KR20190056378A - Hspa5 유전자의 프로모터 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 포유 동물 유래의 배양 세포 등의 숙주 세포에 있어서, 단백질성 의약품이 되는 외래 단백질의 산생을 항진시키는 수단을 제공한다. 신규 Hspa5 유전자의 프로모터를 갖는 형질 전환 세포, 그 형질 전환 숙주 세포를 이용하여, 외래 단백질을 고분비 생산하는 방법이 제공된다.

Description

Hspa5 유전자의 프로모터
본 발명은, Hspa5 유전자의 프로모터를 갖는 외래 유전자 발현 벡터로 포유 동물 숙주 세포를 형질 전환하여 구축한 포유 동물 세포를 이용한 그 외래 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
유전자 재조합 기술의 발전에 의해, 치료용 단백질이나 항체 의약과 같은 단백질성 의약품이 급속히 그 시장을 확대하고 있다. 그 중에서도, 항체 의약은 인체에 투여해도 유해한 면역 반응을 일으키지 않고, 그 높은 특이성으로부터 개발이 활발히 진행되고 있다.
항체 의약으로 대표되는 단백질성 의약을 생산시키는 숙주로는, 미생물이나 효모, 곤충, 동식물 세포, 트랜스제닉 동식물 등을 들 수 있다. 단백질성 의약의 생리 활성이나 항원성에는, 폴딩이나 당사슬 수식과 같은 번역 후 수식이 필수이기 때문에, 복잡한 번역 후 수식을 실시할 수 없는 미생물이나 당사슬 구조가 크게 상이한 식물은 숙주로서 적합하지 않다. 인간과 유사한 당사슬 구조를 갖고, 번역 후 수식이 가능, 나아가서는 안전성의 면을 고려하여, CHO 세포 (Chinese Hamster Ovary : 차이니즈 햄스터의 난소) 등의 포유 동물 배양 세포가 현재의 주류가 되어 있다.
포유 동물 배양 세포를 숙주로 하는 경우, 미생물 등과 비교해, 낮은 증식 속도, 낮은 생산성, 고가의 비용 등의 문제를 안고 있다 (비특허문헌 1). 또, 단백질성 의약품을 임상에서 이용하기 위해서는 대량의 투여가 필요로 되기 때문에, 세계적으로도 그 생산 능력의 부족이 문제가 되고 있다. 포유류 배양 세포 발현계로 단백질성 의약품을 제조하는 경우, 합성 저분자 의약품에 비해 제조 비용이 높기 때문에, 각 제조 공정의 개량에 의해 제조 비용의 저감이 도모되고 있지만, 포유류 배양 세포 발현계에 있어서의 생산량의 향상도 제조 비용 저감의 유력한 방법이다 (비특허문헌 2, 3). 그래서, 포유 동물 배양 세포에 있어서의 외래 유전자의 생산성을 향상시키기 위해, 지금까지 프로모터나 인핸서, 약제 선택 마커, 유전자 증폭, 배양 공학적 수법 등 많은 어프로치가 시행 착오되어 오고 있다. CHO 세포를 숙주 세포로서 사용하는 경우, 외래 유전자의 발현, 즉 단백질성 의약품의 생산에는 바이러스 유래의 인간 사이토메갈로바이러스 주요 초기 발현 프로모터 (Human cytomegalovirus major immediate early promoter) (이하 CMV 프로모터) 가 일반적으로 이용되고 있다 (비특허문헌 4, 5, 6). 또, CHO 세포에 있어서, 신장 인자-1 알파인 EF-1α (특허문헌 1, 비특허문헌 7), 인간 리보솜 단백질 유전자인 RPL32 나 RPS11 의 전사 개시점의 상류역의 폴리뉴클레오티드 (프로모터 영역) 를 단독 또는 다른 이종 (異種) 프로모터와 조합하여 단백질 발현에 사용할 수 있는 것이 알려져 있다 (비특허문헌 8, 특허문헌 2). 그러나, 이들 프로모터는, 숙주가 되는 포유 동물 배양 세포의 세포 내의 생리 상황에 응답하여 하류의 외래 유전자의 발현을 조정하고 있어, 대부분은 포유 동물 배양 세포의 증식이 활발한 대수 증식기에 그 활성이 최대가 된다. 따라서, 최대 세포 밀도 도달 이후의 정상기에서는, 그 발현 조절 기능은 감약되는 경우가 많기 때문에, 포유 동물 배양 세포의 배양 기간을 통해 외래 유전자의 강력한 발현이 가능한 프로모터의 개발이 요망되고 있다.
일본 특허 제3051411호 WO2013/080934
Florian M. Wurm., Nat. Biotechnol. 22(11) : 1393-1398, 2004 Farid SS., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 848(1) : 8-18, 2007 Werner RG. Economic aspects of commercial manufacture of biopharmaceuticals. J Biotechnol. 113 (1-3) : 171-182, 2004 Durocher Y et al., Curr Opin Biotechnol. 20(6) : 700-707, 2009 Boshart M et al., Cell. 41(2) : 521-530, 1985 Foecking MK et al., Gene. 45(1) : 101-105, 1986 Deer JR. and Allison DS., Biotechnol. Prog. 20 : 880-889, 2004 Hoeksema F. et al., Biotechnology Research International, Volume 2011, Article ID 492875, 11 pages Okumura T et al., J Biosci Bioeng., 120(3) : 340-346, 2015 Langmead B et al., Genome Biology. 10 : 1186, 2009 Mortazavi A et al., Nature Methods. 5 : 621-628, 2008
본 발명의 과제는, 포유 동물 배양 세포 등의 숙주 세포에 있어서, 높은 외래 유전자 발현 항진 활성을 갖는 프로모터를 사용하여, 단백질성 의약품이 되는 외래 단백질의 생산량을 항진시키는 수단을 제공하는 것에 있다. CHO 세포 등에 있어서 인간 EF-1α 프로모터와 동일한 정도 이상의 프로모터 활성을 갖고, 또한 포유 동물 배양 세포의 대수 증식기부터 정상기까지의 광범위한 기간에 있어서 높은 프로모터 활성을 유지하는 프로모터를 찾아냄으로써, 포유 동물 세포가 안정적으로 외래 유전자의 고발현을 달성하는 수단을 제공하여, 포유류 배양 세포 발현계에 있어서의 단백질 생의약품의 생산량 향상, 즉 제조 비용 저감에 공헌하는 수단을 제공할 수 있다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, 열 충격 단백질 A5 (Hspa5/GRP78) 유전자의 개시 코돈의 상류 약 3 kbp 의 폴리뉴클레오티드가, 우수한 프로모터 활성을 가져, 포유 동물 배양 세포에 있어서 발현 대상이 되는 외래 단백질의 생산성을 현저하게 향상시키는 것이 가능한 것을 알아내어, 본 발명을 완성시켰다. 즉, 본 발명은 이하의 발명을 포함한다.
(1) 차이니즈 햄스터 유래 Hspa5 유전자의 프로모터로서, 서열 번호 9 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 서열 번호 1 에 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 그 뉴클레오티드 서열의 부분 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
(2) 서열 번호 1 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는, 상기 (1) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.
(3) 서열 번호 5 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는, 상기 (1) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.
(4) 서열 번호 6 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는, 상기 (1) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.
(5) 서열 번호 7 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는, 상기 (1) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.
(6) 서열 번호 8 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는, 상기 (1) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.
(7) 서열 번호 9 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는, 상기 (1) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.
(8) 인간 유래 Hspa5 유전자의 프로모터인, 서열표의 서열 번호 2 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
(9) 마우스 유래 Hspa5 유전자의 프로모터인, 서열표의 서열 번호 3 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
(10) 랫트 유래 Hspa5 유전자의 프로모터인, 서열표의 서열 번호 4 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
(11) 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열에 대해 95 ％ 이상 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드로서, 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드.
(12) 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열에 대해 99 ％ 이상 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드로서, 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드.
(13) 상기 (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드로서, 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드.
(14) 상기 (1) 내지 (13) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 이루어지는, 외래 유전자 발현 유닛.
(15) 외래 유전자가 다량체 단백질을 코드하는 유전자인, 상기 (14) 에 기재된 외래 유전자 발현 유닛.
(16) 외래 유전자가 헤테로 다량체 단백질을 코드하는 유전자인, 상기 (14) 에 기재된 외래 유전자 발현 유닛.
(17) 외래 유전자가 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 코드하는 유전자인, 상기 (14) 에 기재된 외래 유전자 발현 유닛.
(18) 상기 (14) 내지 (17) 중 어느 하나에 기재된 외래 유전자 발현 유닛을 포함하는 외래 유전자 발현 벡터.
(19) 상기 (14) 내지 (17) 중 어느 하나에 기재된 외래 유전자 발현 유닛 및 하기 A 군의 (a) 내지 (e) 에 기재된 폴리뉴클레오티드에서 선택되는 어느 하나 또는 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 외래 유전자 발현 벡터 ;
A 군
(a) 서열표의 서열 번호 35 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드,
(b) 서열표의 서열 번호 36 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드,
(c) 서열표의 서열 번호 37 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드,
(d) 상기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열에 대해 95 ％ 이상 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드이고, 외래 유전자 발현 항진 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드,
(e) 상기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열에 대해 99 ％ 이상 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드이고, 외래 유전자 발현 항진 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드.
(20) 상기 (18) 또는 (19) 에 기재된 외래 유전자 발현 벡터가 도입된 형질 전환 세포.
(21) 세포가 포유 동물 유래의 배양 세포인, 상기 (20) 에 기재된 형질 전환 세포.
(22) 포유 동물 유래의 배양 세포가, COS-1 세포, 293 세포, 또는 CHO 세포인, 상기 (21) 에 기재된 형질 전환 세포.
(23) 상기 (20) 내지 (22) 중 어느 하나에 기재된 형질 전환 세포를 배양하고, 배양물로부터 외래 유전자 유래의 단백질을 취득하는 것을 특징으로 하는, 그 단백질의 제조 방법.
(24) 형질 전환 세포에 있어서 외래 유전자를 발현시키는 것을 목적으로 하는, 상기 (1) 내지 (13) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드의 사용.
(25) 형질 전환 세포에 있어서 외래 유전자를 발현시키는 것을 목적으로 하는, 상기 (18) 또는 (19) 에 기재된 외래 유전자 발현 벡터의 사용.
본 발명의 외래 유전자의 제조 방법에 의해, 치료용 단백질이나 항체 등의 외래 유전자의 발현을 현저하게 항진하는 것이 가능하게 된다. 또, 본 발명의 프로모터는, DNA 엘리먼트와 조합함으로써, 치료용 단백질이나 항체 등의 외래 유전자의 발현을 더욱 항진하는 것이 가능하게 된다.
도 1A 는 1 L 배양조 (Jar) 를 사용한 인간화 항체 X 발현주 X＃1 및 X＃2 의 유가 배양 결과를 나타냈다. 도 1A 는 생세포수의 시간 경과적 변화를 나타낸다.
도 1B 는 1 L 배양조를 사용한 인간화 항체 X 발현주 X＃1 및 X＃2 의 유가 배양 결과를 나타냈다. 도 1B 는 생산량의 시간 경과적 변화를 나타낸다.
도 2A 는 유가 배양의 각 샘플링일에서의 각 유전자의 발현량을 나타냈다. 도 2A 는, 배양조＃1 의 결과를 나타내고, 배양조＃1 의 4 일째의 세포에 있어서의 발현량 상위 20 유전자를 플롯하였다.
도 2B 는 유가 배양의 각 샘플링일에서의 각 유전자의 발현량을 나타냈다. 도 2B 는, 배양조＃2 의 결과를 나타내고, 배양조＃1 의 4 일째의 세포에 있어서의 발현량 상위 20 유전자를 플롯하였다.
도 2C 는 유가 배양의 각 샘플링일에서의 각 유전자의 발현량을 나타냈다. 도 2C 는, 배양조＃3 의 결과를 나타내고, 배양조＃1 의 4 일째의 세포에 있어서의 발현량 상위 20 유전자를 플롯하였다.
도 3 은 각 프로모터를 삽입한 파이어플라이 루시페라아제 발현 벡터로 트랜스펙션하고, 그 1 일 후에 측정한 파이어플라이 루시페라아제 (luc2) 의 발광량을 레닐라 루시페라아제 (Rluc) 의 발광량으로 표준화한 값을 나타낸 도면이다.
도 4 는 항체 H 사슬 및 L 사슬 유전자의 프로모터로서 Hspa5 유전자, 인간 RPS7 유전자, 혹은 인간 EF1-α 유전자 유래의 프로모터를 사용한, 인간화 항체 유전자 Y 발현 벡터 pDSLHA4.1-Hspa5-Y, pDSLHA4.1-hRPS7-Y, 및 pDSLHA4.1-hEF1α-Y 의 개략도이다.
도 5A 는 인간화 항체 Y 발현 안정적 풀을 사용한 유가 배양에서, Hspa5 유전자 프로모터에 의해 발현된 항체 생산량을, 인간 RPS7 유전자 프로모터, 혹은 인간 EF1-α 유전자 프로모터와 비교한 도면이다. 도 5A 는, 각 샘플링일에 있어서의 생세포수를 나타낸다.
도 5B 는 인간화 항체 Y 발현 안정적 풀을 사용한 유가 배양에서, Hspa5 유전자 프로모터에 의해 발현된 항체 생산량을, 인간 RPS7 유전자 프로모터, 혹은 인간 EF1-α 유전자 프로모터와 비교한 도면이다. 도 5B 는, 각 샘플링일에 있어서의 생산량을 나타낸다.
도 5C 는 인간화 항체 Y 발현 안정적 풀을 사용한 유가 배양에서, Hspa5 유전자 프로모터에 의해 발현된 항체 생산량을, 인간 RPS7 유전자 프로모터, 혹은 인간 EF1-α 유전자 프로모터와 비교한 도면이다. 도 5C 는, 각 샘플링일에 있어서의 1 세포 1 일당의 항체 생산량을 나타낸다.
도 6 은 인간화 항체 Y 발현 안정적 풀을 사용한 유가 배양에 있어서의 H 사슬 유전자의 시간 경과적인 상대 발현량을, Hspa5 유전자 프로모터와, 인간 RPS7 유전자 프로모터, 혹은 인간 EF1-α 유전자 프로모터에서 비교한 도면이다.
도 7A 는 레닐라 루시페라아제 (Rluc) 발현 안정적 풀을 사용한 유가 배양에서, Hspa5 유전자 프로모터 (3 kbp) 에 의해 발현된 레닐라 루시페라아제 생산량을, 인간 RPS7 유전자 프로모터, 혹은 인간 EF1-α 유전자 프로모터와 비교한 도면이다. 도 7A 는, 각 샘플링일에 있어서의 생세포수를 나타낸다.
도 7B 는 레닐라 루시페라아제 (Rluc) 발현 안정적 풀을 사용한 유가 배양에서, Hspa5 유전자 프로모터 (3 kbp) 에 의해 발현된 레닐라 루시페라아제 생산량을, 인간 RPS7 유전자 프로모터, 혹은 인간 EF1-α 유전자 프로모터와 비교한 도면이다. 도 7B 는, 각 샘플링일에 있어서의 103 세포당의 레닐라 루시페라아제 발광량을 나타낸다.
도 8A 는 각 프로모터 길이의 Hspa5 유전자 프로모터를 사용하여 제조한 인간화 항체 Y 발현 안정적 풀의 유가 배양에서, 항체 생산량을, 인간 RPS7 유전자 프로모터, 혹은 인간 EF1-α 유전자 프로모터와 비교한 도면이다. 도 8A 는, 각 샘플링일에 있어서의 생세포수를 나타낸다.
도 8B 는 각 프로모터 길이의 Hspa5 유전자 프로모터를 사용하여 제조한 인간화 항체 Y 발현 안정적 풀의 유가 배양에서, 항체 생산량을, 인간 RPS7 유전자 프로모터, 혹은 인간 EF1-α 유전자 프로모터와 비교한 도면이다. 도 8B 는, 각 샘플링일에 있어서의 생산량을 나타낸다.
도 8C 는 각 프로모터 길이의 Hspa5 유전자 프로모터를 사용하여 제조한 인간화 항체 Y 발현 안정적 풀의 유가 배양에서, 항체 생산량을, 인간 RPS7 유전자 프로모터, 혹은 인간 EF1-α 유전자 프로모터와 비교한 도면이다. 도 8C 는, 각 샘플링일에 있어서의 1 세포 1 일당의 항체 생산량을 나타낸다.
도 9A 는 Hspa5 유전자 프로모터 (0.6 kbp) 를 사용하여 취득한 인간화 항체 Y 발현 모노클론의 유가 배양에 의한 항체 생산량 평가 결과를 나타냈다. 도 9A 는, 각 샘플링일에 있어서의 생세포수를 나타낸다.
도 9B 는 Hspa5 유전자 프로모터 (0.6 kbp) 를 사용하여 취득한 인간화 항체 Y 발현 모노클론의 유가 배양에 의한 항체 생산량 평가 결과를 나타냈다. 도 9B 는, 각 샘플링일에 있어서의 생산량을 나타낸다.
도 9C 는 Hspa5 유전자 프로모터 (0.6 kbp) 를 사용하여 취득한 인간화 항체 Y 발현 모노클론의 유가 배양에 의한 항체 생산량 평가 결과를 나타냈다. 도 9C 는, 각 샘플링일에 있어서의 1 세포 1 일당의 항체 생산량을 나타낸다.
도 10A 는 각 생물종 유래 Hspa5 유전자 프로모터를 사용하여 제조한 인간화 항체 Y 발현 안정적 풀의 유가 배양에서, 항체 생산량을 비교한 도면이다. 도 10A 는, 각 샘플링일에 있어서의 생세포수를 나타낸다. ch 1.1 kb, ch 0.6 kb 는, 각각 차이니즈 햄스터 Hspa5 유전자 프로모터의 1.1 kbp, 0.6 kbp 의 부분 서열을 항체 발현용 프로모터에 사용하여 취득한 안정적 풀의 유가 배양 결과를 나타낸다.
도 10B 는 각 생물종 유래 Hspa5 유전자 프로모터를 사용하여 제조한 인간화 항체 Y 발현 안정적 풀의 유가 배양에서, 항체 생산량을 비교한 도면이다. 도 10B 는, 각 샘플링일에 있어서의 생산량을 나타낸다. ch 1.1 kb, ch 0.6 kb 는, 각각 차이니즈 햄스터 Hspa5 유전자 프로모터의 1.1 kbp, 0.6 kbp 의 부분 서열을 항체 발현용 프로모터에 사용하여 취득한 안정적 풀의 유가 배양 결과를 나타낸다.
도 10C 는 각 생물종 유래 Hspa5 유전자 프로모터를 사용하여 제조한 인간화 항체 Y 발현 안정적 풀의 유가 배양에서, 항체 생산량을 비교한 도면이다. 도 10C 는, 각 샘플링일에 있어서의 1 세포 1 일당의 항체 생산량을 나타낸다. ch 1.1 kb, ch 0.6 kb 는, 각각 차이니즈 햄스터 Hspa5 유전자 프로모터의 1.1 kbp, 0.6 kbp 의 부분 서열을 항체 발현용 프로모터에 사용하여 취득한 안정적 풀의 유가 배양 결과를 나타낸다.
도 11A 는 DNA 엘리먼트 A7 을 포함하는, 혹은 포함하지 않는 인간화 항체 Y 발현 벡터를 사용하여 제조한 안정적 풀의 유가 배양에서, 항체 생산량을 비교한 도면이다. 도 11A 는, 각 샘플링일에 있어서의 생세포수를 나타낸다.
도 11B 는 DNA 엘리먼트 A7 을 포함하는, 혹은 포함하지 않는 인간화 항체 Y 발현 벡터를 사용하여 제조한 안정적 풀의 유가 배양에서, 항체 생산량을 비교한 도면이다. 도 11B 는, 각 샘플링일에 있어서의 생산량을 나타낸다.
도 11C 는 DNA 엘리먼트 A7 을 포함하는, 혹은 포함하지 않는 인간화 항체 Y 발현 벡터를 사용하여 제조한 안정적 풀의 유가 배양에서, 항체 생산량을 비교한 도면이다. 도 11C 는, 각 샘플링일에 있어서의 1 세포 1 일당의 항체 생산량을 나타낸다.
도 12A 는 차이니즈 햄스터 유래 Hspa5 유전자의 프로모터인 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이다 (도 12B 에 이어진다).
도 12B 는 차이니즈 햄스터 유래 Hspa5 유전자의 프로모터인 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이다.
도 13 은 인간 유래 Hspa5 유전자의 프로모터인 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이다.
도 14 는 마우스 유래 Hspa5 유전자의 프로모터인 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이다.
도 15 는 랫트 유래 Hspa5 유전자의 프로모터인 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 명세서에 있어서 「유전자」란, mRNA 로 전사되고, 단백질로 번역되는 부분을 의미하고, DNA 뿐만 아니라 그 mRNA, cDNA 및 그 RNA 도 포함되는 것으로 한다.
본 명세서에 있어서 「폴리뉴클레오티드」란 핵산과 동일한 의미로 사용하고 있고, DNA, RNA, 프로브, 올리고뉴클레오티드, 및 프라이머도 포함되어 있다.
본 명세서에 있어서 「폴리펩티드」 와 「단백질」은 구별하지 않고 사용하고 있다.
본 명세서에 있어서 「유전자 발현」이란, 어느 유전자가 mRNA 로 전사되는 현상, 및/또는 그 mRNA 로부터 단백질이 번역되는 현상을 의미하고 있다.
본 명세서에 있어서 「외래 유전자」란, 인공적으로 숙주 세포에 도입되는 유전자를 의미하고 있다.
본 명세서에 있어서 「외래 단백질」이란, 외래 유전자에 코드되는 단백질을 의미하고 있다.
본 명세서에 있어서 「유전자 발현 유닛」이란, 전사의 리딩 프레임의 방향으로, 적어도 프로모터 영역, 외래 유전자, 전사 터미네이터 영역 (폴리 A 부가 시그널) 을 갖는 폴리뉴클레오티드를 의미하고 있다.
본 명세서에 있어서 「프로모터」란, DNA 로부터 RNA 로의 전사의 개시에 관여하는 전사 인자가 결합하는 영역을 의미한다. 본 명세서에 있어서는, 「프로모터 영역」이라고 하는 경우도 있다. 프로모터로서 예를 들어, 개시 코돈의 상류 약 3 kbp 의 뉴클레오티드부터 개시 코돈에 대응하는 뉴클레오티드 서열 직전의 뉴클레오티드까지의 폴리뉴클레오티드를 예시할 수 있고, 5'UTR, 및 인트론을 포함해도 된다.
본 명세서에 있어서 「프로모터 활성」이란, 전사 인자가 프로모터에 결합하고, 전사를 개시하고, 유전자에 코드되는 단백질의 생산을 실시하는 활성을 말하고, 파이어플라이 루시페라아제 등의 리포터 유전자에 코드되는 단백질의 활성을 지표로 하여 검정하는 것이 가능하다.
본 명세서에 있어서 「프로모터 활성을 갖는다」란, 후기 (실시예 5) 에 기재된 유가 배양에서의 항체 발현량을 지표로 한 프로모터 활성의 평가와 동일한 조건에서, 인간 EF-1α 유전자 프로모터와 동등 이상의 항체 발현량을 나타내는 것을 말한다.
본 명세서 중에 있어서 「DNA 엘리먼트」란, 유전자 발현 유닛의 근방 또는, 유전자 발현 유닛이 포함되는 외래 유전자 발현 벡터 상에 배치된 경우에, 외래 유전자 발현 항진 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
본 명세서 중에 있어서 「항체의 항원 결합성 단편」이란, 항원과의 결합 활성을 갖는 항체의 부분 단편을 의미하고 있고, Fab, F(ab')2 등을 포함하지만, 항원과의 결합능을 가지고 있는 한 이들 분자로 한정되지 않는다.
본 명세서 중에 있어서 「동일성」이란, 당해 분야에서 공지된 바와 같이, 서열의 비교에 의해 결정되는, 2 개 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열의, 서열 간의 관계를 말한다. 당해 분야에 있어서 「동일성」은 또, 경우에 따라, 일렬의 2 개 이상의 뉴클레오티드 서열 간 또는 2 개 이상의 아미노산 서열 간의 일치에 의해 결정했을 때의, 핵산 분자 간 또는 폴리펩티드 간의 서열 관련성의 정도를 의미한다. 「동일성」은, 2 개 이상의 서열 중 작은 것과, 특정 수리적 모델 또는 컴퓨터 프로그램 (즉, 「알고리즘」) 에 의해 어드레스 지정되는 갭 얼라인먼트 (존재하는 경우) 간의 동일 일치의 퍼센트를 산출함으로써 평가할 수 있다. 구체적으로는, 유럽 분자생물학 실험실-유럽 생물정보학 기관 ( European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute) (EMBL-EBI) 이 제공하는 ClustalW2 등의 소프트를 사용함으로써 평가할 수 있지만, 당업자에 있어서 사용되는 것이면 이것으로 한정되지 않는다.
본 명세서 중에 있어서 「스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈한다」란, 이른바 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 예를 들어, 어느 핵산에 대한 동일성이 80 ％ 이상, 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상, 가장 바람직하게 99 ％ 이상인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 핵산의 상보 사슬이 하이브리다이즈하고, 그것으로부터 동일성이 낮은 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 핵산의 상보 사슬이 하이브리다이즈하지 않는 조건을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 시판되는 하이브리다이제이션 용액 ExpressHyb Hybridization Solution (클론테크사 제조) 중, 68 ℃ 에서 하이브리다이즈하는 것, 또는 DNA 를 고정한 필터를 사용하여 0.7 내지 1.0 M 의 NaCl 존재하 68 ℃ 에서 하이브리다이제이션을 실시한 후, 0.1 내지 2 배 농도의 SSC 용액 (1 배 농도 SSC 란 150 mM NaCl, 15 mM 시트르산나트륨으로 이루어진다) 을 이용하고, 68 ℃ 에서 세정하는 조건 또는 그것과 동등의 조건에서 하이브리다이즈하는 것을 의미한다.
1. 외래 유전자의 발현 항진에 사용되는 프로모터
본 발명의 외래 유전자 유래의 단백질의 제조 방법에 사용되는 외래 프로모터는, 열 충격 단백질 A5 유전자 (이하, 「Hspa5」라고 한다) 의 프로모터이다. Hspa5 프로모터로서의 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드이면 특별히 한정되지 않지만, Hspa5 의 프로모터로는, 개시 코돈의 상류 약 3 kbp 의 뉴클레오티드부터 개시 코돈에 대응하는 뉴클레오티드 서열 직전의 뉴클레오티드까지의 폴리뉴클레오티드가 바람직하다.
Hspa5 의 프로모터의 유래는 특별히 한정되지 않지만, 포유류 유래여도 되고, 예를 들어 차이니즈 햄스터, 인간, 마우스, 랫트 등 유래의 Hspa5 의 프로모터를 들 수 있다.
본 발명의 외래 유전자 유래의 단백질의 제조 방법에 사용되는 프로모터로서, 바람직하게는 차이니즈 햄스터 유래 Hspa5 의 프로모터이고, 더욱 바람직하게는 서열표의 서열 번호 1 및 도 12 에 기재된 폴리뉴클레오티드이다. 서열 번호 1 의 뉴클레오티드 서열은, 차이니즈 햄스터 유래 Hspa5 의 개시 코돈의 상류 약 3 kbp 의 뉴클레오티드 내지 개시 코돈에 대응하는 뉴클레오티드 서열 직전의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열이다. 서열 번호 2, 3, 및 4 의 뉴클레오티드 서열은, 각각 인간, 마우스, 랫트 유래 Hspa5 의 개시 코돈의 상류 약 1 kbp 의 뉴클레오티드 내지 개시 코돈에 대응하는 뉴클레오티드 서열 직전의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열이다. 서열 번호 2, 3, 및 4 의 뉴클레오티드 서열을, 각각 도 13, 도 14, 도 15 에도 나타낸다.
차이니즈 햄스터 유래 Hspa5 의 프로모터로는 서열 번호 1 에 기재된 서열의 부분 서열로 이루어지는 뉴클레오티드 서열이어도 되고, 각각 Hspa5 의 개시 코돈의 상류 약 2.5, 2.0, 1.5, 1.1 및 0.6 kbp 의 뉴클레오티드 내지 개시 코돈에 대응하는 뉴클레오티드 서열 직전의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열의 서열 번호 5, 6, 7, 8 및 9 에 기재된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 예시되고, 서열 번호 7, 8 및 9 에 기재된 폴리뉴클레오티드가 바람직하고, 서열 번호 8 및 9 에 기재된 폴리뉴클레오티드가 보다 바람직하다.
또, 본 발명의 외래 유전자 유래의 단백질의 제조 방법에 사용되는 프로모터는 서열 번호 1 내지 9 에 나타내는 어느 하나의 뉴클레오티드 서열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상, 가장 바람직하게는 99 ％ 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 또한 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드여도 된다.
본 발명의 외래 유전자 유래의 단백질의 제조 방법에 사용되는 프로모터는, 서열 번호 1 내지 9 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드여도 된다.
본 발명의 외래 유전자 유래의 단백질의 제조 방법에 사용되는 프로모터는, 서열 번호 1 내지 9 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 서열에 있어서, 1 또는 복수, 바람직하게는 1 내지 300 개, 더욱 바람직하게는 1 내지 30 개의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 및/또는 부가된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 변이 폴리뉴클레오티드이고, 또한 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드여도 된다.
상기 뉴클레오티드 서열의 변이 (결실, 치환, 및/또는 부가) 의 도입은, 쿤켈 (Kunkel) 법 혹은 갭드 듀플렉스 (Gapped duplex) 법 등의 당해 기술 분야에서 공지된 수법, 또는 이것에 준하는 방법에 의해 실시할 수 있고, 예를 들어 부위 특이적 돌연변이 유발법을 이용한 변이 도입용 키트 (예를 들어 Mutant-K (다카라 바이오사 제조) 혹은 Mutant-G (다카라 바이오사 제조), 다카라 바이오사의 LA PCR 시험관내 돌연변이유발 시리즈 키트 등) 를 이용할 수 있다. 이와 같은 변이 폴리뉴클레오티드도 본 발명의 프로모터로서 사용할 수 있다.
본 발명의 프로모터가 갖는 외래 유전자 발현 항진 활성은, 파이어플라이 루시페라아제 등의 리포터 유전자에 코드되는 단백질의 활성, 혹은 유가 배양에서의 항체 생산량을 지표로 하여 검정하는 것이 가능하다. 인간 EF-1α 프로모터를 사용한 경우와 본 발명의 프로모터를 사용한 경우를 비교하여, 유가 배양에서의 항체 생산량이 동등 이상, 바람직하게는 1.2 배 이상, 보다 바람직하게는 1.5 배 이상으로 상승한 경우, 그 프로모터가 외래 유전자 발현 항진 활성을 갖는다고 판단할 수 있다. 1.2 배 정도 이상의 항진에 의해서도, 세포의 배양 스케일 삭감, 배양 시간, 및 정제 공정의 단축이 기대되고, 결과적으로 수량의 향상과 배양 비용의 삭감이 가능해진다. 수량이 향상되면, 의약으로서의 외래 단백질을 안정적으로 공급하는 것이 가능해진다. 또, 배양 비용이 삭감되면, 의약으로서의 외래 단백질의 원가가 경감된다.
2. 외래 유전자 발현 유닛
본 발명의 외래 유전자 유래의 단백질의 제조 방법에 사용되는 외래 유전자 발현 유닛 (이하, 「본 발명의 유전자 발현 유닛」이라고 하는 경우도 있다) 은, 전사의 리딩 프레임의 방향으로, 적어도 상기 1. 에 기재된 본 발명의 프로모터, 외래 유전자, 및 전사 터미네이터 영역 (폴리 A 부가 시그널) 을 갖는 것이다.
또, 폴리 A 부가 서열은, 프로모터로부터의 전사에 대해 전사 종결을 일으키는 활성을 갖는 서열이면 되고, 프로모터의 유전자와 동일하거나 또는 상이한 유전자의 것이어도 된다.
3. 외래 유전자의 발현 항진에 사용되는 DNA 엘리먼트
상기 2. 에 기재된 본 발명의 유전자 발현 유닛과 DNA 엘리먼트를 조합하여 사용함으로써, 외래 유전자의 발현을 더욱 항진시킬 수 있다. 조합하여 사용하는 DNA 엘리먼트는, 아세틸화 히스톤 H3 과의 상호작용을 지표로 하여 취득하는 것이 가능하다. 일반적으로 히스톤 (H3, H4) 의 아세틸화는 전사의 활성화에 관여하고 있다고 언급되고 있고, 주로 2 가지 설이 고려되고 있다. 히스톤 테일이 아세틸화함으로써 전하적으로 중화되어, DNA 와 히스톤의 결합이 느슨해진다는 뉴클레오솜의 입체 구조 변화가 관계하고 있다는 설 (Mellor J. (2006) Dynamic nucleosomes and gene transcription. Trends Genet. 22(6) : 320-329) 과, 여러 가지 전사 인자의 동원에 관여한다는 설 (Nakatani Y. (2001) Histone acetylases-versatile players. Genes Cells. 6(2) : 79-86) 이다. 어느 설에 있어서도, 히스톤의 아세틸화가 전사 활성화에 관여하고 있을 가능성은 높아, 항아세틸화 히스톤 H3 항체를 사용한 크로마틴 면역 침강 (Chromatin Immunoprecipitation ; ChIP) 에 의해, 아세틸화 히스톤 H3 과 상호작용하는 DNA 엘리먼트를 농축하는 것이 가능하다.
본 발명의 프로모터와 조합하여 사용하는, 외래 유전자의 발현 항진에 사용되는 DNA 엘리먼트로서, A2, A7, 및, A18 을 들 수 있다.
A2 는 인간 15 번 염색체 80966429 ∼ 80974878 에 위치하고 있고, AT 함량 62.2 ％, 8450 bp 의 폴리뉴클레오티드이다. A2 의 뉴클레오티드 서열은, 서열표의 서열 번호 35 에 기재되어 있다.
A7 은 인간 11 번 염색체 88992123 ∼ 89000542 에 위치하고 있고, AT 함량 64.52 ％, 8420 bp 의 폴리뉴클레오티드이다. A7 의 뉴클레오티드 서열은, 서열표의 서열 번호 36 에 기재되어 있다.
A18 은, 인간 4 번 염색체 111275976 ∼ 111284450 에 위치하고 있고, AT 함량 62.54 ％, 8475 bp 의 폴리뉴클레오티드이다. A18 의 뉴클레오티드 서열은, 서열표의 서열 번호 37 에 기재되어 있다.
본 발명의 프로모터와 조합하여 사용하는, DNA 엘리먼트가 갖는 외래 유전자 발현 항진 활성은, SEAP 등의 리포터 유전자에 코드되는 단백질의 활성을 지표로 하여 검정하는 것이 가능하다.
본 발명의 프로모터와 조합하여 사용하는 경우, 상기 DNA 엘리먼트 중 어느 1 종을 단독으로 사용해도 되고, DNA 엘리먼트의 1 종을 2 카피 이상 사용해도 된다. 혹은 2 종 이상 DNA 엘리먼트를 조합하여 사용해도 된다.
본 발명에 있어서 사용되는 DNA 엘리먼트는, 서열 번호 35 내지 37 에 나타내는 뉴클레오티드 서열에 대해 80 ％ 이상, 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상, 가장 바람직하게는 99 ％ 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 또한 외래 유전자 발현 항진 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열이어도 된다. 뉴클레오티드 서열의 호몰로지 검색은, 예를 들어 일본 DNA 데이터 뱅크 (DNA Databank of JAPAN) 등을 대상으로, FASTA 나 BLAST 등의 프로그램을 사용하여 실시할 수 있다.
당업자이면, Molecular Cloning (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyline Drive Plainview, NY (1989)) 등을 참조함으로써, 본 발명의 프로모터의 이러한 호몰로그 유전자를 용이하게 취득할 수 있다. 또, 상기 뉴클레오티드 서열의 동일성은, 마찬가지로 FASTA 검색이나 BLAST 검색에 의해 결정할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드의 변이 (결실, 치환, 및/또는 부가) 의 도입은, 쿤켈법 혹은 갭드 듀플렉스법 등의 당해 기술 분야에서 공지된 수법, 또는 이것에 준하는 방법에 의해 실시할 수 있고, 예를 들어 부위 특이적 돌연변이 유발법을 이용한 변이 도입용 키트 (예를 들어 Mutant-K (다카라 바이오사 제조) 혹은 Mutant-G (다카라 바이오사 제조), 다카라 바이오사의 LA PCR 시험관내 돌연변이유발 시리즈 키트 등) 를 이용할 수 있다. 이와 같은 변이 폴리뉴클레오티드도 본 발명의 DNA 엘리먼트로서 사용할 수 있다.
4. 폴리뉴클레오티드의 취득
본 발명에 있어서, 후기하는 산생 항진의 대상이 되는 외래 단백질을 코드하는 외래 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 이하에 나타내는 일반적인 방법에 의해 취득할 수 있다. 예를 들어, 외래 유전자가 발현하고 있는 세포나 조직에서 유래하는 cDNA 라이브러리를, 당해 유전자 단편을 기초로 하여 합성한 DNA 프로브를 사용하여 스크리닝함으로써 단리할 수 있다. mRNA 의 조제는, 당해 기술 분야에 있어서 통상 사용되는 수법에 의해 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 세포 또는 조직을, 구아니디닌 시약, 페놀 시약 등으로 처리하여 전체 RNA 를 얻고, 그 후에 올리고 (dT) 셀룰로오스 컬럼이나 세파로오스 2B 를 담체로 하는 폴리 U-세파로오스 등을 사용한 어피니티 컬럼법에 의해, 혹은 배치법에 의해 폴리(A)＋RNA (mRNA) 를 얻는다. 또한, 자당 밀도 구배 원심법 등에 의해 폴리(A)＋RNA 를 또한 분획해도 된다. 이어서, 얻어진 mRNA 를 주형으로 하여, 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 사용하여 1 가닥 cDNA 를 합성하고, 그 1 가닥 cDNA 로부터 DNA 합성 효소 I, DNA 리가아제 및 RNaseH 등을 사용하여 2 가닥 cDNA 를 합성한다. 합성한 2 가닥 cDNA 를 T4DNA 합성 효소에 의해 평활화 후, 어댑터 (예를 들어, EcoRI 어댑터) 의 연결, 인산화 등을 거쳐, λgt11 등의 λ 파지에 삽입하여 생체내 (in vivo) 패키징함으로써 cDNA 라이브러리를 제조한다. 또, λ 파지 이외에도 플라스미드 벡터를 사용하여 cDNA 라이브러리를 제조할 수도 있다. 그 후, cDNA 라이브러리로부터 목적의 DNA 를 갖는 주 (株) (포지티브 클론) 를 선택하면 된다.
또, 단백질의 산생에 사용하는 상기 프로모터, 터미네이터 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 상기 DNA 엘리먼트 또는 외래 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 게놈 DNA 로부터 단리하는 경우에는, 일반적 수법 (Molecular Cloning (1989), Methods in Enzymology 194 (1991)) 에 따라, 채취원이 되는 생물의 세포주로부터 게놈 DNA 를 추출하고, 폴리뉴클레오티드를 선별함으로써 실시한다. 게놈 DNA 의 추출은, 예를 들어 Cryer 등의 방법 (Methods in Cell Biology, 12, 39-44 (1975)) 및 P. Philippsen 등의 방법 (Methods Enzymol., 194, 169-182 (1991)) 에 따라 실시할 수 있다.
목적으로 하는 프로모터, DNA 엘리먼트, 또는 외래 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 취득은, 예를 들어 PCR 법 (PCR Technology. Henry A. Erlich, Atockton press (1989)) 에 의해 실시할 수도 있다. PCR 법을 이용한 폴리뉴클레오티드의 증폭에는, 프라이머로서 20 ∼ 30 mer 의 합성 1 가닥 DNA 를, 주형으로서 게놈 DNA 를 사용한다. 증폭된 유전자는 폴리뉴클레오티드 서열을 확인한 후, 사용한다. PCR 의 주형으로는, 박테리아 인공 염색체 (BAC) 등의 게놈 DNA 라이브러리를 사용하는 것이 가능하다.
한편, 서열 미지의 외래 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 취득은, (a) 통상적인 방법에 의해 유전자 라이브러리를 제조하고, (b) 제조된 유전자 라이브러리로부터 원하는 폴리뉴클레오티드를 선택하고, 당해 폴리뉴클레오티드를 증폭함으로써 실시할 수 있다. 유전자 라이브러리는, 채취원이 되는 생물의 세포주로부터 통상적인 방법에 의해 얻은 염색체 DNA 를 적당한 제한 효소에 의해 부분 소화시켜 단편화하고, 얻어진 단편을 적당한 벡터에 연결하고, 그 벡터를 적당한 숙주에 도입함으로써 조제할 수 있다. 또, 세포로부터 mRNA 를 추출하고, 여기서부터 cDNA 를 합성 후, 적당한 벡터에 연결하고, 그 벡터를 적당한 숙주에 도입함으로써도 조제할 수 있다. 이때 사용되는 벡터로는, 통상 공지된 유전자 라이브러리 조제용 벡터로서 알려진 플라스미드를 사용할 수 있고, 파지 벡터 또는 코스미드 등도 널리 사용할 수 있다. 형질 전환 또는 형질 도입을 실시하는 숙주는, 상기 벡터의 종류에 따른 것을 사용하면 된다. 외래 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 선택은, 상기 유전자 라이브러리로부터, 외래 유전자에 특유의 서열을 포함하는 표지 프로브를 사용하는 콜로니 하이브리다이제이션법, 플라크 하이브리다이제이션법 등에 의해 실시한다.
또 외래 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 화학적으로 전체 합성할 수도 있다. 예를 들어 상보적인 2 쌍의 올리고뉴클레오티드를 제조하고 이들을 어닐시키는 방법이나, 수개의 어닐된 DNA 를 DNA 리가아제에 의해 연결하는 방법, 또는 일부 상보적인 수개의 올리고뉴클레오티드를 제조하고 PCR 에 의해 갭을 메우는 방법 등에 의해, 유전자를 합성할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 서열의 결정은, 통상적인 방법, 예를 들어 디데옥시법 (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463-5467 (1977)) 등에 의해 실시할 수 있다. 또한 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 결정은, 시판되는 서열 키트 등을 사용함으로써도 용이하게 실시할 수 있다.
5. 외래 유전자 발현 벡터
본 발명의 외래 유전자 유래의 단백질의 제조 방법에 사용되는 외래 유전자 발현 벡터로는, 상기 1. 에 기재된 프로모터를 포함하는 상기 2. 에 기재된 외래 유전자 발현 유닛을 포함하는 벡터가 제공된다. 본 발명의 외래 유전자 유래의 단백질의 제조 방법에 사용되는 외래 유전자 발현 벡터는, 상기 3. 에 기재된 DNA 엘리먼트의 1 종, DNA 엘리먼트의 1 종을 2 개 이상의 카피수, DNA 엘리먼트의 2 종 이상의 조합을 포함해도 된다. 상기 외래 유전자 발현 벡터에 의해 외래 유전자를 숙주 세포 내에서 발현시킬 때에는, DNA 엘리먼트를 유전자 발현 유닛의 직전 또는 직후에 배치해도 되고, 또는 유전자 발현 유닛으로부터 떨어진 위치에 배치해도 된다. 또, 복수의 DNA 엘리먼트를 포함하는 1 개의 외래 유전자 발현 벡터를 사용해도 된다. 또한, DNA 엘리먼트의 방향은, 유전자 발현 유닛에 대해 순방향 또는 역방향 중 어느 방향이어도 된다.
외래 유전자로는, 특별히 한정은 되지 않지만, 분비형 알칼리 포스파타아제 (SEAP), 녹색 형광 단백질 (GFP), 루시페라아제 등의 리포터 유전자, α-아밀라아제 유전자, α-갈락토시다아제 유전자 등의 각종 효소 유전자, 의약상 유용한 생리 활성 단백질인 인터페론 α, 인터페론 γ 등의 각종 인터페론 유전자, IL1, IL2 등의 각종 인터류킨 유전자, 에리스로포이에틴 (EPO) 유전자, 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF) 유전자 등의 각종 사이토카인 유전자, 성장 인자 유전자, 또는 다량체 단백질을 코드하는 유전자, 예를 들어 항체 또는 그 항원 결합성 단편인 헤테로 다량체를 코드하는 유전자 등을 들 수 있다. 이들 유전자는 어떠한 수법에 의해 얻어지는 것이어도 된다.
「항체의 항원 결합성 단편」이란, 항원과의 결합 활성을 갖는 항체의 부분 단편을 의미하고 있고, Fab, F(ab')2, Fv, scFv, 다이아바디, 선상 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다특이성 항체 등을 포함한다. 또, F(ab')2 를 환원 조건하에서 처리한 항체의 가변 영역의 1 가의 단편인 Fab' 도 항체의 항원 결합성 단편에 포함된다. 단, 항원과의 결합능을 가지고 있는 한 이들 분자로 한정되지 않는다. 또, 이들 항원 결합성 단편에는, 항체 단백질의 전체 길이 분자를 적당한 효소로 처리한 것뿐만 아니라, 유전자 공학적으로 변형된 항체 유전자를 사용하여 적당한 숙주 세포에 있어서 산생된 단백질도 포함된다.
또, 본 발명의 외래 유전자 유래의 단백질의 제조 방법에 사용되는 외래 유전자 발현 벡터에는, 형질 전환체를 선발하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세룰레닌, 오레오바시딘, 제오신, 카나바닌, 시클로헥시미드, 하이그로마이신, 퓨로마이신, 블라스티시딘, 테트라사이클린, 카나마이신, 암피실린, 네오마이신 등의 약제에 대해 내성을 부여하는 약제 내성 마커 등을 사용함으로써, 형질 전환체의 선발을 실시하는 것이 가능하다. 또, 에탄올 등에 대한 용제 내성이나, 글리세롤이나 염 등에 대한 침투압 내성, 구리 등의 금속 이온 내성 등을 부여하는 유전자를 마커로 함으로써, 형질 전환체의 선발을 실시하는 것도 가능하다.
본 발명의 외래 유전자 유래의 단백질의 제조 방법에 사용되는 외래 유전자 발현 벡터는, 염색체 DNA 에 삽입되지 않는 벡터여도 된다. 일반적으로, 외래 유전자 발현 벡터는 숙주 세포에 유전자 도입된 후, 랜덤으로 염색체에 삽입되지만, 시미안 바이러스 40 (SV40) 이나 파필로마바이러스 (BPV, HPV), EBV 등의 포유 동물 바이러스 유래의 구성 성분을 사용함으로써, 도입된 숙주 세포 중에서 자기 복제가 가능한 에피솜 벡터로서 사용할 수 있다. 예를 들어, SV40 유래의 복제 기점 및 트랜스-작용 인자인 SV40 대형 T 항원을 코드한 서열을 갖는 벡터나 EBV 유래의 oriP 및 EBNA-1 을 코드한 서열을 갖는 벡터 등이 널리 사용되고 있다. DNA 엘리먼트의 효과는 벡터의 종류, 혹은 염색체에의 삽입 유무를 불문하고, 외래 유전자 발현 항진 활성을 나타내는 것이 가능하다.
6. 형질 전환 세포
본 발명의 외래 유전자 유래의 단백질의 제조 방법에 사용되는 형질 전환 세포는, 상기 5. 의 외래 유전자 발현 벡터를 사용하여 도입한 형질 전환 세포이다.
형질 전환시키는 숙주 세포로는, 진핵 세포, 바람직하게는 포유 동물 세포, 더욱 바람직하게는 인간, 마우스, 랫트, 햄스터, 원숭이, 또는 소 유래의 세포이다. 포유 동물 세포로는, COS-1 세포, 293 세포, CHO 세포 (CHO-K1, DG44, CHO dhfr-, CHO-S) 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 숙주 세포에의 발현 벡터의 도입 방법으로는, 도입 유전자가 숙주 내에서 안정적으로 존재하고, 또한 적절히 발현시킬 수 있는 방법이면 어떠한 방법이어도 되고, 일반적으로 이용되고 있는 방법, 예를 들어 인산칼슘법 (Ito et al., (1984) Agric. Biol. Chem., 48, 341), 일렉트로포레이션법 (Becker, D. M. et al. (1990) Methods. Enzymol., 194, 182-187), 스페로플라스트법 (Creggh et al., Mol. Cell. Biol., 5, 3376 (1985)), 아세트산리튬법 (Itoh, H. (1983) J. Bacteriol. 153, 163-168), 리포펙션법 등을 들 수 있다.
7. 외래 단백질의 제조 방법
본 발명의 외래 단백질의 제조 방법은, 상기 6. 의 항목에 기재된 형질 전환 세포를 공지된 방법에 의해 배양하고, 그 배양물로부터 채취하고, 정제함으로써 실시할 수 있다. 「배양물」이란, 배양 상청 외에, 배양 세포, 또는 세포의 파쇄물의 어느 것도 의미하는 것이다. 또한, 6. 의 항목에 기재된 형질 전환 세포를 사용하여 산생할 수 있는 외래 단백질로는, 단량체 단백질뿐만 아니라 다량체 단백질을 선택할 수도 있다. 상이한 복수의 서브유닛으로 구성되는 헤테로 다량체 단백질의 생산을 실시하는 경우, 이들 서브유닛을 코드하고 있는 복수의 유전자를, 각각 6. 의 항목에 기재된 숙주 세포에 도입할 필요가 있다.
형질 전환 세포를 배양하는 방법은, 그 숙주 세포의 배양에 사용되는 통상적인 방법에 따라 실시할 수 있다.
형질 전환 세포가 포유 동물 세포인 경우에는, 예를 들어 37 ℃, 5 ％ 또는 8 ％ CO2 조건하에서 배양하고, 배양 시간은 24 ∼ 1000 시간 정도이고, 배양은 정치 (靜置), 진탕, 교반, 통기하의 회분 배양, 유가 배양, 관류 배양 또는 연속 배양 등에 의해 실시할 수 있다.
상기 배양물 (배양액) 로부터 외래 단백질 유전자의 발현 산물의 확인은, SDS-PAGE, 웨스턴 분석, ELISA 등에 의해 실시할 수 있다.
8. 항체 단백질의 제조 방법
상기 7. 의 항목에 기재된 제조 방법을 이용하여 제조되는 헤테로 다량체 단백질로는 항체 단백질을 들 수 있다. 항체 단백질은, 2 분자의 중쇄 폴리펩티드 및 2 분자의 경쇄 폴리펩티드로 이루어지는 4 량체 단백질이다. 따라서, 항원 결합능을 유지한 형태로 항체 단백질을 취득하기 위해서는, 상기 6. 의 항목에 기재된 형질 전환 세포에 있어서, 중쇄 및 경쇄의 유전자의 쌍방이 도입되어 있을 필요가 있다. 이 경우에, 중쇄 및 경쇄의 유전자 발현 유닛은, 동일한 발현 벡터 상에 존재해도 되고, 혹은 상이한 발현 벡터 상에 존재하고 있어도 된다.
본 발명에 있어서 제조되는 항체로는, 토끼, 마우스, 랫트 등 실험 동물을 원하는 항원으로 면역하여 제조된 항체를 들 수 있다. 또, 상기 항체를 원료로 하는 키메라 항체, 및 인간화 항체도 본 발명에 있어서 제조되는 항체로서 들 수 있다. 또한, 유전자 변형 동물 또는 파지 디스플레이법에 의해 취득되는 인간 항체에 대해서도, 본 발명에 있어서 제조되는 항체이다.
항체 제조에 사용하는 항체 유전자로는, 그 항체 유전자로부터 전사·번역되는 중쇄 폴리펩티드와 경쇄 폴리펩티드의 조합이, 임의의 항원 단백질과 결합하는 활성을 유지하고 있는 한, 특정 폴리뉴클레오티드 서열을 가지는 항체 유전자로 한정되지 않는다.
또, 항체 유전자로는, 반드시 항체의 전체 길이 분자를 코드하고 있을 필요는 없고, 항체의 항원 결합성 단편을 코드하고 있는 유전자를 사용할 수 있다. 이들 항원 결합성 단편을 코드하는 유전자는, 항체 단백질의 전체 길이 분자를 코드하는 유전자를 유전자 공학적으로 변형함으로써 취득할 수 있다.
9. 그 밖의 외래 단백질의 제조 방법
본 발명의 제조 방법의 대상이 되는 외래 단백질로는, 전술한 항체에 추가하여, 인간 또는 비인간 동물 유래의 각종 단백질, 그 항원 결합성 단편, 그 변형체 등을 들 수 있다. 그러한 단백질 등으로는, 심방성 나트륨 이뇨 펩티드 (ANP), 뇌성 나트륨 이뇨 펩티드 (BNP), C 형 나트륨 이뇨 펩티드 (CNP), 바소프레신, 소마토스타틴, 성장 호르몬 (GH), 인슐린, 옥시토신, 그렐린, 렙틴, 아디포넥틴, 레닌, 칼시토닌, 오스테오프로테게린, 인슐린 유사 성장 인자 (IGF) 등의 펩티드 호르몬, 인터류킨, 케모카인, 인터페론, 종양 괴사 인자 (TNFα／β 외 TNF 슈퍼 패밀리 등), 신경 성장 인자 (NGF), 세포 증식 인자 (EGF, FGF, PDGF, HGF, TGF 등), 조혈 인자 (CSF, G-CSF, 에리스로포이에틴 등), 아디포카인 등의 사이토카인, TNF 수용체 등의 수용체, 리소자임, 프로테아제, 프로테이나아제, 펩티다아제 등의 효소, 그 기능성 단편 (원래의 단백질의 생물 활성을 일부 또는 전부 유지하고 있는 단편), 그들의 단백질을 포함하는 것으로 이루어지는 융합 단백질 등을 들 수 있지만, 그것들로 한정되는 것은 아니다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 기술적 범위를 조금도 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 실시예에서 사용하는 플라스미드, 제한 효소, DNA 수식 효소 등은 시판되는 것이고, 통상적인 방법에 따라 사용할 수 있다. 또, DNA 의 클로닝, 폴리뉴클레오티드 서열의 결정, 숙주 세포의 형질 전환, 형질 전환 세포의 배양, 얻어지는 배양물로부터의 단백질 채취, 정제 등에 사용한 조작에 대해서도 당업자에게 잘 알려져 있는 것이거나, 문헌에 의해 알 수 있는 것이다.
(실시예 1) 인간화 항체 유전자 X 발현주의 구축
1-1) 인간화 항체 유전자 X 발현 벡터의 구축
비특허문헌 9 에 기재된 pDSLH4.1 을 벡터 기본 골격으로서 갖는, 인간화 항체 유전자 X 발현 벡터 pDSLH4.1-X 를 구축하였다.
1-2) 인간화 항체 X 발현 안정적 풀의 제조
CHO-K1 세포 (ATCC) 를 무혈청 배지를 사용한 부유 상태에서의 배양이 가능해지도록 순화하여, 숙주 세포 CHO-O1 세포를 얻었다. CHO-O1 세포에, (1-1) 에서 구축한 인간화 항체 유전자 X 발현 벡터 pDSLH4.1-X 를 유전자 도입 장치 Neon 트랜스펙션 시스템 (Invitrogen) 을 사용하여 유전자 도입하고, T-25 플라스크에서 5 ％ CO2, 37 ℃ 에서 배양하였다. 유전자 도입의 1 일 후에 게네티신 (Life Technologies Corporation) 을 최종 농도 800 ㎍/mL 로 첨가하고, 1 주간 약제 선택 배양을 실시하였다. 그 후, 125 mL 용량 삼각 플라스크에서 5 ％ CO2, 37 ℃ 에서 배양하여, 인간화 항체 X 발현 안정적 풀을 제조하였다.
1-3) 인간화 항체 X 발현주의 구축
(1-2) 에서 제조한 인간화 항체 X 발현 안정적 풀을 모노클론화하여 인간화 항체 X 발현주 X＃1 및 X＃2 를 취득하였다.
구체적으로는, (1-2) 에서 제조한 인간화 항체 X 발현 안정적 풀을 연한천 배지에 현탁, 6 웰 플레이트에 파종하고, 5 ％ CO2, 37 ℃ 에서 배양하였다. 배양 후, ClonePix 2 (Genetix) 를 사용하여 인간화 항체 X 고발현 콜로니를 96 웰 플레이트에 픽하였다. 피킹한 콜로니는, 24 웰 플레이트, 6 웰 플레이트, T-25 플라스크, 125 mL 용량 삼각 플라스크로 순차 확대 배양하여, 인간화 항체 X 발현주 X＃1 및 X＃2 를 취득하였다.
(실시예 2) 인간화 항체 X 발현주 X＃1 및 X＃2 의 트랜스크립톰 해석
실시예 1 에서 구축한 인간화 항체 X 발현주 X＃1 및 X＃2 를 사용하여 유가 배양을 실시하고, 그 시간 경과 샘플에 대해 트랜스크립톰 해석을 실시하여, 고발현 유전자를 특정하였다.
2-1) 인간화 항체 X 발현주 X＃1 및 X＃2 의 유가 배양
실시예 1 에서 구축한 인간화 항체 X 발현주를, 1 L 배양조에서 유가 배양을 실시하였다. 배양조＃1 은, 세포주에 X＃1, 기초 배지/피드 배지에 G13 (JX 에너지 제조 커스텀 배지)/F13 (JX 에너지 제조 커스텀 배지) 을, 배양조＃2 는, 세포주에 X＃1, 기초 배지/피드 배지에 DA1 (Life Technologies Corporation 제조 커스텀 배지)/DAFM3 (Life Technologies Corporation 제조 커스텀 배지) 을, 배양조＃3 은, 세포주에 X＃2, 기초 배지/피드 배지에, G13/F13 을 사용하였다.
생세포수와 항체 생산량의 추이를 각각 도 1A, 도 1B 에 나타낸다. 항체 생산량은, 세포주 간에서 비교하면 X＃1 쪽이 X＃2 보다 높고, 기초 배지/피드 배지 간의 비교에서는 G13/F13 쪽이 DA1/DAFM3 보다 높았다.
2-2) 인간화 항체 X 발현주 X＃1 및 X＃2 의 트랜스크립톰 해석
(2-1) 에서 실시한 유가 배양의 4, 7, 9, 11, 14 일째의 세포로부터 RNAiso Plus (다카라 바이오) 를 사용하여 전체 RNA 를 추출하였다. 계속해서, TruSeq RNA 샘플 준비 키트 v2 (illumina) 를 사용하여 서열 라이브러리를 제조하였다. 구체적으로는, 전체 RNA 로부터 PolyA＋ RNA 를 단리, 단편화하여 취득한 RNA 단편을 주형으로 하여 2 가닥 cDNA 를 합성하였다. 합성한 2 가닥 cDNA 의 양말단을 평활화·인산화 처리한 후, 3'-dA 돌출 처리를 실시하여, 인덱스가 부속된 어댑터를 연결하였다. 어댑터를 연결한 2 가닥 cDNA 를 주형으로 하여, PCR 에 의한 증폭을 실시한 후, AMPure XP (BECKMAN COULTER) 를 사용한 자기 (磁氣) 비즈법으로 얻어진 PCR 산물을 정제하여, 서열 라이브러리로 하였다. 그리고, 서열 라이브러리를 사용하여 서열의 주형이 되는 클러스터를 형성하여, HiSeq 2000 시스템 (illumina) 에 제공하고, 고속 서열 해석을 실시, 서열 데이터를 취득하였다.
2-3) 트랜스크립톰 해석 결과의 데이터 해석
서열 해석에 의해 얻어진 리드 서열은 비특허문헌 10 에 기재된 Bowtie (version. 1.0.0) 를 이용하여 레퍼런스 서열로 매핑하였다. 레퍼런스 서열은 NCBI 에 등록되어 있는 차이니즈 햄스터의 염색체 서열에, NCBI 에 등록되어 있는 차이니즈 햄스터의 유전자 정보에 기초하여 추출한 스플라이스 서열을 더하여 작성하였다. 또, 리드 서열의 발현량 (RPKM : 백만 맵핑된 판독 당 엑손 [인트론/유전자간] 모델의 킬로베이스 당 판독, Reads per kilobase of exon [intron/intergenic] model per million mapped reads) 과 신규 유전자 발현 영역은 비특허문헌 11 에 기재된 ERANGE 3.2 를 이용하여 검토하였다.
배양조＃1 의 4 일째의 세포에서의 발현량 상위 20 유전자를 표 1 에, 배양조＃1, 배양조＃2, 배양조＃3 의 각 샘플링일에 있어서의 상기 20 유전자의 발현량을, 각각 도 2A, 도 2B, 도 2C 에 나타낸다. Hspa5 (열 충격 단백질 5) 유전자는 배양조＃1, 2, 3 의 모든 조건에서, Fth1 (페리틴 중쇄 1) 유전자는 배양조＃2, 3 의 조건에서, 배양 후기에서의 발현량 상승이 보였다. Hspa5 유전자는, 세포주, 배지의 조건에 의하지 않고, 배양 후기에 발현량이 상승하고 있어, 배양 후기에 그 프로모터 활성이 향상되어 있다고 시사되었다.
[표 1]
Figure pct00001
(실시예 3) 고발현 유전자의 프로모터 영역의 클로닝
실시예 2 에서 알아낸 발현량 상위 20 유전자 중, tRNA 를 제외한 18 유전자에 대해, 각 유전자의 프로모터 영역의 클로닝을 실시하였다.
3-1) Hspa5 의 프로모터 영역의 클로닝
Hspa5 의 프로모터 영역으로는, GenBank 에 NM_001246739.1 에서 등록되어 있는 mRNA 의 서열 및 NW_003615108.1 에서 등록되어 있는 차이니즈 햄스터 게놈의 스캐폴드 서열을 참고로 하여, Hspa5 의 개시 코돈 서열의 상류 약 3.0 kbp 의 뉴클레오티드부터 개시 코돈 서열에 대응하는 뉴클레오티드 서열 직전의 뉴클레오티드까지의 서열을 사용하였다.
Hspa5 의 프로모터 영역은, CHO 세포의 게놈 DNA 를 주형으로 하고, 이하에 나타내는 프라이머 세트와 KOD FX Neo (TOYOBO) 를 사용한 PCR 로 증폭하여, QIAquick PCR 정제 키트 (QIAGEN) 로 정제하였다. 정제한 DNA 단편을 KpnI-HindIII 로 소화시킨 후, pGL4.10[luc2] (PROMEGA) 의 KpnI-HindIII 사이트 사이에 삽입하여, pGL4.10-Hspa5 를 구축하였다. 클로닝한 Hspa5 의 프로모터 영역의 뉴클레오티드 서열을 서열표의 서열 번호 1 에 나타낸다.
Hspa5 프로모터의 프라이머 세트
Figure pct00002
3-2) 다른 고발현 유전자의 프로모터 영역의 클로닝
상기 3-1) 에 기재된 방법에 준해, Rps14 (리보솜 단백질 S14), Gapdh (글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소), Eef1a1 (진핵생물 번역 신장 인자 1 알파 1), Rps11 (40S 리보솜 단백질 S11-유사), Rplp0 (60S 산성 리보솜 단백질 P0-유사), Rps4 (리보솜 단백질 S4), PKM (피루베이트 키나아제 아이소자임 M1/M2-유사), Rps2 (리보솜 단백질 S2), Actb (액틴, 베타), Chub2 (폴리유비퀴틴), Rps3 (40S 리보솜 단백질 S3a-유사), Prdx1 (페록시레독신 1), Rpsa (리보솜 단백질 SA), Rps25 (40S 리보솜 단백질 S25-유사), Rpl8 (60S 리보솜 단백질 L8-유사), Fth1 (페리틴 중쇄 1), Hspd1 (열 충격 단백질 1) 의 프로모터 영역의 클로닝을 실시하여, pGL4.10[luc2] 의 멀티 클로닝 사이트에 삽입하였다.
3-3) pGL4.10-hEF1α 의 구축
다음으로, pEF1/V5-His A (Invitorogen) 를 주형으로 하고, 이하에 나타내는 프라이머 세트와 KOD -Plus- Ver.2 (TOYOBO) 를 사용한 PCR 로 인간 EF1-α 프로모터를 증폭하여, QIAquick PCR 정제 키트로 정제하였다. 정제한 DNA 단편을 NheI-HindIII 로 소화시킨 후, pGL4.10[luc2] 의 NheI-HindIII 사이트 사이에 삽입하여, pGL4.10-hEF1α 를 구축하였다.
hEF1α 프로모터의 프라이머 세트
Figure pct00003
(실시예 4) 파이어플라이 루시페라아제의 일과성 발현량을 지표로 한 각 프로모터의 활성 평가
4-1) 트랜스펙션
(1-2) 에 기재된 CHO-O1 세포를, Opti-MEM I 저혈청 배지 (Life Technologies Corporation) 로 2.5 × 105 세포/mL 로 현탁하고, 24 웰 플레이트에 1 mL 씩 파종하였다. 실시예 3 에서 구축한 각 프로모터를 삽입한 pGL4.10[luc2] 3.2 ㎍ 과 트랜스펙션 효율 보정용의 컨트롤 벡터 pGL4.74 [hRluc/TK] (PROMEGA) 0.4 ㎍ 을 OptiPro SFM (Life Technologies Corporation) 68 μL 로 희석하였다. 한편, 리포펙타민 2000 CD (Life Technologies Corporation) 8 μL 를 OptiPro SFM 68 μL 로 희석하고, 상기 플라스미드 용액과 혼합하고, 20 분간, 실온에서 방치하였다. 그 후, 절반량씩 2 웰에 첨가하고, 5 ％ CO2, 37 ℃ 에서 배양하였다.
4-2) 루시페라아제 어세이
트랜스펙션의 익일, 듀얼-루시페라아제 리포터 어세이 시스템 (PROMEGA) 을 사용하여 루시페라아제의 일과성 발현량을 측정하였다. 구체적으로는 배양액을 9000G × 1 분간 원심하여 상청을 제거하고, PBS 로 1 회 세정한 후, 키트가 첨부된 패시브 용해 완충제를 사용하여 세포 용해물을 조제하였다. 그리고 상기 키트와 루미노미터를 사용하여, 파이어플라이 루시페라아제와 레닐라 루시페라아제의 발광량을 측정하였다.
도 3 에 각 프로모터를 삽입한 루시페라아제 발현 벡터로 트랜스펙션하고, 그 익일에 측정한 파이어플라이 루시페라아제 (luc2) 의 발광량을 레닐라 루시페라아제 (Rluc) 의 발광량으로 표준화한 값을 나타낸다. Eef1a1 은 강한 프로모터 활성을 나타내고, 컨트롤로서 사용한 인간 EF1-α 와 동일한 정도였다. Hspa5 는 검토한 프로모터 중에서는 Eef1a1 다음으로 강한 프로모터 활성을 나타냈다.
(실시예 5) 항체 발현량을 지표로 한 Hspa5 프로모터의 유가 배양에 의한 평가
Hspa5 유전자는, 트랜스크립톰 해석에서 배양 후기에 발현량이 상승하고 있었던 점에서, 배양 후기에서의 프로모터 활성의 증강이 시사되었다. 또, Hspa5 유전자의 프로모터는, 루시페라아제 어세이를 이용한 일과성 발현에 의한 평가에 있어서 강한 프로모터 활성을 나타냈다. 그래서, 본 프로모터의 평가를, 항체의 안정 발현 세포를 제조하고, 유가 배양에 의해 실시하였다.
5-1) 항체 발현 벡터의 구축
비특허문헌 9 에 기재된 pDSLH4.1 을 벡터 기본 골격으로서 갖고, 항체 H 사슬 및 L 사슬 유전자의 프로모터에 특허문헌 2 에 기재된 인간 RPS7, DNA 엘리먼트에 특허문헌 2 에 기재된 A7 을 사용한 인간화 항체 유전자 Y 발현 벡터 pDSLHA4.1-hRPS7-Y 를 구축하였다. 계속해서, 인간화 항체 유전자 Y 발현 벡터 pDSLHA4.1-hRPS7-Y 의, 항체 H 사슬 및 L 사슬 유전자의 프로모터를 Hspa5, 혹은 인간 EF1-α 로 치환한, pDSLHA4.1-Hspa5-Y, 및 pDSLHA4.1-hEF1α-Y 를 구축하였다. 벡터 개략을 도 4 에 나타낸다.
pDSLHA4.1-Hspa5-Y 는, 이하의 방법에 의해 구축하였다. 먼저, pGL4.10-Hspa5 를 주형으로 하여, 이하에 나타내는 프라이머 세트와 PrimeSTAR Max DNA 중합효소 (다카라 바이오) 를 사용한 PCR 로 차이니즈 햄스터 Hspa5 프로모터를 증폭하여, QIAquick PCR 정제 키트로 정제하였다. 정제한 DNA 단편을 NotI-XbaI 로 소화시킨 후, H 사슬 유전자 발현 벡터 pDSH1.1-hRPS7-Y, 및 L 사슬 유전자 발현 벡터 pDSL2.1-hRPS7-Y 의 NotI-NheI 사이트 사이에 삽입하여, 각각 pDSH1.1-Hspa5-Y, pDSL2.1-Hspa5-Y 를 구축하였다. 다음으로, pDSL2.1-Hspa5-Y 를 AatII-HindIII 로 소화시켜 얻어진 DNA 단편을 pDSH1.1-Hspa5-Y 의 AatII-HindIII 사이에 삽입하여, pDSLH3.1-Hspa5-Y 를 구축하였다. pDSLH3.1-Hspa5-Y 의 발현 카세트 상류에 특허문헌 2 에 기재된 DNA 엘리먼트 A7 을 삽입하여, pDSLHA4.1-Hspa5-Y 를 구축하였다.
Hspa5 프로모터의 프라이머 세트
Figure pct00004
Figure pct00005
한편, pDSLHA4.1-hEF1α-Y 는, 이하의 방법에 의해 구축하였다. 먼저, pGL4.10-hEF1α 를 주형으로 하여, 이하에 나타내는 프라이머 세트와 KOD -Plus- Ver.2 를 사용한 PCR 로 인간 EF1-α 프로모터를 증폭하여, QIAquick PCR 정제 키트로 정제하였다. 정제한 DNA 단편을 NotI-NheI 로 소화시킨 후, H 사슬 유전자 발현 벡터 pDSH1.1-hRPS7-Y, 및 L 사슬 유전자 발현 벡터 pDSL2.1-hRPS7-Y 의 NotI-NheI 사이트 사이에 삽입하여, 각각 pDSH1.1-hEF1α-Y, pDSL2.1-hEF1α-Y 를 구축하였다. 다음으로, pDSL2.1-hEF1α-Y 를 AatII-HindIII 로 소화시켜 얻어진 DNA 단편을 pDSH1.1-hEF1α-Y 의 AatII-HindIII 사이에 삽입하여, pDSLH3.1-hEF1α-Y 를 구축하였다. pDSLH3.1-hEF1α-Y 의 발현 카세트 상류에 특허문헌 2 에 기재된 DNA 엘리먼트 A7 을 삽입하여, pDSLHA4.1-hEF1α-Y 를 구축하였다.
hEF1α 프로모터의 프라이머 세트
Figure pct00006
5-2) 인간화 항체 Y 발현 안정적 풀의 제조
(5-1) 에서 구축한 항체 발현 벡터 pDSLHA4.1-Hspa5-Y, pDSLHA4.1-hRPS7-Y, 혹은 pDSLHA4.1-hEF1α-Y 를, (1-2) 에 기재된 CHO-O1 세포에 (4-1) 에 기재된 방법으로 트랜스펙션하였다. 유전자 도입의 1 일 후, 배양액을 원심하여 상청을 제거, 게네티신 800 ㎍/mL 를 포함하는 배지로 현탁하고, 6 웰 플레이트에서 1 주간 약제 선택 배양을 실시하였다. 그 후, T-25 플라스크, 계속해서 125 mL 용량 삼각 플라스크에서 5 ％ CO2, 37 ℃ 에서 배양하여, 인간화 항체 Y 발현 안정적 풀을 제조하였다. 안정적 풀은 각각의 항체 발현 벡터로 N = 2 로 제조하였다.
5-3) 인간화 항체 Y 발현 안정적 풀의 유가 배양에 의한 항체 생산량 평가
(5-2) 에서 제조한 인간화 항체 Y 발현 안정적 풀을 사용하여, 125 mL 용량 삼각 플라스크에서 유가 배양을 실시하였다. 기초 배지에 G13, 피드 배지에 F13 을 사용하였다.
생세포수, 항체 생산량, 1 세포 1 일당의 항체 생산량 (SPR : 비생산량 (specific production rate)) 의 추이를, 각각 도 5A, 도 5B, 도 5C 에 나타낸다. 1 세포 1 일당의 항체 생산량은, 샘플링 시점에서의 항체 생산량을, 샘플링 시점까지의 적산 생세포수로 나누어 산출하였다. 배양 초기에서는, Hspa5 의 프로모터에서의 항체 생산량, 1 세포 1 일당의 항체 생산량 모두, 컨트롤로서 사용한 인간 RPS7 프로모터와 동일한 정도, 인간 EF1-α 프로모터보다 낮았다. 그러나, Hspa5 프로모터에서는 배양의 중기 이후에서 1 세포 1 일당의 항체 생산량이 대폭 상승하고, 배양 10 일째의 시점에서는 각각 인간 RPS7 프로모터, 인간 EF1-α 프로모터의 1.3, 0.9 배, 배양 14 일째의 시점에서는 각각 인간 RPS7 프로모터, 인간 EF1-α 프로모터의 1.8, 1.4 배의 값을 나타냈다. 그 결과, 배양 14 일째의 Hspa5 프로모터에서의 항체 생산량은, 각각 인간 RPS7 프로모터, 인간 EF1-α 프로모터의 1.5, 1.4 배의 값에 도달하여, 현재 빈번하게 사용되고 있는 프로모터에서의 항체 생산량을 크게 상회하였다.
5-4) 인간화 항체 Y 발현 안정적 풀의 유가 배양에 의한 mRNA 발현량 평가
(5-3) 에서 실시한 유가 배양에서 시간 경과적으로 취득한 세포를 사용하여, 목적의 항체 Y 유전자의 mRNA 레벨에서의 발현량을 실시간 PCR 에 의해 비교하였다. 유가 배양의 4, 6, 9, 10, 11 일째의 세포로부터 RNeasy 마이크로 키트 (QIAGEN) 를 사용하여 추출한 전체 RNA 를 주형으로 하고, PrimeScript 고성능 RT-PCR 키트 (다카라 바이오) 를 사용하여 역전사 반응을 실시하여, cDNA 를 합성하였다. 다음으로, 역전사 반응액을 주형으로 하고, 이하에 나타내는 프라이머 세트와 SYBR Premix Ex Taq II (다카라 바이오) 를 사용하여, 실시간 PCR 을 실시하였다. H 사슬 유전자는 유전자 도입 시에 사용한 인간화 항체 Y 발현 벡터, Gapdh 유전자는 이하에 나타내는 프라이머 세트로 증폭한 DNA 단편을 TOPO 클로닝한 플라스미드 DNA 를 사용하여 검량선을 작성하여, 각 샘플의 H 사슬 유전자 및 Gapdh 유전자의 카피수를 산출하였다. 각 샘플의 H 사슬 유전자의 카피수를 Gapdh 유전자의 카피수로 나누어 표준화한 H 사슬 유전자의 발현량을 도 6 에 나타낸다. Hspa5 프로모터에서의 H 사슬 유전자의 mRNA 발현량은, 배양 초기에서는 컨트롤로서 사용한 인간 RPS7 프로모터와 동일한 정도, 인간 EF1-α 프로모터보다 낮았다. 그러나, 배양 중기 이후에서는 Hspa5 프로모터에서의 H 사슬 유전자의 발현량은 크게 상승하여, 인간 RPS7 프로모터, 인간 EF1-α 프로모터의 값을 크게 상회하였다. 이 mRNA 발현량의 시간 경과적 변화는 도 5C 에서 나타낸 단백질 발현량의 결과와 동일한 결과였다. 이상으로부터, Hspa5 프로모터에서의 배양 후기에 있어서의 단백질 발현량의 상승이 프로모터 활성의 상승에 의한 것이라고 나타났다.
H 사슬 유전자의 프라이머 세트
Figure pct00007
Gapdh 유전자의 프라이머 세트
Figure pct00008
(실시예 6) 레닐라 루시페라아제 발현량을 지표로 한 Hspa5 프로모터의 유가 배양에 의한 평가
6-1) 레닐라 루시페라아제 발현 벡터의 구축
레닐라 루시페라아제 발현 벡터 pGL4.82[hRluc/Puro] (PROMEGA) 의 멀티 클로닝 사이트에 Hspa5 프로모터, 인간 RPS7 프로모터, 혹은 인간 EF1-α 프로모터를 삽입하여, pGL4.82-Hspa5, pGL4.82-hRPS7, 혹은 pGL4.82-hEF1α 를 구축하였다.
구체적으로는, (3-1) 에서 조제한 KpnI-HindIII 로 소화 완료한 Hspa5 의 프로모터 서열을, pGL4.82[hRluc/Puro] 의 KpnI-HindIII 사이트 사이에 삽입하여, pGL4.82-Hspa5 를 구축하였다.
다음으로, pDSLHA4.1-hRPS7-Y 를 주형으로 하고, 이하에 나타내는 프라이머 세트와 PrimeSTAR Max DNA 중합효소 (다카라 바이오) 를 사용한 PCR 로 인간 RPS7 프로모터를 증폭하여, QIAquick PCR 정제 키트로 정제하였다. 정제한 DNA 단편을 XhoI-HindIII 로 소화시킨 후, pGL4.82[hRluc/Puro] 의 XhoI-HindIII 사이트 사이에 삽입하여, pGL4.82-hRPS7 을 구축하였다.
hRPS7 프로모터의 프라이머 세트
Figure pct00009
또, (3-3) 에서 조제한 NheI-HindIII 로 소화 완료한 인간 EF1-α 프로모터 서열을, pGL4.82[hRluc/Puro] 의 NheI-HindIII 사이트 사이에 삽입하여, pGL4.82-hEF1α 를 구축하였다.
6-2) 레닐라 루시페라아제 발현 안정적 풀의 제조
(6-1) 에서 구축한 레닐라 루시페라아제 발현 벡터 pGL4.82-Hspa5, pGL4.82-hRPS7, 혹은 pGL4.82-hEF1α 를, (1-2) 에 기재된 CHO-O1 세포에 (4-1) 에 기재된 방법으로 트랜스펙션하였다. 유전자 도입의 1 일 후, 배양액을 원심하여 상청을 제거, 퓨로마이신 8 ㎍/mL 를 포함하는 배지로 현탁하고, 6 웰 플레이트에서 12 일간 약제 선택 배양을 실시하였다. 그 후, T-25 플라스크, 계속해서 125 mL 용량 삼각 플라스크에서 5 ％ CO2, 37 ℃ 에서 배양하여, 레닐라 루시페라아제 발현 안정적 풀을 제조하였다. 안정적 풀은 각각의 레닐라 루시페라아제 발현 벡터로 N = 3 으로 제조하였다.
6-3) 레닐라 루시페라아제 발현 안정적 풀의 유가 배양에 의한 생산량 평가
(6-2) 에서 제조한 레닐라 루시페라아제 발현 안정적 풀을 사용하여, 125 mL 용량 삼각 플라스크로 유가 배양을 실시하였다. 기초 배지에 G13, 피드 배지에 F13 을 사용하였다. 유가 배양의 3, 4, 7, 9, 11 일째의 세포에 대해 레닐라 루시페라아제 어세이 시스템 (PROMEGA) 을 사용하여, 레닐라 루시페라아제의 발현량을 측정하였다.
구체적으로는 배양액을 9000G × 1 분간 원심하여 상청을 제거하고, PBS 로 1 회 세정한 후, 키트가 첨부된 레닐라 루시페라아제 어세이 용해 완충제를 사용하여 세포 용해물을 조제하였다. 그리고 상기 키트와 루미노미터를 사용하여, 레닐라 루시페라아제의 발광량을 측정하였다.
생세포수, 및 103 세포당의 레닐라 루시페라아제 발광량의 추이를, 각각 도 7A, 도 7B 에 나타낸다. 배양 초기의 세포에서는, Hspa5 프로모터에서의 레닐라 루시페라아제 발광량은, 컨트롤로서 사용한 인간 RPS7 프로모터보다 높고, 인간 EF1-α 프로모터와 동일한 정도였다. 그러나, 배양의 중기 이후의 세포에 있어서의 레닐라 루시페라아제 발광량은, Hspa5 프로모터에서는 시간 경과적으로 상승한 한편, 인간 RPS7 프로모터, 인간 EF1-α 프로모터에서는 크게 저하하였다. 그 때문에, 배양 11 일째 시점의 세포에서는, Hspa5 프로모터에서의 레닐라 루시페라아제 발광량은, 각각 인간 RPS7 프로모터, 인간 EF1-α 프로모터의 4.5, 4.8 배로 큰 값을 나타냈다. 즉, 레닐라 루시페라아제의 발현을 시도한 결과, Hspa5 프로모터에서는, 기존의 인간 RPS7 프로모터, 인간 EF1-α 프로모터와 비교해, 항체 발현계를 상회하는 생산량의 증강 효과를 확인할 수 있었다. 이상으로부터, 항체 이외의 단백질의 생산에 있어서도 Hspa5 프로모터가 유용하다는 것이 나타났다.
(실시예 7) 유가 배양에서의 항체 발현량을 지표로 한 Hspa5 프로모터 길이의 검토
7-1) 항체 발현 벡터의 구축
인간화 항체 유전자 Y 발현 벡터 pDSLHA4.1-hRPS7-Y 의, 항체 H 사슬 및 L 사슬 유전자의 프로모터를 Hspa5 프로모터의 부분 서열로 치환한, pDSLHA4.1-Hspa5-2.5-Y, pDSLHA4.1-Hspa5-2.0-Y, pDSLHA4.1-Hspa5-1.5-Y, pDSLHA4.1-Hspa5-1.1-Y, 및 pDSLHA4.1-Hspa5-0.6-Y 를 구축하였다. 각각의 발현 벡터로, Hspa5 의 개시 코돈 서열의 상류 약 2.5, 2.0, 1.5, 1.1, 0.6 kbp 의 뉴클레오티드부터 개시 코돈 서열에 대응하는 뉴클레오티드 서열 직전의 뉴클레오티드까지의 서열을, Hspa5 프로모터의 부분 서열로서 사용하였다.
pDSLHA4.1-Hspa5-2.5-Y 는, 이하의 방법에 의해 구축하였다. 먼저, pGL4.10-Hspa5 를 주형으로 하고, 이하에 나타내는 프라이머 세트와 PrimeSTAR Max DNA 중합효소를 사용한 PCR 로 차이니즈 햄스터 Hspa5 프로모터의 부분 서열을 증폭하여, QIAquick PCR 정제 키트로 정제하였다. 정제한 DNA 단편을 NotI-XbaI 로 소화시킨 후, H 사슬 유전자 발현 벡터 pDSH1.1-hRPS7-Y, 및 L 사슬 유전자 발현 벡터 pDSL2.1-hRPS7-Y 의 NotI-NheI 사이트 사이에 삽입하여, 각각 pDSH1.1-Hspa5-2.5-Y, pDSL2.1-Hspa5-2.5-Y 를 구축하였다. 다음으로, pDSL2.1-Hspa5-2.5-Y 를 AatII-HindIII 로 소화시켜 얻어진 DNA 단편을 pDSH1.1-Hspa5-2.5-Y 의 AatII-HindIII 사이에 삽입하여, pDSLH3.1-Hspa5-2.5-Y 를 구축하였다. pDSLH3.1-Hspa5-2.5-Y 의 발현 카세트 상류에 특허문헌 2 에 기재된 DNA 엘리먼트 A7 을 삽입하여, pDSLHA4.1-Hspa5-2.5-Y 를 구축하였다. 동일한 방법으로, pDSLHA4.1-Hspa5-2.0-Y, pDSLHA4.1-Hspa5-1.5-Y, pDSLHA4.1-Hspa5-1.1-Y, 및 pDSLHA4.1-Hspa5-0.6-Y 를 구축하였다.
Hspa5 프로모터 2.5 kbp 의 프라이머 세트
Figure pct00010
Hspa5 프로모터 2.0 kbp 의 프라이머 세트
Figure pct00011
Hspa5 프로모터 1.5 kbp 의 프라이머 세트
Figure pct00012
Hspa5 프로모터 1.1 kbp 의 프라이머 세트
Figure pct00013
Hspa5 프로모터 0.6 kbp 의 프라이머 세트
Figure pct00014
7-2) 인간화 항체 Y 발현 안정적 풀의 제조
(5-1) 및 (7-1) 에서 구축한 항체 발현 벡터 pDSLHA4.1-hRPS7-Y, pDSLHA4.1-hEF1α-Y, pDSLHA4.1-Hspa5-Y, pDSLHA4.1-Hspa5-2.5-Y, pDSLHA4.1-Hspa5-2.0-Y, pDSLHA4.1-Hspa5-1.5-Y, pDSLHA4.1-Hspa5-1.1-Y, 혹은 pDSLHA4.1-Hspa5-0.6-Y 를, (1-2) 에 기재된 CHO-O1 세포에 (4-1) 에 기재된 방법으로 트랜스펙션하였다. 그리고, (5-2) 에 기재된 방법으로 약제 선택 배양을 실시하여, 인간화 항체 Y 발현 안정적 풀을 제조하였다. 안정적 풀은 각각의 항체 발현 벡터로 N = 3 으로 제조하였다.
7-3) 인간화 항체 Y 발현 안정적 풀의 유가 배양에 의한 항체 생산량 평가
(7-2) 에서 제조한 인간화 항체 Y 발현 안정적 풀을 사용하여, 125 mL 용량 삼각 플라스크에서 유가 배양을 실시하였다. 기초 배지에 G13, 피드 배지에 F13 을 사용하였다.
생세포수, 항체 생산량, 1 세포 1 일당의 항체 생산량 (SPR : 비생산량) 의 추이를, 각각 도 8A, 도 8B, 도 8C 에 나타낸다. 의외로, Hspa5 프로모터의 길이를 3.0 kbp 로부터 0.6 혹은 1.1 kbp 로 짧게 하였더니, 배양 초기 단계부터 높은 생산성을 나타내고, 배양 5 일째의 시점에서, 항체 생산량, 1 세포 1 일당의 항체 생산량 모두, 컨트롤로서 사용한 인간 RPS7 프로모터, 인간 EF1-α 프로모터보다 높았다. 또한, Hspa5 프로모터의 길이에 관계 없이, 배양의 중기 이후에서 1 세포 1 일당의 항체 생산량이 상승하고, 배양 14 일째 시점에 있어서의 0.6 및 1.1 kbp 의 Hspa5 프로모터에서의 값은, 모두 인간 EF1-α 프로모터의 2.3 배의 값을 나타냈다. 그 결과, 배양 14 일째의 0.6 및 1.1 kbp 의 Hspa5 프로모터에서의 항체 생산량은 모두 0.5 g/L 를 상회하고, 각각 인간 EF1-α 프로모터에서의 2.1, 2.0 배의 값에 이르렀다. Hspa5 프로모터의 길이를 최적화함으로써, 그 프로모터능을 최대한 발휘할 수 있도록 되어, 현재 빈번하게 사용되고 있는 프로모터에서의 항체 생산량을 능가하는 결과가 얻어졌다.
7-4) 인간화 항체 Y 발현 모노클론의 유가 배양에 의한 항체 생산량 평가
(7-2) 에서, Hspa5 프로모터의 부분 서열 0.6 kbp 를 사용하여 제조한 인간화 항체 Y 발현 안정적 풀로부터 모노클론을 취득하고, 유가 배양에 의한 항체 생산량의 평가를 실시하였다.
먼저, 플로우 사이토메트리를 이용하여, 고발현 세포의 농축을 실시하였다. 구체적으로는 배양액을 200G × 3 분간 원심하여 상청을 제거하고, 2 ％ BSA-PBS 로 2 회 세정한 후, 2 ％ BSA-PBS 로 재현탁하였다. 얻어진 세포 부유액에 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-접합된 염소 F(ab')2 단편 항-인간 IgG (H ＋ L) (Beckman Coulter) 를 첨가하고, 4 ℃ 에서 30 분간 정치하여 염색하였다. 그 후, 200G × 3 분간 원심하여 상청을 제거하고, 2 ％ BSA-PBS 로 2 회 세정한 후, 2 ％ BSA-PBS 로 재현탁하였다. 얻어진 세포 부유액을 BD FACS Aria Fusionsorter (Becton Dickinson) 를 이용하여 소팅하였다. 소팅은 이하의 조건으로 실시하였다. 처음으로, 가로축에 FSC-Area, 세로축에 SSC-Area 를 취한 도트 플롯으로, SSC 의 값으로 2 개로, 또한 FSC 의 값으로 4 개로 분획하였다. 그리고, FSC 의 값이 가장 작고, 또한 SSC 의 값이 작은 분획의 세포 집단에 있어서, 고형광 강도를 나타낸 상위 5 ％ 의 세포 집단을 소팅하였다.
다음으로, 소팅한 세포 집단을 배양한 후, 연한천 배지에 현탁, 6 웰 플레이트에 파종하고, 5 ％ CO2, 37 ℃ 에서 배양하였다. 배양 후, ClonePix 2 를 사용하여 인간화 항체 Y 고발현 콜로니를 96 웰 플레이트에 픽하였다. 피킹한 콜로니는, 24 웰 플레이트, 6 웰 플레이트, T-25 플라스크, 125 mL 용량 삼각 플라스크로 순차 확대 배양하였다.
얻어진 인간화 항체 Y 발현 모노클론에 대해 회분 배양을 실시하고 고발현 모노클론을 선택하였다. 계속해서, 선택한 인간화 항체 Y 발현 모노클론에 대해, 125 mL 용량 삼각 플라스크에서 유가 배양을 실시하였다. 기초 배지에 G13, 피드 배지에 F13 를 사용하였다.
생세포수, 항체 생산량, 1 세포 1 일당의 항체 생산량 (SPR : 비생산량) 의 추이를, 각각 도 9A, 도 9B, 도 9C 에 나타낸다. 안정적 풀의 경우와 마찬가지로, 다수의 클론에 있어서 배양의 중기 이후에서 1 세포 1 일당의 항체 생산량이 상승하고 있었다. 또, 평가한 12 클론 중, 5 클론이 2 g/L 이상을 나타내고, 가장 생산량이 높은 ＃48 에서는 약 4 g/L 에 이르렀다. 이상으로부터, 프로모터 길이를 최적화한 Hspa5 프로모터를 사용함으로써, 다수의 클론을 평가하지 않아도 고생산 클론을 취득 가능하고, 그 중에 약 4 g/L 로 매우 높은 생산량을 나타내는 클론이 포함되어 있는 것을 알 수 있었다.
(실시예 8) 항체 발현량을 지표로 한, 인간, 마우스, 랫트 Hspa5 프로모터의 유가 배양에 의한 평가
8-1) 항체 발현 벡터의 구축
인간화 항체 유전자 Y 발현 벡터 pDSLHA4.1-hRPS7-Y 의, 항체 H 사슬 및 L 사슬 유전자의 프로모터를 인간, 마우스, 랫트 Hspa5 프로모터로 치환한, pDSLHA4.1-hHspa5-Y, pDSLHA4.1-mHspa5-Y, pDSLHA4.1-rHspa5-Y 를 구축하였다. 각각, Hspa5 의 개시 코돈 서열의 상류 약 1.0 kbp 의 뉴클레오티드부터 개시 코돈 서열에 대응하는 뉴클레오티드 서열 직전의 뉴클레오티드까지의 서열을, Hspa5 프로모터로서 사용하였다. 클로닝한 인간, 마우스, 랫트 Hspa5 프로모터의의 뉴클레오티드 서열을 각각 서열표의 서열 번호 2, 3, 4 에 나타낸다.
pDSLHA4.1-hHspa5-Y 는, 이하의 방법에 의해 구축하였다. 먼저, 인간 게놈 DNA 를 주형으로 하고, 이하에 나타내는 프라이머 세트와 PrimeSTAR Max DNA 중합효소를 사용한 PCR 로 인간 Hspa5 프로모터를 증폭하여, QIAquick PCR 정제 키트로 정제하였다. 정제한 DNA 단편을 NotI-NheI 로 소화시킨 후, H 사슬 유전자 발현 벡터 pDSH1.1-hRPS7-Y, 및 L 사슬 유전자 발현 벡터 pDSL2.1-hRPS7-Y 의 NotI-NheI 사이트 사이에 삽입하여, 각각 pDSH1.1-hHspa5-Y, pDSL2.1-hHspa5-Y 를 구축하였다. 다음으로, pDSL2.1-hHspa5-Y 를 AatII-HindIII 로 소화시켜 얻어진 DNA 단편을 pDSH1.1-hHspa5-Y 의 AatII-HindIII 사이에 삽입하여, pDSLH3.1-hHspa5-Y 를 구축하였다. pDSLH3.1-hHspa5-Y 의 발현 카세트 상류에 특허문헌 2 에 기재된 DNA 엘리먼트 A7 을 삽입하여, pDSLHA4.1-hHspa5-Y 를 구축하였다. 동일한 방법으로, pDSLHA4.1-mHspa5-Y, pDSLHA4.1-rHspa5-Y 를 구축하였다.
인간 Hspa5 프로모터의 프라이머 세트
Figure pct00015
마우스 Hspa5 프로모터의 프라이머 세트
Figure pct00016
랫트 Hspa5 프로모터의 프라이머 세트
Figure pct00017
8-2) 인간화 항체 Y 발현 안정적 풀의 제조
(7-1) 및 (8-1) 에서 구축한 항체 발현 벡터 pDSLHA4.1-Hspa5-1.1-Y, pDSLHA4.1-Hspa5-0.6-Y, pDSLHA4.1-hHspa5-Y, pDSLHA4.1-mHspa5-Y, 혹은 pDSLHA4.1-rHspa5-Y 를, (1-2) 에 기재된 CHO-O1 세포에 (4-1) 에 기재된 방법으로 트랜스펙션하였다. 그리고, (5-2) 에 기재된 방법으로 약제 선택 배양을 실시하여, 인간화 항체 Y 발현 안정적 풀을 제조하였다. 안정적 풀은 각각의 항체 발현 벡터로 N = 2 로 제조하였다.
8-3) 인간화 항체 Y 발현 안정적 풀의 유가 배양에 의한 항체 생산량 평가
(8-2) 에서 제조한 인간화 항체 Y 발현 안정적 풀을 사용하여, 125 mL 용량 삼각 플라스크에서 유가 배양을 실시하였다. 기초 배지에 G13, 피드 배지에 F13 을 사용하였다.
생세포수, 항체 생산량, 1 세포 1 일당의 항체 생산량 (SPR : 비생산량) 의 추이를, 각각 도 10A, 도 10B, 도 10C 에 나타낸다. 인간, 마우스, 랫트의 어느 Hspa5 프로모터를 사용하여 제조한 안정적 풀에서도, 차이니즈 햄스터의 Hspa5 프로모터와 마찬가지로, 배양의 중기 이후에서 1 세포 1 일당의 항체 생산량이 상승하여, 높은 항체 생산량을 달성할 수 있었다. 이상으로부터, 인간, 마우스, 랫트, 차이니즈 햄스터의 어느 Hspa5 프로모터를 사용한 경우여도, 항체 생산성을 향상시킬 수 있어, 그 효과가 생물종에 의하지 않는다고 시사되었다.
(실시예 9) 유가 배양에서의 항체 발현량을 지표로 한 Hspa5 프로모터와 A7의 조합 효과의 검토
9-1) 인간화 항체 Y 발현 안정적 풀의 제조
(7-1) 에서 구축한 DNA 엘리먼트 A7 을 포함하는 항체 발현 벡터 pDSLHA4.1-Hspa5-1.1-Y, 혹은 pDSLHA4.1-Hspa5-0.6-Y, 또는 DNA 엘리먼트 A7 을 포함하지 않는 항체 발현 벡터 pDSLH3.1-Hspa5-1.1-Y, 혹은 pDSLH3.1-Hspa5-0.6-Y 를, (1-2) 에 기재된 CHO-O1 세포에 (4-1) 에 기재된 방법으로 트랜스펙션하였다. 그리고, (5-2) 에 기재된 방법으로 약제 선택 배양을 실시하여, 인간화 항체 Y 발현 안정적 풀을 제조하였다. 안정적 풀은 각각의 항체 발현 벡터로 N = 2 로 제조하였다.
9-2) 인간화 항체 Y 발현 안정적 풀의 유가 배양에 의한 항체 생산량 평가
(9-1) 에서 제조한 인간화 항체 Y 발현 안정적 풀을 사용하여, 125 mL 용량 삼각 플라스크에서 유가 배양을 실시하였다. 기초 배지에 G13, 피드 배지에 F13 을 사용하였다.
생세포수, 항체 생산량, 1 세포 1 일당의 항체 생산량 (SPR : 비생산량) 의 추이를, 각각 도 11A, 도 11B, 도 11C 에 나타낸다. 0.6 및 1.1 kbp 의 Hspa5 프로모터의 어느 것을 사용한 경우여도, A7 을 포함하는 항체 발현 벡터에서는, A7 을 포함하지 않는 항체 발현 벡터와 비교해, 항체 생산량, 1 세포 1 일당의 항체 생산량 모두 높았다. 배양 14 일째 시점에 있어서의 A7 을 포함하는 0.6 및 1.1 kbp 의 Hspa5 프로모터에서의 항체 생산량은, A7 을 포함하지 않는 0.6 및 1.1 kbp 의 Hspa5 프로모터의 각각 2.1, 1.5 배의 값을 나타냈다. 또, A7 의 유무에 관계 없이, 배양의 중기 이후에서 1 세포 1 일당의 항체 생산량이 상승하여 있었다. 이상으로부터, DNA 엘리먼트 A7 과 Hspa5 프로모터를 조합하여 사용함으로써, 상승 효과에 의해 효과적으로 고생산을 실현하고 있는 것을 알 수 있었다.
산업상 이용가능성
본 발명의 외래 유전자의 제조 방법에 의해, 치료용 단백질이나 항체 등의 외래 유전자의 생산성을 향상시키는 것이 가능해진다. 특히, 포유 동물 세포의 배양 기간을 통해, 외래 유전자 발현 조절 기능을 감약 (減弱) 시키지 않고, 포유 동물 배양 세포의 배양 기간을 통해 외래 유전자의 강력한 발현이 가능한 열 충격 단백질 A5 유전자의 프로모터를 사용하는 본 발명의 제조 방법에 의해, 생산성을 향상시키는 것이 가능해진다.
서열표 프리텍스트
서열 번호 1 : 차이니즈 햄스터 유래 Hspa5 의 프로모터
서열 번호 2 : 인간 유래 Hspa5 의 프로모터
서열 번호 3 : 마우스 유래 Hspa5 의 프로모터
서열 번호 4 : 랫트 유래 Hspa5 의 프로모터
서열 번호 5 : 차이니즈 햄스터 유래 Hspa5 의 프로모터 Hspa5 의 개시 코돈의 상류 약 2.5 kbp 의 뉴클레오티드부터 개시 코돈에 대응하는 뉴클레오티드 서열 직전의 뉴클레오티드까지로 이루어지는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 6 : 차이니즈 햄스터 유래 Hspa5 의 프로모터 Hspa5 의 개시 코돈의 상류 약 2.0 kbp 의 뉴클레오티드부터 개시 코돈에 대응하는 뉴클레오티드 서열 직전의 뉴클레오티드까지로 이루어지는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 7 : 차이니즈 햄스터 유래 Hspa5 의 프로모터 Hspa5 의 개시 코돈의 상류 약 1.5 kbp 의 뉴클레오티드부터 개시 코돈에 대응하는 뉴클레오티드 서열 직전의 뉴클레오티드까지로 이루어지는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 8 : 차이니즈 햄스터 유래 Hspa5 의 프로모터 Hspa5 의 개시 코돈의 상류 약 1.1 kbp 의 뉴클레오티드부터 개시 코돈에 대응하는 뉴클레오티드 서열 직전의 뉴클레오티드까지로 이루어지는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 9 : 차이니즈 햄스터 유래 Hspa5 의 프로모터 Hspa5 의 개시 코돈의 상류 약 0.6 kbp 의 뉴클레오티드부터 개시 코돈에 대응하는 뉴클레오티드 서열 직전의 뉴클레오티드까지로 이루어지는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 10 : Hspa5 프로모터의 프라이머 Hspa5-KpnI-F
서열 번호 11 : Hspa5 프로모터의 프라이머 Hspa5-HindIII-R
서열 번호 12 : hEF1α 프로모터의 프라이머 hEF1α-NheI-F
서열 번호 13 : hEF1α 프로모터의 프라이머 hEF1α-HindIII-R
서열 번호 14 : Hspa5 프로모터의 프라이머 Hspa5-NotI-F
서열 번호 15 : Hspa5 프로모터의 프라이머 Hspa5-XbaI-R
서열 번호 16 : hEF1α 프로모터의 프라이머 hEF1α-NotI-F
서열 번호 17 : hEF1α 프로모터의 프라이머 hEF1α-NheI-R
서열 번호 18 : 인간화 항체 Y 의 H 사슬 유전자의 프라이머 HC-F
서열 번호 19 : 인간화 항체 Y 의 H 사슬 유전자의 프라이머 HC-R
서열 번호 20 : Gapdh 유전자의 프라이머 Gapdh-F
서열 번호 21 : Gapdh 유전자의 프라이머 Gapdh-R
서열 번호 22 : hRPS7 프로모터의 프라이머 hRPS7-XhoI-F
서열 번호 23 : hRPS7 프로모터의 프라이머 hRPS7-HindIII-R
서열 번호 24 : Hspa5 프로모터 2.5 kbp 의 프라이머 Hspa5-NotI-2500F
서열 번호 25 : Hspa5 프로모터 2.0 kbp 의 프라이머 Hspa5-NotI-2000F
서열 번호 26 : Hspa5 프로모터 1.5 kbp 의 프라이머 Hspa5-NotI-1500F
서열 번호 27 : Hspa5 프로모터 1.1 kbp 의 프라이머 Hspa5-NotI-1100F
서열 번호 28 : Hspa5 프로모터 0.6 kbp 의 프라이머 Hspa5-NotI-600F
서열 번호 29 : 인간 Hspa5 프로모터의 프라이머 Hspa5-인간-NotI-F
서열 번호 30 : 인간 Hspa5 프로모터의 프라이머 Hspa5-인간-NheI-R
서열 번호 31 : 마우스 Hspa5 프로모터의 프라이머 Hspa5-마우스-NotI-F
서열 번호 32 : 마우스 Hspa5 프로모터의 프라이머 Hspa5-마우스-XbaI-R
서열 번호 33 : 랫트 Hspa5 프로모터의 프라이머 Hspa5-랫트-NotI-F
서열 번호 34 : 랫트 Hspa5 프로모터의 프라이머 Hspa5-랫트-XbaI-R
서열 번호 35 : DNA 엘리먼트 A2 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 36 : DNA 엘리먼트 A7 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 37 : DNA 엘리먼트 A18 의 뉴클레오티드 서열
SEQUENCE LISTING <110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED <120> Promoters of Hspa5 <130> FP1713 <150> JP2016-195564 <151> 2016-10-03 <160> 37 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2949 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 1 tatagcccag gcacacatga acttgtaatc ctcctgcttc agcctcttca gtagctgggg 60 ttacaggcct accactaggt gtggctcagg tatcactttt ttaaatgtta caaaaattgg 120 tgcaagtact tcattaatca aaaaacaggc tgaaattgag ttttgtattt tagtggaaat 180 agactgtgat acagatgtgc ttgaaatgac atgaagctgt gatgtggtca aatagtgatt 240 tttttctttc atttcttctt cttgttctta ctcttttttc atatagggtt tcaatatgca 300 gctctggaac tatttagacc aggatggcct tgaattcaag agatccctct gcttctgcct 360 cccttgtgct gagattaaag tcatgagcca ccatatccgg ctgtagtctc ctttaaaatt 420 caagccaaaa gtatctgcaa agatggtcgg tggttaagag cactggctgc tctttcatgg 480 gaccagggat taaaggcatg cagcagtaaa ctgggcttag tgacttctgt cttcatactg 540 gactggtaca gtcccaagga agatcaatgt tatgacagta ttacaagcct tactgaaagt 600 ggtgtatgat gcaacatctg tagaaaagat ggtgttgact gagtcaccaa cataaccttt 660 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cgcagacccc gcagcagtcc ccgggggccg ggtgacggga ggacctggac 2400 ggttaccggc ggaaacggtc tcgggttgag aggtcacctg agggacaggc agctgctgaa 2460 ccaataggac cggcgcacag ggcggatgct gcctctcatt ggcggccgtt gagagtaacc 2520 agtagccaat gagtcagccc ggggggcgta gcggtgacgt aagttgcgga ggaggccgct 2580 tcgaatcggc agcggccagc ttggtggcat ggaccaatca gcgtcctcca acgagaagcg 2640 ccttcaccaa tcggaggcct ccacgacggg gctgggggga gggtatataa gccaagtcgg 2700 cggcggcgcg ctccacactg gccaagacaa cagtgaccgg aggacctgcc tttgcggctc 2760 cgagaggtaa gcgccgcggc ctgctcttgc cagacctcct ttgagcctgt ctcgtggctc 2820 ctcctgaccc ggggggcttc tgtcgccctc agatcggaac gccgccgcgc tccgggacta 2880 cagcctgttg ctggacttcg agactgcaga cggaccgacc gctgagcact ggcccacagc 2940 gccggcaag 2949 <210> 2 <211> 999 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 acagtaggga ggggactcag agctggaggc aattcctttg gccgggcttg tcctgcgact 60 taccgtgggg cagcgcaatg tggagaggcc tggtaaaatg gctgggcaag ggtgcggagg 120 ggacataact ggcaggaagg agtcatgatt cgtggtcgaa cagagtccag accagctcga 180 cctgtgagca acgaacggcc ctgagactcg cataccccaa taccggtagt ggccgtgaag 240 ggcaaagaaa tgtgttctga ggcgatccca gcatctaagc tgcgactggt ctactcagag 300 actggatgga agctgggaag agaaagctgc ttcccgcttc ggggtgaggg atggaggaag 360 ggagaacaag cagtagagaa ggaaaagttt cagatcccac agccccgggg ggtcactcct 420 gctggatcta ctccgacccc ctagggccgg gagtgaaggc gggacttgtg cggttaccag 480 cggaaatgcc tcggggtcag aagtcgcagg agagatagac agctgctgaa ccaatgggac 540 cagcggatgg ggcggatgtt atctaccatt ggtgaacgtt agaaacgaat agcagccaat 600 gaatcagctg ggggggcgga gcagtgacgt ttattgcgga gggggccgct tcgaatcggc 660 ggcggccagc ttggtggcct gggccaatga acggcctcca acgagcaggg ccttcaccaa 720 tcggcggcct ccacgacggg gctgggggag ggtatataag ccgagtaggc gacggtgagg 780 tcgacgccgg ccaagacagc acagacagat tgacctattg gggtgtttcg cgagtgtgag 840 agggaagcgc cgcggcctgt atttctagac ctgcccttcg cctggttcgt ggcgccttgt 900 gaccccgggc ccctgccgcc tgcaagtcgg aaattgcgct gtgctcctgt gctacggcct 960 gtggctggac tgcctgctgc tgcccaactg gctggcaag 999 <210> 3 <211> 1000 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 3 atggtggaaa gtgctcgttt gaccatagta ctgaatctcc gcggcggaga aagggaatag 60 gttacaattg gccaggccaa tcctgggact taaccccggc aaagggaaga ttcgaaaggc 120 ctggaaagac acatacggct agccttgggg tgaaggagaa acacggttag ctgagaagca 180 ccaggattct cagcgaggca gaatccagat caggccccag ctcgagacgt gcaggccggg 240 cgagtaacag ggcctggact ctgggacatc cgagaacgtg tggaggctgg ggagggcgat 300 cacagctgag gccgggcagc tcaggacgcg gggaatcgag gaggagaaag gccgcgtact 360 tcttcagagt gagagacaga aaaggagacc ccgagggaac tgacacgcag accccactcc 420 agtccccggg ggcctggcgt gaggggagga cctgaacggt taccggcgga aacggtctcg 480 gggtgagagg tcacccgaag gacaggcagc tgctgaacca ataggaccag cgctcagggc 540 ggatgctgcc tctcattggt ggccgttaag aatgaccagt agccaatgag tcagcccggg 600 gggcgtagca atgacgtgag ttgcggagga ggccgcttcg aatcggcagc agccagcttg 660 gtggcatgga ccaatcagcg gcctccaacg agtagcgact tcaccaatcg gaggcctcca 720 cgacggggct gtggggaggg tatataaggc gagtcggcga cggcgcgctc gatactggcc 780 gagacaacac tgacctggac acttgggctt ctgcgtgtgt gtgaggtaag cgccgcggcc 840 tgctgctagg cctgctccga gtctgcttcg tgtctcctcc tgaccccgag gcccctgtcg 900 ccctcagacc agaaccgtcg tcgcgtttcg gggccacagc ctgttgctgg actcctaaga 960 ctcctgcctg actgctgagc gactggtcct cagcgccggc 1000 <210> 4 <211> 1000 <212> DNA <213> Rutilus rutilus <400> 4 ctcaacggag aagggctccg gactaggtta caattggcca ggccaatcct gggacttatc 60 cccgggaaag ggaaaatcag aaaggcccag aaacatacat acaactagac ttggggtgaa 120 cgaggagcat gattagctga gaagagccag gattctcagc gaggcagaac ccataccagg 180 ccccagcccg ggacatgcag gcccgttgag taacagggcc tggacgctgg aacacccgag 240 aaaagtgccg aggctgggaa gggtgatcac agcatcacag ctgaggccgg gcagctgaag 300 acatgagtga atctaggaga agaaaggcag cgtacttctt ccgagtgaga gacagaaaga 360 gaggacccga gtctcacagc cctgagggaa ctgacacgca gaccccactc cagtccccgg 420 gggcccaacg tgaggggagg acctggacgg ttaccggcgg aaacggtttc caggtgagag 480 gtcacccgag ggacaggcag ctgctcaacc aataggacca gctctcaggg cggatgctgc 540 ctctcattgg cggccgttaa gaatgaccag tagccaatga gtcggcctgg ggggcgtacc 600 agtgacgtga gttgcggagg aggccgcttc gaatcggcag cggccagctt ggtggcatga 660 accaaccagc ggcctccaac gagtagcgag ttcaccaatc ggaggcctcc acgacggggc 720 tgcggggagg atatataagc cgagtcggcg accggcgcgc tcgatactgg ctgtgactac 780 actgacttgg acacttggcc ttttgcgggt ttgagaggta agcgtcgcgg cctgcttcca 840 ggcctaccct gattttggtt cgtggctcct cctgaccctg agacctctgt cgccctcaga 900 tcagaaccgt cgtcgcgttt cggggctaca gcctgttgct ggactctgtg agacacctga 960 ccgaccgctg agcgactgac tggtccacag cgccggcaag 1000 <210> 5 <211> 2506 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 5 tggtcggtgg ttaagagcac tggctgctct ttcatgggac cagggattaa aggcatgcag 60 cagtaaactg ggcttagtga cttctgtctt catactggac tggtacagtc ccaaggaaga 120 tcaatgttat gacagtatta caagccttac tgaaagtggt gtatgatgca acatctgtag 180 aaaagatggt gttgactgag tcaccaacat aacctttgag gaacaagaaa ggagaaattc 240 ctgaacagtg actcacaagc tcacatttta gtgaactgtg tgtaatgttc cagtagtatt 300 cagacagtct acttatgaag ctcaagatac atttaatggg aatactggag tcatttcctg 360 cccgtgacaa catcctaagc atctcctata agcatgtata taagtaagca catgggaggc 420 agagacagta gatctgagag ctccatccca ggggatggat atcagtcagt tgcctagcat 480 gcacagaatc ttgggtcaag tcccaactgg acacagtaat gtatgcctat tagtcccaac 540 acttggaagg tattggcaga aggttcagga gttcaaagtc atctgctaca aagtgttgag 600 gctagcctgg gttacatgag tctccatctt taaaaaaaga aaaaagtggg gctggaaaga 660 tggctcagtg gttaagagca ccgcctgctc ttccaaaggt cctgagttca attcccagca 720 accacatggt ggctcaaaac catctgtagt gaaatctggt gccctctgtg tacaagataa 780 atgaatgaat cttaaaaaaa aaagtcagtg ggtggtggtg gcgcacacct ttagtcccag 840 cactcgggag aggcaggtgt gagttcgaga ccagcctggt ctacaagagc tacttccagg 900 acaaagcctc caaagccaca gagaaaccct gtctcgaaaa accaaaccaa accaaaccaa 960 aaaagtcaat agcataagct acagatcaac caggttatca attctacctg taccactcac 1020 cagtgactat tctatttagc cacccccccc ccaatgatct cttctggaaa atgggaaaca 1080 tctaccaaga attaatcaaa ggactaaatg acacatgcaa aaaaaaaaaa accttagaac 1140 agtgttttaa gcaggataag tagttcaaga ccagtttgga ccatgtctca aaactaaagg 1200 aacaacgaag tacatttagt attttttgca acatgttatt attacatagc atcaggaaga 1260 caattttttc tttgtctgct aaatgccttt gtcatatcag acctatttca 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gagtgagaaa ggtggaagtg gagaaataga 1500 ggcccaaaaa gaaagtttta tcacaggaat atctagatgt cttctgggat tgtctgttaa 1560 agagctgtga cactcatata aatgcagaat tactctcttt cttccttgtt ggttagaagg 1620 ccaagggtgc catggtaata ctaccaaaca tatatcaaag cttggcagga aaaatggtac 1680 cttcagaaat tttataatct gatatcaaat aggtcaagaa atataataaa actagtttct 1740 ttggtttcct tagaaacctg gaaaacttta aattagaaac ttagaaagct ttaaatcaga 1800 ctttgtagtt aaaaaaggaa attttagttc cttccagcat tagaattccg tgattctctg 1860 actctgagcc tggattaaat ctagcccagc tgagtggaaa cttaagtaac tagctggttg 1920 cctttagtga tcttccactt tatggctgct tccgcctaag aagttcatca tcgtgactta 1980 ctttctttgg ggcaaagtcg tgactaactt tctttggggc aaagttggaa agcagaggtc 2040 aaagtcaatc agaaatggga caaactcact tcctactgcc tggtgaaggg gccattttca 2100 gtagcccctt ttcaagatta gtttcattca agatttgata agctgttttg actttactat 2160 agatcttatt atccatgtca gttaagttta tgcttccact aaatctatct gaattcaaaa 2220 ggtaaaaagc taatgctcag tcttatcaga tttatcttat ttattaatag aatgtggatt 2280 tttttaagca tataacaata atagtaatga taggaccata aatgtggatg gctctttaca 2340 agtcactaac attacataaa ttcctcaaca acacactctg aggccataac aaacttttag 2400 aaataacaca attggctacg gaactccagc catctagctt catgggctcc cactttaatt 2460 tcaaaacaac agaactgtgc acattcattt acatgattag ggcagagctt aactgtatct 2520 catgtagcac ctacatcatt cttcagacaa acttattgcc ttttacagac aagaaaactg 2580 gggctcaaaa aaggacttgc ttataactgg ctaataaaga ggaactctgg gttcaaagtg 2640 agtccaattc tttcttccac ccacagcttc tgctaaagtc attacagaaa tgcatagagc 2700 agttcttcca cgttattgct taggtttcta aagagcagtg acctaataca acatgctcta 2760 taatttatta ctgatttaac tatttcacta aggattcact tttaactttt aacttgtaaa 2820 tatgtctaat aaacaccact gaaatagcaa cctctttctt catggccttg tggttgtaaa 2880 gcaagctagt aatatatgtc tgtggatttg tgctaataaa gttctataca cctcattaat 2940 tccacaaatc ctactgggta tttcttatct gccagatcct acgctaggta ctggatacac 3000 agtactgaac aaaatgggta caaatgagcc tcacagagct tgtttcattg aaaagcagag 3060 agatacacac taatcaacaa attaatagta acacactacg atgtgttttg aaggaaaatt 3120 agagcatcaa agagacggtg ttagcaggtg gaggggagct cttttagatg gagaatgaga 3180 atgcctccct aaagacatgg gaataaattg agatcacaaa aaatgagaaa tagccagcct 3240 tgagaagagc agaaggaaga acattcaaag gaaaagaaag tgcatactgg aaagcctgaa 3300 cactagagtt tggtgtatgt aaggagctga gcaatggtca cttgtgtgat aagatgtgtg 3360 gatgtggggt ggggggcagg ggtgagtccc acgcagctct taagtgtgtc ctcagactcc 3420 tgtggtttcc atcagccaca acctgaataa ctgtgtggta atccaaaaat gattacagat 3480 taaacatata aaaatatcat tacacccata gtacctaagc caaggacaca gtattctatc 3540 ttttcaatga agatctgcat gaagtaaaat tattatatat aattttaggt attgatatag 3600 atacatcagt ggatagatat agatatgtgt ctctggtata gaaaaaagtt ttaaagggat 3660 attaaaagtt cttatcttgc agggttgaag attgtggcaa ctttcatttc tttttaattt 3720 taagaaaaaa gtggtattat gggggattag catgtttgtg ggtatatgta tatttttaat 3780 taaaaaataa acaacaaaat gaaaacgttt ttcttctatg aaagcctaat aagaagaaat 3840 ttcagctgtt ttaacttagg gagctaaaaa catcaaatcc aagaatgttc tctggaactg 3900 agctcaatac atttttattt gagtaagaat tggatacatt tccatcccct tggggctcca 3960 gtctgtcaat attttacttt tcagcgataa aaagacacat gtagataatc acagtgacct 4020 cagtaacttt ccttctctta tttaagttta ttttatttct atcgtagttt tccctgttaa 4080 agattttttc tttttgctta catatataat tttagagaat aacaatgcac acacaaaaaa 4140 ttcctcttgt tctgctagac ctggactttt tctctaatat atatctccat tttttgtctt 4200 ttttcagacg tattttggaa gcaaaggaga gaattgctat atagctgact tcctcttctc 4260 atcaacagtg ttttaacagt ttttaagcaa aagtcagctt tgtttatcta agattttttt 4320 tgctggcatt taacctaccc ctgcctcccc tttcccaagt ccacttcagc caacctctca 4380 ttcgacaggt accaccctct aacataactg aaataatgtc taccattact ggatcttgct 4440 agcaaagaat ctcaaatttt cccacttggt tgtaaattat tttgtaatct ctagtgttta 4500 aggtgcgctt gtcctatcta atcccctccc tggcaggaca ccttacagaa cctacccctt 4560 acactagtca ttaagcacca tcagggacgg atggctgtgt cactggtctg tttggtattc 4620 cctactgatc ctaccatgtg gtgattatct atgacttccc taatccctgg ctgccttagc 4680 tgggactggc tgacatgctt ctcaggttgc cgctggcttt acagtccttt actgcccatg 4740 ccactttgga gataggcagg gctagtactt ttctatataa gcccccaaac ttgactttgt 4800 gtttcacagt aggtgaaaaa gttgggtctc ttttctttta cttttctttc cacaagatga 4860 taaagctagg ggaagcctgt ggacatggtt tatttctgca actgcaatga ttgattggtg 4920 cttcctgctg cttacttcct aaactttgtg ctcagtgtca gatccctagc agtttctatc 4980 ccctgctctg ctaaaaaaga atggatgttg actctcaggc cctagttctt tttaattaaa 5040 ttgtattttt gttatcatta ttattattat tattttgaga tggggtctta ctctgtcgcc 5100 caggctgaag tgcagtggtg caatcacagc tcactgtttt agcctcctga gtagctggga 5160 ctacaagcgt catgccacca tgcttctttt taatttttta aaatggtttt ctgccttcaa 5220 ttctaagcac ttctcaattg taaccaagag ataatacttt ttatgaattc ttaaagttat 5280 caacagatac tcaaagtttt agcaaagtct aaatgatatt aagcttgtcc ttattgccca 5340 agtgacttca atgactattt gttaattgca accaagggtc attttttaaa tgaatatata 5400 ttattattat atatataata ttaaggtcct caaataccta aaagtttagc aaaatctaaa 5460 taatattgtg catattcttt tattactgta ttagtccgtt ttcatgttgc tgataaagac 5520 atacccaaga ctgggcaatt tacaaaagaa agaggttcac tggactcaca gttccacgtg 5580 gctggggagg cctcacaatc acggcagctt acgggattgt tgagaaatga cacttctcaa 5640 gctggggcta aactatctct gtggtagttg ttctgattca agtattgaat tggttttttt 5700 tgtttttttt gagatggagt ttcgttcttg ttgcccaggc tggagtgcaa tggcacgatc 5760 tcagctcacc gcaacctctg cctcccgggt tcaagtgatt ctcctgcttc agcctcccaa 5820 gtagctggga ctacaggcat gagccaccac acccagctaa ttttgtattt ttagtagaga 5880 catggtttct ccatgttggt caggctggtc tcaaactccc aacctcaggt gatccacctg 5940 ccttggcctc ctaaagtgct gggattacag gcataagcca ccgtgcccgg ctggagcatt 6000 ggtatataaa agctgcctag gtaactctaa cctttggccc catacatctg aaggatacct 6060 acaatgcacc tgaaaaatgc aactgaaaca gtagttccct gggaccacac actcagaaag 6120 ggggtgtatc aggagatcta gggaccagga gggtggaaga cctaaggcag cactacagat 6180 gatggagaaa aacccactgg ggaggggcga tcctaacctt gagaatcact gagatcatgc 6240 agaagtattt gatcctacag cattaatatt gtattgtatt gtattagtat atatatatag 6300 tgtatatata tagtattagt atatatattg tattgtatta gcatatatat actaattgta 6360 ttgtattgta tttatatata tagtattgta ttagtatata tatacagtat atatgtatat 6420 atactaatac aatgtactaa tacaatacaa taccatatat atatacacta acacaataca 6480 attagtatat atatatatat atatactaat acaatacaat actatatata tactaataca 6540 atatatacat atatactcac caagacatat tagtggtctg atgtctggct gccacactca 6600 tcttctacct tcagctctgc tctaccaaat atcatttgtt tctgggatct ttgcagtcca 6660 aggaacttca tccttgatat cccacccctt actaactttt tttttttttt ttttttttga 6720 gacggagtct cgctgtgtca cccaggctgg agtgcagtgg tgtgatctcg gctcactgca 6780 agctccacct cctgggatca caccattctc ctgcctcagc ctcccaagta gctgggacta 6840 caggtgcccg ccaccacacc aggctaatgt tttaccgtgt tagcaaggat ggtctcgatc 6900 tcctgacctc atgatccatc cgccttggcc tcctaaagtg ctgggattac aggcataagc 6960 caccgcaccc ggccacccct tactaatttt tagtaacgtc caaggattaa aggaaatttg 7020 ccttacctat ttaacaggaa tcaacagggt taatctcact ccctttctaa aaataattta 7080 taaacattgc agacaatctc atctatccct gtctaaactg tgtggaatta ctgccattta 7140 atgtaatcag tctactcatt tagtttgcct aaggaatttt tgaaaaaaca gttaaatgaa 7200 tgacttaatg gaataaccag gaagttgaag tctccaatag taagaatgaa ctcttgctct 7260 ctggataatc aaatgggtcc ttcctccttc aggtagatca tgccatttcc tcacttacac 7320 tgaacaggta aacaacataa ttactgactt caacttctag ttaattcctt cttttatcac 7380 tgagtatcct ttggctggga gttttgttgg ctatgctgcc attttttcta gttatcacag 7440 tcctataaca taccaatcct tcaatataac tcatctttaa attgtggttt taccttctca 7500 agaagttatt aattatgcca gtgctaaatc ttctaaaatg attgttgact tgttgattag 7560 cccccatgca attcccctct cccgtccctc agcacgtaag gaatggccct ttgcttactt 7620 ccacagatcc ttaaatctac cagttagaag ctaatagcct acctctctac caggaaggaa 7680 ctgtgggctg gaacataata catgttgact tataatttct tagaaaattg tgtgagaaac 7740 atcaaactcc tgattccagg atatgccaaa gacacatcat taaaaagcaa aacaaaacaa 7800 aacaaacctc atttgacgtt gctagtagtg gcatatttca tcaagatcag ctcaaataaa 7860 tagaagtgag attttcacac aaattagact gtagtgcttt tttttttaac ttatctttac 7920 catatgattt ttaacggtaa aaaaaatcgt ttgagatatt agatgtataa tatttatcat 7980 ccaattactt cattagttca atcttttttc aatggcgctc ctgcatctga gaataaggtc 8040 agaaaatttc atgttctgat ttcatgctga ttttcagaag aaaaatgtta gttttgtata 8100 gaataaccca tcctaagaaa tacatttctt attatatttc ttatcttata tttcttagga 8160 caatgagcta ttcaaagggt gatgataacc agcaccatca gtcagcatta tctaagaata 8220 agaatctgtg tttctacata cagacctcct aaaaaggaac ctacacttaa caggattccc 8280 caggcaattt ggatgcacat taaagcttga gcaacactgc attagaaagt tagttttcca 8340 tcacaaaaac agtaacaaaa ggaatataaa gtaagttact ttaataatat aagaagaggg 8400 gcaggccggg cgcagtggct cacgcctgta atcccagcac tttgggaggc tgaggcgggt 8460 ggatcacctg aggtc 8475

Claims (25)

  1. 차이니즈 햄스터 유래 Hspa5 유전자의 프로모터이고, 서열 번호 9 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 서열 번호 1 에 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 그 뉴클레오티드 서열의 부분 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    서열 번호 1 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는, 폴리뉴클레오티드.
  3. 제 1 항에 있어서,
    서열 번호 5 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는, 폴리뉴클레오티드.
  4. 제 1 항에 있어서,
    서열 번호 6 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는, 폴리뉴클레오티드.
  5. 제 1 항에 있어서,
    서열 번호 7 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는, 폴리뉴클레오티드.
  6. 제 1 항에 있어서,
    서열 번호 8 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는, 폴리뉴클레오티드.
  7. 제 1 항에 있어서,
    서열 번호 9 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는, 폴리뉴클레오티드.
  8. 인간 유래 Hspa5 유전자의 프로모터인, 서열표의 서열 번호 2 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
  9. 마우스 유래 Hspa5 유전자의 프로모터인, 서열표의 서열 번호 3 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
  10. 랫트 유래 Hspa5 유전자의 프로모터인, 서열표의 서열 번호 4 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 뉴클레오티드 서열에 대해 95 ％ 이상 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드로서, 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드.
  12. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 뉴클레오티드 서열에 대해 99 ％ 이상 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드로서, 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드로서, 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 이루어지는, 외래 유전자 발현 유닛.
  15. 제 14 항에 있어서,
    외래 유전자가 다량체 단백질을 코드하는 유전자인, 외래 유전자 발현 유닛.
  16. 제 14 항에 있어서,
    외래 유전자가 헤테로 다량체 단백질을 코드하는 유전자인, 외래 유전자 발현 유닛.
  17. 제 14 항에 있어서,
    외래 유전자가 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 코드하는 유전자인, 외래 유전자 발현 유닛.
  18. 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 기재된 외래 유전자 발현 유닛을 포함하는 외래 유전자 발현 벡터.
  19. 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 기재된 외래 유전자 발현 유닛 및 하기 A 군의 (a) 내지 (e) 에 기재된 폴리뉴클레오티드에서 선택되는 어느 하나 또는 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 외래 유전자 발현 벡터 ;
    A 군
    (a) 서열표의 서열 번호 35 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드,
    (b) 서열표의 서열 번호 36 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드,
    (c) 서열표의 서열 번호 37 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드,
    (d) 상기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열에 대해 95 ％ 이상 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드이고, 외래 유전자 발현 항진 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드,
    (e) 상기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열에 대해 99 ％ 이상 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드이고, 외래 유전자 발현 항진 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드.
  20. 제 18 항 또는 제 19 항에 기재된 외래 유전자 발현 벡터가 도입된 형질 전환 세포.
  21. 제 20 항에 있어서,
    세포가 포유 동물 유래의 배양 세포인, 형질 전환 세포.
  22. 제 21 항에 있어서,
    포유 동물 유래의 배양 세포가, COS-1 세포, 293 세포, 또는 CHO 세포인, 형질 전환 세포.
  23. 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 기재된 형질 전환 세포를 배양하고, 배양물로부터 외래 유전자 유래의 단백질을 취득하는 것을 특징으로 하는, 외래 유전자 유래의 단백질의 제조 방법.
  24. 형질 전환 세포에 있어서 외래 유전자를 발현시키는 것을 목적으로 하는, 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드의 사용.
  25. 형질 전환 세포에 있어서 외래 유전자를 발현시키는 것을 목적으로 하는, 제 18 항 또는 제 19 항에 기재된 외래 유전자 발현 벡터의 사용.
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