TW202400789A - Ｅｎｏ１基因的啟動子 - Google Patents

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Abstract

作為提供在哺乳動物培養細胞等宿主細胞中具有較高的外來基因表現亢進活性之啟動子及使用該啟動子使成為蛋白質性醫藥品之外來蛋白質的生產量亢進之手段，本發明提供一種多核苷酸，其係源自中國倉鼠之基因的啟動子，該多核苷酸係選自序列編號1、序列編號3、序列編號4、序列編號10、序列編號11、序列編號12、序列編號13及序列編號14，或者包含與該等序列具有至少85%以上的序列同一性之核苷酸序列或該核苷酸序列的部分序列而成。

Description

Ｅｎｏ１基因的啟動子
本發明係關於藉由使用具有Eno1基因的啟動子之外來基因表現載體所獲得之外來蛋白質的轉錄活性增強之哺乳動物轉形細胞，及使用該哺乳動物轉形細胞之該外來蛋白質的製造方法。
隨著基因重組技術的發展，治療用蛋白質、抗體醫藥之類的蛋白質性醫藥品正急速擴大其市場。在該等之中，抗體醫藥被認為即便投予至人體，引起有害的免疫反應之風險亦較低，且由於其特異性較高而正積極進行開發。
作為生產以抗體醫藥為代表之蛋白質性醫藥之宿主，可列舉微生物、酵母、動植物細胞、昆蟲、基因轉殖動植物等。就蛋白質性醫藥的生理活性、抗原性而言，大多需要正確的摺疊、醣鏈修飾等之轉譯後修飾，因而無法施行醣鏈修飾之微生物、醣鏈結構大不相同的植物不適合作為宿主。具有與人類類似的醣鏈結構，能夠進行轉譯後修飾，再者，從眾多使用實績而言，在安全性之方面並無疑慮之CHO(Chinese Hamster Ovary：中國倉鼠的卵巢)細胞等哺乳動物培養細胞已成為目前的主流。
在以哺乳動物培養細胞作為宿主之情況，相較於微生物等而言，存有增殖速度較低、生產性較低、高昂的成本等問題(非專利文獻1)。此外，為了在臨床上利用抗體醫藥品，需要大量的投予，因而其生產能力不足已在全世界成為問題。在以哺乳類培養細胞表現系統製造蛋白質性醫藥品之情況，相比於合成低分子醫藥品而言，製造成本較高，因而試圖藉由改良各製造步驟來減低製造成本，但提升在哺乳類培養細胞表現系統中之生產量亦屬減低製造成本之有力的方法(非專利文獻2、3)。於是，為了提升外來蛋白質在哺乳動物培養細胞中之生產性，迄今為止，已對啟動子、增強子、藥劑選擇標記、基因增幅、培養工程手法等許多方法進行試錯。
在使用CHO細胞作為宿主細胞之情況，就外來基因的表現，即，蛋白質性醫藥品的生產而言，一般係使用源自病毒之人類巨細胞病毒主要立即早期啟動子(human cytomegalovirus major immediate early promoter) (以下，簡稱為CMV啟動子)(非專利文獻4、5、6)。此外，已知在CHO細胞中，可使屬於延長因子-1α(elongation factor-1 alpha)之EF1α(專利文獻1、非專利文獻7)、屬於人類核糖體蛋白質基因之RPL32、RPS11的轉錄起始點的上游區域的多核苷酸(啟動子區域)單獨地或與其他異種啟動子進行組合而使用於蛋白質表現(非專利文獻8、專利文獻2、3)。在哺乳動物細胞中，已知使外來蛋白質的生產性提升之熱休克蛋白A5(Hspa5/GRP78)基因及熱休克蛋白A8(Hspa8)的啟動子(專利文獻4、5)。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1] 日本專利第3051411號 [專利文獻2] 國際公報第2006/123097號 [專利文獻3] 國際公報第2013/080934號 [專利文獻4] 國際公報第2018/066492號 [專利文獻5] 國際公報第2020/032153號 [非專利文獻]
[非專利文獻1] Florian M. Wurm., Nat. Biotechnol. 22(11):1393-1398, 2004 [非專利文獻2] Farid SS., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 848(1):8-18, 2007 [非專利文獻3] Werner RG. Economic aspects of commercial manufacture of biopharmaceuticals. J Biotechnol. 113(1-3):171-182, 2004 [非專利文獻4] Durocher Y et al., Curr Opin Biotechnol. 20(6):700-707, 2009 [非專利文獻5] Boshart M et al., Cell. 41(2):521-530, 1985 [非專利文獻6] Foecking MK et al., Gene. 45(1):101-105, 1986 [非專利文獻7] Deer JR. and Allison DS., Biotechnol. Prog. 20:880-889, 2004 [非專利文獻8] Hoeksema F. et al., Biotechnology Research International, Volume 2011, Article ID 492875, 11 pages
[發明所欲解決之課題]
本發明之課題係在於提供在哺乳動物培養細胞等之宿主細胞中具有較高的外來基因表現亢進活性之啟動子，以及提供使用該啟動子使成為蛋白質性醫藥品之外來蛋白質的生產量亢進之手段。 [解決課題之手段]
為了解決上述課題，本發明提供以下[1]-[34]。 [1] 一種多核苷酸，其係源自中國倉鼠之基因的啟動子， 該多核苷酸係選自序列編號1、序列編號3、序列編號4、序列編號10、序列編號11、序列編號12、序列編號13及序列編號14，或者 包含與該等序列具有至少85%以上的序列同一性之核苷酸序列或該核苷酸序列的部分序列而成。 [2] 如[1]之多核苷酸，其係選自序列編號1、序列編號3、序列編號4、序列編號10、序列編號11及序列編號12，或者 包含與該等序列具有至少85%以上的序列同一性之核苷酸序列或該核苷酸序列的部分序列而成。 [2a] 如[1]或[2]之多核苷酸，其係包含序列編號18的核苷酸序列或與該序列具有至少85%以上的序列同一性之核苷酸序列而成。 [3] 如[1]之多核苷酸，其係由與序列編號1的核苷酸序列具有至少99%以上的序列同一性之核苷酸序列所構成。 [4] 如[1]之多核苷酸，其係由與序列編號3的核苷酸序列具有至少99%以上的序列同一性之核苷酸序列所構成。 [5] 如[1]之多核苷酸，其係由與序列編號4的核苷酸序列具有至少99%以上的序列同一性之核苷酸序列所構成。 [6] 如[1]之多核苷酸，其係由與序列編號10的核苷酸序列具有至少99%以上的序列同一性之核苷酸序列所構成。 [7] 如[1]之多核苷酸，其係由與序列編號11的核苷酸序列具有至少99%以上的序列同一性之核苷酸序列所構成。 [8] 如[1]之多核苷酸，其係由與序列編號12的核苷酸序列具有至少99%以上的序列同一性之核苷酸序列所構成。 [9] 如[1]之多核苷酸，其係由與序列編號13的核苷酸序列具有至少99%以上的序列同一性之核苷酸序列所構成。 [10] 如[1]之多核苷酸，其係由與序列編號14的核苷酸序列具有至少99%以上的序列同一性之核苷酸序列所構成。 [10a] 一種多核苷酸，其係源自中國倉鼠之基因的啟動子，且包含序列編號18的核苷酸序列或與該序列具有至少85%以上的序列同一性之核苷酸序列而成。 [10b] 如[10a]之多核苷酸，其係選自序列編號1、序列編號3、序列編號4、序列編號10、序列編號11、序列編號12及序列編號13，或者 包含與該等序列具有至少85%以上的序列同一性之核苷酸序列或該核苷酸序列的部分序列而成。
[11] 一種多核苷酸，其係源自小鼠之基因的啟動子， 該多核苷酸係選自序列編號2、序列編號17及序列編號16，或者 包含與該等序列具有至少85%以上的序列同一性之核苷酸序列或該核苷酸序列的部分序列而成。 [11a] 如[11]之多核苷酸，其係包含與序列編號18的核苷酸序列具有至少85%以上的序列同一性之核苷酸序列而成。 [12] 如[11]之多核苷酸，其係由與序列編號2的核苷酸序列具有至少99%以上的序列同一性之核苷酸序列所構成。 [13] 如[11]之多核苷酸，其係由與序列編號17的核苷酸序列具有至少99%以上的序列同一性之核苷酸序列所構成。 [14] 如[11]之多核苷酸，其係由與序列編號16的核苷酸序列具有至少99%以上的序列同一性之核苷酸序列所構成。 [14a] 一種多核苷酸，其係源自小鼠之基因的啟動子，該多核苷酸包含與序列編號18的核苷酸序列具有至少85%以上的序列同一性之核苷酸序列而成。 [14b] 如[14a]之多核苷酸，其係選自序列編號2、序列編號17及序列編號16，或者 包含與該等序列具有至少85%以上的序列同一性之核苷酸序列或該核苷酸序列的部分序列而成。
[15] 一種多核苷酸，其係包含對如[1]或[11]之序列編號1、序列編號3、序列編號4、序列編號10、序列編號11、序列編號12、序列編號13、序列編號14、序列編號2、序列編號17或序列編號16的核苷酸序列具有90%以上的序列同一性之核苷酸序列或該核苷酸序列的部分序列而成， 且具有啟動子活性。 [16] 一種多核苷酸，其係包含對如[1]或[11]之序列編號1、序列編號3、序列編號4、序列編號10、序列編號11、序列編號12、序列編號13、序列編號14、序列編號2、序列編號17或序列編號16的核苷酸序列具有95%以上的序列同一性之核苷酸序列或該核苷酸序列的部分序列而成， 且具有啟動子活性。 [17] 一種多核苷酸，其係與由與如[1]或[11]之序列編號1、序列編號3、序列編號4、序列編號10、序列編號11、序列編號12、序列編號13、序列編號14、序列編號2、序列編號17或序列編號16的核苷酸序列互補的核苷酸序列所構成之多核苷酸在嚴苛的條件下進行雜交之多核苷酸，且具有啟動子活性。 [17a] 如[1]-[17]中任一項之多核苷酸，其中，長度為1kbp以上且10kbp以下、2kbp以上且6kbp以下、2.6kbp以上且5kbp以下、2.7kbp以上且4.5kbp以下、2.8kbp以上且4kbp以下。 [18] 一種多核苷酸，其包含如[1]-[17]及[17a]中任一項之多核苷酸及外來基因。
[19] 一種外來基因表現單元，其包含如[1]-[18]及[17a]中任一項之多核苷酸及外來基因。 [19a] 如[19]之外來基因表現單元，其進一步包含轉錄終止子區域。 [20] 如[19]或[19a]之外來基因表現單元，其中，外來基因為編碼出蛋白質之基因。 [21] 如[20]之外來基因表現單元，其中，外來基因為編碼出異源多聚體蛋白質之基因。 [22] 如[21]之外來基因表現單元，其中，外來基因為編碼出抗體或其抗原結合性片段之基因。 [23] 一種外來基因表現載體，其包含如[19]-[22]及[19a]中任一項之外來基因表現單元。 [24] 一種外來基因表現載體，其包含 如[19]-[22]及[19a]中任一項之外來基因表現單元，及 選自下述(a)～(e)中之任一者以上的多核苷酸； (a)序列編號5的核苷酸序列或其部分序列， (b)序列編號6的核苷酸序列或其部分序列， (c)序列編號7的核苷酸序列或其部分序列， (d)包含對序列編號5、序列編號6或序列編號7的核苷酸序列具有80%以上的序列同一性之核苷酸序列或該核苷酸序列的部分序列而成，且具有外來基因表現亢進活性之多核苷酸， (e)包含對序列編號5、序列編號6或序列編號7的核苷酸序列具有85%以上的序列同一性之核苷酸序列或該核苷酸序列的部分序列而成，且具有外來基因表現亢進活性之多核苷酸。 [24a] 一種外來基因表現載體，其包含如[19]-[22]及[19a]中任一項之外來基因表現單元，及下述(b)或(d)的多核苷酸； (b)序列編號6的核苷酸序列或其部分序列， (d)包含對序列編號6的核苷酸序列具有80%以上的序列同一性之核苷酸序列或該核苷酸序列的部分序列而成，且具有外來基因表現亢進活性之多核苷酸。 [25] 一種轉形細胞，其導入有如[23]、[24]或[24a]所記載之外來基因表現載體。 [26] 如[24]之轉形細胞，其係源自哺乳動物之培養細胞。 [27] 如[25]之轉形細胞，其係COS-1細胞、293細胞或CHO細胞。
[28] 一種蛋白質的製造方法，其特徵為將如[25]-[27]中任一項之轉形細胞進行培養，並從培養物中取得源自外來基因之蛋白質。 [29] 如[28]所記載之製造方法，其中，源自外來基因之蛋白質為單體蛋白質或多聚體蛋白質。 [30] 如[29]所記載之製造方法，其中，多聚體蛋白質為異源多聚體蛋白質。 [31] 如[30]所記載之製造方法，其中，異源多聚體蛋白質為抗體蛋白質。 [31a] 如[28]-[31]中任一項之製造方法，其中，轉形細胞的培養為饋料批次培養。 [31b] 如[28]-[31]及[31a]中任一項之製造方法，其中，轉形細胞係培養6日以上。
[32] 一種如[1]-[18]中任一項之多核苷酸的用途，其係用於使外來基因在轉形細胞中進行表現。 [33] 一種如[23]或[24]之外來基因表現載體的用途，其目的為使外來基因在轉形細胞中進行表現。
[34] 一種製造表現外來基因之轉形細胞之方法，其係藉由將如[23]、[24]或[24a]之外來基因載體進行基因導入而成。 [發明效果]
藉由本發明，係提供在哺乳動物培養細胞等之宿主細胞中具有較高的外來基因表現亢進活性之啟動子，及使用該啟動子使成為蛋白質性醫藥品之外來蛋白質的生產量亢進之手段。
以下，針對用於實施本發明之適合的形態進行說明。另外，以下所說明之實施形態表示本發明的代表性實施形態之一例，並非藉此狹隘地解釋本發明的範圍。
在本說明書中，所謂「基因」，係意味會被轉錄成mRNA並被轉譯成蛋白質之部分，不僅包含DNA，亦包含其mRNA、cDNA及其RNA。 在本說明書中，所謂「多核苷酸」，係以與核酸相同的意義使用，亦包含DNA、RNA、探針、寡核苷酸及引子。 在本說明書中，「多肽」與「蛋白質」係無區別地使用。 在本說明書中，所謂「基因表現」，係意味某基因被轉錄成mRNA之現象，及/或自該mRNA轉譯成蛋白質之現象。 在本說明書中，所謂「外來基因」，係意味被人工地導入宿主細胞中之基因。 在本說明書中，所謂「外來蛋白質」，係意味外來基因所編碼出之蛋白質。 在本說明書中，所謂「基因表現單元」，係意味在轉錄的讀框的方向至少具有啟動子區域、外來基因、轉錄終止子區域(poly A加成訊號)之多核苷酸。 在本說明書中，所謂「啟動子」，係意味參與自DNA向RNA之轉錄的開始之轉錄因子所結合之區域。在本說明書中，有時亦稱為「啟動子區域」。作為啟動子，可例示例如起始密碼子的上游約3kbp的核苷酸起至緊接在對應於起始密碼子之核苷酸序列之前之核苷酸為止之多核苷酸，亦可包含5’UTR及內含子。 在本說明書中，所謂「啟動子活性」，係指轉錄因子結合至啟動子，開始進行轉錄，並施行基因所編碼出之蛋白質的生產之活性，能夠以螢火蟲螢光素酶等之報導基因所編碼出之蛋白質的活性作為指標予以檢定。 在本說明書中，所謂「具有啟動子活性」，係指在與後述(實施例2)所記載之以饋料批次培養中之抗體表現量作為指標之啟動子活性的評價同樣的條件下，看得出抗體表現，或者在與後述(實施例3)所記載之方法同樣的條件下，螢火蟲螢光素酶顯示出活性。 在本說明書中，所謂「DNA分子」，係意味在配置於基因表現單元的附近之情況，或在配置於包含基因表現單元之外來基因表現載體上之情況，具有外來基因表現亢進活性之多核苷酸。 在本說明書中，所謂「抗體的抗原結合性片段」，係意味具有與抗原之結合活性之抗體的部分片段，包含Fab、F(ab’) 2等，但在具有與抗原之結合能力之前提下，並不限定於此等分子。 在本說明書中，所謂「序列同一性」，係指如該領域中所公知，藉由序列的比較所決定之2個以上核苷酸序列或胺基酸序列的序列間之關係。在該領域中，「序列同一性」係意味因應情況，藉由一列的2個以上核苷酸序列間或2個以上胺基酸序列間之一致性決定時之核酸分子間或多肽間之序列相關性的程度。「序列同一性」可藉由算出2個以上序列之中較小者與由特定的數理模型或電腦程式(即，「演算法」)進行位址指定之間隙比對(存在之情況)之間之同一一致性的百分比而予以評價。具體而言，可使用歐洲分子生物學實驗室-歐洲生物資訊研究所(European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute(EMBL-EBI))所提供之ClustalW2等軟體予以評價，但只要是熟習該項技術者中所使用者，即不限定於此。 在本說明書中，所謂「在嚴苛的條件下進行雜交」，係指形成所謂的特異性雜交體且不形成非特異性雜交體之條件。可列舉例如由對某核酸之序列同一性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，最佳為99%以上的核苷酸序列所構成之核酸的互補鏈會進行雜交，且由序列同一性比其低的核苷酸序列所構成之核酸的互補鏈不會進行雜交之條件。更具體而言，係意味在於市售的雜交溶液ExpressHyb Hybridization Solution(Clontech公司製)中，於68℃進行雜交，或者，使用已固定DNA之過濾器在0.7至1.0M的NaCl存在下於68℃施行雜交後，使用0.1至2倍濃度的SSC溶液(所謂1倍濃度SSC，係由150mM NaCl、15mM檸檬酸鈉所構成)於68℃進行洗淨之條件或與其同等的條件下進行雜交。
在本說明書中，所謂「約」，係表示相對於基準值而言變動至各自加或減10%、8%、6%、5%、4%、3%、2%或1%之值。較佳地，用語「約」表示相對於基準值而言各自加或減10%、5%或1%的範圍。
1. 使用於使外來基因的表現亢進之啟動子 本發明之使用於使外來基因的表現亢進之啟動子(以下，有時亦稱為「本發明之啟動子」)為α-烯醇化酶(alpha-enolase)(以下，稱為「Eno1)基因的啟動子。
Eno1基因的啟動子的來源並無特別限定，亦可源自哺乳類，可列舉例如源自中國倉鼠、人類、小鼠等之Eno1基因的啟動子。本發明之啟動子較適合為源自齧齒類之Eno1基因的啟動子，更適合為源自中國倉鼠或小鼠之Eno1基因的啟動子。再更適合為源自中國倉鼠之Eno1基因的啟動子。
作為源自中國倉鼠之Eno1基因的啟動子，可例示包含Eno1基因的起始密碼子的上游例如2.0kbp、2.5kbp、2.6kbp、2.7kbp、2.8kbp、3.0kbp、3.5kbp、4.0kbp、4.5kbp、5.0kbp、5.5kbp、6.0kbp的核苷酸起至緊接在對應於起始密碼子之核苷酸序列之前之核苷酸而成之序列。 作為源自中國倉鼠之Eno1基因的啟動子，更具體而言，可例示序列編號1、3、4、10、11、12、13、14的多核苷酸。 序列編號1的核苷酸序列為由源自中國倉鼠之Eno1基因的起始密碼子的上游約3.0kbp的核苷酸起至緊接在對應於起始密碼子之核苷酸序列之前之核苷酸所構成之序列。 序列編號3的核苷酸序列為由源自中國倉鼠之Eno1基因的起始密碼子的上游約2.8kbp的核苷酸起至緊接在對應於起始密碼子之核苷酸序列之前之核苷酸所構成之序列。 序列編號4的核苷酸序列為由源自中國倉鼠之Eno1基因的起始密碼子的上游約4.0kbp的核苷酸起至緊接在對應於起始密碼子之核苷酸序列之前之核苷酸所構成之序列。 序列編號10的核苷酸序列為由源自中國倉鼠之Eno1基因的起始密碼子的上游約5.0kbp的核苷酸起至緊接在對應於起始密碼子之核苷酸序列之前之核苷酸所構成之序列。 序列編號11的核苷酸序列為由源自中國倉鼠之Eno1基因的起始密碼子的上游約4.5kbp的核苷酸起至緊接在對應於起始密碼子之核苷酸序列之前之核苷酸所構成之序列。 序列編號12的核苷酸序列為由源自中國倉鼠之Eno1基因的起始密碼子的上游約3.5kbp的核苷酸起至緊接在對應於起始密碼子之核苷酸序列之前之核苷酸所構成之序列。 序列編號13的核苷酸序列為由源自中國倉鼠之Eno1基因的起始密碼子的上游約2.7kbp的核苷酸起至緊接在對應於起始密碼子之核苷酸序列之前之核苷酸所構成之序列。 序列編號14的核苷酸序列為由源自中國倉鼠之Eno1基因的起始密碼子的上游約2.6kbp的核苷酸起至緊接在對應於起始密碼子之核苷酸序列之前之核苷酸所構成之序列。
Eno1基因的啟動子係由於其優勢的轉錄活性，可設為緊接在對應於起始密碼子序列之核苷酸序列之前之核苷酸起至起始密碼子序列的上游約2.8kbp的長度或比其更長的區域。從而，從優勢的啟動子活性之觀點而言，源自中國倉鼠之Eno1基因啟動子較佳係設為序列編號1、3、4、10、11、12的多核苷酸。源自中國倉鼠之Eno1基因啟動子更佳係可選擇序列編號1、3、4、12的多核苷酸，再佳係可選擇序列編號1、3的多核苷酸。
作為源自小鼠之Eno1基因啟動子，可例示包含Eno1基因的起始密碼子的上游例如2.0kbp、2.5kbp、3.0kbp、3.5kbp、4.0kbp、4.5kbp、5.0kbp、5.5kbp、6.0kbp的核苷酸起至緊接在對應於起始密碼子之核苷酸序列之前之核苷酸而成之序列。 作為源自小鼠之Eno1基因啟動子，更具體而言，可例示序列編號2、17、16的多核苷酸。 序列編號2的核苷酸序列為由源自小鼠之Eno1基因的起始密碼子的上游約3.0kbp的核苷酸起至緊接在對應於起始密碼子之核苷酸序列之前之核苷酸所構成之序列。 序列編號17的核苷酸序列為由源自小鼠之Eno1基因的起始密碼子的上游約3.5kbp的核苷酸起至緊接在對應於起始密碼子之核苷酸序列之前之核苷酸所構成之序列。 序列編號16的核苷酸序列為由源自小鼠之Eno1基因的起始密碼子的上游約4.0kbp的核苷酸起至緊接在對應於起始密碼子之核苷酸序列之前之核苷酸所構成之序列。
此外，本發明之啟動子亦可為包含對序列編號1、2、17、3、4、10、11、12、13、14、16中之任一核苷酸序列具有80%以上，較佳係亦可為85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上，更佳係亦可為90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上，再佳係亦可為95%以上、96%以上、97%以上、98%以上，最佳係99%以上、100%的序列同一性之核苷酸序列或該核苷酸序列的部分序列而成，且具有啟動子活性之多核苷酸。
部分序列可為具有序列編號1、2、17、3、4、10、11、12、13、14、16中之任一核苷酸序列的全長中之80%以上，較佳係亦可為85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上，更佳係亦可為90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上，再佳係亦可為95%以上、96%以上、97%以上、98%以上，最佳係99%以上、100%的長度之片段。部分序列可為全長的5’側(上游)或3’側(下游)的片段，亦可為連接全長中之複數個區域而得之片段。
本發明之啟動子亦可為與由與序列編號1、2、17、3、4、10、11、12、13、14、16中之任一核苷酸序列所構成之多核苷酸互補的核苷酸序列所構成之多核苷酸在嚴苛的條件下進行雜交，且具有啟動子活性之多核苷酸。
本發明之啟動子較佳係包含序列編號18的核苷酸序列或與該序列具有至少85%以上的序列同一性之核苷酸序列，更佳係包含具有90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上的同一性之序列，再佳係包含具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上的同一性之序列，特佳係包含具有99%以上的同一性之序列，最佳係包含具有100%的同一性之序列。 特定而言，源自中國倉鼠之Eno1啟動子較佳係包含序列編號18的核苷酸序列或與該序列具有至少85%以上的序列同一性之核苷酸序列，更佳係包含具有90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上的同一性之序列，再佳係包含具有95%以上、96%以上、97%以上、98%以上的同一性之序列，特佳係包含具有99%以上的同一性之序列，最佳係包含具有100%的同一性之序列。
本發明之啟動子的長度只要是1kbp以上且10kbp以下，即無特別限定，較佳為2kbp以上且6kbp以下，更佳為2.6kbp以上且5kbp以下，再佳為2.7kbp以上且4.5kbp以下，特佳為2.8kbp以上且4kbp以下，典型地，可設為約3kbp。就充分具有啟動子的性能之啟動子長度而言，較短者在基因導入效率之方面易於發揮效果。
本發明之啟動子亦可為屬於突變多核苷酸且具有啟動子活性之多核苷酸，該突變多核苷酸係由在序列編號1、2、17、3、4、10、11、12、13、14、16中之任一核苷酸序列中，1或複數個，較佳為1至300個，更佳為1至200個，再佳為1至100個，特佳為1至30個核苷酸發生缺失、取代及/或附加而得之核苷酸序列所構成。
前述核苷酸序列的突變(缺失、取代及/或附加)的導入可藉由Kunkel法或Gapped duplex法等該技術領域中公知的手法或以此為準之方法來施行，例如可利用部位特異性突變誘發法之變異導入用套組(例如Mutant-K (Takara Bio公司製)或Mutant-G(Takara Bio公司製)、Takara Bio公司的LA PCR in vitro Mutagenesis系列套組等。此種突變多核苷酸亦可使用作為本發明之啟動子。
本發明之啟動子所具有之外來基因表現亢進活性能夠以螢火蟲螢光素酶等報導基因所編碼出之蛋白質的活性或饋料批次培養中之抗體生產量作為指標予以檢定。 在包含本發明之啟動子之載體的報導基因所編碼出之蛋白質的活性(例如螢火蟲螢光素酶發光量)相較於對照載體的報導基因所編碼出之蛋白質的活性(例如海腎螢光素酶發光量)而言顯示出1倍以上，較佳為20倍以上，更佳為30倍以上，再佳為40倍以上，再更佳為45倍以上，特佳為50倍以上的活性之情況，可判斷該啟動子具有外來基因表現亢進活性。 將使用人類EF1α啟動子之情況與使用本發明之啟動子之情況進行比較，在饋料批次培養中之抗體生產量為同等以上，較佳為上升至1.2倍以上，更佳為1.3倍以上，再佳為1.5倍以上，特佳為1.8倍、1.9倍或2.0倍以上之情況，可判斷該啟動子具有外來基因表現亢進活性。藉由1.2倍左右以上的亢進，亦可期待減低細胞的培養規模、縮短培養時間及精製步驟，作為結果而言能夠提升產量及減低培養成本。若產量提升，便能夠穩定地供給作為醫藥之外來蛋白質。此外，若培養成本減低，作為醫藥之外來蛋白質的原價便減低。
2. 外來基因表現單元 本發明之外來基因表現單元(以下，有時亦稱為「本發明之基因表現單元」)在轉錄的讀框的方向至少具有前述1.所記載之本發明之啟動子、外來基因及轉錄終止子區域(poly A加成訊號)。 此外，poly A加成序列只要是具有對從啟動子起之轉錄引起轉錄終結之活性之序列即可，可為與啟動子的基因相同或不同的基因。
3. 使用於使外來基因的表現亢進之DNA分子 藉由將DNA分子組合使用於前述2.所記載之本發明之基因表現單元，便可進一步使外來基因的表現亢進。所組合使用之DNA分子能夠以與乙醯化組蛋白H3之相互作用作為指標而取得。一般而言，組蛋白(H3、H4)的乙醯化據說參與轉錄的活化，主要被認為有2種學說。涉及到因組蛋白尾部發生乙醯化而在電荷上進行中和，DNA與組蛋白之結合鬆緩之核小體的立體結構變化之學說(Mellor J. (2006) Dynamic nucleosomes and gene transcription. Trends Genet. 22(6):320-329)，以及涉及到各式各樣的轉錄因子的募集(recruit)之學說(Nakatani Y. (2001) Histone acetylases-versatile players. Genes Cells. 6(2):79-86)。在任何學說中，組蛋白的乙醯化參與轉錄活化之可能性均高，藉由使用抗乙醯化組蛋白H3抗體之染色質免疫沉澱(Chromatin Immunoprecipitation；ChIP)，便能夠將與乙醯化組蛋白H3進行相互作用之DNA分子進行濃縮。
作為與本發明之啟動子組合使用之使用於使外來基因的表現亢進之DNA分子，可列舉A2、A7及A18。DNA分子較佳為A7。 A2位於人類第15號染色體80966429～80974878，其係AT含量62.2%，8450bp的多核苷酸。A2的核苷酸序列係記載於序列表的序列編號5。 A7位於人類第11號染色體88992123～89000542，其係AT含量64.52%，8420bp的多核苷酸。A7的核苷酸序列係記載於序列表的序列編號6。 A18位於人類第4號染色體111275976～111284450，其係AT含量62.54%，8475bp的多核苷酸。A18的核苷酸序列係記載於序列表的序列編號7。
與本發明之啟動子組合使用之DNA分子所具有之外來基因表現亢進活性能夠以分泌型鹼性磷酸酶(SEAP)等報導基因所編碼出之蛋白質的活性作為指標予以檢定。
在與本發明之啟動子組合使用之情況，可單獨使用前述DNA分子中之任1種，亦可使用2拷貝以上DNA分子中之1種。或者，亦可組合使用2種以上DNA分子。
本發明中所使用之DNA分子亦可為由對序列編號5至7中之任一核苷酸序列具有80%以上，較佳為85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上，更佳為90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上，再佳為95%以上、96%以上、97%以上、98%以上，最佳為99%以上、100%的序列同一性之核苷酸序列所構成，且具有外來基因表現亢進活性之核苷酸序列。
本發明中所使用之DNA分子亦可為屬於突變多核苷酸且具有外來基因表現亢進活性之多核苷酸，該突變多核苷酸係由在序列編號5至7中之任一核苷酸序列中，1個或複數，較佳為1至1000個或1至500個，更佳為1至100個或1至50個，再佳為1至10個或1至5個，特佳為4個、3個、2個或1個核苷酸發生缺失、取代及/或附加而得之核苷酸序列所構成。
前述多核苷酸的突變(缺失、取代及/或附加)的導入可藉由Kunkel法或Gapped duplex法等該技術領域中公知的手法或以此為準之方法來施行，可利用例如利用部位特異性突變誘發法之變異導入用套組(例如Mutant-K (Takara Bio公司製)或Mutant-G(Takara Bio公司製)、Takara Bio公司的LA PCR in vitro Mutagenesis系列套組等。此種變異多核苷酸亦可使用作為本發明之DNA分子。
本發明中所使用之DNA分子可使用由序列編號5至7中之任一者所記載之多核苷酸序列中之至少3000個或至少2000個連續的核苷酸所構成之部分序列。作為此種部分序列，亦可為例如國際公報第2012/005378號所記載者，作為A2的部分序列，可列舉例如A2-1至A2-17，作為A7的部分序列，可列舉例如A7-1至A7-18，作為A18的部分序列，可列舉例如A18-1至A18-4。
在本發明中，可單獨使用前述DNA分子的部分序列中之任1種，亦可使用2拷貝以上部分片段中之1種。或者，亦可組合使用2種以上部分片段。此外，亦可組合使用各DNA分子的全長序列與部分序列。在該組合中，部分序列可源自構成組合之全長序列的DNA分子，亦可源自不同的全長序列的DNA分子。
4. 多核苷酸的取得 在本發明中，包含編碼出後述成為產生亢進的對象之外來蛋白質之外來基因之多核苷酸可藉由以下所示之一般方法取得。例如，可藉由使用基於該基因片段所合成之DNA探針，對源自於外來基因會進行表現之細胞或組織之cDNA庫進行篩選而加以單離。mRNA的調製可藉由該技術領域中通常使用之手法來施行。例如，將前述細胞或組織以胍試劑、酚試劑等進行處理而獲得全RNA，然後，藉由使用寡(dT)纖維素管柱或以Sepharose 2B作為擔體之多U-Sepharose等之親和管柱法，或者藉由批次法，獲得poly (A)+RNA(mRNA)。再者，亦可藉由蔗糖密度梯度離心法等進一步區分poly(A)+RNA。接著，以所獲得之mRNA作為模板，使用寡dT引子及反轉錄酵素來合成單股cDNA，使用DNA合成酵素I、DNA連接酶及RNaseH等自該單股cDNA合成雙股cDNA。將所合成之雙股cDNA藉由T4DNA合成酵素加以平滑化後，歷經轉接子(例如EcoRI轉接子)的連結、磷酸化等，組入λgt11等之λ噬菌體中並進行活體內( in vivo)包裝，藉此製作cDNA庫。此外，除了λ噬菌體以外，亦可使用質體載體來製作cDNA庫。然後，從cDNA庫中選擇具有目標DNA之株(陽性殖株)即可。
此外，在從基因體DNA中單離出用於產生蛋白質之包含前述啟動子、終止子區域之多核苷酸、包含前述DNA分子或外來基因之多核苷酸之情況，係依照一般手法(Molecular Cloning(1989)、Methods in Enzymology 194(1991))，藉由從成為採取源之生物的細胞株中抽出基因體DNA並對多核苷酸進行分選而施行。基因體DNA的抽出可依照例如Cryer等人的方法(Methods in Cell Biology, 12, 39-44(1975))及P. Philippsen等人的方法(Methods Enzymol., 194, 169-182 (1991))來施行。
包含目標啟動子、DNA分子或外來基因之多核苷酸的取得亦可藉由例如PCR法(PCR Technology. Henry A. Erlich, Atockton press (1989))來施行。在使用PCR法之多核苷酸的增幅中，係使用20～30mer的合成單股DNA作為引子，並使用基因體DNA作為模板。所增幅而得之基因係在確認多核苷酸序列後加以使用。作為PCR的模板，能夠使用細菌人工染色體(BAC)等基因體DNA庫。
另一方面，包含序列未知的外來基因之多核苷酸的取得可藉由下列方式來施行：(a)依常法製作基因庫，(b)從所製作而得之基因庫中選擇所期望的多核苷酸，將該多核苷酸進行增幅。基因庫可藉由下列方式予以調製：將依常法從成為採取源之生物的細胞株中所獲得之染色體DNA藉由適當的限制酵素進行部分消化而加以片段化，將所獲得之片段連結至適當的載體，並將該載體導入適當的宿主中。此外，亦可藉由下列方式予以調製：從細胞中抽出mRNA，自此合成cDNA後，連結至適當的載體，並將該載體導入適當的宿主中。作為此時所使用之載體，通常可使用已知為公知的基因庫調製用載體之質體，亦可廣泛地使用噬菌體載體或黏質體等。施行轉形或轉導之宿主只要使用因應前述載體的種類者即可。包含外來基因之多核苷酸的選擇係從前述基因庫中，藉由使用包含外來基因所特有之序列之標識探針之菌落雜交法、溶菌斑雜交法等來施行。
此外，亦可將包含外來基因之多核苷酸化學性地全合成。可藉由例如下列方法合成基因：製作互補的2對寡核苷酸，並使此等進行黏合之方法；或藉由DNA連接酶將數條經黏合之DNA進行連結之方法；或製作一部分互補的數條寡核苷酸，並藉由PCR填補空缺之方法等。
多核苷酸序列的決定可藉由通常的方法，例如雙去氧法(Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463-5467 (1977))等來施行。再者，前述多核苷酸序列的決定亦可藉由使用市售的定序套組等而輕易地施行。
5. 外來基因表現載體 作為本發明之外來基因表現載體，係提供包含前述2.所記載之外來基因表現單元之載體，該外來基因表現單元包含前述1.所記載之啟動子。本發明之外來基因表現載體亦可包含前述3.所記載之DNA分子中之1種、2個以上拷貝數的DNA分子中之1種、DNA分子中之2種以上之組合。藉由前述外來基因表現載體使外來基因在宿主細胞內進行表現時，可將DNA分子配置於緊接在基因表現單元之前或之後，或者亦可配置於遠離基因表現單元之位置。此外，亦可使用包含複數個DNA分子之1個外來基因表現載體。另外，DNA分子的方向相對於基因表現單元而言可為順向或逆向中之任一者。
作為外來基因，並無特別限定，可列舉分泌型鹼性磷酸酶(SEAP)、綠色螢光蛋白質(GFP)、螢光素酶等之報導基因、α-澱粉酶基因、α-半乳糖苷酶基因等之各種酵素基因、屬於醫藥上有用的生理活性蛋白質之干擾素α、干擾素γ等之各種干擾素基因、IL1、IL2等之各種介白素基因、紅血球生成素(EPO)基因、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)基因等之各種細胞介素基因、生長因子基因或編碼出多聚體蛋白質之基因，例如編碼出屬於抗體或其抗原結合性片段之異源多聚體之基因等。此等基因可藉由任何手法獲得。
所謂「抗體的抗原結合性片段」，係意味具有與抗原之結合活性之抗體的部分片段，包含Fab、F(ab’) 2、Fv、scFv、雙價抗體(diabody)、線狀抗體及由抗體片段所形成之多特異性抗體等。此外，屬於將F(ab’) 2在還原條件下進行處理而得之抗體的可變區的一價片段之Fab’亦包含在抗體的抗原結合性片段中。惟，在具有與抗原之結合能力之前提下，並不限定於此等分子。此外，在此等抗原結合性片段中，不僅包含將抗體蛋白質的全長分子以適當的酵素進行處理而得者，亦包含使用經基因工程突變之抗體基因在適當的宿主細胞中所產生之蛋白質。
此外，在本發明之外來基因表現載體中，可包含用於挑選轉形體之選擇標記。藉由使用例如對淺藍菌素(cerulenin)、金擔子素(aureobasidin)、吉歐黴素(zeocin)、刀豆胺酸(canavanine)、環己醯亞胺、潮黴素(hygromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、殺稻瘟菌素(blasticidin)、四環黴素(tetracycline)、卡納黴素(kanamycin)、胺苄青黴素(ampicillin)、新黴素(neomycin)等之藥劑賦予耐性之藥劑耐性標記等，便能夠施行轉形體的挑選。此外，藉由將賦予對乙醇等之溶劑耐性、對甘油或鹽等之滲透壓耐性、銅等金屬離子耐性等之基因當作標記，亦能夠施行轉形體的挑選。
本發明之外來基因表現載體亦可為並未組入染色體DNA中之載體。一般而言，外來基因表現載體被基因導入宿主細胞中後，會隨機地組入染色體中，但藉由使用源自猿猴病毒(simian virus 40(SV40))、乳突病毒(papillomavirus(BPV、HPV))、EBV等哺乳動物病毒之構成成分，便可在所導入之宿主細胞中使用作為能夠自行複製之游離型載體(episomal vector)。例如，具有源自SV40之複製起點及編碼出屬於異側作用因子(trans-acting factor)之SV40大型T抗原之序列之載體或具有源自EBV之oriP及編碼出EBNA-1之序列之載體等已被廣泛地使用。DNA分子的效果係無論載體的種類或有無組入至染色體，皆能夠顯示出外來基因表現亢進活性。
6. 轉形細胞 本發明之轉形細胞為使用前述5.之外來基因表現載體進行導入而得之轉形細胞。 作為所轉形之宿主細胞，係真核細胞，較佳為哺乳動物細胞，更佳為源自人類、小鼠、大鼠、倉鼠、猴或牛之細胞。作為哺乳動物細胞，可列舉COS-1細胞、293細胞、CHO細胞(例如CHO-K1、CHO-O1、CHO DG44、CHO dhfr-、CHO-S等)等，但並不限定於此等。 在本發明中，作為向宿主細胞導入表現載體之方法，只要是可使導入基因在宿主內安定地存在且適宜表現之方法，則任何方法皆可，可列舉一般所使用之方法，例如磷酸鈣法(Ito et al., (1984) Agric. Biol. Chem., 48, 341)、電穿孔法(Becker, D.M. et al. (1990) Methods. Enzymol., 194, 182-187)、原生質球法(Creggh et al., Mol. Cell. Biol., 5, 3376 (1985))、醋酸鋰法(Itoh, H. (1983) J. Bacteriol. 153, 163-168)、脂轉染法等。 在本發明之轉形細胞中，外來基因可瞬時地表現，亦可穩定(stable)地表現，較佳係在穩定表現系統中進行表現。 所謂穩定表現系統，係藉由磷酸鈣法、電穿孔法、脂轉染法等使表現載體組入染色體中並進行表現之方法。導入基因被維持於染色體上，能夠長期維持導入基因的表現長達數週以上。此外，只要施行向質體導入選擇標記，即能夠進行藥劑篩選，可有效率地選出導入基因被維持於染色體上之細胞。
7. 外來蛋白質的製造方法 本發明之外來蛋白質的製造可藉由將前述6.的項目所記載之轉形細胞以公知的方法進行培養，從該培養物中採取並進行精製而施行。所謂「培養物」，係意味培養上清液，除此以外，培養細胞或細胞的破碎物中之任何者。另外，作為可使用6.的項目所記載之轉形細胞來產生之外來蛋白質，不僅能夠選擇單體蛋白質，亦能夠選擇多聚體蛋白質。在施行由不同的複數個次單元所構成之異源多聚體蛋白質的生產之情況，需要將編碼出此等次單元之複數個基因各自導入6.的項目所記載之宿主細胞中。 轉形細胞的培養可依照用於培養該宿主細胞之通常的方法來施行。 在轉形細胞為哺乳動物細胞之情況，可例如在37℃、5%或8%CO 2條件下進行培養，培養時間為24～1000小時左右，培養可藉由靜置、振盪、攪拌、通氣下之批式培養、饋料批次培養、灌流培養或連續培養等來實施。培養較佳為饋料批次培養。作為將轉形細胞進行饋料批次培養之時間，只要是3日以上且20日以下即可，更佳為5日以上且18日以下，特佳為6日以上且15日以下。 從前述培養物(培養液)中確認外來蛋白質基因的表現產物可藉由SDS-PAGE、Western解析、ELISA等來施行。
8. 抗體蛋白質的製造方法 作為使用前述7.的項目所記載之製造方法所製造之異源多聚體蛋白質，可列舉抗體蛋白質。抗體蛋白質為由2分子的重鏈多肽及2分子的輕鏈多肽所構成之4聚體蛋白質。從而，為了在維持抗原結合能力之形態下取得抗體蛋白質，需要在前述6.的項目所記載之轉形細胞中導入重鏈及輕鏈的基因兩者。在此情況，重鏈及輕鏈的基因表現單元可存在於相同的表現載體上，或者，亦可存在於不同的表現載體上。在存在於相同的表現載體上之情況，從基因的讀取方向而言，可依輕鏈的基因表現單元、重鏈的基因表現單元的順序存在，較佳係依DNA分子、輕鏈的基因表現單元、重鏈的基因表現單元的順序存在。再者，更佳係在DNA分子、輕鏈的基因表現單元、重鏈的基因表現單元之後，包含選擇標記。 作為本發明中所製造之抗體，可列舉以所期望的抗原對兔、小鼠、大鼠等實驗動物進行免疫所製作而得之抗體。此外，以前述抗體作為原料之嵌合抗體及人源化抗體亦可列舉為本發明中所製造之抗體。再者，針對藉由基因改變動物或噬菌體呈現法所取得之人類抗體，亦為本發明中所製造之抗體。 作為用於製造抗體之抗體基因，在自該抗體基因所轉錄/轉譯出之重鏈多肽及輕鏈多肽之組合保持與任意的抗原蛋白質進行結合之活性之前提下，並不限定於持有特定的多核苷酸序列之抗體基因。 此外，作為抗體基因，未必需要編碼出抗體的全長分子，可使用編碼出抗體的抗原結合性片段之基因。編碼出此等抗原結合性片段之基因可藉由基因工程突變編碼出抗體蛋白質的全長分子之基因而取得。
9. 其他外來蛋白質的製造方法 作為成為本發明的製造方法的對象之外來蛋白質，除了前述抗體以外，尚可列舉源自人類或非人類動物之各種蛋白質、其抗原結合性片段、其改造體等。作為該種蛋白質等，可列舉心房性鈉利尿肽(ANP)、腦性鈉利尿肽(BNP)、C型鈉利尿肽(CNP)、升壓素、體抑素、生長激素(GH)、胰島素、催產素、飢餓素、瘦素、脂聯素、腎素、降鈣素、骨保護素、胰島素樣生長因子(IGF)等胜肽激素、介白素、趨化介素、干擾素、腫瘍壞死因子(TNFα/β還有TNF超家族等)、神經生長因子(NGF)、細胞增殖因子(EGF、FGF、PDGF、HGF、TGF等)、造血因子(CSF、G-CSF、紅血球生成素等)、脂肪細胞素(adipokine)等細胞介素、TNF受體等受體、溶菌酶、蛋白酶、蛋白質酶、肽酶等酵素、其機能性片段(保持一部分或全部的原本的蛋白質的生物活性之片段)、包含該等蛋白質所構成之融合蛋白質等，但並不限定於該等。 [實施例]
以下，藉由實施例來具體地說明本發明。惟，此等實施例完全不限定本發明的技術範圍。本發明的實施例中所使用之質體、限制酵素、DNA修飾酵素等為市售者，可依照常法來使用。此外，針對用於DNA的選殖、多核苷酸序列的決定、宿主細胞的轉形、轉形細胞的培養、蛋白質從所獲得之培養物中之採取、精製等之操作，亦屬熟習該項技術者所熟知，或者可藉由文獻得知。
(實施例1)Eno1基因的啟動子區域的選殖 作為Eno1的啟動子區域，以在GenBank中以 XM_027398299.1進行登錄之mRNA的序列及以NC_048595.1進行登錄之中國倉鼠基因體的支架序列作為參考，使用Eno1基因的起始密碼子序列的上游約3.0kbp的核苷酸起至緊接在對應於起始密碼子序列之核苷酸序列之前之核苷酸為止之序列。
Eno1基因的啟動子區域係以CHO細胞的基因體DNA作為模板，以使用以下所示之引子組及PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara Bio)之PCR進行增幅，以QIAquick PCR Purification kit(QIAGEN)進行精製。將所選殖而得之中國倉鼠Eno1基因的啟動子區域的核苷酸序列示於序列表的序列編號1。
Eno1基因啟動子的引子組 K24(Fw)： TTCGCGGCCGCGGCACGCAGCGCGCAGG(序列編號8) K25(Rev)： TTCACTAGTTGTCTGTAGGGGAAAAAAAAAAAAC(序列編號9)
(實施例2)以抗體表現量作為指標之經由源自中國倉鼠之Eno1基因啟動子的饋料批次培養之評價 (2-1)抗體表現載體的構築 關於抗體表現載體，係將相當於專利文獻4所記載之人源化抗體基因Y表現載體pDSLH3.1-Hspa5-Y的Hspa5基因啟動子之核苷酸序列使用在實施例1中進行增幅、精製而得之DNA片段取代為源自中國倉鼠之Eno1基因啟動子的核苷酸序列，藉此構築pDSLH3.1-Eno1-Y。將載體的概略圖示於圖1。作為比較對象之pDSLH3.1-hEF1α-Y係使用專利文獻4所記載者。
(2-2)人源化抗體Y表現穩定庫的製作 以能夠在無血清培養基中浮游培養之方式馴化CHO-K1細胞(ATCC)，獲得宿主細胞CHO-O1細胞。使用基因導入裝置Neon Transfection System(Invitrogen)將(2-1)中所構築而得之抗體表現載體pDSLH3.1-Eno1-Y或專利文獻4所記載之pDSLH3.1-hEF1α-Y基因導入CHO-O1細胞中，在T-25燒瓶中於5%CO 2、37℃進行培養。在基因導入的1日後，以終濃度800μg/mL添加Geneticin(Life Technologies Corporation)，施行1週藥劑選擇培養。然後，在125mL容量的三角燒瓶中於5%CO 2、37℃進行培養，製作人源化抗體Y表現穩定庫(針對各載體有2個庫)。
(2-3)經由人源化抗體Y表現穩定庫的饋料批次培養之抗體生產量評價 使用(2-2)中所製作而得之人源化抗體Y表現穩定庫，在125mL容量的三角燒瓶中施行14日的饋料批次培養。培養條件係設為初期接種密度0.3×10 6個細胞/mL、培養液量30mL，使用G13(富士Film和光純藥公司製定制培養基)當作基礎培養基，使用F13(富士Film和光純藥公司製定制培養基)當作饋料培養基。饋料培養基係從培養第3日起，每日添加初期培養液量的3%(v/v)直至第13日為止。在第7日、第10日、第14日施行取樣，測定活細胞密度、抗體生產量等。
將活細胞數、抗體生產量的推移分別示於圖2-A、圖2-B。算出針對各載體所製作而得之2個庫的抗體生產量的平均值，將抗體生產性進行比較而得之結果，培養第14日的藉由Eno1啟動子所得之抗體生產量達到人類EF1α啟動子的2.0倍之值，大幅提高藉由目前所頻繁使用之啟動子所得之抗體生產量。
(實施例3)以瞬時表現下之螢光素酶發光量作為指標之源自中國倉鼠之Eno1基因啟動子長的檢討 (3-1)螢光素酶表現載體的構築 將各鏈長的Eno1啟動子插入pGL4.10(Promega公司製)中而構築源自螢火蟲(Firefly)之螢光素酶表現載體。所檢討之鏈長係設為緊接在對應於Eno1基因的起始密碼子序列之核苷酸序列之前之核苷酸起至上游約5.0kbp為止(序列編號10)、同樣約4.5kbp為止(序列編號11)、同樣約4.0kbp為止(序列編號4)、同樣約3.5kbp為止(序列編號12)、同樣約3.0kbp為止(序列編號1)、同樣約2.8kbp為止(序列編號3)、同樣約2.7kbp為止(序列編號13)、同樣約2.6kbp為止(序列編號14)、同樣約2.5kbp為止(序列編號15)。
(3-2)瞬時表現下之螢光素酶發光量評價 使用Lipofectamin2000 CD(Thermo Fisher Scientific公司製)將(3-1)中所構築而得之源自螢火蟲(Firefly)之螢光素酶表現載體與表現源自海腎(Renilla)之螢光素酶之對照載體pGL4.74同時地基因導入CHO-O1細胞中。基因導入後，在24小時後將細胞進行離心分離(1000rpm，3分鐘)並回收至1.5mL管中，以PBS緩衝液洗淨。然後，使用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega公司製)測定螢光素酶發光量。另外，對於各啟動子長，以N=2實施基因導入。
以pGL4.10上之源自螢火蟲之螢光素酶的發光量除以pGL4.74上之源自海腎之螢光素酶的發光量而得之值作為啟動子活性(圖3)。此外，將由以N＝2所獲得之啟動子活性所算出之平均值示於表1。結果，在使用緊接在對應於源自中國倉鼠之Eno1基因的起始密碼子序列之核苷酸序列之前之核苷酸起至起始密碼子序列的上游約5.0kbp為止(序列編號10)、同樣約4.5kbp為止(序列編號11)、同樣約4.0kbp為止(序列編號4)、同樣約3.5kbp為止(序列編號12)的區域之情況，獲得使用同樣約3.0kbp為止(序列編號1)的區域之情況之80%以上的啟動子活性。此外，在使用緊接在對應於起始密碼子序列之核苷酸序列之前之核苷酸起至起始密碼子序列的上游2.8kbp(序列編號3)之情況，獲得與使用同樣約3.0kbp為止(序列編號1)的區域之情況大致同等的啟動子活性。在使用緊接在對應於起始密碼子序列之核苷酸序列之前之核苷酸起至起始密碼子序列的上游約2.7kbp為止(序列編號13)及同樣約2.6kbp為止(序列編號14)的區域之情況，相較於使用同樣約3.0kbp為止(序列編號1)的區域之情況而言，獲得約50%的啟動子活性。此外，在使用緊接在對應於起始密碼子序列之核苷酸序列之前之核苷酸起至起始密碼子序列的上游約2.5kbp為止(序列編號15)的區域之情況，相較於使用同樣約3.0kbp為止(序列編號1)的區域之情況而言，獲得約15%的啟動子活性。由以上，可看出源自中國倉鼠之Eno1基因的啟動子的轉錄活性在緊接在對應於起始密碼子序列之核苷酸序列之前之核苷酸起至起始密碼子序列的上游約2.8kbp以上的長度的區域顯著地較高。 此外，關於啟動子的轉錄活性，在序列編號3(Eno1 2.8k)與序列編號13(Eno1 2.7k)之間，序列編號3(Eno1 2.8k)顯著地較優異。由此，可認為在啟動子具有序列編號18(序列編號3(Eno1 2.8k)與序列編號13(Eno1 2.7k)之差分序列(100bp))之情況，轉錄活性特別提升。
(實施例4)以抗體表現量作為指標之經由源自小鼠之Eno1基因啟動子的饋料批次培養之評價 (4-1)抗體表現載體的構築 構築將人源化抗體基因Y表現載體pDSLH3.1-hEF1α-Y的抗體H鏈及L鏈基因的啟動子取代成小鼠Eno1啟動子而得之pDSLH3.1-mEno1-Y、pDSLH3.1-mEno1-3.5-Y及 pDSLH3.1-mEno1-4.0-Y。使用緊接在對應於Eno1的起始密碼子序列之核苷酸序列之前之核苷酸起至起始密碼子序列的上游約3.0kbp為止的區域(序列編號2)、同樣約3.5kbp為止的區域(序列編號17)或同樣約4.0kbp為止的區域(序列編號16)當作源自小鼠之Eno1基因啟動子。
同樣地，使用源自中國倉鼠之Eno1基因啟動子的緊接在對應於Eno1的起始密碼子序列之核苷酸序列之前之核苷酸起至起始密碼子序列的上游約4.0kbp為止的區域(序列編號4)、同樣約3.5kbp為止的區域(序列編號12)及同樣約2.8kbp為止的區域(序列編號3)作為Eno1基因啟動子而構築pDSLH3.1-Eno1-4.0-Y、pDSLH3.1-Eno1-3.5-Y、pDSLH3.1-Eno1-2.8-Y。
(4-2)人源化抗體Y表現穩定庫的製作 將pDSLH3.1-hEF1α-Y(專利文獻4)、(2-1)中所構築而得之DSLH3.1-Eno1-Y、(4-1)中所構築而得之pDSLH3.1-mEno1-Y、pDSLH3.1-mEno1-3.5-Y、pDSLH3.1-mEno1-4.0-Y、pDSLH3.1-Eno1-2.8-Y、pDSLH3.1-Eno1-3.5-Y及pDSLH3.1-Eno1-4.0-Y以(2-2)所記載之方法轉染至CHO-O1細胞中，施行藥劑選擇培養，製作人源化抗體Y表現穩定庫(針對各載體有2個庫)。
(4-3)經由人源化抗體Y表現穩定庫的饋料批次培養之抗體生產量評價 使用(4-2)中所製作而得之人源化抗體Y表現穩定庫，在125mL容量的三角燒瓶中施行饋料批次培養。使用G13當作基礎培養基，使用F13當作饋料培養基。
將活細胞數、抗體生產量的推移分別示於圖4-A、圖4-B。算出針對各載體所製作而得之2個庫的抗體生產量的平均值，將抗體生產性進行比較而得之結果，關於在培養第14日時點之抗體生產量，藉由源自小鼠之Eno1基因啟動子3.0kbp(mEno1 3k)、3.5kbp(mEno1 3.5k)及4.0kbp(mEno1 4k)，分別達到人類EF1α啟動子(hEF1α)的1.3倍、1.8倍、1.9倍之值，大幅提高藉由目前所廣泛使用之啟動子所得之抗體生產量。得知源自小鼠之Eno1基因啟動子亦具有與源自中國倉鼠之Eno1基因啟動子同等的啟動子能力。 藉由源自中國倉鼠之Eno1基因啟動子2.8kbp(Eno1 2.8k)、3.0kbp(Eno1 3k)、3.5kbp(Eno1 3.5k)及4.0kbp(Eno1 4k)，分別達到人類EF1α啟動子的2.7倍、2.0倍、2.8倍、3.1倍之值(培養第14日時點)，大幅提高藉由目前所廣泛使用之啟動子所得之抗體生產量。 得知在將源自小鼠之Eno1基因啟動子與源自中國倉鼠之Eno1基因啟動子的抗體產生性進行比較之情況，源自中國倉鼠之Eno1基因啟動子較優異。
再者，藉由以下式算出每1個細胞每1日之抗體產生量(Qp)。 Qp＝[第10日的抗體生產量]÷[第10日的積算活細胞密度] (以使用第0、7、10日的活細胞密度所算出之活細胞密度的經時變化的積分值作為「第10日的積算活細胞密度」)
藉由源自中國倉鼠之Eno1基因啟動子2.8kbp (Eno1 2.8k)、3.0kbp(Eno1 3k)、3.5kbp(Eno1 3.5k)及4.0kbp (Eno1 4k)，亦分別達到人類EF1α啟動子的2.7倍、2.3倍、3.0倍、3.1倍。 藉由源自小鼠之Eno1基因啟動子3kbp(mEno1 3k)、3.5kbp(mEno1 3.5k)、4k(mEno1 4k)，亦分別達到人類EF1α啟動子的1.9倍、2.2倍、2.4倍。 在將每1個細胞之抗體產生量(Qp)進行比較之情況，亦得知源自中國倉鼠之Eno1基因啟動子比源自小鼠之Eno1基因啟動子更優異。
(實施例5)以饋料批次培養中之抗體表現量作為指標之源自各生物種之Eno1基因啟動子與A7之組合效果的檢討 (5-1)抗體表現載體的構築 以(2-1)中所構築而得之pDSLH3.1-Eno1-Y、(4-1)中所構築而得之pDSLH3.1-Eno1-3.5-Y、pDSLH3.1-Eno1-2.8-Y 、pDSLH3.1-mEno1-Y、pDSLH3.1-mEno1-3.5-Y、 pDSLH3.1-mEno1-4.0-Y及pDSLH3.1-Eno1-4.0-Y作為親本載體，構築將DNA分子A7(序列編號6)以與專利文獻5同樣的方法插入該等表現匣的上游中而得之抗體表現載體。
(5-2)人源化抗體Y表現穩定庫的製作 將親本載體及抗體表現載體A7以(2-2)所記載之方法轉染至CHO-O1細胞中，施行藥劑選擇培養，製作人源化抗體Y表現穩定庫(針對各載體有2個庫)。
(5-3)經由人源化抗體Y表現穩定庫的饋料批次培養之抗體生產量評價 使用(5-2)中所製作而得之人源化抗體Y表現穩定庫，在125mL容量的三角燒瓶中施行饋料批次培養。使用G13當作基礎培養基，使用F13當作饋料培養基。將活細胞數、抗體生產量的推移分別示於圖5A、圖5B。算出針對各載體所製作而得之2個庫的抗體生產量的平均值，將抗體生產性進行比較。在培養第14日時點之藉由包含A7之抗體表現載體所得之抗體生產量顯示出不含A7之抗體表現載體的1.7～5.4倍之值。因此，得知在組合使用DNA分子A7與源自中國倉鼠或源自小鼠之任何Eno1基因啟動子之情況，亦大幅地提升抗體生產性。 [序列表非關鍵詞文字]
序列編號1：源自中國倉鼠之Eno1基因的啟動子，Eno1基因的起始密碼子的上游約3.0kbp的核苷酸起至緊接在對應於起始密碼子之核苷酸序列之前之核苷酸為止所構成之核苷酸序列 序列編號2：源自小鼠之Eno1基因的啟動子，Eno1基因的起始密碼子的上游約3.0kbp的核苷酸起至緊接在對應於起始密碼子之核苷酸序列之前之核苷酸為止所構成之核苷酸序列 序列編號3：源自中國倉鼠之Eno1基因的啟動子，Eno1基因的起始密碼子的上游約2.8kbp的核苷酸起至緊接在對應於起始密碼子之核苷酸序列之前之核苷酸為止所構成之核苷酸序列 序列編號4：源自中國倉鼠之Eno1基因的啟動子，Eno1基因的起始密碼子的上游約4.0kbp的核苷酸起至緊接在對應於起始密碼子之核苷酸序列之前之核苷酸為止所構成之核苷酸序列 序列編號5：DNA分子A2的核苷酸序列 序列編號6：DNA分子A7的核苷酸序列 序列編號7：DNA分子A18的核苷酸序列 序列編號8：Eno1基因啟動子的引子 K24 序列編號9：Eno1基因啟動子的引子 K25 序列編號10：源自中國倉鼠之Eno1基因的啟動子，Eno1基因的起始密碼子的上游約5.0kbp的核苷酸起至緊接在對應於起始密碼子之核苷酸序列之前之核苷酸為止所構成之核苷酸序列 序列編號11：源自中國倉鼠之Eno1基因的啟動子，Eno1基因的起始密碼子的上游約4.5kbp的核苷酸起至緊接在對應於起始密碼子之核苷酸序列之前之核苷酸為止所構成之核苷酸序列 序列編號12：源自中國倉鼠之Eno1基因的啟動子，Eno1基因的起始密碼子的上游約3.5kbp的核苷酸起至緊接在對應於起始密碼子之核苷酸序列之前之核苷酸為止所構成之核苷酸序列 序列編號13：源自中國倉鼠之Eno1基因的啟動子，Eno1基因的起始密碼子的上游約2.7kbp的核苷酸起至緊接在對應於起始密碼子之核苷酸序列之前之核苷酸為止所構成之核苷酸序列 序列編號14：源自中國倉鼠之Eno1基因的啟動子，Eno1基因的起始密碼子的上游約2.6kbp的核苷酸起至緊接在對應於起始密碼子之核苷酸序列之前之核苷酸為止所構成之核苷酸序列 序列編號15：源自中國倉鼠之Eno1基因的啟動子，Eno1基因的起始密碼子的上游約2.5kbp的核苷酸起至緊接在對應於起始密碼子之核苷酸序列之前之核苷酸為止所構成之核苷酸序列 序列編號16：源自小鼠之Eno1基因的啟動子，Eno1基因的起始密碼子的上游約4.0kbp的核苷酸起至緊接在對應於起始密碼子之核苷酸序列之前之核苷酸為止所構成之核苷酸序列 序列編號17：源自小鼠之Eno1基因的啟動子，Eno1基因的起始密碼子的上游約3.5kbp的核苷酸起至緊接在對應於起始密碼子之核苷酸序列之前之核苷酸為止所構成之核苷酸序列 序列編號18：序列編號3(Eno1 2.8k)與序列編號13(Eno1 2.7k)之差分序列
[圖1]使用源自Eno1基因或人類EF1α基因之啟動子作為抗體H鏈(HC)及L鏈(LC)基因的啟動子之人源化抗體基因Y表現載體pDSLH3.1-Eno1-Y及pDSLH3.1-hEF1α-Y的概略圖。 [圖2-A]在使用人源化抗體Y表現穩定庫之饋料批次培養中，將藉由源自中國倉鼠之Eno1基因啟動子所表現之抗體生產量與人類EF1α基因啟動子進行比較而得之圖。圖2-A係將在各取樣日之活細胞數示於縱軸。hEF1α表示人類EF1α基因啟動子，Eno1表示源自中國倉鼠之Eno1基因啟動子(在圖2-B中亦相同)。 [圖2-B]在使用人源化抗體Y表現穩定庫之饋料批次培養中，將藉由源自中國倉鼠之Eno1基因啟動子所表現之抗體生產量與人類EF1α基因啟動子進行比較而得之圖。圖2-B係將在各取樣日之生產量示於縱軸。 [圖3]將使用源自中國倉鼠之Eno1基因的起始密碼子起上游約5.0kbp至2.5kbp的區域作為啟動子而瞬時表現之螢火蟲螢光素酶表現量在各鏈長下進行比較而得之圖。縱軸表示pGL4.10上之源自螢火蟲(Firefly)之螢光素酶的發光量除以pGL4.74上之源自海腎(Renilla)之螢光素酶的發光量而得之值。圖中，將緊接在對應於源自中國倉鼠之Eno1基因的起始密碼子序列之核苷酸序列之前之核苷酸起至上游約5.0kbp為止(序列編號10)、同樣約4.5kbp為止(序列編號11)、同樣約4.0kbp為止(序列編號4)、同樣約3.5kbp為止(序列編號12)、同樣約3.0kbp為止(序列編號1)、同樣約2.8kbp為止(序列編號3)、同樣約2.7kbp為止(序列編號13)、同樣約2.6kbp為止(序列編號14)、同樣約2.5kbp為止(序列編號15)的各區域分別標註為Eno1 5k、Eno1 4.5k、Eno1 4k、Eno1 3.5k、Eno1 3.0k、Eno1 2.8k、Eno1 2.7k、Eno1 2.6k、Eno1 2.5k。 [圖4-A]在使用源自各生物種之Eno1基因啟動子所製作而得之人源化抗體Y表現穩定庫的饋料批次培養中，將抗體生產量進行比較而得之圖。Eno1、mEno1分別表示源自中國倉鼠之Eno1基因啟動子、源自小鼠之Eno1基因啟動子的結果。圖4-A係將在各取樣日之活細胞數示於縱軸。圖中，將緊接在對應於源自中國倉鼠之Eno1基因的起始密碼子序列之核苷酸序列之前之核苷酸起至上游約4.0kbp為止(序列編號4)、同樣約3.5kbp為止(序列編號12)、同樣約3.0kbp為止(序列編號1)、同樣約2.8kbp為止(序列編號3)的各區域分別標註為Eno1 4k、Eno1 3.5k、Eno1 3k、Eno1 2.8k。將緊接在對應於源自小鼠之Eno1基因的起始密碼子序列之核苷酸序列之前之核苷酸起至上游約4.0kbp為止(序列編號16)、同樣約3.5kbp為止(序列編號17)、同樣約3.0kbp為止(序列編號2)的各區域分別標註為mEno1 4k、mEno1 3.5k、mEno1 3k(在圖4-B中亦相同)。 [圖4-B]在使用源自各生物種之Eno1基因啟動子所製作而得之人源化抗體Y表現穩定庫的饋料批次培養中，將抗體生產量進行比較而得之圖。Eno1、mEno1分別表示源自中國倉鼠之Eno1基因啟動子、源自小鼠之Eno1基因啟動子的結果。圖4-B係將在各取樣日之生產量示於縱軸。 [圖5-A]在組合使用源自各生物種之Eno1基因啟動子與DNA分子A7所製作而得之人源化抗體Y表現穩定庫的饋料批次培養中，將抗體生產量進行比較而得之圖。Eno1、mEno1分別表示源自中國倉鼠之Eno1基因啟動子、源自小鼠之Eno1基因啟動子的結果。圖5-A係將在各取樣日之活細胞數示於縱軸。圖中，各Eno1基因啟動子係與圖4-A同樣地進行標註，在與DNA分子A7進行組合之情況，標註為A7(+)，在無A7之情況，標註為A7(-)(圖5-B亦相同)。 [圖5-B]在組合使用源自各生物種之Eno1基因啟動子與DNA分子A7所製作而得之人源化抗體Y表現穩定庫的饋料批次培養中，將抗體生產量進行比較而得之圖。圖5-B係將在各取樣日之生產量示於縱軸。 [圖6]序列表
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Claims (33)

  1. 一種多核苷酸，其係源自中國倉鼠之基因的啟動子， 該多核苷酸係選自序列編號1、序列編號3、序列編號4、序列編號10、序列編號11、序列編號12、序列編號13及序列編號14，或者 包含與該等序列具有至少85%以上的序列同一性之核苷酸序列或該核苷酸序列的部分序列而成。
  2. 如請求項1之多核苷酸，其係選自序列編號1、序列編號3、序列編號4、序列編號10、序列編號11及序列編號12，或者 包含與該等序列具有至少85%以上的序列同一性之核苷酸序列或該核苷酸序列的部分序列而成。
  3. 如請求項1之多核苷酸，其係由與序列編號1的核苷酸序列具有至少99%以上的序列同一性之核苷酸序列所構成。
  4. 如請求項1之多核苷酸，其係由與序列編號3的核苷酸序列具有至少99%以上的序列同一性之核苷酸序列所構成。
  5. 如請求項1之多核苷酸，其係由與序列編號4的核苷酸序列具有至少99%以上的序列同一性之核苷酸序列所構成。
  6. 如請求項1之多核苷酸，其係由與序列編號10的核苷酸序列具有至少99%以上的序列同一性之核苷酸序列所構成。
  7. 如請求項1之多核苷酸，其係由與序列編號11的核苷酸序列具有至少99%以上的序列同一性之核苷酸序列所構成。
  8. 如請求項1之多核苷酸，其係由與序列編號12的核苷酸序列具有至少99%以上的序列同一性之核苷酸序列所構成。
  9. 如請求項1之多核苷酸，其係由與序列編號13的核苷酸序列具有至少99%以上的序列同一性之核苷酸序列所構成。
  10. 如請求項1之多核苷酸，其係由與序列編號14的核苷酸序列具有至少99%以上的序列同一性之核苷酸序列所構成。
  11. 一種多核苷酸，其係源自小鼠之基因的啟動子， 該多核苷酸係選自序列編號2、序列編號17及序列編號16，或者 包含與該等序列具有至少85%以上的序列同一性之核苷酸序列或該核苷酸序列的部分序列而成。
  12. 如請求項11之多核苷酸，其係由與序列編號2的核苷酸序列具有至少99%以上的序列同一性之核苷酸序列所構成。
  13. 如請求項11之多核苷酸，其係由與序列編號17的核苷酸序列具有至少99%以上的序列同一性之核苷酸序列所構成。
  14. 如請求項11之多核苷酸，其係由與序列編號16的核苷酸序列具有至少99%以上的序列同一性之核苷酸序列所構成。
  15. 一種多核苷酸，其係包含對如請求項1或11之序列編號1、序列編號3、序列編號4、序列編號10、序列編號11、序列編號12、序列編號13、序列編號14、序列編號2、序列編號17或序列編號16的核苷酸序列具有90%以上的序列同一性之核苷酸序列或該核苷酸序列的部分序列而成， 且具有啟動子活性。
  16. 一種多核苷酸，其係包含對如請求項1或11之序列編號1、序列編號3、序列編號4、序列編號10、序列編號11、序列編號12、序列編號13、序列編號14、序列編號2、序列編號17或序列編號16的核苷酸序列具有95%以上的序列同一性之核苷酸序列或該核苷酸序列的部分序列而成， 且具有啟動子活性。
  17. 一種多核苷酸，其係與由與如請求項1或11之序列編號1、序列編號3、序列編號4、序列編號10、序列編號11、序列編號12、序列編號13、序列編號14、序列編號2、序列編號17或序列編號16的核苷酸序列互補的核苷酸序列所構成之多核苷酸在嚴苛的條件下進行雜交之多核苷酸，且具有啟動子活性。
  18. 如請求項17之多核苷酸，其係源自中國倉鼠之基因的啟動子，且包含序列編號18的核苷酸序列或與該序列具有至少85%以上的序列同一性之核苷酸序列而成。
  19. 一種外來基因表現單元，其包含如請求項1至18中任一項之多核苷酸及外來基因。
  20. 如請求項19之外來基因表現單元，其中，外來基因為編碼出蛋白質之基因。
  21. 如請求項20之外來基因表現單元，其中，外來基因為編碼出異源多聚體蛋白質之基因。
  22. 如請求項21之外來基因表現單元，其中，外來基因為編碼出抗體或其抗原結合性片段之基因。
  23. 一種外來基因表現載體，其包含如請求項19至22中任一項之外來基因表現單元。
  24. 一種外來基因表現載體，其包含 如請求項19至22中任一項之外來基因表現單元，及 選自下述(a)～(e)中之任一者以上的多核苷酸； (a)序列編號5的核苷酸序列或其部分序列， (b)序列編號6的核苷酸序列或其部分序列， (c)序列編號7的核苷酸序列或其部分序列， (d)包含對序列編號5、序列編號6或序列編號7的核苷酸序列具有80%以上的序列同一性之核苷酸序列或該核苷酸序列的部分序列而成，且具有外來基因表現亢進活性之多核苷酸， (e)包含對序列編號5、序列編號6或序列編號7的核苷酸序列具有85%以上的序列同一性之核苷酸序列或該核苷酸序列的部分序列而成，且具有外來基因表現亢進活性之多核苷酸。
  25. 一種轉形細胞，其導入有如請求項23或24之外來基因表現載體。
  26. 如請求項25之轉形細胞，其係源自哺乳動物之培養細胞。
  27. 如請求項26之轉形細胞，其係COS-1細胞、293細胞或CHO細胞。
  28. 一種蛋白質的製造方法，其特徵為將如請求項25至27中任一項之轉形細胞進行培養，並從培養物中取得源自外來基因之蛋白質。
  29. 如請求項28之製造方法，其中，源自外來基因之蛋白質為單體蛋白質或多聚體蛋白質。
  30. 如請求項29之製造方法，其中，多聚體蛋白質為異源多聚體蛋白質。
  31. 如請求項30之製造方法，其中，異源多聚體蛋白質為抗體蛋白質。
  32. 一種如請求項1至18中任一項之多核苷酸的用途，其係用於使外來基因在轉形細胞中進行表現。
  33. 一種如請求項23或24之外來基因表現載體的用途，其係用於使外來基因在轉形細胞中進行表現。
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