CN109790539A - Hspa5基因的启动子 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种在诸如源自哺乳动物的培养的细胞的宿主细胞中增强充当基于蛋白质的药物产品的异种蛋白的生产的方法。本发明提供了具有新Hspa5基因启动子的转化的细胞，以及使用转化的宿主细胞以高水平分泌和生产异种蛋白的方法。

Description

Hspa5基因的启动子
技术领域
本发明涉及使用哺乳动物细胞生产异种蛋白的方法，所述哺乳动物细胞是通过用具有Hspa5基因启动子的外源基因表达载体转染哺乳动物宿主细胞而构建的。
背景技术
基因重组技术的发展已迅速扩大了基于蛋白质的药物产品如治疗用蛋白质和抗体药物的市场。其中，抗体药物当施用于人体时不引起不利的免疫反应，并且由于它们的高特异性而正在积极开发。
生产以抗体药物为代表的基于蛋白质的药物产品的宿主的实例可包括微生物、酵母、昆虫、动物和植物细胞，以及转基因动物和植物。翻译后修饰如折叠或糖链修饰对于基于蛋白质的药物产品的生理活性或抗原性是必不可少的。因此，不能进行复杂的翻译后修饰的微生物，或与人在糖链结构方面显著不同的植物不适合作为宿主。培养的哺乳动物细胞，例如CHO（中国仓鼠卵巢）细胞，由于具有与人相似的糖链结构并允许翻译后修饰且进一步考虑到安全性，目前是主流。
与微生物等相比，使用培养的哺乳动物细胞作为宿主产生了诸如低生长速率、低生产力和高成本的问题（非专利文献1）。此外，基于蛋白质的药物产品的临床利用需要以大剂量施用药物产品。因此，缺乏足够的其生产能力已成为全球性问题。在培养的哺乳动物细胞表达系统中生产基于蛋白质的药物产品的情况下，已尝试通过改进每个生产步骤来降低生产成本，这是因为生产成本高于合成低分子量药物产品的生产成本。然而，增加培养的哺乳动物细胞表达系统中生产的蛋白质的量也是用于降低生产成本的有前途的方法（非专利文献2和3）。因此，为了提高培养的哺乳动物细胞中外源基因的生产力，迄今已通过尝试与错误实施了许多方法，例如启动子、增强子、药物选择标记、基因扩增和培养工程方法。在使用CHO细胞作为宿主细胞的情况下，通常使用源自病毒的人巨细胞病毒主要立即早期启动子（下文称为CMV启动子）来表达外源基因，即，基于蛋白质的药物产品的生产（非专利文献4，5和6）。还已知在延伸因子-1α（EF-1α）（专利文献1和非专利文献7）或人核糖体蛋白RPL32或RPS11的基因的转录起始位点上游的多核苷酸（启动子区域）可以单独地或与另外的异源启动子组合用于CHO细胞中的蛋白质表达（非专利文献8和专利文献2）。然而，这些启动子响应于充当宿主的培养的哺乳动物细胞的细胞内生理条件调节其下游外源基因的表达，并且经常在培养的哺乳动物细胞活跃增殖的对数生长期中表现出最大活性。因此，这种启动子的活性经常在细胞密度达到其最大水平后的稳定期减弱。因此，需要开发一种启动子，该启动子允许在培养的哺乳动物细胞的整个培养期期间外源基因的强表达。
引用列表
专利文献
专利文献1：日本专利第3051411号
专利文献2：WO2013/080934
[非专利文献]
非专利文献1：Florian M. Wurm., Nat. Biotechnol. 22 (11): 1393-1398, 2004
非专利文献2：Farid SS., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 848(1): 8-18, 2007
非专利文献3：Werner RG. Economic aspects of commercial manufacture ofbiopharmaceuticals. J Biotechnol. 113 (1-3): 171-182, 2004
非专利文献4：Durocher Y等人, Curr Opin Biotechnol. 20 (6): 700-707, 2009
非专利文献5：Boshart M等人, Cell. 41 (2): 521-530, 1985
非专利文献6：Foecking MK等人, Gene. 45 (1): 101-105, 1986
非专利文献7：Deer JR.和Allison DS., Biotechnol. Prog. 20: 880-889, 2004
非专利文献8：Hoeksema F.等人, Biotechnology Research International, 2011卷, Article ID 492875, 11页
非专利文献9：Okumura T等人, J Biosci Bioeng., 120 (3): 340-346, 2015
非专利文献10：Langmead B等人, Genome Biology. 10: 1186, 2009
非专利文献11：Mortazavi A等人, Nature Methods. 5: 621-628, 2008
发明概述
技术问题
本发明的目的是提供一种提高使用在宿主细胞如培养的哺乳动物细胞中具有高外源基因表达增强活性的启动子生产的异种蛋白的量的方法，该异种蛋白充当基于蛋白质的药物产品。如果发现了在CHO细胞等中具有可与人EF-1α启动子相匹敌或更高的启动子活性且保持其高启动子活性达从培养的哺乳动物细胞的对数生长期到稳定期的长时间段的启动子，则可以提供在哺乳动物细胞中实现外源基因的稳定和高表达的方法。因此，可以提供一种方法，其有助于增加在培养的哺乳动物细胞表达系统中生产的基于蛋白质的药物产品的量，即，降低生产成本。
问题的解决方案
本发明人已进行了目的在于实现上述目的的深入细致的研究。结果，发明人已发现热激蛋白A5（Hspa5/GRP78）基因起始密码子上游约3 kbp的多核苷酸具有优良的启动子活性，并且能够显著提高要在培养的哺乳动物细胞中表达的异种蛋白的生产力，从而完成了本发明。具体而言，本发明包括本发明的以下方面。
（1）由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或该核苷酸序列的部分序列组成的多核苷酸，该多核苷酸是中国仓鼠来源的Hspa5基因启动子，并且包含由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列组成的多核苷酸。
（2）根据上述（1）的多核苷酸，其由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列组成。
（3）根据上述（1）的多核苷酸，其由SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列组成。
（4）根据上述（1）的多核苷酸，其由SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列组成。
（5）根据上述（1）的多核苷酸，其由SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列组成。
（6）根据上述（1）的多核苷酸，其由SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列组成。
（7）根据上述（1）的多核苷酸，其由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列组成。
（8）由序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，该多核苷酸是人来源的Hspa5基因启动子。
（9）由序列表中SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，该多核苷酸是小鼠来源的Hspa5基因启动子。
（10）由序列表中SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，该多核苷酸是大鼠来源的Hspa5基因启动子。
（11）一种多核苷酸，其由与根据上述（1）-（10）中任一项的核苷酸序列具有95％或更高同一性的核苷酸序列组成，所述多核苷酸具有启动子活性。
（12）一种多核苷酸，其由与根据上述（1）-（10）中任一项的核苷酸序列具有99％或更高同一性的核苷酸序列组成，所述多核苷酸具有启动子活性。
（13）一种多核苷酸，其在严格条件下与由与根据上述（1）-（12）中任一项的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，该多核苷酸具有启动子活性。
（14）外源基因表达单位，其包含根据上述（1）-（13）中任一项的多核苷酸。
（15）根据上述（14）的外源基因表达单位，其中，所述外源基因是编码多聚体蛋白质的基因。
（16）根据上述（14）的外源基因表达单位，其中，所述外源基因是编码异源多聚蛋白质的基因。
（17）根据上述（14）的外源基因表达单位，其中，所述外源基因是编码抗体或其抗原结合片段的基因。
（18）一种外源基因表达载体，其包含根据上述（14）-（17）中任一项的外源基因表达单位。
（19）一种外源基因表达载体，其包含根据上述（14）-（17）中任一项的外源基因表达单位和选自下述A组的多核苷酸（a）-（e）的任意一种或多种多核苷酸：
A组
（a）由序列表中SEQ ID NO：35所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，
（b）由序列表中SEQ ID NO：36所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，
（c）由序列表中SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，
（d）由与多核苷酸（a）-（c）中任一种的核苷酸序列具有95％或更高同一性的核苷酸序列组成的多核苷酸，该多核苷酸具有外源基因表达增强活性，和
（e）由与多核苷酸（a）-（c）中任一种的核苷酸序列具有99％或更高同一性的核苷酸序列组成的多核苷酸，该多核苷酸具有外源基因表达增强活性。
（20）转化的细胞，已向其中引入了根据上述（18）或（19）的外源基因表达载体。
（21）根据上述（20）的转化的细胞，其中，所述细胞是来源于哺乳动物的培养的细胞。
（22）根据上述（21）的转化的细胞，其中，所述来源于哺乳动物的培养的细胞是COS-1细胞、293细胞或CHO细胞。
（23）一种生产外源基因衍生的蛋白质的方法，包括培养根据上述（20）-（22）中任一项的转化的细胞，和从培养物中获得外源基因衍生的蛋白质。
（24）根据上述（1）-（13）中任一项的多核苷酸为了在转化的细胞中表达外源基因的用途。
（25）根据上述（18）或（19）的外源基因表达载体为了在转化的细胞中表达外源基因的用途。
本发明的有利效果
根据本发明的用于生产外源基因的方法能够显著提高外源基因如编码治疗用蛋白质或抗体的外源基因的表达。此外，本发明的启动子与DNA元件的组合可以进一步增强编码治疗用蛋白质、抗体等的外源基因的表达。
附图简述
[图1A]显示了使用1 L瓶（jar）的人源化抗体X-表达性细胞系X＃1和X＃2的补料分批培养的结果。图1A显示了活细胞数目的时间依赖性变化。
[图1B]显示了使用1 L瓶的人源化抗体X-表达性细胞系X＃1和X＃2的补料分批培养的结果。图1B显示了生产的抗体量的时间依赖性变化。
[图2A]显示了在补料分批培养中取样的每一天的每个基因的表达水平。图2A显示了关于瓶＃1的结果。绘制了在瓶＃1中第4天的细胞中具有最高表达水平的最前面20个基因。
[图2B]显示了在补料分批培养中取样的每一天的每个基因的表达水平。图2B显示了关于瓶＃2的结果。绘制了在瓶＃1中第4天的细胞中具有最高表达水平的最前面20个基因。
[图2C]显示了在补料分批培养中取样的每一天的每个基因的表达水平。图2C显示了关于瓶＃3的结果。绘制了在瓶＃1中第4天的细胞中具有最高表达水平的最前面20个基因。
[图3]图3显示通过用具有每个启动子的插入的萤火虫萤光素酶表达载体转染细胞并通过海肾（Renilla）萤光素酶值（Rluc）归一化萤火虫萤光素酶值（luc2）而获得的值。
[图4]图4示意性地显示含有Hspa5基因、人RPS7基因或人EF1-α基因来源的启动子作为抗体H链和L链基因表达的启动子的人源化抗体基因Y表达载体pDSLHA4.1-Hspa5-Y、pDSLHA4.1-hRPS7-Y和pDSLHA4.1-hEF1α-Y。
[图5A]在Hspa5基因启动子下的表达和在人RPS7基因启动子或人EF1-α基因启动子下的表达之间比较使用表达人源化抗体Y的稳定库的补料分批培养中生产的抗体的量。图5A显示了取样的每一天时的活细胞数目。
[图5B]在Hspa5基因启动子下的表达和在人RPS7基因启动子或人EF1-α基因启动子下的表达之间比较使用表达人源化抗体Y的稳定库的补料分批培养中生产的抗体的量。图5B显示了取样的每一天时生产的抗体量。
[图5C]在Hspa5基因启动子下的表达和在人RPS7基因启动子或人EF1-α基因启动子下的表达之间比较使用表达人源化抗体Y的稳定库的补料分批培养中生产的抗体的量。图5C显示了取样的每一天时每个细胞和每天生产的抗体量。
[图6]图6显示在Hspa5基因启动子、人RPS7基因启动子和人EF1-α基因启动子之间比较使用表达人源化抗体Y的稳定库的补料分批培养中H链基因的时间依赖性相对表达水平的结果。
[图7A]在Hspa5基因启动子（3 kbp）下的表达和在人RPS7基因启动子和人EF1-α基因启动子下的表达之间比较使用表达海肾萤光素酶（Rluc）的稳定库的补料分批培养中生产的海肾萤光素酶的量。图7A显示了取样的每一天时的活细胞数目。
[图7B]在Hspa5基因启动子（3 kbp）下的表达和在人RPS7基因启动子和人EF1-α基因启动子下的表达之间比较使用表达海肾萤光素酶（Rluc）的稳定库的补料分批培养中生产的海肾萤光素酶的量。图7B显示了取样的每一天时每103细胞的海肾萤光素酶的发光量。
[图8A]将使用每个启动子长度的Hspa5基因启动子产生的表达人源化抗体Y的稳定库的补料分批培养中生产的抗体的量与对于人RPS7基因启动子和人EF1-α基因启动子的进行了比较。图8A显示了取样的每一天时的活细胞数目。
[图8B]将使用每个启动子长度的Hspa5基因启动子产生的表达人源化抗体Y的稳定库的补料分批培养中生产的抗体的量与对于人RPS7基因启动子和人EF1-α基因启动子的进行了比较。图8B显示了取样的每一天时生产的抗体量。
[图8C]将使用每个启动子长度的Hspa5基因启动子产生的表达人源化抗体Y的稳定库的补料分批培养中生产的抗体的量与对于人RPS7基因启动子和人EF1-α基因启动子的进行了比较。图8C显示了取样的每一天时每个细胞和每天生产的抗体量。
[图9A]显示了评价在使用Hspa5基因启动子（0.6 kbp）获得的表达人源化抗体Y的单克隆的补料分批培养中生产的抗体量的结果。图9A显示了取样的每一天时的活细胞数目。
[图9B]显示了评价在使用Hspa5基因启动子（0.6 kbp）获得的表达人源化抗体Y的单克隆的补料分批培养中生产的抗体量的结果。图9B显示了取样的每一天时生产的抗体量。
[图9C]显示了评价在使用Hspa5基因启动子（0.6 kbp）获得的表达人源化抗体Y的单克隆的补料分批培养中生产的抗体量的结果。图9C显示了取样的每一天时每个细胞和每天生产的抗体量。
[图10A]在Hspa5基因启动子来源的物种之间，比较使用Hspa5基因启动子产生的表达人源化抗体Y的稳定库的补料分批培养中生产的抗体的量。图10A显示了取样的每一天时的活细胞数目。ch 1.1kb和ch 0.6kb描绘了来自分别使用中国仓鼠Hspa5基因启动子的1.1 kbp和0.6 kbp部分序列作为用于抗体表达的启动子获得的稳定库的补料分批培养的结果。
[图10B]在Hspa5基因启动子来源的物种之间，比较使用Hspa5基因启动子产生的表达人源化抗体Y的稳定库的补料分批培养中生产的抗体的量。图10B显示了取样的每一天时生产的抗体量。ch 1.1kb和ch 0.6kb描绘了来自分别使用中国仓鼠Hspa5基因启动子的1.1 kbp和0.6 kbp部分序列作为用于抗体表达的启动子获得的稳定库的补料分批培养的结果。
[图10C]在Hspa5基因启动子来源的物种之间，比较使用Hspa5基因启动子产生的表达人源化抗体Y的稳定库的补料分批培养中生产的抗体的量。图10C显示了取样的每一天时每个细胞和每天生产的抗体量。ch 1.1kb和ch 0.6kb描绘了来自分别使用中国仓鼠Hspa5基因启动子的1.1 kbp和0.6 kbp部分序列作为用于抗体表达的启动子获得的稳定库的补料分批培养的结果。
[图11A]在DNA元件A7的存在和不存在之间比较在使用含有或不含有DNA元件A7的人源化抗体Y表达载体产生的稳定库的补料分批培养中生产的抗体量。图11A显示了取样的每一天时的活细胞数目。
[图11B]在DNA元件A7的存在和不存在之间比较在使用含有或不含有DNA元件A7的人源化抗体Y表达载体产生的稳定库的补料分批培养中生产的抗体量。图11B显示了取样的每一天时生产的抗体量。
[图11C]在DNA元件A7的存在和不存在之间比较在使用含有或不含有DNA元件A7的人源化抗体Y表达载体产生的稳定库的补料分批培养中生产的抗体量。图11C显示了取样的每一天时每个细胞和每天生产的抗体量。
[图12A]图12A显示多核苷酸的核苷酸序列，其是中国仓鼠来源的Hspa5基因启动子（下转图12B）。
[图12B]图12B显示多核苷酸的核苷酸序列，其是中国仓鼠Hspa5基因启动子。
[图13]图13显示多核苷酸的核苷酸序列，其是人来源的Hspa5基因启动子。
[图14]图14显示多核苷酸的核苷酸序列，其是小鼠来源的Hspa5基因启动子。
[图15]图15显示多核苷酸的核苷酸序列，其是大鼠来源的Hspa5基因启动子。
实施方案描述
在下文中，将具体描述本发明。
在本说明书中，术语“基因”是指转录成mRNA并翻译成蛋白质的部分，并且用于不仅包括DNA而且包括其mRNA和cDNA及其RNA。
在本说明书中，术语“多核苷酸”用于具有与核酸的含义相同的含义，并且包括DNA、RNA、探针、寡核苷酸和引物。
在本说明书中，在不与术语“蛋白质”区别开的情况下使用术语“多肽”。
在本说明书中，术语“基因表达”是指基因转录成mRNA的现象，和/或mRNA翻译成蛋白质的现象。
在本说明书中，术语“外源基因”是指人工引入宿主细胞的基因。
在本说明书中，术语“异种蛋白”是指由外源基因编码的蛋白质。
在本说明书中，术语“基因表达单位”是指在转录的读框方向上具有至少启动子区域、外源基因和转录终止子区域（聚腺苷酸（polyA）添加信号）的多核苷酸。
在本说明书中，术语“启动子”是指与DNA转录开始转录成RNA有关的转录因子结合的区域。在本说明书中，还使用术语“启动子区域”。启动子的实例可包括从起始密码子上游约3 kbp的核苷酸到紧接地对应于起始密码子的核苷酸序列上游的核苷酸的多核苷酸。启动子可含有5'UTR和内含子。
在本说明书中，术语“启动子活性”是指转录通过转录因子与启动子的结合开始以执行由基因编码的蛋白质的生产的活性。可以通过使用由报道基因编码的蛋白质（例如萤火虫萤光素酶）的活性作为指示物来检查启动子活性。
在本说明书中，短语“具有启动子活性”是指在类似于在下面提及的（实施例5）中描述的补料分批培养中以抗体表达水平作为指示物评价启动子活性的那些的条件下，表现出等于或高于人EF-1α基因启动子的抗体表达水平的抗体表达水平。
在本说明书中，术语“DNA元件”是指当位于基因表达单位附近或位于包含基因表达单位的外源基因表达载体中时具有外源基因表达增强活性的多核苷酸。
在本说明书中，术语“抗体的抗原结合片段”是指对抗原具有结合活性的抗体的部分片段。其实例包括Fab和F（ab'）2 ，尽管抗原结合片段不限于这些分子，只要其具有抗原结合能力。
在本说明书中，术语“同一性”是指关于两个或更多个核苷酸序列或氨基酸序列的序列之间的关系，并且通过序列比较来确定，如本领域已知的。在一些情况下，当依赖于连续的两个或更多个核苷酸序列之间或两个或更多个氨基酸序列之间的一致确定时，本领域中的术语“同一性”还意指核酸分子之间或多肽之间的序列相关程度。术语“同一性”可以通过计算由特定数学模型或计算机程序（即，“算法”）处理的两个或更多个序列的较小序列和缺口比对（如果存在的话）之间的百分比同一性来评价。具体地，可以使用由欧洲分子生物学实验室-欧洲生物信息学研究所（European Molecular Biology Laboratory-EuropeanBioinformatics Institute）（EMBL-EBI）提供的诸如ClustalW2的软件来评价同一性，尽管评价方法不限于此，只要所述方法由本领域技术人员使用。
在本说明书中，短语“在严格条件下杂交”是指在形成所谓的特异性杂交体而不形成非特异性杂交体的条件下杂交。其实例可包括这样的条件，在所述条件下由与核酸具有80％或更高、优选90％或更高、更优选95％或更高、最优选99％或更高的同一性的核苷酸序列组成的核酸的互补链杂交，而由具有较低同一性的核苷酸序列组成的核酸的互补链不杂交。更具体地，该短语用于表示杂交在商业上可获得的杂交溶液ExpressHyb杂交溶液（由Clontech制造）中于68℃进行，或杂交在这样的条件或与其相当的条件下进行，其中使用DNA固定化的过滤器在0.7-1.0 M NaCl存在的情况下于68℃进行杂交，然后于68℃用0.1×-2×SSC溶液（其中1×SSC由150 mM NaCl和15 mM柠檬酸钠组成）洗涤生成物。
1.用于增强外源基因表达的启动子
根据本发明的用于生产外源基因衍生的蛋白质的方法的外源启动子是热激蛋白A5基因（以下称为“Hspa5”）的启动子。启动子没有特别限制，只要启动子是具有作为Hspa5启动子的活性的多核苷酸。Hspa5启动子优选是从起始密码子上游约3 kbp的核苷酸到紧接地对应于起始密码子的核苷酸序列上游的核苷酸的多核苷酸。
Hspa5启动子的来源没有特别限制，且可以是哺乳动物来源。其实例可包括中国仓鼠、人、小鼠和大鼠来源的Hspa5启动子。
根据本发明的用于生产外源基因衍生的蛋白质的方法的启动子优选是中国仓鼠Hspa5启动子，更优选是序列表和图12中SEQ ID NO：1所示的多核苷酸。SEQ ID NO：1的核苷酸序列是从中国仓鼠来源的Hspa5的起始密码子上游约3 kbp的核苷酸到紧接地对应于起始密码子的核苷酸序列上游的核苷酸的序列。SEQ ID NOs：2、3和4的核苷酸序列是分别从人来源的Hspa5、小鼠来源的Hspa5和大鼠来源的Hspa5的起始密码子上游约1 kbp的核苷酸到紧接地对应于起始密码子的核苷酸序列上游的核苷酸的序列。SEQ ID NOs：2、3和4的核苷酸序列也分别显示在图13、14和15中。
中国仓鼠来源的Hspa5启动子可以具有由SEQ ID NO：1中所示序列的部分序列组成的核苷酸序列。其实例包括包含SEQ ID NOs：5、6、7、8和9中所示序列的多核苷酸，其是分别从Hspa5的起始密码子上游约2.5、2.0、1.5、1.1和0.6 kbp的核苷酸到紧接地对应于起始密码子的核苷酸序列上游的核苷酸的序列。优选SEQ ID NOs：7、8和9中所示的多核苷酸，且更优选SEQ ID NOs：8和9中所示的多核苷酸。
根据本发明的用于生产外源基因衍生的蛋白质的方法的启动子可以是由与SEQID NOs：1-9中任一种所示的核苷酸序列具有80％或更高、优选90％或更高、更优选95％或更高、最优选99％或更高的同一性的核苷酸序列组成，并具有启动子活性的多核苷酸。
根据本发明的用于生产外源基因衍生的蛋白质的方法的启动子可以是在严格条件下与由与由选自SEQ ID NOs：1-9所示的核苷酸序列的任一种核苷酸序列组成的多核苷酸互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，并具有启动子活性的多核苷酸。
根据本发明的用于生产外源基因衍生的蛋白质的方法的启动子可以是由在选自SEQ ID NOs：1-9所示的核苷酸序列的任何一种核苷酸序列中包含一个或多个、优选1-300个、更优选1-30个核苷酸的缺失、取代和/或添加的核苷酸序列组成，并具有启动子活性的的突变型多核苷酸。
向核苷酸序列中引入突变（缺失、取代和/或添加）可以通过本领域已知的方法进行，例如Kunkel法或缺口双链体方法，或与其相当的方法。例如，可以使用利用定点诱变的突变引入试剂盒（例如，Mutant-K（由Takara Bio Inc.制造）或Mutant-G（由Takara BioInc.制造））或来自Takara Bio Inc.的LA PCR 体外诱变系列试剂盒。这种突变型多核苷酸也可用作本发明的启动子。
本发明的启动子所具有的外源基因表达增强活性可以通过使用由报道基因编码的蛋白质（例如萤火虫萤光素酶）的活性或在补料分批培养中生产的抗体的量作为指示物来检查。当与使用人EF-1α启动子相比，通过使用本发明的启动子，在补料分批培养中生产的抗体的量相等或更高、优选为1.2倍或更多倍、更优选为1.5倍或更多倍时，可以确定这个启动子具有外源基因表达增强活性。即使在约1.2倍或更多倍的提高的情况下，也预期细胞培养规模、培养时间和纯化步骤数目的减少。结果，达到了得率的提高和培养成本的降低。提高的得率允许作为药物的异种蛋白的稳定供应。同样，降低的培养成本导致作为药物的异种蛋白的主要成本降低。
2.外源基因表达单位
根据本发明的用于生产外源基因衍生的蛋白质的方法的外源基因表达单位（下文也称为“本发明的基因表达单位”）在转录的读框方向上具有至少在前面部分1中描述的本发明的启动子、外源基因和转录终止子区域（聚腺苷酸添加信号）。
聚腺苷酸添加序列可以是具有终止从启动子转录的活性的任何序列，并且可以衍生自与启动子基因相同或不同的基因。
3.用于增强外源基因表达的DNA元件
前面部分2中描述的本发明的基因表达单位与DNA元件的组合使用可以进一步增强外源基因的表达。用于组合使用的DNA元件可以通过与作为指示物的乙酰化组蛋白H3相互作用获得。一般来说，组蛋白（H3，H4）的乙酰化据报道基于两种主要假说与转录的激活有关：涉及核小体的构象变化，从而使得组蛋白尾乙酰化中和其电荷以松开DNA与组蛋白之间的结合（Mellor J.（2006）Dynamic nucleosomes and gene transcription. Trends Genet.22 (6): 320-329）；和乙酰化与各种转录因子的募集有关（Nakatani Y.（2001）Histoneacetylases - versatile players. Genes Cells. 6 (2): 79-86）。这两种假说都强烈提示组蛋白的乙酰化与转录激活有关。因此，使用抗乙酰化组蛋白H3抗体的染色质免疫沉淀法（ChIP）能够富集样品的与乙酰化组蛋白H3相互作用的DNA元件。
用于与本发明的启动子组合增强外源基因表达的DNA元件的实例可包括A2、A7和A18。
A2位于人染色体15的80966429至80974878的位点，并且是具有62.2％的AT含量的8450 bp多核苷酸。A2的核苷酸序列显示在序列表中的SEQ ID NO：35中。
A7位于人染色体11的88992123至89000542的位点，并且是具有64.52％的AT含量的8420 bp多核苷酸。A7的核苷酸序列显示在序列表中的SEQ ID NO：36中。
A18位于人染色体4的111275976至111284450的位点，并且是具有62.54％的AT含量的8475 bp多核苷酸。A18的核苷酸序列显示在序列表中的SEQ ID NO：37中。
用于与本发明的启动子组合使用的DNA元件所具有的外源基因表达增强活性可以通过使用由报道基因编码的蛋白质（例如SEAP）的活性作为指示物来检查。
对于与本发明的启动子的组合使用，可以单独使用上述任何一种DNA元件，或者可以使用一种DNA元件的两个或更多个拷贝。或者，可以组合使用两种或更多种DNA元件。
用于本发明的DNA元件可以由与SEQ ID NO：35-37中任一个所示的核苷酸序列具有80％或更高、优选90％或更高、更优选95％或更高、最优选99％或更高同一性，且具有外源基因表达增强活性的核苷酸序列组成。核苷酸序列的同源性搜索可以使用例如诸如FASTA或BLAST的程序和作为搜索对象的日本的DNA数据库来进行。
本领域技术人员可参考Molecular Cloning（Sambrook，J.等人，MolecularCloning: a Laboratory Manual 第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，10Skyline Drive Plainview，NY（1989））等获得本发明启动子的这种同源基因。同样，上述核苷酸序列的同一性可通过FASTA搜索或BLAST搜索确定。
向多核苷酸中引入突变（缺失、取代和/或添加）可以通过本领域已知的方法进行，例如Kunkel法或缺口双链体方法，或与其相当的方法。例如，可以使用突变引入试剂盒（例如，Mutant-K（由Takara Bio Inc.制造）或Mutant-G（由Takara Bio Inc.制造）或来自Takara Bio Inc.的LA PCR 体外诱变系列试剂盒，其利用定点诱变。这种突变型多核苷酸也可用作本发明的DNA元件。
4.获得多核苷酸
在本发明中，包含编码异种蛋白的外源基因的多核苷酸可以通过下面给出的一般方法获得，所述异种蛋白的生产将如下面提到的提高。例如，可以通过使用基于基因片段合成的DNA探针筛选衍生自表达外源基因的细胞或组织的cDNA文库来分离多核苷酸。mRNA可以通过本领域常用的方法制备。例如，用胍试剂、酚试剂等处理细胞或组织以获得总RNA。然后，通过亲和柱法，使用寡脱氧胸苷酸纤维素柱、以琼脂糖凝胶2B作为载体的聚尿甘酸-琼脂糖凝胶等，或通过分批方法，从中获得聚腺苷酸化RNA（mRNA）。可以通过蔗糖密度梯度离心法等进一步分级分离聚腺苷酸化RNA。接着，使用寡脱氧胸苷酸引物和逆转录酶，以获得的mRNA作为模板合成单链cDNA。使用DNA合成酶I、DNA连接酶和RNA酶H等从单链cDNA合成双链cDNA。合成的双链cDNA用T4 DNA合成酶平端化，然后经受衔接子（例如，EcoRI衔接子）的连接、磷酸化等，且并入λ噬菌体如λgt11用于体内包装以制备cDNA文库。或者，可以使用质粒载体而不是λ噬菌体来制备cDNA文库。然后，可以从cDNA文库中选择具有目的DNA的克隆（阳性克隆）。
在从基因组DNA分离包含启动子和终止子区域的多核苷酸、DNA元件或包含用于蛋白质生产的外源基因的多核苷酸的情况下，根据一般方法（Molecular Cloning（1989）和Methods in Enzymology 194（1991））从充当来源的生物的细胞系中提取基因组DNA，后面是多核苷酸选择。基因组DNA的提取可以根据例如Cryer等人的方法（Methods in CellBiology, 12, 39-44 (1975)）和P. Philippsen等人的方法（Methods Enzymol., 194,169-182 (1991)）进行。
获得包含启动子、DNA元件或外源基因的目标多核苷酸也可以通过例如PCR（PCRTechnology. Henry A. Erlich, Atockton press (1989)）进行。通过PCR扩增多核苷酸使用20-30聚体合成的单链DNA作为引物和基因组DNA作为模板。在确认其多核苷酸序列后使用扩增的基因。诸如细菌人工染色体（BAC）文库的基因组DNA文库可以用作PCR的模板。
另一方面，通过（a）根据一般方法制备基因文库，（b）从制备的基因文库选择所期望的多核苷酸，并扩增多核苷酸，可以获得包含具有未知序列的外源基因的多核苷酸。基因文库可以通过下述制备：用适当的限制酶部分消化通过一般方法从充当来源的生物的细胞系获得的染色体DNA以制备片段，将获得的片段连接到合适的载体，并将所述载体引入到合适的宿主中。或者，可以通过从细胞中提取mRNA，从中合成cDNA，然后将cDNA连接到合适的载体上，并将所述载体引入合适的宿主中来制备基因文库。在这方面，可以使用已知为众所周知的用于基因文库制备的载体的质粒作为载体，并且还可以广泛使用噬菌体载体或粘粒等。可以根据载体的类型使用待转化或转导的宿主。使用包含外源基因独特的序列的标记的探针，通过集落杂交、噬菌斑杂交等从基因文库中选择包含外源基因的多核苷酸。
包含外源基因的多核苷酸也可以完全化学合成。该基因可以通过下述合成，例如，制备两对互补寡核苷酸并使其退火的方法，使用DNA连接酶连接几个退火的DNA的方法，或制备几个部分互补的寡核苷酸并通过PCR填补其中的缺口的方法。
多核苷酸序列可以通过通常的方法测定，例如，双脱氧法（Sanger等人，Proc.Natl. Acad. Sci. USA，74, 5463-5467（1977））。或者，可以使用商业上可获得的测序试剂盒等容易地测定多核苷酸序列。
5.外源基因表达载体
包含前面部分2中描述的外源基因表达单位的载体作为根据本发明的用于生产外源基因衍生的蛋白质的方法的外源基因表达载体提供，所述外源基因表达单位包含前面部分1中描述的启动子。根据本发明的用于生产外源基因衍生的蛋白质的方法的外源基因表达载体可以包含前面部分3中描述的DNA元件之一、一种DNA元件的两个或更多个拷贝或两种或更多种DNA元件的组合。当使用外源基因表达载体在宿主细胞中表达外源基因时，DNA元件可以紧接地位于基因表达单位之前或紧接地位于其之后，或者可以位于远离基因表达单位的位置。或者，可以使用一种包含多种DNA元件的外源基因表达载体。DNA元件的取向可以是相对于基因表达单位的正向或反向。
外源基因的实例可包括，但不特别限于：报道基因，例如分泌性碱性磷酸酶（SEAP）基因、绿色荧光蛋白（GFP）基因和萤光素酶基因；各种酶基因，如α- 淀粉酶基因和α- 半乳糖苷酶基因；各种干扰素的基因，如干扰素α和干扰素γ，它们是药学上有用的生理活性蛋白质；各种白细胞介素的基因，如IL1和IL2；各种细胞因子基因，如促红细胞生成素（EPO）基因和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）基因；生长因子基因；编码多聚体蛋白质的基因，例如，编码作为抗体或其抗原结合片段的异源多聚体的基因。这些基因可以通过任何方法获得。
术语“抗体的抗原结合片段”是指对抗原具有结合活性的抗体的部分片段。其实例包括Fab、F（ab'）2、Fv、scFv、双抗体、线性抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。同样，作为通过在还原条件下处理F（ab'）2获得的抗体可变区的单价片段的Fab'包括在抗体的抗原结合片段中。然而，抗原结合片段不限于这些分子，只要其具有抗原结合能力。此外，这些抗原结合片段也不仅包括通过用合适的酶处理抗体蛋白质的全长分子而获得的片段，而且还包括使用基因工程抗体基因在合适的宿主细胞中生产的蛋白质。
根据本发明的用于生产外源基因衍生的蛋白质的方法的外源基因表达载体可包含用于选择转化体的选择标记。可以使用例如赋予对药物的抗性的抗药性标记来选择转化体，所述药物例如浅蓝菌素、金担子素（aureobasidin）、zeocin、刀豆氨酸、环己酰亚胺、潮霉素、嘌呤霉素、杀稻瘟素、四环素、卡那霉素、氨苄青霉素或新霉素。或者，可以通过使用赋予例如对乙醇等的溶剂抗性，对甘油、盐等的渗透压抗性或对铜等的金属离子抗性的基因作为标记来选择转化体。
根据本发明的用于生产外源基因衍生的蛋白质的方法的外源基因表达载体可以是未整合到染色体DNA中的载体。通常，外源基因表达载体在转染宿主细胞后随机整合到染色体中。对比起来，使用源自哺乳动物病毒如猿猴病毒40（SV40）、乳头瘤病毒（BPV、HPV）或EBV的组分允许外源基因表达载体用作能够在转染的宿主细胞中自主复制的附加型载体。例如，广泛使用具有编码SV40-衍生的复制起点和反式作用因子SV40大T抗原的序列的载体，或具有编码EBV-衍生的oriP和EBNA-1的序列的载体。无论载体的类型或是否存在到染色体中的整合，DNA元件都能够表现出外源基因表达增强活性。
6.转化的细胞
根据本发明的用于生产外源基因衍生的蛋白质的方法的转化的细胞是包含向其中引入的前面部分5的外源基因表达载体的转化的细胞。
待转化的宿主细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，更优选人、小鼠、大鼠、仓鼠、猴或牛来源的细胞。哺乳动物细胞的实例可包括，但不限于COS-1细胞、293细胞和CHO细胞（CHO-K1、DG44、CHO dhfr-、CHO-S）。
在本发明中，将表达载体引入宿主细胞的方法可以是任何方法，只要所述方法允许引入的基因在宿主中稳定存在并适当表达。其实例可包括通常使用的方法，例如，磷酸钙法（Ito等人，（1984）Agric. Biol. Chem., 48, 341）、电穿孔（Becker, D.M.等人，(1990)Methods. Enzymol., 194, 182-187）、原生质球法（Creggh等人，Mol. Cell. Biol., 5,3376（1985））、乙酸锂法（Itoh, H.（1983）J. Bacteriol. 153, 163-168）和脂质转染。
7.生产异种蛋白的方法
根据本发明的生产异种蛋白的方法可以通过下述进行：通过已知方法培养前面部分6中描述的转化的细胞，并从培养物收集异种蛋白，后面是纯化。“培养物”是指培养上清液、培养的细胞和细胞匀浆中的任何一种。不仅可以选择单体蛋白质而且可以选择多聚体蛋白质作为可以使用部分6中描述的转化的细胞生产的异种蛋白。在生产由多个不同亚基构成的异源多聚蛋白质的情况下，编码这些亚基的多个基因各自需要引入部分6中描述的宿主细胞中。
培养转化的细胞的方法可以根据用于宿主细胞培养的通常的方法进行。
当转化的细胞是哺乳动物细胞时，转化的细胞例如于37℃在5％或8％CO2条件下培养达约24-1000小时的培养时间。培养可以通过例如静置培养、振荡培养、搅拌培养、通气下分批培养、补料分批培养、灌注培养或连续培养来进行。
来自上述培养物（培养液）的异种蛋白基因的表达产物可通过SDS-PAGE、蛋白质印迹法、ELISA等确认。
8.生产抗体蛋白质的方法
使用前面部分7中描述的生产方法生产的异源多聚蛋白质的实例可包括抗体蛋白质。抗体蛋白质是由两个重链多肽分子和两个轻链多肽分子组成的四聚体蛋白质。因此，为了获得保持抗原结合能力的形式的抗体蛋白质，必须将重链和轻链基因两者引入前面部分6中描述的转化的细胞中。在这种情况下，重链和轻链基因表达单位可以存在于相同的表达载体上或可以存在于不同的表达载体上。
根据本发明生产的抗体的实例可包括通过用所期望的抗原免疫实验动物如兔、小鼠和大鼠而制备的抗体。根据本发明生产的抗体的进一步实例可包括源自上述抗体的嵌合抗体和人源化抗体。另外，从基因工程动物或通过噬菌体展示方法获得的人抗体也是要根据本发明生产的抗体。
用于抗体生产的抗体基因不限于具有特定多核苷酸序列的抗体基因，只要通过抗体基因的转录和随后的翻译获得的重链多肽和轻链多肽的组合保留了与任意抗原蛋白结合的活性。
抗体基因不必定需要编码抗体的全长分子。可以使用编码抗体的抗原结合片段的基因。编码这种抗原结合片段的基因可以通过基因工程改造编码抗体蛋白全长分子的基因而获得。
9.生产其他异种蛋白的方法
通过本发明的生产方法生产的异种蛋白的实例可包括上述抗体以及各种人或非人动物来源的蛋白质，其抗原结合片段和蛋白质的修饰形式或片段。这种蛋白质等的实例可包括，但不限于：肽激素如心房钠尿肽（ANP）、脑钠尿肽（BNP）、C-型钠尿肽（CNP）、血管升压素、促生长素抑制素、生长激素（GH）、胰岛素、催产素、生长素释放肽、瘦蛋白、脂连蛋白、肾素、降钙素、护骨蛋白和胰岛素样生长因子（IGF）；细胞因子如白细胞介素、趋化因子、干扰素、肿瘤坏死因子（TNFα/β以及TNF超家族等）、神经生长因子（NGF）、细胞生长因子（EGF、FGF、PDGF、HGF、TGF等）、造血因子（CSF、G-CSF、促红细胞生成素等）和脂连蛋白；受体如TNF受体；酶如溶菌酶、蛋白酶（protease）、蛋白水解酶（proteinase）和肽酶；其功能片段（部分或全部保留原始蛋白质的生物活性的片段）；和包含这些蛋白质的融合蛋白。
实施例
下文中，本发明将参考实施例来具体描述。然而，这些实施例不以任何手段限制本发明的技术范围。用于本发明实施例的质粒、限制酶、DNA修饰酶等可商购获得，并可根据一般方法使用。用于DNA克隆、多核苷酸测序、宿主细胞转化、转化的细胞培养、从所得培养物收集蛋白质、纯化等的操作也是本领域技术人员众所周知的或者可以通过文献得到。
（实施例1）人源化抗体X-表达性细胞系的构建
1-1）人源化抗体基因X表达载体的构建
构建了具有非专利文献9中描述的pDSLH4.1作为载体主链的人源化抗体基因X表达载体pDSLH4.1-X。
1-2）产生表达人源化抗体X的稳定库
使CHO-K1细胞（ATCC）适应在无血清悬浮培养条件中的悬浮培养，以获得CHO-O1细胞作为宿主细胞。使用转染装置Neon Transfection System（Invitrogen），用（1-1）中构建的人源化抗体基因X表达载体pDSLH4.1-X转染CHO-O1细胞，并在T25瓶中于37℃在5％CO2中培养。转染后一天，向其中加入终浓度为800 µg/mL的遗传霉素（Geneticin）（LifeTechnologies Corporation），后面为药物选择培养达1周。然后，将细胞在125 mL锥形瓶中于37℃在5％CO2中培养以获得表达人源化抗体X的稳定库。
1-3）人源化抗体X-表达性细胞系的构建
将（1-2）中产生的表达人源化抗体X的稳定库单克隆以获得人源化抗体X-表达性细胞系X＃1和X＃2。
具体地，将在（1-2）中产生的表达人源化抗体X的稳定库悬浮在软琼脂培养基中，接种到6-孔板上，并于37℃在5％CO2中培养。培养后，使用ClonePix 2（Genetix）将高度表达人源化抗体X的集落挑取到96-孔板上。将如此挑取的集落通过连续的细胞扩充步骤依次传代培养至24-孔板、6-孔板、T25瓶和125 mL锥形瓶中，以获得人源化抗体X-表达性细胞系X＃1和X＃2。
（实施例2）人源化抗体X-表达性细胞系X＃1和X＃2的转录组分析
使用实施例1中产生的人源化抗体X-表达性细胞系X＃1和X＃2进行补料分批培养。对其时间依赖性样品进行转录组分析以鉴定高度表达的基因。
2-1）人源化抗体X-表达性细胞系X＃1和X＃2的补料分批培养
将实施例1中产生的每种人源化抗体X-表达性细胞系在1 L瓶中经受补料分批培养。对于瓶＃1，使用的细胞系是X＃1，并且使用的基础培养基/进料培养基是G13（由JX Energy制造的定制培养基）/F13（由JX Energy制造的定制培养基）。对于瓶＃2，使用的细胞系是X＃1，并且使用的基础培养基/进料培养基是DA1（由Life Technologies Corporation制造的定制培养基）/DAFM3（由Life Technologies Corporation制造的定制培养基）。对于瓶＃3，使用的细胞系是X＃2，并且使用的基础培养基/进料培养基是G13/F13。
活细胞数目的变化和生产的抗体量的变化分别显示在图1A和1B中。生产的抗体的量在细胞系之间进行比较，且发现在X＃1中比在X＃2中更高。生产的抗体的量在基础培养基/进料培养基之间进行比较，且发现在G13/F13中比在DA1/DAFM3中更高。
2-2）人源化抗体X-表达性细胞系X＃1和X＃2的转录组分析
在（2-1）中进行的补料分批培养的第4、7、9、11和14天，使用RNAiso Plus（Takara BioInc.）从细胞中提取总RNA。接着，使用TruSeq RNA样品制备（Prep）试剂盒v2（illumina）制备测序文库。具体地，从总RNA中分离聚腺苷酸化RNA并片段化。用获得的RNA片段作为模板合成双链cDNA。合成的双链cDNA在两端平端化并被磷酸化，后面是3'-dA突出端反应。加标记的（indexed）衔接子与其链接。衔接子连接的双链cDNA用作PCR扩增中的模板。然后，使用AMPure XP（Beckman Coulter）通过磁珠法纯化获得的PCR产物以制备测序文库。然后，使用测序文库形成充当测序模板的聚簇，并应用于HiSeq 2000系统（illumina），在所述系统中进行高速测序分析以获得测序数据。
2-3）转录组分析结果的数据分析
通过测序分析获得的读出序列使用非专利文献10中描述的Bowtie（版本，1.0.0）作图（map）到参考序列上。通过将基于NCBI中登记的中国仓鼠基因信息提取的剪接序列添加至NCBI中登记的中国仓鼠染色体序列来制备参考序列。使用非专利文献11中描述的ERANGE3.2研究读出序列（RPKM：每千碱基外显子[内含子/基因间]模型每百万作图的读数的读数）和新基因表达区域的表达水平。
在瓶＃1的第4天的细胞中具有最高表达水平的最前面20个基因显示在表1中。在瓶＃1、瓶＃2和瓶＃3的取样的每一天的上述20个基因的表达水平分别显示在图2A、2B和2C中。Hspa5（热激蛋白5）基因在瓶＃1、瓶＃2和瓶＃3的所有条件下在培养后期都表现出更高水平的表达，并且Fth1（铁蛋白重链1）基因在瓶＃2和瓶＃3的条件下在培养后期表现出更高水平的表达。与细胞系和培养基条件无关，Hspa5基因的表达水平在培养后期都升高，从而提示其启动子活性在培养后期增加。
[表1]
（实施例3）克隆高度表达的基因的启动子区域
除了tRNA之外，对在实施例2中发现的具有最高表达水平的最前面20个基因中的18个基因克隆了每个基因的启动子区域。
3-1）克隆Hspa5启动子区域
使用的Hspa5启动子区是参考在GenBank中在NM_001246739.1下登记的mRNA的序列和在NW_003615108.1下登记的中国仓鼠基因组的支架序列，从Hspa5起始密码子上游约3.0kbp的核苷酸到紧接地对应于起始密码子的核苷酸序列上游的核苷酸的序列。
使用下面给出的引物组和KOD FX Neo（Toyobo），以CHO细胞的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增Hspa5启动子区域，并使用QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化PCR产物。纯化的DNA片段用KpnI-HindIII消化，并然后插入pGL4.10 [luc2]（Promega）的KpnI-HindIII位点以构建pGL4.10-Hspa5。克隆的Hspa5启动子区域的核苷酸序列显示在序列表中的SEQ ID NO：1中。
用于Hspa5启动子的引物组
3-2）克隆其他高度表达的基因的启动子区域
按照前面部分3-1）中描述的方法，将Rps14（核糖体蛋白S14）、Gapdh（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、Eef1a1（真核翻译延伸因子1α1）、Rps11（40S核糖体蛋白S11-样）、Rplp0（60S酸性核糖体蛋白P0-样）、Rps4（核糖体蛋白S4）、PKM（丙酮酸激酶同工酶M1/M2-样）、Rps2（核糖体蛋白S2）、Actb（肌动蛋白，β）、Chub2（多聚遍在蛋白）、Rps3（40S核糖体蛋白S3a-样）、Prdx1（过氧化物氧还蛋白1）、Rpsa（核糖体蛋白SA）、Rps25（40S核糖体蛋白S25-样）、Rpl8（60S核糖体蛋白L8-样）、Fth1（铁蛋白重链1）和Hspd1（热激蛋白1）启动子区域各自克隆并插入pGL4.10[luc2]的多克隆位点。
3-3）pGL4.10-hEF1α的构建
接下来，使用下面给出的引物组和KOD-Plus-Ver. 2（Toyobo），以pEF1/V5-His A（Invitrogen）作为模板，通过PCR扩增人EF1-α启动子，并使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。纯化的DNA片段用NheI-HindIII消化，并然后插入pGL4.10 [luc2]的NheI-HindIII位点以构建pGL4.10-hEF1α。
用于hEF1α启动子的引物组
（实施例4）利用萤火虫萤光素酶的瞬时表达水平作为指示物对每个启动子的活性评价
4-1）转染
将（1-2）中描述的CHO-O1细胞以2.5×105个细胞/mL悬浮于Opti-MEM I还原血清培养基（Life Technologies Corporation）中，并以1 mL/孔接种到24-孔板上。3.2 µg实施例3中构建的具有每个启动子的插入的pGL4.10 [luc2]和0.4 µg用于转染效率校正的对照载体pGL4.74 [hRluc/TK]（Promega）用68 µL OptiPro SFM（Life TechnologiesCorporation）稀释。同时，8 µL Lipofectamine 2000 CD（Life TechnologiesCorporation）用68 µL OptiPro SFM稀释，与质粒溶液混合，并在室温放置20分钟。然后，将一半量添加到2个孔中的每一个中，并于37℃在5％CO2中培养。
4-2）萤光素酶测定
在转染后第二天，使用双重萤光素酶报道基因测定系统（Dual-Luciferase ReporterAssay System）（Promega）测量萤光素酶的瞬时表达水平。具体而言，将培养液于9000 G离心1分钟，并除去上清液。用PBS洗涤细胞沉淀一次。然后，使用附属于试剂盒的被动裂解缓冲液（Passive Lysis Buffer）制备细胞裂解物。然后，使用试剂盒和发光计测量萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶的发光量。
图3显示通过用具有每个启动子插入的萤光素酶表达载体转染细胞，并用下一天测量的海肾萤光素酶（Rluc）的发光量使萤火虫萤光素酶（luc2）的发光量归一化获得的值。Eef1a1表现出强的启动子活性，其与用作对照的人EF1-α相匹敌。在研究的启动子中，Hspa5在Eef1a1之后表现出第二最强启动子活性。
（实施例5）通过以抗体表达水平作为指示物的补料分批培养评价Hspa5启动子
在转录组分析中，Hspa5基因的表达水平在培养后期增加，从而提示在培养后期增强的启动子活性。同样，Hspa5基因启动子在使用萤光素酶测定的瞬时表达的评价中表现出强启动子活性。因此，通过表达抗体的稳定库的补料分批培养评价这个启动子。
5-1）抗体表达载体的构建
构建了具有非专利文献9中描述的pDSLH4.1作为载体主链的人源化抗体基因Y表达载体pDSLHA4.1-hRPS7-Y。这个载体含有专利文献2中描述的用于表达抗体H链和L链基因的人RPS7启动子和专利文献2中描述的作为DNA元件的DNA元件A7。接着，通过用Hspa5或人EF1-α启动子代替在人源化抗体基因Y表达载体pDSLHA4.1-hRPS7-Y中用于抗体H链和L链基因的启动子来构建pDSLHA4.1-Hspa5-Y和pDSLHA4.1-hEF1α-Y。载体示意性地显示于图4中。
通过以下方法构建pDSLHA4.1-Hspa5-Y：首先，使用下面给出的引物组和PrimeSTAR Max DNA聚合酶（Takara Bio Inc.），以pGL4.10-Hspa5作为模板，通过PCR扩增中国仓鼠Hspa5启动子，并使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。纯化的DNA片段用NotI-XbaI消化，并然后分别插入H链基因表达载体pDSH1.1-hRPS7-Y和L链基因表达载体pDSL2.1-hRPS7-Y的NotI-NheI位点以构建pDSH1.1-Hspa5-Y和pDSL2.1-Hspa5-Y。接下来，将通过用AatII-HindIII消化pDSL2.1-Hspa5-Y而获得的DNA片段插入pDSH1.1-Hspa5-Y的AatII-HindIII位点以构建pDSLH3.1-Hspa5-Y。将专利文献2中描述的DNA元件A7插入pDSLH3.1-Hspa5-Y的表达盒的上游，以构建pDSLHA4.1-Hspa5-Y。
用于Hspa5启动子的的引物组
另一方面，通过以下方法构建pDSLHA4.1-hEF1α-Y：首先，使用下面给出的引物组和KOD-Plus-Ver. 2，以pGL4.10-hEF1α作为模板，通过PCR扩增人EF1-α启动子，并使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。纯化的DNA片段用NotI-NheI消化，并然后分别插入H链基因表达载体pDSH1.1-hRPS7-Y和L链基因表达载体pDSL2.1-hRPS7-Y的NotI-NheI位点以构建pDSH1.1-hEF1α-Y和pDSL2.1-hEF1α-Y。接下来，将通过用AatII-HindIII消化pDSL2.1-hEF1α-Y而获得的DNA片段插入pDSH1.1-hEF1α-Y的AatII-HindIII位点以构建pDSLH3.1-hEF1α-Y。将专利文献2中描述的DNA元件A7插入pDSLH3.1-hEF1α-Y的表达盒的上游，以构建pDSLHA4.1-hEF1α-Y。
用于hEF1α启动子的引物组
5-2）表达人源化抗体Y的稳定库的产生
根据（4-1）中描述的方法，用在（5-1）中构建的抗体表达载体pDSLHA4.1-Hspa5-Y、pDSLHA4.1-hRPS7-Y或pDSLHA4.1-hEF1α-Y转染（1-2）中描述的CHO-O1细胞。转染后一天，离心培养液，并除去上清液。将细胞沉淀悬浮在含有800 µg/mL遗传霉素的培养基中，后面是在6-孔板上药物选择培养达1周。然后，将转染子在T25瓶中并接着在125 mL锥形瓶中于37℃在5％CO2中培养，以产生表达人源化抗体Y的稳定库。用每种抗体表达载体于N = 2产生稳定库。
5-3）通过表达人源化抗体Y的稳定库的补料分批培养生产的抗体量的评价
使用在（5-2）中产生的每种表达人源化抗体Y的稳定库，在125 mL锥形瓶中进行补料分批培养。使用的基础培养基是G13，且使用的进料培养基是F13。
活细胞数目的变化、生产的抗体量的变化以及每个细胞和每天生产的抗体量的变化（SPR：比生产率）分别显示在图5A、5B和5C中。通过将取样时生产的抗体的量除以一直到取样时间的活细胞的积分数目来计算每个细胞和每天生产的抗体的量。在培养的起始阶段，Hspa5启动子的生产的抗体量和每个细胞和每天生产的抗体量两者都与用作对照的人RPS7启动子的那些相匹敌，且低于人EF1-α启动子的那些。然而，Hspa5启动子的每个细胞和每天生产的抗体量在培养的中期或更后期急剧增加，并且在培养的第10天分别是人RPS7启动子和人EF1-α启动子的值的1.3和0.9倍，且在培养的第14天分别是人RPS7启动子和人EF1-α启动子的值的1.8和1.4倍。结果，在培养第14天Hspa5启动子的生产的抗体量分别达到人RPS7启动子和人EF1-α启动子的值的1.5和1.4倍，并因此大大超过了目前常常使用的启动子生产的抗体的量。
5-4）通过表达人源化抗体Y的稳定库的补料分批培养进行的mRNA表达水平评价
通过使用在（5-3）中进行的补料分批培养中随时间过去获得的细胞进行实时PCR比较目标抗体Y基因的mRNA表达水平。使用RNeasy Micro试剂盒（Qiagen）在补料分批培养的第4、6、9、10和11天从细胞中提取总RNA，并使用PrimeScript高保真度（High Fidelity）RT-PCR试剂盒（Takara Bio Inc.）以总RNA作为模板通过逆转录反应合成cDNA。接下来，使用下面给出的引物组和SYBR Premix Ex Taq II（Takara Bio Inc.），以逆转录反应溶液作为模板进行实时PCR。使用用于H链基因转染的人源化抗体Y表达载体和通过TOPO克隆用下面给出的用于Gapdh基因的引物组扩增的DNA片段获得的质粒DNA制备校准曲线，以计算每个样品中的H链基因和Gapdh基因的拷贝数。通过将每个样品中H链基因的拷贝数除以Gapdh基因的拷贝数来归一化的H链基因的表达水平显示在图6中。在培养的起始阶段，Hspa5启动子下H链基因的mRNA表达水平与用作对照的人RPS7启动子下的相匹敌，并且低于人EF1-α启动子下的。然而，Hspa5启动子下H链基因的表达水平在培养的中期或更后期大大增加，并且大大超过人RPS7启动子和人EF1-α启动子下的值。显示mRNA表达水平的这种时间依赖性变化的结果与图5C中所示的蛋白质表达水平的结果相似。这些结果表明，对于Hspa5启动子在培养后期蛋白质表达水平的增加可归因于Hspa5启动子的启动子活性的增加。
用于H链基因的引物组
用于Gapdh基因的引物组
（实施例6）通过以海肾萤光素酶表达水平作为指示物的补料分批培养评价Hspa5启动子
6-1）海肾萤光素酶表达载体的构建
将Hspa5启动子、人RPS7启动子或人EF1-α启动子插入海肾萤光素酶表达载体pGL4.82[hRluc/Puro]（Promega）的多克隆位点以构建pGL4.82-Hspa5、pGL4.82-hRPS7或pGL4.82-hEF1α。
具体地，将（3-1）中制备的KpnI-HindIII消化的Hspa5启动子插入pGL4.82[hRluc/Puro]的KpnI-HindIII位点以构建pGL4.82-Hspa5。
接下来，使用下面给出的引物组和PrimeSTAR Max DNA聚合酶（Takara BioInc.），以pDSLHA4.1-hRPS7-Y作为模板，通过PCR扩增人RPS7启动子，并使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。纯化的DNA片段用XhoI-HindIII消化，并然后插入pGL4.82[hRluc/Puro]的XhoI-HindIII位点以构建pGL4.82-hRPS7。
用于hRPS7启动子的引物组
同样，将（3-3）中制备的NheI-HindIII消化的人EF1-α启动子插入pGL4.82 [hRluc/Puro]的NheI-HindIII位点以构建pGL4.82-hEF1α。
6-2）表达海肾萤光素酶的稳定库的产生
根据（4-1）中描述的方法，用在（6-1）中构建的海肾萤光素酶表达载体pGL4.82-Hspa5、pGL4.82-hRPS7或pGL4.82-hEF1α转染（1-2）中描述的CHO-O1细胞。转染后一天，离心培养液，并除去上清液。将细胞沉淀悬浮在含有8 µg/mL嘌呤霉素的培养基中，后面是在6-孔板上药物选择培养达12天。然后，将转染子在T25瓶中且接着在125 mL锥形瓶中于37℃在5％CO2中培养，以产生表达海肾萤光素酶的稳定库。用每种海肾萤光素酶表达载体于N = 3产生稳定库。
6-3）通过表达海肾萤光素酶的稳定库的补料分批培养生产的蛋白质的量的评价
使用在（6-2）中产生的每种表达海肾萤光素酶的稳定库，在125 mL锥形瓶中进行补料分批培养。使用的基础培养基是G13，且使用的进料培养基是F13。使用海肾萤光素酶测定系统（Promega），测量关于在分批补料培养的第3、4、7、9和11天的细胞的海肾萤光素酶的表达水平。
具体而言，将培养液于9000 G离心1分钟，并除去上清液。用PBS洗涤细胞沉淀一次。然后，使用附属于试剂盒的海肾萤光素酶测定裂解缓冲液（Luciferase Assay LysisBuffer）制备细胞裂解物。然后，使用试剂盒和发光计测量海肾萤光素酶的发光量。
图7A和7B分别显示了活细胞数目的变化和每103细胞的海肾萤光素酶发光量的变化。在培养起始阶段的细胞中，Hspa5启动子的海肾萤光素酶的发光量高于用作对照的人RPS7启动子的，并且与人EF1-α启动子的相匹敌。然而，Hspa5启动子的海肾萤光素酶的发光量在培养的中期或更后期的细胞中随时间过去增加，而人RPS7启动子和人EF1-α启动子的海肾萤光素酶的发光量急剧下降。因此，在培养第11天的细胞中，Hspa5启动子的海肾萤光素酶的发光量分别是人RPS7启动子和人EF1-α启动子的值的4.5倍和4.8倍。因此，作为尝试表达海肾萤光素酶的结果，可能证实Hspa5启动子在增强除抗体表达系统以外的系统中生产的蛋白质的量的效果中优于现有人RPS7启动子和人EF1-α启动子。这些结果表明Hspa5启动子也可用于生产抗体以外的蛋白质。
（实施例7）在补料分批培养中以抗体表达水平作为的指示物对Hspa5启动子长度的研究
7-1）抗体表达载体的构建
pDSLHA4.1-Hspa5-2.5-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-2.0-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-1.5-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-1.1-Y和pDSLHA4.1-Hspa5-0.6-Y通过用Hspa5启动子的部分序列代替人源化抗体基因Y表达载体pDSLHA4.1-hRPS7-Y中的抗体H链和L链基因的启动子来构建。在这些表达载体中，所用的Hspa5启动子的部分序列是分别从Hspa5起始密码子上游约2.5、2.0、1.5、1.1和0.6 kbp的核苷酸到紧接地对应于起始密码子的核苷酸序列上游的核苷酸的序列。
通过以下方法构建pDSLHA4.1-Hspa5-2.5-Y：首先，使用下面给出的引物组和PrimeSTAR Max DNA聚合酶，以pGL4.10-Hspa5作为模板，通过PCR扩增中国仓鼠Hspa5启动子的部分序列，并使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。用NotI-XbaI消化纯化的DNA片段，并然后分别插入H链基因表达载体pDSH1.1-hRPS7-Y和L链基因表达载体pDSL2.1-hRPS7-Y的NotI-NheI位点以构建pDSH1.1-Hspa5-2.5-Y和pDSL2.1-Hspa5-2.5-Y。接下来，将通过用AatII-HindIII消化pDSL2.1-Hspa5-2.5-Y获得的DNA片段插入pDSH1.1-Hspa5-2.5-Y的AatII-HindIII位点以构建pDSLH3.1-Hspa5-2.5-Y。将专利文献2中描述的DNA元件A7插入pDSLH3.1-Hspa5-2.5-Y的表达盒的上游，以构建pDSLHA4.1-Hspa5-2.5-Y。以与上述相同的方式构建pDSLHA4.1-Hspa5-2.0-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-1.5-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-1.1-Y和pDSLHA4.1-Hspa5-0.6-Y。
用于Hspa5启动子2.5 kbp的引物组
用于Hspa5启动子2.0 kbp的引物组
用于Hspa5启动子1.5 kbp的引物组
用于Hspa5启动子1.1 kbp的引物组
用于Hspa5启动子0.6 kbp的引物组
7-2）表达人源化抗体Y的稳定库的产生
根据（4-1）中描述的方法，用在（5-1）或（7-1）中构建的抗体表达载体pDSLHA4.1-hRPS7-Y、pDSLHA4.1-hEF1α-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-2.5-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-2.0-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-1.5-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-1.1-Y或pDSLHA4.1-Hspa5-0.6-Y转染（1-2）中描述的CHO-O1细胞。然后，通过（5-2）中描述的方法进行药物选择培养，以产生表达人源化抗体Y的稳定库。用每种抗体表达载体于N = 3产生稳定库。
7-3）通过表达人源化抗体Y的稳定库的补料分批培养生产的抗体量的评价
使用在（7-2）中产生的每种表达人源化抗体Y的稳定库，在125 mL锥形瓶中进行补料分批培养。使用的基础培养基是G13，且使用的进料培养基是F13。
活细胞数目的变化、生产的抗体量的变化以及每个细胞和每天生产的抗体量的变化（SPR：比生产率）分别显示在图8A、8B和8C中。出乎意料的是，长度从3.0 kbp降至0.6或1.1 kbp的Hspa5启动子从培养的起始阶段表现出高生产力。在培养的第5天，Hspa5启动子的生产的抗体量和每个细胞和每天生产的抗体量两者均高于用作对照的人RPS7启动子和人EF1-α启动子的那些。此外，无论Hspa5启动子的长度如何，每个细胞和每天生产的抗体量在培养的中期或更后期都增加，并且在培养的第14天0.6和1.1 kbp Hspa5启动子的值均为人EF1-α启动子的值的2.3倍。结果，在培养第14天0.6和1.1 kbp Hspa5启动子的生产的抗体量均超过0.5 g/L，且分别达到人EF1-α启动子的值的2.1和2.0倍。就生产的抗体量而论，具有最优化长度的Hspa5启动子能够发挥其最大启动子活性，并因此优于目前经常使用的启动子。
7-4）通过表达人源化抗体Y的单克隆的补料分批培养生产的抗体量的评价
从（7-2）中使用Hspa5启动子的0.6 kbp部分序列产生的表达人源化抗体Y的稳定库获得单克隆，并评价通过补料分批培养生产的抗体的量。
首先，使用流式细胞仪富集高度表达性细胞。具体地，将培养液于200 G离心3分钟，并除去上清液。用2％BSA-PBS洗涤细胞沉淀两次，并然后重悬浮于2％BSA-PBS中。将异硫氰酸荧光素（FITC）-缀合的山羊F（ab'）2片段抗人IgG（H + L）（Beckman Coulter）添加到获得的细胞悬浮液中，其然后于4℃染色30分钟。然后，将细胞悬浮液于200 G离心3分钟，并除去上清液。用2％BSA-PBS洗涤细胞沉淀两次，并然后重悬浮于2％BSA-PBS中。使用BDFACSAria Fusion分选器（sorter）（Becton Dickinson）分选获得的细胞悬浮液。在下述条件下进行分选：首先，在横坐标上的FSC-Area对纵坐标上的SSC-Area的点图中，基于SSC的值设置两个门，并进一步基于FSC的值设置四个门。然后，在具有最小FSC值和较小SSC值的级分中的细胞群体中分选表现出最高荧光强度的最前面5％细胞群体。
接下来，培养分选的细胞群体，然后悬浮在软琼脂培养基中，接种到6-孔板上，并于37℃在5％CO2中培养。培养后，使用ClonePix 2将高度表达人源化抗体Y的集落挑取到96-孔板上。通过连续的细胞扩充步骤将如此挑取的集落依次传代培养至24-孔板、6-孔板、T25瓶和125 mL锥形瓶中。
使用获得的表达人源化抗体Y的单克隆进行分批培养以选择高度表达性单克隆。接着，使用选择的表达人源化抗体Y的单克隆在125 mL锥形瓶中进行补料分批培养。使用的基础培养基是G13，且使用的进料培养基是F13。
活细胞数目的变化、生产的抗体量的变化以及每个细胞和每天生产的抗体量的变化（SPR：比生产率）分别显示在图9A、9B和9C中。如稳定库中那样，每个细胞和每天生产的抗体量在许多克隆的培养的中期或更后期增加。在评价的12个克隆中，5个克隆表现出2 g/L或更多，并且＃48具有最高量的生产的抗体，其达到约4 g/L。这些结果证明，使用具有最优化的启动子长度的Hspa5启动子允许即使在不评价许多克隆的情况下也可以获得高度生产性克隆，并且这些克隆包括表现出生产的抗体量非常高达约4 g/L的克隆。
（实施例8）通过以抗体表达水平作为指示物的补料分批培养评价人、小鼠和大鼠Hspa5启动子
8-1）抗体表达载体的构建
通过分别用人、小鼠和大鼠Hspa5启动子代替人源化抗体基因Y表达载体pDSLHA4.1-hRPS7-Y中的抗体H链和L链基因的启动子来构建pDSLHA4.1-hHspa5-Y、pDSLHA4.1-mHspa5-Y和pDSLHA4.1-rHspa5-Y。在每个表达载体中，使用的Hspa5启动子是从Hspa5起始密码子上游约1.0 kbp的核苷酸到紧接地对应于起始密码子的核苷酸序列上游的核苷酸的序列。克隆的人、小鼠和大鼠Hspa5启动子的核苷酸序列分别显示在序列表中的SEQ ID NOs：2、3和4中。
通过以下方法构建pDSLHA4.1-hHspa5-Y：首先，使用下文给出的引物组和PrimeSTAR Max DNA聚合酶，以人基因组DNA作为模板，通过PCR扩增人Hspa5启动子，并使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。用NotI-NheI消化纯化的DNA片段，并然后分别插入H链基因表达载体pDSH1.1-hRPS7-Y和L链基因表达载体pDSL2.1-hRPS7-Y的NotI-NheI位点以构建pDSH1.1-hHspa5-Y和pDSL2.1-hHspa5-Y。接下来，将通过用AatII-HindIII消化pDSL2.1-hHspa5-Y而获得的DNA片段插入pDSH1.1-hHspa5-Y的AatII-HindIII位点以构建pDSLH3.1-hHspa5-Y。将专利文献2中描述的DNA元件A7插入pDSLH3.1-hHspa5-Y的表达盒的上游，以构建pDSLHA4.1-hHspa5-Y。以与上述相同的方式构建pDSLHA4.1-mHspa5-Y和pDSLHA4.1-rHspa5-Y。
用于人Hspa5启动子的引物组
用于小鼠Hspa5启动子的引物组
用于大鼠Hspa5启动子的引物组
8-2）表达人源化抗体Y的稳定库的产生
根据（4-1）中描述的方法，用在（7-1）或（8-1）中构建的抗体表达载体pDSLHA4.1-Hspa5-1.1-Y、pDSLHA4.1-Hspa5-0.6-Y、pDSLHA4.1-hHspa5-Y、pDSLHA4.1-mHspa5-Y或pDSLHA4.1-rHspa5-Y转染（1-2）中描述的CHO-O1细胞。然后，通过（5-2）中描述的方法进行药物选择培养，以产生表达人源化抗体Y的稳定库。用每种抗体表达载体于N = 2产生稳定库。
8-3）通过表达人源化抗体Y的稳定库的补料分批培养生产的抗体量的评价
使用在（8-2）中产生的每种表达人源化抗体Y的稳定库，在125 mL锥形瓶中进行补料分批培养。使用的基础培养基是G13，且使用的进料培养基是F13。
活细胞数目的变化、生产的抗体量的变化以及每个细胞和每天生产的抗体量的变化（SPR：比生产率）分别显示在图10A、10B和10C中。如在中国仓鼠Hspa5启动子中那样，在使用人、小鼠和大鼠Hspa5启动子的任一种产生的稳定库中培养的中期或更后期，每个细胞和每天生产的抗体的量都增加。因此，这些稳定库能够实现高抗体量的生产。这些结果证明，通过使用人、小鼠、大鼠和中国仓鼠Hspa5启动子的任一种都可以提高抗体生产力，并且该效果不依赖于生物。
（实施例9）在补料分批培养中以抗体表达水平作为指示物研究Hspa5启动子和A7的组合所带来的效果
9-1）表达人源化抗体Y的稳定库的产生
根据（4-1）中描述的方法，用（7-1）中构建的含有DNA元件A7的抗体表达载体pDSLHA4.1-Hspa5-1.1-Y或pDSLHA4.1-Hspa5-0.6-Y或不含DNA元件A7的抗体表达载体pDSLH3.1-Hspa5-1.1-Y或pDSLH3.1-Hspa5-0.6-Y转染（1-2）中描述的CHO-O1细胞。然后，通过（5-2）中描述的方法进行药物选择培养，以产生表达人源化抗体Y的稳定库。用每种抗体表达载体于N = 2产生稳定库。
9-2）通过表达人源化抗体Y的稳定库的补料分批培养生产的抗体量的评价
使用（9-1）中产生的每种表达人源化抗体Y的稳定库，在125 mL锥形瓶中进行补料分批培养。使用的基础培养基是G13，且使用的进料培养基是F13。
活细胞数目的变化、生产的抗体量的变化以及每个细胞和每天生产的抗体量的变化（SPR：比生产率）分别显示在图11A、11B和11C中。在使用0.6和1.1 kbp Hspa5启动子中的任何一种的情况下，含有A7的抗体表达载体的生产的抗体量和每个细胞和每天生产的抗体量均高于不含A7的抗体表达载体的。在第14天，0.6和1.1 kbp Hspa5启动子与A7组合的生产的抗体量分别是没有A7的0.6和1.1 kbp Hspa5启动子的值的2.1和1.5倍。无论是否存在A7，每个细胞和每天生产的抗体量在培养的中期或更后期都增加。这些结果证明，Hspa5启动子与DNA元件A7的组合使用通过协同效应有效地实现了高生产。
工业实用性
根据本发明的生产外源基因的方法能够提高外源基因如治疗用蛋白质或抗体的生产力。特别地，通过使用热激蛋白A5基因启动子的本发明的生产方法可以提高生产力，所述热激蛋白A5基因启动子允许在哺乳动物细胞的整个培养期期间不减弱外源基因表达调节功能的情况下在哺乳动物细胞的整个培养期期间外源基因的强表达。
序列表自由文本
SEQ ID NO：1-中国仓鼠来源的Hspa5启动子
SEQ ID NO：2-人来源的Hspa5启动子
SEQ ID NO：3-小鼠来源的Hspa5启动子
SEQ ID NO：4-大鼠来源的Hspa5启动子
SEQ ID NO：5-从中国仓鼠Hspa5起始密码子上游约2.5 kbp的核苷酸到紧接地对应于起始密码子的核苷酸序列上游的核苷酸的中国仓鼠来源的Hspa5启动子的核苷酸序列
SEQ ID NO：6-从中国仓鼠Hspa5起始密码子上游约2.0 kbp的核苷酸到紧接地对应于起始密码子的核苷酸序列上游的核苷酸的中国仓鼠来源的Hspa5启动子的核苷酸序列
SEQ ID NO：7-从中国仓鼠Hspa5起始密码子上游约1.5 kbp的核苷酸到紧接地对应于起始密码子的核苷酸序列上游的核苷酸的中国仓鼠来源的Hspa5启动子的核苷酸序列
SEQ ID NO：8-从中国仓鼠Hspa5起始密码子上游约1.1 kbp的核苷酸到紧接地对应于起始密码子的核苷酸序列上游的核苷酸的中国仓鼠来源的Hspa5启动子的核苷酸序列
SEQ ID NO：9-从中国仓鼠Hspa5起始密码子上游约0.6 kbp的核苷酸到紧接地对应于起始密码子的核苷酸序列上游的核苷酸的中国仓鼠来源的Hspa5启动子的核苷酸序列
SEQ ID NO：10-用于Hspa5启动子的引物Hspa5-KpnI-F
SEQ ID NO：11-用于Hspa5启动子的引物Hspa5-HindIII-R
SEQ ID NO：12-用于hEF1α启动子的引物hEF1α-NheI-F
SEQ ID NO：13-用于hEF1α启动子的引物hEF1α-HindIII-R
SEQ ID NO：14-用于Hspa5启动子的引物Hspa5-NotI-F
SEQ ID NO：15-用于Hspa5启动子的引物Hspa5-XbaI-R
SEQ ID NO：16-用于hEF1α启动子的引物hEF1α-NotI-F
SEQ ID NO：17-用于hEF1α启动子的引物hEF1α-NheI-R
SEQ ID NO：18-用于人源化抗体Y的H链基因的引物HC-F
SEQ ID NO：19-用于人源化抗体Y的H链基因的引物HC-R
SEQ ID NO：20-用于Gapdh基因的引物Gapdh-F
SEQ ID NO：21-用于Gapdh基因的引物Gapdh-R
SEQ ID NO：22-用于hRPS7启动子的引物hRPS7-XhoI-F
SEQ ID NO：23-用于hRPS7启动子的引物hRPS7-HindIII-R
SEQ ID NO：24-用于Hspa5启动子2.5 kbp的引物Hspa5-NotI-2500F
SEQ ID NO：25-用于Hspa5启动子2.0 kbp的引物Hspa5-NotI-2000F
SEQ ID NO：26-用于Hspa5启动子1.5 kbp的引物Hspa5-NotI-1500F
SEQ ID NO：27-用于Hspa5启动子1.1 kbp的引物Hspa5-NotI-1100F
SEQ ID NO：28-用于Hspa5启动子0.6 kbp的引物Hspa5-NotI-600F
SEQ ID NO：29-用于人Hspa5启动子的引物Hspa5-人- NotI-F
SEQ ID NO：30-用于人Hspa5启动子的引物Hspa5-人-NheI-R
SEQ ID NO：31-用于小鼠Hspa5启动子的引物Hspa5-小鼠-NotI-F
SEQ ID NO：32-用于小鼠Hspa5启动子的引物Hspa5-小鼠-XbaI-R
SEQ ID NO：33-用于大鼠Hspa5启动子的引物Hspa5-大鼠-NotI-F
SEQ ID NO：34-用于大鼠Hspa5启动子的引物Hspa5-大鼠-XbaI-R
SEQ ID NO：35- DNA元件A2的核苷酸序列
SEQ ID NO：36- DNA元件A7的核苷酸序列
SEQ ID NO：37- DNA元件A18的核苷酸序列
序列表
<110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED
<120> Hspa5基因的启动子
<130> FP1713
<150> JP2016-195564
<151> 2016-10-03
<160> 37
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2949
<212> DNA
<213> 中国仓鼠（Cricetulus griseus）
<400> 1
tatagcccag gcacacatga acttgtaatc ctcctgcttc agcctcttca gtagctgggg 60
ttacaggcct accactaggt gtggctcagg tatcactttt ttaaatgtta caaaaattgg 120
tgcaagtact tcattaatca aaaaacaggc tgaaattgag ttttgtattt tagtggaaat 180
agactgtgat acagatgtgc ttgaaatgac atgaagctgt gatgtggtca aatagtgatt 240
tttttctttc atttcttctt cttgttctta ctcttttttc atatagggtt tcaatatgca 300
gctctggaac tatttagacc aggatggcct tgaattcaag agatccctct gcttctgcct 360
cccttgtgct gagattaaag tcatgagcca ccatatccgg ctgtagtctc ctttaaaatt 420
caagccaaaa gtatctgcaa agatggtcgg tggttaagag cactggctgc tctttcatgg 480
gaccagggat taaaggcatg cagcagtaaa ctgggcttag tgacttctgt cttcatactg 540
gactggtaca gtcccaagga agatcaatgt tatgacagta ttacaagcct tactgaaagt 600
ggtgtatgat gcaacatctg tagaaaagat ggtgttgact gagtcaccaa cataaccttt 660
gaggaacaag aaaggagaaa ttcctgaaca gtgactcaca agctcacatt ttagtgaact 720
gtgtgtaatg ttccagtagt attcagacag tctacttatg aagctcaaga tacatttaat 780
gggaatactg gagtcatttc ctgcccgtga caacatccta agcatctcct ataagcatgt 840
atataagtaa gcacatggga ggcagagaca gtagatctga gagctccatc ccaggggatg 900
gatatcagtc agttgcctag catgcacaga atcttgggtc aagtcccaac tggacacagt 960
aatgtatgcc tattagtccc aacacttgga aggtattggc agaaggttca ggagttcaaa 1020
gtcatctgct acaaagtgtt gaggctagcc tgggttacat gagtctccat ctttaaaaaa 1080
agaaaaaagt ggggctggaa agatggctca gtggttaaga gcaccgcctg ctcttccaaa 1140
ggtcctgagt tcaattccca gcaaccacat ggtggctcaa aaccatctgt agtgaaatct 1200
ggtgccctct gtgtacaaga taaatgaatg aatcttaaaa aaaaaagtca gtgggtggtg 1260
gtggcgcaca cctttagtcc cagcactcgg gagaggcagg tgtgagttcg agaccagcct 1320
ggtctacaag agctacttcc aggacaaagc ctccaaagcc acagagaaac cctgtctcga 1380
aaaaccaaac caaaccaaac caaaaaagtc aatagcataa gctacagatc aaccaggtta 1440
tcaattctac ctgtaccact caccagtgac tattctattt agccaccccc cccccaatga 1500
tctcttctgg aaaatgggaa acatctacca agaattaatc aaaggactaa atgacacatg 1560
caaaaaaaaa aaaaccttag aacagtgttt taagcaggat aagtagttca agaccagttt 1620
ggaccatgtc tcaaaactaa aggaacaacg aagtacattt agtatttttt gcaacatgtt 1680
attattacat agcatcagga agacaatttt ttctttgtct gctaaatgcc tttgtcatat 1740
cagacctatt tcaagagtca ggatagaatg gtgtcaagaa gggatgagga aggacttgta 1800
aattataacc aagccacaaa tgaaaatgat agacaaggat cgggaacatt atggggcgac 1860
aagctagaga aaaaaaatga tatattccag ggtggaaagt gctcgcttga ctattcatag 1920
aacagaatag ccacagcata gcggggggct cagtactagg ttgcaaatgg ccaggccaat 1980
tctgggactt aaccccaaga aaagaaaaat tggcaaggcc aggatagaca aatgcagctg 2040
gcctaggggt gaagggaaaa cagttggctg agaagagcca cgattcgcag agaggcagaa 2100
cacagactag gacccagctc gagacgtgca ggccgggtgg gtaacataga gcccgggcgc 2160
tcggctaccc gagaacgtga gggaggcttg gaagggcaga gatgcgttcc caggcgacca 2220
cagcatctat gctgaggctg agcagctcgg gacccgaggg gacttaggag gagaaaaggc 2280
cgcatactgc ttcggggtaa gggacagacc ggggaaggac ccaagtccca ccgcccagag 2340
ggaactgaca cgcagacccc gcagcagtcc ccgggggccg ggtgacggga ggacctggac 2400
ggttaccggc ggaaacggtc tcgggttgag aggtcacctg agggacaggc agctgctgaa 2460
ccaataggac cggcgcacag ggcggatgct gcctctcatt ggcggccgtt gagagtaacc 2520
agtagccaat gagtcagccc ggggggcgta gcggtgacgt aagttgcgga ggaggccgct 2580
tcgaatcggc agcggccagc ttggtggcat ggaccaatca gcgtcctcca acgagaagcg 2640
ccttcaccaa tcggaggcct ccacgacggg gctgggggga gggtatataa gccaagtcgg 2700
cggcggcgcg ctccacactg gccaagacaa cagtgaccgg aggacctgcc tttgcggctc 2760
cgagaggtaa gcgccgcggc ctgctcttgc cagacctcct ttgagcctgt ctcgtggctc 2820
ctcctgaccc ggggggcttc tgtcgccctc agatcggaac gccgccgcgc tccgggacta 2880
cagcctgttg ctggacttcg agactgcaga cggaccgacc gctgagcact ggcccacagc 2940
gccggcaag 2949
<210> 2
<211> 999
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
acagtaggga ggggactcag agctggaggc aattcctttg gccgggcttg tcctgcgact 60
taccgtgggg cagcgcaatg tggagaggcc tggtaaaatg gctgggcaag ggtgcggagg 120
ggacataact ggcaggaagg agtcatgatt cgtggtcgaa cagagtccag accagctcga 180
cctgtgagca acgaacggcc ctgagactcg cataccccaa taccggtagt ggccgtgaag 240
ggcaaagaaa tgtgttctga ggcgatccca gcatctaagc tgcgactggt ctactcagag 300
actggatgga agctgggaag agaaagctgc ttcccgcttc ggggtgaggg atggaggaag 360
ggagaacaag cagtagagaa ggaaaagttt cagatcccac agccccgggg ggtcactcct 420
gctggatcta ctccgacccc ctagggccgg gagtgaaggc gggacttgtg cggttaccag 480
cggaaatgcc tcggggtcag aagtcgcagg agagatagac agctgctgaa ccaatgggac 540
cagcggatgg ggcggatgtt atctaccatt ggtgaacgtt agaaacgaat agcagccaat 600
gaatcagctg ggggggcgga gcagtgacgt ttattgcgga gggggccgct tcgaatcggc 660
ggcggccagc ttggtggcct gggccaatga acggcctcca acgagcaggg ccttcaccaa 720
tcggcggcct ccacgacggg gctgggggag ggtatataag ccgagtaggc gacggtgagg 780
tcgacgccgg ccaagacagc acagacagat tgacctattg gggtgtttcg cgagtgtgag 840
agggaagcgc cgcggcctgt atttctagac ctgcccttcg cctggttcgt ggcgccttgt 900
gaccccgggc ccctgccgcc tgcaagtcgg aaattgcgct gtgctcctgt gctacggcct 960
gtggctggac tgcctgctgc tgcccaactg gctggcaag 999
<210> 3
<211> 1000
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 3
atggtggaaa gtgctcgttt gaccatagta ctgaatctcc gcggcggaga aagggaatag 60
gttacaattg gccaggccaa tcctgggact taaccccggc aaagggaaga ttcgaaaggc 120
ctggaaagac acatacggct agccttgggg tgaaggagaa acacggttag ctgagaagca 180
ccaggattct cagcgaggca gaatccagat caggccccag ctcgagacgt gcaggccggg 240
cgagtaacag ggcctggact ctgggacatc cgagaacgtg tggaggctgg ggagggcgat 300
cacagctgag gccgggcagc tcaggacgcg gggaatcgag gaggagaaag gccgcgtact 360
tcttcagagt gagagacaga aaaggagacc ccgagggaac tgacacgcag accccactcc 420
agtccccggg ggcctggcgt gaggggagga cctgaacggt taccggcgga aacggtctcg 480
gggtgagagg tcacccgaag gacaggcagc tgctgaacca ataggaccag cgctcagggc 540
ggatgctgcc tctcattggt ggccgttaag aatgaccagt agccaatgag tcagcccggg 600
gggcgtagca atgacgtgag ttgcggagga ggccgcttcg aatcggcagc agccagcttg 660
gtggcatgga ccaatcagcg gcctccaacg agtagcgact tcaccaatcg gaggcctcca 720
cgacggggct gtggggaggg tatataaggc gagtcggcga cggcgcgctc gatactggcc 780
gagacaacac tgacctggac acttgggctt ctgcgtgtgt gtgaggtaag cgccgcggcc 840
tgctgctagg cctgctccga gtctgcttcg tgtctcctcc tgaccccgag gcccctgtcg 900
ccctcagacc agaaccgtcg tcgcgtttcg gggccacagc ctgttgctgg actcctaaga 960
ctcctgcctg actgctgagc gactggtcct cagcgccggc 1000
<210> 4
<211> 1000
<212> DNA
<213> 拟鲤（Rutilus rutilus）
<400> 4
ctcaacggag aagggctccg gactaggtta caattggcca ggccaatcct gggacttatc 60
cccgggaaag ggaaaatcag aaaggcccag aaacatacat acaactagac ttggggtgaa 120
cgaggagcat gattagctga gaagagccag gattctcagc gaggcagaac ccataccagg 180
ccccagcccg ggacatgcag gcccgttgag taacagggcc tggacgctgg aacacccgag 240
aaaagtgccg aggctgggaa gggtgatcac agcatcacag ctgaggccgg gcagctgaag 300
acatgagtga atctaggaga agaaaggcag cgtacttctt ccgagtgaga gacagaaaga 360
gaggacccga gtctcacagc cctgagggaa ctgacacgca gaccccactc cagtccccgg 420
gggcccaacg tgaggggagg acctggacgg ttaccggcgg aaacggtttc caggtgagag 480
gtcacccgag ggacaggcag ctgctcaacc aataggacca gctctcaggg cggatgctgc 540
ctctcattgg cggccgttaa gaatgaccag tagccaatga gtcggcctgg ggggcgtacc 600
agtgacgtga gttgcggagg aggccgcttc gaatcggcag cggccagctt ggtggcatga 660
accaaccagc ggcctccaac gagtagcgag ttcaccaatc ggaggcctcc acgacggggc 720
tgcggggagg atatataagc cgagtcggcg accggcgcgc tcgatactgg ctgtgactac 780
actgacttgg acacttggcc ttttgcgggt ttgagaggta agcgtcgcgg cctgcttcca 840
ggcctaccct gattttggtt cgtggctcct cctgaccctg agacctctgt cgccctcaga 900
tcagaaccgt cgtcgcgttt cggggctaca gcctgttgct ggactctgtg agacacctga 960
ccgaccgctg agcgactgac tggtccacag cgccggcaag 1000
<210> 5
<211> 2506
<212> DNA
<213> 中国仓鼠（Cricetulus griseus）
<400> 5
tggtcggtgg ttaagagcac tggctgctct ttcatgggac cagggattaa aggcatgcag 60
cagtaaactg ggcttagtga cttctgtctt catactggac tggtacagtc ccaaggaaga 120
tcaatgttat gacagtatta caagccttac tgaaagtggt gtatgatgca acatctgtag 180
aaaagatggt gttgactgag tcaccaacat aacctttgag gaacaagaaa ggagaaattc 240
ctgaacagtg actcacaagc tcacatttta gtgaactgtg tgtaatgttc cagtagtatt 300
cagacagtct acttatgaag ctcaagatac atttaatggg aatactggag tcatttcctg 360
cccgtgacaa catcctaagc atctcctata agcatgtata taagtaagca catgggaggc 420
agagacagta gatctgagag ctccatccca ggggatggat atcagtcagt tgcctagcat 480
gcacagaatc ttgggtcaag tcccaactgg acacagtaat gtatgcctat tagtcccaac 540
acttggaagg tattggcaga aggttcagga gttcaaagtc atctgctaca aagtgttgag 600
gctagcctgg gttacatgag tctccatctt taaaaaaaga aaaaagtggg gctggaaaga 660
tggctcagtg gttaagagca ccgcctgctc ttccaaaggt cctgagttca attcccagca 720
accacatggt ggctcaaaac catctgtagt gaaatctggt gccctctgtg tacaagataa 780
atgaatgaat cttaaaaaaa aaagtcagtg ggtggtggtg gcgcacacct ttagtcccag 840
cactcgggag aggcaggtgt gagttcgaga ccagcctggt ctacaagagc tacttccagg 900
acaaagcctc caaagccaca gagaaaccct gtctcgaaaa accaaaccaa accaaaccaa 960
aaaagtcaat agcataagct acagatcaac caggttatca attctacctg taccactcac 1020
cagtgactat tctatttagc cacccccccc ccaatgatct cttctggaaa atgggaaaca 1080
tctaccaaga attaatcaaa ggactaaatg acacatgcaa aaaaaaaaaa accttagaac 1140
agtgttttaa gcaggataag tagttcaaga ccagtttgga ccatgtctca aaactaaagg 1200
aacaacgaag tacatttagt attttttgca acatgttatt attacatagc atcaggaaga 1260
caattttttc tttgtctgct aaatgccttt gtcatatcag acctatttca agagtcagga 1320
tagaatggtg tcaagaaggg atgaggaagg acttgtaaat tataaccaag ccacaaatga 1380
aaatgataga caaggatcgg gaacattatg gggcgacaag ctagagaaaa aaaatgatat 1440
attccagggt ggaaagtgct cgcttgacta ttcatagaac agaatagcca cagcatagcg 1500
gggggctcag tactaggttg caaatggcca ggccaattct gggacttaac cccaagaaaa 1560
gaaaaattgg caaggccagg atagacaaat gcagctggcc taggggtgaa gggaaaacag 1620
ttggctgaga agagccacga ttcgcagaga ggcagaacac agactaggac ccagctcgag 1680
acgtgcaggc cgggtgggta acatagagcc cgggcgctcg gctacccgag aacgtgaggg 1740
aggcttggaa gggcagagat gcgttcccag gcgaccacag catctatgct gaggctgagc 1800
agctcgggac ccgaggggac ttaggaggag aaaaggccgc atactgcttc ggggtaaggg 1860
acagaccggg gaaggaccca agtcccaccg cccagaggga actgacacgc agaccccgca 1920
gcagtccccg ggggccgggt gacgggagga cctggacggt taccggcgga aacggtctcg 1980
ggttgagagg tcacctgagg gacaggcagc tgctgaacca ataggaccgg cgcacagggc 2040
ggatgctgcc tctcattggc ggccgttgag agtaaccagt agccaatgag tcagcccggg 2100
gggcgtagcg gtgacgtaag ttgcggagga ggccgcttcg aatcggcagc ggccagcttg 2160
gtggcatgga ccaatcagcg tcctccaacg agaagcgcct tcaccaatcg gaggcctcca 2220
cgacggggct ggggggaggg tatataagcc aagtcggcgg cggcgcgctc cacactggcc 2280
aagacaacag tgaccggagg acctgccttt gcggctccga gaggtaagcg ccgcggcctg 2340
ctcttgccag acctcctttg agcctgtctc gtggctcctc ctgacccggg gggcttctgt 2400
cgccctcaga tcggaacgcc gccgcgctcc gggactacag cctgttgctg gacttcgaga 2460
ctgcagacgg accgaccgct gagcactggc ccacagcgcc ggcaag 2506
<210> 6
<211> 2006
<212> DNA
<213> 中国仓鼠（Cricetulus griseus）
<400> 6
tcccaactgg acacagtaat gtatgcctat tagtcccaac acttggaagg tattggcaga 60
aggttcagga gttcaaagtc atctgctaca aagtgttgag gctagcctgg gttacatgag 120
tctccatctt taaaaaaaga aaaaagtggg gctggaaaga tggctcagtg gttaagagca 180
ccgcctgctc ttccaaaggt cctgagttca attcccagca accacatggt ggctcaaaac 240
catctgtagt gaaatctggt gccctctgtg tacaagataa atgaatgaat cttaaaaaaa 300
aaagtcagtg ggtggtggtg gcgcacacct ttagtcccag cactcgggag aggcaggtgt 360
gagttcgaga ccagcctggt ctacaagagc tacttccagg acaaagcctc caaagccaca 420
gagaaaccct gtctcgaaaa accaaaccaa accaaaccaa aaaagtcaat agcataagct 480
acagatcaac caggttatca attctacctg taccactcac cagtgactat tctatttagc 540
cacccccccc ccaatgatct cttctggaaa atgggaaaca tctaccaaga attaatcaaa 600
ggactaaatg acacatgcaa aaaaaaaaaa accttagaac agtgttttaa gcaggataag 660
tagttcaaga ccagtttgga ccatgtctca aaactaaagg aacaacgaag tacatttagt 720
attttttgca acatgttatt attacatagc atcaggaaga caattttttc tttgtctgct 780
aaatgccttt gtcatatcag acctatttca agagtcagga tagaatggtg tcaagaaggg 840
atgaggaagg acttgtaaat tataaccaag ccacaaatga aaatgataga caaggatcgg 900
gaacattatg gggcgacaag ctagagaaaa aaaatgatat attccagggt ggaaagtgct 960
cgcttgacta ttcatagaac agaatagcca cagcatagcg gggggctcag tactaggttg 1020
caaatggcca ggccaattct gggacttaac cccaagaaaa gaaaaattgg caaggccagg 1080
atagacaaat gcagctggcc taggggtgaa gggaaaacag ttggctgaga agagccacga 1140
ttcgcagaga ggcagaacac agactaggac ccagctcgag acgtgcaggc cgggtgggta 1200
acatagagcc cgggcgctcg gctacccgag aacgtgaggg aggcttggaa gggcagagat 1260
gcgttcccag gcgaccacag catctatgct gaggctgagc agctcgggac ccgaggggac 1320
ttaggaggag aaaaggccgc atactgcttc ggggtaaggg acagaccggg gaaggaccca 1380
agtcccaccg cccagaggga actgacacgc agaccccgca gcagtccccg ggggccgggt 1440
gacgggagga cctggacggt taccggcgga aacggtctcg ggttgagagg tcacctgagg 1500
gacaggcagc tgctgaacca ataggaccgg cgcacagggc ggatgctgcc tctcattggc 1560
ggccgttgag agtaaccagt agccaatgag tcagcccggg gggcgtagcg gtgacgtaag 1620
ttgcggagga ggccgcttcg aatcggcagc ggccagcttg gtggcatgga ccaatcagcg 1680
tcctccaacg agaagcgcct tcaccaatcg gaggcctcca cgacggggct ggggggaggg 1740
tatataagcc aagtcggcgg cggcgcgctc cacactggcc aagacaacag tgaccggagg 1800
acctgccttt gcggctccga gaggtaagcg ccgcggcctg ctcttgccag acctcctttg 1860
agcctgtctc gtggctcctc ctgacccggg gggcttctgt cgccctcaga tcggaacgcc 1920
gccgcgctcc gggactacag cctgttgctg gacttcgaga ctgcagacgg accgaccgct 1980
gagcactggc ccacagcgcc ggcaag 2006
<210> 7
<211> 1507
<212> DNA
<213> 中国仓鼠（Cricetulus griseus）
<400> 7
aattctacct gtaccactca ccagtgacta ttctatttag ccaccccccc cccaatgatc 60
tcttctggaa aatgggaaac atctaccaag aattaatcaa aggactaaat gacacatgca 120
aaaaaaaaaa aaccttagaa cagtgtttta agcaggataa gtagttcaag accagtttgg 180
accatgtctc aaaactaaag gaacaacgaa gtacatttag tattttttgc aacatgttat 240
tattacatag catcaggaag acaatttttt ctttgtctgc taaatgcctt tgtcatatca 300
gacctatttc aagagtcagg atagaatggt gtcaagaagg gatgaggaag gacttgtaaa 360
ttataaccaa gccacaaatg aaaatgatag acaaggatcg ggaacattat ggggcgacaa 420
gctagagaaa aaaaatgata tattccaggg tggaaagtgc tcgcttgact attcatagaa 480
cagaatagcc acagcatagc ggggggctca gtactaggtt gcaaatggcc aggccaattc 540
tgggacttaa ccccaagaaa agaaaaattg gcaaggccag gatagacaaa tgcagctggc 600
ctaggggtga agggaaaaca gttggctgag aagagccacg attcgcagag aggcagaaca 660
cagactagga cccagctcga gacgtgcagg ccgggtgggt aacatagagc ccgggcgctc 720
ggctacccga gaacgtgagg gaggcttgga agggcagaga tgcgttccca ggcgaccaca 780
gcatctatgc tgaggctgag cagctcggga cccgagggga cttaggagga gaaaaggccg 840
catactgctt cggggtaagg gacagaccgg ggaaggaccc aagtcccacc gcccagaggg 900
aactgacacg cagaccccgc agcagtcccc gggggccggg tgacgggagg acctggacgg 960
ttaccggcgg aaacggtctc gggttgagag gtcacctgag ggacaggcag ctgctgaacc 1020
aataggaccg gcgcacaggg cggatgctgc ctctcattgg cggccgttga gagtaaccag 1080
tagccaatga gtcagcccgg ggggcgtagc ggtgacgtaa gttgcggagg aggccgcttc 1140
gaatcggcag cggccagctt ggtggcatgg accaatcagc gtcctccaac gagaagcgcc 1200
ttcaccaatc ggaggcctcc acgacggggc tggggggagg gtatataagc caagtcggcg 1260
gcggcgcgct ccacactggc caagacaaca gtgaccggag gacctgcctt tgcggctccg 1320
agaggtaagc gccgcggcct gctcttgcca gacctccttt gagcctgtct cgtggctcct 1380
cctgacccgg ggggcttctg tcgccctcag atcggaacgc cgccgcgctc cgggactaca 1440
gcctgttgct ggacttcgag actgcagacg gaccgaccgc tgagcactgg cccacagcgc 1500
cggcaag 1507
<210> 8
<211> 1109
<212> DNA
<213> 中国仓鼠（Cricetulus griseus）
<400> 8
cgggaacatt atggggcgac aagctagaga aaaaaaatga tatattccag ggtggaaagt 60
gctcgcttga ctattcatag aacagaatag ccacagcata gcggggggct cagtactagg 120
ttgcaaatgg ccaggccaat tctgggactt aaccccaaga aaagaaaaat tggcaaggcc 180
aggatagaca aatgcagctg gcctaggggt gaagggaaaa cagttggctg agaagagcca 240
cgattcgcag agaggcagaa cacagactag gacccagctc gagacgtgca ggccgggtgg 300
gtaacataga gcccgggcgc tcggctaccc gagaacgtga gggaggcttg gaagggcaga 360
gatgcgttcc caggcgacca cagcatctat gctgaggctg agcagctcgg gacccgaggg 420
gacttaggag gagaaaaggc cgcatactgc ttcggggtaa gggacagacc ggggaaggac 480
ccaagtccca ccgcccagag ggaactgaca cgcagacccc gcagcagtcc ccgggggccg 540
ggtgacggga ggacctggac ggttaccggc ggaaacggtc tcgggttgag aggtcacctg 600
agggacaggc agctgctgaa ccaataggac cggcgcacag ggcggatgct gcctctcatt 660
ggcggccgtt gagagtaacc agtagccaat gagtcagccc ggggggcgta gcggtgacgt 720
aagttgcgga ggaggccgct tcgaatcggc agcggccagc ttggtggcat ggaccaatca 780
gcgtcctcca acgagaagcg ccttcaccaa tcggaggcct ccacgacggg gctgggggga 840
gggtatataa gccaagtcgg cggcggcgcg ctccacactg gccaagacaa cagtgaccgg 900
aggacctgcc tttgcggctc cgagaggtaa gcgccgcggc ctgctcttgc cagacctcct 960
ttgagcctgt ctcgtggctc ctcctgaccc ggggggcttc tgtcgccctc agatcggaac 1020
gccgccgcgc tccgggacta cagcctgttg ctggacttcg agactgcaga cggaccgacc 1080
gctgagcact ggcccacagc gccggcaag 1109
<210> 9
<211> 609
<212> DNA
<213> 中国仓鼠（Cricetulus griseus）
<400> 9
ggaactgaca cgcagacccc gcagcagtcc ccgggggccg ggtgacggga ggacctggac 60
ggttaccggc ggaaacggtc tcgggttgag aggtcacctg agggacaggc agctgctgaa 120
ccaataggac cggcgcacag ggcggatgct gcctctcatt ggcggccgtt gagagtaacc 180
agtagccaat gagtcagccc ggggggcgta gcggtgacgt aagttgcgga ggaggccgct 240
tcgaatcggc agcggccagc ttggtggcat ggaccaatca gcgtcctcca acgagaagcg 300
ccttcaccaa tcggaggcct ccacgacggg gctgggggga gggtatataa gccaagtcgg 360
cggcggcgcg ctccacactg gccaagacaa cagtgaccgg aggacctgcc tttgcggctc 420
cgagaggtaa gcgccgcggc ctgctcttgc cagacctcct ttgagcctgt ctcgtggctc 480
ctcctgaccc ggggggcttc tgtcgccctc agatcggaac gccgccgcgc tccgggacta 540
cagcctgttg ctggacttcg agactgcaga cggaccgacc gctgagcact ggcccacagc 600
gccggcaag 609
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hspa5-KpnI-F
<400> 10
gggggggtac ctatagccca ggcacacatg aacttg 36
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hspa5-HindIII-R
<400> 11
gggggaagct tcttgccggc gctgtgggcc agtgct 36
<210> 12
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hEF1α-NheI-F
<400> 12
gagtgggcta gcgaattggc tccggtgccc gtcagtg 37
<210> 13
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hEF1α-HindIII-R
<400> 13
gagtggaagc ttcctcacga cacctgaaat ggaag 35
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hspa5-NotI-F
<400> 14
ggggggcggc cgctatagcc caggcacaca tgaacttg 38
<210> 15
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hspa5-XbaI-R
<400> 15
gggggtctag acttgccggc gctgtgggcc agtgct 36
<210> 16
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hEF1a-NotI-F
<400> 16
gagtgggcgg ccgcgaattg gctccggtgc ccgtcagtg 39
<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hEF1a-NheI-R
<400> 17
gagtgggcta gccctcacga cacctgaaat ggaag 35
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HC-F
<400> 18
tggctgaacg gcaaagagta 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HC-R
<400> 19
ttggccttgg agatggtctt 20
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gapdh-F
<400> 20
gtattggacg cctggttacc ag 22
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gapdh-R
<400> 21
agtcatactg gaacatgtag ac 22
<210> 22
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hRPS7-XhoI-F
<400> 22
gggggctcga gtgtatatta acagcacatt a 31
<210> 23
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hRPS7-HindIII-R
<400> 23
gggggaagct tcggctttct cctgggagaa c 31
<210> 24
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hspa5-NotI-2500F
<400> 24
ggggggcggc cgctggtcgg tggttaagag cac 33
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hspa5-NotI-2000F
<400> 25
ggggggcggc cgctcccaac tggacacagt aat 33
<210> 26
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hspa5-NotI-1500F
<400> 26
ggggggcggc cgcaattcta cctgtaccac tca 33
<210> 27
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hspa5-NotI-1100F
<400> 27
ggggggcggc cgccgggaac attatggggc gac 33
<210> 28
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hspa5-NotI-600F
<400> 28
ggggggcggc cgcggaactg acacgcagac ccc 33
<210> 29
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hspa5-人-NotI-F
<400> 29
gtgttgcggc cgcacagtag ggaggggact cagagc 36
<210> 30
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hspa5-人-NheI-R
<400> 30
gtggggctag ccttgccagc cagttgggca gcag 34
<210> 31
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hspa5-小鼠-NotI-F
<400> 31
ggtgggcggc cgcatggtgg aaagtgctcg tttgacc 37
<210> 32
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hspa5-小鼠-XbaI-R
<400> 32
ggtggtctag agccggcgct gaggaccagt cgctc 35
<210> 33
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hspa5-大鼠-NotI-F
<400> 33
ggtgagcggc cgcctcaacg gagaagggct ccggac 36
<210> 34
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hspa5-大鼠-XbaI-R
<400> 34
ggtaggtcta gacttgccgg cgctgtggac cagtc 35
<210> 35
<211> 8450
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 35
attttgcttg aaaggatagc atcaaggaag tgaaatgaca acccacagaa tgagagataa 60
tttttgcaaa tcatgtatct gataagggac ctgtagtcag aatatgcaaa gaacccttac 120
aattcaataa gacaacccaa tttaaaaaca ggcaaaggat gtgaataggc atttctccaa 180
agatacggaa aaacggccaa taagcacata aaaagatgct caaaatcatt tgccatttgg 240
gaaatgcaat caaaaccaca atgaggtatc acttcacgcc cattagggtg gctatagatc 300
agaaagtcag ataacatgtg ttggcaagca catggaaaca ctgaagtcct tacacactgc 360
tggtaggaat gtaaaatggt gcagccactg tggaaaacag ttttccaatt tctcaaaatg 420
ttaaacacag ttatcataca cccaagcaat tctactctta ggtatatacc caagagaaat 480
gaaaacatat gtcttcacca gaacttgctg ttcacagcag cattatgcat aatagaccaa 540
aagtggaaac aactcaactg cccatcaact ggtgaatgga taagtaaaat gtgatgtaac 600
cagtcattgg actgtcattc attaataaaa agaacaaggt actgattcat gttctaacat 660
gagtgaatct tgaaaacact atgctaaatt aaagaagcca gtcacaaaag gccgtgtatt 720
gcatgatttt atatatacat gaacttttat atatatataa ttatatatat tatatataat 780
tttatatata taaatttcta tatataaata tataaaatca tatatatgat atatattttt 840
tcatatacat catatatatt tacaaaaatt atatatcata tatcatatga tatatgagat 900
atatatcatg atatatatga tatatgatat atatcatatg agatatatga tatcatgaga 960
tatatgatat catatgatat atatgatata gatatcatat gatatatata taatatatat 1020
atgatagata tattatatat gatagatatg atagatatca tattatatat gatagatatg 1080
atagatatca tattatatat gatagatata gatatcatat tatatatgat agatatgata 1140
gatatcatat tatatatgat agatatgata gatatcatat tatatatgat agatatgata 1200
gatatcatat tatatatgat agatatgata gatatcatat tatatatgat agatatgata 1260
gatatcatat tatatatgat agatatgata gatatcatat tatatatgat agatatgata 1320
gatatcatat tatatatgat agatatgata gatatcatat tatatatgat agatatgata 1380
gatatcatat tatatatgat agatatgata gatatcatat tatatatgat agatatgata 1440
gatatcatat tatatatgat atcatatata taccacatac atcatatata catcatatat 1500
acatcatata tatcatacat atatatgaac tttccagaat aggtatatca ataaagacag 1560
gaagtataca agtggttgcc acagcctgag aggagcaggg aatggtgagt gactgctaat 1620
ggatatggca ctttttttgg ggggtgatga aaatgttctg gtcagacaat ggcaattaca 1680
aaactgtata cacacgaaaa accaaagaat cacacacttt aaaagggagg atttagctcg 1740
gcatggtggc atgcgcctgt actcccagtt actcgggagg ctgaagcagg actgcttaga 1800
gcccaggact tcaaggctgc agcgagctat gatcgctcca ctgcactcca acaaggatga 1860
cagtgcgaga cccgttttct aaataataat aataataata ataataaata acccaaggta 1920
cccagttcac atgcaaaacc actggtaaac ataaattatc tccaagtaat ctagaaagaa 1980
aatgagcaca taagacgtct tctaaaaaca cacatatatt tctttacatg ttacatttaa 2040
cgtaaaaatc agctatgcag aagttacatg aacattttat gttggaaagg taaatgacta 2100
ttattaatac agaatggtta agtacattta tgtttttatg tacaaacgca taaaaggaaa 2160
agcatcctta aaataaacac catcaatggc tcctcggtgg tcacaaaaca aaatcctcac 2220
acctttgtct tccttcacaa ttgagcttta tccacctttt caggcttatc tcccattatt 2280
acctgacaca aacttgggtg ggccagagtt tccactgacc atcccccgac tattcatcca 2340
acactatgtt cactgcctcc cattcctgac catttgcctt ttgtcttcaa ctaattctgg 2400
ggacgttttg tccaaataaa tgatccatat tcttgaaggc tggaatcaag tcctattaca 2460
aatatatttt ctcaccctct ccagagcata gcaacccagc atctactggc ctctcacagc 2520
tctaaccatc cacaacccta agctggcttc tcatcaaacg ggtacttttc accacccaaa 2580
ttcaattaat tcactcttac aataatgaag aatagtcgcc tacagcctac cttttccagc 2640
cttgattcaa tcatttatca attttatctt caaagtccct cacttcaggg agatgatata 2700
tcagctttca cccagagtcc taaagaaaac agcactcttg ccaatgacat agtgccacct 2760
agtggcaaca taaggtaaat cacagtggca gtagaaggat ctccacacta cttttacagg 2820
aatgcactgc aggtaaaaaa taagaagcta cagtactgtt tggcaggaca atttgtttca 2880
tacgtgcata ctatcgccct gactaaatta actcgcaagt cttacaggta ttatttgttt 2940
tcagttccat gcacagatta gccatttagt acttactaaa tcaaactcaa tttctgaagt 3000
gtcttacacc aatatattca tgcacatatg gttaaaattt tccttgagga tctatcatgt 3060
gagagtgtgg cttattataa caagtaaaca gaacaaataa atacaaaatg aaaagaaatc 3120
gtatgattta ctcgcatata agggagcttg ttgtggatta agtttcatga cccaggacac 3180
tgaaacagaa atggaataaa tgagaataaa attaaaagtt gtcatcaaaa atatagaagc 3240
catctaaaga cctaggtgtc aagcatagct ctatgagtac aatcccgtgc ctgagattac 3300
catatgccca gctgtatgct atacactaag agatttagga aggaagcggg gtcagggatt 3360
gaccccagac tccatctttt caagtgggga agaaagatct tccgattgaa aaataaaggc 3420
aaaaaaggct tcaccgtcac agaagtttca acaaccaaca ggatatttaa aacagttatc 3480
aaagcaaaac cattgtatgt tcacttacat ttttacatag tccctcaaac tcacaaaatg 3540
ctgtttactc agggacttct tccggtctta ctagggagcc tggaaagtga cgggaggatt 3600
gcaagggacc actagaaccc tcttcctcaa ttccccttct ctgagaaggg aggctacagc 3660
ttgcctctct aaccactaaa aggcatgacc ctcctcaaag ttaatagccg gattccctga 3720
tagatatttt cactaaatga attctcataa aactctcact aagatttaga gaaggcttcc 3780
agggttgaat tcctgaacat taagaacagc atgtttttta aaagtttaac ttggtgattg 3840
gaccaggact tcatctaggc tatgaatgct cagaatggta ggtcctttac caaacagctt 3900
gagtttgtgt ataaagtgat ctcatcctct taagagtcag agaaacagaa ccaagcgact 3960
tcactataat ttgatctgag gaagtttctt actcacaata ggtaaatgaa ggcacatact 4020
aaccagcaat ataaacaaca atatcaagtg tcattcacac atgcaaaaaa cagacaaaat 4080
cccaaactct gtgttctaac aaatcgcaaa aacctcacta acaataaatt gaaatgacca 4140
aatgtttgga ctgaaaagca atgccttggt agcctagcca tgcctaactc aaataacaga 4200
accatctcga tgttaaaatc ctcacagatc aagctgtgta tgtctcgggt caagacttcg 4260
ccaaaaagca gtgagcacac acttaagagg gaaaaaatct acctcagcct cctaaatgca 4320
atcatctcta cacgagttgc aggccccaag cttcaacgtg ttctgctgga caacgcagta 4380
gaaagctgac aagcaggtgg ccttcccaca ctgactgaac cacctccatg cccatgtcca 4440
ttcattttct tgcccacccc atgtgctata acagacctcc tggctcaggg cactctttcc 4500
ttcctgactg ccttcactta atgactttgt acttttaggt gcaaaaatta tctgcagaaa 4560
tccacactga aaaccaagct tgagaaaggc agcaataacc aacattttta caagaagaac 4620
aaggtcaata tcaagcccat cagattcaaa tagcaagcat ggatgaaaat gaaagattga 4680
aaggcttgag tgccttctta atgtattaaa tatccattta atttacaatt aagctcactg 4740
tgctcactgg ccttttaatc agctttccag gtcctgctca gacttgccta ggacatggga 4800
atgaaagaac ctatacattt atggaccaat ctaccttaac taacttgtca agtgttcctg 4860
catcaagcag aagaaacatc agtgaaactg atacaggaat taaccccttg ttaatccata 4920
aaacttaaag gagcgggatc caatcttctg gcttccctgg gccacgctgg aagaagaatt 4980
gtcttgcgcc acacataaaa tacacgaaca ctaataatag ctgctaagct ttaaaaaaat 5040
tgcaaaaaag gaaaatctca taattttttg tttgttgtga ggtggagcct cactctgtca 5100
cccaggccgg agtgcagtgg caccatcttg gctcactgca acctctgcct cctgggttca 5160
agccattctc ctgcctcagc ctcccgagta gctgggatga taggcgtgtg ccaccatgcc 5220
cagctaattt tcgtattttt agtagagacg gggtttcacc atgttggcca ggctggtctc 5280
aaactcctga cctcaggtga tccacccacc tcggcctccc aaagtgctgg gattacaggt 5340
gtgagccacc gtgcccggcc aatgttttaa gaacgtttac gaatttgtat tgggccacat 5400
tcaaagcctt cacaggctgc atgcagcctg caggccgcgg ttggacaagc ttggattaga 5460
gaaatctaca gagacaaact agtgacttag tagccctctg atagctcatg atttgcaaga 5520
aacttaggat gactatgtgt aaagaccaca aacatcaatt taactgaatg gttcccgcca 5580
cactggaatg aggaagctga gcaaactcag aggactctaa gaaagggctg atgtcatctg 5640
aactgttcgg aattataaac tcctctaaac atgtttcaaa gccagaactt gtaggagttg 5700
ttctgataca cggattaaaa gagggatgac aaagtgtctg tcccccacac tggtcaaagg 5760
gacaggtcat tgttatgctg gcaatgcagg ctgctgaaaa gaatgtatct gtcaaaagta 5820
atcaaagtaa tgaccccaga aggctccaga aacagactgg taaattcagg ttgctttcag 5880
acttccacaa tgctggcaca caaggggaaa gacaaaacta acatttacag agcattatat 5940
ttgatattac atttaatccc cattaaaaag atactatttc ccgtttcact agtgaaaaag 6000
ttgatctttc aaaggttaaa ttatttaaca ccaaggtcaa agggtaagtt ggagagacca 6060
gattcaaacc cagtctgaca ttaaaacatg tgttttcccc ccacatcgtc tcctgctaat 6120
aacctcaaat ctaaaaactg acttgcccta caccttgagc cccatcctac aaactctccc 6180
tgacgttatt aattcagctg tcactgtgca cctacaacgt gccagacacc atactcctca 6240
acactctgta ggcacagaag gaacagataa aaatccctac cttcatagat attattctag 6300
gggtaacaca ggtaaataaa acattaaaat agttttcaca tagtagcaaa ttccatatag 6360
caaaataaaa cagaagaagg aatagcaaat gagggagatg ccctcttaaa catggtgctg 6420
agggaaggcc tccctgagaa agatatcatt taccccaaaa ataaaaaagc aagtaataga 6480
aaaaacaggt aaaaggtgtt ctagacactt aaacctgcca cattgagaac tcagggttct 6540
gatgcaaaac ctcgctgcat agaatgcatt aacttatttt tatacattta aacaaacaaa 6600
ctctacttaa gaactgtgtt ctaaaggaag gagcatatta caggaaggca atttttggtc 6660
agagtagaca cacttaaaaa ctaaacctat tgaaagacca agaacaactg aaagtctttg 6720
ctttgtcaga tttttgacca aaaggaaaat taaagaaaca caccgtgccc atccaatgat 6780
ttcaccaagg aattttaaga gagaaaatcc tacttcttcc tcacccagta gccagtgaaa 6840
tgactgagca aattcacaag ttcactgggg ctgctttcat gtaacacagg gacaacacat 6900
gacagacaca gtggaaccct acaggttgcc tagtatttga aagactgtga agaggaggag 6960
atgtcaaaat tcaaagtctt aaatgatgta gttttaagta tgttcagcaa tttcaccact 7020
cagtagtaaa gccagctaca gttgaaagca atcagaaatt tgaggggtgt gaaataagca 7080
gaagcacaga agttaaggat ttgtattctt cccacatttt ccactttatt ttatactgct 7140
gagaaaaaac aaatttaata gttttctgct gtataagaga gacacattca ctttatgtca 7200
cagtaagagt cactcaattt taatacaact atctcaatgt ataaattaac attctccccc 7260
ctgcccacac atagtaagtc tcttatgatg ttgctgatta gagaagcaaa agttgccgct 7320
acaattctct tcctgcattt taatataaac aatcatcagt cttttcttca tagagtgcag 7380
tgtgggcact atcatcagaa tgtaccagca ctgggtgtgc aaagtttaca aagattagca 7440
agagcaaaag tgttgagatt tttgaaattc atgctgctgc aaagaagtat gtaaaaactc 7500
actcaccata gaggaccaca cagaaactca ggcatgaagt tatatggctg tgtgagtggt 7560
ttgggagaag gaacggaaag cacttccacc aacctatatg cctgagcaaa ttaatgcaaa 7620
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ttctaagcac ttctcaattg taaccaagag ataatacttt ttatgaattc ttaaagttat 5280
caacagatac tcaaagtttt agcaaagtct aaatgatatt aagcttgtcc ttattgccca 5340
agtgacttca atgactattt gttaattgca accaagggtc attttttaaa tgaatatata 5400
ttattattat atatataata ttaaggtcct caaataccta aaagtttagc aaaatctaaa 5460
taatattgtg catattcttt tattactgta ttagtccgtt ttcatgttgc tgataaagac 5520
atacccaaga ctgggcaatt tacaaaagaa agaggttcac tggactcaca gttccacgtg 5580
gctggggagg cctcacaatc acggcagctt acgggattgt tgagaaatga cacttctcaa 5640
gctggggcta aactatctct gtggtagttg ttctgattca agtattgaat tggttttttt 5700
tgtttttttt gagatggagt ttcgttcttg ttgcccaggc tggagtgcaa tggcacgatc 5760
tcagctcacc gcaacctctg cctcccgggt tcaagtgatt ctcctgcttc agcctcccaa 5820
gtagctggga ctacaggcat gagccaccac acccagctaa ttttgtattt ttagtagaga 5880
catggtttct ccatgttggt caggctggtc tcaaactccc aacctcaggt gatccacctg 5940
ccttggcctc ctaaagtgct gggattacag gcataagcca ccgtgcccgg ctggagcatt 6000
ggtatataaa agctgcctag gtaactctaa cctttggccc catacatctg aaggatacct 6060
acaatgcacc tgaaaaatgc aactgaaaca gtagttccct gggaccacac actcagaaag 6120
ggggtgtatc aggagatcta gggaccagga gggtggaaga cctaaggcag cactacagat 6180
gatggagaaa aacccactgg ggaggggcga tcctaacctt gagaatcact gagatcatgc 6240
agaagtattt gatcctacag cattaatatt gtattgtatt gtattagtat atatatatag 6300
tgtatatata tagtattagt atatatattg tattgtatta gcatatatat actaattgta 6360
ttgtattgta tttatatata tagtattgta ttagtatata tatacagtat atatgtatat 6420
atactaatac aatgtactaa tacaatacaa taccatatat atatacacta acacaataca 6480
attagtatat atatatatat atatactaat acaatacaat actatatata tactaataca 6540
atatatacat atatactcac caagacatat tagtggtctg atgtctggct gccacactca 6600
tcttctacct tcagctctgc tctaccaaat atcatttgtt tctgggatct ttgcagtcca 6660
aggaacttca tccttgatat cccacccctt actaactttt tttttttttt ttttttttga 6720
gacggagtct cgctgtgtca cccaggctgg agtgcagtgg tgtgatctcg gctcactgca 6780
agctccacct cctgggatca caccattctc ctgcctcagc ctcccaagta gctgggacta 6840
caggtgcccg ccaccacacc aggctaatgt tttaccgtgt tagcaaggat ggtctcgatc 6900
tcctgacctc atgatccatc cgccttggcc tcctaaagtg ctgggattac aggcataagc 6960
caccgcaccc ggccacccct tactaatttt tagtaacgtc caaggattaa aggaaatttg 7020
ccttacctat ttaacaggaa tcaacagggt taatctcact ccctttctaa aaataattta 7080
taaacattgc agacaatctc atctatccct gtctaaactg tgtggaatta ctgccattta 7140
atgtaatcag tctactcatt tagtttgcct aaggaatttt tgaaaaaaca gttaaatgaa 7200
tgacttaatg gaataaccag gaagttgaag tctccaatag taagaatgaa ctcttgctct 7260
ctggataatc aaatgggtcc ttcctccttc aggtagatca tgccatttcc tcacttacac 7320
tgaacaggta aacaacataa ttactgactt caacttctag ttaattcctt cttttatcac 7380
tgagtatcct ttggctggga gttttgttgg ctatgctgcc attttttcta gttatcacag 7440
tcctataaca taccaatcct tcaatataac tcatctttaa attgtggttt taccttctca 7500
agaagttatt aattatgcca gtgctaaatc ttctaaaatg attgttgact tgttgattag 7560
cccccatgca attcccctct cccgtccctc agcacgtaag gaatggccct ttgcttactt 7620
ccacagatcc ttaaatctac cagttagaag ctaatagcct acctctctac caggaaggaa 7680
ctgtgggctg gaacataata catgttgact tataatttct tagaaaattg tgtgagaaac 7740
atcaaactcc tgattccagg atatgccaaa gacacatcat taaaaagcaa aacaaaacaa 7800
aacaaacctc atttgacgtt gctagtagtg gcatatttca tcaagatcag ctcaaataaa 7860
tagaagtgag attttcacac aaattagact gtagtgcttt tttttttaac ttatctttac 7920
catatgattt ttaacggtaa aaaaaatcgt ttgagatatt agatgtataa tatttatcat 7980
ccaattactt cattagttca atcttttttc aatggcgctc ctgcatctga gaataaggtc 8040
agaaaatttc atgttctgat ttcatgctga ttttcagaag aaaaatgtta gttttgtata 8100
gaataaccca tcctaagaaa tacatttctt attatatttc ttatcttata tttcttagga 8160
caatgagcta ttcaaagggt gatgataacc agcaccatca gtcagcatta tctaagaata 8220
agaatctgtg tttctacata cagacctcct aaaaaggaac ctacacttaa caggattccc 8280
caggcaattt ggatgcacat taaagcttga gcaacactgc attagaaagt tagttttcca 8340
tcacaaaaac agtaacaaaa ggaatataaa gtaagttact ttaataatat aagaagaggg 8400
gcaggccggg cgcagtggct cacgcctgta atcccagcac tttgggaggc tgaggcgggt 8460
ggatcacctg aggtc 8475

Claims (25)

1. 由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或该核苷酸序列的部分序列组成的多核苷酸，该多核苷酸是中国仓鼠来源的Hspa5基因启动子，并且包含由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列组成的多核苷酸。
2. 根据权利要求1的多核苷酸，其由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列组成。
3. 根据权利要求1的多核苷酸，其由SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列组成。
4. 根据权利要求1的多核苷酸，其由SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列组成。
5. 根据权利要求1的多核苷酸，其由SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列组成。
6. 根据权利要求1的多核苷酸，其由SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列组成。
7. 根据权利要求1的多核苷酸，其由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列组成。
8. 由序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，该多核苷酸是人来源的Hspa5基因启动子。
9. 由序列表中SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，该多核苷酸是小鼠来源的Hspa5基因启动子。
10. 由序列表中SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，该多核苷酸是大鼠来源的Hspa5基因启动子。
11.一种多核苷酸，其由与根据权利要求1-10中任一项的核苷酸序列具有95％或更高同一性的核苷酸序列组成，所述多核苷酸具有启动子活性。
12.一种多核苷酸，其由与根据权利要求1-10中任一项的核苷酸序列具有99％或更高同一性的核苷酸序列组成，所述多核苷酸具有启动子活性。
13.一种多核苷酸，其在严格条件下与由与根据权利要求1-12中任一项的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，该多核苷酸具有启动子活性。
14.外源基因表达单位，其包含根据权利要求1-13中任一项的多核苷酸。
15.根据权利要求14的外源基因表达单位，其中，所述外源基因是编码多聚体蛋白质的基因。
16.根据权利要求14的外源基因表达单位，其中，所述外源基因是编码异源多聚蛋白质的基因。
17.根据权利要求14的外源基因表达单位，其中，所述外源基因是编码抗体或其抗原结合片段的基因。
18.一种外源基因表达载体，其包含根据权利要求14-17中任一项的外源基因表达单位。
19. 一种外源基因表达载体，其包含根据权利要求14-17中任一项的外源基因表达单位和选自下述A组的多核苷酸（a）-（e）的任意一种或多种多核苷酸：
A组
（a）由序列表中SEQ ID NO：35所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，
（b）由序列表中SEQ ID NO：36所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，
（c）由序列表中SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，
（d）由与多核苷酸（a）-（c）中任一种的核苷酸序列具有95％或更高同一性的核苷酸序列组成的多核苷酸，该多核苷酸具有外源基因表达增强活性，和
（e）由与多核苷酸（a）-（c）中任一种的核苷酸序列具有99％或更高同一性的核苷酸序列组成的多核苷酸，该多核苷酸具有外源基因表达增强活性。
20.转化的细胞，已向其中引入了根据权利要求18或19的外源基因表达载体。
21.根据权利要求20的转化的细胞，其中，所述细胞是来源于哺乳动物的培养的细胞。
22.根据权利要求21的转化的细胞，其中，所述来源于哺乳动物的培养的细胞是COS-1细胞、293细胞或CHO细胞。
23.一种生产外源基因衍生的蛋白质的方法，包括培养根据权利要求20-22中任一项的转化的细胞，和从培养物中获得外源基因衍生的蛋白质。
24.根据权利要求1-13中任一项的多核苷酸为了在转化的细胞中表达外源基因的用途。
25.根据权利要求18或19的外源基因表达载体为了在转化的细胞中表达外源基因的用途。
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