ES2829199T3 - Nuevas secuencias de señalización para mejorar la expresión y segregación de proteínas de enzimas recombinantes y otras proteínas - Google Patents
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Abstract
Un método para producir un polipéptido, que comprende: expresar una proteína de fusión que comprende un fragmento modificado de una secuencia de señalización de un polipéptido de proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina operativamente enlazado a un polipéptido heterólogo, en donde el fragmento modificado de proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; y recuperar el polipéptido heterólogo.
Description
DESCRIPCIÓN
Nuevas secuencias de señalización para mejorar la expresión y segregación de proteínas de enzimas recombinantes y otras proteínas
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Se reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional de EE. UU. núm. 61/415.926, presentada el 22 de noviembre de 2010, que se incorpora a la presente memoria por referencia en su totalidad.
Campo técnico
Expresión y segregación de enzimas recombinantes y otras proteínas para uso terapéutico y otros usos.
Antecedentes
En eucariotas, la síntesis de proteínas para casi todas las proteínas comienza en el citoplasma mediante mega complejos de proteínas llamados ribosomas. Varias proteínas completan su síntesis y plegado en el citoplasma y permanecen allí, en donde funcionan. No obstante, muchas otras son exportadas del citoplasma hacia el retículo endoplasmático (ER) en donde adquieren las modificaciones post-traducción necesarias (p. ej., enlaces disulfuro, glucosilación, etc.) para alcanzar su estructura de proteína y su actividad biológica correctas antes de exportarse hacia sus localizaciones celulares de destino (p. ej., Golgi, peroxisoma y proteínas lisosomales) o hacia la superficie celular (p. ej., receptores, canales iónicos, etc.) o segregarse fuera de las células (p. ej., anticuerpos, factores de coagulación, hormonas, etc.). Las proteínas destinadas a ser exportadas del citoplasma se distinguen de las proteínas citoplásmicas mediante un elemento de proteína especializado en el término amino (N-) llamado secuencia de señalización.
Las secuencias de señalización (también llamadas péptidos de señal) no tienen secuencia de aminoácidos de consenso o longitud pero típicamente comprenden los residuos 15-40 iniciales en el término N con 7-20 residuos de aminoácidos hidrófobos contiguos que forman una estructura secundaria a-helicoidal que a menudo es flanqueada por residuos cargados. Las secuencias de señalización se identifican en el citoplasma mediante una proteína de múltiples subunidades especializada: complejo de ARN que se denomina partícula de reconocimiento de señales (SRP) que dirige estas proteínas nacientes hacia poros especializados dentro de la membrana del ER llamados translocones en donde estas proteínas son transportadas por la membrana del ER hacia el lumen del ER - un proceso conocido como translocación de proteínas.
La translocación de proteínas ocurre concurrentemente durante la síntesis de proteínas (es decir, de manera cotraducción) en mamíferos, mientras que en otras eucariotas (p. ej., levadura), este proceso puede ser o bien co- o post-traducción. La translocación de proteínas mediada por secuencias de señalización también se utiliza en bacterias para dirigir proteínas fuera del citoplasma y hacia el periplasma. En mamíferos, las secuencias de señalización se identifican mediante SRP a medida que emergen de los ribosomas que pausan temporalmente la traducción de proteínas para permitir el direccionamiento de todo el complejo de SRP-proteína naciente-ribosoma hacia translocones a través del receptor de SRP asociado. La síntesis de proteínas se retoma después de que se libera la SRP y el complejo de ribosoma-proteína naciente se acopla correctamente en el translocón.
La mayoría de los productos terapéuticos con enzimas y otras proteínas se producen por tecnología recombinante diseñada para segregar estas proteínas recombinantes fuera de las células y hacia el cultivo celular para simplificar la purificación en un paso posterior. Estas enzimas recombinantes y otras proteínas deben utilizar por ende secuencias de señalización y esta misma vía celular para segregación. La producción de alto nivel de estas proteínas requiere entonces secuencias de señalización que puedan mediar el direccionamiento eficiente del ER y la translocación de proteínas en la membrana del ER. No obstante, las secuencias de señalización no son equivalentes para facilitar el direccionamiento y la señalización del ER. Se cree que la identificación de secuencias de señalización por SRP ocurre rápida y eficientemente, pero las etapas de direccionamiento y translocación del ER subsiguientes son altamente dispares entre las proteínas. Puesto que las secuencias de señalización son reconocidas dos veces, primero por el SRP para direccionamiento del complejo de proteína naciente-ribosoma al ER y luego por las proteínas de los translocones (es decir, proteínas Sec61) y otras proteínas del ER asociadas a los translocones para iniciar la translocación, ambas son sitios potenciales de regulación. Se ha demostrado que esta última etapa es mucho más rigurosa y menos eficiente, y por lo tanto es un obstáculo importante en este proceso. Sorprendentemente, la mayoría de las secuencias de señalización son intrínsecamente ineficientes para facilitar la translocación de proteínas. En consecuencia, muchos complejos de proteínas nacientes-ribosomas dirigidos al ER se disocian de la membrana del ER y se aborta la síntesis de proteínas, reduciendo así su expresión y segregación de proteínas.
Compendio
La presente invención da a conocer un método para producir un polipéptido, que comprende: expresar una proteína de fusión que comprende un fragmento modificado de una secuencia de señalización de polipéptidos de proteínas de unión (Bip) de la cadena pesada de inmunoglobulina humana operativamente enlazada a un polipéptido
heterólogo, en donde el fragmento modificado de la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina humana consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; y recuperar el polipéptido heterólogo.
El polipéptido heterólogo puede comprender una o más enzimas, uno o más modificadores de la respuesta biológica, una o más toxinas, uno o más anticuerpos, uno o más fragmentos del polipéptido heterólogo o cualquiera de sus combinaciones.
El polipéptido heterólogo puede comprender uno o más de los siguientes: p-glucocerebrosidasa ácida, a-glucosidasa ácida, proinsulina, hormona del crecimiento de tipo insulina 2 (IGF-2) insulina y una hormona del crecimiento de tipo insulina 1 (IGF-1).
El polipéptido heterólogo puede comprender p-glucocerebrosidasa ácida.
El polipéptido heterólogo puede comprender a-glucosidasa ácida.
El fragmento modificado de la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.
El fragmento modificado de la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.
El fragmento modificado de la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.
El fragmento modificado de la proteína de unión (Bip) de la cadena pesada de inmunoglobulina humana puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23.
El fragmento modificado de la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana puede aumentar la expresión del polipéptido heterólogo.
El fragmento modificado de la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina humana (Bip) puede aumentar la segregación del polipéptido heterólogo.
Breve descripción de los dibujos
Los aspectos precedentes y otros aspectos de la invención son obvios a partir de la siguiente descripción detallada de la invención cuando se consideran en conjunto con los dibujos adjuntos. Para el propósito de ilustrar la invención, se muestran las realizaciones de los dibujos actualmente preferidos, entendiéndose, no obstante, que la invención no se limita a los medios específicos descritos. Los dibujos no necesariamente están hechos a escala:
La Figura 1 muestra el efecto funcional de las secuencias de señalización para la expresión y segregación de pglucocerebrosidasa ácida humana de tipo salvaje recombinante en un periodo de aproximadamente 72 horas.
La Figura 2 muestra la expresión y segregación preferencial de p-glucocerebrosidasa ácida humana de tipo salvaje recombinante en un periodo de aproximadamente 63 horas a alta densidad celular y desprovista de nutrientes. La Figura 3 muestra el efecto funcional de secuencias de señalización para la expresión y segregación de aglucocerebrosidasa ácida humana de tipo salvaje recombinante en un periodo de aproximadamente 43 horas.
Descripción detallada de las realizaciones ilustrativas
Tal como se usa en esta memoria, un "polipéptido heterólogo" es cualquier polipéptido que es un fragmento no modificado de la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana.
Tal como se emplea en este documento, "Bip" es una abreviatura de proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina.
Las secuencias de señalización de polipéptidos adecuadas comprenden un fragmento modificado de la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana, que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 23.
Las proteínas de fusión adecuadas comprenden un fragmento modificado de la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana operativamente enlazada a un polipéptido heterólogo. El fragmento modificado de la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 o SEQ iD NO: 23. Todas estas proteínas de fusión se pueden caracterizar por tener una mayor expresión en el cultivo celular. Los cultivos celulares pueden también estar en condiciones de cultivo no óptimas. Las condiciones de cultivo celular no óptimas pueden ser alta
densidad celular y agotamiento de nutrientes. El polipéptido heterólogo puede ser una o más enzimas, uno o más modificadores de respuesta biológica, una o más toxinas, uno o más anticuerpos, uno o más fragmentos del polipéptido heterólogo, o cualquiera de sus combinaciones. El polipéptido heterólogo puede ser pglucocerebrosidasa ácida. El polipéptido heterólogo puede ser también a-galactosidasa ácida. El polipéptido heterólogo puede ser también a-glucosidasa ácida. El polipéptido heterólogo puede ser también proinsulina. El polipéptido heterólogo puede ser también la hormona del crecimiento de tipo insulina 2 (IGF-2). El polipéptido heterólogo puede ser interferón. El polipéptido heterólogo puede ser también un anticuerpo terapéutico. El polipéptido heterólogo puede ser también la hormona del crecimiento de tipo insulina 1 (IGF-1).
Otras proteínas de fusión adecuadas con el fragmento modificado de la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana pueden comprender la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 23, y el polipéptido heterólogo puede comprender p-glucocerebrosidasa. Esas proteínas de fusión se pueden caracterizar por tener mayor expresión en cultivo celular que p-glucocerebrosidasa de tipo salvaje (p-glucocerebrosidasa con la secuencia de señalización de p-glucocerebrosidasa nativa). El aumento de expresión en el cultivo celular se me ensayando la actividad de la p-glucocerebrosidasa en un periodo de aproximadamente 3 días. El cultivo celular puede también estar en condiciones de cultivo celular no óptimas. Las condiciones de cultivo celular no óptimas pueden ser alta densidad celular y agotamiento de nutrientes. El aumento de la expresión en el cultivo celular de alta densidad celular y agotamiento de nutrientes se puede medir ensayando la actividad de la p-glucocerebrosidasa en un periodo de aproximadamente 3 días.
En otras proteínas de fusión adecuadas con el fragmento modificado de la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 23, el polipéptido heterólogo puede comprender a-galactosidasa ácida. Esas proteínas de fusión se pueden caracterizar por tener un aumento de la expresión en el cultivo celular en comparación con a-galactosidasa de tipo salvaje (a-galactosidasa con secuencia de señalización de a-galactosidasa nativa). El aumento de la expresión en el cultivo celular se puede medir ensayando la actividad de a-galactosidasa durante un periodo de aproximadamente 3 días. El cultivo celular puede también estar en condiciones de cultivo celular no óptimas. Las condiciones de cultivo celular no óptimas pueden ser alta densidad celular y agotamiento de nutrientes. El aumento de la expresión en el cultivo celular de alta densidad celular y agotamiento de nutrientes se puede medir ensayando la actividad de a-galactosidasa durante un periodo de 3 días.
En otras proteínas de fusión adecuadas con el fragmento modificado de la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 23, el polipéptido heterólogo puede comprender a-glucosidasa ácida. Esas proteínas de fusión se pueden caracterizar por tener mayor expresión en cultivo celular en comparación con a-glucosidasa ácida de tipo salvaje (a-glucosidasa ácida con la secuencia de señalización de a-glucosidasa ácida nativa). El aumento de la expresión en el cultivo celular se puede medir ensayando la actividad de la a-glucosidasa ácida en un periodo de aproximadamente 3 días. El cultivo celular también se puede medir en condiciones de cultivo celular no óptimas. Las condiciones de cultivo celular no óptimas pueden ser alta densidad celular y agotamiento de nutrientes. El aumento de la expresión en cultivo celular de alta densidad celular y agotamiento de nutrientes se puede medir ensayando la actividad de la a-glucosidasa ácida durante un periodo de aproximadamente 3 días.
En otras proteínas de fusión adecuadas con el fragmento modificado de la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 23, el polipéptido heterólogo puede comprender proinsulina. Esas proteínas de fusión se pueden caracterizar por tener un aumento de la expresión en cultivo celular en comparación con la proinsulina de tipo salvaje (proinsulina con la secuencia de señalización de proinsulina nativa). El aumento de la expresión en cultivo celular se puede medir ensayando la actividad de la proinsulina durante un periodo de aproximadamente 3 días. El cultivo celular también puede estar en condiciones de cultivo celular no óptimas. Las condiciones de cultivo celular no óptimas pueden ser alta densidad celular y agotamiento de nutrientes. El aumento de expresión en el cultivo celular de alta densidad celular y agotamiento de nutrientes se puede medir ensayando la actividad de la proinsulina en un periodo de aproximadamente 3 días.
En otras proteínas de fusión adecuadas con el fragmento modificado de la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 23, el polipéptido heterólogo puede comprender la hormona del crecimiento de tipo insulina 2 (IGF-2). Esas proteínas de fusión se pueden caracterizar por tener mayor expresión en el cultivo celular en comparación con la hormona del crecimiento de tipo insulina 2 (IGF-2) salvaje (hormona del crecimiento de tipo insulina 2 (IGF-2) con la secuencia de señalización de la hormona del crecimiento de tipo insulina 2 (IGF-2) nativa). El aumento de la expresión en cultivo celular se puede medir ensayando la actividad de la hormona del crecimiento de tipo insulina 2 (IGF-2) durante un periodo de aproximadamente 3 días. El cultivo celular también puede ser en condiciones de cultivo celular no óptimas. Las condiciones de cultivo celular no óptimas pueden ser alta densidad celular y agotamiento de nutrientes. El aumento de expresión en cultivo celular con alta densidad celular y agotamiento de nutrientes se puede medir ensayando la actividad de la hormona del crecimiento de tipo insulina 2 (IGF-2) durante un periodo de aproximadamente 3 días.
En otras proteínas de fusión adecuadas con el fragmento modificado de la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 23, el polipéptido heterólogo puede comprender interferón. Esas proteínas de fusión se pueden caracterizar por tener un aumento de expresión en cultivo celular en comparación con interferón de tipo salvaje (interferón con la secuencia de señalización de interferón nativa). El aumento de expresión en el cultivo celular se puede medir ensayando la actividad del interferón durante un periodo de aproximadamente 3 días. El cultivo celular puede estar también en condiciones de cultivo celular no óptimas. Las condiciones de cultivo celular no óptimas pueden ser alta densidad celular y agotamiento de nutrientes. El aumento de la expresión en cultivo celular con alta densidad celular y agotamiento de nutrientes se puede medir ensayando la actividad del interferón durante un periodo de aproximadamente 3 días.
Otras proteínas de fusión adecuadas con el fragmento modificado de la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana pueden comprender la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 23 y el polipéptido heterólogo puede comprender un anticuerpo terapéutico. Esas proteínas de fusión se pueden caracterizar por tener mayor expresión en cultivo celular en comparación con un anticuerpo terapéutico de tipo salvaje (un anticuerpo terapéutico con la secuencia de señalización del anticuerpo terapéutico natural). El aumento de expresión en cultivo celular se puede medir ensayando la actividad de un anticuerpo terapéutico durante un periodo de aproximadamente 3 días. El cultivo celular puede estar también en condiciones de cultivo celular no óptimas. Las condiciones de cultivo celular no óptimas pueden ser alta densidad celular y agotamiento de nutrientes. El aumento de expresión en cultivo celular con alta densidad celular y agotamiento de nutrientes se puede medir ensayando la actividad del anticuerpo terapéutico durante un periodo de aproximadamente 3 días.
En otras proteínas de fusión adecuadas con el fragmento modificado de la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 23, el polipéptido heterólogo puede comprender la hormona del crecimiento de tipo insulina 1 (IGF-1). Esas proteínas de fusión se pueden caracterizar por tener un aumento de expresión en cultivo celular en comparación con la hormona del crecimiento de tipo insulina 1 (IGF-1) de tipo salvaje (hormona del crecimiento de tipo insulina 1 (IGF-1) con la secuencia de señalización de la hormona del crecimiento de tipo insulina 1 (IGF-1) nativa). El aumento de la expresión en cultivo celular se puede medir ensayando la actividad de la hormona del crecimiento de tipo insulina 1 (IGF-1) durante un periodo de aproximadamente 3 días. El cultivo celular puede también estar bajo condiciones de cultivo celular no óptimas. Las condiciones de cultivo celular no óptimas pueden ser alta densidad celular y agotamiento de nutrientes. El aumento de la expresión en cultivo celular con alta densidad celular y agotamiento de nutrientes se puede medir ensayando la actividad de la hormona del crecimiento de tipo insulina 1 (IGF-1) durante un periodo de aproximadamente 3 días.
Un vector de expresión de proteínas adecuado puede comprender un promotor operativamente enlazado a una primera secuencia de ADN que codifica una secuencia de señalización de polipéptidos, que comprende un fragmento modificado de la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20, SEQ ID nO: 21, SEQ ID NO: 22 o SEQ iD NO: 23 y una segunda secuencia de ADN que codifica un polipéptido heterólogo, que se fusiona en marco a la primera secuencia de ADN. La segunda secuencia de ADN puede codificar p-glucocerebrosidasa.
Un vector de expresión de proteínas adecuado puede comprender un promotor operativamente enlazado a una primera secuencia de ADN que codifica una secuencia de señalización de polipéptidos, que comprende un fragmento modificado de proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 o s Eq ID NO: 23 y una segunda secuencia de ADN que codifica un polipéptido heterólogo, que se fusiona en marco a la primera secuencia de ADN. La segunda secuencia de ADN puede codificar una a-glucosidasa ácida.
Un vector de expresión de proteínas adecuado puede comprender un promotor operativamente enlazado a una primera secuencia de ADN que codifica una secuencia de señalización de polipéptidos, que comprende un fragmento modificado de una proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 23 y una segunda secuencia de ADN que codifica un polipéptido heterólogo, que se condensa en marco a la primera secuencia de ADN. La segunda secuencia de ADN puede codificar otras proteínas heterólogas como a-galactosidasa ácida. El polipéptido heterólogo puede ser también proinsulina. El polipéptido heterólogo puede ser también la hormona del crecimiento de tipo insulina 2 (IGF-2) o la hormona del crecimiento de tipo insulina 1 (IGF-1). El polipéptido heterólogo puede ser también interferón. El polipéptido heterólogo puede ser también un anticuerpo terapéutico. El polipéptido heterólogo puede ser también cualquier otra proteína que sea segregada fuera de las células.
Un método adecuado de producir un polipéptido puede comprender expresar una proteína de fusión con el fragmento modificado de la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana operativamente enlazado a un polipéptido heterólogo y recuperar dicho polipéptido heterólogo. El método de producir un polipéptido se puede llevar a cabo en células cultivadas. Las células cultivadas pueden ser células de levadura o células mamíferas. El método para producir un polipéptido se puede llevar a cabo en un sistema transgénico. Ese sistema transgénico puede comprender vacas, cabras, ovejas, conejos o cualquier combinación de
estos. La recuperación del sistema transgénico puede provenir de la leche. El sistema transgénico puede además comprender pollos. La recuperación del sistema transgénico puede provenir de huevos.
Un método adecuado para elaborar un vector de expresión de proteínas puede comprender enlazar un promotor operativamente unido a una primera secuencia de ADN que codifica una secuencia de señalización de polipéptidos que comprende un fragmento modificado de una proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana y condensar en marco una segunda secuencia de ADN que codifica un polipéptido heterólogo a la primera secuencia de ADN. El método para elaborar un vector de expresión de proteínas puede también tener una primera secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20, s Eq ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 23. El método para elaborar un vector de expresión de proteínas puede también tener una segunda secuencia de ADN que codifica p-glucocerebrosidasa ácida, a-galactosidasa ácida, a-glucosidasa ácida, proinsulina, hormona del crecimiento de tipo insulina 2 (IGF-2), interferón, anticuerpo terapéutico u hormona del crecimiento de tipo insulina 1 (IGF-1) u otras proteínas que se segregan fuera de las células.
Un método adecuado de incrementar la expresión de proteínas puede comprender expresar una proteína de fusión que comprende un fragmento modificado de la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana y una proteína heteróloga, y recuperar la proteína heteróloga.
Un método adecuado de aumentar la segregación de proteínas puede comprender expresar una proteína de fusión que comprende un fragmento modificado de proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana y una proteína heteróloga, y recuperar la proteína heteróloga.
Ejemplo 1
Reactivos
ADNc de p-glucocerebrosidasa humana de tipo salvaje (''GlcCerase'') (NM_000157.3), ADNc de a-galactosidasa ácida humana de tipo salvaje A (GLA) NM_000169.2), ADNc de a-glucosidasa ácida humana de tipo salvaje (GAA) (NM_000152.2) y ADNc factor de crecimiento de tipo insulina humana de tipo salvaje 2 (IGF-2) (Nm_000612.4) se adquirieron todos de Origene™ (Rockville, MD) mientras que todos los cebadores de oligonucléotidos y minigenes sintéticos eran de Integrated ADN Technologies™ (IDT™; Coralville, IA). El vector de expresión mamífero pEF6/V5-HisA, medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), suero bovino fetal (FBS) y otros reactivos de cultivo de tejido se obtuvieron de Invitrogen™ (Carlsbad, CA). Las endonucleasas de restricción, Phusion-HF ADN polymerase™, T4 ADN ligasa, fosfatasa Antarctic, E. coli químicamente competente (células DH5a) se adquirieron todos de New England Biolabs™ (Ipswich, MA). Los sustratos fluorogénicos para diversas glucosidasas se adquirieron de Research Products International™ (Mt. Prospect, IL), los kits ADN Gel Extraction y Miniprep ADN eran de QIAGEN™ (Valencia, CA), el kit PureYield Maxiprep ADN™ era de Promega™ (Madison, WI). A menos que se indique otra cosa, las sustancias químicas eran de Sigma™ (St. Louis, MO), el reactivo de transfección Fugene-HD™ era de Roche™ (Indianápolis, IN), las células de riñón embrionario humano transformadas con el antígeno T (HEK293T) eran de ATCC™.
Ejemplo 2
Construcción de plásmidos
Se construyeron plásmidos de ADN para codificar distintas proteínas modelo que contenían o bien sus secuencias de señalización nativas o reemplazadas con las secuencias de señalización Bip humanas para evaluar el efecto de estas secuencias de señalización sobre la expresión y segregación de proteínas de ensayo.
Para evaluar la p-glucocerebrosidasa ácida humana (GlcCerase, EC 3.2.1.45), se construyeron varios plásmidos de ADN diferentes para codificar GlcCerase de tipo salvaje o bien con su secuencia de señalización nativa o con la secuencia de señalización Bip humana o una secuencia de señalización Bip modificada. Para generar GlcCerase humana de tipo salvaje con su secuencia de señalización nativa, se amplió todo el ADNc de GlcCerase humana por PCR mediante Phusion-HF ADN polymerase™ usando los cebadores 1 y 2 (Tabla I) y un clon de ADNc de GlcCerase (NM_000157.3, Origene). El cebador 1 se construyó para contener un sitio de restricción 5' Bgl II y un sitio de restricción EcoRI interno que precedió inmediatamente a la secuencia GlcCerase Kozak nativa, mientras que el cebador 2 contenía los sitios de restricción 3' NheI y NotI que sucedieron al codón de finalización para permitir la clonación del producto de PCR en vectores de expresión mamífera. El producto PCR de ~1,6 kilobases (kb) (A) se separó y escindió de 1% (p/v) gel preparativo de agarosa y se aisló empleando el kit QIAGEN™'s Gel Extraction kit™. El producto de PCR A se digirió posteriormente durante la noche con las endonucleasas de restricción Bgl II y NotI a 37°C, se re-purificó y se ligó en el vector de expresión mamífera pEF6/V5-HisA (Invitrogen™) que había sido previamente digerido con BamHI y Not I y desfosforilado con fosfatasa Antarctic usando T4 ADN ligasa. El sitio de restricción Bgl II se incorporó al cebador 1 de modo tal que la ligadura del producto de pCR GlcCerase digerido con Bgl II en el sitio BamHI compatible del vector pEF6/V5-HisA eliminó el sitio de restricción BamHI dentro del sitio de clonación múltiple, y este vector de expresión modificado se denominará en lo sucesivo en este documento pEF6'. Este constructo de ADN, diseñado como pHD101, se usó para transformar células de E. coli químicamente competentes, y las colonias bacterianas resistentes a ampicilina individuales se expandieron y estudiaron por reacciones de digestión de restricción usando EcoRI yNheI, y con BamHI, respectivamente. Un ADN plasmídico
correcto del clon 4 (designado como pHD101.4) se verificó adicionalmente por secuenciación de ADN y se seleccionó para expresión de GlcCerase de tipo salvaje. Se usó pHD101.4 para construir otros plásmidos que codifican GlcCerase de tipo salvaje o bien con la secuencia de señalización Bip humana o versiones modificadas de esta secuencia de señalización Bip en lugar de la secuencia de señalización GlcCerase nativa. En síntesis, se construyó un minigen de ADN bicatenario (designado como minigen 1 en la Tabla II) (y se sintetizó por Integrated ADN Technologies™, IDT™) para contener la secuencia Kozak nativa del gen de oxidasa alcohólica de levadura 1 (AOX1), el gen de toda la secuencia de señalización Bip humana nativa de 18 residuos (incluida su secuencia de reconocimiento de peptidasa de señalización natural: Ser-Ala-Ala-Arg-Ala; SAARA (SEQ ID NO:24)) y los 123 residuos de aminoácidos N-terminales de GlcCerase humana madura de tipo salvaje (nucleótidos 118-490). El minigen 1 también contenía un sitio de restricción 5' EcoRI que precedía la secuencia AOX1 Kozak y un sitio NcoI natural dentro del gen de GlcCerase en el extremo 3' para permitir la clonación en pHD101.4 para reemplazar la secuencia de señalización GlcCerase nativa con la secuencia de señalización Bip humana. Asimismo, esta estrategia permite la construcción de plásmidos de ADN para expresión de GlcCerase de tipo salvaje (con la secuencia de señalización Bip) o bien en sistemas mamíferos o de levadura (que están bajo el control del promotor AOX1 inducible). El diseño de esta y otras proteínas de fusión utilizó el programa de análisis SignalP 4.0™ para pronosticar si la secuencia de señalización Bip se escindiría de la proteína de ensayo.
Se añadieron residuos de aminoácidos adicionales a los constructos según fue necesario para facilitar la escisión de la secuencia de señalización, y solamente las secuencias que se pronosticó que tendrían escisión de la secuencia de señalización correcta se seleccionaron para generar estas proteínas de ensayo de fusión. Para expresión en sistemas mamíferos, el fragmento de ADN Bip-GlcCerase que contenía la secuencia Bip Kozak humana nativa se sintetizó vía PCR usando los cebadores 3 y 4, y el molde de ADN minigen 1. Este producto de PCR de ~440 bp (B) se separó y escindió de gel preparativo de agarosa al 1% (p/v) y se aisló usando el kit de extracción de gel de QIAGEN. El producto de PCR B se digirió durante la noche con las endonucleasas de restricción EcoRI y Nco I, se re-purificó y ligó con el fragmento de ADN NcoI—Not I de pHD101.4 que codifica los residuos de aminoácidos 124 497 de GlcCerase de tipo salvaje madura (carece de la secuencia de señalización GlcCerase nativa) y el fragmento de ADN de ~ 5,8 kb del vector EcoRI—Not I pEF6' como se describió previamente. Este constructo de ADN, designado pHD201, se verificó por digestión de restricción usando EcoRI-Xba I, y se verificó un clon correcto (pHD201.2) por secuenciación de ADN y posteriormente se usó para evaluar los efectos de la secuencia de señalización Bip humana sobre la expresión y segregación de GlcCerase de tipo salvaje. De modo similar, se construyó una versión modificada de la secuencia de señalización Bip (minigen 2) y se sintetizó por IDT™ para contener la secuencia Kozak nativa del gen de levadura AOX1, los primeros 13 residuos de la secuencia de señalización Bip humana seguidos de una repetición de los residuos de aminoácidos 4-13, la secuencia de reconocimiento de peptidasa de señalización Bip nativa (residuos 14-18) y los 123 residuos N-terminales de GlcCerase humana madura de tipo salvaje (nucleótidos 118-490). Esta modificación de la secuencia de señalización Bip (designada como secuencia de señalización Bip modificada 1) expandió el dominio hidrófobo de manera que abarcara toda la membrana del ER y alargara la secuencia de señalización de 18 a 28 residuos. Para expresión en sistemas mamíferos, el ADN de la secuencia de señalización Bip modificada -1-GlcCerase que contenía el fragmento de la secuencia Bip Kozak humana nativa se sintetizó por PCR usando los cebadores 3 y4, y el molde de ADN del minigen 2. Este producto de PCR de ~470 bp (C) se aisló de gel preparativo de agarosa al 1% (p/v), se digirió con EcoRI y Nco I, se re-purificó y ligó con el fragmento de ADN Nco I—^Not I de pHD101.4 que codifica los residuos de aminoácidos 124-497 de GlcCerase de tipo salvaje madura (carece de la secuencia de señalización GlcCerase nativa) y el fragmento de ADN del vector de ~ 5,8 kb EcoRI—Not I pEF6' como anteriormente. Este constructo de ADN, designado pHD204, se verificó por digestión de restricción usando EcoRI y Xba I, y se confirmó un clon correcto (pHD204.1) por secuenciación de ADN y posteriormente se usó para evaluar los efectos de esta secuencia de señalización Bip modificada sobre la expresión y segregación de GlcCerase de tipo salvaje.
Los cebadores utilizados en este documento para preparar los constructos de ADN se resumen en la Tabla 1.
Tabla 1
La señal Bip modificada 1 se anexó posteriormente a otras proteínas para evaluar sus efectos sobre la expresión y segregación. En síntesis, se construyó el minigen 3 (Tabla II) para contener los primeros 13 residuos de la secuencia de señalización Bip humana seguido de una repetición de los residuos de aminoácidos 4-13 y los residuos 14-17 de la secuencia de reconocimiento de peptidasa de señalización Bip nativa. El minigen 3 contenía la secuencia Kozak nativa de Bip humana, además de los sitios de restricción 5' EcoRI, 3' Stu I y Not I. Stu I se incorporó al minigen 3, dado que esta enzima de restricción produce un extremo 3' romo después de AGG (codón para arginina, Arg; R) que sirve como el Arg natural en el residuo 17 de la secuencia de escisión de peptidasa de señalización Bip nativa. Por lo tanto, cualquier proteína puede ligarse a este fragmento modificado de la secuencia de señalización Bip siempre que se añada una alanina adicional a la secuencia de la proteína en el término N a fin de completar la secuencia de reconocimiento de peptidasa de señalización SAARA natural (SEQ ID NO: 24).
Las secuencias de nucleótidos de ADN de los minigenes para secuencias de señalización Bip y Bip modificada se resumen en la Tabla 2.
Tabla 2
* Minigen 1 (Bip-GIcCerase humana nativa) SEQ ID NO:13:
Secuencia de nucleótidos (hebra sentido, 5’^ 3):
acggaaítcgaaacgatgaagctctccctggtggccgcgatgctgctgctgctcagcgcggcgcgggccgcccgcccctgca tccctaaaagcttcggctacagctcggtggtgtgtgtctgcaatgccacatactgtgactcctttgaccccccgacctttcctgccct tggtaccttcagccgctatgagagtacacgcagtgggcgacggatggagctgagtatggggcccatccaggctaatcacacgg gcacaggcctgctactgaccctgcagccagaacagaagttccagaaagtgaagggatttggaggggccatgacagatgctgct gctctcaacatccttgccctgtcaccccctgcccaaaatttgctacttaaatcgtacttctctgaagaaggaatcggatataacatca tccgggtaccc.'aíggcc
Minigen 2 (Secuencia de señalización Bip modificada 1 GlcCerase) SEQ ID NO: 14:
Secuencia de nucleótidos (hebra sentido, 5’^ 3):
a c£ g fla» c£aaac£atgaa£Ctotccct££t££CC£Cgat£Ct£Ct£Ct£Ctca£Cctggtggccgcgatgctgctgctgctcagc£ cggcgcgggccgcccgcccctgcatccctaaaagcttcggctacagctcggtggtgtgtgtctgcaatgccacatactgtgact cctttgaccccccgacctttcctgcccttggtaccttcagccgctatgagagtacacgcagtgggcgacggatggagctgagtat ggggcccatccaggctaatcacacgggcacaggcctgctactgaccctgcagccagaacagaagttccagaaagtgaaggg atttggaggggccatgacagatgctgctgctctcaacatccttgccctgtcaccccctgcccaaaatttgctacttaaatcgtacttc tctgaagaaggaatcggatataacatcatccgggtacratíggcc
Minigen 3 (Secuencia de señalización Bip modificada 1) SEQ ID NO:15:
Secuencia de nucleótidos (hebra sentido, 5’^ 3):
acggaaí/cgcaagatjjaagctctccctggtggccgcgatgctgctgctgctcagcctggtggccgcgatgctgctgctgctca gcgcggcgaggcctgeggccgc
Minigen 4 (Secuencia de señalización Bip modificada 2) SEQ ID NO: 16:
Secuencia de nucleótidos (hebra sentido, 5 '^ 3):
ggííicrgaañegctggcaagatgaagctctccctggtggccgcgatgctgctgctgctctgggtggcactgctgctgctcagc gcggcgaggccttcUiga
Minigen 5 (Secuencia de señalización Bip modificada 3) SEQ ID NO 17:
Secuencia de nucleótidos (hebra sentido, 5’^ 3’):
ggí«í.rg«a»í:gctggcaagatgaagctctccctggtggccgcgatgctgctgctgctctccctggtggccctgctgctgctca gcgcggcg aggccttctagu
Minigen 6 (Secuencia de señalización Bip modificada 4) SEQ ID NO 18:
Secuencia de nucleótidos (hebra sentido, 5 '^ 3'):
ggmccgttflftrgctggcaagatgaagctctccctggtggccgcgatgctgctgctgctcgcactggtggccctgctgctgctc agcgcggcg aggccttctaga
*El codón de inicio ATG se muestra en negrita, mientras que la secuencia de consenso Kozak está subrayada. Las secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción se muestran en cursiva.
Para evaluar la a-galactosidasa ácida A (GLA, EC 3.2.1.22), la enzima de tipo salvaje con su secuencia de señalización nativa se amplió por PCR usando los cebadores 5 y 6 con el molde de ADN del clon de ADNc GLA (NM_000169.2, Origene™). Este producto de PCR de ~1,3 kb se aisló por gel preparativo de agarosa, se digirió con EcoRI y Not I y se ligó al EcoRI-Not I digerido, pEF6' desfosforilado. Este constructo de ADN se designó pHD214 y se usó para evaluar la expresión de GLA. Para construir GLA con la secuencia de señalización Bip modificada 1, la enzima GLA madura se sintetizó por PCR usando los cebadores 6 y 7 con el ADN molde del clon de ADNc GLA. Este producto de PCR de ~1,2 kb (D) se digirió con Not I, se aisló de gel preparativo de agarosa y se ligó al fragmento de ADN del minigen 3 EcoRI->Stu I y al vector pEF6’ digerido con EcoRI-Not I como anteriormente. Este constructo de ADN designado pHD215 se usó para evaluar los efectos de esta secuencia de señalización Bip modificada sobre la expresión y segregación de GLA de tipo salvaje.
Para evaluar la a-glucosidasa ácida a (GAA, EC 3.2.1.0), se amplió toda la enzima GAA de tipo salvaje (con su secuencia de señalización nativa) por PCR usando los cebadores 8 y 9 con el molde de ADN del clon de ADNc GAA (NM_000152.2, Origene). Este producto de PCR de ~3 kb (E) se aisló con gel preparativo de agarosa, se digirió con EcoRI y Not I, y se ligó a EcoRI-Not I digerido, pEF6' desfosforilado. Este constructo de ADN designado pHD217 se usó para evaluar la expresión de GAA con su secuencia de señalización nativa. Ya que GAA se expresa con múltiples pro-secuencias que preceden a la enzima madura (Moreland et al., 2005), se sintetizaron distintas proteínas GAA con longitudes variables y se anexaron a la secuencia de señalización Bip modificada 1 para ensayo. Un fragmento de ADN GAA que carece de su secuencia de señalización nativa pero que contiene los residuos 24 952 se sintetizó por PCR usando los cebadores 9 y 10. Este producto de PCR de ~3 kb (F) se aisló de gel preparativo de agarosa y se digirió con Not I y se ligó al fragmento de ADN del minigen 3 EcoRI^Stu I y al vector pEF6’ digerido con EcoRI-Not I. Este constructo de ADN que contenía la secuencia de señalización Bip modificada 1 y GAA (24-952) se designó pHD218. De modo similar, un fragmento de ADN A GAA que carece de su secuencia de señalización nativa pero que contiene los residuos 57-952 se sintetizó por PCR usando los cebadores 9 y11. Este producto de PCR de ~2,9 kb (G) se aisló de gel preparativo de agarosa y se digirió con Not I y se ligó al fragmento de ADN del minigen 3 EcoRI^Stu I y al vector pEF6’ digerido con EcoRI-Not I como anteriormente. Este constructo de ADN que contenía la secuencia de señalización Bip modificada 1 y GAA (57-952) se designó pHD219. El fragmento de ADN A GAA que carece de su secuencia de señalización nativa pero que contiene los residuos 78 952 se sintetizó por PCR usando los cebadores 9 y 12. Este producto de PCR de ~2,8 kb (H) se aisló de gel preparativo de agarosa y se digirió con Not I y se ligó al fragmento de ADN del minigen 3 EcoRI^Stu I y al vector pEF6’ digerido con EcoRI-Not I. Este constructo de ADN que contenía la secuencia de señalización Bip modificada 1 y GAA (78-952) se designó pHD220. Los efectos de esta secuencia de señalización Bip modificada 1, así como también las pro-secuencias sobre la expresión y segregación de GAA pueden por lo tanto examinarse cautelosamente usando los constructos de ADN pHD217-220.
Se diseñaron otras secuencias de señalización Bip modificadas (Tabla III) derivadas de la secuencia de señalización Bip modificada 1 y se evaluarán para determinar si estas modificaciones adicionales pueden además mejorar la expresión y segregación de proteínas. Estas modificaciones incluyen el reemplazo de residuos serina y leucina en las posiciones 14 y15 con un solo residuo triptófano, y la eliminación de residuos alanina y metionina en las posiciones 18 y19 dentro del dominio hidrófobo (designado secuencia de señalización Bip modificada 2), eliminación de residuos alanina y metionina en las posiciones 18 y19 dentro del dominio hidrófobo (designado secuencia de señalización Bip modificada 3) y reemplazo de un residuo serina en la posición 14 con alanina y eliminación de residuos alanina y metionina en las posiciones 18 y 19 dentro del dominio hidrófobo (secuencia de señalización Bip modificada 4). Estas modificaciones tuvieron como propósito aumentar la hidrofobicidad del dominio hidrófobo, lo cual puede potenciar más las interacciones de estas secuencias de señalización con proteínas translocón del ER y ribosomales clave, y crear un sitio de escisión de peptidasa de señalización más eficiente para mejorar la translocación y segregación de proteínas para proteínas recombinantes.
Otras proteínas de ensayo, incluidas insulina humana, factor de crecimiento de tipo insulina 2 (IGF-2), anticuerpos, interferones, apolipoproteínas, etc. serán también evaluados para determinar si estas secuencias de señalización Bip modificadas mejorarían su expresión y segregación.
Las secuencias de aminoácidos para secuencias de señalización Bip modificadas se resumen en la Tabla 3.
Tabla 3
Ejemplo 3
Expresión transitoria de proteínas de ensayo
Para los experimentos de expresión transitoria se dispusieron células HEK293T en placas de cultivo de tejido de 12 pocillos con 1 ml de medio DMEM enriquecido con FBS al 10% y se incubaron a 37°C con 5% atmósfera CO2. Cuando las células HEK293T alcanzaron 70-100% confluencia, el medio consumido se reemplazó con 1 ml de medio DMEM/10% FBS fresco y cada pocillo se transfectó con 1 pg de ADN plasmídico para proteínas de ensayo individuales o PBS (para un control negativo transfectado de manera simulada) y 3 pl de reactivo de transfección Fugene™-HD de acuerdo al protocolo de fabricación. Se incubaron células transfectadas durante 24-72 horas y se controlaron a diario para expresión de la enzima recombinante individual (segregada en el medio) mediante ensayos de actividad enzimática y/o Western blotting y ELISA.
Ejemplo 4
Ensayos de actividad enzimática
La expresión y segregación de p-glucocerebrosidasa (GlcCerase) ácida humana recombinante en medio de cultivo celular se determinó con ensayos de actividad enzimática usando medio acondicionado a partir de experimentos de transfección transitoria después de 24, 48 o a aproximadamente 72 horas, y sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferilp-D-glucopiranósido (4-MU-p-Glc). En síntesis, se cosecharon 20 pl de medio acondicionado de cada muestra en los puntos de tiempo indicados y se diluyeron con 80 pl de tampón McIlvane (tampón MI: citrato sódico/fosfato sódico 50 mM (pH 5,2)/0,25% (v/v) Triton X-100/0,25% (p/v) taurocolato sódico) en tubos microcentrífugos de 0,5 ml. Se dividieron en alícuotas 25 pl de cada muestra diluida en pocillos individuales de placas de fondo claro de 96 pocillos (por triplicado) y se añadieron 50 pl de sustrato 4-MU-p-Glc 6 mM (preparado en tampón MI) a cada pocillo mediante una pipeta de múltiples canales. Las placas después se sellaron con cinta y se incubaron a 37°C durante 1 h. Las reacciones enzimáticas se detuvieron añadiendo 125 pl de NaOH 0,1 M y la fluorescencia de 4-MU liberada se leyó en una lectora de placas de fluorescencia usando longitudes de onda de 355 nm de excitación y 460 nm de emisión, respectivamente. La fluorescencia de 4-MU de la muestra transfectada de manera simulada sirvió como control de "fondo" y se sustrajo de todas las muestras de GlcCerase.
Se midió la expresión y segregación de a-glucosidasa (GAA) ácida humana recombinante con ensayos de actividad enzimática usando medio acondicionado a partir de experimentos de transfección transitoria después de 24, 48 o 72 horas, y el sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-a-D-glucopiranósido (4-MU-a-Glc). Concretamente, se cosecharon 20 pl de medio acondicionado de cada muestra en distintos puntos de tiempo y se diluyeron con 80 pl de tampón de acetato sódico 50 mM (pH 4,0) en tubos microcentrífugos de 0,5 ml. Se dividieron en alícuotas 25 pl de cada muestra diluida en pocillos individuales de placas con fondo claro de 96 pocillos (por triplicado) y se añadieron 50 pl de sustrato 4-MU-a-Glc 6 mM (preparado en tampón de acetato sódico 50 mM, pH 4,0) a cada pocillo mediante una pipeta de múltiples canales. Las placas luego se sellaron con cinta y se incubaron a 37°C durante 1 h. Las reacciones enzimáticas se detuvieron añadiendo 125 pl de NaOH 0,1 M, y la fluorescencia de 4-MU liberada se leyó en una lectora de placas usando longitudes de onda de 355 nm de excitación y 460 nm de emisión, respectivamente. La fluorescencia de 4-MU de la muestra transfectada de manera simulada sirvió como el control de "fondo" y se sustrajo de todas las muestras de GAA.
Se mide la expresión y segregación de a-galactosidasa (GLA) humana ácida recombinante usando medio acondicionado a partir de experimentos de transfección transitoria después de 24, 48 o 72 horas, y el sustrato
fluorogénico 4-metilumbeliferil-a-D-galactopiranósido (4-MU-a-Gal). Concretamente, 20 gl de medio acondicionado de cada muestra se cosecharon en distintos puntos de tiempo y se diluyeron con 80 gl de tampón 50 mM de citrato sódico/fosfato sódico (pH 4,6) en tubos microcentrífugos de 0,5 ml. Se dividieron en alícuotas 25 gl de cada muestra diluida en pocillos individuales de placas con fondo claro de 96 pocillos (por triplicado) y se añaden 50 gl de sustrato 4-MU-a-Gal 8 mM (preparado en 50 mM de tampón citrato sódico/fosfato sódico, pH 4,6) a cada pocillo de una pipeta de múltiples canales. Las placas se sellan con cinta y se incuban a 37°C durante 1 h. Las reacciones enzimáticas se detienen añadiendo 125 gl de NaOH 0,1 M y la fluorescencia de 4-MU liberada se lee en una lectora de placas de fluorescencia usando longitudes de onda de 355 nm de excitación y 460 nm de emisión, respectivamente. La fluorescencia de 4-MU de la muestra transfectada de manera simulada sirve como el control de "fondo" y se sustrae de todas las muestras de GLA.
Ejemplo 5
Se reconoció que ciertas proteínas se expresan naturalmente en muy altos niveles mientras que otras se expresan poco. Si bien la abundancia y estabilidad del ARNm son factores importantes a nivel de la transcripción, que pueden afectar la expresión de las proteínas, está cada vez más claro que las secuencias de señalización también cumplen funciones críticas al nivel de la proteína y contribuyen a la expresión dispar de proteínas. La proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana tiene características específicas que serían particularmente ventajosas para desarrollar secuencias de señalización superiores para mejorar la expresión y segregación de proteínas recombinantes. Se preparó una secuencia de señalización Bip modificada y se anexó a una proteína modelo para determinar si esta secuencia de señalización no natural mejoraría la expresión y segregación de proteínas para la proteína modelo. Concretamente, el núcleo hidrófobo se alargó para formar una estructura ahelicoidal más larga. Se pronostica que el alargamiento del dominio hidrófobo en la secuencia de señalización Bip modificada 1 tendría varias ventajas. Primero, el dominio hidrófobo modificado (más largo) formaría una a-hélice más larga y abarcaría todo el túnel de salida ribosomal que puede identificarse fácilmente mediante la proteína ribosomal Rpl17 a fin de facilitar mejores interacciones con otras proteínas del ER clave tales como las subunidades Sec61, y RAMP4. En segundo lugar, un dominio hidrófobo a-helicoidal más largo puede permitir que esta secuencia de señalización Bip modificada interactúe con las proteínas translocón tales como TRAM y las subunidades Sec61 para ayudar eficientemente a orientar el polipéptido naciente en el poro translocón a fin de promover la orientación del bucle competente con la translocación de proteínas necesaria. En tercer lugar, un dominio hidrófobo a-helicoidal más largo puede permitir que esta secuencia de señalización Bip modificada se traslade fuera del poro del translocón acuoso y hacia la bicapa de lípidos más eficientemente, de modo tal que pueda escindirse por la peptidasa de señalización a una velocidad más rápida. En cuarto lugar, una secuencia de señalización Bip modificada puede trasladarse fuera del translocón a una mayor velocidad para permitir que la proteína recombinante interactúe con otras proteínas importantes tales como las proteínas chaperonas del Er tales como Bip, proteína isomerasa disulfuro y calnexina más pronto durante su síntesis para mejorar el pliegue de las proteínas. Todos y cada uno de estos beneficios potenciales mejoraría la velocidad de expresión de la proteína, el plegado y la exportación de las células.
Se pueden efectuar otras modificaciones que incluyen añadir residuos cargados a regiones flanqueantes del dominio hidrófobo extendido para potenciar más su hidrofobicidad y ayudar correctamente a orientar la secuencia de señalización en el translocón. Estas modificaciones tienen como propósito potenciar las interacciones de las secuencias de señalización con ciertas proteínas ribosomales, particularmente Rp117, que a su vez incrementarían las interacciones con las proteínas translocón Sec61p, RAMP4 y TRAM para mejorar la translocación de proteínas, la expresión y segregación de proteínas.
Se generaron varios constructos de ADN diferentes que codifican GlcCerase humana de tipo salvaje para contener o bien la secuencia de señalización GlcCerase nativa (WT GlcCerase) o la secuencia de señalización Bip humana (CBP201 GlcCerase) o la nueva secuencia de señalización Bip modificada 1 (CBP204 GlcCerase). Estos constructos (1 gg) se ensayaron con experimentos de expresión transitoria en la línea de células humanas (HEK293T) que estuvo en confluencia de ~80%. Se cosechó el medio de cultivo celular acondicionado (20 gl) a diario durante un curso de tiempo de 72 horas y se ensayó para actividad enzimática de GlcCerase usando el sustrato fluorogénico de 4-MU-p-glucosa a fin de evaluar los efectos de las secuencias de señalización sobre la expresión y segregación de GlcCerase. Como se puede observar en la Figura 1, ambas secuencias de señalización pueden promover la expresión y segregación de GlcCerase en el medio de cultivo celular. No obstante, se observó que la secuencia de señalización Bip modificada genéticamente 1 (en CBP204 GlcCerase) produce el doble de actividad de GlcCerase en relación a WT GlcCerase 72 horas post-transfección. Se observó la actividad basal del control negativo transfectado de manera simulada (vector vacío) y se confirmó que el aumento de la actividad enzimática resultó de la expresión de GlcCerase recombinante. Múltiples experimentos de transfección (n >3) confirmaron que la nueva secuencia de señalización aumentó la expresión y segregación de GlcCerase.
Ejemplo 6
La síntesis de proteínas se ve altamente afectada por la disponibilidad de nutrientes (es decir, ATP, aminoácidos, carbohidratos, etc.) además de otros componentes celulares esenciales (p. ej., factores de inicio y estiramiento, ARNt, proteínas chaperonas, etc.). Los primeros se pueden aumentar o reponer con medio de cultivo durante la re alimentación mientras que los segundos componentes son limitados en las células y no pueden enriquecerse
durante la producción de proteínas. El agotamiento de estos componentes vitales causa estrés celular importante que resulta en la reducción o incluso en la suspensión de nuevas síntesis de proteínas para la mayoría de las proteínas. Cabe destacar que la expresión de algunas proteínas se mantiene y realmente aumenta durante estos periodos estresantes como parte de una respuesta celular adaptativa para ayudar a las células a retornar a la homeostasis. No está del todo claro cómo estas proteínas selectas son distinguidas por la maquinaria de síntesis de proteínas celulares para permitir su expresión preferencial, pero se cree que las secuencias de señalización cumplen una función importante en este proceso. Ya que Bip es una proteína chaperona del ER importante cuya expresión se mantiene durante este periodo estresante para ayudar a reestablecer la homeostasis celular, pronosticamos que esta secuencia de señalización Bip modificada permitiría que la expresión preferencial de la proteína recombinante heteróloga se mantuviera bajo condiciones en las que la expresión de otras proteínas se reduce o suprime. Para ensayar esta hipótesis, transfectamos cultivos de células KEK293T a una alta densidad celular (~100% confluentes) con WT GlcCerase y CBP204 GlcCerase y se vigiló su expresión y segregación durante un periodo de 63 horas. Asimismo, el medio de cultivo celular no cambió durante el experimento para agotar nutrientes (durante las etapas tardías del experimento para imitar periodos de pocos nutrientes durante las aplicaciones de lotes antes de la re alimentación) con el propósito de determinar si la expresión de WT GlcCerase y CBP204 GlcCerase cambia en respuesta al agotamiento de nutrientes.
Nuestros resultados demuestran que bajo condiciones experimentales, CBP204 GlcCerase que contiene la secuencia de señalización Bip modificada 1 se expresó mejor que WT GlcCerase con su secuencia de señalización nativa durante el periodo de 63 horas, como se muestra en la Figura 2. Los niveles de CBP204 GlcCerase fueron 1,9 veces más altos que WT GlcCerase después de 24 horas, 2,1 veces más altos después de 48 horas y 2,5 veces más altos después de 63 horas. Si se extrapola a 72 horas, CBP204 GlcCerase sería 3,3 veces superior que WT GlcCerase. Cabe destacar que la expresión deCBP204 GlcCerase se mantuvo a una velocidad casi constante en donde hubo una duplicación de la proteína segregada después de cada día. En contraste, la velocidad de expresión de WT GlcCerase se ralentizó significativamente en puntos de tiempo posteriores. Esta diferencia fue más evidente cuando se comparó la forma de las curvas de expresión para estas dos enzimas - una curva prácticamente lineal para CBP204 GlcCerase y una curva no lineal para WT GlcCerase a medida que la velocidad de expresión se estabilizaba en puntos de tiempo posteriores. Estos datos demuestran la expresión diferencial de CBP204 GlcCerase y WT GlcCerase, supuestamente en respuesta al agotamiento de nutrientes, y esta divergencia se incrementaría más con incubaciones más prolongadas. Ya que la única diferencia entre CBP204 GlcCerase y WT GlcCerase es la secuencia de señalización, estos datos respaldan la hipótesis de que la secuencia de señalización Bip modificada 1 permitió la expresión preferencial durante condiciones de cultivo celular no óptimas.
Ejemplo 7
Para ensayar los efectos de la secuencia de señalización Bip modificada 1 sobre la expresión y segregación de una proteína modelo diferente, se construyeron plásmidos de ADN para codificar a-glucosidasa (GAA) ácida humana de tipo salvaje que contenían o bien su secuencia de señalización de GAA nativa (WT GAA) o la secuencia de señalización Bip genéticamente modificada 1 y los residuos de aminoácidos 24-952 de GAA (designados CBP218 GAA). Estos constructos de ADN se ensayaron por expresión transitoria en HEK293T durante un periodo de ~2 días para comparar directamente los efectos de estas secuencias de señalización sobre la expresión y segregación de GAA de tipo salvaje. Como se puede observar en la Figura 3, CBP218 GAA tuvo una actividad de GAA segregada 2,5 superior en el medio que WT GAA 43 horas después de la transfección. Se observó la actividad basal para el control negativo transfectado de manera simulada (vector vacío) y se confirmó que la actividad enzimática observada en el medio resultó de la expresión de GAA recombinante. Estos resultados demuestran que la secuencia de señalización Bip modificada 1 (en CBP218 GAA) aumentó significativamente la expresión y segregación de GAA bajo las mismas condiciones experimentales, ya que la única diferencia entre CBP218 GAA y WT GAA es sus secuencias de señalización respectivas.
Ejemplo 8
Ensayos Western blotting y ELISA
La expresión y segregación de las proteínas de ensayo se evaluará por análisis Western blot. En síntesis, se recogerá medio de cultivo acondicionado de experimentos de transfección transitoria después de 24, 48 o 72 horas, y se someterá a electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico poliacrilamida (SDS-PAGE) y posteriormente se transferirá a una membrana de nitrocelulosa. La membrana se bloqueará con 4% (p/v) de leche desnatada en disolución salina tamponada con TRIS/0,1% (v/v) Tween-20 (TBST) durante 1 h a temperatura ambiente con agitación. La membrana se incubará luego con el anticuerpo primario (p. ej., IGF-2 anti-humano de conejo) apropiadamente diluido (p. ej., 1:5000) en 4% (p/v) de leche desnatada en TBST durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4°C con agitación. La mancha se lavará luego con TBST a temperatura ambiente con agitación y múltiples cambios de tampón durante 1 hora. La mancha se incubará luego con un anticuerpo secundario ligado a enzimas (p. ej., anticuerpos anti-conejo de cabra conjugados a peroxidasa de rábano picante) diluido apropiadamente (p. ej., 1:20,000) en 4% (p/v) de leche desnatada en TBST durante 1 h a temperatura ambiente con agitación. La mancha se lavará luego con TBST a temperatura ambiente con agitación y múltiples cambios de tampón durante 1 hora. La mancha luego se incubará con sustrato de quimioluminiscencia durante 5 min a
temperatura ambiente y se visualizará con un sistema de imágenes o por película para evaluar el nivel de expresión de la proteína de ensayo.
De modo similar, la expresión de proteínas de ensayo se puede evaluar por ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA). En síntesis, se recubren placas inmunoabsorbentes de 96 pocillos con 50 gl de anticuerpos primarios (p. ej., IGF-2 anti-humano de conejo) a una concentración de proteína de 5 gg/ml en disolución salina tamponada con TRIS (TBS). Estas placas luego se bloquean con 200 gl de 4% (p/v) de leche desnatada en TBST por 1 hora a temperatura ambiente. Se recoge el medio de cultivo celular acondicionado de los experimentos de transfección transitoria después de 24, 48 o 72 horas y se incuba en estas placas por 1 h a temperatura ambiente. Estas placas luego se lavan con 200 gl TBST a temperatura ambiente con agitación y múltiples cambios de tampón durante 1 hora. Estas placas después se incuban con un anticuerpo secundario ligado a enzimas (p. ej., anticuerpos anti-conejo conjugado a peroxidasa de rábano picante) que ha sido apropiadamente diluido (p. ej., 1:20,000) en TBST por 1 h a temperatura ambiente. Estas placas se lavan con TBST con múltiples cambios de tampón durante 1 h a temperatura ambiente. Estas placas después se incuban con un sustrato colorimétrico (p. ej., 3,3 ',5,5 '-tetrametilbencidina, TMB) durante 5-15 min a temperatura ambiente y se cesa con ácido sulfúrico 0,1 M y se lee en una lectora de placas en la longitud de onda adecuada (p. ej., 450 nm) para determinar la expresión de la proteína de ensayo.
Claims (11)
1. Un método para producir un polipéptido, que comprende:
expresar una proteína de fusión que comprende un fragmento modificado de una secuencia de señalización de un polipéptido de proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina operativamente enlazado a un polipéptido heterólogo, en donde el fragmento modificado de proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; y recuperar el polipéptido heterólogo.
2. El método según la reivindicación 1, en donde el polipéptido heterólogo comprende una o más enzimas, uno o más modificadores de la respuesta biológica, una o más toxinas, uno o más anticuerpos, uno o más fragmentos del polipéptido heterólogo o cualquiera de sus combinaciones.
3. El método según la reivindicación 1 o 2, en donde el polipéptido heterólogo comprende uno o más de los siguientes: p-glucocerebrosidasa ácida, a-glucosidasa ácida, proinsulina, hormona del crecimiento de tipo insulina 2 (IGF-2), interferón, anticuerpo terapéutico y hormona del crecimiento de tipo insulina 1 (IGF-1).
4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el polipéptido heterólogo comprende pglucocerebrosidasa ácida.
5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el polipéptido heterólogo comprende aglucosidasa ácida.
6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el fragmento modificado de la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.
7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el fragmento modificado de la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.
8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el fragmento modificado de la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.
9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el fragmento modificado de la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23.
10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el fragmento modificado de la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana aumenta la expresión del polipéptido heterólogo.
11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el fragmento modificado de la proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina (Bip) humana aumenta la segregación del polipéptido heterólogo.
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