CN112342247B - 一种提高家蚕细胞表达外源蛋白分泌率的方法 - Google Patents
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Abstract
一种提高家蚕细胞表达外源蛋白分泌率的方法，设计并合成用于干扰家蚕BmN细胞中BiP基因的RNAi干扰片段，转染BmN细胞24h后继续转染携带外源基因的表达载体，72h后即可以显著提高外源蛋白的分泌率。该方法操作简单易行，能有效提高家蚕细胞内表达外源蛋白的分泌效率，可在利用BiP等作为分子靶点提高膜蛋白表达量提供一种新的思路，并且有利于深入理解杆状病毒表达系统，并为信号肽参与蛋白分泌的机制研究提供参考。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及靶点免疫球蛋白重链结合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein，BiP)敲低后提高家蚕细胞表达外源蛋白分泌率的方法。
背景技术
随着人类生活水平的提高，健康意识的增强，各种治疗或保健用重组蛋白类药物的需求逐年攀升，使以生产疫苗、免疫球蛋白、抗体和蛋白质因子等治疗用重组蛋白的生物技术产业产值增速强劲，在生物医药行业中的地位也越来越突出。
许多蛋白需要分泌到胞外或定位于膜上才能够发挥其生物学功能，而已有多项研究表明，在表达膜蛋白、分泌蛋白时表达方面效率偏低，Sasaki等人利用杆状病毒表达系统在家蚕细胞中表达人类免疫细胞表面受体(KIR2DL1)，用Ni2+亲和柱纯化后，1只幼虫仅获得0.2mg的蛋白(Sasaki et al.，2009)。而Zhou等人利用BmNPV/Bac-to-Bac表达系统在家蚕中表达重组β-葡聚糖酶(rEGII)时，其产率高达386mg/幼虫(Zhou et al.，2010)。因此有效提高外源基因在家蚕细胞中的表达水平在分子生物学领域具有十分重要的作用。
利用有效靶向昆虫细胞内质网的蛋白质的信号肽序列，如苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcMNPV)GP64蛋白或蜂毒素信号肽等，可以大大提高膜蛋白的分泌率(De Pinheiroet al.，2016；Wang et al.，2007)。但是利用RNAi技术将关键靶基因敲低后提高外源蛋白分泌率的方法目前却鲜有报道。
本专利公开的是一种新方法，可以提高家蚕细胞表达外源蛋白分泌率。目前，没有将靶基因BiP干扰后应用于提高家蚕细胞表达外源蛋白分泌率的任何文献报道和专利申请。本发明公开的方法操作简单方便。
发明内容
解决的技术问题：本发明公开一种提高家蚕细胞表达外源蛋白分泌率的方法，利用RNAi技术将靶基因BiP有效敲低，转染BmN细胞24h后，接着表达外源蛋白，72h后即可以显著提高外源蛋白的分泌率。
技术方案：如SEQ ID NO.1所示的核苷酸BiP作为抑制靶标在提高家蚕细胞表达外源蛋白分泌率中的应用。
敲低SEQ ID NO.1所示的核苷酸BiP表达的试剂在制备提高家蚕细胞表达外源蛋白分泌率产品中的应用。
上述试剂含有干扰家蚕BmN细胞中BiP基因的RNAi干扰片段。
提高家蚕细胞表达外源蛋白分泌率产品，有效成分为干扰家蚕BmN细胞中BiP基因的RNAi干扰片段。
检测SEQ ID NO.1所示的核苷酸BiP表达的引物在制备判断家蚕细胞表达外源蛋白分泌率试剂盒中的应用。
具体步骤为：
1.细胞系及质粒
BmN细胞由农业农村部家蚕遗传改良重点实验室保存，用含有10％胎牛血清(Thermo Fisher Scientific)的TC-100培养基于27℃培养。
膜蛋白分离、纯化难度很大，只有用较剧烈的条件才能把它们从膜上分离出来，而一旦分离出来，它们也会聚集成不溶性物质；大部分膜蛋白含量很低。因此近年来利用基因工程技术表达膜蛋白，且将膜蛋白以分泌方式表达以利于纯化。但是膜蛋白自身表达量偏低，分泌率更低等原因限制了其大量表达。本发明首先将报告基因egfp表达且定位于膜上，与表达在细胞质内egfp做了比较，验证了膜蛋白的表达量偏低的事实。将egfp基因两侧分别融合BmNPV GP64信号肽(SP)和跨膜域(TMD)序列，构建瞬时表达绿色荧光蛋白且定位细胞膜的重组质粒pIZ/V5-SP-eGFP-TMD，以没有信号肽的质粒pIZ/V5-eGFP-TMD为对照(图1：A)。同时为了便于统计本专利所述的分泌率，将荧光素酶报告基因与SP融合，构建了重组质粒pIZ/V5-SP-Luc，以pIZ/V5-Luc为对照(图1：A)。
利用NCBI设计RNAi所需目的基因引物(BiP，靶序列见表1)，随机打乱siRNA序列作为对照(NC，表1)，引物合成后通过T7 RNAi体外转录试剂盒(Takara，南京)合成siRNA。将2×104个BmN细胞预先接种于24孔细胞培养板过夜培养，然后使用R4000(英格恩生物公司，北京)按照说明书转染50pmol的siRNA，24h后，收集细胞用qPCR检测干扰效应。
表1 RNAi所需靶基因序列
2.瞬时表达载体转染BmN细胞后荧光图及荧光强度统计图
将2μg的重组质粒pIZ/V5-SP-eGFP-TMD及pIZ/V5-eGFP-TMD分别转染BmN细胞，转染24小时之后加zeocin抗生素，每3天更换一次含zeocin的培养基，直至荧光比率达到90％，且能够长期稳定表达。将细胞系放置于荧光显微镜(OLYMPUS IX 83)下观察，采用相同的荧光强度和曝光时间，比较不同细胞内eGFP的表达。结果如图1所示，与对照组pIZ/V5-eGFP-TMD相比，SP的存在明显降低外源蛋白eGFP的表达(图1：B)。利用ImageJ-v1.8.0进一步测量其荧光强度发现，SP的荧光强度显著低于pIZ/V5-eGFP-TMD(图1：C)。结果表明在BmN细胞中，膜蛋白、分泌蛋白表达效率的确偏低。
3.瞬时表达载体转染BmN细胞后蛋白表达量统计图
将0.8μg的重组质粒pIZ/V5-SP-Luc及pIZ/V5-Luc分别转染BmN细胞，72h后收集上清及细胞样品，检测其荧光素酶活性，利用One-way Anova分析信号肽对蛋白表达量的影响(图1：D)，实验设三个重复。结果发现pIZ/V5-SP-Luc的总表达量显著低于对照组，这些结果表明在BmN细胞中，分泌蛋白表达后其表达量显著下降。
4.RNAi干扰效率验证及干扰后对外源蛋白分泌率统计图
利用RNAi技术敲低宿主细胞内BiP的表达量，NC组作为对照，24h后收取细胞样品，提取其RNA，反转录后利用qPCR技术对BiP的表达做定量分析。结果显示当转染siBiP后宿主细胞内BiP相对表达量仅为对照的22.48％，表达量显著降低(图2：A)。
在确定宿主细胞内BiP的表达量被有效干扰后，将0.8μg pIZ/V5-SP-Luc和pIZ/V5-Luc分别转染BmN细胞，在不同时间点收集上清及细胞中的荧光素酶活性，并计算分泌率。结果显示，在分泌蛋白(pIZ/V5-SP-Luc)中，当利用RNAi技术敲低BiP的表达，转染pIZ/V5-SP-Luc 72h后，SP-Luc分泌率显著增加(图2：B)，统计结果显示分泌率提高了4.1％。结果表明干扰宿主BiP后可以显著提高外源蛋白的分泌率。
有益效果：本发明首次发现一种分子伴侣BiP的用途，用RNAi技术将靶基因BiP有效敲低，转染BmN细胞24h后继续转染外源蛋白，72h后即可以显著提高外源蛋白的分泌率。该方法操作简单易行，能有效提高家蚕细胞内表达外源蛋白的分泌效率，该方法简单明了，便于操作，成本低廉，易于推广，提高效率显著。该用途的发明，解决了杆状病毒表达系统在膜蛋白、分泌蛋白表达方面效率偏低的问题，能有效提高家蚕细胞内表达外源蛋白的分泌效率，可在利用BiP等作为分子靶点提高膜蛋白表达量提供一种新的思路，并且有利于深入理解杆状病毒表达系统，并为信号肽参与蛋白分泌的机制研究提供参考。本发明提供的方法简单明了，易于理解、操作简单易行，效率高。
附图说明
图1为利用本发明中所述分泌蛋白与对照组瞬时表达载体构建、荧光强度及表达量、分泌量和分泌率比较：(A)瞬时载体pIZ/V5-SP-eGFP-TMD、pIZ/V5-eGFP-TMD及pIZ/V5-SP-Luc、pIZ/V5-Luc示意图(B)pIZ/V5-SP-eGFP及pIZ/V5-eGFP-TMD细胞系荧光图。将pIZ/V5-SP-eGFP及pIZ/V5-eGFP-TMD分别转染BmN细胞，每次更换培养基时添加相同体积的zeocin抗生素，直至荧光比率达到90％，且能够长期稳定表达。(C)根据pIZ/V5-SP-eGFP-TMD、pIZ/V5-eGFP-TMD细胞系荧光图，利用ImageJ-v1.8.0测量荧光强度，并进行统计学分析。(D)重组质粒pIZ/V5-SP-Luc及对照组pIZ/V5-Luc分别转染BmN细胞，72h后收集上清及细胞样品，测定其荧光素酶活性，并计算其分泌率。结果显示信号肽的存在会影响外源蛋白的表达量。
图2为利用本发明中所述RNAi干扰效率验证及干扰后对外源蛋白分泌率统计图：(A)体外合成siBiP及对照组NC后分别转染BmN细胞，24h后收集细胞样品后提取其RNA进行qPCR验证。(B)干扰BiP后，继续转染pIZ/V5-SP-Luc，72h后测定转染细胞的荧光素酶活性，并分别计算其分泌率。当利用RNAi技术敲低BiP的表达，转染pIZ/V5-SP-Luc 72h后，SP-Luc的分泌率显著增加，表明干扰BiP后外源蛋白的分泌率显著提高。
具体实施方式
以含有SP的重组质粒转染BmN细胞为例，说明本发明的具体实施步骤：
BmN细胞由农业农村部家蚕遗传改良重点实验室保存，用含有10％胎牛血清(Thermo Fisher Scientific)的TC-100培养基于27℃培养。
为了检测膜蛋白在家蚕细胞内的表达量变化，将egfp基因两侧分别融合BmNPVGP64信号肽(SP)和跨膜域(TMD)序列，构建瞬时表达绿色荧光蛋白且定位细胞膜的重组质粒pIZ/V5-SP-eGFP-TMD，以没有信号肽的质粒pIZ/V5-eGFP-TMD为对照。同时为了便于统计本专利所述的分泌率，将荧光素酶报告基因与SP融合，构建了重组质粒pIZ/V5-SP-Luc，以pIZ/V5-Luc为对照。
利用NCBI设计RNAi所需目的基因引物(BiP)，随机打乱siRNA序列作为对照(NC)，引物合成后通过T7 RNAi体外转录试剂盒(Takara，南京)合成siRNA。将2×104个BmN细胞预先接种于24孔细胞培养板过夜培养，然后使用R4000(英格恩生物公司，北京)按照说明书转染50pmol的siRNA，24h后，收集细胞用qPCR检测干扰效应。
实施例1：GP64 SP的存在影响外源蛋白的表达与分泌
将2μg的重组质粒pIZ/V5-SP-eGFP-TMD及pIZ/V5-eGFP-TMD分别转染BmN细胞，转染24小时之后加zeocin抗生素，每3天更换一次含zeocin的培养基，直至荧光比率达到90％，且能够长期稳定表达。将细胞系放置于荧光显微镜(OLYMPUS IX 83)下观察，采用相同的荧光强度和曝光时间，比较不同细胞内eGFP的表达。结果如图1所示，与对照组pIZ/V5-eGFP-TMD相比，SP的存在明显降低外源蛋白eGFP的表达(图1：B)。利用ImageJ-v1.8.0进一步测量其荧光强度发现，SP的荧光强度显著低于pIZ/V5-eGFP-TMD(图1：C)。结果表明在BmN细胞中，膜蛋白、分泌蛋白表达效率的确偏低。
将0.8μg的重组质粒pIZ/V5-SP-Luc及pIZ/V5-Luc分别转染BmN细胞，72h后收集上清及细胞样品，检测其荧光素酶活性，利用One-way Anova分析信号肽对蛋白表达量(图1：D)、的影响，实验设三个重复。结果发现pIZ/V5-SP-Luc的总表达量显著低于对照组(图1：D)，这些结果表明在BmN细胞中，分泌蛋白表达后其表达量显著下降。
实施例2：干扰宿主BiP后对外源蛋白表达量、分泌量及分泌率统计
利用RNAi技术敲低宿主细胞内BiP的表达量，NC组作为对照，24h后收取细胞样品，提取其RNA，反转录后利用qPCR技术对BiP的表达做定量分析。结果显示当转染siBiP后宿主细胞内BiP相对表达量仅为对照的22.48％，表达量显著降低(图2：A)。
在确定宿主细胞内BiP的表达量被有效干扰后，将0.8μg pIZ/V5-SP-Luc和pIZ/V5-Luc分别转染BmN细胞，在不同时间点收集上清及细胞中的荧光素酶活性，并计算分泌率。结果显示，在分泌蛋白(pIZ/V5-SP-Luc)中，当利用RNAi技术敲低BiP的表达，转染pIZ/V5-SP-Luc 72h后，SP-Luc分泌率显著增加(图2：B)。结果表明干扰宿主BiP后可以显著提高外源蛋白的分泌率。
最后应当说明的是：以上实施例和实施方式所述的siRNA剂量和处理时间仅用于说明性目的而非限制，但本领域的普通技术人员应当理解，在细胞状态或者细胞培养基理化性质比如酸碱度等等微小的差异，可以在形式上和细节上对其做出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
序列表
<110> 江苏科技大学
<120> 一种提高家蚕细胞表达外源蛋白分泌率的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctcatgttc aagtacaaa 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caatacatgc ataacgctt 19
Claims (5)
1.如SEQ ID NO.1所示的核苷酸BiP作为抑制靶标在提高含有BmNPV GP64信号肽的真核表达载体的家蚕BmN细胞表达外源蛋白分泌率中的应用。
2.敲低SEQ ID NO.1所示的核苷酸BiP表达的试剂在制备提高含有BmNPV GP64信号肽的真核表达载体的家蚕BmN细胞中表达外源蛋白的分泌率中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述试剂含有干扰家蚕BmN细胞中BiP基因的RNAi干扰片段。
4.提高家蚕细胞表达外源蛋白分泌率产品，其特征在于有效成分为干扰含有BmNPVGP64信号肽的真核表达载体的家蚕BmN细胞中BiP基因的RNAi干扰片段。
5.检测SEQ ID NO.1所示的核苷酸BiP表达的引物在制备判断含有BmNPV GP64信号肽的真核表达载体的家蚕BmN细胞表达外源蛋白分泌率试剂盒中的应用。
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