TW202146432A

TW202146432A - 新基因表現單元

Info

Publication number: TW202146432A
Application number: TW110112080A
Authority: TW
Inventors: 酒井雄大; 西尾真初; 增田兼治
Original assignee: 日商第一三共股份有限公司
Priority date: 2020-04-03
Filing date: 2021-04-01
Publication date: 2021-12-16
Also published as: WO2021201268A1

Abstract

本發明課題係提供一種在源自哺乳動物的培養細胞等宿主細胞中，更新會成為蛋白質性醫藥品之外源蛋白質的生產的手段。解決手段係提供一種在外源基因的表現亢進所使用的新穎的表現單元、一種包含該表現單元的轉型細胞(transformed cell)，一種使用該轉型宿主細胞並高分泌生產外源蛋白質的方法。

Description

新基因表現單元

本發明關於一種哺乳動物轉型細胞，其藉由使用組合轉錄活性(transcriptive activity)高的啟動子與轉譯活性(translation activity)高的5’-UTR所設計出的表現單元而增強外源蛋白質的表現量；以及一種使用其之該外源蛋白質的製造方法。

因基因重組技術的發展，治療用蛋白質及抗體醫藥等的蛋白質醫藥品正急速地擴大其市場。其中，抗體醫藥即使對人體進行投予亦不引起有害的免疫反應，且因其高度的專一性而開發旺盛地進行中。就生產以抗體醫藥為代表之蛋白質醫藥的宿主而言，具有與人類類似的糖鏈結構，且轉譯後可修飾，進而考慮安全性方面，而中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary，CHO：中國倉鼠的卵巢)細胞等哺乳動物培養細胞成為現在的主流。以哺乳動物培養細胞作為宿主的情況，與微生物等相比較，起因於增殖速度及生產率低的高製造成本成為了問題(非專利文獻1)。再者，因近年抗體醫藥的發展與投予量多，而世界性抗體醫藥的生產能力不足。以提升生產能力為目標，而謀求蛋白質醫藥品之各製造步驟的改良，而哺乳類培養細胞表現系統的改良係在達成生產量提升面向上有力的手段(專利文獻1～3，非專利文獻2、3)。啟動子存在於DNA上，RNA聚合酶從啟動子區域內的轉錄起始點開始轉錄RNA。進行轉錄的效率主要與轉錄起始點上游的序列區域有關，轉錄效率高的啟動子係於序列區域內具有多個轉錄因子的結合序列(非專利文獻4)。在帶有基因/蛋白質訊息的信使RNA(mRNA)，係透過轉譯而合成蛋白質。mRNA不僅具有基因/蛋白質訊息，在其上游與下游還具有為不含基因/蛋白質訊息之非轉譯區域的5’-非轉譯區(5’-Untranslated Region，5’-UTR)及3’-UTR。非轉譯區域與基因表現相關，但特別是5’-UTR係控制轉譯效率(非專利文獻5)。轉譯量、mRNA的細胞內穩定性，會依5’-UTR內的AUG序列及RNA結合蛋白質、微小RNA(micro RNA，miRNA)的結合/標的序列之有無而改變。再者，在包含哺乳類培養細胞的真核生物內，係藉由剪接(splicing)而排除內含子(intron)，並成熟為僅由外顯子(exon)所構成的mRNA。內含子不僅存在於非轉譯區域，也存在於結構基因序列，但其數量及位置在每個mRNA是不同的。已在核內被轉錄的mRNA被輸送至核外，即細胞質內，而起始轉譯。內含子與該mRNA往核外的輸送、及3’末端的多腺苷酸化(polyadenylation)相關(非專利文獻6)。作為以生產能力的提升為目標之哺乳動物培養細胞表現系統的改良，而已報告：包含源自病毒的增強子(enhancer)及TATA-box、源自哺乳類之內含子的雜交型啟動子(hybrid promoter)(專利文獻4)；外源蛋白質生產率經提升的熱休克蛋白A5(heat shock protein A5)(Hspa5/GRP78)基因的啟動子(專利文獻5)；於結構基因內或下游插入外源內含子的例子(非專利文獻7)。 [先前技術文獻] [專利文獻]

專利文獻1：日本專利第3051411號專利文獻2：WO2006/123097 專利文獻3：WO2005/000888 專利文獻4：US9234211 專利文獻5：WO2018/066492 [非專利文獻] 非專利文獻1：Florian M.Wurm., Nat. Biotechnol. 22(11):1393-1398,2004 非專利文獻2：Farid SS., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 848(1):8-18,2007 非專利文獻3：Werner RG., Economic aspects of commercial manufacture of biopharmaceuticals. J Biotechnol. 113(1-3):171-182,2004 非專利文獻4：Brown AJ et al., Biotechnol. J. 10:1019-1028,2015 非專利文獻5：Araujo AR et al., Comp. Funct. Genomics 475731,2012 非專利文獻6：Hir HL et al., Trends Biochem. Sci. 28(4):215-220,2003 非專利文獻7：Xu D et al., J. Cell. Mol. Med. 22(4):2231-2239,2018

[發明欲解決之課題]

本發明之課題在於設計一種於哺乳動物培養細胞等宿主細胞中組合具高轉錄活性的啟動子區域與具高轉譯活性之5’-UTR、內含子而成的表現單元，並提供一種使用其而使成為蛋白質醫藥品之外源蛋白質的生產量亢進的手段係。藉由發現一種表現單元，而提供一種哺乳動物培養細胞會穩定地達成外源基因的高表現的手段，並能夠提供一種對於哺乳動物培養細胞表現系統中蛋白質性醫藥品生產量之提升，即有貢獻於製造成本減少有貢獻的手段；其中，該表現單元係藉由將5’-UTR組合至啟動子區域，或者更進一步將已組合之5’-UTR內的內含子取代為不同的內含子，而在CHO細胞等中，與僅使用了啟動子區域時相比，可獲得同程度以上之蛋白質表現量。 [用以解決課題之手段]

本發明人等為解決前述課題而反覆深入研究的結果，發現藉由使用包含在具有轉錄活性的啟動子區域組合了5’-UTR而成之多核苷酸的表現單元，或者包含進一步將該表現單元內的內含子取代為不同內含子而成之多核苷酸的表現單元，而在哺乳動物培養細胞中，成為表現對象之外源蛋白質生產率能夠明顯提升，以完成了本發明。即，本發明包含以下發明。 (1)一種多核苷酸，其係於啟動子區域下游，連結與包含該啟動子區域的基因係相同或不同的基因所含之5’-UTR而成。 (2)如前述(1)記載之多核苷酸，其中5’-UTR所含之內含子係與包含該5’-UTR之基因相同或不同的基因所含之5’-UTR所含的內含子。 (3)如前述(1)或(2)記載之多核苷酸，其中啟動子區域為序列識別號1至3中任一者記載的多核苷酸。 (4)如前述(1)或(2)記載之多核苷酸，其中啟動子區域是在序列識別號1記載的多核苷酸的3’末端連結序列識別號4記載的多核苷酸而成之，序列識別號5記載的多核苷酸。 (5)如前述(4)記載之多核苷酸，其係序列識別號4記載的多核苷酸的全長或缺損一部分而成。 (6)如前述(1)或(2)記載之多核苷酸，其中啟動子區域是在序列識別號1記載之多核苷酸的3’末端連結序列識別號36記載的多核苷酸之全部或一部分而成。 (7)如前述(1)至(6)中任一者記載之多核苷酸，其中5’-UTR係序列識別號6至11中任一者記載的多核苷酸。 (8)如前述(2)至(7)中任一者記載之多核苷酸，其中內含子係序列識別號12至17中任一者記載的多核苷酸。 (9)如前述(1)記載之多核苷酸，其係由序列識別號18至35、及45至48中任一者記載的多核苷酸構成。 (10)如前述(1)記載之多核苷酸，其係由序列識別號18、24至29、及45至48中任一者記載的多核苷酸構成。 (11)一種具有轉錄活性及轉譯活性之多核苷酸，其係相對於如前述(9)或(10)記載之多核苷酸具有95%以上相同性的多核苷酸。 (12)一種具有轉錄活性及轉譯活性之多核苷酸，其係相對於如前述(9)或(10)記載之多核苷酸具有99%以上相同性的多核苷酸。 (13)一種具有轉錄活性及轉譯活性之多核苷酸，其係會在嚴苛條件下跟與如前述(9)或(10)記載之多核苷酸互補的多核苷酸雜交的多核苷酸。 (14)一種由如前述(1)至(13)中任一者記載之多核苷酸構成的表現單元。 (15)一種外源基因表現卡匣(cassette)，其包含如前述(14)記載之表現單元。 (16)如前述(15)記載之外源基因表現卡匣，其中外源基因係編碼多聚體蛋白質的基因。 (17)如前述(15)記載之外源基因表現卡匣，其中外源基因係編碼異多聚體蛋白質(heteromultimeric protein)的基因。 (18)如前述(15)記載之外源基因表現卡匣，其中外源基因係編碼抗體或其抗原結合片段的基因。 (19)一種外源基因表現載體，其包含如前述(15)至(18)中任一者記載之外源基因表現卡匣。 (20)一種轉型細胞，其導入有如前述(19)記載之外源基因表現載體。 (21)如前述(20)記載之轉型細胞，其中細胞係源自哺乳動物的培養細胞。 (22)如前述(21)記載之轉型細胞，其中源自哺乳動物的培養細胞係COS-1細胞、HEK293細胞、或CHO細胞。 (23)一種下述蛋白質之製造方法，其特徵在於培養如前述(20)至(22)中任一者記載之轉型細胞，並從培養物取得源自外源基因的蛋白質。 (24)一種如前述(1)及至(13)中任一者記載的多核苷酸的用途，其目的係使外源基因在轉型細胞中表現。 (25)一種如前述(19)記載之外源基因表現載體的用途，其目的係使外源基因在轉型細胞中表現。 [發明之效果]

本發明之表現單元係與基因一起被組入至外源基因表現載體而被導入至哺乳動物宿主細胞，藉此而能夠使治療用蛋白質及抗體等外源基因的表現明顯亢進。

[用以實施發明的形態]

以下，具體地說明本發明。在本說明書中，所謂「啟動子區域」意指從轉錄起始點至其上游序列中具有轉錄活性的序列。在本說明書中有時亦稱為「啟動子」。在本說明書中，所謂「5’-UTR」係存在於被轉錄出之mRNA的基因起始密碼子的上游序列，且意指不含基因/蛋白質訊息的非轉譯區域。在本說明書中，所謂「上游」係指基因、序列區域、或者鹼基的5’末端側，所謂「下游」係指基因、序列區域、或者鹼基的3’末端側。在本說明書中，所謂「內含子」係在基因表現中自DNA藉由剪接而生產成熟信使RNA(mRNA)之際，被切除或去除的非編碼部分，意指與編碼部分(外顯子)一起構成DNA的序列。於5’-UTR中亦包含內含子。在本說明書中，所謂「基因」意指被轉錄為mRNA，並被轉譯為蛋白質的部分，不僅是DNA，亦包含其mRNA、cDNA及其RNA。在本說明書中，「多核苷酸」係以相同於核酸的意義使用，亦包含DNA、RNA、探針、寡核苷酸、及引子。在本說明書中，當序列識別號例如為α的情況，亦會省略[由序列識別號α的核苷酸序列構成之多核苷酸]而記載為[序列識別號α記載的多核苷酸]。在本說明書中，「多肽」與「蛋白質」係不區別地使用。在本說明書中，所謂「基因表現」意指某基因被轉錄為mRNA，且從該mRNA轉譯蛋白質的現象。在本說明書中，所謂「外源基因」意指被人工地導入於宿主細胞的基因。在本說明書中，所謂「外源蛋白質」意指外源基因所編碼的蛋白質。在本說明書中，所謂「基因表現卡匣」意指在轉錄的讀框(reading frame)之方向上，至少具有啟動子區域、外源基因、轉錄終止子區域(多腺苷酸附加信號(poly-A additional signal))的多核苷酸。在本說明書中，所謂「轉錄活性」是指藉由RNA聚合酶而從DNA起始轉錄，並合成mRNA的活性。在本說明書中，所謂「轉譯活性」是指從被轉錄出的mRNA合成蛋白質的活性。在本說明書中，所謂「DNA元件」意指當被配置於基因表現卡匣附近，或被配置於表現基因表現卡匣所含之外源基因的載體上的情況，具有外源基因表現亢進活性的多核苷酸。在本說明書中，所謂「抗體的抗原結合片段」，意指具有與抗原之結合活性的抗體的部分片段，包含Fab、F(ab’)₂ 等，但只要具有與抗原之結合能力，則不被限定於該等分子。在本說明書中，所謂「相同性」，如於該領域所周知地，係指藉由序列的比較所決定之2個以上核苷酸序列或胺基酸序列的序列間關係。在該領域中，「相同性」又因應情況而意指藉由一列的2個以上核苷酸序列間或者2個以上的胺基酸序列間的一致性而決定時之核酸分子間或者多肽間的序列相關性的程度。「相同性」可藉由算出2個以上的序列中較小者、與以特定數學模型或者電腦程式(即，「演算法」)而被指定位址的間隔排比(gap alignment)(當存在之情況)之間的相同一致的百分比，而進行評價。具體而言，可藉由使用歐洲分子生物學實驗室-歐洲生物資訊學研究所(European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute，EMBL-EBI)提供的ClustalW2等軟體，而進行評價，但若為該技術領域者所使用之物，則不被限定於此。在本說明書中，所謂「在嚴苛條件下雜交」，係指會形成所謂專一性雜交型，且不形成非專一性雜交型的條件。可舉出例如：由對於某核酸的相同性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，最佳為99%以上的核苷酸序列所構成之核酸的互補股會雜交，且由相同性低於其的核苷酸序列所構成之核酸的互補股不會雜交的條件。更具體而言，意指在市售的雜交溶液ExpressHyb雜交溶液(ExpressHyb Hybridization Solution，Clontech公司製)中，於68℃進行雜交；或使用已固定了DNA的過濾器而在0.7至1.0M之NaCl存在下於68℃進行了雜交之後，使用0.1至2倍濃度的SSC溶液(所謂1倍濃度SSC係由150 mM NaCl、15 mM 檸檬酸鈉構成)，且於68℃進行洗淨的條件或與其同等之條件會進行雜交。

1.外源基因的表現亢進所使用的表現單元所謂本發明之表現單元，係在存在於基因上游之為轉錄所必需之序列區域的啟動子區域的下游，連結5’-UTR而成的多核苷酸。5’-UTR可為存在於包含該啟動子區域之基因上游的5’-UTR，亦可為存在於與包含該啟動子區域之基因不同之基因的上游的5’-UTR。於圖1顯示於該啟動子區域的下游連結有存在於與包含該啟動子區域之基因不同之基因的上游的5’-UTR而成之表現單元的概略。進一步，於5’-UTR係包含內含子，且內含子可被取代為與包含該5’-UTR之基因不同之基因中的5’-UTR所包含的內含子。於圖2顯示將表現單元所包含的內含子，取代為與包含該5’-UTR之基因不同之基因中的5’-UTR所包含的內含子而成之表現單元的概略。本發明之表現單元所包含的啟動子區域，係從轉錄起始點至其上游序列中的具有轉錄活性的序列區域。轉錄起始點，或者5’-UTR的5’末端，係藉由NCBI等資料庫上所公開的序列、或者藉由5’-RACE法等實驗性手法而鑑定出的序列位置。本發明之表現單元所包含的啟動子區域，其來源未被特別限定，但較佳源自哺乳動物培養細胞，就哺乳動物而言，可舉出例如：中國倉鼠、人類、小鼠、大鼠等。作為本發明之表現單元所包含的啟動子區域的較佳例，可舉出：源自中國倉鼠之Hspa5基因所含的啟動子區域、源自小鼠之Ubc基因所含的啟動子區域。進一步合適地可舉出：由序列表序列識別號1記載的多核苷酸構成之源自中國倉鼠之Hspa5基因的啟動子區域、由序列識別號2、3記載的多核苷酸構成之源自小鼠之Ubc基因的啟動子區域。序列識別號1的核苷酸序列，係由源自中國倉鼠之Hspa5基因的起始密碼子之上游約0.6kbp的核苷酸至轉錄起始點的核苷酸所構成的序列。序列識別號2的核苷酸序列，係由源自小鼠之Ubc基因的起始密碼子之上游約3.0kbp的核苷酸至轉錄起始點的核苷酸所構成的序列。針對源自小鼠之Ubc基因的啟動子區域而言，可為由序列識別號2記載之序列的部分序列所構成的核苷酸序列，較佳為由源自小鼠之Ubc基因的起始密碼子之上游約2.1kbp的核苷酸至轉錄起始點的核苷酸所構成的序列識別號3記載的多核苷酸。序列識別號4的核苷酸序列，係由源自中國倉鼠之Hspa5基因的起始密碼子之上游約0.2kbp的轉錄起始點至32核苷酸下游所構成的序列。序列識別號5的核苷酸序列，係由在序列識別號1的核苷酸序列之3’側連結了序列識別號4的核苷酸序列而成之核苷酸序列所構成的多核苷酸。由序列識別號4的核苷酸序列所構成之多核苷酸，可為其全長被包含於啟動子區域、亦可為以一部分已缺損的狀態被包含於啟動子區域。本發明之表現單元所包含的5’-UTR，其來源未被特別限定，較佳為源自哺乳動物培養細胞，就哺乳動物而言，可舉出例如：中國倉鼠、人類、小鼠、大鼠等。作為本發明之表現單元所包含的5’-UTR的較佳例，就Hspa8基因、Actb基因、Rpsa基因、EF1α基因的5’-UTR而言，可舉出源自中國倉鼠之5’-UTR；就Ubc基因的5’-UTR而言，可舉出源自中國倉鼠及源自小鼠之5’-UTR。更佳為由序列識別號6～11記載的多核苷酸所構成的5’-UTR。序列識別號6的核苷酸序列，係由對應於在源自中國倉鼠之Hspa8基因的起始密碼子之上游約0.6kbp處之轉錄起始點的核苷酸至緊接對應於起始密碼子之核苷酸序列之前的核苷酸所構成的序列。此中，序列識別號12記載的多核苷酸，係由序列識別號6記載的多核苷酸所構成之5’-UTR所含的內含子。序列識別號7的核苷酸序列，係由對應於在源自中國倉鼠之Actb基因的起始密碼子上游約1.0kbp處之轉錄起始點的核苷酸至緊接對應於起始密碼子之核苷酸序列之前的核苷酸所構成的序列。此中，序列識別號13，係由序列識別號7記載的多核苷酸所構成之5’-UTR所含的內含子。序列識別號8的核苷酸序列，係由對應於在源自中國倉鼠之Rpsa基因的起始密碼子上游約0.6kbp處之轉錄起始點的核苷酸至緊接對應於起始密碼子之核苷酸序列之前的核苷酸所構成的序列。此中，序列識別號14，係由序列識別號8記載的多核苷酸所構成之5’-UTR所含的內含子。序列識別號9的核苷酸序列，係由對應於在源自中國倉鼠之Ubc的起始密碼子上游約1.7kbp處之轉錄起始點的核苷酸至緊接對應於起始密碼子之核苷酸序列之前的核苷酸所構成的序列。此中，序列識別號15係由序列識別號9記載的多核苷酸所構成之5’-UTR所含的內含子。序列識別號10的核苷酸序列，係由對應於在源自中國倉鼠之EF1α基因的起始密碼子上游約1.0kbp處之轉錄起始點的核苷酸至緊接對應於起始密碼子之核苷酸序列之前的核苷酸所構成的序列。此中，序列識別號16係由序列識別號10記載的多核苷酸所構成之5’-UTR所含的內含子。序列識別號11的核苷酸序列，係由對應於在源自小鼠之Ubc基因之起始密碼子上游約1.5kbp處之轉錄起始點的核苷酸至緊接對應於起始密碼子之核苷酸序列之前的核苷酸所構成的序列。此中，序列識別號17係由序列識別號11記載的多核苷酸所構成之5’-UTR所含的內含子。本發明之表現單元所包含的內含子，係藉由NCBI等資料庫上所公開的序列、或者序列分析等實驗性手法所鑑定的序列，包含在本發明之表現單元中的5’-UTR中。就內含子而言，較佳可舉出本發明之表現單元所包含的5’-UTR內的內含子，更佳可舉出上述序列識別號12至17記載的多核苷酸。本發明之表現單元較佳為在序列識別號1、2、3、5中任一者記載的啟動子區域之下游，連結序列識別號6至11中任一者記載之5’-UTR而成的多核苷酸。於該5’-UTR係包含內含子。內含子亦可取代為與包含該5’-UTR之基因不同之基因所包含的內含子。例如，由序列識別號6至11記載的多核苷酸所構成之5’-UTR的各個中所包含的由序列識別號12至17記載的多核苷酸所構成的內含子，亦可取代為序列識別號12至17記載的其它的內含子。就本發明之表現單元的較佳具體例而言，可舉出由序列識別號18～35、45～48記載的多核苷酸所構成的表現單元。該等之中作為更佳的具體例，而可舉出由序列識別號18、24～29、及45～48記載的多核苷酸所構成的表現單元。序列識別號18～23的核苷酸序列，係在由序列識別號1記載的多核苷酸所構成之源自中國倉鼠之Hspa5基因的啟動子區域連結序列識別號4記載的32核苷酸而成之核苷酸序列的下游，分別連結源自中國倉鼠之Hspa8基因、Actb基因、Rpsa基因、Ubc基因、EF1α基因、或源自小鼠之Ubc基因的5’-UTR而成的多核苷酸。序列識別號24～29的核苷酸序列，係在由序列識別號2記載的多核苷酸所構成之源自小鼠之Ubc基因的啟動子區域下游，分別連結源自中國倉鼠之Hspa8基因、Actb基因、Rpsa基因、Ubc基因、EF1α基因、或源自小鼠之Ubc基因的5’-UTR而成的多核苷酸。序列識別號30～35的核苷酸序列，係在由序列識別號3記載的多核苷酸構成之源自小鼠之Ubc基因的啟動子區域下游，分別連結源自中國倉鼠之Hspa8基因、Actb基因、Rpsa基因、Ubc基因、EF1α基因、或源自小鼠之Ubc基因的5’-UTR而成的多核苷酸。序列識別號36的核苷酸序列，係源自中國倉鼠之Hspa5之起始密碼子之上游約0.2kbp的轉錄起始點的33核苷酸下游至48核苷酸下游為止的序列。該序列是有助於維持或者提升轉錄活性或轉譯活性的序列，且能夠附加於序列識別號5的核苷酸序列。在於其下游分別連結了源自中國倉鼠之Hspa8基因、Actb基因、Rpsa基因、Ubc基因、EF1α基因、或源自小鼠之Ubc基因的5’-UTR的情形，具有與序列識別號18～23記載的多核苷酸同樣的轉錄活性或轉譯活性。使用於表現單元之啟動子區域的3’末端、及5’-UTR的5’末端，係較佳為轉錄起始點、或者緊接對應於轉錄起始點之核苷酸之前的核苷酸，但在設計表現單元方面，若能夠維持或者提升轉錄活性或轉譯活性，則能夠在啟動子區域及5’-UTR的末端附加核苷酸。要附加的核苷酸序列，係轉錄起始點之上游或者下游的核苷酸序列，可藉由利用實驗性手法來評價表現單元的轉錄活性及轉譯活性，而選擇/鑑定鏈長及區域。序列識別號45～47的核苷酸序列，係在由序列識別號29記載的多核苷酸所構成之源自小鼠之Ubc基因啟動子區域之下游連結源自小鼠之Ubc的5’-UTR而成的多核苷酸中，將其中之5’-UTR中所包含的內含子，分別取代為源自中國倉鼠之Hspa8、Actb、Rpsa基因的5’-UTR中所包含的內含子而成的多核苷酸序列。序列識別號48的核苷酸序列，係在由序列識別號3記載的多核苷酸所構成之源自小鼠之Ubc基因啟動子區域下游，連結包含序列識別號6記載的多核苷酸序列的第31個鹼基以後的序列之源自中國倉鼠之Hspa8基因的5’-UTR而成的多核苷酸。將在本發明之各表現單元使用的啟動子區域與5’-UTR的組合記為「啟動子區域來源的基因名‐5’-UTR來源的基因名」。本發明之表現單元亦可為由對於以下核苷酸序列具有80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，特佳為99%以上之相同性的核苷酸序列所構成的多核苷酸：其係序列識別號18至35、及45至48記載之任一者的核苷酸序列；或將序列識別號18至35記載的核苷酸序列中對應於內含子的核苷酸序列與對應於序列識別號12至17記載之任一者的其它內含子的核苷酸序列進行重組而成的任一核苷酸序列。這樣的本發明之表現單元具有轉錄活性及轉譯活性。本發明之表現單元，亦可為會在嚴苛條件下跟由與以下之多核苷酸互補的核苷酸序列所構成的多核苷酸進行雜交的多核苷酸：由選自包含序列識別號18至35、及45至48記載的核苷酸序列、及將序列識別號18至35記載的核苷酸序列中對應於內含子之核苷酸序列與對應於序列識別號12至17記載之任一者的其它內含子的核苷酸序列重組而成的核苷酸序列的群組中之任一核苷酸序列所構成的多核苷酸。將使用於這樣的各表現單元的啟動子區域、與經取代之內含子的組合記為「啟動子區域來源的基因名-內含子來源的基因名」。於序列識別號45至47呈示將序列識別號29記載的核苷酸序列中對應於內含子的核苷酸序列取代為對應於序列識別號12至17記載之任一者之其它內含子的核苷酸而成的核苷酸序列。這樣的本發明之表現單元具有轉錄活性與轉譯活性。本發明之表現單元，亦可為由在選自包含以下核苷酸序列的群組之任一核苷酸序列中有1或多個，較佳為1至300個，進一步較佳為1至30個核苷酸缺失、取代、及/或附加而成之核苷酸序列所構成的突變多核苷酸：記載於序列識別號18至35及45至48的核苷酸序列；及將記載於序列識別號18至35的核苷酸序列中對應於內含子的核苷酸序列，與對應於序列識別號12至17記載之任一者之其它內含子的核苷酸序列重組而成的核苷酸序列。這樣的本發明之表現單元具有轉錄活性及轉譯活性。前述核苷酸序列的突變(缺失、取代、及/或附加)的導入，能夠藉由Kunkel法或者Gapped duplex法等該技術領域所周知的手法，或以此為準的方法而進行，能夠利用例如：利用了定點突變(site-directed mutagenesis)誘發法的突變導入用套組(例如Mutant-K(Takara Bio公司製)或者Mutant-G(Takara Bio公司製)、Takara Bio公司的LA PCR體外突變(LA PCR in vitro Mutagenesis)系列套組等。這樣的突變多核苷酸亦可使用來作為本發明的啟動子。本發明之表現單元的具有的外源基因表現亢進活性，能夠以螢火蟲螢光素酶等報導基因所編碼之蛋白質的活性、或者在饋料批次培養中的抗體生產量為指標而檢驗。將使用了本發明之表現單元之情形，與使用了由源自人類EF1α(hEF1α)之啟動子區域與5’-UTR構成之表現單元的情形進行比較，在饋料批次培養中的抗體生產量係同等以上，較佳上升為1.2倍以上，更佳上升為1.5倍以上的情況，可判斷為該表現單元具有外源基因表現亢進活性。因著1.2倍程度以上的亢進，也可期待細胞之培養規模的削減、培養時間、及純化步驟的縮短，而結果使產量的提升與培養成本的削減成為可能。若產量提升，則變得能夠穩定地供給作為醫藥的外源蛋白質。又，若培養成本被削減，則作為醫藥之外源蛋白質的原價(first cost)會減少。

2.外源基因表現卡匣本發明之外源基因表現卡匣(以下有時亦稱為「本發明之基因表現卡匣」)，是於轉錄的讀框之方向上，至少具有前述1.記載的本發明之表現單元、外源基因、及轉錄終止子區域(多腺苷酸附加信號(poly-A additional signal))者。再者，多腺苷酸附加序列，若為對於從啟動子區域開始的轉錄是具有會引起轉錄終結之活性的序列即可，也可為與啟動子區域或者5’-UTR來源的基因相同或不同的基因者。

3.DNA元件可藉由組合前述2.記載的本發明之表現卡匣與DNA元件而使用，而使得外源基因的表現更為亢進。組合而使用的DNA元件係能夠取得與乙醯基化組蛋白H3的相互作用作為指標。組蛋白(H3、H4)的乙醯基化一般被認為會參與轉錄的活化，主要考慮2個學說。藉著組蛋白尾部(histone tail)乙醯基化而在電荷上被中和，DNA與組蛋白的結合變得鬆散這樣的，核小體立體結構變化有關的學說(Mellor J. (2006) Dynamic nucleosomes and gene transcription. Trends Genet. 22(6)：320-329)；與會參與各種各樣轉錄因子的召集(recruit)這樣的學說(Nakatani Y. (2001) Histone acetylases-versatile players. Genes Cells. 6(2)：79-86)。在任一學說來說，皆是組蛋白的乙醯基化有參與轉錄活化的可能性高，且藉由使用了抗乙醯基化組蛋白H3抗體的染色質免疫沉澱(Chromatin Immunoprecipitation；ChIP)，而能夠濃縮與乙醯基化組蛋白H3進行相互作用的DNA元件。就與本發明之表現單元組合而使用之，於外源基因的表現亢進所使用的DNA元件而言，可舉出：A2、A7、及A18。A2係位置於人類15號染色體80966429～80974878，AT含量62.2%，8450bp的多核苷酸。A2的核苷酸序列係記載於序列表的序列識別號42。 A7係位置於人類11號染色體88992123～89000542，AT含量64.52%，8420bp的多核苷酸。A7的核苷酸序列係記載於序列表的序列識別號43。 A18係位置於人類4號染色體111275976～111284450，AT含量62.54%，8475bp的多核苷酸。A18的核苷酸序列係記載於序列表的序列識別號44。與本發明之表現單元組合而使用之，DNA元件具有的外源基因表現亢進活性，是能夠以SEAP等報導基因所編碼之蛋白質的活性作為指標而檢驗。當與本發明之表現單元組合而使用的情況，可將前述DNA元件中任一種以單獨來使用，亦可將DNA元件的1種使用2拷貝以上。或者亦可組合2種以上DNA元件而使用。於本發明中所使用的DNA元件，係由對於序列識別號42至44顯示的核苷酸序列，具有80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，最佳為99%以上之相同性的核苷酸序列構成，並且亦可為具有外源基因表現亢進活性的核苷酸序列。核苷酸序列的同源性檢索，能夠以例如：日本DNA資料庫(data bank)(DNA Databank of JAPAN)等為對象並使用FASTA或BLAST等程式而進行。若為該技術領域者的話，透過參照Molecular Cloning(Sambrook， J. et al.， Molecular Cloning ：a Laboratory Manual 2nd ed.， Cold Spring Harbor Laboratory Press， 10 Skyline Drive Plainview， NY (1989))等，能夠容易地取得DNA元件的這種同源基因。再者，前述的核苷酸序列的相同性，同樣地能夠透過FASTA檢索或BLAST檢索而決定。前述多核苷酸之突變(缺失、取代、及/或附加)的導入，能夠透過Kunkel法或者Gapped duplex法等在該技術領域所周知的手法，或以此為準之方法而進行，能夠利用例如：利用了定點突變誘發法之突變導入用套組(例如Mutant-K(Takara Bio公司製)或者Mutant-G(Takara Bio公司製)、Takara Bio公司的LA PCR體外突變系列套組等。這樣的突變多核苷酸亦能夠使用來作為本發明的DNA元件。

4.多核苷酸的取得在本發明中，含有編碼會成為後述之生產亢進之對象的外源蛋白質之外源基因的多核苷酸，是能夠透過以下顯示的一般性方法而取得。例如：可將源自表現著外源基因之細胞或組織的cDNA庫(cDNA library)，藉由使用以該基因片段為基礎而合成出的DNA探針而進行篩選而單離。mRNA的製備能夠透過在該技術領域通常可使用的手法而進行。例如，利用胍試劑、酚試劑等將前述細胞或組織進行處理而獲得總RNA，其後，透過使用了以寡聚脫氧胸腺嘧啶(oligo(dT))纖維素管柱或瓊脂糖2B (sepharose 2B)作為承載體的多尿苷酸-瓊脂糖(poly U sepharose)等的親和管柱法，或者透過批次法而獲得多腺苷酸＋RNA(mRNA)。進一步，亦可透過蔗糖密度梯度離心法等進一步分劃多腺苷酸＋RNA。接著，將所獲得之mRNA作為模板，並使用寡聚脫氧胸腺嘧啶引子及反轉錄酶而合成單股cDNA，使用DNA合成酶I、DNA連接酶及核糖核酸酶H(RNaseH)等而從該單股cDNA合成雙股cDNA。透過T4DNA合成酶將合成出的雙股cDNA予以平滑化後，經由轉接子(adaptor)(例如，EcoRI轉接子)的連結、磷酸化等，而被組入至λgt11等λ噬菌體而活體內組裝(in vivo packaging)，而藉以製作cDNA庫。再者，在λ噬菌體以外，亦能夠使用質體載體而製作cDNA庫。其後從cDNA庫選擇具有目標DNA的株(陽性殖株(positive clone))即可。再者，要從基因體DNA把使用於蛋白質之生產的前述表現單元、包含終止子區域的多核苷酸、包含前述DNA元件或外源基因的多核苷酸予以單離的情況，是依照一般性手法(Molecular Cloning(1989)，Methods in Enzymology 194(1991))，透過由成為採取源之生物的細胞株萃取基因體DNA，並挑選多核苷酸而進行。基因體DNA的萃取，能夠按照例如：Cryer等人的方法(Methods in Cell Biology， 12， 39-44(1975))及P. Philippsen等人的方法(Methods Enzymol.， 194， 169-182(1991))而進行。包含為目標的啟動子區域、5’-UTR、內含子、DNA元件或外源基因之多核苷酸的取得，亦能夠透過例如：PCR法(PCR Technology.Henry A.Erlich，Atockton press(1989))而進行。在使用了PCR法之多核苷酸的擴增來說，係使用20～30mer的合成單股DNA作為引子，並使用基因體DNA作為模板。被擴增過的基因是在確認過多核苷酸序列之後使用。就PCR的模板而言，能夠使用人造細菌染色體(bacterial artificial chromosome，BAC)等的基因體DNA庫。另一方面，包含序列未知之外源基因的多核苷酸的取得，是能夠藉由以下(a)及(b)來進行：(a)透過常用方法而製作基因庫；(b)從所製作出的基因庫選擇所期望的多核苷酸，並將該多核苷酸進行擴增。基因庫可透過以下而製備：把透過常用方法從成為採取源的生物的細胞株獲得的染色體DNA，透過適當的限制酶而進行部分消化而片段化，將所獲得之片段連結至適當的載體，並將該載體導入至適當的宿主。再者，亦可透過以下而製備：由細胞萃取mRNA，並由此合成cDNA後，連結至適當的載體，並將該載體導入至適當的宿主。就此際所使用的載體而言，能夠使用通常作為周知之基因庫製備用載體而已知的質體，亦能夠廣泛使用噬菌體載體或黏接質體(cosmid)等。進行轉型或轉導的宿主，若使用因應前述載體之種類者的話即可。包含外源基因之多核苷酸的選擇，是自前述基因庫，透過使用包含外源基因特有序列的標記探針的菌落雜交法，溶菌斑雜交法(Plaque hybridization)等而進行。再者也可化學性地全合成包含外源基因的多核苷酸。可藉由例如以下方法來合成基因：製作互補的2對寡核苷酸並使該等降溫貼合(annealing)的方法；或藉由DNA連接酶將數條被降溫貼合過的DNA予以連結的方法；或製作一部分互補的數條寡核苷酸並透過PCR而填補間隙的方法等。多核苷酸序列的決定，能夠透過通常的方法，例如：雙去氧鏈終止法(dideoxy chain-termination method)(Sanger et al.， Proc. Natl. Acad. Sci.， USA， 74， 5463-5467(1977))等進行。進而，前述多核苷酸序列的決定，透過使用市售的定序套組等亦能夠容易地進行。

5.外源基因表現載體就本發明之外源基因表現載體而言，提供一種含有前述2.記載之外源基因表現卡匣的載體，其中該外源基因表現卡匣包含前述1.記載之表現單元。本發明之外源基因表現載體，可包含前述3.記載之DNA元件的1種、拷貝數(copy number)2個以上之DNA元件的1種、DNA元件的2種以上的組合。在透過前述外源基因表現載體而使得外源基因在宿主細胞內表現之際來說，可將DNA元件配置於在緊接基因表現卡匣之前或緊接基因表現卡匣之後，或亦可被配置在遠離基因表現卡匣的位置。再者，亦可使用包含多個DNA元件的1個外源基因表現載體。再者，DNA元件的朝向，相對於基因表現卡匣可為順向或反向之任一者。就外源基因而言，沒有特別限定，但可舉出：分泌型鹼性磷酸酶(SEAP)、綠色螢光蛋白質(GFP)、螢光素酶等報導基因、α-澱粉酶基因、α-半乳糖苷酶基因等各種酵素基因、為醫藥上有用之生理活性蛋白質的干擾素α、干擾素γ等各種干擾素基因、IL1、IL2等各種介白素基因、紅血球生成素(EPO)基因、顆粒性白血球群落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)基因等各種細胞介素基因、生長因子基因、或編碼多聚體蛋白質的基因，例如：編碼抗體或為其抗原結合片段的異多聚體的基因等。該等基因可為透過任何手法而獲得者。所謂「抗體的抗原結合片段」，意指具有與抗原之結合活性的抗體的部分片段，包含：Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、雙價抗體(diabody)、線狀抗體、及由抗體片段所形成的多專一性抗體等。再者，Fab’亦包含於抗體的抗原結合片段，該Fab’係將F(ab’)2在還原條件下進行過處理之抗體的可變區的一價的片段。不過，只要具有與抗原的結合能力，不被限定於該等分子。再者，在該等抗原結合片段來說，不僅包含把抗體蛋白質的全長分子以適當的酵素進行過處理者，亦包含使用基因工程學上被改變過的抗體基因而在適當的宿主細胞中所生產出的蛋白質。再者，在本發明的外源基因表現載體來說，能夠包含用以選出轉型株(transformant)的選擇標記物。能夠使用會對例如：淺藍菌素(cerulenin)、金擔子素(aureobasidin)、吉歐黴素(zeocin)、刀豆胺酸(canavanine)、放線菌酮(cycloheximide)、潮黴素(hygromycin)、嘌黴素(puromycin)、殺稻瘟菌素(blasticidin)、四環黴素(tetracycline)、康黴素(kanamycin)、安比西林(ampicillin)、新黴素(neomycin)等藥劑賦予耐性的抗藥性標記物(drug resistance marker)等，而藉以進行轉型株的選出。再者，亦可把會賦予對乙醇等的抗溶劑性、或對於甘油及鹽等的滲透壓耐性、銅等金屬離子耐性等的基因作成標記物，而藉以進行轉型株的選出。本發明之外源基因表現載體，亦可為不被組入至染色體DNA的載體。外源基因表現載體一般是被基因導入至宿主細胞之後，被隨機地組入染色體，但能夠透過使用猿猴病毒四十型(simian virus 40，SV40)或乳突病毒(papillomavirus)(BPV，HPV)、EBV等源自哺乳動物病毒的構成成分，而作為可自我複製之附加型載體(episomal vector)而在被導入之宿主細胞中使用。可廣泛使用例如：具有源自SV40之複製起點及編碼為異側作用因子(trans-acting factor)之SV40大型T(SV40 large T)抗原之序列的載體，或者具有編碼有源自EBV之oriP及EBNA-1之序列的載體等。DNA元件的效果能夠不問載體的種類、或者有無組入染色體，皆顯示外源基因表現亢進活性。

6. 轉型細胞本發明之轉型細胞，是使用前述5.的外源基因表現載體而進行了導入而成的轉型細胞。就使進行轉型的宿主細胞而言，係：真核細胞、較佳為哺乳動物細胞，進一步較佳為源自人類、小鼠、大鼠、倉鼠、猴、或牛的細胞。就哺乳動物細胞而言，可舉出：COS-1細胞、HEK293細胞、CHO細胞(CHO-K1、DG44、CHO dhfr-、CHO-S)等，但未被限定於該等。在本發明中，往宿主細胞導入表現載體的方法而言，係導入基因能夠穩定地存在於宿主內，並且可使之適宜表現的方法的話，可為任何方法，可舉一般所使用的方法，例如：磷酸鈣法(Ito et al.， (1984) Agric.Biol.Chem.，48，341)、電穿孔法(Becker， D.M. et al. (1990) Methods. Enzymol.， 194，182-187)、球形質體(spheroplast)法(Creggh et al.， Mol.Cell.Biol.，5，3376(1985))、乙酸鋰法(Itoh， H. (1983) J. Bacteriol. 153， 163-168)、脂質體轉染(lipofection)法等。

7.外源蛋白質的製造方法本發明之外源蛋白質的製造方法，是能夠將前述6.之項目記載的轉型細胞藉由周知的方法進行培養，並從其培養物進行採取、並純化而藉以進行。所謂「培養物」，是在培養上清液之外，還意指培養細胞、或細胞的破碎物之任意一者。再者，就能夠使用6.之項目記載的轉型細胞而生產的外源蛋白質而言，不僅是單體蛋白質，也能夠選擇多聚體蛋白質。在進行由不同的多個次單元所構成的異多聚體蛋白質的生產的情況，須將編碼了該等次單元的多個基因，分別導入至6.的項目記載的宿主細胞。培養轉型細胞方法，能夠按照在其宿主細胞之培養所使用的通常方法而進行。當轉型細胞為哺乳動物細胞的情況，例如在37℃，以5%或8%CO₂ 條件下進行培養，且培養時間係24～1000小時左右，培養可透過靜置、振盪、攪拌、通氣下的批次培養、饋料批次培養、灌流培養或連續培養等而實施。從前述的培養物(培養液)確認外源蛋白質基因的表現產物，是能夠透過十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺膠體電泳(SDS-PAGE)、西方墨點法、酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)等而進行。

8.抗體蛋白質之製造方法就使用前述7.之項目記載之製造方法所製造的異多聚體蛋白質而言，可舉出：抗體蛋白質。抗體蛋白質是由2分子重鏈多肽及2分子輕鏈多肽構成的四聚體蛋白質。因此，為了要以維持著抗原結合能力的形態取得抗體蛋白質，必須在前述6.之項目記載之轉型細胞中導入有重鏈及輕鏈的基因雙方。於此情況下，重鏈及輕鏈的基因表現卡匣可存在於相同的表現載體上，或者亦可存在於不同的表現載體上。就在本發明中所製造的抗體而言，可舉出：將兔、小鼠、大鼠等實驗動物以所期望的抗原進行免疫所製作出的抗體。再者，亦可舉出以前述抗體作為原料的嵌合抗體、及人源化抗體作為在本發明所製造的抗體。進而，針對透過基因改造(genetic modification)動物或噬菌體顯示(phage display)法所取得之人類抗體，亦為本發明中所製造的抗體。就於抗體製造使用的抗體基因而言，只要由該抗體基因所轉錄/轉譯的重鏈多肽與輕鏈多肽的組合，會保持著與任意抗原蛋白質相結合的活性，則不限定於帶有特定多核苷酸序列的抗體基因。再者，就抗體基因而言，無需一定要編碼有抗體的全長分子，能夠使用編碼有抗體的抗原結合片段的基因。該等編碼抗原結合片段的基因，是可透過基因工程學上改變編碼抗體蛋白質之全長分子的基因而取得。

9.其它的外源蛋白質的製造方法就成為本發明之製造方法之對象的外源蛋白質而言，於前述抗體外，可舉出：源自人類或非人類動物的各種蛋白質、其抗原結合片段、其修飾物(modifier)等。就那樣的蛋白質等而言，可舉出：心房利鈉尿胜肽(atrial natriuretic peptide，ANP)、腦利鈉尿胜肽(brain natriuretic peptide，BNP)、C型利鈉尿胜肽(CNP)、血管加壓素(vasopressin)、體抑素(somatostatin)、生長激素(growth hormone，GH)、胰島素、催產素(oxytocin)、飢餓肽(ghrelin)、瘦素(leptin)、脂聯素(adiponectin)、腎素(renin)、降鈣素(calcitonin)、骨保護素(osteoprotegerin)、類胰島素生長因子(insulin-like growth factor，IGF)等胜肽激素、介白素、趨化激素(chemokine)、干擾素、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor)(TNFα/β之外還有TNF超家族(superfamily)等)、神經生長因子(nerve growth factor，NGF)、細胞生長因子(cell growth factor)(EGF、FGF、PDGF、HGF、TGF等)、造血因子(CSF、G-CSF、紅血球生成素等)、脂肪細胞激素(adipokine)等細胞介素(cytokine)、ТNF受體等受體、溶菌酶、蛋白酶(protease)、蛋白質酵素(proteinase)、胜肽酶(peptidase)等酵素、其機能性片段(保持著原本蛋白質的生物活性的一部分或全部的片段)、由包含該等蛋白質構成的融合蛋白質等，但並非被限定於該等。 [實施例]

以下，藉由實施例具體地說明本發明。不過，該等實施例並非將本發明技術的範圍進行任何的限定。在本發明之實施例使用的質體、限制酶、DNA修飾酶(modifying enzyme)等是市售者，能夠按照常用方法而使用。再者，針對DNA的選殖、核苷酸序列的決定、宿主細胞的轉型、轉型細胞的培養、從所獲得之培養物之蛋白質的採取、純化等使用的操作亦係該技術領域者所熟知者，或能夠由文獻知悉者。

(實施例1)啟動子區域及5’-UTR的選殖源自中國倉鼠之Hspa5基因、Actb基因、Rpsa基因、Ubc基因、EF1α基因的啟動子區域及5’-UTR的選殖是能夠根據專利文獻5記載的方法而進行。源自中國倉鼠之Hspa8基因的5’-UTR與源自小鼠之Ubc基因的啟動子區域及5’-UTR，是以表1記載之資料庫為參考。使用表1記載之引子組與PrimeSTAR Max DNA 聚合酶(PrimeSTAR Max DNA Polymerase，Takara Bio)或者KOD FX Neo(東洋紡)而進行PCR擴增，並利用QIAquick PCR純化套組(QIAquick PCR Purification kit，QIAGEN)進行純化而獲得了目標的核苷酸序列。 [表1]

基因	資料庫	模板DNA	引子組	選殖序列
源自中國倉鼠之Hspa8	NM_001246729.1 NW_003616190.1	CHO細胞基因體DNA	Hspa8-NotI-F:TTCGCGGCCGCCAAGGCTGAGGCAGCG(序列識別號37) Hspa8-XbaI-R:TTCTCTAGAGGTTGCTGAAAGAAAACCAAA(序列識別號38)	序列識別號39
源自小鼠之Ubc	NC_000071.6 NM_019639.4	小鼠基因體DNA (Mouse Genomic DNA，TakaraBio)	mChub2p-NotI-f:GGGTGCGGCCGCAGCTGCCTGACAGGGTTGCTGGG(序列識別號40) mChub2p-NheI-r:GGGTGCTAGCCGTCTGTCACAAAATATACAAAACA(序列識別號41)	序列識別號29

將序列識別號39記載的多核苷酸進行PCR擴增，而獲得了為Hspa8基因的5’-UTR的多核苷酸。使用序列識別號29記載的多核苷酸作為表現單元，而獲得了為源自小鼠之Ubc基因的啟動子區域及5’-UTR序列的多核苷酸。

(實施例2)以抗體表現量為指標之表現單元基於饋料批次培養的評價 (2-1)建構抗體表現載體於抗體表現載體的建構，係使用了專利文獻5記載的人源化抗體基因Y表現載體pDSLH3.1-Hspa5-Y。將符合pDSLH3.1-Hspa5-Y內之Hspa5的核苷酸序列區域取代為序列識別號18～22、24～26、29記載的核苷酸序列，而藉以建構了抗體表現載體。於圖3顯示載體的示意圖。pDSLH3.1-Hspa5-Y、pDSLH3.1-hEF1α-Y係使用了專利文獻5所記載者。

(2-2)製作人源化抗體Y表現穩定庫馴化CHO-K1細胞(ATCC)，其使變得能夠以使用了無血清培養基之懸浮狀態的培養，獲得了宿主細胞CHO-O1細胞。使用基因導入裝置Neon 轉染系統(Neon　Transfection System，Thermo Fisher Scientific公司製)，把在(2-1)建構出的抗體表現載體對CHO-O1細胞進行基因導入，於T-25燒瓶以5%CO₂ 、37℃進行了培養。於基因導入1日後添加遺傳黴素(Geneticin，Thermo Fisher Scientific公司製)使得最終濃度為800μg/mL，並進行了1週藥劑選擇培養。其後，於125mL容量的三角燒瓶以5%CO₂ 、37℃進行培養，製作出人源化抗體Y表現穩定庫。

(2-3)評價人源化抗體Y表現穩定庫基於饋料批次培養的抗體生產量使用在(2-2)製作出之人源化抗體Y表現穩定庫，以125 mL容量的三角燒瓶進行了饋料批次培養。於基本培養基使用了G13(富士軟片和光純藥公司(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)製特製培養基(custom medium))、於饋料培養基使用了F13(富士軟片和光純藥公司製特製培養基)。將穩定庫的活細胞數、抗體生產量的變遷，分別顯示於圖4A、圖4B。在培養第14日之各表現單元的抗體生產量，分別與由Hspa5基因的啟動子區域與5’-UTR所構成的表現單元(Hspa5-Hspa5)進行比較，在Hspa5-Hspa8到達了2.2倍，在Hspa5-Actb到達了1.9倍，在Hspa5-Rpsa到達了1.3倍，在Hspa5-chUbc及Hspa5-EF1α分別到達了2.0倍。這與由人類EF1α基因的啟動子區域與5’-UTR所構成的表現單元(hEF1α-hEF1α)相比較，到達了約3.9～6.7倍之值，是大大超出以現在所頻繁使用著的啟動子的抗體生產量。再者，把導入有由mUbc基因的啟動子與各5’-UTR構成之表現單元的穩定庫的活細胞數、抗體生產量的變遷分別顯示於圖5A、圖5B。在培養第14日之各表現單元中的抗體生產量，相對於mUbc-mUbc，在mUbc-Hspa8到達了1.6倍，在mUbc-Actb到達了2.1倍，在mUbc-Rpsa到達了1.1倍。這與hEF1α-hEF1α相比較到達約4.6～8.1倍之值，大大超出了以現在所頻繁使用著的啟動子的抗體生產量。

(實施例3)探討以暫時性表現中之螢光素酶發光量作為指標之源自小鼠之Ubc啟動子區域 (3-1)建構螢光素酶表現載體螢光素酶表現載體是將序列識別號29或35記載的核苷酸序列插入至pGL4.10(Promega公司製)而建構。

(3-2)評價暫時性表現中之螢光素酶發光量使用Lipofectamin2000 CD(Thermo Fisher Scientific公司製)而把在(3-1)建構出的螢光素酶表現載體，與對照載體pGL4.74同時地對CHO-O1細胞進行了基因導入。基因導入後，於24小時後將細胞進行離心分離(1000 rpm，3min)再回收至1.5 mL短管(tube)，並以PBS緩衝液進行了洗淨。其後，使用雙螢光素酶報告檢測系統(Dual-Luciferase Reporter Assay System，Promega公司製)而測定了螢光素酶發光量。再者，把pGL4.10上源自螢火蟲(Firefly)之螢光素酶的發光量除以pGL4.74上源自海腎(Renilla)之螢光素酶的發光量而得之值設為了啟動子活性(圖6)。評價了螢光素酶發光之結果，具有TATA-box至上游0.6kb以上之全長約2.1kb的區域係可獲得與mUbc基因的啟動子區域全長為同等的啟動子活性，推測mUbc基因的啟動子區域為了要顯示轉錄活性需要轉錄起始點至起始密碼子上游2.1kb以上的區域。

(實施例4)以抗體表現量為指標之Hspa5基因的啟動子區域鏈長基於饋料批次培養的探討 (4-1)建構抗體表現載體及製作人源化抗體Y表現穩定庫利用與記載於實施例(2-1)同樣的手法，建構了人源化抗體Y表現載體，該人源化抗體Y表現載體具有Hspa5-Hspa8所包含的Hspa5基因的啟動子區域被包含在轉錄起始點之後0、8、16、24、32、40、48核苷酸下游為止的表現單元。其後，利用與記載於實施例(2-2)同樣的手法往CHO-O1細胞進行基因導入，製作了人源化抗體Y表現穩定庫。

(4-2)評價人源化抗體Y表現穩定庫基於饋料批次培養的抗體生產量利用與記載於實施例(2-3)同樣的手法，將在(4-1)製作出的穩定庫進行饋料批次培養而藉以評價了抗體生產量。分別於圖7A、圖7B顯示製作出之穩定庫的活細胞數的變遷、及抗體生產量。與表現單元所包含的Hspa5基因的啟動子區域的鏈長無關，當與使用了由Hspa5基因的啟動子區域與5’-UTR所構成的表現單元(Hspa5-Hspa5)的情況相比較，抗體生產量到達了約1.7～2.3倍。這相當於是使用了由人類EF1α基因的啟動子區域與5’-UTR所構成的表現單元(hEF1α-hEF1α)之情況的約3.2～4.4倍，大大超出了以現在所頻繁使用著的啟動子的抗體生產量。再者，從以上的結果來看，顯示：在表現單元來說，即便連結Hspa5基因的啟動子區域的轉錄起始點之後＋0～＋48核苷酸下游為止的序列亦能夠維持抗體表現量，啟示了在轉錄起始點之後能夠連結一定的核苷酸序列。

(實施例5)探討以饋料批次培養中的抗體表現量作為指標之表現單元與A7的組合效果 (5-1)建構抗體表現載體建構了於(2-1)建構出之抗體表現載體的表現卡匣的上游，插入有DNA元件A7而成的抗體表現載體。

(5-2)製作人源化抗體Y表現穩定庫利用(2-2)記載的方法，將以下抗體表現載體轉染至CHO-O1細胞，並進行藥劑選擇培養，製作出人源化抗體Y表現穩定庫：將符合在(2-1)所建構出之不含DNA元件A7之pDSLH3.1-Hspa5-Y內的Hspa5之核苷酸序列的區域，取代為序列識別號24～26、29及45～48記載的核苷酸序列而成的抗體表現載體；在(5-1)所建構出之包含DNA元件A7的抗體表現載體。

(5-3)評價人源化抗體Y表現穩定庫基於饋料批次培養的抗體生產量使用在(5-2)製作出之人源化抗體Y表現穩定庫並以125mL容量的三角燒瓶利用與記載於實施例(2-3)同等的方法來進行了饋料批次培養。將活細胞數、抗體生產量的變遷分別顯示於圖8A、圖8B。在各基因表現單元培養第14日時點時，在包含A7的抗體表現載體中的抗體生產量，係顯示了不包含A7的抗體表現載體的1.3～2.1倍之值。因而了解到：透過組合DNA元件A7，和由mUbc基因的啟動子與各5’-UTR構成之表現單元而使用，而能夠藉由加乘效果而有效地實現高生產。因為在全部的表現單元中啟示了：基於DNA元件A7所致之表現量提升，而推測在組合了由Hspa5基因的啟動子與各5’-UTR構成之表現單元的情況亦能夠實現同樣的加乘效果。 [產業上利用之可能性]

透過把使用本發明之表現單元所建構的外源基因表現卡匣或本發明之外源基因表現載體導入至哺乳動物宿主細胞，而變得能夠使得治療用蛋白質及抗體等外源基因的生產率提升。 [序列表之非關鍵詞文字]

序列識別號1：源自中國倉鼠之Hspa5的啟動子區域序列識別號2：源自小鼠之Ubc的啟動子區域序列識別號3：源自小鼠之Ubc的啟動子區域由Ubc的起始密碼子上游約2.1kbp的核苷酸至對應於轉錄起始點的核苷酸序列為止構成的核苷酸序列序列識別號4：可附加於Hspa5的啟動子區域之3’側的核苷酸序列序列識別號5：Hspa5的啟動子區域在為轉錄起始點的3’側連結有32鹼基而成的核苷酸序列序列識別號6：源自中國倉鼠之Hspa8的5’-UTR 序列識別號7：源自中國倉鼠之Actb的5’-UTR 序列識別號8：源自中國倉鼠之Rpsa的5’-UTR 序列識別號9：源自中國倉鼠之Ubc的5’-UTR 序列識別號10：源自中國倉鼠之EF1α的5’-UTR 序列識別號11：源自小鼠之Ubc的5’-UTR 序列識別號12：源自中國倉鼠之Hspa8的5’-UTR所含的內含子序列識別號13：源自中國倉鼠之Actb的5’-UTR所含的內含子序列識別號14：源自中國倉鼠之Rpsa的5’-UTR所含的內含子序列識別號15：源自中國倉鼠之Ubc的5’-UTR所含的內含子序列識別號16：源自中國倉鼠之EF1α的5’-UTR所含的內含子序列識別號17：源自小鼠之Ubc的5’-UTR所含的內含子序列識別號18：由源自中國倉鼠之Hspa5的啟動子區域與源自中國倉鼠之Hspa8的5’-UTR所構成的表現單元序列識別號19：由源自中國倉鼠之Hspa5的啟動子區域與源自中國倉鼠之Actb的5’-UTR所構成的表現單元序列識別號20：由源自中國倉鼠之Hspa5的啟動子區域與源自中國倉鼠之Rpsa的5’-UTR所構成的表現單元序列識別號21：由源自中國倉鼠之Hspa5的啟動子區域與源自中國倉鼠之Ubc的5’-UTR所構成的表現單元序列識別號22：由源自中國倉鼠之Hspa5的啟動子區域與源自中國倉鼠之EF1α的5’-UTR所構成的表現單元序列識別號23：由源自中國倉鼠之Hspa5的啟動子區域與源自小鼠之Ubc的5’-UTR所構成的表現單元序列識別號24：由源自小鼠之Ubc的啟動子區域與源自中國倉鼠之Hspa8的5’-UTR所構成的表現單元序列識別號25：由源自小鼠之Ubc的啟動子區域與源自中國倉鼠之Actb的5’-UTR所構成的表現單元序列識別號26：由源自小鼠之Ubc的啟動子區域與源自中國倉鼠之Rpsa的5’-UTR所構成的表現單元序列識別號27：由源自小鼠之Ubc的啟動子區域與源自中國倉鼠之Ubc的5’-UTR所構成的表現單元序列識別號28：由源自小鼠之Ubc的啟動子區域與源自中國倉鼠之EF1α的5’-UTR所構成的表現單元序列識別號29：由源自小鼠之Ubc的啟動子區域與源自小鼠之Ubc的5’-UTR所構成的表現單元序列識別號30：由源自小鼠之Ubc的啟動子區域與源自中國倉鼠之Hspa8的5’-UTR所構成的表現單元序列識別號31：由源自小鼠之Ubc的啟動子區域與源自中國倉鼠之Actb的5’-UTR所構成的表現單元序列識別號32：由源自小鼠之Ubc的啟動子區域與源自中國倉鼠之Rpsa的5’-UTR所構成的表現單元序列識別號33：由源自小鼠之Ubc的啟動子區域與源自中國倉鼠之Ubc的5’-UTR所構成的表現單元序列識別號34：由源自小鼠之Ubc的啟動子區域與源自中國倉鼠之EF1α的5’-UTR所構成的表現單元序列識別號35：由源自小鼠之Ubc的啟動子區域與源自小鼠之Ubc的5’-UTR所構成的表現單元序列識別號36：可附加於Hspa5的啟動子區域的3’側的核苷酸序列序列識別號37：Hspa8的引子 Hspa8-NotI-F 序列識別號38：Hspa8的引子 Hspa8-XbaI-R 序列識別號39：經選殖之DNA所包含的Hspa8基因上游的核苷酸序列序列識別號40：源自小鼠之Ubc的引子 mChub2-3k-NotI-f 序列識別號41：源自小鼠之Ubc的引子 mChub2-2p-NheI-r 序列識別號42：DNA元件A2的核苷酸序列序列識別號43：DNA元件A7的核苷酸序列序列識別號44：DNA元件A18的核苷酸序列序列識別號45：由源自小鼠之Ubc的啟動子區域與把源自小鼠之Ubc之5’-UTR中的內含子區域取代為源自中國倉鼠之Hspa8的5’-UTR所含的內含子區域而成的核苷酸序列所構成的表現單元序列識別號46：由源自小鼠之Ubc的啟動子區域與把源自小鼠之Ubc之5’-UTR中的內含子區域取代為源自中國倉鼠之Actb的5’-UTR所含的內含子區域而成的核苷酸序列所構成的表現單元序列識別號47：由源自小鼠之Ubc的啟動子區域與把源自小鼠之Ubc之5’-UTR中的內含子區域取代為源自中國倉鼠之Rpsa之5’-UTR所含的內含子區域而成的核苷酸序列所構成的表現單元序列識別號48：由源自小鼠之Ubc的啟動子區域與源自中國倉鼠之Hspa8的5’-UTR所構成的表現單元

無。

圖1係由啟動子區域、5’-UTR所構成的表現單元(Expression Unit)的示意圖。圖中，TSS表示轉錄起始點(Transcription Start Site)。圖2係對表現單元進行了內含子之取代的示意圖。圖3係包含使用了表現單元的抗體H鏈及L鏈基之人源化抗體基因Y表現載體(pDSLH3.1-Expression Unit-Y)的示意圖。圖4A係在使用了人源化抗體Y表現穩定庫(stable pool)的饋料批次培養(fed-batch culture)中，將藉由包含Hspa5啟動子區域的表現單元所表現的抗體生產量，與由人類EF1α(hEF1α)基因的啟動子區域與5’-UTR所構成的表現單元進行了比較的圖。圖4A顯示各採樣日的活細胞數。圖4B係在使用了人源化抗體Y表現穩定庫的饋料批次培養中，將藉由包含Hspa5啟動子區域的表現單元所表現的抗體生產量，與由人類EF1α基因的啟動子區域與5’-UTR所構成的表現單元進行了比較的圖。圖4B顯示各採樣日的生產量。圖5A係在使用了人源化抗體Y表現穩定庫的饋料批次培養中，將藉由包含源自小鼠之Ubc啟動子區域的表現單元所表現的抗體生產量，與由人類EF1α基因的啟動子區域與5’-UTR所構成的表現單元進行了比較的圖。圖5A顯示各採樣日的活細胞數。圖5B係在使用了人源化抗體Y表現穩定庫的饋料批次培養中，將藉由包含源自小鼠之Ubc啟動子區域的表現單元所表現的抗體生產量，與由人類EF1α基因的啟動子區域與5’-UTR所構成的表現單元進行了比較的圖。圖5B顯示各採樣日的生產量。圖6係將使用包含源自小鼠之Ubc的起始密碼子至上游約3.0kbp的核苷酸序列、及起始密碼子至上游約2.1kbp的核苷酸序列的啟動子區域與5’-UTR的表現單元而使暫時性表現(transient expression)之螢火蟲螢光素酶表現量，與人類EF1α基因啟動子進行了比較之圖。圖7A係在使用了人源化抗體Y表現穩定庫的饋料批次培養中，將藉由包含Hspa5啟動子區域與Hspa8之5’‐UTR的表現單元所表現的抗體生產量，與由人類EF1α基因的啟動子區域與5’-UTR所構成的表現單元進行了比較的圖。於括弧內記載轉錄起始點以後的核苷酸長。圖7A顯示各採樣日的活細胞數。圖7B係在使用了人源化抗體Y表現穩定庫的饋料批次培養中，將藉由包含Hspa5啟動子區域與Hspa8之5’‐UTR的表現單元所表現的抗體生產量，與由人類EF1α基因的啟動子區域與5’-UTR所構成的表現單元進行了比較的圖。於括弧內記載轉錄起始點以後的核苷酸長。圖7B顯示各採樣日的生產量。圖8A係在使用包含mUbc啟動子區域與5’‐UTR的表現單元作為抗體H鏈及L鏈基因的啟動子，並使用包含或是不包含DNA元件A7的人源化抗體Y表現載體而製作出的穩定庫的饋料批次培養中，將抗體生產量進行了比較的圖。圖8A顯示各採樣日的活細胞數。圖8B係在使用包含mUbc啟動子區域與5’‐UTR的表現單元作為抗體H鏈及L鏈基因的啟動子，並使用包含或是不包含DNA元件A7的人源化抗體Y表現載體而製作出的穩定庫的饋料批次培養中，將抗體生產量進行了比較的圖。圖8B顯示各採樣日的生產量。

無。