, proinsulina, hormona 2 del crecimiento similar a insulina (IGF-2), interferon, anticuerpo terapeutico, y una hormona 1 del crecimiento similar a insulina (IGF-1).
    15 5. Un vector de expresion proteica, que comprende: (a) un promotor enlazado operablemente a una primera
    secuencia de ADN, en el que dicha primera secuencia de ADN codifica una secuencia senal polipeptfdica segun la reivindicacion 1, y (b) una segunda secuencia de ADN que esta fusionada en el marco a dicha primera secuencia de ADN, en el que dicha segunda secuencia de ADN codifica un polipeptido heterologo.
  5. 6. El vector de expresion proteica de la reivindicacion 5, en el que la segunda secuencia de ADN codifica p20 glucocerebrosidasa acida, a-glucosidasa acida, proinsulina, hormona 2 del crecimiento similar a insulina (IGF-2), interferon, anticuerpo terapeutico, o una hormona 1 del crecimiento similar a insulina (IGF-1).
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