CN110607312A

CN110607312A - 一种黄曲霉致病基因hsp90及其应用

Info

Publication number: CN110607312A
Application number: CN201910898125.3A
Authority: CN
Inventors: 聂鑫怡; 张轶; 王银春; 王佳琪; 薛杨; 汪世华
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2019-09-23
Filing date: 2019-09-23
Publication date: 2019-12-24
Anticipated expiration: 2039-09-23
Also published as: CN110607312B

Abstract

本发明公开了一种黄曲霉致病基因hsp90，并提供了一种黄曲霉致病基因hsp90在制备、筛选抑制黄曲霉致病性潜在药物方法上的应用。更加具体地，该方法包含，在黄曲霉的培养体系中添加待筛选的候选物，并检测黄曲霉体内的hsp90基因的转录水平或Hsp90蛋白的表达水平，并与不添加候选物的对照组进行比较，如果测试组中hsp90基因的转录水平或Hsp90蛋白的表达水平在统计学上低于对照组，就表明该候选物是抑制黄曲霉的致病性的潜在药物。

Description

一种黄曲霉致病基因hsp90及其应用

技术领域

本发明属于微生物学领域，具体涉及一种黄曲霉致病基因hsp90在筛选抑制黄曲霉致病性的潜在药物中的应用。

背景技术

黄曲霉（Aspergillus flavus）是广泛分布的农作物病原真菌，可以侵染花生、玉米等含油脂丰富的作物种子，并产生剧毒的黄曲霉毒素，使作物种子及其加工制品产生黄曲霉毒素的污染，造成巨大的经济损失的同时严重危害人畜健康。我国花生和玉米被黄曲霉污染的情况比较普遍，畜禽饲料和水产饲料的黄曲霉污染则更为严重。因此研究黄曲霉产毒调控机制，寻找预防和控制黄曲霉毒素污染的方法和策略，具有重大的社会和经济意义。

目前，防控黄曲霉及黄曲霉毒素污染的策略主要有通过物理或化学方法对被污染的种子进行脱毒，有培育抗黄曲霉的作物品种、用不产毒黄曲霉菌株进行种群替换以及运用一些分子生物学手段来控制黄曲霉产毒等。这些方法是污染的后处理，目的是做到提前干预，防止或降低黄曲霉毒素污染，不仅能有效的减少农业和食品加工业的损失，也能够更好的保障粮食/食品安全和公共健康。

热休克蛋白（Heat shock proteins，HSP）又称为热激蛋白，是细胞内一类重要的分子伴侣的蛋白，在原核和真核细胞内广泛存在并高度保守，参与细胞内多种生物学过程，如蛋白的正确折叠等。特异性的抑制Hsp90蛋白的活性能够显著提高土曲霉ATR株（两性霉素B抗性菌株）对多烯类抗真菌药物两性霉素B的敏感性。烟曲霉中hsp90基因参与了产孢和细胞壁完整性的调控。Hsp90特异性抑制剂和抗真菌药卡泊芬净或者他克莫司（FK506）的联用能够对烟曲霉伏立康唑抗性菌株产生杀菌活性。虽然曾经有印度学者通过荧光定量PCR方法将产毒的黄曲霉菌株和不能产毒的黄曲霉菌株中hsp90基因的转录水平进行了比较，但得出的结论是不产毒菌株中的hsp90基因转录水平比产毒菌株高。这与我们的实验结果并不一致。

本发明人经过广泛研究，首次从黄曲霉中分离出hsp90基因，通过基因敲除和表型分析验证了hsp90在黄曲霉生长发育和产毒过程中都起了正调控的作用。因此，本发明公开了一种黄曲霉致病基因hsp90基因及在防治黄曲霉及黄曲霉毒素污染方面的应用，即通过检测黄曲霉体内hsp90基因的转录水平或Hsp90蛋白的表达水平来筛选抑制黄曲霉致病性的潜在药物的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黄曲霉致病基因hsp90在筛选抑制黄曲霉致病性潜在药物方面的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

通过生物信息学同源比对分析方法，在黄曲霉基因组中寻找与白念珠菌WOR1基因同源的hsp90基因；

构建黄曲霉hsp90基因缺失株，验证hsp90基因缺失是否影响黄曲霉致病性：

检测黄曲霉致病性相关检测指标包括：

(1) 相对于野生型黄曲霉，黄曲霉毒素的产量；

(2) 相对于野生型黄曲霉，产毒相关基因的表达；

(3) 所述的产毒相关基因包括：aflR基因、aflS基因、aflA基因，aflB基因，aflC基因、aflD基因、aflE基因、aflF基因、aflG基因、aflH基因、aflI基因、aflJ基因、aflK基因、aflL基因、aflM基因、aflN基因、aflO基因、aflP基因或aflQ基因；

(4) 相对于野生型黄曲霉，侵染宿主的能力；

(5) 所述的宿主包括：粮食及其制品、豆类及其制品、坚果及其制品、植物油及其制品、调味香辛料及其制品和饲料；

(6) 所述的侵染宿主的能力包括：在宿主上定殖生成菌丝、产生孢子、产生黄曲霉毒素AFB1或AFB2。

⊿hsp90菌株通过同源重组的方法（Nie et al., Journal of agricultural andfood chemistry, 2016, Sep 7, 64(35):6772-6782.）从黄曲霉菌株的染色体中敲除hsp90基因或基因片段获得，所述的hsp90基因：

(1) 具有SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列；或

(2) 截短的SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列，且该基因不编码Hsp90蛋白或编码降低活性（优选活性降低50%，更优选降低80%，更优选无活性）的Hsp90蛋白或蛋白片段。hsp90基因编码的Hsp90蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二目的，是提供一种抑制黄曲霉致病性的潜在药物的筛选方法，所述方法包括：

(a) 在测试组中，在黄曲霉培养体系中添加待筛选的候选物，检测黄曲霉体内的hsp90基因的转录水平或Hsp90蛋白的表达水平，并且，在对照组中，在不添加所述候选物的、所述菌株的培养体系中，检测黄曲霉体内的hsp90基因的转录水平或Hsp90蛋白的表达水平；

在一具体的实施方式中，所述检测黄曲霉体内的hsp90基因的转录水平或Hsp90蛋白的表达水平包括：

(1) 检测黄曲霉体内hsp90基因的mRNA转录水平；或

(2) 检测黄曲霉体内Hsp90蛋白的表达水平；

(b) 将步骤(a)测试组黄曲霉体内的hsp90基因的转录水平或Hsp90蛋白的表达水平与对照组中黄曲霉体内的hsp90基因的转录水平或Hsp90蛋白的表达水平进行比较，

如果测试组中黄曲霉体内的hsp90基因的转录水平或Hsp90蛋白的表达水平在统计学上低于（优选显著低于，较佳的低20%或更低；更佳的低40%或更低；进一步更佳的低60%或更低）对照组，就表明该候选物是抑制黄曲霉致病性的潜在药物。

本发明的优点在于：只需要在mRNA或蛋白水平上检测鉴定药物对黄曲霉毒性的抑制效果，而不需要提取黄曲霉毒素，因此缩短了黄曲霉的培养时间和实验周期，减少了提取黄曲霉毒素过程中各种有毒有机挥发性化学试剂的使用，减少对环境的污染，同时也大大减少可能对实验操作人员产生的毒害。

附图说明

图1. 黄曲霉hsp90基因的敲除和验证；（A）在黄曲霉基因组中敲除hsp90基因策略示意图；（B）hsp90基因敲除转化子进行AP（上游片段-pyrG）和BP（下游片段-pyrG）片段PCR验证的琼脂糖凝胶电泳结果；图中WT表示对照菌株，T1-T6表示不同的hsp90基因敲除转化子，-为阴性对照。

图2. hsp90基因敲除株的生长和产孢表观察；取约10³个新鲜孢子接种于YGT固体培养基中心点，29℃暗培养6天；图中WT表示对照菌株，⊿hsp90 1#、2#、5#为随机挑取的三个PCR验证阳性的hsp90基因敲除转化子。

图3. 黄曲霉⊿hsp90菌株和对照菌株在YESSB培养基中产生黄曲霉毒素AFB1的薄层层析分析；图中WT表示对照菌株，⊿hsp90 1#、2#、5#表示hsp90基因敲除株，AFB1表示黄曲霉毒素B1。

图4. 在广谱抗真菌药物伏立康唑（VRC）作用条件下，黄曲霉hsp90基因的转录水平qPCR分析；图中图示（-VRC）代表黄曲霉培养体系内未加入伏立康唑，图示（+VRC）代表在黄曲霉培养体系内加入终浓度为0.1 μg/ml的伏立康唑，培养时间为24小时；qPCR分析所使用的内参基因为beta-tubulin（β-tub）。

具体实施方式

如本文所用，黄曲霉hsp90基因（SEQ ID NO:1）用斜体hsp90表示，黄曲霉的缺失株用⊿hsp90表示，黄曲霉的野生型对照菌株用WT表示。黄曲霉Hsp90蛋白（SEQ ID NO:2）用正体Hsp90表示。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

hsp90基因基本上不表达的菌株可以通过各种基因抑制、基因沉默、基因敲除等技术来构建。例如，可以通过基于同源重组的基因敲除技术来将hsp90基因从染色体上敲除，从而使得hsp90基因缺失；可以针对hsp90基因设计干扰性RNA或反义核苷酸来使hsp90基因表达抑制或沉默。

作为本发明的一具体实施方式，一种使得hsp90基因缺失的方法是基因敲除技术，所述的hsp90基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，也包括截短形式的hsp90基因（或称为hsp90基因片段），Hsp90蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，也包括截短形式的Hsp90蛋白。只要hsp90基因片段在被敲除后可导致Hsp90蛋白不表达或表达异常，或其表达的Hsp90蛋白片段活性降低或没有活性。

在本发明的一具体实施方式中，本发明通过搜索FungiDB数据库（http://fungidb.org/fungidb/），利用生物信息学比较分析，在黄曲霉的基因组序列中找到编号为AFLA_006960（ Gene ID: 7920459）的基因，该基因编码的产物与烟曲霉Hsp90蛋白具有较高的同源性，为黄曲霉hsp90基因。本发明体外构建hsp90基因敲除片段，通过同源重组的方法，把黄曲霉染色体上包含hsp90基因的2.2 kb DNA片段用烟曲霉pyrG基因片段替换，从而敲除染色体上的hsp90基因。

hsp90基因缺失严重影响黄曲霉生长、产孢和产毒。YGT固体培养基上的菌落形态观察表明，hsp90基因缺失后黄曲霉生长明显变慢，菌落直径明显小于对照菌株，且产孢数量也明显减少。薄层层析没有检测到明显的黄曲霉毒素AFB1。这些结果表明hsp90正向调控黄曲霉生长、产孢和产毒，hsp90影响该菌的致病性表现。

所述的hsp90基因可以作为一种黄曲霉致病性鉴定的标志物。例如可通过检测待测黄曲霉中hsp90基因的转录表达情况来确定黄曲霉的致病性；若相对于野生型黄曲霉，待测黄曲霉hsp90基因正常表达或超表达（即相对于野生型黄曲霉，待测黄曲霉中hsp90基因的表达高20%或更高，更佳的高50%或更高），则该黄曲霉具有一般致病性或高致病性；若相对于野生型黄曲霉，待测黄曲霉hsp90基因低表达或不表达，则该黄曲霉具有低致病性或无致病性。

hsp90基因还可以作为黄曲霉减毒的靶标。本发明提供了一种筛选抑制黄曲霉致病性的潜在药物的方法，即可以在黄曲霉培养体系中添加候选药物，通过检测黄曲霉体内的hsp90的转录水平或Hsp90蛋白的表达水平，筛选抑制黄曲霉致病性的潜在药物。

所述用于分析检测黄曲霉体内的hsp90基因的转录水平的方法可以是Northernblot杂交分析，qPCR荧光定量分析等。

所述用于分析检测黄曲霉体内的Hsp90蛋白表达水平的方法可以是Western blot免疫印迹杂交分析、荧光强度分析法、酶联免疫吸附法（ELISA法）和点杂交法等。用于分析检测Hsp90蛋白表达水平的相应抗体可以是直接针对Hsp90蛋白或蛋白片段的抗体，也可以是将Hsp90蛋白的N端或C端与小分子多肽标签进行融合表达后针对小分子多肽标签的抗体。所述小分子多肽标签包括：His标签、HA标签、Flag标签、Myc标签、GST标签、GFP标签、YFP标签、RFP标签、mCherry标签等。

如果测试组中hsp90的转录水平或Hsp90蛋白的表达水平在统计学上低于（优选显著低于，较佳的低20%或更低；更佳的低40%或更低；进一步更佳的低60%或更低）对照组，就表明该候选物是抑制黄曲霉的致病性的潜在药物。

在一具体的实施方式中，所述的方法还包括：对获得的潜在药物进行进一步的黄曲霉产毒抑制或种子侵染抑制试验，以进一步选择和确定对于抑制黄曲霉致病性有用的物质。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南（New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

I.材料和方法

1. 总RNA提取与反转录

黄曲霉菌丝加入液氮冷冻后迅速研磨成粉末，按每100 mg菌丝粉末加入1 mL的Trizol试剂（Thermo Fisher Scientific），参照说明书提取黄曲霉总RNA，用无核酸酶水溶解并通过琼脂糖凝胶电泳检测抽提的RNA质量。

RNA的反转录参照Thermo Scientific RevertAcid First Strand cDNASynthesis Kit试剂盒说明书。

2. 总蛋白提取与Western杂交

黄曲霉菌丝加入液氮冷冻后迅速研磨成粉末，按每100 mg菌丝粉末加入500 μl的RIPA裂解液（Beyotime），加入PMSF至终浓度1mM，混匀后冰上裂解30 min，4℃高速离心10 min，收集上清并测定蛋白浓度，进行SDS-PAGE电泳，用湿法将蛋白条带转移到尼龙膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液RT封闭1小时，一抗4℃杂交过夜，用TBST 室温洗膜3次，每次5分钟，用相应的二抗于室温结合1小时，再用TBST洗膜3次，每次5分钟，用ECL试剂显色。

3. 黄曲霉生长和产孢表型观察

在YGT（5%酵母提取物，2%葡萄糖，1‰微量金属母液）或PDA固体培养基平板中心点接种新鲜的黄曲霉孢子10³个，29℃持续黑暗培养6天，拍照并测量黄曲霉菌落的最大直径，同时使用打孔器沿着菌落中心到边缘的半径进行打孔，并将打孔获得的琼脂块用1ml 0.05%的曲拉通X-100溶液剧烈震荡混匀，洗脱孢子并用血球计数板进行孢子计数。

微量金属母液配方如下：2.2 g ZnSO₄∙7H₂O， 1.1 g H₃BO₃，0.5 g FeSO₄∙7H₂O，0.5g MnCl₂∙4H₂O，0.16 g CoCl₂∙5H₂O，0.16 g CuSO₄∙5H₂O，0.11 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄∙4H₂O，5 gEDTA，溶于无菌水中配制成100 mL母液。

4. 黄曲霉毒素提取及分析

在YESSB液体培养基（2%酵母提取物，15%蔗糖，1%大豆蛋白胨，pH 5.5）中接种黄曲霉孢子至浓度10⁶个/ml，28℃持续黑暗静置培养5天，吸取500 µl液体培养基加入等体积二氯甲烷，振荡混匀，高速离心5 min，吸取有机相液体，干燥后用200 µl二氯甲烷重新溶解并取10µl点样，进行薄层层析（TLC）分析。

II. 实施例

实施例1、黄曲霉中hsp90基因的敲除

为了研究黄曲霉hsp90基因在黄曲霉形态发生和毒性表现中的功能，首先在黄曲霉中敲除hsp90基因。

图1A显示了基因敲除的策略。体外构建hsp90基因敲除片段，通过同源重组的方法，把染色体hsp90基因中的2.2 kb DNA片段用pyrG替换，从而敲除染色体上的hsp90基因。

具体方法如下：

利用5’引物TATGGGTGGCGAACGACTG（SEQ ID NO.3）；和3’引物GGGTGAAGAGCATTGTTTGAGGCGCGAGGCCAGAAGAGTTTAG（SEQ ID NO.4）；从黄曲霉基因组DNA中用PCR的方法扩增约1.2kb上游片段；

利用5’引物GCCTCAAACAATGCTCTTCACCC（SEQ ID NO.5）；和3’引物GTCTGAGAGGAGGCACTGATGC（SEQ ID NO.6）；从烟曲霉基因组DNA中用PCR的方法扩增约1.9kb的pyrG基因片段；

用5’引物GCATCAGTGCCTCCTCTCAGACTTCGGCAGCAGCGGAAATG（SEQ ID NO.7）；和3’引物GGCGAGTGTATTGTAGATGG（SEQ ID NO.8）；从黄曲霉基因组DNA中用PCR的方法扩增约1.2 kb的下游片段；

将上述三个片段用融合PCR法连接到一起构建hsp90敲除片段，导入黄曲霉PTs⊿ku70⊿pyrG菌株（Chang et al., Journal of microbiological methods, 2010, Jun, 81(3):240-246.），在不含尿嘧啶和尿苷的培养基上筛选阳性转化子。通过敲除片段上、下游的两个同源片段与染色体上hsp90基因的上、下游同源片段的同源重组，把染色体上的hsp90基因给替换掉，从而敲除染色体上的hsp90基因。正确插入的转化子的用PCR方法进行筛选验证。分别用插入位点上游的引物和pyrG内部的引物扩增AP片段，用插入位点下游的引物和pyrG内部的引物扩增BP片段，能够同时扩增出这两种片段的转化子，即为敲除片段正确整合到基因组内相应位置的hsp90基因敲除株（图1B）。

实施例2、hsp90基因的敲除对黄曲霉菌生长和产孢的影响

为了检测hsp90基因的缺失是否会影响黄曲霉的生长和产孢，本发明在固体YGT培养基（配方详见材料方法部分）平板中心点接种新鲜的黄曲霉孢子10³个，29℃持续黑暗培养6天，观察产孢情况并测量黄曲霉菌落的最大直径。结果表明WT菌株能够正常生长并产生大量成熟的绿色孢子，而⊿hsp90缺失株形成的菌落直径明显小于WT菌株且产生绿色的孢子能力显著降低（图2）。

以上结果说明，hsp90基因的缺失会影响黄曲霉的生长和产孢。

实施例3、hsp90基因的敲除对黄曲霉菌产毒的影响

为了检测hsp90基因的缺失是否会影响黄曲霉产毒，本发明在YESSB液体培养基（配方详见材料方法部分）内接种黄曲霉孢子至终浓度10⁵个/ml，29℃的持续黑暗条件下静置培养5天，提取毒素，通过薄层层析分析各菌株的产毒情况。结果表明WT菌株产生了大量的黄曲霉毒素AFB1，而⊿hsp90缺失株则没有检测到AFB1的产生（图3）。

以上结果说明，hsp90基因的缺失会影响黄曲霉产毒。

因此，Hsp90调控黄曲霉的致病性表现，是一个重要的致病相关因子。

实施例4、根据hsp90转录水平筛选抑制黄曲霉致病性的潜在药物

为了验证hsp90转录水平能否说明潜在药物对黄曲霉致病性的抑制能力，本发明设计建立了潜在药物筛选的荧光定量PCR法分析系统。

具体方法如下：

在黄曲霉菌株的培养体系中加入终浓度为0.1 μg/ml或不加入广谱康真菌药物伏立康唑B培养24小时，提取总RNA并反转录成cDNA，检测hsp90基因mRNA的转录水平。

利用5’引物TTGAGCCCTACAACGCCACT（SEQ ID NO.9）；和3’引物TGGTTCAGGTCACCGTAAGAGG（SEQ ID NO.10）；从上述cDNA中用PCR的方法扩增约142 bp片段来代表内参基因beta-tubulin（β-tub）的转录水平。

利用5’引物CCGTACCGTCAAGTCCATC（SEQ ID NO.11）；和3’引物TCCTCGTCGACGTTCAGACC（SEQ ID NO.12）；从上述cDNA中用PCR的方法扩增约188 bp片段来代表hsp90基因转录水平。

利用REST分析软件来统计分析hsp90基因在加入和不加入伏立康唑B条件下转录水平的差异（图4）。在加入伏立康唑B的培养条件下，黄曲霉野生型菌株中hsp90基因的转录水平显著低于未加入伏立康唑B时该基因的转录水平（P<0.01）。这一结果说明，hsp90基因的转录水平与黄曲霉的致病性密切相关，伏立康唑B是抑制黄曲霉致病性或防治黄曲霉污染的潜在药物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种黄曲霉致病基因hsp90及其应用

<130> 12

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2173

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtccgaga cttttgagtt ccaggctgag atctctcagc tcctttctct tatcatcaac 60

actgtctact ccaacaagga gattttcctg cgtgaactta tctccaatgc ctccgatgcc 120

cttgacaaga tccgctatga gtctttgtcg gacccttcca agcttgactc aggcaaggac 180

ctccgtatcg atatcattcc caacaaggag gccaagacct tgactatccg tgataccggt 240

atcggtatga ccaaggctgt aagtcaatct cgtctcggtt gccattatat gtctacacag 300

accccaatct aatcatatcg cttttgtata ggacctgatc aacaaccttg gtaccatcgc 360

tcgctctggt accaagcagt tcatggaagc cctctccgca ggtgccgata tttccatgat 420

tggccagttc ggtgttggct tctactctgc ttaccttgtc gctgaccgcg tcactgtcat 480

ctctaagcac aacgatgatg agcagtacgt ctgggagtcc gctgccggcg gtaccttcac 540

gctcacccag gacaccgagg gtgagcccct tggccgtggt accaagatga tccttcactt 600

gaaggatgag cagaccgact acctcaacga gagccgcatc aaggaggttg ttcgcaagca 660

ctccgaattc atctcttacc ccatctacct ccacgttctg aaggaaaccg agaaggaggt 720

tcctgatgag gaggaagaga ccaaggaaga ggaaggcgat gagaaaaagc ccaaaattga 780

ggaggttgac gaagaagaag aaaagaagga gaagaagacc aagactgtca aggagagcaa 840

gatcgaggag gaggagctca acaagactaa gcccatctgg acccgtaacc ctgctgatat 900

cactcaggag gaatacgctg ccttctacaa gtctctctcc aatgactggg aggatcacct 960

tgccgtcaag cacttctccg ttgagggtca gctcgagttc cgtgccatcc tctatattcc 1020

taagcgtgct cctttcgacc tcttcgagac caagaagact aagaacaaca tcaagctcta 1080

tgttcgccgt gtcttcatca ccgacgacgc caccgacctc atccctgagt ggctcagctt 1140

catcaagggt gttgttgatt cagaggacct tcctctcaac ttgtcccgtg agaccctgca 1200

gcagaacaag atcatgaagg ttatcaaaaa gaacattgtc aagaagaccc ttgagctctt 1260

caccgagatt gctgaagacc gtgagcagtt tgacaagttc tactccgcct tcagcaagaa 1320

catcaaactt ggtgtccacg aggatgctca gaaccgccag actctcgcta agctgctccg 1380

ttaccagtcc accaagtcgg gtgatgaggt cacctccctc tctgactatg tcacccgcat 1440

gcctgagcac cagaagcaaa tctactacat cactggcgag tctatcaagg ctgtcgccaa 1500

gtctcctttc cttgacagcc tcaagcagaa gaactttgag gttctcttcc tggttgaccc 1560

tattgatgag tacgctttca ctcagcttaa ggagtttgat ggcaagaagc ttgtcgacat 1620

cactaaggac ttcgaactcg aggagtccga ggaggagaag gctgagcgtg agaaggagga 1680

gaaggagttc gagggcctcg ccaagagcct taagaacatc ctcggtgaca aggttgagaa 1740

ggttgttgtc tctcacaaac ttgttggctc tccttgcgcc atccgtactg gccagtttgg 1800

ttggtctgcc aatatggagc gtatcatgaa ggcccaggcc ctccgtgaca cctccatgag 1860

ctcctacatg tcttccaaga agaccttcga gatctctccc aagtctgcta tcatcaagga 1920

gctcaagaag aaggtcgagg ctgatggtga aagcgaccgt accgtcaagt ccatcactca 1980

gcttctgttc gagacctctc ttttggtttc cggcttcacc atcgacgagc ctgccagctt 2040

tgccgagcgc atccacaagc ttgtgtctct tggtctgaac gtcgacgagg aggctgagac 2100

ctctgaggaa aaggccgctg aggaggctcc tgccgctgcc accggtgaga gctccatgga 2160

ggaggttgac taa 2173

<210> 2

<211> 699

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ser Glu Thr Phe Glu Phe Gln Ala Glu Ile Ser Gln Leu Leu Ser

1 5 10 15

Leu Ile Ile Asn Thr Val Tyr Ser Asn Lys Glu Ile Phe Leu Arg Glu

20 25 30

Leu Ile Ser Asn Ala Ser Asp Ala Leu Asp Lys Ile Arg Tyr Glu Ser

35 40 45

Leu Ser Asp Pro Ser Lys Leu Asp Ser Gly Lys Asp Leu Arg Ile Asp

50 55 60

Ile Ile Pro Asn Lys Glu Ala Lys Thr Leu Thr Ile Arg Asp Thr Gly

65 70 75 80

Ile Gly Met Thr Lys Ala Asp Leu Ile Asn Asn Leu Gly Thr Ile Ala

85 90 95

Arg Ser Gly Thr Lys Gln Phe Met Glu Ala Leu Ser Ala Gly Ala Asp

100 105 110

Ile Ser Met Ile Gly Gln Phe Gly Val Gly Phe Tyr Ser Ala Tyr Leu

115 120 125

Val Ala Asp Arg Val Thr Val Ile Ser Lys His Asn Asp Asp Glu Gln

130 135 140

Tyr Val Trp Glu Ser Ala Ala Gly Gly Thr Phe Thr Leu Thr Gln Asp

145 150 155 160

Thr Glu Gly Glu Pro Leu Gly Arg Gly Thr Lys Met Ile Leu His Leu

165 170 175

Lys Asp Glu Gln Thr Asp Tyr Leu Asn Glu Ser Arg Ile Lys Glu Val

180 185 190

Val Arg Lys His Ser Glu Phe Ile Ser Tyr Pro Ile Tyr Leu His Val

195 200 205

Leu Lys Glu Thr Glu Lys Glu Val Pro Asp Glu Glu Glu Glu Thr Lys

210 215 220

Glu Glu Glu Gly Asp Glu Lys Lys Pro Lys Ile Glu Glu Val Asp Glu

225 230 235 240

Glu Glu Glu Lys Lys Glu Lys Lys Thr Lys Thr Val Lys Glu Ser Lys

245 250 255

Ile Glu Glu Glu Glu Leu Asn Lys Thr Lys Pro Ile Trp Thr Arg Asn

260 265 270

Pro Ala Asp Ile Thr Gln Glu Glu Tyr Ala Ala Phe Tyr Lys Ser Leu

275 280 285

Ser Asn Asp Trp Glu Asp His Leu Ala Val Lys His Phe Ser Val Glu

290 295 300

Gly Gln Leu Glu Phe Arg Ala Ile Leu Tyr Ile Pro Lys Arg Ala Pro

305 310 315 320

Phe Asp Leu Phe Glu Thr Lys Lys Thr Lys Asn Asn Ile Lys Leu Tyr

325 330 335

Val Arg Arg Val Phe Ile Thr Asp Asp Ala Thr Asp Leu Ile Pro Glu

340 345 350

Trp Leu Ser Phe Ile Lys Gly Val Val Asp Ser Glu Asp Leu Pro Leu

355 360 365

Asn Leu Ser Arg Glu Thr Leu Gln Gln Asn Lys Ile Met Lys Val Ile

370 375 380

Lys Lys Asn Ile Val Lys Lys Thr Leu Glu Leu Phe Thr Glu Ile Ala

385 390 395 400

Glu Asp Arg Glu Gln Phe Asp Lys Phe Tyr Ser Ala Phe Ser Lys Asn

405 410 415

Ile Lys Leu Gly Val His Glu Asp Ala Gln Asn Arg Gln Thr Leu Ala

420 425 430

Lys Leu Leu Arg Tyr Gln Ser Thr Lys Ser Gly Asp Glu Val Thr Ser

435 440 445

Leu Ser Asp Tyr Val Thr Arg Met Pro Glu His Gln Lys Gln Ile Tyr

450 455 460

Tyr Ile Thr Gly Glu Ser Ile Lys Ala Val Ala Lys Ser Pro Phe Leu

465 470 475 480

Asp Ser Leu Lys Gln Lys Asn Phe Glu Val Leu Phe Leu Val Asp Pro

485 490 495

Ile Asp Glu Tyr Ala Phe Thr Gln Leu Lys Glu Phe Asp Gly Lys Lys

500 505 510

Leu Val Asp Ile Thr Lys Asp Phe Glu Leu Glu Glu Ser Glu Glu Glu

515 520 525

Lys Ala Glu Arg Glu Lys Glu Glu Lys Glu Phe Glu Gly Leu Ala Lys

530 535 540

Ser Leu Lys Asn Ile Leu Gly Asp Lys Val Glu Lys Val Val Val Ser

545 550 555 560

His Lys Leu Val Gly Ser Pro Cys Ala Ile Arg Thr Gly Gln Phe Gly

565 570 575

Trp Ser Ala Asn Met Glu Arg Ile Met Lys Ala Gln Ala Leu Arg Asp

580 585 590

Thr Ser Met Ser Ser Tyr Met Ser Ser Lys Lys Thr Phe Glu Ile Ser

595 600 605

Pro Lys Ser Ala Ile Ile Lys Glu Leu Lys Lys Lys Val Glu Ala Asp

610 615 620

Gly Glu Ser Asp Arg Thr Val Lys Ser Ile Thr Gln Leu Leu Phe Glu

625 630 635 640

Thr Ser Leu Leu Val Ser Gly Phe Thr Ile Asp Glu Pro Ala Ser Phe

645 650 655

Ala Glu Arg Ile His Lys Leu Val Ser Leu Gly Leu Asn Val Asp Glu

660 665 670

Glu Ala Glu Thr Ser Glu Glu Lys Ala Ala Glu Glu Ala Pro Ala Ala

675 680 685

Ala Thr Gly Glu Ser Ser Met Glu Glu Val Asp

690 695

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tatgggtggc gaacgactg 19

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gggtgaagag cattgtttga ggcgcgaggc cagaagagtt tag 43

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcctcaaaca atgctcttca ccc 23

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtctgagagg aggcactgat gc 22

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcatcagtgc ctcctctcag acttcggcag cagcggaaat g 41

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggcgagtgta ttgtagatgg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ttgagcccta caacgccact 20

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tggttcaggt caccgtaaga gg 22

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ccgtaccgtc aagtccatc 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcctcgtcga cgttcagacc 20

Claims

1.黄曲霉致病基因在筛选抑制黄曲霉致病性的潜在药物中的应用，其特征在于，所述基因为hsp90基因：

(1) 具有SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列；或

(2) 截短的SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列，且该基因不编码Hsp90蛋白或编码降低活性的Hsp90蛋白或蛋白片段。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Hsp90蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，筛选抑制黄曲霉致病性潜在药物的方法包括：

(a) 在测试组中，在黄曲霉培养体系中添加待筛选的候选物，检测黄曲霉体内的hsp90基因的转录水平或Hsp90蛋白的表达水平，并且，在对照组中，在不添加所述候选物的、所述菌株的培养体系中，检测hsp90基因的转录水平或Hsp90蛋白的表达水平；

(b) 将步骤(a)测试组中hsp90基因的转录水平或Hsp90蛋白的表达水平，与对照组中hsp90基因的转录水平或Hsp90蛋白的表达水平进行比较，测试组中hsp90基因的转录表达水平或Hsp90蛋白的表达水平在统计学上低于对照组，就表明该候选物是抑制黄曲霉致病性的潜在药物。