JP7382138B2 - Hspa5遺伝子のプロモーター - Google Patents
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Description
(1)チャイニーズハムスター由来Hspa5遺伝子のプロモーターであって、配列番号9に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、配列番号1に記載のヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列の部分配列からなるポリヌクレオチド。
(2)配列番号1に記載のヌクレオチド配列からなる、前記(1)に記載のポリヌクレオチド。
(3)配列番号5に記載のヌクレオチド配列からなる、前記(1)に記載のポリヌクレオチド。
(4)配列番号6に記載のヌクレオチド配列からなる、前記(1)に記載のポリヌクレオチド。
(5)配列番号7に記載のヌクレオチド配列からなる、前記(1)に記載のポリヌクレオチド。
(6)配列番号8に記載のヌクレオチド配列からなる、前記(1)に記載のポリヌクレオチド。
(7)配列番号9に記載のヌクレオチド配列からなる、前記(1)に記載のポリヌクレオチド。
(8)ヒト由来Hspa5遺伝子のプロモーターである、配列表の配列番号2に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
(9)マウス由来Hspa5遺伝子のプロモーターである、配列表の配列番号3に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
(10)ラット由来Hspa5遺伝子のプロモーターである、配列表の配列番号4に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
(11)前記(1)乃至(10)のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列に対して95%以上同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
(12)前記(1)乃至(10)のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列に対して99%以上同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
(13)前記(1)乃至(12)のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
(14)前記(1)乃至(13)のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含むことからなる、外来遺伝子発現ユニット。
(15)外来遺伝子が多量体蛋白質をコードする遺伝子である、前記(14)に記載の外来遺伝子発現ユニット。
(16)外来遺伝子がヘテロ多量体蛋白質をコードする遺伝子である、前記(14)に記載の外来遺伝子発現ユニット。
(17)外来遺伝子が抗体又はその抗原結合性断片をコードする遺伝子である、前記(14)に記載の外来遺伝子発現ユニット。
(18)前記(14)乃至(17)のいずれか一つに記載の外来遺伝子発現ユニットを含む外来遺伝子発現ベクター。
(19)前記(14)乃至(17)のいずれか一つに記載の外来遺伝子発現ユニット及び下記A群の(a)乃至(e)に記載のポリヌクレオチドから選択されるいずれか一つ
又は複数のポリヌクレオチドを含む外来遺伝子発現ベクター;
A群
(a)配列表の配列番号35に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
(b)配列表の配列番号36に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
(c)配列表の配列番号37に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
(d)前記(a)乃至(c)のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列に対して95%以上同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、外来遺伝子発現亢進活性を有するポリヌクレオチド、
(e)上記(a)乃至(c)のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列に対して99%以上同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、外来遺伝子発現亢進活性を有するポリヌクレオチド。
(20)前記(18)又は(19)に記載の外来遺伝子発現ベクターが導入された形質転換細胞。
(21)細胞が哺乳動物由来の培養細胞である、前記(20)に記載の形質転換細胞。
(22)哺乳動物由来の培養細胞が、COS-1細胞、293細胞、又はCHO細胞である、前記(21)に記載の形質転換細胞。
(23)前記(20)乃至(22)のいずれか一つに記載の形質転換細胞を培養し、培養物から外来遺伝子由来の蛋白質を取得することを特徴とする、該蛋白質の製造方法。
(24)形質転換細胞において外来遺伝子を発現させることを目的とする、前記(1)乃至(13)のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの使用。
(25)形質転換細胞において外来遺伝子を発現させることを目的とする、前記(18)又は(19)に記載の外来遺伝子発現ベクターの使用。
本発明の外来遺伝子由来の蛋白質の製造方法に使用される外来プロモーターは、ヒートショックプロテインA5遺伝子(以下、「Hspa5」という)のプロモーターである。Hspa5プロモーターとしての活性を有するポリヌクレオチドであれば特に限定されないが、Hspa5のプロモーターとしては、開始コドンの上流約3kbpのヌクレオチドから開始コドンに対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドまでのポリヌクレオチドが好ましい。
本発明の外来遺伝子由来の蛋白質の製造方法に使用される外来遺伝子発現ユニット(以下、「本発明の遺伝子発現ユニット」ということもある)は、転写の読み枠の方向に、少なくとも前記1.に記載の本発明のプロモーター、外来遺伝子、及び転写ターミネーター領域(ポリA付加シグナル)を有するものである。
前記2.に記載の本発明の遺伝子発現ユニットとDNAエレメントを組み合わせて使用することにより、外来遺伝子の発現をさらに亢進することができる。組み合わせて使用するDNAエレメントは、アセチル化ヒストンH3との相互作用を指標として取得することが可能である。一般にヒストン(H3、H4)のアセチル化は転写の活性化に関与しているといわれており、主に2つの説が考えられている。ヒストンテールがアセチル化することで電荷的に中和され、DNAとヒストンとの結合が緩くなるというヌクレオソームの立体構造変化が関係している説(Mellor J. (2006) Dynamic nucleosomes and gene transcription. Trends Genet. 22(6):320-329)と、様々な転写因子のリクルートに関与するという説(Nakatani Y. (2001) Histone acetylases-versatile players. Genes Cells. 6(2):79-86)である。いずれの説においても、ヒストンのアセチル化が転写活性化に関与している可能性は高く、抗アセチル化ヒストンH3抗体を用いたクロマチン免疫沈降(Chromatin Immunoprecipitation;ChIP)によって、アセチル化ヒストンH3と相互作用するDNAエレメントを濃縮することが可能である。
本発明において、後記の産生亢進の対象となる外来蛋白質をコードする外来遺伝子を含むポリヌクレオチドは、以下に示す一般的な方法により取得することができる。例えば、外来遺伝子が発現している細胞や組織に由来するcDNAライブラリーを、当該遺伝子断片をもとにして合成したDNAプローブを用いてスクリーニングすることにより単離することができる。mRNAの調製は、当該技術分野において通常用いられる手法により行うことができる。例えば、前記細胞又は組織を、グアニジニン試薬、フェノール試薬等で処理して全RNAを得、その後、オリゴ(dT)セルロースカラムやセファロース2Bを担体とするポリU-セファロース等を用いたアフィニティーカラム法により、あるいはバッチ法によりポリ(A)+RNA(mRNA)を得る。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ(A)+RNAをさらに分画してもよい。次いで、得られたmRNAを鋳型として、オリゴdTプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖cDNAを合成し、該一本鎖cDNAからDNA合成酵素I、DNAリガーゼ及びRNaseH等を用いて二本鎖cDNAを合成する。合成した二本鎖cDNAをT4DNA合成酵素によって平滑化後、アダプター(例えば、EcoRIアダプター)の連結、リン酸化等を経て、λgt11等のλファージに組み込んでin vivoパッケージングすることによってcDNAライブラリーを作製する。また、λファージ以外にもプラスミドベクターを用いてcDNAライブラリーを作製することもできる。その後、cDNAライブラリーから目的のDNAを有する株(ポジティブクローン)を選択すればよい。
本発明の外来遺伝子由来の蛋白質の製造方法に使用される外来遺伝子発現ベクターとしては、前記1.に記載のプロモーターを含む前記2.に記載の外来遺伝子発現ユニットを含むベクターが提供される。本発明の外来遺伝子由来の蛋白質の製造方法に使用される外来遺伝子発現ベクターは、前記3.に記載のDNAエレメントの1種、DNAエレメントの1種を2個以上のコピー数、DNAエレメントの2種以上の組み合わせを含んでもよい。前記の外来遺伝子発現ベクターによって外来遺伝子を宿主細胞内で発現させる際には、DNAエレメントを遺伝子発現ユニットの直前又は直後に配置してもよく、又は遺伝子発現ユニットから離れた位置に配置しても良い。また、複数のDNAエレメントを含む1つの外来遺伝子発現ベクターを用いてもよい。なお、DNAエレメントの向きは、遺伝子発現ユニットに対して順方向又は逆方向のいずれであっても良い。
本発明の外来遺伝子由来の蛋白質の製造方法に使用される形質転換細胞は、前記5.の外来遺伝子発現ベクターを用いて導入した形質転換細胞である。
本発明の外来蛋白質の製造方法は、前記6.の項目に記載の形質転換細胞を公知の方法により培養し、その培養物から採取し、精製することにより行うことができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞、又は細胞の破砕物のいずれをも意味するものである。なお、6.の項目に記載の形質転換細胞を用いて産生することのできる外来蛋白質としては、単量体蛋白質のみならず多量体蛋白質を選択することも可能である。異なる複数のサブユニットから構成されるヘテロ多量体蛋白質の生産を行う場合、これらのサブユニットをコードしている複数の遺伝子を、それぞれ6.の項目に記載の宿主細胞に導入する必要がある。
前記7.の項目に記載の製造方法を用いて製造されるヘテロ多量体蛋白質としては抗体蛋白質を挙げることができる。抗体蛋白質は、2分子の重鎖ポリペプチド及び2分子の軽鎖ポリペプチドからなる4量体蛋白質である。従って、抗原結合能を維持した形態で抗体蛋白質を取得するためには、前記6.の項目に記載の形質転換細胞において、重鎖及び軽鎖の遺伝子の双方が導入されている必要がある。この場合に、重鎖及び軽鎖の遺伝子発現ユニットは、同じ発現ベクター上に存在しても良く、あるいは異なる発現ベクター上に存在していても良い。
本発明の製造方法の対象となる外来蛋白質としては、前述の抗体に加え、ヒト又は非ヒト動物由来の各種蛋白質、その抗原結合性断片、その改変体等を挙げることができる。そのような蛋白質等としては、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)、C型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)、バソプレッシン、ソマトスタチン、成長ホルモン(GH)、インスリン、オキシトシン、グレリン、レプチン、アディポネクチン、レニン、カルシトニン、オステオプロテジェリン、インスリン様成長因子(IGF)等のペプチドホルモン、インターロイキン、ケモカイン、インターフェロン、腫瘍壊死因子(TNFα/βほかTNFスーパーファミリー等)、神経成長因子(NGF)、細胞増殖因子(EGF、FGF、PDGF、HGF、TGF等)、造血因子(CSF、G-CSF、エリスロポエチン等)、アディポカイン等のサイトカイン、ТNF受容体等の受容体、リゾチーム、プロテアーゼ、プロテイナーゼ、ペプチダーゼ等の酵素、その機能性断片(元の蛋白質の生物活性を一部又は全部保持している断片)、それらの蛋白質を含むことからなる融合蛋白質等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
1-1)ヒト化抗体遺伝子X発現ベクターの構築
非特許文献9記載のpDSLH4.1をベクター基本骨格として有する、ヒト化抗体遺伝子X発現ベクターpDSLH4.1-Xを構築した。
CHO-K1細胞(ATCC)を無血清培地を用いた浮遊状態での培養が可能となるように馴化し、宿主細胞CHO-O1細胞を得た。CHO-O1細胞に、(1-1)で構築したヒト化抗体遺伝子X発現ベクターpDSLH4.1-Xを遺伝子導入装置Neon Transfection System(Invitrogen)を用いて遺伝子導入し、T-25フラスコにて5%CO2、37℃で培養した。遺伝子導入の1日後にGeneticin(Life Technologies Corporation)を終濃度800 μg/mLで添加し、1週間薬剤選択培養を行った。その後、125mL容三角フラスコにて5%CO2、37℃で培養し、ヒト化抗体X発現ステーブルプールを作製した。
(1-2)で作製したヒト化抗体X発現ステーブルプールをモノクローン化してヒト化抗体X発現株X#1およびX#2を取得した。
実施例1で構築したヒト化抗体X発現株X#1およびX#2を用いて流加培養を行い、その経時サンプルについてトランスクリプトーム解析を実施し、高発現遺伝子を特定した。
実施例1で構築したヒト化抗体X発現株を、1L Jarにて流加培養を行った。Jar#1は、細胞株にX#1、基礎培地/フィード培地にG13(JXエネルギー製カスタム培地)/F13(JXエネルギー製カスタム培地)を、Jar#2は、細胞株にX#1、基礎培地/フィード培地にDA1(Life Technologies Corporation製カスタム培地)/DAFM3(Life Technologies Corporation製カスタム培地)を、Jar#3は、細胞株にX#2、基礎培地/フィード培地に、G13/F13を用いた。
(2-1)で実施した流加培養の4、7、9、11、14日目の細胞からRNAiso Plus(タカラバイオ)を用いてtotal RNAを抽出した。続いて、TruSeq RNA Sample Prep Kit v2(illumina)を用いてシーケンスライブラリーを作製した。具体的には、total RNAからPolyA+ RNAを単離、断片化して取得したRNA断片を鋳型として二本鎖cDNAを合成した。合成した二本鎖cDNAの両末端を平滑化・リン酸化処理した後、3’-dA突出処理を行い、Index付きアダプターを連結した。アダプターを連結した二本鎖cDNAを鋳型とし、PCRによる増幅を行った後、AMPure XP(BECKMAN COULTER)を用いた磁気ビーズ法にて得られたPCR産物を精製し、シーケンスライブラリーとした。そして、シーケンスライブラリーを用いてシーケンスの鋳型となるクラスターを形成し、HiSeq 2000システム(illumina)に供し、高速シーケンス解析を実施、シーケンスデータを取得した。
シーケンス解析によって得られたリード配列は非特許文献10記載のBowtie(version. 1.0.0)を用いてリファレンス配列にマッピングした。リファレンス配列はNCBIに登録されているチャイニーズハムスターの染色体配列に、NCBIに登録されているチャイニーズハムスターの遺伝子情報に基づき抽出したsplices配列を加えて作成した。また、リード配列の発現量(RPKM:Reads per kilobase of exon[intron/intergenic] model per million mapped reads)と新規遺伝子発現領域は非特許文献11記載のERANGE 3.2を用いて検討した。
実施例2で見出した発現量上位20遺伝子のうち、tRNAを除く18遺伝子について、各遺伝子のプロモーター領域のクローニングを行った。
Hspa5のプロモーター領域としては、GenBankにNM_001246739.1で登録されているmRNAの配列およびNW_003615108.1で登録されているチャイニーズハムスターゲノムのスキャフォールド配列を参考にして、Hspa5の開始コドン配列の上流約3.0kbpのヌクレオチドから開始コドン配列に対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドまでの配列を用いた。
Hspa5プロモーターのプライマーセット
Hspa5-KpnI-F:GGGGGGGTACCTATAGCCCAGGCACACATGAACTTG(配列番号10)
Hspa5-HindIII-R:GGGGGAAGCTTCTTGCCGGCGCTGTGGGCCAGTGCT(配列番号11)
前記3-1)に記載の方法に準じて、Rps14(ribosomal protein S14)、Gapdh(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、Eef1a1(eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1)、Rps11(40S ribosomal protein S11-like)、Rplp0(60S acidic ribosomal protein P0-like)、Rps4(ribosomal protein S4)、PKM(pyruvate kinase isozymes M1/M2-like)、Rps2(ribosomal protein S2)、Actb(actin, beta)、Chub2(polyubiquitin)、Rps3(40S ribosomal protein S3a-like)、Prdx1(peroxiredoxin 1)、Rpsa(ribosomal protein SA)、Rps25(40S ribosomal protein S25-like)、Rpl8(60S ribosomal protein L8-like)、Fth1(ferritin heavy chain 1)、Hspd1(heat shock protein 1)のプロモーター領域のクローニングを行い、pGL4.10[luc2]のマルチクローニングサイトに挿入した。
次に、pEF1/V5-His A(Invitorogen)をテンプレートとして、以下に示すプライマーセットとKOD -Plus- Ver.2(TOYOBO)を用いたPCRでヒトEF1-αプロモーターを増幅し、QIAquick PCR Purification kitで精製した。精製したDNA断片をNheI-HindIIIで消化した後、pGL4.10[luc2]のNheI-HindIIIサイト間に挿入して、pGL4.10-hEF1αを構築した。
hEF1αプロモーターのプライマーセット
hEF1α-NheI-F:GAGTGGGCTAGCGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTG(配列番号12)
hEF1α-HindIII-R:GAGTGGAAGCTTCCTCACGACACCTGAAATGGAAG(配列番号13)
(実施例4)ホタルルシフェラーゼの一過性発現量を指標とした各プロモーターの活性評価
(1-2)に記載のCHO-O1細胞を、Opti-MEM I Reduced Serum Medium(Life Technologies Corporation)にて2.5×105 cells/mLに懸濁し、24 wellプレートに1mLずつ播種した。実施例3で構築した各プロモーターを挿入したpGL4.10[luc2] 3.2μgとトランスフェクション効率補正用のコントロールベクターpGL4.74[hRluc/TK](PROMEGA) 0.4μgをOptiPro SFM(Life Technologies Corporation) 68μLで希釈した。一方、Lipofectamine 2000 CD(Life Technologies Corporation) 8μLをOptiPro SFM 68μLで希釈し、前記プラスミド溶液と混合し、20分間、室温で放置した。その後、半量ずつ2 wellに添加し、5%CO2、37℃で培養した。
トランスフェクションの翌日、Dual-Luciferase Reporter Assay System(PROMEGA)を用いてルシフェラーゼの一過性発現量を測定した。具体的には培養液を9000G×1分間遠心して上清を除去し、PBSで1回洗浄した後、キット添付のPassive Lysis Bufferを用いて細胞ライセートを調製した。そして前記キットとルミノメーターを用いて、ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼの発光量を測定した。
Hspa5遺伝子は、トランスクリプトーム解析で培養後期に発現量が上昇していたことから、培養後期でのプロモーター活性の増強が示唆された。また、Hspa5遺伝子のプロモーターは、ルシフェラーゼアッセイを利用した一過性発現による評価において強いプロモーター活性を示した。そこで、本プロモーターの評価を、抗体の安定発現細胞を作製し、流加培養により行った。
非特許文献9記載のpDSLH4.1をベクター基本骨格として有し、抗体H鎖およびL鎖遺伝子のプロモーターに特許文献2に記載のヒトRPS7、DNAエレメントに特許文献2に記載のA7を使用したヒト化抗体遺伝子Y発現ベクターpDSLHA4.1-hRPS7-Yを構築した。続いて、ヒト化抗体遺伝子Y発現ベクターpDSLHA4.1-hRPS7-Yの、抗体H鎖およびL鎖遺伝子のプロモーターをHspa5、あるいは、ヒトEF1-αに置換した、pDSLHA4.1-Hspa5-Y、および、pDSLHA4.1-hEF1α-Yを構築した。ベクター概略を図4に示す。
Hspa5プロモーターのプライマーセット
Hspa5-NotI-F:GGGGGGCGGCCGCTATAGCCCAGGCACACATGAACTTG(配列番号14)
Hspa5-XbaI-R:GGGGGTCTAGACTTGCCGGCGCTGTGGGCCAGTGCT(配列番号15)
hEF1αプロモーターのプライマーセット
hEF1α-NotI-F:GAGTGGGCGGCCGCGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTG(配列番号16)
hEF1α-NheI-R:GAGTGGGCTAGCCCTCACGACACCTGAAATGGAAG(配列番号17)
(5-1)で構築した抗体発現ベクターpDSLHA4.1-Hspa5-Y、pDSLHA4.1-hRPS7-Y、あるいは、pDSLHA4.1-hEF1α-Yを、(1-2)に記載のCHO-O1細胞に(4-1)に記載の方法でトランスフェクションした。遺伝子導入の1日後、培養液を遠心して上清を除去、Geneticin 800 μg/mLを含む培地で懸濁し、6 wellプレートで1週間薬剤選択培養を行った。その後、T-25フラスコ、続いて、125 mL容三角フラスコにて5%CO2、37℃で培養し、ヒト化抗体Y発現ステーブルプールを作製した。ステーブルプールはそれぞれの抗体発現ベクターでN=2で作製した。
(5-2)で作製したヒト化抗体Y発現ステーブルプールを用いて、125 mL容三角フラスコにて流加培養を行った。基礎培地にG13、フィード培地にF13を用いた。
(5-3)で実施した流加培養で経時的に取得した細胞を用いて、目的の抗体Y遺伝子のmRNAレベルでの発現量をリアルタイムPCRにより比較した。流加培養の4、6、9、10、11日目の細胞からRNeasy Micro Kit(QIAGEN)を用いて抽出したtotal RNAをテンプレートとして、PrimeScript High Fidelity RT-PCR Kit(タカラバイオ)を用いて逆転写反応を行い、cDNAを合成した。次に、逆転写反応液をテンプレートとして、以下に示すプライマーセットとSYBR Premix Ex Taq II(タカラバイオ)を用いて、リアルタイムPCRを実施した。H鎖遺伝子は遺伝子導入時に使用したヒト化抗体Y発現ベクター、Gapdh遺伝子は以下に示すプライマーセットで増幅したDNA断片をTOPOクローニングしたプラスミドDNAを用いて検量線を作成し、各サンプルのH鎖遺伝子およびGapdh遺伝子のコピー数を算出した。各サンプルのH鎖遺伝子のコピー数をGapdh遺伝子のコピー数で割って標準化したH鎖遺伝子の発現量を図6に示す。Hspa5プロモーターでのH鎖遺伝子のmRNA発現量は、培養初期ではコントロールとして用いたヒトRPS7プロモーターと同程度、ヒトEF1-αプロモーターよりも低かった。しかしながら、培養中期以降ではHspa5プロモーターでのH鎖遺伝子の発現量は大きく上昇し、ヒトRPS7プロモーター、ヒトEF1-αプロモーターの値を大きく上回った。このmRNA発現量の経時変化は図5Cで示したタンパク質発現量の結果と同様の結果であった。以上から、Hspa5プロモーターでの培養後期におけるタンパク質発現量の上昇がプロモーター活性の上昇によるものと示された。
H鎖遺伝子のプライマーセット
HC-F:TGGCTGAACGGCAAAGAGTA(配列番号18)
HC-R:TTGGCCTTGGAGATGGTCTT(配列番号19)
Gapdh遺伝子のプライマーセット
Gapdh-F:GTATTGGACGCCTGGTTACCAG(配列番号20)
Gapdh-R:AGTCATACTGGAACATGTAGAC(配列番号21)
ウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクターpGL4.82[hRluc/Puro](PROMEGA)のマルチクローニングサイトにHspa5プロモーター、ヒトRPS7プロモーター、あるいは、ヒトEF1-αプロモーターを挿入し、pGL4.82-Hspa5、pGL4.82-hRPS7、あるいは、pGL4.82-hEF1αを構築した。
hRPS7プロモーターのプライマーセット
hRPS7-XhoI-F:GGGGGCTCGAGTGTATATTAACAGCACATTA(配列番号22)
hRPS7-HindIII-R:GGGGGAAGCTTCGGCTTTCTCCTGGGAGAAC(配列番号23)
また、(3-3)で調製したNheI-HindIIIで消化済みのヒトEF1-αプロモーター配列を、pGL4.82[hRluc/Puro]のNheI-HindIIIサイト間に挿入して、pGL4.82-hEF1αを構築した。
(6-1)で構築したウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクターpGL4.82-Hspa5、pGL4.82-hRPS7、あるいは、pGL4.82-hEF1αを、(1-2)に記載のCHO-O1細胞に(4-1)に記載の方法でトランスフェクションした。遺伝子導入の1日後、培養液を遠心して上清を除去、Puromycin 8 μg/mLを含む培地で懸濁し、6 wellプレートで12日間薬剤選択培養を行った。その後、T-25フラスコ、続いて、125 mL容三角フラスコにて5%CO2、37℃で培養し、ウミシイタケルシフェラーゼ発現ステーブルプールを作製した。ステーブルプールはそれぞれのウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクターでN=3で作製した。
(6-2)で作製したウミシイタケルシフェラーゼ発現ステーブルプールを用いて、125 mL容三角フラスコにて流加培養を行った。基礎培地にG13、フィード培地にF13を用いた。流加培養の3,4,7,9,11日目の細胞についてRenilla Luciferase Assay System(PROMEGA)を用いて、ウミシイタケルシフェラーゼの発現量を測定した。
ヒト化抗体遺伝子Y発現ベクターpDSLHA4.1-hRPS7-Yの、抗体H鎖およびL鎖遺伝子のプロモーターをHspa5プロモーターの部分配列に置換した、pDSLHA4.1-Hspa5-2.5-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-2.0-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-1.5-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-1.1-Y、および、pDSLHA4.1-Hspa5-0.6-Yを構築した。それぞれの発現ベクターで、Hspa5の開始コドン配列の上流約2.5、2.0、1.5、1.1、0.6kbpのヌクレオチドから開始コドン配列に対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドまでの配列を、Hspa5プロモーターの部分配列として用いた。
Hspa5プロモーター 2.5kbpのプライマーセット
Hspa5-NotI-2500F:GGGGGGCGGCCGCTGGTCGGTGGTTAAGAGCAC(配列番号24)
Hspa5-XbaI-R:GGGGGTCTAGACTTGCCGGCGCTGTGGGCCAGTGCT(配列番号15)
Hspa5プロモーター 2.0kbpのプライマーセット
Hspa5-NotI-2000F:GGGGGGCGGCCGCTCCCAACTGGACACAGTAAT(配列番号25)
Hspa5-XbaI-R:GGGGGTCTAGACTTGCCGGCGCTGTGGGCCAGTGCT(配列番号15)
Hspa5プロモーター 1.5kbpのプライマーセット
Hspa5-NotI-1500F:GGGGGGCGGCCGCAATTCTACCTGTACCACTCA(配列番号26)
Hspa5-XbaI-R:GGGGGTCTAGACTTGCCGGCGCTGTGGGCCAGTGCT(配列番号15)
Hspa5プロモーター 1.1kbpのプライマーセット
Hspa5-NotI-1100F:GGGGGGCGGCCGCCGGGAACATTATGGGGCGAC(配列番号27)
Hspa5-XbaI-R:GGGGGTCTAGACTTGCCGGCGCTGTGGGCCAGTGCT(配列番号15)
Hspa5プロモーター 0.6kbpのプライマーセット
Hspa5-NotI-600F:GGGGGGCGGCCGCGGAACTGACACGCAGACCCC(配列番号28)
Hspa5-XbaI-R:GGGGGTCTAGACTTGCCGGCGCTGTGGGCCAGTGCT(配列番号15)
(5-1)および(7-1)で構築した抗体発現ベクターpDSLHA4.1-hRPS7-Y、pDSLHA4.1-hEF1α-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-2.5-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-2.0-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-1.5-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-1.1-Y、あるいは、pDSLHA4.1-Hspa5-0.6-Yを、(1-2)に記載のCHO-O1細胞に(4-1)に記載の方法でトランスフェクションした。そして、(5-2)に記載の方法で薬剤選択培養を行い、ヒト化抗体Y発現ステーブルプールを作製した。ステーブルプールはそれぞれの抗体発現ベクターでN=3で作製した。
(7-2)で作製したヒト化抗体Y発現ステーブルプールを用いて、125 mL容三角フラスコにて流加培養を行った。基礎培地にG13、フィード培地にF13を用いた。
(7-2)で、Hspa5プロモーターの部分配列0.6kbpを使用して作製したヒト化抗体Y発現ステーブルプールからモノクローンを取得し、流加培養による抗体生産量の評価を行った。
ヒト化抗体遺伝子Y発現ベクターpDSLHA4.1-hRPS7-Yの、抗体H鎖およびL鎖遺伝子のプロモーターをヒト、マウス、ラットHspa5プロモーターに置換した、pDSLHA4.1-hHspa5-Y、pDSLHA4.1-mHspa5-Y、pDSLHA4.1-rHspa5-Yを構築した。それぞれ、Hspa5の開始コドン配列の上流約1.0kbpのヌクレオチドから開始コドン配列に対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドまでの配列を、Hspa5プロモーターとして用いた。クローニングしたヒト、マウス、ラットHspa5プロモーターののヌクレオチド配列をそれぞれ配列表の配列番号2、3、4に示す。
ヒトHspa5プロモーターのプライマーセット
Hspa5-human-NotI-F:GTGTTGCGGCCGCACAGTAGGGAGGGGACTCAGAGC(配列番号29)
Hspa5-human-NheI-R:GTGGGGCTAGCCTTGCCAGCCAGTTGGGCAGCAG(配列番号30)
マウスHspa5プロモーターのプライマーセット
Hspa5-mouse-NotI-F:GGTGGGCGGCCGCATGGTGGAAAGTGCTCGTTTGACC(配列番号31)
Hspa5-mouse-XbaI-R:GGTGGTCTAGAGCCGGCGCTGAGGACCAGTCGCTC(配列番号32)
ラットHspa5プロモーターのプライマーセット
Hspa5-rat-NotI-F:GGTGAGCGGCCGCCTCAACGGAGAAGGGCTCCGGAC(配列番号33)
Hspa5-rat-XbaI-R:GGTAGGTCTAGACTTGCCGGCGCTGTGGACCAGTC(配列番号34)
(7-1)および(8-1)で構築した抗体発現ベクターpDSLHA4.1-Hspa5-1.1-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-0.6-Y、pDSLHA4.1-hHspa5-Y、pDSLHA4.1-mHspa5-Y、あるいは、pDSLHA4.1-rHspa5-Yを、(1-2)に記載のCHO-O1細胞に(4-1)に記載の方法でトランスフェクションした。そして、(5-2)に記載の方法で薬剤選択培養を行い、ヒト化抗体Y発現ステーブルプールを作製した。ステーブルプールはそれぞれの抗体発現ベクターでN=2で作製した。
(8-2)で作製したヒト化抗体Y発現ステーブルプールを用いて、125 mL容三角フラスコにて流加培養を行った。基礎培地にG13、フィード培地にF13を用いた。
(7-1)で構築したDNAエレメントA7を含む抗体発現ベクターpDSLHA4.1-Hspa5-1.1-Y、あるいは、pDSLHA4.1-Hspa5-0.6-Y、または、DNAエレメントA7を含まない抗体発現ベクターpDSLH3.1-Hspa5-1.1-Y、あるいはpDSLH3.1-Hspa5-0.6-Yを、(1-2)に記載のCHO-O1細胞に(4-1)に記載の方法でトランスフェクションした。そして、(5-2)に記載の方法で薬剤選択培養を行い、ヒト化抗体Y発現ステーブルプールを作製した。ステーブルプールはそれぞれの抗体発現ベクターでN=2で作製した。
(9-1)で作製したヒト化抗体Y発現ステーブルプールを用いて、125 mL容三角フラスコにて流加培養を行った。基礎培地にG13、フィード培地にF13を用いた。
配列番号2:ヒト由来Hspa5のプロモーター
配列番号3:マウス由来Hspa5のプロモーター
配列番号4:ラット由来Hspa5のプロモーター
配列番号5:チャイニーズハムスター由来Hspa5のプロモーター Hspa5の開始コドンの上流約2.5kbpのヌクレオチドから開始コドンに対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドまでからなるヌクレオチド配列
配列番号6:チャイニーズハムスター由来Hspa5のプロモーター Hspa5の開始コドンの上流約2.0kbpのヌクレオチドから開始コドンに対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドまでからなるヌクレオチド配列
配列番号7:チャイニーズハムスター由来Hspa5のプロモーター Hspa5の開始コドンの上流約1.5kbpのヌクレオチドから開始コドンに対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドまでからなるヌクレオチド配列
配列番号8:チャイニーズハムスター由来Hspa5のプロモーター Hspa5の開始コドンの上流約1.1kbpのヌクレオチドから開始コドンに対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドまでからなるヌクレオチド配列
配列番号9:チャイニーズハムスター由来Hspa5のプロモーター Hspa5の開始コドンの上流約0.6kbpのヌクレオチドから開始コドンに対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドまでからなるヌクレオチド配列
配列番号10:Hspa5プロモーターのプライマー Hspa5-KpnI-F
配列番号11:Hspa5プロモーターのプライマー Hspa5-HindIII-R
配列番号12:hEF1αプロモーターのプライマー hEF1α-NheI-F
配列番号13:hEF1αプロモーターのプライマー hEF1α-HindIII-R
配列番号14:Hspa5プロモーターのプライマー Hspa5-NotI-F
配列番号15:Hspa5プロモーターのプライマー Hspa5-XbaI-R
配列番号16:hEF1αプロモーターのプライマー hEF1α-NotI-F
配列番号17:hEF1αプロモーターのプライマー hEF1α-NheI-R
配列番号18:ヒト化抗体YのH鎖遺伝子のプライマー HC-F
配列番号19:ヒト化抗体YのH鎖遺伝子のプライマー HC-R
配列番号20:Gapdh遺伝子のプライマー Gapdh-F
配列番号21:Gapdh遺伝子のプライマー Gapdh-R
配列番号22:hRPS7プロモーターのプライマー hRPS7-XhoI-F
配列番号23:hRPS7プロモーターのプライマー hRPS7-HindIII-R
配列番号24:Hspa5プロモーター 2.5kbpのプライマー Hspa5-NotI-2500F
配列番号25:Hspa5プロモーター 2.0kbpのプライマー Hspa5-NotI-2000F
配列番号26:Hspa5プロモーター 1.5kbpのプライマー Hspa5-NotI-1500F
配列番号27:Hspa5プロモーター 1.1kbpのプライマー Hspa5-NotI-1100F
配列番号28:Hspa5プロモーター 0.6kbpのプライマー Hspa5-NotI-600F
配列番号29:ヒトHspa5プロモーターのプライマー Hspa5-human-NotI-F
配列番号30:ヒトHspa5プロモーターのプライマー Hspa5-human-NheI-R
配列番号31:マウスHspa5プロモーターのプライマー Hspa5-mouse-NotI-F
配列番号32:マウスHspa5プロモーターのプライマー Hspa5-mouse-XbaI-R
配列番号33:ラットHspa5プロモーターのプライマー Hspa5-rat-NotI-F
配列番号34:ラットHspa5プロモーターのプライマー Hspa5-rat-XbaI-R
配列番号35:DNAエレメントA2のヌクレオチド配列
配列番号36:DNAエレメントA7のヌクレオチド配列
配列番号37:DNAエレメントA18のヌクレオチド配列
Claims (25)
- チャイニーズハムスター由来Hspa5遺伝子のプロモーターであって、配列番号9に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、配列番号1に記載のヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列の部分配列からなるポリヌクレオチド。
- 配列番号1に記載のヌクレオチド配列からなる、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号5に記載のヌクレオチド配列からなる、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号6に記載のヌクレオチド配列からなる、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号7に記載のヌクレオチド配列からなる、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号8に記載のヌクレオチド配列からなる、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号9に記載のヌクレオチド配列からなる、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- ヒト由来Hspa5遺伝子のプロモーターである、配列表の配列番号2に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
- マウス由来Hspa5遺伝子のプロモーターである、配列表の配列番号3に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
- ラット由来Hspa5遺伝子のプロモーターである、配列表の配列番号4に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
- 請求項1乃至10のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含むことからなる、外来遺伝子発現ユニット。
- 外来遺伝子が多量体蛋白質をコードする遺伝子である、請求項11に記載の外来遺伝子発現ユニット。
- 外来遺伝子がヘテロ多量体蛋白質をコードする遺伝子である、請求項11に記載の外来遺伝子発現ユニット。
- 外来遺伝子が抗体又はその抗原結合性断片をコードする遺伝子である、請求項11に記載の外来遺伝子発現ユニット。
- 請求項11乃至14のいずれか一つに記載の外来遺伝子発現ユニットを含む外来遺伝子発現ベクター。
- 請求項11乃至14のいずれか一つに記載の外来遺伝子発現ユニット及び下記A群の(a)乃至(e)に記載のポリヌクレオチドから選択されるいずれか一つ又は複数のポリヌクレオチドを含む外来遺伝子発現ベクター;
A群
(a)配列表の配列番号35に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
(b)配列表の配列番号36に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
(c)配列表の配列番号37に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
(d)前記(a)乃至(c)のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列の全長に対して95%以上同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、外来遺伝子発現亢進活性を有するポリヌクレオチド、
(e)上記(a)乃至(c)のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列の全長に対して99%以上同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、外来遺伝子発現亢進活性を有するポリヌクレオチド。 - 請求項15又は16に記載の外来遺伝子発現ベクターが導入された形質転換細胞。
- 細胞が哺乳動物由来の培養細胞である、請求項17に記載の形質転換細胞。
- 哺乳動物由来の培養細胞が、COS-1細胞、293細胞、又はCHO細胞である、請求項18に記載の形質転換細胞。
- 請求項17乃至19のいずれか一つに記載の形質転換細胞を培養し、培養物から外来遺伝子由来の蛋白質を取得することを特徴とする、該蛋白質の製造方法。
- 形質転換細胞において外来遺伝子を発現させることを目的とする、請求項1乃至10のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの使用。
- 形質転換細胞において外来遺伝子を発現させることを目的とする、請求項15又は16に記載の外来遺伝子発現ベクターの使用。
- 外来遺伝子由来の蛋白質が、単量体蛋白質又は多量体蛋白質である、請求項20に記載の製造方法。
- 多量体蛋白質が、ヘテロ多量体蛋白質である、請求項23に記載の製造方法。
- ヘテロ多量体蛋白質が、抗体蛋白質である、請求項24に記載の製造方法。
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