WO2020032153A1 - Ｈｓｐａ８遺伝子のプロモーター - Google Patents

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WO2020032153A1
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nucleotide sequence
promoter
hspa8
gene
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兼治 増田
祐人 中澤
渡辺　和彦
真初 西尾
武 奥村
浩一 野中
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第一三共株式会社
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    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription

Definitions

  • the present invention relates to a mammalian transformed cell having enhanced transcriptional activity of a foreign protein obtained by using a foreign gene expression vector having an Hspa8 gene promoter, and a method for producing the foreign protein using the same.
  • Examples of a host that produces a proteinaceous drug represented by an antibody drug include microorganisms, yeasts, insects, animal and plant cells, transgenic animals and plants, and the like. Post-translational modifications such as folding and glycosylation are essential for the biological activity and antigenicity of proteinaceous drugs, so microorganisms that cannot perform complex post-translational modifications and plants with significantly different sugar chain structures are unsuitable as hosts. It is. In consideration of safety, it has a sugar chain structure similar to that of humans and can be modified after translation, and in consideration of safety, mammalian cultured cells such as CHO cells (Chinese Hamster Ovarie: ovary of Chinese hamster) Has become.
  • CHO cells Choinese Hamster Ovarie: ovary of Chinese hamster
  • Non-Patent Document 1 When a cultured mammalian cell is used as a host, there are problems such as low growth rate, low productivity, and high cost as compared with microorganisms and the like (Non-Patent Document 1). In addition, since clinical use of proteinaceous drugs requires a large amount of administration, there is a problem worldwide insufficient production capacity. When manufacturing proteinaceous drugs using a mammalian cell culture expression system, production costs are higher than synthetic low-molecular-weight drugs. Increasing the production volume is also an effective method for reducing the manufacturing cost (Non-Patent Documents 2 and 3).
  • CMV promoter virus-derived Human cytomegalovirus / major / immediate / early / promoter
  • Non-Patent Document 7 EF-1 ⁇ which is an elongation ⁇ factor-1 ⁇ alpha
  • a promoter of a heat shock protein A5 (Hspa5 / GRP78) gene which has improved productivity of a foreign protein is known (Patent Document 4).
  • Patent No. 3051411 WO2006 / 123097 WO2013 / 080934 WO2018 / 066492
  • An object of the present invention is to provide a promoter having a high exogenous gene expression enhancing activity in a host cell such as a cultured mammalian cell, and to enhance the production of a foreign protein to be a protein drug by using the promoter.
  • the purpose is to provide a means for causing this to occur.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above problems, and as a result, a polynucleotide of about 2.9 kbp upstream of the initiation codon of the heat shock protein A8 (Hspa8) gene has excellent promoter activity,
  • the present inventors have found that it is possible to significantly improve the productivity of a foreign protein to be expressed in cultured animal cells, and have completed the present invention. That is, the present invention includes the following inventions.
  • a promoter of the Chinese hamster-derived Hspa8 gene comprising a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a partial sequence of the nucleotide sequence.
  • a polynucleotide comprising (2) The polynucleotide according to (1), comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. (3) The polynucleotide according to (1), consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5. (4) The polynucleotide according to (1), comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6. (5) A polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing, which is a promoter of a human-derived Hspa8 gene.
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having 99% or more identity to the nucleotide sequence according to any one of (1) to (7), wherein the polynucleotide has promoter activity.
  • An exogenous gene expression unit comprising the polynucleotide according to any one of (1) to (10).
  • a foreign gene expression vector comprising the foreign gene expression unit according to any one of (11) to (14).
  • the transformed cell according to (17), wherein the cell is a cultured cell derived from a mammal.
  • the transformed cell according to (18), wherein the cultured cell derived from a mammal is a COS-1 cell, a 293 cell, or a CHO cell.
  • a method for producing a protein which comprises culturing the transformed cell according to any one of (17) to (19) and obtaining a protein derived from a foreign gene from the culture.
  • (21) Use of the polynucleotide according to any one of the above (1) to (10) for expressing a foreign gene in a transformed cell.
  • the promoter of the present invention can further enhance the expression of a foreign gene such as a therapeutic protein or an antibody by combining it with a DNA element.
  • Schematic diagram of Y The figure which compared the production amount of the antibody expressed by the Hspa8 gene promoter with the human EF1- ⁇ gene promoter in the fed-batch culture using the stable pool expressing the humanized antibody Y.
  • FIG. 2A shows the number of viable cells on each sampling day.
  • FIG. 2B shows the production amount on each sampling day.
  • FIG. 3A shows the number of living cells on each sampling day.
  • FIG. 3B shows the production amount on each sampling day.
  • FIG. 4A shows the number of viable cells on each sampling day.
  • FIG. 4B shows the production amount on each sampling day.
  • Hspa8 The figure which compared the antibody production amount in the fed-batch culture of the humanized antibody Y expression stable pool produced using the Hspa8 gene promoter derived from each species.
  • Hspa8, hHspa8, mHspa8 and rHspa8 show the results of Hspa8 derived from Chinese hamster, human, mouse and rat, respectively.
  • FIG. 5A shows the number of living cells on each sampling day.
  • Hspa8, hHspa8, mHspa8 and rHspa8 show the results of Hspa8 derived from Chinese hamster, human, mouse and rat, respectively.
  • 5B shows the production amount on each sampling day.
  • Nucleotide sequence of polynucleotide which is promoter of Chinese hamster-derived Hspa8 gene Nucleotide sequence of a polynucleotide that is a promoter of human Hspa8 gene Nucleotide sequence of polynucleotide that is promoter of mouse-derived Hspa8 gene Nucleotide sequence of polynucleotide which is a promoter of rat-derived Hspa8 gene
  • the term “gene” means a portion that is transcribed into mRNA and translated into protein, and includes not only DNA but also its mRNA, cDNA and its RNA.
  • polynucleotide is used in the same meaning as nucleic acid, and also includes DNA, RNA, probe, oligonucleotide, and primer.
  • polypeptide and “protein” are used interchangeably.
  • gene expression means a phenomenon in which a certain gene is transcribed into mRNA and / or a phenomenon in which a protein is translated from the mRNA.
  • the term “foreign gene” means a gene that is artificially introduced into a host cell.
  • foreign protein means a protein encoded by a foreign gene.
  • the term “gene expression unit” means a polynucleotide having at least a promoter region, a foreign gene, and a transcription terminator region (polyA addition signal) in the direction of the reading frame of transcription.
  • promoter refers to a region to which a transcription factor involved in initiation of transcription from DNA to RNA is bound. In this specification, it may be referred to as a “promoter region”. Examples of the promoter include, for example, a polynucleotide from a nucleotide of about 3 kbp upstream of the start codon to a nucleotide immediately before the nucleotide sequence corresponding to the start codon, and may include a 5'UTR and an intron.
  • promoter activity refers to an activity in which a transcription factor binds to a promoter, initiates transcription, and produces a protein encoded by a gene.
  • a protein encoded by a reporter gene such as firefly luciferase Can be tested by using the activity of the as an index.
  • “having promoter activity” means that the human EF-1 ⁇ gene is expressed under the same conditions as in the evaluation of promoter activity using an antibody expression level in fed-batch culture as an index described later (Example 2). This means that the antibody expression level is equal to or higher than that of the promoter.
  • DNA element means a polynucleotide having a foreign gene expression enhancing activity when placed near a gene expression unit or on a foreign gene expression vector containing the gene expression unit.
  • antigen-binding fragment of an antibody refers to a partial fragment of an antibody having an antigen-binding activity, and includes Fab, F (ab ') 2, and the like. It is not limited to these molecules as long as they have binding ability.
  • identity refers to the relationship between two or more nucleotide or amino acid sequences, as known in the art, as determined by comparing the sequences. In the art, “identity” also refers to the sequence between nucleic acid molecules or between polypeptides, as the case may be, as determined by the match between two or more nucleotide sequences or two or more amino acid sequences in a row. Means the degree of relevance. "Identity” is an identity match between a small one of two or more sequences and a gap alignment, if any, addressed by a particular mathematical model or computer program (ie, "algorithm").
  • ClustalW2 European ⁇ Molecular ⁇ Biology ⁇ Laboratory-European ⁇ Bioinformatics ⁇ Institute (EMBL-EBI), but it is limited to those used by those skilled in the art. Not done.
  • hybridize under stringent conditions refers to conditions under which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. For example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and most preferably 99% or more of a nucleotide sequence of a nucleic acid complementary to a nucleic acid is hybridized, and the identity is higher than that. Conditions that do not allow the complementary strand of a nucleic acid having a low nucleotide sequence to hybridize can be mentioned. More specifically, hybridization is performed at 68 ° C.
  • promoter used for enhancing the expression of foreign gene of the present invention is a heat shock protein A8 gene (hereinafter, “Hspa8”). It is a promoter of. There is no particular limitation as long as it is a polynucleotide having an activity as an Hspa8 promoter. Examples of the Hspa8 promoter include polynucleotides from a nucleotide at about 2.9 kbp upstream of a start codon to a nucleotide immediately before a nucleotide sequence corresponding to the start codon. preferable.
  • Hspa8 promoter Although the origin of the Hspa8 promoter is not particularly limited, it may be derived from mammals, and examples thereof include Hspa8 promoters derived from Chinese hamster, human, mouse, rat and the like.
  • the promoter of the present invention is preferably a rodent-derived Hspa8 promoter, more preferably a Chinese hamster, mouse or rat-derived Hspa8 promoter, and still more preferably a mouse or rat-derived Hspa8 promoter.
  • Hspa8 promoter examples of the Chinese hamster-derived Hspa8 promoter include SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and the polynucleotide described in FIG.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is a sequence consisting of a nucleotide of about 2.9 kbp upstream of the initiation codon of Chinese hamster-derived Hspa8 to a nucleotide immediately before the nucleotide sequence corresponding to the initiation codon.
  • nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 2, 3, and 4 are sequences consisting of nucleotides about 2 kbp upstream of the initiation codon of human, mouse and rat-derived Hspa8 to nucleotides immediately before the nucleotide sequence corresponding to the initiation codon, respectively.
  • the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 2, 3, and 4 are also shown in FIGS. 7, 8, and 9, respectively.
  • the Chinese hamster-derived Hspa8 promoter may be a nucleotide sequence consisting of a partial sequence of the sequence set forth in SEQ ID NO: 1, corresponding to a start codon from a nucleotide of about 1.9 and 1.2 kbp upstream of the start codon of Hspa8, respectively.
  • a polynucleotide comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6 of the sequence consisting of the nucleotide immediately before the nucleotide sequence to be described further corresponds to the start codon from nucleotides about 1.1 and 1.0 kbp upstream of the start codon of Hspa8
  • a polynucleotide containing a sequence consisting of the nucleotide immediately before the nucleotide sequence to be described is also exemplified, the polynucleotide described in SEQ ID NO: 6 is preferable.
  • the promoter of the present invention has 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and most preferably 99% or more identity to any one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS: 1 to 6. It may be a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having a promoter activity.
  • the promoter of the present invention comprises, under stringent conditions, a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide consisting of any one nucleotide sequence selected from the group consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 6. It may be a polynucleotide that hybridizes and has promoter activity.
  • the promoter of the present invention may have one or more, preferably 1 to 300, and more preferably 1 to 30 nucleotides in any one nucleotide sequence selected from the group consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 6. It may be a mutant polynucleotide consisting of a nucleotide sequence in which nucleotides have been deleted, substituted, and / or added, and may have a promoter activity.
  • the mutation (deletion, substitution, and / or addition) of the nucleotide sequence can be introduced by a method known in the art, such as the Kunkel method or the Gapped Duplex method, or a method analogous thereto.
  • a method known in the art such as the Kunkel method or the Gapped Duplex method, or a method analogous thereto.
  • Mutant-K manufactured by Takara Bio Inc.
  • Mutant-G manufactured by Takara Bio Inc.
  • LA PCR in vitro Mutogenesis series kit of Takara Bio Inc. can be used.
  • Such a mutant polynucleotide can also be used as the promoter of the present invention.
  • the activity of the promoter of the present invention to enhance the expression of a foreign gene can be assayed using the activity of a protein encoded by a reporter gene such as firefly luciferase or the amount of antibody produced in fed-batch culture as an index.
  • a reporter gene such as firefly luciferase or the amount of antibody produced in fed-batch culture as an index.
  • the amount of antibody production in fed-batch culture was equal to or higher, preferably 1.2 times or higher, more preferably 1.5 times.
  • the enhancement is about 1.2 times or more, reduction of the culture scale of the cells, reduction of the culture time, and reduction of the purification process are expected, and as a result, it is possible to improve the yield and reduce the culture cost. If the yield is improved, it becomes possible to stably supply a foreign protein as a drug. Also, if the culturing cost is reduced, the cost of the foreign protein as a medicine is reduced.
  • the foreign gene expression unit of the present invention may have at least 1. And a promoter, a foreign gene, and a transcription terminator region (poly-A addition signal) according to the present invention.
  • the poly-A additional sequence may be any sequence having an activity of initiating transcription termination from transcription from the promoter, and may be of the same or different gene as the promoter gene.
  • DNA element used for enhancing expression of foreign gene can be further enhanced by using the gene expression unit of the present invention described in (1) and a DNA element in combination.
  • DNA elements used in combination can be obtained using the interaction with acetylated histone H3 as an index. It is generally said that histone (H3, H4) acetylation is involved in the activation of transcription, and two main theories are considered. A theory related to a nucleosome conformational change in which the histone tail is acetylated to neutralize charge and loosen the binding between DNA and histone (Mellor J. (2006) Dynamic nucleosomes and gene transcription. Trends). Genet.
  • DNA A2, A7, and A18 can be mentioned as DNA elements used in combination with the promoter of the present invention and used for enhancing the expression of a foreign gene.
  • A2 is a polynucleotide having a AT content of 62.2% and 8450 bp, which is located on human chromosome 15 at 80966429-80974878.
  • the nucleotide sequence of A2 is described in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing.
  • ⁇ A7 is a polynucleotide having a AT content of 64.52% and 8420 bp, which is located on human chromosome 11 at 88992123 to 89000542.
  • the nucleotide sequence of A7 is described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing.
  • A18 is a polynucleotide having a AT content of 62.54% and 8475 bp, which is located on human chromosome 4 at 1112759776 to 111284450.
  • the nucleotide sequence of A18 is described in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing.
  • the exogenous gene expression-enhancing activity of a DNA element used in combination with the promoter of the present invention can be assayed using the activity of a protein encoded by a reporter gene such as SEAP as an index.
  • any one of the above DNA elements may be used alone, or one or more DNA elements may be used in two or more copies. Alternatively, two or more DNA elements may be used in combination.
  • the DNA element used in the present invention has 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and most preferably 99% or more identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 7 to 9. It may be a nucleotide sequence consisting of a nucleotide sequence and having a foreign gene expression enhancing activity.
  • the homology search of the nucleotide sequence can be performed using, for example, a program such as FASTA or BLAST for the Japan DNA Data Bank (DNA ⁇ Databank ⁇ of ⁇ JAPAN).
  • a mutation (deletion, substitution, and / or addition) of the polynucleotide can be performed by a method known in the art such as the Kunkel method or the Gapped Duplex method, or a method analogous thereto.
  • a method known in the art such as the Kunkel method or the Gapped Duplex method, or a method analogous thereto.
  • Mutant-K manufactured by Takara Bio Inc.
  • Mutant-G manufactured by Takara Bio Inc.
  • LA PCR in vitro Mutogenesis series kit of Takara Bio Inc. can be used.
  • Such a mutant polynucleotide can also be used as the DNA element of the present invention.
  • a polynucleotide containing an exogenous gene encoding an exogenous protein to be described below whose production is to be enhanced can be acquired by the following general method.
  • a cDNA library derived from a cell or tissue in which a foreign gene is expressed can be isolated by screening using a DNA probe synthesized based on the gene fragment.
  • Preparation of mRNA can be performed by a technique commonly used in the art.
  • the cells or tissues are treated with a guanidinin reagent, a phenol reagent or the like to obtain total RNA, and then subjected to an affinity column method using an oligo (dT) cellulose column or poly U-sepharose using Sepharose 2B as a carrier.
  • poly (A) + RNA (mRNA) is obtained by a batch method.
  • poly (A) + RNA may be further fractionated by sucrose density gradient centrifugation or the like.
  • a single-stranded cDNA is synthesized using an oligo dT primer and a reverse transcriptase, and a double-stranded DNA is synthesized from the single-stranded cDNA using Synthesize cDNA.
  • a double-stranded DNA is synthesized from the single-stranded cDNA using Synthesize cDNA.
  • the cDNA library is obtained. Make it.
  • a cDNA library can also be prepared using a plasmid vector other than the ⁇ phage. Then, a strain (positive clone) having the target DNA may be selected from the cDNA library.
  • genomic DNA is extracted from the cell line of the organism to be collected, and polynucleotides are selected. Extraction of genomic DNA can be performed, for example, by the method of Cryer et al. (Methods in Cell Biology, 12, 12, 39-44 (1975)) and P.I. Philippsen et al. (Methods Enzymol., 194, 169-182 (1991)).
  • the polynucleotide containing the promoter, DNA element, or foreign gene of interest can also be obtained, for example, by the PCR method (PCR, Technology, Henry, A. Erlich, Ackton, Press (1989)).
  • PCR PCR, Technology, Henry, A. Erlich, Ackton, Press (1989)
  • genomic DNA is used as a template.
  • the amplified gene is used after confirming the polynucleotide sequence.
  • a genomic DNA library such as a bacterial artificial chromosome (BAC) can be used as a template for PCR.
  • a gene library is prepared by an ordinary method, (b) a desired polynucleotide is selected from the prepared gene library, and the polynucleotide is obtained.
  • Amplification can be performed.
  • a gene library is obtained by partially digesting chromosomal DNA obtained from a cell line of an organism to be collected by an ordinary method with an appropriate restriction enzyme to fragment the fragment, ligating the obtained fragment to an appropriate vector, and It can be prepared by introducing into a suitable host. Alternatively, it can be prepared by extracting mRNA from cells, synthesizing cDNA therefrom, ligating it to an appropriate vector, and introducing the vector into an appropriate host.
  • a plasmid generally known as a known vector for preparing a gene library can be used, and a phage vector or a cosmid can also be widely used.
  • a host for transformation or transduction may be used depending on the type of the vector. Selection of a polynucleotide containing a foreign gene is performed from the gene library by a colony hybridization method, a plaque hybridization method, or the like using a labeled probe containing a sequence specific to the foreign gene.
  • a polynucleotide containing a foreign gene can be chemically totally synthesized.
  • a method of producing a pair of complementary oligonucleotides and annealing them, a method of ligating several annealed DNAs with DNA ligase, or a method of producing several partially complementary oligonucleotides and performing PCR Genes can be synthesized by methods such as filling gaps.
  • Polynucleotide sequence can be determined by a conventional method such as the dideoxy method (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463-5467 (1977)). Further, the polynucleotide sequence can be easily determined by using a commercially available sequence kit or the like.
  • the foreign gene expression vector of the present invention includes the aforementioned 1. 2. The promoter containing the promoter described in 2. above. And a vector comprising the foreign gene expression unit described in (1).
  • the foreign gene expression vector of the present invention is the same as described in 3. above. Or the combination of two or more of the DNA elements may be included.
  • the DNA element When expressing a foreign gene in a host cell using the above-described foreign gene expression vector, the DNA element may be placed immediately before or immediately after the gene expression unit, or may be placed at a position away from the gene expression unit. good. Further, one foreign gene expression vector containing a plurality of DNA elements may be used. The direction of the DNA element may be either forward or backward with respect to the gene expression unit.
  • the foreign gene is not particularly limited, but includes reporter genes such as secreted alkaline phosphatase (SEAP), green fluorescent protein (GFP) and luciferase; various enzyme genes such as ⁇ -amylase gene and ⁇ -galactosidase gene; Various bioactive proteins such as interferon ⁇ and interferon ⁇ ; various interleukin genes such as IL1 and IL2; erythropoietin (EPO) gene; various cytokine genes such as granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) gene; Examples of the gene include a gene encoding a growth factor gene or a multimeric protein, such as a gene encoding a heteromultimer that is an antibody or an antigen-binding fragment thereof. These genes may be obtained by any technique.
  • SEAP secreted alkaline phosphatase
  • GFP green fluorescent protein
  • luciferase various enzyme genes such as ⁇ -amylase gene and ⁇ -galactosidas
  • the “antigen-binding fragment of an antibody” refers to a partial fragment of an antibody having an antigen-binding activity, and includes Fab, F (ab ′) 2 , Fv, scFv, diabody, linear antibody, and antibody fragment. And multispecific antibodies formed therefrom.
  • Fab ' which is a monovalent fragment of the variable region of an antibody obtained by treating F (ab') 2 under reducing conditions, is also included in the antigen-binding fragment of the antibody. However, it is not limited to these molecules as long as it has an antigen binding ability.
  • These antigen-binding fragments include not only those obtained by treating the full-length molecule of an antibody protein with an appropriate enzyme, but also those produced in an appropriate host cell using an antibody gene modified by genetic engineering. included.
  • the exogenous gene expression vector of the present invention may contain a selection marker for selecting a transformant.
  • a selection marker for selecting a transformant for example, cerulenin, aureobasidin, zeocin, canavanine, cycloheximide, hygromycin, puromycin, blasticidin, tetracycline, kanamycin, ampicillin, by using a drug resistance marker or the like that imparts resistance to drugs such as neomycin, Transformants can be selected.
  • the foreign gene expression vector of the present invention may be a vector that is not integrated into chromosomal DNA.
  • a foreign gene expression vector is randomly integrated into a chromosome after gene introduction into a host cell, but components derived from a mammalian virus such as simian virus 40 (SV40), papillomavirus (BPV, HPV), and EBV.
  • SV40 simian virus 40
  • BPV papillomavirus
  • EBV papillomavirus
  • a vector having an SV40-derived replication origin and a sequence encoding SV40 large T antigen, which is a trans-acting factor and a vector having a sequence encoding EBV-derived oriP and EBNA-1 are widely used.
  • EBV-derived oriP and EBNA-1 are widely used.
  • Transformed cell The transformed cell of the present invention may be any one of the aforementioned 5. Transformed cells introduced using the exogenous gene expression vector.
  • the host cell to be transformed is a eukaryotic cell, preferably a mammalian cell, more preferably a cell derived from human, mouse, rat, hamster, monkey, or cow.
  • mammalian cells include, but are not limited to, COS-1 cells, 293 cells, CHO cells (CHO-K1, CHO-O1, CHO DG44, CHO dhfr-, CHO-S) and the like.
  • any method may be used as long as the introduced gene is stably present in the host and can be appropriately expressed, and is generally used.
  • Methods such as the calcium phosphate method (Ito et al., (1984) Agric. Biol. Chem., 48, 341), the electroporation method (Becker, ⁇ DM ⁇ et al. (1990) Methods. Enzymol., 194, 182-187), the spheroplast method (Creggh et al., Mol. Cell. Biol., 5, 3376 (1985)), the lithium acetate method (Itoh, H. (1983) J. Bacteriol. 153, 163). -168), Lipo Ekushon method, or the like can be mentioned.
  • the method for producing a foreign protein of the present invention is described in 6. above. Can be carried out by culturing the transformed cells described in the item 3) by a known method, collecting from the culture, and purifying.
  • the term “culture” refers to any of cultured cells or crushed cells in addition to the culture supernatant.
  • a foreign protein that can be produced using the transformed cell described in the item not only a monomeric protein but also a multimeric protein can be selected. When a heteromultimeric protein composed of a plurality of different subunits is to be produced, a plurality of genes encoding these subunits are each transferred to 6. Need to be introduced into the host cell described in the item.
  • the method of culturing the transformed cell can be performed according to a usual method used for culturing the host cell.
  • the cells are cultured, for example, at 37 ° C., 5% or 8% CO 2 , and the culturing time is about 24 to 1000 hours.
  • the culture is allowed to stand, shake, stir, aerate. It can be carried out by batch culture, fed-batch culture, perfusion culture, continuous culture or the like below.
  • ⁇ ⁇ Confirmation of the expression product of the foreign protein gene from the culture (culture solution) can be performed by SDS-PAGE, Western analysis, ELISA or the like.
  • Examples of the heteromultimeric protein produced by using the production method described in the item 3) include an antibody protein.
  • Antibody proteins are tetrameric proteins consisting of two heavy chain polypeptides and two light chain polypeptides. Therefore, in order to obtain an antibody protein in a form maintaining the antigen-binding ability, the above-mentioned 6. It is necessary that both the heavy chain and the light chain genes have been introduced into the transformed cell described in the item. In this case, the heavy chain and light chain gene expression units may be present on the same expression vector, or may be present on different expression vectors.
  • an antibody produced in the present invention an antibody produced by immunizing a laboratory animal such as a rabbit, a mouse or a rat with a desired antigen can be mentioned.
  • chimeric antibodies and humanized antibodies using the above-mentioned antibodies as raw materials can also be mentioned as antibodies produced in the present invention.
  • a human antibody obtained by a genetically modified animal or a phage display method is also an antibody produced in the present invention.
  • a specific polynucleotide It is not limited to an antibody gene having a sequence.
  • the antibody gene it is not necessary to encode the full-length molecule of the antibody, and a gene encoding an antigen-binding fragment of the antibody can be used. Genes encoding these antigen-binding fragments can be obtained by genetically modifying a gene encoding a full-length antibody protein molecule.
  • the foreign proteins to be subjected to the production method of the present invention include various proteins derived from human or non-human animals, antigen-binding fragments thereof, variants thereof, and the like. Can be.
  • Such proteins include atrial natriuretic peptide (ANP), brain natriuretic peptide (BNP), C-type natriuretic peptide (CNP), vasopressin, somatostatin, growth hormone (GH), insulin, oxytocin, ghrelin, Peptide hormones such as leptin, adiponectin, renin, calcitonin, osteoprotegerin, insulin-like growth factor (IGF), interleukins, chemokines, interferons, tumor necrosis factors (TNF ⁇ / ⁇ and other TNF superfamily, etc.), nerve growth factors (NGF ), Cell growth factors (EGF, FGF, PDGF, HGF, TGF, etc.), hematopoietic factors (CSF, G-CSF, erythropoietin, etc.), cytokines such as adipokine, receptors such as NF receptor, lysozyme , Proteases
  • the plasmids, restriction enzymes, DNA modifying enzymes and the like used in the examples of the present invention are commercially available and can be used according to a conventional method.
  • the procedures used for cloning DNA, determining the polynucleotide sequence, transforming host cells, culturing transformed cells, collecting and purifying proteins from the resulting culture, and the like are well known to those skilled in the art. Or can be known from the literature.
  • the promoter region of Hspa8 was amplified by PCR using genomic DNA of CHO cells as a template and the following primer set and PrimeSTAR Max DNA Polymerase (Takara Bio), and purified by QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN).
  • the nucleotide sequence of the promoter region of the cloned Chinese hamster Hspa8 is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • Hspa8-XbaI-R TTCTCTAGAGGTTGCTGAAAGAAAACCAAA (SEQ ID NO: 11)
  • Example 2 Evaluation by fed-batch culture of Hspa8 promoter using antibody expression level as an index 2-1
  • Construction of antibody expression vector pDSLH4.1 (Okumura T et al., J Biosci Bioeng., 120 (3): 340) -346, 2015) as a vector backbone, and Hspa8 is used as a promoter for antibody H chain and L chain genes to construct a humanized antibody gene Y expression vector pDSLH3.1-Hspa8-Y containing no DNA element. did.
  • Example 1 After the DNA fragment amplified and purified in Example 1 was digested with NotI-XbaI, the H chain gene expression vector pDSH1.1-hEF1 ⁇ -Y and the L chain gene expression vector pDSL2.1 described in Patent Document 4 were used. -Insertion between NotI-NheI sites of -hEF1 ⁇ -Y to construct pDSH1.1-Hspa8-Y and pDSL2.1-Hspa8-Y, respectively. Next, a DNA fragment obtained by digesting pDSL2.1-Hspa8-Y with AatII-MluI was inserted between AatII-MluI of pDSH1.1-Hspa8-Y to construct pDSLH3.1-Hspa8-Y. did. The vector outline is shown in FIG.
  • FIGS. 2A and 2B Changes in the number of living cells and the amount of antibody production are shown in FIGS. 2A and 2B, respectively.
  • the amount of antibody produced by the Hspa8 promoter reached a value 3.9 times that of the human EF1- ⁇ promoter, far exceeding the amount produced by the promoter frequently used at present.
  • Example 3 Examination of Hspa8 promoter length using index of antibody expression in fed-batch culture 3-1) Construction of antibody expression vector Antibody H chain of humanized antibody gene Y expression vector pDSLH3.1-hEF1 ⁇ -Y
  • pDSLH3.1-Hspa8-1.9-Y and pDSLH3.1-Hspa8-1.2-Y in which the promoter of the L chain gene was replaced with a partial sequence of the Hspa8 promoter were constructed.
  • a sequence from a nucleotide of about 1.9, 1.2 kbp upstream of the Hspa8 start codon sequence to a nucleotide immediately before the nucleotide sequence corresponding to the start codon sequence was used as a partial sequence of the Hspa8 promoter.
  • pDSLH3.1-Hspa8-1.9-Y was constructed by the following method. First, a partial sequence of the Chinese hamster Hspa8 promoter was amplified by PCR using pDSH1.1-Hspa8-Y as a template and the following primer set and PrimeSTAR Max DNA Polymerase, and purified by QIAquick PCR Purification kit. After the purified DNA fragment was digested with NotI-XbaI, the fragment was inserted between the NotI-NheI sites of the H chain gene expression vector pDSH1.1-hEF1 ⁇ -Y and the L chain gene expression vector pDSL2.1-hEF1 ⁇ -Y.
  • pDSL2.1-Hspa8-1.9-Y and pDSL2.1-Hspa8-1.9-Y respectively.
  • a DNA fragment obtained by digesting pDSL2.1-Hspa8-1.9-Y with AatII-MluI was inserted between AatII-MluI of pDSH1.1-Hspa8-1.9-Y, and pDSLH3 .1-Hspa8-1.9-Y was constructed.
  • pDSLH3.1-Hspa8-1.2-Y was constructed.
  • Hspa8 promoter 1.9 kbp primer set Hspa8-NotI-1900F: TTCGCGGCCGCAACAACCTAACTAATAGCTGTCC (SEQ ID NO: 12) Hspa8-XbaI-R: TTCTCTAGAGGTTGCTGAAAGAAAACCAAA (SEQ ID NO: 11) Hspa8 promoter 1.2 kbp primer set Hspa8-NotI-1200F: TTCGCGGCCGCAACCTTCGCGGCCATTTTGTCCC (SEQ ID NO: 13) Hspa8-XbaI-R: TTCTCTAGAGGTTGCTGAAAGAAAACCAAA (SEQ ID NO: 11)
  • Example 4 Examination of combination effect of Hspa8 promoter and A7 using index of antibody expression in fed-batch culture 4-1) Construction of antibody expression vector The antibody expression vector pDSLH3.1 constructed in (3-1) The DNA element A7 described in Patent Document 3 was inserted upstream of the expression cassette of Hspa8-1.9-Y to construct pDSLHA4.1-Hspa8-1.9-Y.
  • FIGS. 4A and 4B Changes in the number of living cells and the amount of antibody production are shown in FIGS. 4A and 4B, respectively.
  • the amount of antibody produced by the A7-containing antibody expression vector on the 14th day of culture was 3.4 times that of the A7-free antibody expression vector. It was found that by using the DNA element A7 and the Hspa8 promoter in combination, a high production can be effectively realized by a synergistic effect.
  • Example 5 Evaluation by fed-batch culture of human, mouse, and rat Hspa8 promoters using antibody expression level as an index 5-1) Construction of antibody expression vector Construction of humanized antibody gene Y expression vector pDSLH3.1-hEF1 ⁇ -Y PDSLH3.1-hHspa8-Y, pDSLH3.1-mHspa8-Y, and pDSLH3.1-rHspa8-Y, in which the promoters of the antibody H chain and L chain genes were replaced with human, mouse, and rat Hspa8 promoters, respectively.
  • Hspa8 promoter a sequence from a nucleotide of about 2.0 kbp upstream of the start codon sequence of Hspa8 to a nucleotide immediately before the nucleotide sequence corresponding to the start codon sequence was used as the Hspa8 promoter.
  • the nucleotide sequences of the cloned human, mouse, and rat Hspa8 promoters are shown in SEQ ID NOs: 2, 3, and 4, respectively.
  • pDSLH3.1-hHspa8-Y was constructed by the following method. First, using the human genomic DNA as a template, the human Hspa8 promoter was amplified by PCR using the following primer set and PrimeSTAR Max DNA Polymerase, and purified by QIAquick PCR Purification kit. After the purified DNA fragment was digested with HindIII-EcoT14I or AatII-EcoT14I, the HindIII-NheI of the heavy chain gene expression vector pDSH1.1-hEF1 ⁇ -Y and the Lchain gene expression vector pDSL2.1-hEF1 ⁇ -Y were respectively digested.
  • Hspa8-human-HindIII-F GGTGGAAGCTTATACAAACGTTCAGAAAGTCTTAA
  • Hspa8-human-EcoT14I-R GGTGCCATGGGGTTTGCTGAAAAAAAGAAAAATC
  • Primer set of human Hspa8 promoter for insertion of L chain gene expression vector Hspa8-human-AatII-F GGGTGACGTCCATACAAACGTTCAAAAGTCTAA
  • Hspa8-human-EcoT14I-R GGTGCCATGGGGTTTGCTGAAAAAAAGAAAAATC (SEQ ID NO: 15)
  • FIGS. 5A and 5B Changes in the number of living cells and the amount of antibody production are shown in FIGS. 5A and 5B, respectively.
  • the production of antibodies from the rat, mouse, Chinese hamster, and human Hspa8 promoters was 7.0, 6.8, 4.5, and 2.1 times that of the human EF1- ⁇ promoter, respectively.
  • the Hspa8 promoter from any species greatly exceeded the amount of antibody produced by the human EF1- ⁇ promoter.
  • a further increase in antibody production was observed from the Chinese hamster Hspa8 promoter, and it was found that by selecting an appropriate species, the promoter ability could be strongly exerted.
  • SEQ ID NO: 1 Chinese hamster-derived Hspa8 promoter
  • SEQ ID NO: 2 Human-derived Hspa8 promoter
  • SEQ ID NO: 3 Mouse-derived Hspa8 promoter
  • SEQ ID NO: 4 Rat-derived Hspa8 promoter
  • SEQ ID NO: 5 Chinese hamster-derived Hspa8 promoter Hspa8 Nucleotide sequence consisting of about 1.9 kbp nucleotide upstream of the codon to the nucleotide immediately preceding the nucleotide sequence corresponding to the start codon
  • SEQ ID NO: 6 Promoter of Hspa8 from Chinese hamster Starting from about 1.2 kbp nucleotide upstream of the start codon of Hspa8 Nucleotide sequence consisting of up to the nucleotide immediately preceding the nucleotide sequence corresponding to the codon
  • SEQ ID NO: 7 Nucleotide sequence sequence of DNA element A2 Issue 8: DNA element A7 nucleotide sequence

Abstract

本発明は、哺乳動物由来の培養細胞等の宿主細胞において、蛋白質性医薬品となる外来蛋白質の産生を亢進させる手段を提供する。　新規なＨｓｐａ８遺伝子のプロモーターを有する形質転換細胞、該形質転換細胞を用い、外来蛋白質を高分泌生産する方法が提供される。

Description

Ｈｓｐａ８遺伝子のプロモーター
　本発明は、Ｈｓｐａ８遺伝子のプロモーターを有する外来遺伝子発現ベクターを用いることによって得られた外来蛋白質の転写活性が増強された哺乳動物形質転換細胞、及びこれを用いた該外来蛋白質の製造方法に関する。
　遺伝子組換え技術の発展によって、治療用蛋白質や抗体医薬といった蛋白質性医薬品が急速にその市場を拡大している。中でも、抗体医薬は人体に投与しても有害な免疫反応を引き起こさず、その特異性の高さから開発が盛んに進められている。
　抗体医薬に代表される蛋白質性医薬を生産させる宿主としては、微生物や酵母、昆虫、動植物細胞、トランスジェニック動植物等を挙げることができる。蛋白質性医薬の生理活性や抗原性には、フォールディングや糖鎖修飾といった翻訳後修飾が必須であるため、複雑な翻訳後修飾を行うことができない微生物や糖鎖構造の大きく異なる植物は宿主として不適である。ヒトと類似した糖鎖構造を有し、翻訳後修飾が可能、さらには安全性の面を考慮し、ＣＨＯ細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅｒ　Ｏｖａｒｙ：チャイニーズハムスターの卵巣）等の哺乳動物培養細胞が現在の主流となっている。
　哺乳動物培養細胞を宿主とする場合、微生物等と比較して、増殖速度の低さ、生産性の低さ、高価なコスト等の問題を抱えている（非特許文献１）。また、蛋白質性医薬品を臨床で利用するためには大量の投与が必要となるため、世界的にもその生産能力の不足が問題となっている。哺乳類培養細胞発現系で蛋白質性医薬品を製造する場合、合成低分子医薬品に比べて製造コストが高いため、各製造工程の改良によって製造コストの低減が図られているが、哺乳類培養細胞発現系における生産量の向上も製造コスト低減の有力な方法である（非特許文献２、３）。そこで、哺乳動物培養細胞における外来遺伝子の生産性を向上させるため、これまでに、プロモーターやエンハンサー、薬剤選択マーカー、遺伝子増幅、培養工学的手法等多くのアプローチが試行錯誤されてきている。ＣＨＯ細胞を宿主細胞として用いる場合、外来遺伝子の発現、すなわち蛋白質性医薬品の生産にはウイルス由来のＨｕｍａｎ　ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ　ｍａｊｏｒ　ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ（以下ＣＭＶプロモーター）が一般的に用いられている（非特許文献４、５、６）。また、ＣＨＯ細胞において、ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ－１　ａｌｐｈａ　であるＥＦ－１α（特許文献１、非特許文献７）、ヒトリボソーム蛋白質遺伝子であるＲＰＬ３２やＲＰＳ１１の転写開始点の上流域のポリヌクレオチド（プロモーター領域）を単独または他の異種プロモーターと組み合わせて蛋白質発現に使用できることが知られている（非特許文献８、特許文献２、３）。哺乳動物細胞において、外来蛋白質の生産性を向上させたヒートショックプロテインＡ５（Ｈｓｐａ５／ＧＲＰ７８）遺伝子のプロモーターが知られている（特許文献４）。
特許第３０５１４１１号 ＷＯ２００６／１２３０９７ ＷＯ２０１３／０８０９３４ ＷＯ２０１８／０６６４９２
Ｆｌｏｒｉａｎ　Ｍ．Ｗｕｒｍ．，Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　２２（１１）：１３９３－１３９８，２００４ Ｆａｒｉｄ　ＳＳ．，　Ｊ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ　Ｂ　Ａｎａｌｙｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｍｅｄ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ．　８４８（１）：８－１８，２００７ Ｗｅｒｎｅｒ　ＲＧ．　Ｅｃｏｎｏｍｉｃ　ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ　ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．　Ｊ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　１１３（１－３）：１７１－１８２，２００４ Ｄｕｒｏｃｈｅｒ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　２０（６）：７００－７０７，２００９ Ｂｏｓｈａｒｔ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ．　４１（２）：５２１－５３０，１９８５ Ｆｏｅｃｋｉｎｇ　ＭＫ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ．　４５（１）：１０１－１０５，１９８６ Ｄｅｅｒ　ＪＲ． ａｎｄ　Ａｌｌｉｓｏｎ　ＤＳ.，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｐｒｏｇ.　２０：８８０－８８９，２００４ Ｈｏｅｋｓｅｍａ　Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｖｏｌｕｍｅ２０１１，　Ａｒｔｉｃｌｅ　ＩＤ　４９２８７５，　１１ｐａｇｅｓ
　本発明の課題は、哺乳動物培養細胞等の宿主細胞において、高い外来遺伝子発現亢進活性を有するプロモーターを提供すること、及び、当該プロモーターを用いて、蛋白質性医薬品となる外来蛋白質の生産量を亢進させる手段を提供することにある。ＣＨＯ細胞等においてヒトＥＦ－１αプロモーターと同程度以上のプロモーター活性をもつプロモーターを見出すことにより、哺乳動物細胞が安定的に外来遺伝子の高発現を達成する手段を提供し、哺乳類培養細胞発現系における蛋白質性医薬品の生産量の向上、すなわち製造コスト低減に貢献する手段を提供することができる。
　本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ヒートショックプロテインＡ８（Ｈｓｐａ８）遺伝子の開始コドンの上流約２．９ｋｂｐのポリヌクレオチドが、優れたプロモーター活性を有し、哺乳動物培養細胞において発現対象となる外来蛋白質の生産性を著しく向上させることが可能であることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）チャイニーズハムスター由来Ｈｓｐａ８遺伝子のプロモーターであって、配列番号６に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、配列番号１に記載のヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列の部分配列からなるポリヌクレオチド。
（２）配列番号１に記載のヌクレオチド配列からなる、前記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（３）配列番号５に記載のヌクレオチド配列からなる、前記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（４）配列番号６に記載のヌクレオチド配列からなる、前記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（５）ヒト由来Ｈｓｐａ８遺伝子のプロモーターである、配列表の配列番号２に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
（６）マウス由来Ｈｓｐａ８遺伝子のプロモーターである、配列表の配列番号３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
（７）ラット由来Ｈｓｐａ８遺伝子のプロモーターである、配列表の配列番号４に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
（８）前記（１）乃至（７）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列に対して９５％以上同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
（９）前記（１）乃至（７）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列に対して９９％以上同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
（１０）前記（１）乃至（９）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
（１１）前記（１）乃至（１０）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含むことからなる、外来遺伝子発現ユニット。
（１２）外来遺伝子が多量体蛋白質をコードする遺伝子である、前記（１１）に記載の外来遺伝子発現ユニット。
（１３）外来遺伝子がヘテロ多量体蛋白質をコードする遺伝子である、前記（１１）に記載の外来遺伝子発現ユニット。
（１４）外来遺伝子が抗体又はその抗原結合性断片をコードする遺伝子である、前記（１１）に記載の外来遺伝子発現ユニット。
（１５）前記（１１）乃至（１４）のいずれか一つに記載の外来遺伝子発現ユニットを含む外来遺伝子発現ベクター。
（１６）前記（１１）乃至（１４）のいずれか一つに記載の外来遺伝子発現ユニット及び下記Ａ群の（ａ）乃至（ｅ）に記載のポリヌクレオチドから選択されるいずれか一つ又は複数のポリヌクレオチドを含む外来遺伝子発現ベクター；
Ａ群
（ａ）配列表の配列番号７に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列表の配列番号８に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
（ｃ）配列表の配列番号９に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
（ｄ）前記（ａ）乃至（ｃ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列に対して９５％以上同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、外来遺伝子発現亢進活性を有するポリヌクレオチド、
（e）上記（ａ）乃至（ｃ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列に対して９９％以上同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、外来遺伝子発現亢進活性を有するポリヌクレオチド。
（１７）前記（１５）又は（１６）に記載の外来遺伝子発現ベクターが導入された形質転換細胞。
（１８）細胞が哺乳動物由来の培養細胞である、前記（１７）に記載の形質転換細胞。
（１９）哺乳動物由来の培養細胞が、ＣＯＳ－１細胞、２９３細胞、又はＣＨＯ細胞である、前記（１８）に記載の形質転換細胞。
（２０）前記（１７）乃至（１９）のいずれか一つに記載の形質転換細胞を培養し、培養物から外来遺伝子由来の蛋白質を取得することを特徴とする、該蛋白質の製造方法。
（２１）形質転換細胞において外来遺伝子を発現させることを目的とする、前記（１）乃至（１０）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの使用。
（２２）形質転換細胞において外来遺伝子を発現させることを目的とする、前記（１５）又は（１６）に記載の外来遺伝子発現ベクターの使用。
　本発明のＨｓｐａ８遺伝子由来のプロモーターを用いた外来遺伝子発現ベクターを哺乳動物宿主細胞へ導入することによって、治療用蛋白質や抗体等の外来遺伝子の発現を著しく亢進することが可能になる。また、本発明のプロモーターは、ＤＮＡエレメントと組み合わせることにより、治療用蛋白質や抗体等の外来遺伝子の発現をさらに亢進することが可能である。
抗体Ｈ鎖およびＬ鎖遺伝子のプロモーターとしてＨｓｐａ８遺伝子、あるいは、ヒトＥＦ１－α遺伝子由来のプロモーターを用いた、ヒト化抗体遺伝子Ｙ発現ベクターｐＤＳＬＨ３．１－Ｈｓｐａ８－Ｙ、および、ｐＤＳＬＨ３．１－ｈＥＦ１α－Ｙの概略図。 ヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールを用いた流加培養にて、Ｈｓｐａ８遺伝子プロモーターにより発現された抗体生産量を、ヒトＥＦ１－α遺伝子プロモーターと比較した図。図２Ａは、各サンプリング日における生細胞数を示す。 ヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールを用いた流加培養にて、Ｈｓｐａ８遺伝子プロモーターにより発現された抗体生産量を、ヒトＥＦ１－α遺伝子プロモーターと比較した図。図２Ｂは、各サンプリング日における生産量を示す。 各プロモーター長のＨｓｐａ８遺伝子プロモーターを使用して作製したヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールの流加培養にて、抗体生産量をヒトＥＦ１－α遺伝子プロモーターと比較した図。図３Ａは、各サンプリング日における生細胞数を示す。 各プロモーター長のＨｓｐａ８遺伝子プロモーターを使用して作製したヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールの流加培養にて、抗体生産量をヒトＥＦ１－α遺伝子プロモーターと比較した図。図３Ｂは、各サンプリング日における生産量を示す。
抗体Ｈ鎖およびＬ鎖遺伝子のプロモーターとしてＨｓｐａ８遺伝子を使用し、ＤＮＡエレメントＡ７を含む、あるいは、含まないヒト化抗体Ｙ発現ベクターを用いて作製したステーブルプールの流加培養にて、抗体生産量を比較した図。図４Ａは、各サンプリング日における生細胞数を示す。 抗体Ｈ鎖およびＬ鎖遺伝子のプロモーターとしてＨｓｐａ８遺伝子を使用し、ＤＮＡエレメントＡ７を含む、あるいは、含まないヒト化抗体Ｙ発現ベクターを用いて作製したステーブルプールの流加培養にて、抗体生産量を比較した図。図４Ｂは、各サンプリング日における生産量を示す。 各生物種由来Ｈｓｐａ８遺伝子プロモーターを使用して作製したヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールの流加培養にて、抗体生産量を比較した図。Ｈｓｐａ８、ｈＨｓｐａ８、ｍＨｓｐａ８、ｒＨｓｐａ８は、それぞれチャイニーズハムスター、ヒト、マウス、ラット由来Ｈｓｐａ８の結果を示す。図５Ａは、各サンプリング日における生細胞数を示す。 各生物種由来Ｈｓｐａ８遺伝子プロモーターを使用して作製したヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールの流加培養にて、抗体生産量を比較した図。Ｈｓｐａ８、ｈＨｓｐａ８、ｍＨｓｐａ８、ｒＨｓｐａ８は、それぞれチャイニーズハムスター、ヒト、マウス、ラット由来Ｈｓｐａ８の結果を示す。図５Ｂは、各サンプリング日における生産量を示す。 チャイニーズハムスター由来Ｈｓｐａ８遺伝子のプロモーターであるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列 ヒト由来Ｈｓｐａ８遺伝子のプロモーターであるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列 マウス由来Ｈｓｐａ８遺伝子のプロモーターであるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列 ラット由来Ｈｓｐａ８遺伝子のプロモーターであるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列
　以下、本発明を具体的に説明する。
　本明細書において、「遺伝子」とは、ｍＲＮＡに転写され、蛋白質に翻訳される部分を意味し、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びそのＲＮＡも含まれるものとする。
　本明細書において、「ポリヌクレオチド」とは核酸と同じ意味で用いており、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーも含まれている。
　本明細書において、「ポリペプチド」と「蛋白質」は区別せずに用いている。
　本明細書において、「遺伝子発現」とは、ある遺伝子がｍＲＮＡに転写される現象、及び／又は該ｍＲＮＡから蛋白質が翻訳される現象を意味している。
　本明細書において、「外来遺伝子」とは、人工的に宿主細胞に導入される遺伝子を意味している。
　本明細書において、「外来蛋白質」とは、外来遺伝子にコードされる蛋白質を意味している。
　本明細書において、「遺伝子発現ユニット」とは、転写の読み枠の方向に、少なくともプロモーター領域、外来遺伝子、転写ターミネーター領域（ポリＡ付加シグナル）を有するポリヌクレオチドを意味している。
　本明細書において、「プロモーター」とは、ＤＮＡからＲＮＡへの転写の開始に関与する転写因子が結合する領域を意味する。本明細書においては、「プロモーター領域」ということもある。プロモーターとして、例えば、開始コドンの上流約３ｋｂｐのヌクレオチドから開始コドンに対応するヌクレオチド配列直前のヌクレオチドまでのポリヌクレオチドを例示でき、５’ＵＴＲ、及びイントロンを含んでもよい。
　本明細書において、「プロモーター活性」とは、転写因子がプロモーターに結合し、転写を開始し、遺伝子にコードされる蛋白質の生産を行う活性をいい、ホタルルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子にコードされる蛋白質の活性を指標として検定することが可能である。
　本明細書において、「プロモーター活性を有する」とは、後記（実施例２）に記載の流加培養での抗体発現量を指標としたプロモーター活性の評価と同様の条件で、ヒトＥＦ－１α遺伝子プロモーターと同等以上の抗体発現量を示すことをいう。
　本明細書中において、「ＤＮＡエレメント」とは、遺伝子発現ユニットの近傍又は、遺伝子発現ユニットの含まれる外来遺伝子発現ベクター上に配置された場合に、外来遺伝子発現亢進活性を有するポリヌクレオチドを意味する。
　本明細書中において、「抗体の抗原結合性断片」とは、抗原との結合活性を有する抗体の部分断片を意味しており、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等を含むが、抗原との結合能を有している限りこれらの分子に限定されない。
　本明細書中において、「同一性」とは、当該分野で公知のように、配列の比較によって決定される、２つ以上のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の、配列間の関係をいう。当該分野において、「同一性」はまた、場合に応じて、一列の２つ以上のヌクレオチド配列間または２つ以上のアミノ酸配列間の一致によって決定したときの、核酸分子間またはポリペプチド間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」は、２つ以上の配列のうち小さなものと、特定の数理的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によってアドレス指定されるギャップアラインメント（存在する場合）との間の同一一致のパーセントを算出することにより評価することができる。具体的には、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ－Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ）が提供するＣｌｕｓｔａｌＷ２等のソフトを使用することにより評価することができるが、当業者において使用されるものであればこれに限定されない。
　本明細書中において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、ある核酸に対する同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のヌクレオチド配列からなる核酸の相補鎖がハイブリダイズし、それより同一性が低いヌクレオチド配列からなる核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件を挙げることができる。より具体的には、市販のハイブリダイゼーション溶液ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（クロンテック社製）中、６８℃でハイブリダイズすること、又は、ＤＮＡを固定したフィルターを用いて０．７乃至１．０ＭのＮａＣｌ存在下６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１乃至２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度ＳＳＣとは１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ、１５　ｍＭ　クエン酸ナトリウムからなる）を用い、６８℃で洗浄する条件又はそれと同等の条件でハイブリダイズすることを意味する。
１．外来遺伝子の発現亢進に使用されるプロモーター
　本発明の外来遺伝子の発現亢進に使用されるプロモーター（以下、「本発明のプロモーター」ということもある）は、ヒートショックプロテインＡ８遺伝子（以下、「Ｈｓｐａ８」という）のプロモーターである。Ｈｓｐａ８プロモーターとしての活性を有するポリヌクレオチドであれば特に限定されないが、Ｈｓｐａ８のプロモーターとしては、開始コドンの上流約２．９ｋｂｐのヌクレオチドから開始コドンに対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドまでのポリヌクレオチドが好ましい。
　Ｈｓｐａ８のプロモーターの由来は特に限定されないが、哺乳類由来であってもよく、例えばチャイニーズハムスター、ヒト、マウス、ラット等由来のＨｓｐａ８のプロモーターを挙げることができる。本発明のプロモーターとして、好適には、げっ歯類由来のＨｓｐａ８のプロモーターであり、さらに好適には、チャイニーズハムスター、マウス、あるいは、ラット由来のＨｓｐａ８のプロモーター、よりさらに好適には、マウスあるいはラット由来のＨｓｐａ８のプロモーターである。
チャイニーズハムスター由来Ｈｓｐａ８のプロモーターとしては、配列表の配列番号１及び図６に記載のポリヌクレオチドが例示される。配列番号１のヌクレオチド配列は、チャイニーズハムスター由来Ｈｓｐａ８の開始コドンの上流約２．９ｋｂｐのヌクレオチドから開始コドンに対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドからなる配列である。
　配列番号２、３、及び４のヌクレオチド配列は、それぞれ、ヒト、マウス、ラット由来Ｈｓｐａ８の開始コドンの上流約２ｋｂｐのヌクレオチドから開始コドンに対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドからなる配列である。配列番号２、３、及び４のヌクレオチド配列を、それぞれ、図７、図８、図９にも示す。
　チャイニーズハムスター由来Ｈｓｐａ８のプロモーターとしては配列番号１に記載の配列の部分配列からなるヌクレオチド配列であってもよく、それぞれＨｓｐａ８の開始コドンの上流約１．９及び１．２ｋｂｐのヌクレオチドから開始コドンに対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドからなる配列の配列番号５及び６記載の配列を含むポリヌクレオチドが例示され、さらに、Ｈｓｐａ８の開始コドンの上流約１．１及び１．０ｋｂｐのヌクレオチドから開始コドンに対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドからなる配列を含むポリヌクレオチドも例示されるが、配列番号６に記載のポリヌクレオチドが好ましい。
　また、本発明のプロモーターは配列番号１乃至６に示すいずれか一つのヌクレオチド配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドであっても良い。
　本発明のプロモーターは、配列番号１乃至６に記載のヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドであってもよい。
　本発明のプロモーターは、配列番号１乃至６に記載のヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列において、１又は複数、好ましくは１乃至３００個、さらに好ましくは１乃至３０個のヌクレオチドが欠失、置換、及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなる変異ポリヌクレオチドであって、かつプロモーター活性を有するポリヌクレオチドであってもよい。
　前記ヌクレオチド配列の変異（欠失、置換、及び／又は付加）の導入は、Ｋｕｎｋｅｌ法若しくはＧａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法等の当該技術分野で公知の手法、又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ－Ｋ（タカラバイオ社製）若しくはＭｕｔａｎｔ－Ｇ（タカラバイオ社製）、タカラバイオ社のＬＡ　ＰＣＲ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　シリーズキット等）が利用できる。このような変異ポリヌクレオチドも本発明のプロモーターとして使用することができる。
　本発明のプロモーターの有する外来遺伝子発現亢進活性は、ホタルルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子にコードされる蛋白質の活性、あるいは、流加培養での抗体生産量を指標として検定することが可能である。ヒトＥＦ－１αプロモーターを使用した場合と本発明のプロモーターを使用した場合を比較して、流加培養での抗体生産量が同等以上、好ましくは１．２倍以上、より好ましくは１．５倍以上に上昇した場合、該プロモーターが外来遺伝子発現亢進活性を有すると判断することができる。１．２倍程度以上の亢進によっても、細胞の培養スケールの削減、培養時間、及び精製工程の短縮が期待され、結果として収量の向上と培養コストの削減が可能となる。収量が向上すれば、医薬としての外来蛋白質を安定して供給することが可能となる。又、培養コストが削減されれば、医薬としての外来蛋白質の原価が軽減される。
２．外来遺伝子発現ユニット
　本発明の外来遺伝子発現ユニット（以下、「本発明の遺伝子発現ユニット」ということもある）は、転写の読み枠の方向に、少なくとも前記１．に記載の本発明のプロモーター、外来遺伝子、及び転写ターミネーター領域（ポリＡ付加シグナル）を有するものである。
　また、ポリＡ付加配列は、プロモーターからの転写に対して転写終結を起こす活性を有する配列であればよく、プロモーターの遺伝子と同じ又は異なる遺伝子のものであってもよい。
３．外来遺伝子の発現亢進に使用されるＤＮＡエレメント
　前記２．に記載の本発明の遺伝子発現ユニットとＤＮＡエレメントを組み合わせて使用することにより、外来遺伝子の発現をさらに亢進することができる。組み合わせて使用するＤＮＡエレメントは、アセチル化ヒストンＨ３との相互作用を指標として取得することが可能である。一般にヒストン（Ｈ３、Ｈ４）のアセチル化は転写の活性化に関与しているといわれており、主に２つの説が考えられている。ヒストンテールがアセチル化することで電荷的に中和され、ＤＮＡとヒストンとの結合が緩くなるというヌクレオソームの立体構造変化が関係している説（Ｍｅｌｌｏｒ　Ｊ．　（２００６）　Ｄｙｎａｍｉｃ　ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅｓ　ａｎｄ　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ．　２２（６）：３２０－３２９）と、様々な転写因子のリクルートに関与するという説（Ｎａｋａｔａｎｉ　Ｙ．　（２００１）　Ｈｉｓｔｏｎｅ　ａｃｅｔｙｌａｓｅｓ－ｖｅｒｓａｔｉｌｅ　ｐｌａｙｅｒｓ．　Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ．　６（２）：７９－８６）である。いずれの説においても、ヒストンのアセチル化が転写活性化に関与している可能性は高く、抗アセチル化ヒストンＨ３抗体を用いたクロマチン免疫沈降（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ；ＣｈＩＰ）によって、アセチル化ヒストンＨ３と相互作用するＤＮＡエレメントを濃縮することが可能である。
　本発明のプロモーターと組み合わせて使用する、外来遺伝子の発現亢進に使用されるＤＮＡエレメントとして、Ａ２、Ａ７、及び、Ａ１８を挙げることができる。
　Ａ２はヒト１５番染色体８０９６６４２９～８０９７４８７８に位置しており、ＡＴ含量６２．２％、８４５０ｂｐのポリヌクレオチドである。Ａ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号７に記載されている。
　Ａ７はヒト１１番染色体８８９９２１２３～８９０００５４２に位置しており、ＡＴ含量６４．５２％、８４２０ｂｐのポリヌクレオチドである。Ａ７のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号８に記載されている。
　Ａ１８は、ヒト４番染色体１１１２７５９７６～１１１２８４４５０に位置しており、ＡＴ含量６２．５４％、８４７５ｂｐのポリヌクレオチドである。Ａ１８のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号９に記載されている。
　本発明のプロモーターと組み合わせて使用する、ＤＮＡエレメントの有する外来遺伝子発現亢進活性は、ＳＥＡＰ等のレポーター遺伝子にコードされる蛋白質の活性を指標として検定することが可能である。
　本発明のプロモーターと組み合わせて使用する場合、前記ＤＮＡエレメントのいずれか１種を単独で使用しても良く、ＤＮＡエレメントの１種を２コピー以上使用しても良い。あるいは２種以上ＤＮＡエレメントを組み合わせて使用しても良い。
　本発明において使用されるＤＮＡエレメントは、配列番号７乃至９に示すヌクレオチド配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ外来遺伝子発現亢進活性を有するヌクレオチド配列であっても良い。ヌクレオチド配列のホモロジー検索は、例えば、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＮＡ　Ｄａｔａｂａｎｋ　ｏｆ　ＪＡＰＡＮ）等を対象に、ＦＡＳＴＡやＢＬＡＳＴ等のプログラムを用いて行うことができる。
　当業者であれば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１０　Ｓｋｙｌｉｎｅ　Ｄｒｉｖｅ　Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，　ＮＹ　（１９８９））等を参照することにより、本発明のプロモーターのこうしたホモログ遺伝子を容易に取得することができる。また、前記のヌクレオチド配列の同一性は、同様に、ＦＡＳＴＡ検索やＢＬＡＳＴ検索により決定することができる。
　前記ポリヌクレオチドの変異（欠失、置換、及び／又は付加）の導入は、Ｋｕｎｋｅｌ法若しくはＧａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法等の当該技術分野で公知の手法、又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ－Ｋ（タカラバイオ社製）若しくはＭｕｔａｎｔ－Ｇ（タカラバイオ社製）、タカラバイオ社のＬＡ　ＰＣＲ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　シリーズキット等）が利用できる。このような変異ポリヌクレオチドも本発明のＤＮＡエレメントとして使用することができる。
４．ポリヌクレオチドの取得
　本発明において、後記の産生亢進の対象となる外来蛋白質をコードする外来遺伝子を含むポリヌクレオチドは、以下に示す一般的な方法により取得することができる。例えば、外来遺伝子が発現している細胞や組織に由来するｃＤＮＡライブラリーを、当該遺伝子断片をもとにして合成したＤＮＡプローブを用いてスクリーニングすることにより単離することができる。ｍＲＮＡの調製は、当該技術分野において通常用いられる手法により行うことができる。例えば、前記細胞又は組織を、グアニジニン試薬、フェノール試薬等で処理して全ＲＮＡを得、その後、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムやセファロース２Ｂを担体とするポリＵ－セファロース等を用いたアフィニティーカラム法により、あるいはバッチ法によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得る。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡをさらに分画してもよい。次いで、得られたｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成し、該一本鎖ｃＤＮＡからＤＮＡ合成酵素Ｉ、ＤＮＡリガーゼ及びＲＮａｓｅＨ等を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成する。合成した二本鎖ｃＤＮＡをＴ４ＤＮＡ合成酵素によって平滑化後、アダプター（例えば、ＥｃｏＲＩアダプター）の連結、リン酸化等を経て、λｇｔ１１等のλファージに組み込んでｉｎ　ｖｉｖｏパッケージングすることによってｃＤＮＡライブラリーを作製する。また、λファージ以外にもプラスミドベクターを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製することもできる。その後、ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを有する株（ポジティブクローン）を選択すればよい。
　また、蛋白質の産生に用いる前記プロモーター、ターミネーター領域を含むポリヌクレオチド、前記ＤＮＡエレメント又は外来遺伝子を含むポリヌクレオチドをゲノムＤＮＡから単離する場合は、一般的手法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９），Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１９４（１９９１））に従い、採取源となる生物の細胞株よりゲノムＤＮＡを抽出し、ポリヌクレオチドを選別することにより行う。ゲノムＤＮＡの抽出は、例えば、Ｃｒｙｅｒ　らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　１２，　３９－４４（１９７５））及びＰ．　Ｐｈｉｌｉｐｐｓｅｎらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１９４，　１６９－１８２（１９９１））に従って行うことができる。
　目的とするプロモーター、ＤＮＡエレメント、又は外来遺伝子を含むポリヌクレオチドの取得は、例えばＰＣＲ法（ＰＣＲ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｈｅｎｒｙ　Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ，Ａｔｏｃｋｔｏｎ　ｐｒｅｓｓ（１９８９））によって行うこともできる。ＰＣＲ法を用いたポリヌクレオチドの増幅には、プライマーとして２０～３０ｍｅｒの合成１本鎖ＤＮＡを、鋳型としてゲノムＤＮＡを用いる。増幅された遺伝子はポリヌクレオチド配列を確認した後、用いる。ＰＣＲの鋳型としては、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）等のゲノムＤＮＡライブラリーを使用することが可能である。
　一方、配列未知の外来遺伝子を含むポリヌクレオチドの取得は、（ａ）常法により遺伝子ライブラリーを作製し、（ｂ）作製された遺伝子ライブラリーから所望のポリヌクレオチドを選択し、当該ポリヌクレオチドを増幅する、ことによって行うことができる。遺伝子ライブラリーは、採取源となる生物の細胞株から常法により得た染色体ＤＮＡを適当な制限酵素によって部分消化して断片化し、得られた断片を適当なベクターに連結し、該ベクターを適当な宿主に導入することによって調製することができる。また、細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ここからｃＤＮＡを合成後、適当なベクターに連結し、該ベクターを適当な宿主に導入することによっても調製することができる。この際用いられるベクターとしては、通常公知の遺伝子ライブラリー調製用ベクターとして知られるプラスミドを用いることができ、ファージベクター又はコスミド等も広く用いることができる。形質転換又は形質導入を行う宿主は、前記ベクターの種類に応じたものを用いればよい。外来遺伝子を含むポリヌクレオチドの選択は、前記遺伝子ライブラリーから、外来遺伝子に特有の配列を含む標識プローブを用いるコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法等によって行う。
　また外来遺伝子を含むポリヌクレオチドを化学的に全合成することもできる。例えば相補的な１対のオリゴヌクレオチドを作製しこれらをアニールさせる方法や、数本のアニールされたＤＮＡをＤＮＡリガーゼにより連結する方法、又は一部相補的な数本のオリゴヌクレオチドを作製しＰＣＲによりギャップを埋める方法等により、遺伝子を合成することができる。
　ポリヌクレオチド配列の決定は、通常の方法、例えばジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　７４，　５４６３－５４６７（１９７７））等により行うことができる。更に前記ポリヌクレオチド配列の決定は、市販のシークエンスキット等を用いることによっても容易に行い得る。
５．外来遺伝子発現ベクター
　本発明の外来遺伝子発現ベクターとしては、前記１．に記載のプロモーターを含む前記２．に記載の外来遺伝子発現ユニットを含むベクターが提供される。本発明の外来遺伝子発現ベクターは、前記３．に記載のＤＮＡエレメントの１種、ＤＮＡエレメントの１種を２個以上のコピー数、ＤＮＡエレメントの２種以上の組み合わせを含んでもよい。前記の外来遺伝子発現ベクターによって外来遺伝子を宿主細胞内で発現させる際には、ＤＮＡエレメントを遺伝子発現ユニットの直前又は直後に配置してもよく、又は遺伝子発現ユニットから離れた位置に配置しても良い。また、複数のＤＮＡエレメントを含む１つの外来遺伝子発現ベクターを用いてもよい。なお、ＤＮＡエレメントの向きは、遺伝子発現ユニットに対して順方向又は逆方向のいずれであっても良い。
　外来遺伝子としては、特に限定はされないが、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子、α－アミラーゼ遺伝子、α－ガラクトシダーゼ遺伝子等の各種酵素遺伝子、医薬上有用な生理活性蛋白質であるインターフェロンα、インターフェロンγ等の各種インターフェロン遺伝子、ＩＬ１、ＩＬ２等の各種インターロイキン遺伝子、エリスロポエチン（ＥＰＯ）遺伝子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）遺伝子等の各種サイトカイン遺伝子、成長因子遺伝子、又は多量体蛋白質をコードする遺伝子、例えば抗体又はその抗原結合性断片であるヘテロ多量体をコードする遺伝子等を挙げることができる。これらの遺伝子はいかなる手法によって得られるものでもよい。
　「抗体の抗原結合性断片」とは、抗原との結合活性を有する抗体の部分断片を意味しており、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体等を含む。また、Ｆ（ａｂ’）２を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるＦａｂ’も抗体の抗原結合性断片に含まれる。但し、抗原との結合能を有している限りこれらの分子に限定されない。また、これらの抗原結合性断片には、抗体蛋白質の全長分子を適当な酵素で処理したもののみならず、遺伝子工学的に改変された抗体遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された蛋白質も含まれる。
　また、本発明の外来遺伝子発現ベクターには、形質転換体を選抜するための選択マーカーを含めることができる。例えば、セルレニン、オーレオバシジン、ゼオシン、カナバニン、シクロヘキシミド、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストシジン、テトラサイクリン、カナマイシン、アンピシリン、ネオマイシン等の薬剤に対して耐性を付与する薬剤耐性マーカー等を使用することで、形質転換体の選抜を行うことが可能である。また、エタノール等に対する溶剤耐性や、グリセロールや塩等に対する浸透圧耐性、銅等の金属イオン耐性等を付与する遺伝子をマーカーにすることで、形質転換体の選抜を行うことも可能である。
　本発明の外来遺伝子発現ベクターは、染色体ＤＮＡに組込まれないベクターであってもよい。一般的に、外来遺伝子発現ベクターは宿主細胞に遺伝子導入された後、ランダムに染色体に組込まれるが、ｓｉｍｉａｎ　ｖｉｒｕｓ　４０（ＳＶ４０）やｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ（ＢＰＶ、ＨＰＶ）、ＥＢＶ等の哺乳動物ウイルス由来の構成成分を用いることにより、導入された宿主細胞中で自己複製が可能なｅｐｉｓｏｍａｌ　ｖｅｃｔｏｒとして使用することができる。例えば、ＳＶ４０由来の複製起点及びｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒであるＳＶ４０　ｌａｒｇｅ　Ｔ抗原をコードした配列を有するベクターやＥＢＶ由来のｏｒｉＰ及びＥＢＮＡ－１をコードした配列を有するベクター等が広く用いられている。ＤＮＡエレメントの効果はベクターの種類、あるいは染色体への組込み有無を問わず、外来遺伝子発現亢進活性を示すことが可能である。
６．形質転換細胞
　本発明の形質転換細胞は、前記５．の外来遺伝子発現ベクターを用いて導入した形質転換細胞である。
　形質転換させる宿主細胞としては、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、さらに好ましくはヒト、マウス、ラット、ハムスター、サル、又はウシ由来の細胞である。哺乳動物細胞としては、ＣＯＳ－１細胞、２９３細胞、ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－Ｏ1、ＣＨＯ　ＤＧ４４、ＣＨＯ　ｄｈｆｒ－、ＣＨＯ－Ｓ）等を挙げることができるが、これらに限定されない。
　本発明において、宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、導入遺伝子が宿主内にて安定に存在し、かつ適宜発現させることができる方法であればいかなる方法でもよく、一般的に用いられている方法、例えば、リン酸カルシウム法（Ｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　（１９８４）　Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，３４１）、エレクトロポレーション法（Ｂｅｃｋｅｒ，　Ｄ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９０）　Ｍｅｔｈｏｄｓ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１９４，１８２－１８７）、スフェロプラスト法（Ｃｒｅｇｇｈ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５，３３７６（１９８５））、酢酸リチウム法（Ｉｔｏｈ，　Ｈ．　（１９８３）　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１５３，　１６３－１６８）、リポフェクション法等を挙げることができる。
７．外来蛋白質の製造方法
　本発明の外来蛋白質の製造方法は、前記６．の項目に記載の形質転換細胞を公知の方法により培養し、その培養物から採取し、精製することにより行うことができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞、又は細胞の破砕物のいずれをも意味するものである。なお、６．の項目に記載の形質転換細胞を用いて産生することのできる外来蛋白質としては、単量体蛋白質のみならず多量体蛋白質を選択することも可能である。異なる複数のサブユニットから構成されるヘテロ多量体蛋白質の生産を行う場合、これらのサブユニットをコードしている複数の遺伝子を、それぞれ６．の項目に記載の宿主細胞に導入する必要がある。
　形質転換細胞を培養する方法は、その宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　形質転換細胞が哺乳動物細胞の場合は、例えば３７℃、５％又は８％ＣＯ２条件下で培養し、培養時間は２４～１０００時間程度であり、培養は静置、振とう、攪拌、通気下の回分培養、流加培養、灌流培養又は連続培養等により実施することができる。
　前記の培養物（培養液）から外来蛋白質遺伝子の発現産物の確認は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ウエスタン解析、ＥＬＩＳＡ等により行うことができる。
８．抗体蛋白質の製造方法
　前記７．の項目に記載の製造方法を用いて製造されるヘテロ多量体蛋白質としては抗体蛋白質を挙げることができる。抗体蛋白質は、２分子の重鎖ポリペプチド及び２分子の軽鎖ポリペプチドからなる４量体蛋白質である。従って、抗原結合能を維持した形態で抗体蛋白質を取得するためには、前記６．の項目に記載の形質転換細胞において、重鎖及び軽鎖の遺伝子の双方が導入されている必要がある。この場合に、重鎖及び軽鎖の遺伝子発現ユニットは、同じ発現ベクター上に存在しても良く、あるいは異なる発現ベクター上に存在していても良い。
　本発明において製造される抗体としては、ウサギ、マウス、ラット等実験動物を所望の抗原で免疫して作製された抗体を挙げることができる。また、前記の抗体を原料とするキメラ抗体、及びヒト化抗体も本発明において製造される抗体として挙げることができる。さらに、遺伝子改変動物又はファージディスプレイ法によって取得されるヒト抗体についても、本発明において製造される抗体である。
　抗体製造に用いる抗体遺伝子としては、該抗体遺伝子より転写・翻訳される重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの組合せが、任意の抗原蛋白質と結合する活性を保持している限り、特定のポリヌクレオチド配列を持つ抗体遺伝子に限定されない。
　また、抗体遺伝子としては、必ずしも抗体の全長分子をコードしている必要はなく、抗体の抗原結合性断片をコードしている遺伝子を用いることができる。これらの抗原結合性断片をコードする遺伝子は、抗体蛋白質の全長分子をコードする遺伝子を遺伝子工学的に改変することによって取得することができる。
９．その他の外来蛋白質の製造方法
　本発明の製造方法の対象となる外来蛋白質としては、前述の抗体に加え、ヒト又は非ヒト動物由来の各種蛋白質、その抗原結合性断片、その改変体等を挙げることができる。そのような蛋白質等としては、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、バソプレッシン、ソマトスタチン、成長ホルモン（ＧＨ）、インスリン、オキシトシン、グレリン、レプチン、アディポネクチン、レニン、カルシトニン、オステオプロテジェリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）等のペプチドホルモン、インターロイキン、ケモカイン、インターフェロン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα／βほかＴＮＦスーパーファミリー等）、神経成長因子（ＮＧＦ）、細胞増殖因子（ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＴＧＦ等）、造血因子（ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、エリスロポエチン等）、アディポカイン等のサイトカイン、ТＮＦ受容体等の受容体、リゾチーム、プロテアーゼ、プロテイナーゼ、ペプチダーゼ等の酵素、その機能性断片（元の蛋白質の生物活性を一部又は全部保持している断片）、それらの蛋白質を含むことからなる融合蛋白質等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
　以下、実施例により本発明を具体的に説明する。ただし、これらの実施例は本発明の技術的範囲をなんら限定するものではない。本発明の実施例で用いるプラスミド、制限酵素、ＤＮＡ修飾酵素等は市販のものであり、常法に従って使用することができる。また、ＤＮＡのクローニング、ポリヌクレオチド配列の決定、宿主細胞の形質転換、形質転換細胞の培養、得られる培養物からの蛋白質の採取、精製等に用いた操作についても当業者によく知られているものであるか、文献により知ることのできるものである。
（実施例１）Ｈｓｐａ８遺伝子のプロモーター領域のクローニング
　Ｈｓｐａ８のプロモーター領域としては、ＧｅｎＢａｎｋにＮＭ＿００１２４６７２９．１で登録されているｍＲＮＡの配列およびＮＷ＿００３６１６１９０．１で登録されているチャイニーズハムスターゲノムのスキャフォールド配列を参考にして、Ｈｓｐａ８の開始コドン配列の上流約２．９ｋｂｐのヌクレオチドから開始コドン配列に対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドまでの配列を用いた。
　Ｈｓｐａ８のプロモーター領域は、ＣＨＯ細胞のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、以下に示すプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）を用いたＰＣＲで増幅し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。クローニングしたチャイニーズハムスターＨｓｐａ８のプロモーター領域のヌクレオチド配列を配列表の配列番号１に示す。
Ｈｓｐａ８プロモーターのプライマーセット
Ｈｓｐａ８－ＮｏｔＩ－Ｆ：ＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＣＧ（配列番号１０）
Ｈｓｐａ８－ＸｂａＩ－Ｒ：ＴＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＡ（配列番号１１）
（実施例２）抗体発現量を指標としたＨｓｐａ８プロモーターの流加培養による評価
２－１）抗体発現ベクターの構築
　ｐＤＳＬＨ４．１（Ｏｋｕｍｕｒａ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｂｉｏｓｃｉ　Ｂｉｏｅｎｇ．，　１２０（３）：３４０－３４６，２０１５参照）をベクター基本骨格として有し、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖遺伝子のプロモーターにＨｓｐａ８を使用し、ＤＮＡエレメントを含まないヒト化抗体遺伝子Ｙ発現ベクターｐＤＳＬＨ３．１－Ｈｓｐａ８－Ｙを構築した。まず、実施例１で増幅、精製したＤＮＡ断片をＮｏｔＩ－ＸｂａＩで消化した後、特許文献４に記載のＨ鎖遺伝子発現ベクターｐＤＳＨ１．１－ｈＥＦ１α－Ｙ、および、Ｌ鎖遺伝子発現ベクターｐＤＳＬ２．１－ｈＥＦ１α－ＹのＮｏｔＩ－ＮｈｅＩサイト間に挿入して、それぞれｐＤＳＨ１．１－Ｈｓｐａ８－Ｙ、ｐＤＳＬ２．１－Ｈｓｐａ８－Ｙを構築した。次に、ｐＤＳＬ２．１－Ｈｓｐａ８－ＹをＡａｔＩＩ－ＭｌｕＩで消化して得られたＤＮＡ断片をｐＤＳＨ１．１－Ｈｓｐａ８－ＹのＡａｔＩＩ－ＭｌｕＩ間に挿入して、ｐＤＳＬＨ３．１－Ｈｓｐａ８－Ｙを構築した。ベクター概略を図１に示す。
２－２）ヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールの作製
　ＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ）を無血清培地を用いた浮遊状態での培養が可能となるように馴化し、宿主細胞ＣＨＯ－Ｏ１細胞を得た。ＣＨＯ－Ｏ１細胞に、（２－１）で構築した抗体発現ベクターｐＤＳＬＨ３．１－Ｈｓｐａ８－Ｙ、特許文献４に記載のｐＤＳＬＨ３．１－ｈＥＦ１α－Ｙを、遺伝子導入装置Ｎｅｏｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて遺伝子導入し、Ｔ－２５フラスコにて５％ＣＯ２、３７℃で培養した。遺伝子導入の１日後にＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を終濃度８００　μｇ／ｍＬで添加し、１週間薬剤選択培養を行った。その後、１２５ｍＬ容三角フラスコにて５％ＣＯ２、３７℃で培養し、ヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールを作製した。
２－３）ヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールの流加培養による抗体生産量評価
　（２－２）で作製したヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールを用いて、１２５ｍＬ容三角フラスコにて流加培養を行った。基礎培地にＧ１３（アイエスジャパン製カスタム培地）、フィード培地にＦ１３（アイエスジャパン製カスタム培地）を用いた。
　生細胞数、抗体生産量の推移を、それぞれ図２Ａ、図２Ｂに示す。培養１４日目のＨｓｐａ８プロモーターでの抗体生産量は、ヒトＥＦ１－αプロモーターの３．９倍の値に達し、現在頻繁に使用されているプロモーターでの抗体生産量を大きく上回った。
（実施例３）流加培養での抗体発現量を指標としたＨｓｐａ８プロモーター長の検討
３－１）抗体発現ベクターの構築
　ヒト化抗体遺伝子Ｙ発現ベクターｐＤＳＬＨ３．１－ｈＥＦ１α－Ｙの、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖遺伝子のプロモーターをＨｓｐａ８プロモーターの部分配列に置換した、ｐＤＳＬＨ３．１－Ｈｓｐａ８－１．９－Ｙ、および、ｐＤＳＬＨ３．１－Ｈｓｐａ８－１．２－Ｙを構築した。それぞれの発現ベクターで、Ｈｓｐａ８の開始コドン配列の上流約１．９、１．２ｋｂｐのヌクレオチドから開始コドン配列に対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドまでの配列を、Ｈｓｐａ８プロモーターの部分配列として用いた。
　ｐＤＳＬＨ３．１－Ｈｓｐａ８－１．９－Ｙは、以下の方法により構築した。まず、ｐＤＳＨ１．１－Ｈｓｐａ８－Ｙをテンプレートとして、以下に示すプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲでチャイニーズハムスターＨｓｐａ８プロモーターの部分配列を増幅し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔで精製した。精製したＤＮＡ断片をＮｏｔＩ－ＸｂａＩで消化した後、Ｈ鎖遺伝子発現ベクターｐＤＳＨ１．１－ｈＥＦ１α－Ｙ、および、Ｌ鎖遺伝子発現ベクターｐＤＳＬ２．１－ｈＥＦ１α－ＹのＮｏｔＩ－ＮｈｅＩサイト間に挿入して、それぞれｐＤＳＨ１．１－Ｈｓｐａ８－１．９－Ｙ、ｐＤＳＬ２．１－Ｈｓｐａ８－１．９－Ｙを構築した。次に、ｐＤＳＬ２．１－Ｈｓｐａ８－１．９－ＹをＡａｔＩＩ－ＭｌｕＩで消化して得られたＤＮＡ断片をｐＤＳＨ１．１－Ｈｓｐａ８－１．９－ＹのＡａｔＩＩ－ＭｌｕＩ間に挿入して、ｐＤＳＬＨ３．１－Ｈｓｐａ８－１．９－Ｙを構築した。同様の方法で、ｐＤＳＬＨ３．１－Ｈｓｐａ８－１．２－Ｙを構築した。
Ｈｓｐａ８プロモーター　１．９ｋｂｐのプライマーセット
Ｈｓｐａ８－ＮｏｔＩ－１９００Ｆ：ＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＡＡＣＣＴＡＡＣＴＡＡＴＡＧＣＴＧＴＣＣ（配列番号１２）
Ｈｓｐａ８－ＸｂａＩ－Ｒ：ＴＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＡ（配列番号１１）
Ｈｓｐａ８プロモーター　１．２ｋｂｐのプライマーセット
Ｈｓｐａ８－ＮｏｔＩ－１２００Ｆ：ＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＣＴＴＣＧＣＧＧＣＣＡＴＴＴＴＧＴＣＣＴＣ（配列番号１３）
Ｈｓｐａ８－ＸｂａＩ－Ｒ：ＴＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＡ（配列番号１１）
３－２）ヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールの作製
　（２－１）および（３－１）で構築した抗体発現ベクターｐＤＳＬＨ３．１－ｈＥＦ１α－Ｙ、ｐＤＳＬＨ３．１－Ｈｓｐａ８－Ｙ、ｐＤＳＬＨ３．１－Ｈｓｐａ８－１．９－Ｙ、あるいは、ｐＤＳＬＨ３．１－Ｈｓｐａ８－１．２－Ｙを、（２－２）に記載の方法でＣＨＯ－Ｏ１細胞にトランスフェクション、薬剤選択培養を行い、ヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールを作製した。
３－３）ヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールの流加培養による抗体生産量評価
　（３－２）で作製したヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールを用いて、１２５ｍＬ容三角フラスコにて流加培養を行った。基礎培地にＧ１３、フィード培地にＦ１３を用いた。
　生細胞数、抗体生産量の推移を、それぞれ図３Ａ、図３Ｂに示す。Ｈｓｐａ８プロモーターの長さを短くしたところ、抗体生産量が上昇し、１．２ｋｂｐのＨｓｐａ８プロモーターでは２．９ｋｂｐの１．３倍の値を示し、コントロールとして用いたヒトＥＦ１－αプロモーターの５．２倍の値に達した。Ｈｓｐａ８プロモーターの長さを最適化することで、そのプロモーター能を強く発揮できるようになり、ヒトＥＦ１－αプロモーターでの抗体生産量を凌駕する結果が得られた。
（実施例４）流加培養での抗体発現量を指標としたＨｓｐａ８プロモーターとＡ７の組み合わせ効果の検討
４－１）抗体発現ベクターの構築
　（３－１）で構築した抗体発現ベクターｐＤＳＬＨ３．１－Ｈｓｐａ８－１．９－Ｙの発現カセット上流に、特許文献３に記載のＤＮＡエレメントＡ７を挿入して、ｐＤＳＬＨＡ４．１－Ｈｓｐａ８－１．９－Ｙを構築した。
４－２）ヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールの作製
　（３－１）で構築したＤＮＡエレメントＡ７を含まない抗体発現ベクターｐＤＳＬＨ３．１－Ｈｓｐａ８－１．９－Ｙ、（４－１）で構築したＤＮＡエレメントＡ７を含む抗体発現ベクターｐＤＳＬＨＡ４．１－Ｈｓｐａ８－１．９－Ｙを、（２－２）に記載の方法でＣＨＯ－Ｏ１細胞にトランスフェクション、薬剤選択培養を行い、ヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールを作製した。
４－３）ヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールの流加培養による抗体生産量評価
　（４－２）で作製したヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールを用いて、１２５ｍＬ容三角フラスコにて流加培養を行った。基礎培地にＧ１３、フィード培地にＦ１３を用いた。
　生細胞数、抗体生産量の推移を、それぞれ図４Ａ、図４Ｂに示す。培養１４日目時点におけるＡ７を含む抗体発現ベクターでの抗体生産量は、Ａ７を含まない抗体発現ベクターの３．４倍の値を示した。ＤＮＡエレメントＡ７とＨｓｐａ８プロモーターを組み合わせて使用することで、相乗効果によって効果的に高生産を実現できることがわかった。
（実施例５）抗体発現量を指標とした、ヒト、マウス、ラットＨｓｐａ８プロモーターの流加培養による評価
５－１）抗体発現ベクターの構築
　ヒト化抗体遺伝子Ｙ発現ベクターｐＤＳＬＨ３．１－ｈＥＦ１α－Ｙの、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖遺伝子のプロモーターをヒト、マウス、ラットＨｓｐａ８プロモーターに置換した、ｐＤＳＬＨ３．１－ｈＨｓｐａ８－Ｙ、ｐＤＳＬＨ３．１－ｍＨｓｐａ８－Ｙ、ｐＤＳＬＨ３．１－ｒＨｓｐａ８－Ｙを構築した。それぞれ、Ｈｓｐａ８の開始コドン配列の上流約２．０ｋｂｐのヌクレオチドから開始コドン配列に対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドまでの配列を、Ｈｓｐａ８プロモーターとして用いた。クローニングしたヒト、マウス、ラットＨｓｐａ８プロモーターのヌクレオチド配列をそれぞれ配列表の配列番号２、３、４に示す。
　ｐＤＳＬＨ３．１－ｈＨｓｐａ８－Ｙは、以下の方法により構築した。まず、ヒトゲノムＤＮＡをテンプレートとして、以下に示すプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲでヒトＨｓｐａ８プロモーターを増幅し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔで精製した。精製したＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩ－ＥｃｏＴ１４ＩあるいはＡａｔＩＩ－ＥｃｏＴ１４Ｉで消化した後、それぞれＨ鎖遺伝子発現ベクターｐＤＳＨ１．１－ｈＥＦ１α－ＹのＨｉｎｄＩＩＩ－ＮｈｅＩ、および、Ｌ鎖遺伝子発現ベクターｐＤＳＬ２．１－ｈＥＦ１α－ＹのＡａｔＩＩ－ＮｈｅＩサイト間に挿入して、それぞれｐＤＳＨ１．１－ｈＨｓｐａ８－Ｙ、ｐＤＳＬ２．１－ｈＨｓｐａ８－Ｙを構築した。次に、ｐＤＳＬ２．１－ｈＨｓｐａ８－ＹをＡａｔＩＩ－ＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られたＤＮＡ断片をｐＤＳＨ１．１－ｈＨｓｐａ８－ＹのＡａｔＩＩ－ＨｉｎｄＩＩＩ間に挿入して、ｐＤＳＬＨ３．１－ｈＨｓｐａ８－Ｙを構築した。同様の方法で、ｐＤＳＬＨ３．１－ｍＨｓｐａ８－Ｙ、ｐＤＳＬＨ３．１－ｒＨｓｐａ８－Ｙを構築した。
Ｈ鎖遺伝子発現ベクター挿入用のヒトＨｓｐａ８プロモーターのプライマーセット
Ｈｓｐａ８－ｈｕｍａｎ－ＨｉｎｄＩＩＩ－Ｆ：ＧＧＴＧＡＡＧＣＴＴＡＴＡＣＡＡＡＣＧＴＴＣＡＧＡＡＡＧＴＣＴＡＡ（配列番号１４）
Ｈｓｐａ８－ｈｕｍａｎ－ＥｃｏＴ１４Ｉ－Ｒ：ＧＧＴＧＣＣＡＴＧＧＧＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＣ（配列番号１５）
Ｌ鎖遺伝子発現ベクター挿入用のヒトＨｓｐａ８プロモーターのプライマーセット
Ｈｓｐａ８－ｈｕｍａｎ－ＡａｔＩＩ－Ｆ：ＧＧＧＴＧＡＣＧＴＣＡＴＡＣＡＡＡＣＧＴＴＣＡＧＡＡＡＧＴＣＴＡＡ（配列番号１６）
Ｈｓｐａ８－ｈｕｍａｎ－ＥｃｏＴ１４Ｉ－Ｒ：ＧＧＴＧＣＣＡＴＧＧＧＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＣ（配列番号１５）
マウスＨｓｐａ８プロモーターのプライマーセット
Ｈｓｐａ８－ｍｏｕｓｅ－ＮｏｔＩ－Ｆ：ＧＧＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＣＣＴＴＣＣＡＡＴＴＴＡＡＡＣＧＣＣＡＣ（配列番号１７）
Ｈｓｐａ８－ｍｏｕｓｅ－ＸｂａＩ－Ｒ：ＧＡＧＧＴＣＴＡＧＡＧＧＴＴＧＣＴＡＴＴＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧ（配列番号１８）
ラットＨｓｐａ８プロモーターのプライマーセット
Ｈｓｐａ８－ｒａｔ－ＮｏｔＩ－Ｆ：ＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＴＴＴＧＡＴＡＧＣＣＴＴＣＣＴＣＡＣＡＴＧ（配列番号１９）
Ｈｓｐａ８－ｒａｔ－ＮｈｅＩ－Ｒ：ＧＧＴＣＧＣＴＡＧＣＧＧＴＴＧＣＴＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２０）
５－２）ヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールの作製
　（２－１）、（３－１）および（５－１）で構築した抗体発現ベクターｐＤＳＬＨ３．１－ｈＥＦ１α－Ｙ、ｐＤＳＬＨ３．１－Ｈｓｐａ８－１．９－Ｙ、ｐＤＳＬＨ３．１－ｈＨｓｐａ８－Ｙ、ｐＤＳＬＨ３．１－ｍＨｓｐａ８－Ｙ、あるいは、ｐＤＳＬＨ３．１－ｒＨｓｐａ８－Ｙを、（２－２）に記載の方法でＣＨＯ－Ｏ１細胞にトランスフェクション、薬剤選択培養を行い、ヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールを作製した。
５－３）ヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールの流加培養による抗体生産量評価
　（５－２）で作製したヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールを用いて、１２５ｍＬ容三角フラスコにて流加培養を行った。基礎培地にＧ１３、フィード培地にＦ１３を用いた。
　生細胞数、抗体生産量の推移を、それぞれ図５Ａ、図５Ｂに示す。培養１４日目のラット、マウス、チャイニーズハムスター、および、ヒトＨｓｐａ８プロモーターでの抗体生産量は、ヒトＥＦ１－αプロモーターのそれぞれ７．０、６．８、４．５、２．１倍の値に達し、どの生物種由来のＨｓｐａ８プロモーターでもヒトＥＦ１－αプロモーターでの抗体生産量を大きく上回った。ラット、および、マウスＨｓｐａ８プロモーターでは、チャイニーズハムスターＨｓｐａ８プロモーターから更なる抗体生産量の上昇が見られ、適切な生物種を選択することによって、そのプロモーター能を強く発揮できることがわかった。
　本発明のプロモーターを用いた外来遺伝子発現ユニット又は本発明の外来遺伝子発現ベクターを哺乳動物宿主細胞へ導入することによって、治療用蛋白質や抗体等の外来遺伝子の生産性を向上させることが可能となる。
配列番号１：チャイニーズハムスター由来Ｈｓｐａ８のプロモーター
配列番号２：ヒト由来Ｈｓｐａ８のプロモーター
配列番号３：マウス由来Ｈｓｐａ８のプロモーター
配列番号４：ラット由来Ｈｓｐａ８のプロモーター
配列番号５：チャイニーズハムスター由来Ｈｓｐａ８のプロモーター　Ｈｓｐａ８の開始コドンの上流約１．９ｋｂｐのヌクレオチドから開始コドンに対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドまでからなるヌクレオチド配列
配列番号６：チャイニーズハムスター由来Ｈｓｐａ８のプロモーター　Ｈｓｐａ８の開始コドンの上流約１．２ｋｂｐのヌクレオチドから開始コドンに対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドまでからなるヌクレオチド配列
配列番号７：ＤＮＡエレメントＡ２のヌクレオチド配列
配列番号８：ＤＮＡエレメントＡ７のヌクレオチド配列
配列番号９：ＤＮＡエレメントＡ１８のヌクレオチド配列
配列番号１０：Ｈｓｐａ８プロモーターのプライマー　Ｈｓｐａ８－ＮｏｔＩ－Ｆ
配列番号１１：Ｈｓｐａ８プロモーターのプライマー　Ｈｓｐａ８－ＸｂａＩ－Ｒ
配列番号１２：Ｈｓｐａ８プロモーター　１．９ｋｂｐのプライマー　Ｈｓｐａ８－ＮｏｔＩ－１９００Ｆ
配列番号１３：Ｈｓｐａ８プロモーター　１．２ｋｂｐのプライマー　Ｈｓｐａ８－ＮｏｔＩ－１２００Ｆ
配列番号１４：ヒトＨｓｐａ８プロモーターのプライマー　Ｈｓｐａ８－ｈｕｍａｎ－ＨｉｎｄＩＩＩ－Ｆ
配列番号１５：ヒトＨｓｐａ８プロモーターのプライマー　Ｈｓｐａ８－ｈｕｍａｎ－ＥｃｏＴ１４Ｉ－Ｒ
配列番号１６：ヒトＨｓｐａ８プロモーターのプライマー　Ｈｓｐａ８－ｈｕｍａｎ－ＡａｔＩＩ－Ｆ
配列番号１７：マウスＨｓｐａ８プロモーターのプライマー　Ｈｓｐａ８－ｍｏｕｓｅ－ＮｏｔＩ－Ｆ
配列番号１８：マウスＨｓｐａ８プロモーターのプライマー　Ｈｓｐａ８－ｍｏｕｓｅ－ＸｂａＩ－Ｒ
配列番号１９：ラットＨｓｐａ８プロモーターのプライマー　Ｈｓｐａ８－ｒａｔ－ＮｏｔＩ－Ｆ
配列番号２０：ラットＨｓｐａ８プロモーターのプライマー　Ｈｓｐａ８－ｒａｔ－ＮｈｅＩ－Ｒ

Claims (22)

  1. 　チャイニーズハムスター由来Ｈｓｐａ８遺伝子のプロモーターであって、配列番号６に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、配列番号１に記載のヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列の部分配列からなるポリヌクレオチド。
  2. 　配列番号１に記載のヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 　配列番号５に記載のヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  4. 　配列番号６に記載のヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  5. 　ヒト由来Ｈｓｐａ８遺伝子のプロモーターである、配列表の配列番号２に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
  6. 　マウス由来Ｈｓｐａ８遺伝子のプロモーターである、配列表の配列番号３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
  7. 　ラット由来Ｈｓｐａ８遺伝子のプロモーターである、配列表の配列番号４に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
  8. 　請求項１乃至７のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列に対して９５％以上同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
  9. 　請求項１乃至７のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列に対して９９％以上同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
  10. 　請求項１乃至９のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
  11. 　請求項１乃至１０のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含むことからなる、外来遺伝子発現ユニット。
  12. 　外来遺伝子が多量体蛋白質をコードする遺伝子である、請求項１１に記載の外来遺伝子発現ユニット。
  13. 　外来遺伝子がヘテロ多量体蛋白質をコードする遺伝子である、請求項１１に記載の外来遺伝子発現ユニット。
  14. 　外来遺伝子が抗体又はその抗原結合性断片をコードする遺伝子である、請求項１１に記載の外来遺伝子発現ユニット。
  15. 　請求項１１乃至１４のいずれか一つに記載の外来遺伝子発現ユニットを含む外来遺伝子発現ベクター。
  16. 　請求項１１乃至１４のいずれか一つに記載の外来遺伝子発現ユニット及び下記Ａ群の（ａ）乃至（ｅ）に記載のポリヌクレオチドから選択されるいずれか一つ又は複数のポリヌクレオチドを含む外来遺伝子発現ベクター；
    Ａ群
    （ａ）配列表の配列番号７に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
    （ｂ）配列表の配列番号８に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
    （ｃ）配列表の配列番号９に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
    （ｄ）前記（ａ）乃至（ｃ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列に対して９５％以上同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、外来遺伝子発現亢進活性を有するポリヌクレオチド、
    （e）上記（ａ）乃至（ｃ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列に対して９９％以上同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、外来遺伝子発現亢進活性を有するポリヌクレオチド。
  17. 　請求項１５又は１６に記載の外来遺伝子発現ベクターが導入された形質転換細胞。
  18. 　細胞が哺乳動物由来の培養細胞である、請求項１７に記載の形質転換細胞。
  19. 　哺乳動物由来の培養細胞が、ＣＯＳ－１細胞、２９３細胞、又はＣＨＯ細胞である、請求項１８に記載の形質転換細胞。
  20. 　請求項１７乃至１９のいずれか一つに記載の形質転換細胞を培養し、培養物から外来遺伝子由来の蛋白質を取得することを特徴とする、該蛋白質の製造方法。
  21. 　形質転換細胞において外来遺伝子を発現させることを目的とする、請求項１乃至１０のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの使用。
  22. 　形質転換細胞において外来遺伝子を発現させることを目的とする、請求項１５又は１６に記載の外来遺伝子発現ベクターの使用。
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