CN105073995A

CN105073995A - 增强的转基因表达和加工

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Publication number: CN105073995A
Application number: CN201480010305.9A
Authority: CN
Inventors: V·勒富尔; N·梅尔莫; A·雷加梅; M·巴赛特; D·莱伊; N·哈拉奇; K·科斯特拉科; P-A·吉拉; D·卡拉布列兹
Original assignee: Selexis SA
Current assignee: Selexis SA
Priority date: 2013-02-01
Filing date: 2014-02-01
Publication date: 2015-11-18
Also published as: HUE061494T2; PT3536797T; US20150361451A1; IL240198B; HUE043103T2; CA2898878A1; EP2951309A2; LT2951309T; HK1216323A1; PL2951309T3; ZA201506419B; ES2940433T3; ES2717175T3; JP6563816B2; AU2019250224B2; DK2951309T3; US11898154B2; JP2016504922A; RU2711505C9; SG11201505487UA

Abstract

本发明公开了用于表达所关注的DNA，特别是在非灵长类动物真核宿主细胞中表达所关注的DNA的构建体和方法，所述细胞在表达的量和质量方面显示出优势，包括高表达稳定性，以及如果合适的话，将表达产物从所述细胞中转运出。

Description

增强的转基因表达和加工

技术领域

本发明涉及提供参与或作用于介导或影响细胞代谢的代谢途径的核酸构建体和蛋白质以及影响细胞代谢的方法，所述细胞代谢例如穿过ER膜的易位和/或穿过细胞质膜的分泌。本发明还涉及重组哺乳动物细胞的制备和用途，在所述重组哺乳动物细胞中，例如多种多样的异源蛋白质(转基因表达产物)的易位/分泌发生改变。所述方法、核酸构建体一般被设计以提高转基因表达。

背景技术

治疗性蛋白质以及基因和细胞疗法的生物技术制备取决于向真核细胞中引入成功的转基因表达。成功的转基因表达一般需要将转基因整合到宿主染色体中并且尤其受限于被整合的转基因拷贝数以及可能导致低转录或不稳定转录和/或高克隆变异性的表观遗传效应。转基因表达产物不能从细胞中被转运出或所述转运减少往往也会限制治疗性蛋白质以及基因和细胞疗法的制备。

在本文用于说明本发明并且特别是提供关于实施的另外的细节的出版物和其它材料，包括专利、专利申请以及登录号以引用的方式整体并入本文。

为了使转基因在哺乳动物细胞中的表达提高和稳定，表观遗传调节因子正被越来越多地用于保护转基因防止负面位置效应(Bell和Felsenfeld,1999)。这些表观遗传调节因子包括边界元件或绝缘子元件、基因座控制区(LCR)、稳定和抗阻抑(STAR)元件、遍在作用染色质开放(UCOE)元件以及上述基质附着区(MAR)。所有这些表观遗传调节因子已经被用于哺乳动物细胞系中的重组蛋白质产生(Zahn-Zabal等,2001；Kim等,2004)以及用于基因疗法(Agarwal等,1998；Allen等,1996；Castilla等,1998)。

转基因表达产物在加工和转运出细胞期间往往会遇到不同的瓶颈：仅配备有加工和转运先天蛋白质的机制的细胞可能会因转运某些类型的转基因表达产物而容易变得超负荷，特别是在以常常所需的异常高的水平产生这些转基因表达产物时，从而使得产物聚集在细胞内和/或例如阻止功能蛋白产物进行正确的折叠。

已经采取不同的方法来克服转运和加工的瓶颈。举例来说，通过SM蛋白质Munc18c或Sly1的表达将具有提高的分泌特性的CHO细胞工程化，这些SM蛋白质充当膜泡囊运输以及从而分泌的蛋白质胞吐的调节因子(美国专利公开20090247609)。X盒结合蛋白1(Xbp1)(一种调节分泌细胞分化和ER维持和扩张的转录因子)或各种蛋白质二硫键异构酶(PDI)已经被用于减少ER应激和提高蛋白质分泌(Mohan等,2007)。其它提高蛋白质分泌的尝试包括在CHO细胞中伴侣蛋白ERp57、钙联蛋白、钙网蛋白以及BiP1的表达(Chung等,2004)。冷休克诱导蛋白，特别是冷诱导型RNA结合蛋白(CIRP)的表达被证实会提高重组γ-干扰素的产量。还试图使分泌复合体的蛋白质过表达。然而，例如，Lakkaraju等(2008)报道外源性SRP14在野生型人类细胞中(例如在没有经过工程化而表达低的SRP14水平的细胞中)的表达没有提高分泌的碱性磷酸酶蛋白的分泌效率。

因此，需要高效的可靠的转基因表达，例如重组蛋白质制备和基因疗法。还需要成功地将转基因表达产物转运到细胞外。

这种需要以及本领域的其它需要是通过本发明的实施方案来解决的。

发明内容

在一个实施方案中，本发明涉及一种重组核酸分子，所述重组核酸分子包含：

(a)5'端转座子特异性反向末端重复序列(ITR)和3'端转座子特异性反向末端重复序列，

(b)至少一个编码转基因表达加工(TEP)蛋白或TEP功能性RNA的核酸序列，所述核酸序列位于5'端ITR与3'端ITR之间并且在启动子的控制下，以及

(c)任选的至少一种转基因，所述转基因也位于5'端ITR与3'端ITR之间并且在转基因启动子的控制下，其中所述核酸分子任选地是载体的一部分。

所述重组核酸分子可以包含至少一个表观遗传调节元件，特别是至少一个MAR(基质附着区)元件。

所述MAR元件可以位于5'端ITR与3'端ITR之间。任选地在另外的启动子控制下的诸如抗生素抗性基因或编码免疫球蛋白的基因之类的转基因可以位于5'端ITR与3'端ITR之间，如5'端ITR与MAR之间。

TEP蛋白或TEP功能性RNA可以是如下的蛋白质或功能性RNA，它直接地或间接地涉及核酸序列向基因组中的整合、转基因RNA产物的加工或翻译，或涉及诸如转基因表达产物之类的蛋白质的ER易位、分泌、加工、折叠、ER-高尔基体-质膜转运、糖基化和/或另外的翻译后修饰。

TEP蛋白可以是蛋白质分泌途径的蛋白质、DNA重组或修复途径的蛋白质、包括伴侣蛋白(如BiP)的蛋白质加工或代谢蛋白、或其组合。

TEP蛋白可以是蛋白质分泌途径的下列蛋白质中的一种或多种：hSRP14、hSec61α1、hSec61β、hSec61γ、hSRP54、hSRP9、hSRPRα、hSRPβ、以及hCANX。

TEP蛋白还可以对应于蛋白质分泌途径的蛋白质的下列氨基酸序列中的一个或多个：具有SEQIDNO:13的hSRP14、具有SEQIDNO:15的hSec61α1、具有SEQIDNO:17的hSec61β、具有SEQIDNO:19的hSec61γ、具有SEQIDNO:21的hSRP54、具有SEQIDNO:23的hSRP9、具有SEQIDNO:25的hSRPRα、具有SEQIDNO:27的hSRPβ、以及具有SEQIDNO:29的hCANX和/或可以对应于与所指定的序列具有大于80％、90％、95％或98％序列同一性的氨基酸序列。

TEP蛋白可以是下列蛋白质加工或代谢蛋白中的一种或多种：hUCP4、hCMPSAT、rST6Gal1、hCOMSC、hT-合酶、hP4HA1、hP4HB、hGILZ、hCyPB、hNRF2、hHK1、hPDI、hPIN1、hSEPW1、hCALR、hDDOST、hHSP40、hATP5A1、hSERCA2、hPDIA4、hHSC70/HSPA8、hHYOU1、hCMP-SAS、hBeclin-1、hERdj3、CHO-AGE、hWip1、hRTP4、hREEP2、hDPM1以及hDRiP78。

TEP蛋白还可以对应于蛋白质加工或代谢蛋白的下列氨基酸序列中的一个或多个：具有SEQIDNO:31的hUCP4、具有SEQIDNO:33的hCMPSAT、具有SEQIDNO:35的rST6Gal1、具有SEQIDNO:37的hCOMSC、具有SEQIDNO:39的hT-合酶、具有SEQIDNO:41的hP4HA1、具有SEQIDNO:43的hP4HB、具有SEQIDNO:45的hGILZ、具有SEQIDNO:47的hCyPB、具有SEQIDNO:49的hNRF2、具有SEQIDNO:51的hHK1、具有SEQIDNO:53的hPDI、具有SEQIDNO:55的hPIN1、具有SEQIDNO:57的hSEPW1、具有SEQIDNO:59的hCALR、具有SEQIDNO:62的hDDOST、具有SEQIDNO:64的hHSP40、具有SEQIDNO:66的hATP5A1、具有SEQIDNO:68的hSERCA2、具有SEQIDNO:70的hPDIA4、具有SEQIDNO:72的hHSC70/HSPA8、具有SEQIDNO:74的hHYOU1、具有SEQIDNO:76的hCMP-SAS、具有SEQIDNO:78的hBeclin-1、具有SEQIDNO:80的hERdj3、具有SEQIDNO:82的CHO-AGE、具有SEQIDNO:84的hWip1、具有SEQIDNO:86的hRTP4、具有SEQIDNO:88的hREEP2、具有SEQIDNO:90的hDPM1以及具有SEQIDNO:92的hDRiP78和/或可以对应于与所指定的序列具有大于80％、90％、95％或98％序列同一性的氨基酸序列。

TEP蛋白可以是伴侣蛋白，特别是BiP蛋白，更特别是与SEQIDNO.:60具有80％、90％、95％或100％序列同一性的修饰的果蝇BIP蛋白衍生物(DroBiP)。

MAR元件可以选自SEQIDNO:1(MAR1-68)、2(MAR1_6)、3(MARX_S29)、4(MARS4)、5(鸡溶菌酶MAR)，或优选地是工程化，特别是重排的对应物和/或与SEQIDNO:1至5中的任一个或SEQIDNO:6至10中的任一个具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性。

所述细胞内的TEP功能性RNA可以包含如下的核酸序列/由如下的核酸序列组成，所述核酸序列编码功能性RNA，优选地miRNA或shRNA，所述功能性RNA干扰DNA重组或修复途径的至少一种蛋白质的表达，所述蛋白质诸如但不限于Rad51、Rad51B、Rad51C、Rad51D、Xrcc2、Xrcc3、Rad52、Rad54、Brca1、Brca2、细胞周期蛋白D1、Ercc、MDC1、Bard1、连接酶1、Mre11和/或53BP1。

TEP功能性RNA还可以干扰与以下各项具有至少80％、90％、95％、98％或100％序列同一性的基因的表达：具有SEQIDNO:93的Rad51、具有SEQIDNO:94的Rad51B、具有SEQIDNO:95的Rad51C、具有SEQIDNO:96的Rad51D、具有SEQIDNO:99的Xrcc2、具有SEQIDNO:100的Xrcc3、具有SEQIDNO:97的Rad52、具有SEQIDNO:98的Rad54、具有SEQIDNO:101的Brca1、具有SEQIDNO:102的Brca2、具有SEQIDNO:103的细胞周期蛋白D1、具有SEQIDNO:104的Ercc1、具有SEQIDNO:105的MDC1、具有SEQIDNO:106的Bard1、具有SEQIDNO:107的连接酶1、具有SEQIDNO:108的Mre11和/或具有SEQIDNO:109的53BP1。

重组核酸分子的长度可以是至少5000bp、6000bp、7000bp、8000bp、90000bp或10000bp。

5'端ITR和3'端ITR可以是SleepingBeauty转座子或优选地PiggyBac转座子的5'端ITR和3'端ITR。

在向哺乳动物细胞中第一次转染所述重组核酸分子中的一种并且第二次后续转染含有转基因的另外的重组核酸分子之后，在所述细胞中，相对于没有接受所述第一次转染的细胞，转基因整合和/或表达可以增加。

本文提到的TEP编码序列或TEP功能性RNA可以是包括表达载体在内的载体的一部分。所述载体可以包含单个MAR元件、两个或更多个MAR元件，其中所述元件可以位于5'端ITR与3'端ITR之间。

举例来说，所述载体可以包含两个MAR元件。第一MAR元件可以被定位于TEP或TEP功能性RNA的上游并且第二MAR元件可以被定位于TEP或TEP功能性RNA的下游，其中所述第一MAR元件可以包含MAR1_6元件和/或与SEQIDNO.2具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的元件，特别是基于MAR1-6的重排MAR，更特别是与SEQIDNO:8(MAR1_6R2)具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的元件，并且所述第二MAR元件可以包含MAR1-68元件和/或与SEQIDNO.1具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的元件。

所述载体还可以包含单个MAR元件。所述单个MAR元件可以被定位于TEP或TEP功能性RNA的下游，其中所述单个MAR元件可以是MAR1-68或MARX-29元件和/或与SEQIDNO.1或3具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的元件，特别是基于MAR1-68或MARX-29的重排MAR，特别是与SEQIDNO:6、7或10(MAR1_68R、MAR1_68R2或MARX_29R3)或9具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的元件，并且可以优选地是MARX-29元件和/或与SEQIDNO.3具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的元件。

TEP或TEP功能性RNA可以在EF1α启动子的控制下并且任选地后面是BGH多聚腺苷酸化信号。

所述载体可以包含一个或多个启动子和/或一个或多个增强子或其融合体，如GAPDH、SV40p、CMV、CHOEF1α、CHOActb和/或CHOHspa5、或其工程融合体，如CGAPDH。

作为所述载体的一部分的启动子可以是具有SEQIDNO:111的GAPDH、具有SEQIDNO:114的SV40p、具有SEQIDNO:113的CMVp、具有SEQIDNO:112的CHOEf1α、具有SEQIDNO:115的CHOActb、具有SEQIDNO:116的CHOHspa5、和/或其融合体，如具有SEQIDNO:11的CGAPDH，或可以具有与所指定的序列具有大于80％、90％、95％或98％序列同一性的核酸序列。

本发明还涉及一种用于表达TEP或TEP功能性RNA的方法，所述方法包括：

提供包含转基因的重组哺乳动物细胞，并且所述载体是表达TEP或TEP功能性RNA的表达载体，其中经由所述载体表达的所述TEP或TEP功能性RNA任选地使所述哺乳动物细胞中转基因的表达增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或至少70％。

所述载体可以包含单个MARX-29元件和/或与SEQIDNO.3具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列，并且其中在培养超过4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周或14周之后，经由所述载体表达的所述TEP或TEP功能性RNA可以使所关注的基因的表达增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或至少70％。

本发明还涉及一种重组哺乳动物细胞，所述重组哺乳动物细胞包含不超过20种、15种、10种或5种重组核酸分子，这些重组核酸分子优选地作为单拷贝被整合到所述细胞的基因组中。

如上文所指出，所述TEP蛋白可以是蛋白质分泌途径的下列蛋白质中的一种或多种：hSRP14、hSec61α1、hSec61β、hSec61γ、hSRP54、hSRP9、hSRPRα、hSRPβ、以及hCANX。

TEP蛋白可以是伴侣蛋白，特别是BiP蛋白，更特别是与SEQIDNO.:60具有80％、90％、95％或100％序列同一性的工程化的果蝇BIP蛋白衍生物(DroBiP)。

所述重组哺乳动物细胞内的TEP功能性RNA可以包含如下一个或多个核酸序列/由如下一个或多个核酸序列组成，所述核酸序列编码功能性RNA，优选地miRNA或shRNA，所述功能性RNA干扰至少一种重组蛋白，优选地HR基因的表达，所述重组蛋白诸如但不限于Rad51、Rad51B、Rad51C、Rad51D、Xrcc2、Xrcc3、Rad52、Rad54、Brca1、Brca2、细胞周期蛋白D1、Ercc1、MDC1、Bard1、连接酶1、Mre11和/或53BP1。所述核酸可以与以下各项具有至少80％、90％、95％、98％或100％序列同一性：具有SEQIDNO:93的Rad51、具有SEQIDNO:94的Rad51B、具有SEQIDNO:95的Rad51C、具有SEQIDNO:96的Rad51D、具有SEQIDNO:99的Xrcc2、具有SEQIDNO:100的Xrcc3、具有SEQIDNO:97的Rad52、具有SEQIDNO:98的Rad54、具有SEQIDNO:101的Brca1、具有SEQIDNO:102的Brca2、具有SEQIDNO:103的细胞周期蛋白D1、具有SEQIDNO:104的Ercc1、具有SEQIDNO:105的MDC1、具有SEQIDNO:106的Bard1、具有SEQIDNO:107的连接酶1、具有SEQIDNO:108的Mre11和/或具有SEQIDNO:109的53BP1.

所述重组哺乳动物细胞可以是原代干细胞、仓鼠细胞(例如CHO(中国仓鼠卵巢)细胞)或人类细胞，例如HEK293细胞。

本发明还涉及一种重组哺乳动物细胞，所述重组哺乳动物细胞包含：

a)至少一种TEP功能性RNA和/或至少一个重组核酸序列，所述重组核酸序列编码TEP蛋白或编码TEP功能性RNA，以及

b)重组核酸分子，所述重组核酸分子包含：

(i)至少一种所关注的转基因，以及

(ii)任选的MAR元件。

TEP蛋白可以是伴侣蛋白，特别是BiP蛋白，更特别是与SEQIDNO.:60具有80％、90％、95％或100％序列同一性的合成果蝇BIP蛋白衍生物(DroBiP)。

所述功能性RNA可以是从所述至少一个分离的核酸序列转录的瞬时转染的siRNA或shRNA，其中所述siRNA或所述经过加工的shRNA是具有20个、21个、22个、23个、24个或25个碱基对长度的反义RNA，所述反义RNA与至少一种靶基因的mRNA的20个、21个、22个、23个、24个或25个连续核苷酸完全互补，所述靶基因是NHEJ(非同源末端连接)、HR(同源重组)、MMEJ(微同源介导的末端连接)重组途径的一部分或是DNA修复蛋白，如MDC1(DNA损伤检验点介质1)。

所述至少一种靶基因可以是以下各项的一部分：

-DNA修复和NHEJ，所述靶基因是

53BP1(肿瘤抑制因子p53结合蛋白1)；

-HR，所述靶基因是

Rad51(DNA修复蛋白RAD51)、Rad51B(DNA修复蛋白RAD51同源物2)、Rad51C(DNA修复蛋白RAD51同源物3)，

Rad51D(DNA修复蛋白RAD51同源物4)、Rad52(DNA修复蛋白RAD52)、Rad54(DNA修复和重组蛋白RAD54)，

Xrcc2(中国仓鼠细胞X射线修复互补缺陷修复基因2)，

Xrcc3(中国仓鼠细胞X射线修复互补缺陷修复基因3)，

Brca1(早发性乳腺癌基因1)，

Brca2(早发性乳腺癌基因2)，

Bard1(BRCA1相关环状结构域1)；

-MMEJ，所述靶基因是

Ercc1(切除修复交叉互补啮齿动物修复缺陷基因，互补群1)，

Mre11(减数分裂重组基因11)，

连接酶1(DNA连接酶1)，

和/或

所述至少一种靶基因是DNA修复蛋白MDC1。

所述靶基因可以是与以下各项具有至少80％、90％、95％、98％或100％序列同一性的核酸：具有SEQIDNO:93的Rad51、具有SEQIDNO:94的Rad51B、具有SEQIDNO:95的Rad51C、具有SEQIDNO:96的Rad51D、具有SEQIDNO:99的Xrcc2、具有SEQIDNO:100的Xrcc3、具有SEQIDNO:97的Rad52、具有SEQIDNO:98的Rad54、具有SEQIDNO:101的Brca1、具有SEQIDNO:102的Brca2、具有SEQIDNO:103的细胞周期蛋白D1、具有SEQIDNO:104的Ercc1、具有SEQIDNO:105的MDC1、具有SEQIDNO:106的Bard1、具有SEQIDNO:107的连接酶1、具有SEQIDNO:108的Mre11和/或具有SEQIDNO:109的53BP1。

所述至少一种转基因可以表达治疗性蛋白质，如免疫球蛋白、激素(如促红细胞生成素)、或生长因子，并且其中任选地，在所述重组哺乳动物细胞中，相对于不包含所述一种或多种重组核酸分子的细胞，转基因整合和/或表达增加。

所述重组哺乳动物细胞可以包含至少两种TEP功能性RNA，其中所述TEPRNA中的一种或这两种是瞬时转染的siRNA，或由所述一个或多个编码TEP功能性RNA的分离的核酸序列表达。

重组哺乳动物细胞可以包含MAR元件。

本发明还涉及一种用于转染哺乳动物细胞，特别是仓鼠细胞的方法，所述方法包括：

任选地在第一次转染中，使用以下各项对所述哺乳动物细胞进行转染：

(i)如技术方案1至13中任一个的所述重组核酸分子中的至少一种，和/或

(ii)至少一种分离的TEP功能性RNA和至少一种转基因，所述转基因任选地是如下的重组核酸分子的一部分，所述重组核酸分子任选地在第二次后续的转染中，任选地连同表达识别5'端ITR和3'端ITR的转座酶的分离的核酸或mRNA一起被转染。

可以使用编码以下各项中的一种、两种或三种的所述重组核酸分子中的多于一种，包括至少两种、至少三种或至少四种对所述重组哺乳动物细胞进行转染：hSRP14、hSec61α1、hSec61β、hSec61γ、hSRP54、hSRP9、hSRPRα、hSRPβ、以及hCANX。

还可以用以下各项对它进行转染：具有SEQIDNO:13的hSRP14、具有SEQIDNO:15的hSec61α1、具有SEQIDNO:17的hSec61β、具有SEQIDNO:19的hSec61γ、具有SEQIDNO:21的hSRP54、具有SEQIDNO:23的hSRP9、具有SEQIDNO:25的hSRPRα、具有SEQIDNO:27的hSRPβ、以及具有SEQIDNO:29的hCANX和/或与所指定的序列具有大于80％、90％、95％或98％序列同一性的氨基酸序列。

所述重组核酸分子中的任一种可以是载体的一部分，其中所述载体可以被共转染。

在所述细胞中编码若干种TEP蛋白的载体的共转染，优选地编码蛋白质SRP14、SRP9以及SRP54的重组核酸分子的共转染可以相对于没有接受这种共转染的细胞提高转基因整合和/或表达。包含具有至少80％、90％、95％、98％或100％的SEQIDNO:12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:20的核酸序列的载体的共转染也在本发明的范围内。

可以获得一定数目的所述稳定表达所述TEP蛋白或TEP功能性RNA的哺乳动物细胞以获得重组哺乳动物细胞并且其中重组哺乳动物细胞的所述数目可以与所述MAR元件的存在无关。可以对所述哺乳动物细胞进行第二次转染以及任选第三次转染。

优选地，所述哺乳动物细胞中的至少30％、40％或45％可以变成重组哺乳动物细胞并且表达所述转基因。

可以使用所述至少一种分离的TEP功能性RNA和包含所述至少一种转基因和任选的侧接所述至少一种转基因的3'端ITR和5'端ITR的载体，任选地连同表达识别5'端ITR和3'端ITR的转座酶的分离的核酸或mRNA一起对所述哺乳动物细胞进行转染。

所述转基因可以是治疗性蛋白质，如免疫球蛋白、激素、细胞因子或生长因子。

所述重组核酸分子可以任选地包含选择标记并且其中所述至少一种转基因在以下情况下表达：

(a)在没有针对所述标记进行选择的情况下，或

(b)在例如经由培养基中所含的选择剂针对所述标记进行选择的情况下，以及

(c)在不存在转座酶的情况下，或

(d)在转座酶存在下。

所述TEP功能性RNA可以由编码shRNA或miRNA的重组核酸序列编码，或可以包含siRNA/由siRNA组成，所述siRNA干扰至少一种HR基因的表达，所述HR基因诸如但不限于Rad51、Rad51B、Rad51C、Rad51D、Xrcc2、Xrcc3、Rad52、Rad54、Brca1、Brca2、细胞周期蛋白D1、Ercc1、MDC1、Bard1、连接酶1、Mre11和/或53BP1。

所述TEP功能性RNA还可以干扰与以下各项具有至少80％、90％、95％、98％或100％序列同一性的基因的表达：具有SEQIDNO:93的Rad51、具有SEQIDNO:94的Rad51B、具有SEQIDNO:95的Rad51C、具有SEQIDNO:96的Rad51D、具有SEQIDNO:99的Xrcc2、具有SEQIDNO:100的Xrcc3、具有SEQIDNO:97的Rad52、具有SEQIDNO:98的Rad54、具有SEQIDNO:101的Brca1、具有SEQIDNO:102的Brca2、具有SEQIDNO:103的细胞周期蛋白D1、具有SEQIDNO:104的Ercc1、具有SEQIDNO:105的MDC1、具有SEQIDNO:106的Bard1、具有SEQIDNO:107的连接酶1、具有SEQIDNO:108的Mre11和/或具有SEQIDNO:109的53BP1。

在这种细胞中，相对于没有经过所述分离的核酸分子和/或所述分离的TEP功能性RNA中的所述至少一种转染的细胞，转基因整合和/或表达可以增加。

本发明还涉及一种试剂盒，所述试剂盒包含在一个容器中的至少一种载体，所述载体包含根据技术方案1至13的重组核酸分子中的任一种；以及在第二任选的容器中的编码相容的转座酶的载体，和在另一个容器中的如何使用所述一种载体或多种载体的说明书。

上文所提到的试剂盒，其中在一个或多个容器中提供超过一种载体，并且其中TEP蛋白是以下各项中的至少两种：伴侣蛋白、SRP14、SRP9、SRP54、SR或易位子。

上文所提到的试剂盒，其中所述一种或多种载体内的所述一种或多种TEP功能性RNA包含如下的核酸序列/由如下的核酸序列组成，所述核酸序列编码干扰至少一种HR基因的表达的miRNA、siRNA或shRNA，所述HR基因诸如但不限于Rad51、Rad51B、Rad51C、Rad51D、Xrcc2、Xrcc3、Rad52、Rad54、Brca1、Brca2、细胞周期蛋白D1、Ercc1、MDC1、Bard1、连接酶1、Mre11和/或53BP1，以及优选地在另一个容器中的干扰至少一种其它HR基因的表达的一种或多种siRNA，所述HR基因诸如但不限于Rad51、Rad51B、Rad51C、Rad51D、Xrcc2、Xrcc3、Rad52、Rad54、Brca1、Brca2、细胞周期蛋白D1、Ercc1、MDC1、Bard1、连接酶1、Mre11和/或53BP1。

所述HR基因可以对应于与以下各项具有至少80％、90％、95％、98％或100％序列同一性的核酸：具有SEQIDNO:93的Rad51、具有SEQIDNO:94的Rad51B、具有SEQIDNO:95的Rad51C、具有SEQIDNO:96的Rad51D、具有SEQIDNO:99的Xrcc2、具有SEQIDNO:100的Xrcc3、具有SEQIDNO:97的Rad52、具有SEQIDNO:98的Rad54、具有SEQIDNO:101的Brca1、具有SEQIDNO:102的Brca2、具有SEQIDNO:103的细胞周期蛋白D1、具有SEQIDNO:104的Ercc1、具有SEQIDNO:105的MDC1、具有SEQIDNO:106的Bard1、具有SEQIDNO:107的连接酶1、具有SEQIDNO:108的Mre11和/或具有SEQIDNO:109的53BP1。

本发明还涉及本文所公开的重组核酸和/或本文所公开的重组哺乳动物细胞的用途，它们优选地用于提高转基因整合和/或表达。

本发明还涉及一种表达载体，所述表达载体包含：

(a)在上游由启动子并且在下游由多聚腺苷酸化信号侧接的转基因，

(b)在所述多聚腺苷酸化信号下游的单个MAR元件，或

(c)在所关注的转基因上游的第一MAR元件和在所述转基因整合位点下游的第二MAR元件。

单个MAR元件或第一MAR元件和第二MAR元件可以选自MAR元件1_68、1_6、1_6R2、1_68R、1_68R2、X_29R3或X_29或者与SEQIDNO:1、2、3、6、7、8、9或10具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的元件。

单个MAR或第一MAR和第二MAR可以选自重排的MAR元件1_6R2、1_68R、1_68R2或X_29R3或者与SEQIDNO:6、7、8或10具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的元件，其中任选地，所述MAR元件相对于它们的非重排对应物使所关注的转基因的表达增加了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或至少70％。

所述启动子可以是EF1α启动子并且所述多聚腺苷酸化信号是BGH多聚腺苷酸化信号。

所述载体可以包含一个或多个启动子和/或一个或多个增强子或其融合体，如GAPDH、CGAPD、CSV40p、CMVp、CHOEf1α、CHOActb或CHOHspa5。

所述启动子可以是具有SEQIDNO:111的GAPDH、具有SEQIDNO:11的CGAPDH、具有SEQIDNO:114的SV40p、具有SEQIDNO:113的CMVp、具有SEQIDNO:112的CHOEf1α、具有SEQIDNO:115的CHOActb和/或具有SEQIDNO:116的CHOHspa5以及与所指定的序列具有大于80％、90％、95％或98％序列同一性的核酸序列。

所述启动子可以是GAPDH启动子并且包含CMV增强子。

第一MAR和/或第二MAR、增强子、启动子、所关注的转基因以及多聚腺苷酸化信号可以位于5'端ITR与3'端ITR之间。

在某些实施方案中，所述表达载体可以包含：

(a)处于多聚腺苷酸化信号下游的单个MAR元件，其中所述单个MAR元件优选地是MAR1-68或MARX-29元件和/或与SEQIDNO.1或3具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的元件，特别是基于MAR1-68或MARX-29的重排MAR，特别是与SEQIDNo:6、7或10(MAR1_68R、MAR1_68R2或MARX_29R3)或SEQIDNO:9具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的元件，并且优选地是MARX-29元件和/或与SEQIDNO.3具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％的序列同一性，或

(b)位于所关注的转基因上游的第一MAR元件和位于所述所关注的转基因下游的第二MAR元件，其中所述第一MAR元件优选地包含1_6元件和/或与SEQIDNO.2具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％的序列同一性，特别是基于MAR1-6的重排MAR，特别是与SEQIDNO:8(MAR1_6R2)具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％的序列同一性的元件并且所述第二MAR元件优选地包含MAR1-68元件和/或与SEQIDNO.1具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％的序列同一性。

所述表达载体可以包含单个MAR元件并且所述单个MAR元件可以被定位于多聚腺苷酸化位点的下游并且是MAR1-68或MARX-29和/或与SEQIDNO.1或3具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性，特别是基于MAR1-68或MARX-29的重排的MAR，特别是与SEQIDNo:6、7或10(MAR1_68R、MAR1_68R2或MARX_29R3)或9具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的元件，并且可以优选地是MARX-29衍生元件和/或与SEQIDNO.3具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性。

所述第一MAR元件可以在所关注的转基因的上游并且第二MAR元件可以在所述所关注的转基因的下游，其中所述第一MAR元件可以包含MAR1_6元件和/或可以与SEQIDNO.2具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％的序列同一性并且所述第二MAR元件可以包含MAR1_68元件和/或可以与SEQIDNO.1具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％的序列同一性。

本发明还涉及一种用于表达转基因的方法，所述方法包括：

提供包含上述包含所述转基因的载体中的一种的重组哺乳动物细胞，以及使所述转基因表达，其中所述一个或多个MAR元件可以优选地使所述转基因的表达增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或至少70％。所述载体可以包含单个MARX_29元件和/或可以与SEQIDNO.3具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的核酸，并且其中，在培养超过4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周或14周之后，所述MAR元件可以使所关注的转基因的表达增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或至少70％。

附图说明

图1：转座子载体的构造

为了测试将MAR元件添加到PB(PiggyBack)转座子中是否可能影响转座效率和转基因表达，以及为了评估MAR在构建体中的位置是否对这些效应有任何影响，设计一系列含有GFP和嘌呤霉素抗性(Puro)基因的转座子供体构建体，其中MAR1_68或对照中性间隔DNA序列被插入到质粒中的不同位置。没有插入物的亲本Puro-GFP转座子质粒用作转座的对照，以相对于MAR或间隔序列的添加的影响辨别增加的转座子尺寸的影响。

图2：转座子载体：转座效率

通过评估(A)在转染并且在没有抗生素选择的情况下培养三周之后GFP表达细胞的百分比，以及(B)通过对嘌呤霉素抗性集落进行计数来测量各种转座子构建体的转座效率。

图3：转座子载体：表达水平

通过与(+PB)或不与(-PB)转座酶表达质粒一起转染的不同的转座子载体，通过在仅将GFP阳性细胞的荧光考虑在内的情况下探测在转染后在针对嘌呤霉素抗性没有进行选择(A)或进行选择(B)的情况下培养3周之后CHO细胞的GFP荧光水平来对表达水平进行分析。

图4：MAR和转座酶对转基因的基因组整合的影响

使用从如图1-3的图例说明中所述而产生的未经过选择的CHO细胞(A)、或嘌呤霉素抗性细胞(B)中分离的基因组DNA，使用qPCR确定整合的GFP转基因拷贝的数目，并且将值相对于细胞B2M基因归一化。值代表平均值±SEM(n＝3)。*P<0.05。

图5：每种转基因的转基因表达

在没有进行(A)和进行(B)嘌呤霉素选择的情况下，独立于载体在基因组中整合的倾向对它们的固有表达潜能进行评估。

图6：来自转座载体和质粒载体的分泌蛋白的表达对重组蛋白(转基因)表达的影响。构建转座载体或常规的质粒载体以表达分泌蛋白SRP9、SRP14、SRP54、SRP受体α亚基和β亚基(SR)、或易位子。如本文所述，在表达英夫利昔单抗(Infliximab)抗体的细胞克隆中，将转座载体与PiggyBack转座酶载体共转染(右图)，而单独转染非转座质粒载体(左图)在进行选择(左图)或没有进行选择(右图)的情况下培养三周之后，由细胞培养上清液测定分泌的英夫利昔单抗抗体的水平。如可以看到的是，在使用转座子载体时，相对于没有TEP的亲本细胞，单位生产率分别从0.25至1.5增加到1至2.5，所述单位生产率是含有编码转基因表达加工(TEP)蛋白或TEP功能性RNA的序列的细胞的相对表达。

图7：来自电穿孔的CHO-M细胞悬浮液的重组蛋白表达

(A)在存在(+PB)或不存在(-PB)piggyBac转座酶的情况下以带有MARX-29的GFP表达转座子载体电穿孔一次或两次的CHO-M细胞。示出了在没有进行选择的情况下进行培养3周之后稳定的GFP表达细胞的百分比。

(B)GFP阳性细胞的GFP荧光的平均值。

(C)将编码贝伐单抗(Bevacizumab，Beva)、阿达木单抗(Adalimumab，Adal)以及利妥昔单抗(Rituximab，Ritu)抗体的免疫球蛋白轻链和重链的cDNA引入到含有MARX29的转座子质粒中代替GFP。在CHO-M细胞中在存在piggyBac转座酶表达载体的情况下以12天的时间间隔将轻链转座子构建体和重链转座子构建体电穿孔三次。示出了在没有进行选择的情况下培养的多克隆细胞池的培养上清液中所分泌的免疫球蛋白的水平(空心条柱)。或者，通过使用磁性微珠对在表面上展示免疫球蛋白的细胞进行淘选来分选未经过选择的多克隆细胞群体：示出了未分选的群体的分泌的免疫球蛋白的水平(实心条柱)。

(D)使用集落挑选装置从转染的细胞群体中分选表达免疫球蛋白的集落，并且在旋管式生物反应器中在补料分批培养中培养表达这三种免疫球蛋白中的每一种的两个克隆。示出了所分泌的免疫球蛋白的水平并且如对于图(C)测定所述水平。

图8：SRP14的异源表达提高了曲妥珠单抗(Trastuzumab)的分泌以及恢复了英夫利昔单抗的分泌

将以所获得的最高水平表达曲妥珠单抗(A)或英夫利昔单抗(B)免疫球蛋白的CHO-K1HP克隆和LP克隆用SRP14表达载体稳定地重新转染并且分离单克隆群体。评价被标记为A至E的衍生的亚克隆在分批培养条件下的细胞生长和产量。绘制在整个培养的7天内每一个采样日的细胞密度(细胞/毫升)和IgG滴度(μg/ml)的曲线。(C)与亲本HP克隆和LP克隆(-)相比，在使用SRP14表达载体转染之后曲妥珠单抗(HP)亚克隆和英夫利昔单抗(LP)亚克隆的单位生产率分布(条带S)。(D)测定5种单独的SRP14-LPA-E亚克隆和亲本对照LP克隆的SRP14mRNA的相对水平，并且绘制在4次培养操作中它们相对于IgG单位生产率的关系图。mRNA和单位生产率平均值和标准差值表示为相对于LP对照克隆的那些的增加倍数。

图9：SRP14的异源表达介导了在制备过程中难表达的免疫球蛋白的高产量

将如在图8中所分析的经过SRP14载体转染的曲妥珠单抗HP亚克隆B(A)和英夫利昔单抗LP亚克隆E(B)以25ml的工作体积在补料分批培养中培养在125ml通风摇瓶容器中，并且在11天的时间过程期间测定活细胞密度和IgG滴度。

图10：SRP14的表达消除了CHO细胞克隆的轻链聚集

(A)通过SDS-PAGE对通过离心所收集的Tx100透化的细胞的上清液和沉淀物进行分析，如由以Tx-100可溶性和Tx-100不溶性标记的组分别针对LP衍生的SRP14-LP亚克隆E和HP衍生的SRP14-HP亚克隆B(泳道S)或针对表达对照GFP蛋白的CHO亚克隆(泳道G)所描绘。箭头示出了被错误加工的游离LC和聚集的(Aggr.)LC。(B)对由SRP14-LP克隆E和LP对照克隆E产生的各种LC、HC以及IgG组装中间体物质进行追踪分析并且示出了结果。

图11：SRP、SR以及易位子亚基的组合表达对免疫球蛋白分泌的影响

(A)将英夫利昔单抗LP克隆E用SRP、SR以及易位子转座表达载体的各种组合重新转染。然后在分批培养中评价所得细胞池的单位生产率并且所述单位生产率表示为相对于LP对照细胞pcd值的％。箱形图表示在独立的培养操作的第3天测定的归一化的单位生产率的中值、上四分位数以及下四分位数。(B)将表达SRP14的英夫利昔单抗产生细胞亚克隆E用各种SR和易位子转座表达载体组合重新转染。如对于图A来表示细胞池的单位生产率。

图12：表达SRP14的克隆解救英夫利昔单抗分泌的模型

低产克隆在SRP/易位子亚基过表达之前(A)以及之后(B)的IgG折叠和分泌的模型。数据表明由低产克隆产生的新合成的LC表现出不适当的加工和折叠状态。英夫利昔单抗LC的信号肽错误加工可能会导致ER共翻译易位机制的饱和(图A，编号1)。它在无IgG组装能力的聚集的LC形式内在ER中的聚集(图A，编号2)诱导ER应激并且触发自噬体样结构的形成(图A，编号3)。SRP14和其它SRP/易位子组分蛋白的过表达完全解救了英夫利昔单抗IgG的加工和分泌(图B)。SRP14的延伸停滞活性可能延迟在LC的mRNA翻译期间所述LC的ER易位(图B，编号1)。这进而将有利于LC的正确加工和它与ER折叠伴侣蛋白的适当的相互作用(图B，编号2)。呈有IgG组装能力的状态的新合成的LC的维持因此恢复了完全组装的抗体的高产量分泌(图B，编号3)。

图13：HR和NHEJ的si-RNA敲落对表达的影响

代表未经过处理的细胞(空白对照)、经过阴性siRNA处理的细胞(siNeg)、经过针对NHEJ因子的siRNA处理的细胞(siKu70+80+DNA-PKcs)以及经过抗HRsiRNA处理的细胞(siRad51)中的重组事件频率的GFP阳性细胞百分比(相对于在此被示为1.0的经过GFP对照质粒转染的细胞)的倍数差异。GFP条带示出了GFP表达细胞的阳性对照。以HRundigest.和NHEJundigest.标记的条带示出了阴性对照细胞，即经过环状HR和NHEJ报告基因质粒转染的细胞。以HRI-Scel和NHEJI-Scel标记的条带指示经过Scel切割的报告基因质粒转染的细胞，所述质粒在分别通过同源重组或非同源末端连接进行DNA切割修复后恢复了GFP表达。该图示出了siRNA抑制HR或NHEJ的功效，如通过GFP阳性细胞的百分比所表明，将所述百分比针对dsRed阳性细胞的百分比归一化并且表示为相对于GFP对照细胞的百分比(被设定为1)的倍数变化。3次实验的平均值，误差棒示出了平均值的标准误差。通过非配对斯图登氏t检验(unpairedStudent'st-test)确定统计显著性；显著性水平p<0.05(*)以及p<0.01(**)。

图14：MAR在NHEJ的siRNA敲落中的作用

示出了经过针对NHEJ因子的siRNA处理并且经过GFP质粒或MAR-GFP质粒重新转染的CHO细胞的GFP表达和整合的增加倍数。平均GFP荧光、拷贝数以及每个GFP拷贝的荧光被示为相对于从经过GFP质粒转染的未经过处理的细胞(被标记为‘空白对照’)所获得的结果的增加倍数。A)流式细胞术结果，B)通过qPCR对基因组中GFP的拷贝数的分析，C)每一个整合的GFP基因的平均荧光(对于每一次实验，被计算为表达数与拷贝数之间的比率)。3次或更多次实验的平均值；由非配对斯图登氏t检验确定的统计显著性。星号表示经过siRNA处理的样品与相应的未经过处理的对照之间的显著性差异；显著性水平：p<0.05(*)，p<0.01(**)；误差棒示出了平均值的标准误差。

图15：MAR在HR的siRNA敲落中的作用

示出了经过针对HR因子的siRNA处理并且经过GFP质粒或MAR-GFP质粒重新转染的CHO细胞的GFP表达和整合的增加倍数。平均GFP荧光、拷贝数以及每个GFP拷贝的荧光被示为相对于从经过GFP质粒转染的未经过处理的细胞(被标记为‘空白对照’)所获得的结果的增加倍数。A)流式细胞术结果，B)通过qPCR对基因组中GFP的拷贝数的分析，C)每一个整合的GFP基因的平均荧光(对于每一次实验，被计算为表达数与拷贝数之间的比率)。3次或更多次实验的平均值；由非配对斯图登氏t检验确定的统计显著性。星号表示经过siRNA处理的样品与相应的未经过处理的对照之间的显著性差异；显著性水平：p<0.05(*)，p<0.01(**)；误差棒示出了平均值的标准误差。

图16：MAR在MMEJ的siRNA敲落中的作用

示出了经过针对MMEJ因子(和某些HR因子)的siRNA处理并且经过GFP质粒(A)或MAR-GFP质粒(B)重新转染的CHO细胞的GFP表达和整合。平均GFP荧光、拷贝数以及每个GFP拷贝的荧光被示为相对于从经过GFP质粒转染的未经过处理的细胞(被标记为‘空白对照’)所获得的结果的增加倍数。所述图示出了流式细胞术结果。示出了在底部所示次数的实验的平均值。经过siMDC1转染的细胞甚至在不存在MAR的情况下仍表达GFP，比率是没有经过siMDC转染的细胞的11.8倍。也可以使用确实含有MAR，即siBard1和siLigl的某些质粒实现特别好的结果。

图17：si-RNA介导的HR蛋白敲落的作用

该图示出了可以由稳定表达针对Rad51的shRNA的CHO-M细胞实现更高的GFP和免疫球蛋白表达。将CHO-M细胞用PiggyBac衍生的转座Rad51shRNA表达载体转染，并且将多克隆细胞池以及其衍生的细胞克隆连同亲本CHO-M细胞一起用GFP表达质粒重新转染。在针对GFP和嘌呤霉素抗性基因的稳定表达进行选择后的10天时评估亲本CHO-M、表达Rad51-shRNA的细胞池以及衍生的克隆的GFP荧光。紧跟在细胞池和亲本细胞的荧光谱之后示出了发出最多荧光的克隆中的两种的荧光谱(A)，以及在针对嘌呤霉素抗性进行选择后的10天时M1、M2以及M3象限中细胞的百分比(B)，如由图A中以1、2以及3标记的水平条柱所描绘。在没有进行选择的情况下进一步培养68天期间追踪高表达M3细胞的比例，证实在与亲本CHO_M细胞相比时，可以从表达shRNA的细胞克隆获得更高的并且更稳定的表达(C)。或者，将编码英夫利昔单抗抗体的轻链和重链的表达质粒转染到代表性克隆中，并且在进行选择之后在不存在抗生素的情况下进一步培养三周期间评估分泌的免疫球蛋白的单位生产率。

图18：各种人类重组上游MAR对高产细胞和非常高产细胞的百分位数(M3/M2％)的影响，如通过在双MAR构建体中进行FACS分析对GFP荧光所评估。(A)MAR元件是MARX-29(X_29R2(SEQIDNO:9)、X_29R3(SEQIDNO:10))、MAR1-42(1_42R2Bis、1_42R3)、MAR1-6(1_6R2(SEQIDNO:8)、1_6R3)、或MAR1-68(1_68R2(SEQIDNO:7))的重排衍生物，如以构建体的名称所指示。(B)获得最好的上游MAR元件(MAR1_68R(SEQIDNO:6))的典型FACS谱。

图19：双MAR载体中表达的稳定性

在没有进行选择的情况下培养5周的时间内测试由含有1_68R2、1_6R2以及X_29R3MAR衍生物的载体构建的多克隆群体，并且在这段时间内每周评估GFP荧光。评估M3亚群的百分位数：作为上游MAR的1_6R2元件和作为下游MAR的未重排的MAR1-68是具有两个MAR的载体的最佳测试组合。还示出了M1亚群和M2亚群。

图20：含有单个遗传元件的表达载体

对MAR1_68和MARX_29进行测试并且将它们与LmnB2复制基因组合使用。将MAR定位在转基因表达盒下游并且在两个月的时间内在转基因转染测定中评估。在两周期间针对抗生素抗性对稳定转染的细胞的多克隆群体进行选择并且在七周期间通过荧光激活细胞分选仪(FACS)分析测试GFP荧光。高产M3细胞的比例示于(A)中，而典型的FACS谱示于(B)中。

图21：含有单个遗传元件的表达载体：X-29

X_29载体的稳定性测定：在表达盒下游含有单个X_29的表达载体被证实是稳定的并且甚至在培养14周之后(27代)仍提供非常高百分位数的M2亚群和M3亚群。

图22：在抗生素选择24周之后稳定转染的CHO群体的对比分析

与具有两个MAR(作为上游MAR的1_6R2和作为下游MAR的1_68)的载体(Puro_1_6R2_CGAPD_GFP_胃泌素_1_68)相比，在表达盒下游具有单个X_29MAR的载体(Puro_CGAPD_GFP_胃泌素_X29)使高GFP表达细胞的出现率增加并且还提高了表达随时间推移的稳定性。

具体实施方式

如在本发明的上下文中所使用的转基因是编码给定的成熟蛋白质(在本文也被称为编码蛋白质的DNA)、前体蛋白或不编码蛋白质的功能性RNA(非编码RNA)的分离的脱氧核糖核苷酸(DNA)序列。将转基因分离并且引入到细胞中以产生转基因产物。根据本发明的一些优选的转基因是编码免疫球蛋白(Ig)和Fc融合蛋白以及其它蛋白质，特别是具有治疗活性的蛋白质(“生物治疗剂”)的转基因。举例来说，某些免疫球蛋白(如英夫利昔单抗(Remicade))或其它分泌蛋白(如凝血因子VIII)由于大多未被表征的细胞瓶颈而特别难表达。借助于本发明的重组核酸分子、载体以及方法，这些瓶颈可以被鉴定和/或打开。这一般会提高可以产生的治疗性蛋白质的量和/或它们的质量，例如像它们的加工以及翻译后修饰(如糖基化)的同质性。

如本文所用的术语转基因在编码蛋白质的DNA的背景下应当不包括非翻译侧接区，如RNA转录起始信号、多聚腺苷酸化添加位点、启动子或增强子。其它优选的转基因包括编码功能性RNA的DNA序列。因此，在本发明的上下文中在提到如下的DNA序列时使用术语转基因，所述DNA序列经由转染(在本发明的背景下还包括转导，即经由病毒载体引入)被引入到诸如真核宿主细胞之类的细胞中并且编码所关注的产物，所述所关注的产物在本文也被称为“转基因表达产物”，例如“异源蛋白质”。所述转基因可能功能性地连接到信号肽编码序列，所述信号肽编码序列编码信号肽，所述信号肽进而介导和/或促进穿过内质网和/或细胞质膜的易位和/或分泌并且在分泌前或期间被去除。

小干扰RNA(siRNA)是一般具有20-25个碱基对的长度的双链RNA分子，所述RNA分子在RNA干扰(RNAi)中通过干扰具有互补的核苷酸序列的特定基因的表达而起作用。siRNA可以直接地被引入到细胞中或可以经由载体在细胞中表达。如本文所提到的分离的TEPsiRNA是这样的具有20-25个碱基对长度的siRNA，所述siRNA通常直接被引入到细胞中，即在没有经由已经被引入到细胞中的核酸而表达的情况下。

小发夹RNA/短发夹RNA(shRNA)是形成紧密发夹弯(hairpinturn)的RNA序列，所述发夹弯可以用于经由RNAi使靶基因表达沉默。shRNA在细胞中的表达通常是通过递送质粒或诸如逆转录病毒载体之类的病毒载体来实现的。为了产生shRNA，通常对siRNA序列进行修饰以在siRNA的两条链之间引入短环。然后将编码shRNA的核酸经由载体递送到细胞中并且转录成短发夹RNA(shRNA)，所述短发夹RNA可以通过切丁酶(Dicer)以它常见的方式被加工成功能性siRNA。

siRNA/shRNA能够以序列特异性方式减少靶基因的表达。shRNA可以与编码靶基因的产物的mRNA转录物的区域杂交，从而经由RNA干扰抑制靶基因表达。双功能性shRNA具有超过一个靶标，例如mRNA的编码区以及某些非翻译区。细胞基因组中的整合有助于持久的或组成型基因的沉默，所述沉默可以传到后代细胞上。

微小RNA(miRNA)是一种小RNA分子，例如具有20至24个，特别是22个核苷酸的长度，它的功能在于经由与mRNA内的互补序列配对对基因表达进行转录调节和转录后调节。基因沉默可以经由转基因转录抑制、mRNA降解或阻止mRNA被翻译而发生。miRNA可以通过递送质粒或诸如逆转录病毒载体之类的病毒载体来表达。或者，抑制或模拟miRNA的RNA分子可以被合成并且直接转染到细胞中。

“编码转基因表达加工(TEP)蛋白或TEP功能性RNA的序列”分别允许在它被转移到细胞中之后给定的TEP蛋白表达或表达增加，而编码非编码功能性RNA的序列抑制细胞蛋白的表达。所述TEP蛋白可以与细胞蛋白相同或相似，或它们可以是来自不同的细胞或物种的蛋白质。表达例如受到功能性RNA抑制的细胞蛋白是引入有功能性RNA的细胞的组成蛋白。TEP蛋白还可以补充另一种细胞蛋白的表达并且因此，优选地增强转基因的表达。所述蛋白质可以涉及重组；mRNA翻译过程；多肽的ER易位、分泌、加工或折叠；内质网-高尔基体-质膜转运；糖基化；和/或另外的翻译后修饰。功能性RNA包括例如siRNA、shRNA、微小RNA、套索形式的剪接RNA、短临时(short-temporary)正义RNA(stRNA)、反义RNA(aRNA)、核糖酶RNA以及其它RNA，特别是可以敲落靶基因表达的那些。在一个具体的优选实施方案中，这些蛋白质涉及“蛋白质分泌途径”或“重组途径”，而且还包括如下文所述的某些蛋白质加工或代谢蛋白。

TEP功能性RNA不仅可以由如上文所述的核酸序列表达，还可以直接被引入到细胞中。这特别是对于分离的TEPsiRNA来说是如此。

术语“分离的核酸分子”在本发明的上下文中等同于“重组核酸分子”，即在自然界中不以这种形式存在，但是已经以在自然界中确实存在的部分为起始物所构建的核酸分子。

如果例如两条单链DNA链或两条单链RNA链的核苷酸可以形成稳定的氢键，如鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)之间的氢键，那么诸如DNA或RNA之类的核酸序列与另一个DNA或RNA互补。在细胞中，互补碱基配对允许例如细胞将信息从一代拷贝到另一代。在RNA干扰(RNAi)中，互补碱基配对允许某些靶基因的沉默或完全敲除。基本上，siRNA、shRNA或miRNA序列通过具有与宿主细胞的RNA，特别是mRNA对齐的单条RNA链(例如siRNA中的反义链)特异性减少或敲除靶基因的表达。两条核酸链之间的互补程度可以不同，从完全互补(每一个核苷酸的对面均是它的相反者)到部分互补(50％、60％、70％、80％、90％或95％)。互补程度决定了复合体的稳定性以及因此可以将基因例如敲除的成功程度。因此，完全互补或至少95％互补是优选的。

siRNA在RNAi中的活性很大程度上取决于它与RNA诱导沉默复合体(RISC)的结合能力。在双链siRNA与RISC结合后，是核酸内切酶对正义链进行解旋和切割。剩余的反义链-RISC复合体然后可以与靶mRNA结合以起始转录沉默。

在本发明的上下文中，如上文所定义的转基因一般表达需要以更大的量产生以例如用于药物用途的蛋白质，而编码TEP蛋白/功能性RNA的序列或功能性RNA本身被设计成直接地或间接地帮助这些转基因表达。“使用转座子载体表达的TEP蛋白的示例性列表”被列为表A。如本领域技术人员将了解的那样，这些蛋白质中的绝大多数已经在本领域中公开并且表A公开了对应的蛋白质以及编码其的核酸序列的NCBI参考序列号。最后一列提供了那些序列中的某些的序列标识号。本领域技术人员将了解的是，这些蛋白质的变体以及具有大于80％、90％、95％或98％序列同一性的序列是本发明的一部分。

“使用例如特异性piggybac转座子载体表达的shRNA的示例性列表”被列为表B。如本领域技术人员将了解的那样，在已经选择了靶基因时，这些shRNA可以容易地构建。举例来说，重组途径的已知基因中的任一种是现成的靶基因。然而，其它基因，如表A中所阐述的蛋白质的基因也可以是由那些shRNA产生的siRNA的现成的靶标。表C是siRNA(正义链)的实例和由相应siRNA产生的shRNA的实例的列表。siRNA的反义链最终被用于阻止和/或引起细胞mRNA的降解。这一般会导致由mRNA编码的蛋白质的水平降低。

同一性意指两个核苷酸序列之间的序列相关程度，如由这些序列，如完全和完整的序列的两条链之间匹配的同一性所确定。同一性可以容易被计算出。虽然存在许多方法来测量两个核苷酸序列之间的同一性，但是术语“同一性”是本领域技术人员公知的(《计算分子生物学》(ComputationalMolecularBiology),Lesk,A.M.编著,OxfordUniversityPress,NewYork,1988；《生物计算：信息学和基因组计划》(Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects),Smith,D.W.编著,AcademicPress,NewYork,1993；《序列数据的计算机分析》(ComputerAnalysisofSequenceData),部分I,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编著,HumanaPress,NewJersey,1994；《分子生物学中的序列分析》(SequenceAnalysisinMolecularBiology),vonHeinje,G.,AcademicPress,1987；以及《序列分析入门》(SequenceAnalysisPrimer),Gribskov,M.和Devereux,J.编著,MStocktonPress,NewYork,1991)。常用于确定两个序列之间的同一性的方法包括但不限于以下文献中所公开的那些：《庞大计算机指南》(GuidetoHugeComputers),MartinJ.Bishop编著,AcademicPress,SanDiego,1994；以及Carillo,H.和Lipman,D.,SIAMJAppliedMath.48:1073(1988)。优选的确定同一性的方法被设计成提供所测试的两个序列之间的最大匹配。这些方法被编入计算机程序。优选的确定两个序列之间的同一性的计算机程序方法包括但不限于GCG(遗传学计算机小组(GeneticsComputerGroup)，威斯康星州的麦迪逊(MadisonWis.))程序包(Devereux,J.等,NucleicAcidsResearch12(1).387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Altschul等(1990)；Altschul等(1997))。公知的史密斯沃特曼算法(SmithWatermanalgorithm)也可以用于确定同一性。

作为说明，包含与参考核苷酸序列具有至少例如95％“同一性”的核苷酸序列的核酸意指所述核酸的核苷酸序列与参考序列是同一的，不同的是所述核苷酸序列可以包括参考核苷酸序列的每各100个核苷酸最多五处点突变。换句话说，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％同一的核苷酸序列的核苷酸，所述参考序列中最多5％的核苷酸可以缺失或被另外的核苷酸取代，或占所述参考序列中总核苷酸的最多5％的数目的核苷酸可以插入所述参考序列中。参考序列的这些突变可以存在于参考核苷酸序列的5'端或3'端位置上或那些末端位置之间的任何地方，在参考序列中的核苷酸间单独地交替或在参考序列内以一个或多个连续组的形式交替。本文所公开的任何序列(例如以序列标识号和/或以登录号)的超过约60％、约70％、约75％、约85％或约90％的序列同一性也在本发明的范围内。

与另一个核酸序列基本上同一的核酸序列指的是在它的序列中具有对所描述的对应的方法没有影响或有微小影响的点突变、缺失或添加的序列并且常常以100bp中的一处、两处、三处或四处突变来反映。

本发明涉及多核苷酸变体和多肽变体。“变体”指的是与所公开的多核苷酸或多肽不同，但是保留其必要的特性的多核苷酸或多肽。一般来说，变体与本发明的多核苷酸或多肽整体非常相似并且在许多区域中是相同的。

变体可以在编码区、非编码区或这两者中含有变化。特别优选的是含有如下变化的多核苷酸变体，所述变化产生沉默取代、添加或缺失，但不改变所编码的多肽的特性或活性。通过由遗传密码的简并所引起的沉默取代而产生的核苷酸变体是优选的。此外，其中本文公开的5-10个、1-5个或1-2个氨基酸以任何组合的形式被取代、缺失、或添加的变体也是优选的。

本发明还涵盖所述多核苷酸的等位基因变体。等位基因变体表示占据同一个染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异经由突变自然产生，并且可以在群体内产生多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。本文所公开的核酸分子中的任一种的变体是本发明的一部分。

启动子序列或仅启动子是由宿主细胞识别以表达特异性核酸序列的核酸序列。启动子序列含有转录控制序列，所述转录控制序列调节多核苷酸的表达。所述启动子可以是任何核酸序列，所述核酸序列在所选择的宿主细胞中显示出转录活性，包括突变启动子、截短启动子、以及杂合启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外多肽或细胞内多肽的基因获得。根据本发明的启动子包括诱导型启动子和非诱导型启动子。核酸序列在启动子的控制下指的是所述启动子对所述核酸发挥它的功能。

CGAPDH(在本文也被称为C_GAPDH)是增强子-启动子融合体，它包含人类GAPDH启动子和人类CMV即刻早期基因增强子。在一个实施方案中，为了产生它，将人类GAPDH启动子和它的5'端UTR从人类HEK293细胞基因组DNA中进行PCR扩增。将产物放置在人类CMV即刻早期基因增强子的下游。对于代表性序列，参见SEQIDNO:11。与SEQIDNO.11具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的序列也在本发明的范围内。其它一种或多种理想的启动子和/或增强子或其融合体是但不限于CMVIE增强子、人类GAPDH启动子、人类Ef1α启动子、CMV启动子、SV40启动子、CHOActb启动子或CHOHspa5启动子。这些元件是本领域公知的并且样品序列列于SEQIDNO:110至116下。如本领域技术人员将了解的那样，其变体以及与SEQIDNO:110至116中的任一个具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的元件也是本发明的一部分。

“转座子”是在载体与染色体之间经由“剪切和粘贴”或“拷贝和粘贴”机制有效地进行转座的可移动的遗传元件。在转座期间，转座酶(例如PiggyBac转座子系统中的PB转座酶)识别位于转座子的两端上的转座子特异性反向末端重复序列(ITR)(任何转座子系统均存在5'端ITR和3'端ITR)并且使内容物从原始位点移动并且将它们整合到染色体位点，如TTAA染色体位点中。PiggyBac转座子系统的强效活性使得这两个ITR之间的所关注的基因能够容易地被移动到靶基因组中。PiggyBac转座子系统描述于例如2010/0154070中，该2010/0154070以引用的方式整体并入本文。

MAR元件(MAR构建体、MAR序列、S/MAR或仅MAR)属于一组较广泛的表观遗传调节因子元件，它们还包括边界元件或绝缘子元件(如cHS4)、基因座控制区(LCR)、稳定和抗阻抑(STAR)元件、遍在作用染色质开放(UCOE)元件或组蛋白修饰因子，如组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)。

MAR元件可以基于它们所主要基于的所鉴定的MAR来限定：MARS4构建体因此是大部分的核苷酸(50％+，优选地60％、70％或80％)是基于MARS4的MAR元件。在MAR内常常存在若干个简单序列基序，所述基序诸如具有高的A和T含量。通常存在的其它基序是A盒、T盒、DNA解旋基序、SATB1结合位点(H盒、A/T/C25)以及脊椎动物或果蝇的共有拓扑异构酶II位点。

MAR一般被表征为真核染色体的DNA中的附着核基质的序列。MAR的特性仅仅部分地通过它们的一级结构来限定。举例来说，在MAR元件中存在的典型的一级结构(如富含AT的区域)已知会产生三级结构，即限定MAR的功能的一定的弯曲。因此，MAR常常不仅由它们的一级结构来限定，还由它们的二级结构、三级结构来限定，例如它们的弯曲度和/或物理特性，如解链温度。

如在MAR元件中所通常存在的富含AT/TA二核苷酸的弯曲的DNA区域(在下文中被称为“富含AT的区域”)是包含高数量的A和T(特别是呈二核苷酸AT和TA形式)的弯曲的DNA区域。在一个优选的实施方案中，它在一段100个连续碱基对上含有至少10％的二核苷酸TA和/或至少12％的二核苷酸AT，优选地在一段100个连续碱基对上(或在富含AT的区域具有较短的长度时，在对应的较短的一段上)含有至少33％的二核苷酸TA、和/或至少33％的二核苷酸AT，同时具有弯曲的二级结构。然而，“富含AT的区域”可以短到约30个核苷酸或更少，但优选地是约50个核苷酸、约75个核苷酸、约100个核苷酸、约150个、约200个、约250个、约300个、约350个或约400个核苷酸长或更长。

一些结合位点也常常具有相对高的A和T含量，如SATB1结合位点(H盒、A/T/C25)和脊椎动物(RNYNNCNNGYNGKTNYNY)或果蝇(GTNWAYATTNATNNR)的共有拓扑异构酶II位点。然而，包含一群结合位点的结合位点区域(模块)，特别是TFBS区域可以容易地通过比较区域的弯曲模式而与MAR元件中具有高A和T含量的富含AT和TA二核苷酸的区域(“富含AT的区域”)相区分。举例来说，对于人类MAR1_68，后者可能具有超过约3.8或约4.0的平均弯曲度，而TFBS区域可能具有低于约3.5或约3.3的平均弯曲度。所鉴定的MAR的区域还可以通过替代方式来确定，所述替代方式诸如但不限于相对解链温度，如本文别处所述。然而，这些值具有物种特异性并且因此可以在物种间变化，并且可以例如更低。因此，对应的富含AT和TA二核苷酸的区域可以具有更低的弯曲度，如约3.2至约3.4、或约3.4至约3.6、或约3.6至约3.8，并且TFBS区域可以具有按比例更低的弯曲度，如低于约2.7、低于约2.9、低于约3.1、低于约3.3。在SMARScanII中，对应地更低窗口尺寸将由本领域技术人员选择。

根据本发明的MAR元件、MAR构建体、MAR序列、S/MAR或仅MAR是与天然存在的“SAR”或“MAR”共有一种或多种(如两种、三种或四种)特征(如上文所述的特征)的核苷酸序列。优选地，这种MAR元件、MAR构建体、MAR序列、S/MAR或仅MAR具有促进受所述MAR影响的任何基因的蛋白质表达的至少一种特性。MAR元件一般还具有作为分离的和/或纯化的核酸的特征，所述核酸优选地表现出MAR活性，特别是表现出转录调节活性，优选地增强活性，而且还表现出例如表达稳定化活性和/或其它活性。

术语MAR元件、MAR构建体、MAR序列、S/MAR或仅MAR在某些实施方案中还包括增强的MAR构建体，所述构建体具有构成相对于根据本发明的MAR构建体可以基于的天然存在的和/或所鉴定的MAR的增强作用的特性。这些特性包括但不限于长度相对于全长的天然存在的和/或所鉴定的MAR缩短、基因表达/转录增强、表达的稳定性、组织特异性、诱导性的增强或其组合。因此，增强的MAR元件可以例如包含所鉴定的MAR序列的少于约90％，优选地少于约80％，甚至更优选地少于约70％、少于约60％、或少于约50％数目的核苷酸。MAR元件可以在使用所述构建体转化适当的细胞后增强转基因的基因表达和/或转录。

MAR元件优选地被插入到启动子区域的上游，所关注的基因与所述启动子区域可操作地连接或可以与所述启动子区域可操作地连接。然而，在某些实施方案中，有利的是，MAR元件位于所关注的基因/核苷酸序列的上游以及下游或只是位于下游。其它多种呈顺式和/或反式的MAR排列也在本发明的范围内。

合成的在用于MAR元件的背景下时指的是MAR的设计涉及所鉴定的MAR或基于其的MAR的不止简单改组、序列/区域或部分区域的重复和/或缺失。具体来说，合成MAR/MAR元件一般包含所鉴定的MAR的一个或多个区域，优选地一个区域，然而在某个实施方案中，所述区域可能是合成的或修饰的以及特定设计的、充分表征的元件，如单个TFBS或一系列TFBS，在一个优选的实施方案中，以合成方式产生。这些设计元件在许多实施方案中是相对短的，具体来说，它们一般不超过约300bp长，优选地不超过约100bp、约50bp、约40bp、约30bp、约20bp或约10bp长。在某些实施方案中，这些元件可以被多聚化。这些合成MAR元件也是本发明的一部分，并且应当了解的是，一般来说，本发明的说明可以被理解成，被说成适用于“MAR元件”的任何情况同样适用于合成MAR元件。

还包括所鉴定的MAR元件的核苷酸序列的功能性片段，只要它们维持如上文所述的MAR元件的功能即可。

一些优选的所鉴定的MAR元件包括但不限于如WO2005040377和美国专利公开20070178469中所公开的MAR1_68、MARX_29、MAR1_6、MARS4、MARS46，包括它们所有的排列在内，这些参考文献中有关这些和其它MAR元件的序列的公开内容明确地以引用的方式并入本申请中。鸡溶菌酶MAR也是一个优选的实施方案(参见美国专利号7,129,062，该美国专利中有关MAR元件的公开内容也明确地并入本文)。

如果载体被说成包含单个MAR，这意味着在这种载体中，存在一个MAR并且在载体内不存在具有相同或不同类型或结构的其它MAR。

在本发明的某些实施方案中，存在多个MAR，它们可以具有相同或不同的类型或结构并且均可以位于所关注的基因的下游。这被称作单个MAR簇。

如果某些事物，如稳定表达多肽的细胞数目被说成是与例如序列的存在“无关”，则所述序列没有在任何统计显著性程度上(对例如稳定表达多肽的细胞数目)造成影响。

本发明的转基因或编码转基因表达加工蛋白或功能性RNA的序列常常是载体的一部分。

根据本发明的载体是一种核酸分子，所述核酸分子能够转运将由这种载体表达的另一种核酸，如转基因，所述另一种核酸已经与这种载体连接，一般已经被整合到这种载体中。举例来说，质粒是一种类型的载体，反转录病毒或慢病毒是另一种类型的载体。在本发明的一个优选的实施方案中，所述载体在转染之前被线性化。表达载体包含调节元件或在这些调节元件的控制下，这些调节元件被设计成促进由所述表达载体携带的核酸序列的转录和/或表达。调节元件包括增强子和/或启动子，而且还包括本文所述的多种其它元件(还参见“载体设计”)。

载体的载体序列是不包括任何“其它”核酸(如转基因)以及遗传元件(如MAR元件)在内的载体的DNA或RNA序列。

根据本发明的真核细胞，包括哺乳动物细胞，如重组哺乳动物细胞/真核宿主细胞能够被维持在细胞培养条件下。这种类型的细胞的非限制性实例是非灵长类动物真核宿主细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL10)。灵长类动物真核宿主细胞包括例如人类宫颈癌细胞(HELA，ATCCCCL2)和经过SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCCCRL-1587)。重组真核宿主细胞或重组哺乳动物细胞表示已经例如通过使用例如转基因序列进行转染和/或通过突变修饰的细胞。真核宿主细胞或重组哺乳动物细胞能够进行由所述细胞表达的蛋白质的转录后修饰。在本发明的某些实施方案中，真核(例如非灵长类动物)宿主细胞的细胞对应物是全功能的，即没有例如因突变而失活。相反，除了它的细胞对应物(例如非灵长类动物)外，还表达转基因序列(例如灵长类动物)。

根据本发明的转染是诸如但不限于通过电穿孔、脂质体转染，一般经由非病毒载体(载体介导的转染)或经由化学手段(包括涉及聚阳离子脂质的那些)将核酸引入到接受体真核细胞中。非载体介导的转染包括例如将分离的TEPsiRNA直接引入到细胞中。在瞬时转染的细胞中，例如siRNA仅瞬时保留。在本发明的背景下，可以通过使用具有编码转基因表达加工(TEP)蛋白或TEP功能性RNA的序列的至少一种核酸分子，或可替代地，直接使用TEP功能性RNA(例如siRNA)进行第一次转染，并且使用编码转基因的核酸进行第二次后续的转染。可以重复第一次转染和第二次转染这两者。例如siRNA在第一次转染期间被引入，作用于，特别是抑制重组蛋白(在转染的细胞中涉及重组事件的蛋白质)。在此之后，在第二次后续的转染期间引入转基因。

转录意指RNA从DNA模板的合成。“转录活性”指的是例如转基因正在被转录。翻译是RNA产生蛋白质的过程。

分泌的增强是相对于从不包含对应的转基因序列的对照细胞获得的值来测量的。相对于对照的值的任何统计显著性增强有资格作为促进。

选择标记是含有如下的基因的核酸，所述基因的产物赋予针对选择剂抗生素(例如氯霉素(chloramphenicol)、氨苄青霉素(ampicillin)、庆大霉素(gentamycin)、链霉素(streptomycin)、四环素(tetracyclin)、卡那霉素(kanamycin)、新霉素(neomycin)、嘌呤霉素(puromycin))的抗性或在选择培养基(例如DHFR(二氢叶酸还原酶))上生长的能力。

被称为伴侣蛋白的一类蛋白质已经被定义为如下的蛋白质，所述蛋白质与另一种蛋白质的否则不稳定的构象体结合并且使它稳定，并且通过受控的结合和释放，促进它在体内正确的命运、促进它折叠、低聚组装、转运到特定的亚细胞区室中、或通过降解处置。BiP(也被称为GRP78、Ig重链结合蛋白以及酵母中的Kar2p)是hsp70家族的一种丰富的约70kDa的伴侣蛋白，它存在于内质网(ER)中，它除了其它功能以外尤其用来辅助分泌系统中的转运和蛋白质折叠。蛋白质二硫键异构酶(PDI)是一种伴侣蛋白，存在于ER中，涉及在蛋白质的翻译后加工期间二硫键形成的催化。

细胞代谢工程化

在细胞代谢工程化中，例如为表达细胞所固有的过程发生改变。举例来说，分泌途径的某些蛋白质例如过表达。或者，通过影响重组途径而使重组事件发生改变。

蛋白质分泌途径

蛋白质的分泌是所有三界生物体所共有的过程。这种复杂的分泌途径最为显著地需要蛋白质从胞质易位穿过细胞的细胞质膜。蛋白质需要多个步骤和多种因子以到达它的最终目的地。在哺乳动物细胞中，这种分泌途径涉及两种主要的大分子组装，即信号识别颗粒(SRP)和分泌复合体(Sec-复合体或易位子)。SRP由具有9kDa、14kDa、19kDa、54kDa、68kDa以及72kDa的质量的六种蛋白质以及7SRNA构成，并且易位子是由Sec61αβγ、Sec62以及Sec63构成的圆环状的颗粒。这些蛋白质中的一些的人类型式的登录号(在括号中)如下：hSRP14(登录号：X73459.1)；hSRP9(NM_001130440)；hSRP54(NM_003136)；hSRPRα(NM_003139)；hSRPRβ(NM_021203)；hSEC61α1(NM_013336)；hSEC61β(L25085.1)；hSEC61γ(AK311845.1)。

蛋白质分泌中的第一步骤依赖于信号肽，所述信号肽在多肽的氨基末端包含特定的肽序列，所述肽序列介导新生的蛋白质易位穿过膜并且进入内质网(ER)的腔中。在这个步骤期间，自引导翻译核糖体出现的信号肽与识别所述信号肽的SRP颗粒的亚基(即SRP54)相互作用。SRP与信号肽结合，阻止了新生多肽的进一步延伸，从而引起翻译停滞。SRP9和SRP14蛋白质是为延伸停滞所需的(Walter和Blobel1981)。在第二步骤中，核糖体-新生多肽-SRP复合体经由SRP54与SRP受体(SR)的相互作用而停靠到ER膜上(Gilmore,Blobel等,1982；Pool,Stumm等,2002)。SR是一种异二聚复合体，含有表现出GTP酶活性的两种蛋白质，即SRα和SRβ(Gilmore,Walter等,1982)。SR与SRP54的相互作用依赖于GTP的结合(Connolly,Rapiejko等,1991)。SR协调SRP从核糖体-新生多肽复合体中的释放以及核糖体的退出位点(exitsite)与Sec61复合体(易位子)的缔合。增长的新生多肽经由易位子通道进入ER中并且翻译以它的正常速度重新开始。核糖体保持结合在易位子的细胞质面上直到翻译完成为止。除了核糖体之外，易位子在细胞质面上与核糖体结合糖蛋白(ribophorin)以及与伴侣蛋白(如钙网蛋白和钙联蛋白)以及在腔面上与蛋白质二硫键异构酶(PDI)和寡糖基转移酶紧密缔合。在增长的新生多肽被排出到ER腔内之后，信号肽由被称作信号肽酶的酶从蛋白质前体中切割，从而将成熟的蛋白质释放到ER中。在翻译后修饰、正确折叠以及多聚化之后，蛋白质离开ER并且迁移到高尔基体中，然后到分泌泡囊中。分泌泡囊与质膜融合，将泡囊的内容物释放到细胞外环境中。

值得注意的是，分泌的蛋白质已经演变而具有非常适用于它们自身易位穿过细胞膜的特定的信号序列。作为不同的信号肽存在的各种序列可能以独特的方式与分泌细胞器相互作用。信号序列在性质上主要是疏水性的，这是可能涉及将新生肽导向分泌蛋白的一种特征。除了疏水性氨基酸段之外，许多共同序列特征由大部分的哺乳动物分泌信号所共有。不同的信号肽在它们引导异源蛋白质的分泌的效率方面有所不同，但是已经鉴定出多种分泌信号肽(即白细胞介素信号序列、免疫球蛋白信号序列、组织相容性受体信号序列等的那些)，所述分泌信号肽可以用于引导异源重组蛋白的分泌。尽管具有相似性，但是这些序列对于促进难以表达的一些蛋白质的高效分泌来说不是最佳的，这是因为天然信号肽在天然背景以外可能无法正确地起作用，或因为与宿主细胞或分泌过程相关的差异。对于异源蛋白质的高效分泌适当的信号序列的选择可能因切割的信号肽内的序列与成熟蛋白的其它部分的相互作用而进一步复杂化(Johansson,Nilsson等,1993)。

重组途径

重组途径也被称为DNA重组途径，是如下的细胞途径，所述细胞途径产生DNA损伤修复，如在染色体双链断裂之后DNA分子末端的连接；以及在染色体DNA分子与非染色体DNA分子之间DNA序列的交换或融合，例如像在淋巴细胞中在免疫球蛋白基因减数分裂或重排时染色体的互换。三种主要的重组途径是同源重组途径(HR)、非同源末端连接途径(NHEJ)以及微同源介导的末端连接(MMEJ)和替代性末端连接(Alt-EJ)途径。

同源重组(HR)、非同源末端连接(NHEJ)以及微同源介导的末端连接(MMEJ)的机制

转基因使用重组机制以在双链断裂时整合到宿主基因组中。

双链断裂(DSB)是生物学上最有害的类型的基因组损伤，会潜在地导致细胞死亡或多种多样的基因重排。准确的修复对于遗传信息的成功维持和传递来说是必要的。

存在两种主要的DSB修复机制：非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)。第三种机制被称作微同源介导的末端连接(MMEJ)，常常在两种主要的DSB修复机制无效时起作用。同源重组是共有同源性的DNA序列之间基因交换的过程，并且主要在细胞周期的S/G2期的期间起作用，而NHEJ通常在不存在序列同源性的情况下将两个断裂的DNA末端简单地拼在一起，并且它在细胞周期的所有阶段内均起作用，但是在有丝分裂细胞的G0-G1期和早期S期的期间具有特别的重要性(Wong和Capecchi,1985；Delacote和Lopez,2008)。在脊椎动物中，HR、NHEJ以及MMEJ差异性地促成DSB修复，这取决于DSB的性质以及细胞周期的阶段(Takata等,1998)。

NHEJ：基本机制

在概念上，NHEJ过程的分子机制似乎是简单的：1)一组酶捕捉断裂的DNA分子；2)形成使这两个DNA末端汇聚在一起的分子桥；以及3)使断裂的分子重新连接。为了进行这些反应，哺乳动物细胞中的NHEJ机制涉及两种蛋白质复合体，即异二聚体Ku80/Ku70与DNA-PKcs(DNA依赖性蛋白激酶的催化亚基)的缔合体以及DNA连接酶IV与它的辅因子XRCC4(X射线互补中国仓鼠基因4)以及许多蛋白因子(如Artemis和XLF(XRCC4样因子；或Cernunnos))的缔合体(等,2002)。NHEJ经常被认为是易错DSB修复，这是因为它通常在不存在序列同源性的情况下将两个断裂的DNA末端简单地拼在一起并且它产生小的插入和缺失(Moore和Haber,1996；Wilson等,1999)。NHEJ提供了在整个细胞周期的期间进行DSB修复的机制，但是在有丝分裂细胞的G0-G1期和早期S期的期间具有特别的重要性(Takata等,1998；Delacote和Lopez,2008)。在从细菌到哺乳动物的生物体中观测到通过NHEJ进行的DSB修复，这表示它在进化过程中是被保留的。

在DSB形成之后，NHEJ修复途径中的关键步骤是断裂DNA末端的物理并置。NHEJ是通过Ku70/80异二聚体蛋白质复合体与断裂DNA分子的两个末端缔合以将所述末端捕捉、拴系在一起并且产生用于其它NHEJ关键因子组装的支架而引发。与DNA结合的Ku异二聚体复合体向DSB处招募DNA-PKcs(属于PIKK(磷酸肌醇3-激酶样蛋白激酶家族)的460kDa蛋白质)(Gottlieb和Jackson,1993)并且激活它的丝氨酸/苏氨酸激酶功能(Yaneva等,1997)。两个DNA-PKcs分子跨DSB共同相互作用，从而在两个断裂的DNA末端之间形成分子桥并且抑制它们降解(DeFazio等,2002)。然后，DNA末端可以直接连接，尽管由DSB产生的大部分末端在连接之前必须经过正确的加工(Nikjoo等,1998)。取决于断裂的性质，可能需要加工酶的不同组合的作用以通过填充缺口而产生相容的突出端，从而去除断裂周围的受损DNA或二级结构。NHEJ过程中的这个步骤被认为会造成与NHEJ修复相关的偶尔核苷酸缺失。哺乳动物NHEJ中的一种关键的末端加工酶是Artemis，它是酶的金属-β-内酰胺酶超家族的成员，作为大部分放射敏感性严重联合免疫缺陷(SCID)患者的突变基因而被发现(Moshous等,2001)。Artemis具有5'→3'核酸外切酶活性和针对含有ds-ss转变和DNA发夹结构的DNA的DNA-PKcs依赖性核酸内切酶活性这两者(Ma等,2002)。它的活性还受ATM调节。因此，Artemis似乎有可能涉及多种DNA损伤反应。然而，只有一个子集的DNA损伤似乎由Artemis修复，这是因为在缺少Artemis的细胞中没有观测到DSB修复的主要缺陷(Wang等,2005；Darroudi等,2007)。

DNA缺口必须被填充以使得能够进行修复。向DSB添加核苷酸限于聚合酶μ和λ(Lee等,2004；Capp等,2007)。通过与XRCC4相互作用，多核苷酸激酶(PNK)也被招募到DNA末端以容许DNA聚合和连接(Koch等,2004)。最终，NHEJ通过连接DNA末端而完成，该步骤是通过含有XRCC4、DNA连接酶IV以及XLF的复合体进行的(Grawunder等,1997)。其它连接酶可以部分地取代DNA连接酶IV，这是因为NHEJ可以在不存在XRCC4和连接酶IV的情况下发生(Yan等,2008)。此外，研究证实XRCC4和连接酶IV不具有NHEJ以外的作用，而相比之下，KU在其它过程中起作用，如转录、细胞凋亡以及对微环境的反应(Monferran等,2004；Müller等,2005；Downs和Jackson,2004)。

可以不同的方式使NHEJ减少或停止，这些方式中有许多直接影响上文所提到的蛋白质(例如异二聚体Ku80/Ku70、DNA-PKcs，但特别是DNA连接酶IV、XRCC4、Artemis以及XLF(XRCC4样因子；或Cernunnos)、PIKK(磷酸肌醇3-激酶样蛋白激酶家族)。

HR：基本机制

同源重组(HR)是一种非常准确的修复机制。同源的染色单体用作模板以修复断裂的链。HR在细胞周期的S期和G2期的期间，在可获得姐妹染色单体时发生。经典的HR的特征主要在于以下三个步骤：1)断裂末端的5'端的切除；2)同源DNA双链体的链侵入以及交换；以及3)重组中间体的拆分。不同的途径可以完成DSB修复，这取决于进行链侵入的能力，并且包括合成依赖性链退火(SDSA)途径、经典双链断裂修复(DSBR)(Szostak等,1983)、断裂诱导复制(BIR)、以及可替代地，单链退火(SSA)途径。所有HR机制是相互关联的并且共有许多酶促步骤。

所有HR反应的第一步骤对应于通过核酸酶借助于MRN复合体(MRE11、RAD50、NBN(先前的NBS1，对于奈梅亨断裂综合征1(Nijmegenbreakagesyndrome1)))和CtIP(CtBP相互作用蛋白)将5'末端断裂的DNA链切除(Sun等,1991；White和Haber,1990)。所引起的3'单链DSB的产生能够寻找同源序列。同源双链体的侵入是通过核丝进行的，所述核丝由包覆有RAD51重组酶蛋白质的3'ss-DNA构成(Benson等,1994)。对参与真核细胞中与ssDNA相关的DNA代谢过程(Wold,1997)的复制蛋白A(RPA)(一种异三聚体ssDNA结合蛋白)的需要是为RAD51丝的组装所需的(Song和sung,2000)。然后，RAD51与RAD52相互作用，所述RAD52具有环形结构(Shen等,1996)以置换RPA分子并且有助于RAD51加载(Song和sung,2000)。Rad52对于酵母中的重组过程是重要的(Symington,2002)。然而，在脊椎动物中，BRCA2(2型乳腺癌易感蛋白)而非RAD52似乎在链侵入和交换中起重要作用(Davies和Pellegrini,2007；Esashi等,2007)。通过结合RAD54使RAD51/RAD52相互作用稳定。RAD54还在D环形成后重组中间体的成熟中起作用(Bugreev等,2007)。另一方面，BRCA1(乳腺癌1)与BARD1(BRCA1相关环状结构域1)和BACH1(BTB和CNC同源性1)相互作用以分别发挥连接酶和解旋酶DSB修复活性(Greenberg等,2006)。BRCA1还以CDK依赖性方式与CtIP相互作用并且响应于DNA损伤进行泛素化(Limbo等,2007)。因此，BRCA1、CtIP以及MRN复合体在细胞周期的S期和G2期中HR介导的DNA修复的激活中起作用。

核丝的侵入引起被称作置换环(D环)的异源双链体的形成并且涉及双链体的一条链被侵入性链置换并且与另一条链配对。然后，多种HR途径可以使用同源序列作为模板以置换DSB周围的序列来完成修复。取决于所使用的机制，同源模板与断裂DNA分子之间的相互交换(互换)可能与HR修复有关或可能与HR修复无关。互换可以具有重要的遗传后果，如基因组重排或杂合性缺失。

五种Rad51旁系同源物也涉及同源重组：Xrcc2、Xrcc3、Rad51B、Rad51C、Rad51D(Suwaki等,2011)。Rad51旁系同源物形成两种类型的复合体：被称作BCDX2的一种包含Rad51B、Rad51C、Rad51D以及Xrcc2；另一种含有Rad51C和Xrcc3(CX3)(Masson等,2001)。第一种复合体已经被提出参与Rad51-DNA复合体的形成和/或稳定化(Masson等,2001)。第二种复合体的作用似乎是分支迁移以及霍利迪交叉(Hollidayjunction)的拆分(Liu等,2007)。

如先前所报道，使HR相对于NHEJ增加(参见美国专利公开20120231449，以引用的方式整体并入本文)可以用于增强和/或促进转基因表达。

本发明集中在减少或停止HR。可以不同的方式使HR减少或停止，这些方式中有许多直接影响上文所提到的蛋白质(例如以下蛋白质：MRN复合体(MRE11、RAD50、NBN(先前的NBS1，对于奈梅亨断裂综合征1))以及CtIP(CtBP相互作用蛋白)、RAD51、复制蛋白A(RPA)、Rad52、BRCA2(2型乳腺癌易感蛋白)、RAD54、BRCA1(乳腺癌1)与BARD1(BRCA1相关环状结构域1)、BACH1(BTB和CNC同源性1)相互作用)。本发明集中在产生RNA，如siRNA以实现这个目标。

微同源介导的末端连接(MMEJ)

当其它重组途径无效或没有活性时，DSB可以通过被称作微同源介导的末端连接(MMEJ)的另一种易错修复机制来修复。这种途径仍需要被充分表征并且有时也被称为替代性末端连接(alt-EJ)，尽管尚不明确这两个过程是否基于相同的机制。这种途径的使它与NHEJ相区分的最具特色的特征在于在断裂的DNA链对齐期间使用5bp-25bp的微同源(McVey和Lee,2008)。

MMEJ可以在细胞周期的任何时间发生并且不依赖于核心NHEJ和HR因子，即Ku70、连接酶IV以及Rad52基因(Boboila等,2010；Yu和McVey,2010；Lee和Lee,2007；Ma等,2003)。相反，MMEJ的开始依赖于它自身的一组蛋白质，最重要的蛋白质是包含Mre11、Rad50以及Nbs1(酵母中的Xrs2)的MRN复合体(酵母中的MRX)的组分，所述MRN复合体也牵涉到HR的第一步骤(Ma等,2003)。除MRN复合体之外，许多其它因子已经被提出参与MMEJ，例如CTBP相互作用蛋白(CtIP；Yun和Hiom,2009)、多聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP1)、连接酶III/Xrcc1复合体、连接酶I(Audebert等,2004)、DNA聚合酶θ(Yu和McVey,2010)、以及ERCC1/XPF复合体(Ma等,2003)。然而，还有很多的蛋白质参与这个过程。

已经表明的是，在不存在其它DNA末端结合蛋白(如Ku或Rad51)的情况下，DSB由PARP1识别，所述PARP1然后引发它们经由MMEJ的修复(McVey和Lee,2008)。修复过程类似于HR，开始于5'端至3'端的切除，从而暴露断裂的每一侧上具有同源性的短区域。这个加工步骤是通过MRN复合体进行的并且由CtIP调节(Mladenov和Iliakis,2011)。互补区(存在于3'ssDNA片段中)配对在一起并且非互补段(侧翼)可能由ERCC1/XPF复合体去除(Yu和McVey,2010)。缺口(如果有的话)然后由聚合酶(例如DNA聚合酶θ或δ(Yu和McVey,2010；Lee和Lee,2007))填充并且断裂由连接酶I或连接酶III/Xrcc1复合体连接。

在DNA末端处不存在临近的微同源区的情况下(这是最常见的情况)，所修复的分子的更远处的片段可以使用准确的DNA聚合酶(例如聚合酶θ)拷贝。这个复制区然后参与DNA末端的对齐，从而在所产生的交叉处引起插入。微同源介导的修复的这种更复杂的变体已经被称作合成依赖性MMEJ(SD-MMEJ)(Yu和McVey,2010)。

尽管MMEJ被认为充当替代性重组修复途径，但是它已经被证实在B淋巴细胞中的IgH类别转换重组的过程中是非常高效的(Boboila等,2010)，这表明它可能不仅仅是一种备用机制。还可能的是，一些DSB，例如不相容的突出端或平端(它们是不良的NHEJ和/或HR靶标)可能由MMEJ更有效地修复(Zhang和Paull,2005)。

表D列出了这三种途径中的每一种中的一些关键基因，这些关键基因因此也是影响这三种途径中的每一种的关键靶标(还参见美国专利公开20120231449，以引用的方式整体并入本文)。在该表中还包括DNA修复蛋白，如MDC1和MHS2。需要MDC1响应于DNA损伤激活S期内和G2/M期细胞周期检验点。然而，MDC1还在Rad51介导的同源重组中通过将Rad51保留在染色质中而起作用。

“敲落”在本发明的上下文中表示使靶基因的表达减少诸如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。完全敲落意指靶基因不再存在可检测出的表达。表D还示出了使用某些敲落的靶标所获得的结果。如本领域技术人员将了解的是，在靶标的核酸序列中存在变异，因此基因的变体，特别是表现出80％、90％或95％的序列同一性的变体是本发明的一部分。

蛋白质加工和代谢蛋白

可以用于细胞代谢工程化的这类蛋白质既不属于蛋白质分泌途径，也不属于重组途径，但是以其它方式影响为表达细胞所固有的过程。

蛋白质加工或代谢蛋白常常是酶，诸如伴侣蛋白(参见上述伴侣蛋白的定义)、蛋白质异构酶、糖加成酶(例如唾液酸转移酶或糖基转移酶)或磷酸酶，或控制细胞能量水平或线粒体功能。

表A在副标题“蛋白质加工和代谢蛋白”下阐述了已经表达(exp)和/或表达已经被“敲落”(KD)的蛋白质的列表。

载体设计

在非病毒载体当中，转座子是特别有吸引力的，这是因为它们能够将DNA序列的单拷贝以高频率整合到宿主基因组内的多个基因座处。据报道，不同于病毒载体，一些转座子不优先整合到靠近细胞基因处，并且因此，它们不太可能引入有害的突变。此外，转座子容易产生和处理，一般包含含有由反向重复序列侧接的运载DNA(cargoDNA)的转座子供体质粒以及表达转座酶的辅助质粒或mRNA。多种转座子系统被研发以在不干扰内源性转座子拷贝的情况下使DNA在多种细胞系中移动。举例来说，最初从甘蓝银纹夜蛾(cabbagelooper)分离的PiggyBac(PB)转座子有效地使运载DNA转座到多种哺乳动物细胞中。

表观遗传调节元件可以用于在质粒载体上被放置在转基因附近时保护运载DNA防止不必要的表观遗传效应。举例来说，被称作基质附着区(MAR)的元件被提出以提高运载DNA基因组整合和转录，同时防止异染色质沉默，如由强效的人类MAR1-68所举例说明。它们还可以充当绝缘子并且从而防止相邻细胞基因的激活。MAR元件因此已经被用于在质粒或病毒载体的背景下介导高度和持续的表达。

如本文所示，使用适当的载体设计，表观遗传调节因子，特别是MAR元件的有利特性可以与转座载体的那些组合。

本发明的转座子和基于转座子的载体可以用于细胞代谢工程化，例如以表达本文所述的不同的分泌途径的分泌蛋白。在需要多轮运载DNA引入时，它们也是特别有用的。这在测试细胞分泌途径的多种蛋白质时被确认，其中多种载体的转染和/或多个连续的转染循环可以排除可供使用的抗生素或其它选择方法。在不需要抗生素选择的情况下使治疗性蛋白质快速表达的能力也是特别令人感兴趣的，例如在必须表达多种治疗性蛋白质候选者以实现筛选目的时，这是因为可以在转染后的2-3周时从未经过选择的细胞群体获得显著量的蛋白质。具体来说，含有MAR的转座子载体因此是当前可供使用的表达载体库的一种有前途的新增物。

所选择的实验方法允许(与依赖于基于抗生素的测定的方法相反)在基于(1)运载DNA拷贝数的作用与基于(2)运载DNA表达水平的作用之间进行区分。

MAR1-68在位于PiggyBac转座子的ITR之间的中央时是特别高效的，这是因为它没有降低转座效率。MARX-29在转座子的边缘处也良好地起作用而不降低转座效率或表达。

有趣的是，转座基因的MAR介导的激活的程度在与自发的质粒整合的程度相比时降低。此外，在针对例如转基因拷贝进行归一化时，来自转座子的表达水平高于在不存在转座酶的情况下由质粒的自发整合所获得的表达水平。这种效应被观测到而与构建体的尺寸、MAR的存在或启动子强度无关。这在转座可能常常在如下的基因组基因座处发生的情况下将是预期的，所述基因组基因座例如由于开放的染色质结构可以在更大程度上由转座酶和转录因子接近而相对地容许进行表达。在这方面，先前的研究已经表明转座子可以优先地整合在基因内含子内、启动子处、或基因组基因座处而具有较低的沉默倾向，尽管这仍是有争议的问题。或者，如由自发的整合事件所引出的许多质粒拷贝在相同的基因组基因座处的共同整合可能引起异染色质的形成以及重复序列的沉默(MAR将对抗这种情况)，而单拷贝转座子整合可能不易出现这种染色质介导的沉默。此外，转座子在多个独立的基因组基因座处的整合使得有可能的是，至少一个拷贝落在有利的基因组环境中并且表达，而质粒整合被发现仅主要在一个基因组基因座处发生。

在与强启动子连接时，由含有MAR的转座子获得每个运载DNA(例如转基因/TER)最高的表达水平。惊人地发现可以由几个转座运载DNA拷贝，例如不超过20个、15个、10个或5个获得高表达水平。如果仍然可以获得高生产率，那么更少整合的例如运载DNA拷贝是有利的，这是因为它降低了在一个转基因中或在一个子集的转基因中点突变出现的概率，如由自发的诱变事件所引出。此外，转座酶介导的整合事件的诱变性低于涉及自发质粒整合的DNA修复和重组机制，所述自发的质粒整合可能产生不完全的或重排的转基因拷贝。

通过piggyBac(PB)转座子进行基因组整合的高效率在靶细胞的量有限时也是有利的，例如对于将治疗性基因以非病毒方式转移到原代干细胞中以产生用于例如基于细胞的疗法或再生医学的克隆群体来说。在这种背景下，来自几个转座运载DNA拷贝的生理性表达水平以及转座事件的频繁发生，从而避免了对抗生素选择的需要是有利的，这是因为使用抗生素抗性基因和/或不可靠的例如转基因表达可能会引发安全问题。

MAR纳入对转座效率的影响

由于抗生素抗性并不一定反映高效的转基因表达，因此使用由强GAPDH细胞启动子衍生物表达的绿色荧光蛋白(GFP)作为指标。为了测试将MAR元件添加到PB转座子中是否可能影响转座效率和转基因表达，以及为了评估MAR在构建体中的位置是否对这些效应有任何影响，设计一系列含有GFP和嘌呤霉素抗性(Puro)基因的转座子供体构建体，其中MAR1-68或对照中性间隔DNA序列被插入到质粒中的不同位置(图1)。没有插入物的亲本Puro-GFP转座子质粒用作转座的对照，以相对于MAR或间隔序列的添加的影响辨别增加的转座子尺寸的影响。

在转座酶存在下，在MAR位于中央时观测到未经过选择的细胞的最高水平的GFP表达，但是在MAR被放置在GFP编码序列下游时没有观测到，在MAR被插入到转座序列外侧时，如所预期也没有观测到(图3A)。在存在嘌呤霉素选择的情况下，在存在或不存在转座酶的情况下，MAR介导的激活减少，而GFP表达平均值增加了一个数量级(图3B)。这确认了嘌呤霉素选择仅产生少数表现出最高表达水平的细胞，如上文通过转座事件的定量所提出。还表明的是，含有位于中央的MAR的转座载体在与它们的在没有转座酶的情况下转染的质粒对应物相比时产生类似的表达水平。

MAR纳入对整合的转座子的拷贝数的影响

更高的GFP荧光水平可以由于转基因的转录增加和/或通过整合更多的转基因拷贝而产生。这是通过对由各种类型的载体产生的基因组整合的转基因拷贝数进行定量来评估。在从未经过选择的群体中对荧光细胞进行细胞荧光测定分选之后或在针对嘌呤霉素抗性进行选择之后，将总基因组DNA从汇集的细胞群体中分离。通过相对于细胞β2-微球蛋白(B2M)基因对GFP编码序列进行定量聚合酶链反应(qPCR)分析来确定转基因拷贝数。在不存在抗生素选择的情况下，由转座酶或由细胞重组酶整合的转基因的平均数目是相似的，每个基因组约1-6个拷贝，并且它们不受MAR或控制序列的显著影响(图4A)。然而，当在转座子边缘处包括MAR时获得最低的拷贝数，这支持了我们以前的结论，即它在这个位置上减少了转座。在使用嘌呤霉素对高表达细胞进行选择之后，转座转基因的数目在相似的2-7个拷贝范围内(图4B)。然而，在不存在转座酶的情况下所整合的转基因拷贝数一般显著更高，在6至14个拷贝的范围内。这可以容易地通过以下事实来解释：自发的整合通常引起多个质粒拷贝的串联体在单个基因组基因座处的整合(结果未示)，以及在已经通过抗生素选择去除了经受沉默效应的细胞时，更高的转基因拷贝数应当产生更高的表达水平。综合以下先前的结论来看，这还表明自发的质粒整合与转座载体相比产生更可变的转基因拷贝数，所述先前的结论即抗生素选择优先地产生高表达细胞。

然后将GFP表达针对基因拷贝数归一化以独立于载体在基因组中整合的倾向对它们的固有表达潜能进行评估。总体而言，从在不存在转座酶或位于中央的MAR的情况下转染的未经过选择的细胞或经过抗生素选择的细胞获得每个转基因拷贝更低的表达，这表示转基因表达受表观遗传调节元件的纳入以及转基因整合的模式这两者影响(图5)。在通过各种载体和元件的组合进行评估时，每个基因拷贝的表达一般由转座酶增加，并且这在存在或不存在抗生素选择的情况下被观测到。在对使用含有位于中央的MAR元件的转座子载体并且在转座酶存在下产生的细胞进行抗生素选择之后获得每个转基因拷贝最高的表达水平。将MAR包括在紧靠GFP编码序列的下游处没有显著地提高转基因表达，如之前对于绝对表达水平所指出。

最终，评估MAR1-68对表达的有利作用是否可能是在此所使用的强人类GAPDH启动子所特有的，或它是否也将在其它启动子的情况下出现。因此，我们将驱动GFP表达的人类GAPDH启动子替换为更弱的猿猴病毒40(SV40)早期启动子。使用更弱的启动子产生了相当数目的GFP阳性细胞和整合的转基因，这表示转座效率没有由转基因表达而改变(结果未示以及图2A和图4B)。然而，在SV40启动子的情况下，绝对表达水平更低，(未示对比图3B)。此外，通过使用SV40启动子，在不存在MAR的情况下使针对转座子拷贝数归一化的表达减少到1/4.6，并且在存在MAR1-68的情况下使针对转座子拷贝数归一化的表达减少到1/3.1(结果未示)。这表示即使在转座酶存在下，MAR可以部分地，而不是完全地防止由于使用更弱的启动子而引起的表达减少。总体而言，可以证实的是，几个整合的拷贝足以从转座子获得高转基因表达，以及当在这种背景下，MAR-68被放置在强启动子上游时获得每个转基因最高的表达。

以含有单个转基因MARX_29的转座载体将CHO-M细胞电穿孔一次或两次。在电穿孔之后转座效率最高(30％-45％的细胞显示出稳定表达)。然而，转基因表达水平类似于化学转染，所述化学转染显示出更低的阳性细胞，因此更低的转座效率。图7示出了被插入到MARX_29上游的治疗性免疫球蛋白的轻链和重链的结果并且获得了在1至8μg/ml范围内的标题物。通过分选表达细胞使水平进一步增加到23-55μg/ml(图7C)。

转基因的表达还可以常常独立于使用转座子，通过特定的载体设计，特别是通过在相对于转基因特定的位置处使用一个或多个特定的MAR元件，并且优选地这一个或多个MAR元件与启动子、增强子或其融合体的组合而显著增加。

对应的载体可以含有侧接转基因表达盒的MAR。举例来说，所述载体可以含有例如上游MAR(一个或多个)和下游MAR(一个或多个)，例如相对于转基因表达盒被定位在上游的一个MAR以及被定位在下游的一个MAR(图18A、图18B、图19)。所述载体可以含有在SV40启动子控制下的整合的嘌呤霉素抗性基因。转基因可以在与人类巨细胞病毒(CMV)即刻早期基因增强子融合的人类GAPDH启动子(特别是如上文所述的CGAPD融合启动子)的控制下。

如对于GFP荧光(通过FACS分析)和最小变异性所评估，使用1_6R2、1_68R2以及X_29R3作为上游MAR可以获得高产细胞和非常高产细胞的最高百分位数(M3/M2％)(超过80％、80％以及超过80％)。因此，大于70％、大于75％、或大于80％的高产细胞和非常高产细胞的百分位数(M3/M2％)完全在本发明的范围内。如本领域技术人员将理解的是，由这些MAR的具体序列所致的一定的偏差是允许的。因此，含有与SEQIDNo:6、7、8、9以及10具有大于80％、85％、90％、95％序列同一性的核酸序列的载体在本发明的范围内(图18A、图18B)。

在生物反应器中和/或在不存在选择压力的情况下表达的损失往往限制了所关注的蛋白质的回收率。在没有进行选择的情况下培养5周的时间内测试含有1_68R2、1_6R2以及X_29R3MAR衍生物作为上游MAR的载体，并且在这段时间内每周评估GFP荧光。当考虑M3亚群的百分位数时，发现作为上游MAR的1_6R2元件和作为下游MAR的未重排的MAR1-68是具有至少一个上游MAR和一个下游MAR，即两个MAR的载体中最好的测试组合(在超过2周、3周、4周之后远高于80％)(参见图19)。

类似设计的载体还可以含有例如只是位于下游的MAR(一个或多个)，例如被定位在转基因表达盒下游的一个MAR(图20A、20B、21以及22)而没有上游MAR。所述载体在这种情况下还可以含有在SV40启动子控制下的整合的嘌呤霉素抗性基因。转基因可以在与人类巨细胞病毒(CMV)即刻早期基因增强子融合的人类GAPDH启动子的控制下。参见例如SEQIDNO:11以及具有超过80％、85％、90％或95％的序列同一性的其它序列。在使用X_29作为MAR的这种单MAR构象中实现优异的结果。高GFP表达细胞的百分位数(如上述所测定)以及表达随时间推移的稳定性(如上述所测定)优于例如其中MAR侧接转基因表达盒的高性能载体，即包含上游的MAR1_6R2和下游的未重排MAR1-68的载体(参见图22)。这一研究结果与以下公认的假设形成对比，即MAR在它们侧接转基因时是最有效的(参见美国专利5,731,178)。表达的稳定性意指即使在一定时间段之后，例如在超过4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周或14周之后，所关注的DNA，例如转基因仍由细胞群体以与在开始表达的最多两周时相当(少了不超过20％、10％或5％)以及特别是甚至更高的速率表达。往往，稳定的表达与细胞的高百分位数(例如超过80％)或高表达亚群有关。

细胞代谢工程化：分泌蛋白

诸如IgG的异源蛋白质的分泌因诸如CHO细胞的培养细胞中不正确的多肽加工和低IgG产生而减少。

观测到应激诱导的伴侣蛋白(如BiP)的表达被诱导以及伴侣蛋白准确地定位在ER中并且能够与IgG前体链相互作用。然而，含有特定的可变序列(如英夫利昔单抗中存在的那些)的IgG仍然被不正确地加工和组装，这导致不良的分泌。因此，在这些细胞中UPR反应的激活在解救显著水平的免疫球蛋白方面仍是无效的。

SRP14被证实牵涉到过表达外源蛋白质的CHO细胞中的分泌途径的具有限制性的分子步骤。有趣的是，这个限制性步骤对于容易产生高表达子克隆的容易表达的曲妥珠单抗来说也存在。在该发现后得出这个结论，即人类SRP14的表达容易恢复LP克隆的表达，但是它也提高了容易表达的IgG的分泌。发现SRP14表达使LC前体和HC前体的加工和利用率增加并且对于这两种类型的IgG产生相当的分泌水平。总体而言，证实了当诸如IgG的分泌蛋白在CHO细胞中过表达时，SRP14一般可能具有限制性。

如在这个研究中所观测到的在CHO细胞中由SRP14的表达所获得的强烈作用是意想不到的并且表明SRP14在难以产生的IgG产生克隆中引起LC延伸的长时间延迟(图12B，点1)。

先前的研究表明自翻译核糖体出现的信号肽首先与SRP颗粒的SRP54亚基相互作用，而与SRP9和SRP14的缔合可以阻止新生多肽的进一步延伸，从而引起翻译停滞(Walter和Blobel1981)。在第二步骤中，核糖体-新生多肽-SRP复合体经由它与SR受体的相互作用停靠到ER膜(Gilmore等,1982；Walter等,1982)。SR然后可以协调SRP从核糖体-新生多肽复合体的释放以及核糖体的退出位点与易位子通道的缔合，经由所述易位子通道，增长的新生多肽进入ER(Lakkaraju等,2008)。然后，翻译偶联易位可以重新开始，从而引起信号肽的去除以及正确加工的和分泌的多肽的合成。

如果IgG可变域和信号肽序列的特定组合停靠到ER上的动力学由于新生肽的不利结构而可能是更慢的，那么难表达的IgG的正确加工可能需要特别长的翻译暂停。因此，通过表达外源人类SRP14组分来调节翻译停滞动力学被认为进而提高了正确的ER停靠以及LC前体的易位，并且因此恢复了对信号肽的高效加工(图12B，点2)。始终如一地，降低人类细胞中SRP14的水平会导致在多聚核糖体中缺少翻译延伸延迟，这可能会导致新生多肽过度延伸超过临界长度，之后SRP可能不再使分泌蛋白正确地定位到ER。因此，CHO细胞的SRP14以及有可能SRP54将对异源人类英夫利昔单抗蛋白质的信号序列具有降低的亲和力，从而导致不正确的ER停靠和/或新生肽在已经发生正确的停靠之前进行延伸。这将通过过表达人类SRP14来纠正，所述过表达延长了停滞的核糖体-SRP复合体可以寻找ER上正确组织的停靠位点的时间段，尽管在ER门处存在过表达的IgG蛋白质的‘分子拥堵(molecularjam)’。

始终如一地，SR和易位子的过表达可以在易位方面提高ER的能力，还会甚至在不存在人类SRP14过表达的情况下引起分泌的提高。最终，证实通过人类SRP、易位子以及SR亚基的组合的共表达对分泌途径进行代谢工程化使得蛋白质分泌细胞能力进一步提高，从而产生甚至更高的分泌水平。总体而言，得出的结论是在诸如人类免疫球蛋白的分泌蛋白由CHO细胞过表达时，SRP蛋白、它的受体以及易位子一般可能具有限制性。

关于在不同的细胞类型中SRP和ER膜组分相对于分泌蛋白和核糖体的丰度知之甚少，但是可以设想在表达高量的重组蛋白的细胞中出现易位缺陷。举例来说，在分泌蛋白以异常高的水平表达或SRP14在CHO细胞中相对于其它SRP亚基可能以亚化学计量水平存在时，SR和/或易位子可以变得具有限制性。始终如一地，SRP9和SRP14在灵长类动物细胞中存在的量是其它SRP蛋白的20倍，但是在小鼠细胞中不是这样，并且在正常的人类细胞中人类SRP14的过表达没有提高碱性磷酸酶的分泌效率。此外，人类SRP14大于它的啮齿动物对应物，这是因为它在它的C末端处含有富含丙氨酸的尾区，所述尾区不存在于啮齿动物SRP14中。因此，将更大的人类SRP14并入到CHOSRP中可能以主要积极的作用引起具有更高活性的功能性SRP嵌合体的形成。

以下的研究结果针对可以用于提高重组蛋白产量的瓶颈，所述研究结果即在CHO细胞中诸如SRP14的胞质SRP组分的表达引起过表达的蛋白质的高效加工和分泌。这个瓶颈限制了不同的和无关的IgG，以及有可能多种其它单克隆抗体和衍生物的表达，这些到目前为止构成了最丰富类别的重组治疗性蛋白质。

对分泌中间体以及可能的细胞应激反应进行分析，继而系统搜索导致这种应激反应的上游限制活性，然后以对CHO细胞分泌代谢进行工程化而告终，已经使得更好地了解这些细胞的代谢限制以及如何解决它们。

SRP14的异源表达恢复了分泌和LC加工

将IgG的HP(高产)和LP(低产)克隆用编码SRP的SRP14组分的载体和新霉素抗性质粒共转染。通过有限稀释将新霉素抗性池中的单个细胞分离并且随后在振荡培养皿批料中测试生长和免疫球蛋白分泌。表达SRP14的LP衍生的亚克隆在整个培养期间比它们的亲本对应物分泌显著更高的抗体量，并且它们产生与表达SRP14的HP亚克隆相似的免疫球蛋白滴度(图8A和8B，左图)。

SRP14的表达没有影响细胞活力，但是它似乎减慢并且延长了HP细胞培养物生长到相似的细胞密度(图8A和8B，右图)。收集各种亚克隆的培养上清液并且分析抗体浓度。如图8C中所示，SRP14表达增强了LP细胞的分泌，从而使得IgG单位生产率增加到7倍。此外，SRP14的外源性表达还提高了HP亚克隆的IgG分泌，从而使得单位生产率增加了30％。有趣的是，表达SRP14的单个亚克隆以基本上相同的平均速率分泌难表达的IgG和容易表达的IgG，其中中值单位生产率超过每天每个细胞30皮克(pcd)。在培养超过6个月内维持了这些非常高的IgG分泌水平，这表明它是表达SRP14的细胞的稳定特性。

为了进一步研究SRP14表达与IgG生产率之间的关系，通过相对定量PCR分析5种单个表达SRP14的LP亚克隆的SRP14mRNA水平。如图8D中所示，亚克隆过表达SRP14，所述过表达的水平在内源性CHO细胞SRP14mRNA的水平的50倍到差不多200倍的范围内。这伴有IgG的分泌与LP对照细胞克隆相比增强到4倍至6倍。有趣的是，从以中间水平过表达SRP14的亚克隆获得最高的单位生产率，所述中间水平是CHO细胞内源性SRP14mRNA的约100倍(SRP14-LP亚克隆E，未示)。这表示SRP14过表达的水平与IgG单位生产率具有相互依赖性直到对应于增加到内源性表达水平的100倍的SRP14的阈值水平。这表明分泌途径的其它组分可能在非常高的SRP14水平下进而变得具有限制性，以及途径组分的平衡表达可能是为最佳的IgG表达所需的。

为了测试在克隆细胞系评价期间所获得的增加的单位生产率是否可以应用于生产工艺，在振荡培养皿中在补料分批条件下测试最好的表达SRP14的HP亚克隆和LP亚克隆(即图8的LP亚克隆E和HP亚克隆B)。表达SRP14的LP亚克隆与表达SRP14的HP亚克隆相比产生相似高数目的活细胞和免疫球蛋白滴度，其中在生产运行结束时最大值是8×10⁶个细胞/毫升和高于2克/升(图9A和B)。

随后测试这两种亚克隆的SRP14过表达对免疫球蛋白合成的影响。这揭示了在LP衍生的亚克隆中人类SRP14的表达产生有折叠和IgG组装能力的被正常加工的和成熟的LC(图10A，LP泳道S对比泳道-)。游离HC的迁移不受影响，这表明SRP14表达特异性地作用于难表达的蛋白质的被错误加工的LC。惊人的是，SRP14表达完全消除了TritonX不溶性级分中聚集的LC的积聚(图9A，底图)。对照GFP蛋白的表达没有提高蛋白质溶解度，它也没有恢复对LC的正确加工(图10A，LP细胞的泳道G)。SRP14的表达对从HP亚克隆获得的HC和LC迁移模式没有影响，并且观测到在与对照相比时对游离链和完全组装的IgG的量有很小的影响(图10A，HP细胞的泳道G)。

进行基于放线菌酮(cycloheximide)的追踪测定以研究在表达SRP14的英夫利昔单抗产生亚克隆中IgG的折叠和组装动力学以及IgG聚集体的命运。与表现出无IgG组装能力的聚集的LC的亲本LP细胞对比，表达SRP14的LP亚克隆不再积聚有Tx-100不溶性LC(图9B，底图)。然而，相对于游离HC，游离LC仍以少量残留，对于HP细胞也注意到这种情况，这表明它被快速地并入HC-LC二聚体和成熟IgG中以及它可以限制IgG组装(图9A和9B)。总的来说，这些结果表示SRP14可能在LP细胞的LC加工中起必要的作用，以及额外的SRP蛋白表达可以将难表达的IgG和容易表达的IgG的分泌提高到相似的水平。

ER易位的工程化提高了重组IgG分泌

鉴于异源SRP14的过表达使IgG分泌增加直到给定的阈值，它的理由是，分泌途径的与SRP14直接或间接相互作用的其它组分在SRP14-LP亚克隆中可能变得具有限制性。我们因此研究分泌途径的其它组分单独或与SRP14的组合的过表达是否也可以提高IgG表达。这些包括连同SRP14一起构成SRP复合体的人类SRP9和SRP54蛋白质、以及SRP受体(SR)的亚基、以及易位子的Sec61α、β和γ亚基。

在第一组实验中，将表现最好的LP克隆，即图1的LP克隆E用单独的编码SRP蛋白或易位子蛋白质的表达载体或它们的组合转染。然后在分批培养中评价所得的LP多克隆细胞池的IgG产生。SRP组分或易位子蛋白质的表达使这些重新转染的LP多克隆细胞池的免疫球蛋白分泌增加(图11A并且数据未示)。与单独的SRP14表达相比，SRP蛋白组合或易位子的过表达使转染的LP多克隆细胞池的单位生产率提高了额外的20％至40％(图11A，中值的比较)。这些结果清楚地表明特定的组合比单独的SRP14表达对于恢复英夫利昔单抗的分泌来说更强效，诸如由三种SRP多肽和它的受体(SR)的表达，或SR和易位子的共表达组成的那些(图11A)。

还评估了表达SRP14的LP亚克隆E是否可以通过SR和/或易位子组合的表达来进一步优化。与SRP14-LP亚克隆E的30pcd相比，在使用SR蛋白质和易位子转染之后选择的多克隆细胞池产生高于60pcd的难表达的免疫球蛋白的单位生产率(图10B)。得出的结论是，还可以使用SR蛋白质和易位子表达载体来产生与SRP14-LP克隆E相比具有增加的单位生产率的克隆，以及可以成功地应用基于一系列连续转染和选择循环的方法。

细胞代谢工程化：重组途径的敲落以及TEP和TEP功能性RNA的表达

为了影响重组，可以使关键性的DNA重组基因沉默。用于敲落的靶标是从文献中获知对于哺乳动物中的特定重组修复途径来说关键性的基因(表D)。由于这些基因中的大部分为细胞存活和发育所需，因此它们的永久性沉默可能会引起细胞活力降低。因此，使用RNA干扰(RNAi)使这些靶基因瞬时沉默是优选的。

在经过针对涉及NHEJ的第一步骤的因子，即Ku70、Ku80以及DNA-PKcs的siRNA混合物(每种蛋白质一种siRNA双链体)处理的细胞中，NHEJ事件的频率显著低于未经过处理的细胞。相反，在这些细胞中，HR更高效，从而使得NHEJ与HR的比率降低(从2.7:1降低到1.3:1)。相反，在经过靶向必要的HR因子，即Rad51的siRNA处理的细胞中，HR依赖性GFP重建几乎完全被消除，这使得NHEJ:HR比率增加到5:1。这些结果似乎表明HR和NHEJ报告基因测定灵敏到足以在染色体外形式下使用。它们还进一步向先前使用的CHO突变型细胞系(特别是51D1细胞，最初作为HR阴性细胞被公开，但是根据这一测定似乎能够进行HR，数据未示)的可靠性提出异议。

在MAR存在下GFP表达和整合增加。在平行实验中，将经过不同的抗HRsiRNA或抗NHEJsiRNA处理的CHO细胞用含有GFP或MAR-GFP的质粒转染。在抗生素选择两周之后，分别通过FACS和qPCR测定细胞的GFP表达和整合。在所测试的所有条件下，MAR的添加使得GFP表达与经过没有MAR的质粒转染的细胞相比增加到4倍-5倍(图13、图14A)，这与先前的报道一致(Grandjean等,2011)。这一增加伴有经过MAR-GFP质粒转染的细胞中整合的GFP拷贝数与接受无MAR载体的细胞相比增加到约3倍(图13、图14B)。每个基因拷贝的平均GFP荧光也增加到2倍(图13、图14C)，这可能是因为整合位点的定位更有利(例如在富含常染色质的区域中)。因此，可以假设的是，MAR元件具有将基因引导到容许基因表达的基因组基因座的能力。抗HRsiRNA与MAR的组合(siRNA：RAD51、Rad51C以及Brca1)产生高于11倍的平均GFP表达的倍数变化，而单个抗HR-siRNA(siRNA：Rad51)产生低于9倍的倍数变化。其它组合，如siMMEJsiRNA与MAR的组合也相对于单个siRNA产生提高的表达(结果未示)。因此，针对相同或不同的代谢途径，特别是重组途径中的靶标的不同的siRNA(2种、3种、4种、5种、6种、8种、9种、10种)的组合在本发明的范围内。

NHEJ基因敲落对转基因表达和整合没有影响。使用针对NHEJ蛋白质的siRNA进行处理似乎没有显著地影响稳定的转基因表达。与未经过处理的细胞相比较，基因组中的GFP拷贝数也没有显著的变化(除了在经过抗53BP1siRNA处理的细胞中，但是只有在不存在MAR的情况下如此，可能指向不同于通过NHEJ途径进行的重组的效应)。

在不存在HR因子的情况下转基因表达和整合增加。与NHEJ因子的敲落对比，针对HR蛋白质的siRNA的存在往往使得稳定的GFP表达与未经过处理的细胞相比显著增加(除了Brca2，对于Brca2而言，出现显著的减少，但是同样只有在不存在MAR的情况下如此)(图15A)。正如使NHEJ基因沉默的情况那样，MAR的存在使得稳定的GFP表达和整合以及每个基因拷贝的表达增加。然而，这一次使HR因子沉默使这种作用增强到5倍至7倍(最显著的是Rad51的敲落，GFP表达水平达到7.4倍)(图15A)，这可以表明HR蛋白质抵消了MAR元件对转基因表达的积极的作用。在不存在MAR的情况下，GFP表达的增加与基因组中GFP拷贝数升高有关(结果未示)。惊人的是，在MAR存在下并非如此，这表明MAR介导的拷贝数增加不受HR蛋白质敲落的影响(除了Rad51DsiRNA)。这似乎表明功能性HR修复途径的不存在没有提高由MAR促进的重组事件的数目。相反，它可能刺激MAR和转基因在更有利的基因座中的整合，从而允许所述转基因的更高效的表达。这种观点也由在经过抗HRsiRNA处理的细胞中在MAR存在下单个GFP拷贝的表达升高所支持(图14C)。另一种可能性在于被整合到基因组中的质粒拷贝数已经处在它在对照细胞(具有在此所使用的量的质粒DNA)中的最大值并且即使在更有益于MAR的条件下也不能进一步增加。

综上所述，这些结果表明MAR介导的转基因整合的过程是优先地由与同源重组相对的途径所介导的，尽管有可能不是NHEJ，这是因为它的组分的敲落对整合或表达没有影响。可以假设的是，这种替代途径在功能性HR途径存在下不太具有活性，但是在HR无效的情况下，变得更为重要。

使抗HRshRNA表达以提高治疗性蛋白质的表达

将靶向Rad51的三种siRNA转化成可以形成发夹结构的shRNA序列，并且将shRNA编码序列插入piggyBac转座子载体中处在GAPDH增强子和CMV启动子融合体的控制下，并且之后是MARX-29，但是缺少抗生素选择基因。将悬浮适应的CHO-M细胞用转座子供体质粒和转座酶表达载体转染三次，之后使用ClonePix装置随机挑取30种单个细胞克隆。将亲本细胞以及表达shRNA的细胞池和克隆用GFP表达质粒(即Puro-GFP-MARX_29构建体)重新转染，继而对表达GFP的细胞的多克隆池进行嘌呤霉素选择。GFP荧光谱的比较表明与亲本CHO-M细胞相比，从经过shRNA载体转染的细胞池获得更高比例的中到高荧光细胞(M2细胞群体)或非常高荧光细胞(M3细胞群体)(图17A)

多种表达shRNA的克隆介导非常高的GFP水平，其中在转染后10天时超过80％的抗生素抗性细胞在高荧光M3亚群中，如由克隆16和克隆26所举例说明(图17A和B)。在没有进行选择的情况下进一步培养35天之后在这两种克隆中维持高水平的GFP荧光(图17C)。相比之下，克隆17在第10天时没有表达非常高水平的GFP，并且GFP表达似乎不稳定(图17B和C)。从克隆8和克隆22获得中等表达水平和稳定性。还将这些克隆用编码难表达的英夫利昔单抗治疗性抗体的轻链和重链的表达质粒转染。如之前那样，克隆16和克隆26产生最高水平的抗体，其次是克隆8和克隆22，而克隆17表达类似于从亲本CHO-M细胞获得的0.5pcd至1pcd的量的免疫球蛋白(图17D并且数据未示)。表现出最显著降低的Rad51mRNA水平的细胞克隆产生GFP和英夫利昔单抗免疫球蛋白这两者的高表达，这表明增加的转基因表达由重组蛋白的表达减少而产生(结果未示)。

因此，可以从表达靶向Rad51的shRNA的细胞或从由诸如靶向Rad51的siRNA等siRNA瞬时转染的细胞实现分泌的治疗性蛋白质(如英夫利昔单抗)的更高的并且更稳定的产生水平。

材料与方法

质粒和DNA载体

PB转座酶表达载体pCS2+U5V5PBU3含有由非洲爪蟾(Xenopuslaevis)β-球蛋白基因的5'端非翻译末端区域(UTR)和3'端非翻译末端区域围绕的PB转座酶编码序列。这种质粒是如下构建的：将来自pBSSK/SB10(由S.Ivics博士友情提供)的3'端UTR317bp片段插入pCS2+U5(英国佩斯利的英杰/生命科技公司(Invitrogen/LifeTechnologies,Paisley,UK))中以产生pCS2+U5U3。PB转座酶编码序列(2067bp，基因库登录号：EF587698)是由ATG生物合成公司(ATG:biosynthetic)(德国的梅尔茨豪森(Merzhausen,Germany))合成的并且克隆到pCS2+U5U3骨架中两个UTR之间。PB对照载体对应于未经过修饰的pCS2+U5质粒(图1，左图)。

这项研究中所使用的不同的转座子载体是通过将由ATG生物合成公司(德国的梅尔茨豪森)合成的PB235bp3'端反向末端重复序列(ITR)和310bp5'端反向末端重复序列引入到pBluescriptSK-质粒中而产生的(pBSKITR3'-ITR5'；图1，右图)。然后将来自pRc/RSV质粒(英杰/生命科技公司)的在SV40启动子控制下的嘌呤霉素抗性基因(Puro^R)插入到这两个ITR之间。在这项研究中所使用的MAR1-68和MARX-29元件、嘌呤霉素抗性基因以及GFP基因如先前所述。免疫球蛋白表达载体以及SRP9、SRP14、SRP54、SRPRα、SRPRβ、SEC61A1、SEC61B和SEC61G编码序列如LeFourn等(Metab.Eng.,2013年2月1日电子出版)所述。

使用真核细胞表达盒表达GFP、免疫球蛋白或分泌蛋白，所述真核细胞表达盒由编码序列上游的人类CMV增强子和人类GAPDH启动子，编码序列后面的SV40多聚腺苷酸化信号、人类胃泌素终止子以及SV40增强子构成(参见LeFourn等,2013)。如图1和附图说明中所说明，使用标准克隆方法将表达盒和/或MAR元件插入ITR序列之间或细菌载体骨架中。

细胞培养和转染分析

将CHODG44细胞系培养在补充有次黄嘌呤/胸苷(HT，Gibco公司)和10％胎牛血清(FBS，Gibco公司)的DMEM:F12(Gibco公司)中。使用PEI(JetPRIME，PolyplusTransfection公司)，根据制造商的说明书进行转染。将细胞用各种量的PB转座酶的pDNA来源(在0ng至1500ng的范围内)进行转染以进行滴定实验或用最佳比率的300ngPB转座酶表达质粒和300ng转座子供体质粒共转染。在转染后的两天时，将细胞转移到若干个皮氏培养皿(Petridish)中，这取决于实验。为了分析未经过选择的转染过的CHO细胞，将细胞在不存在抗生素选择的情况下重新接种，持续3周并且通过使用CyAnADP流式细胞仪(贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter))进行FACS分析来测定荧光细胞的百分比和GFP阳性细胞的荧光强度。为了对未经过选择的细胞进行基因拷贝数分析，使用FACSAriaII分选稳定的GFP阳性CHO细胞。对于抗生素抗性集落计数测定，将50,000个转染的细胞接种到100mm培养板中并且使用5μg/ml嘌呤霉素选择2周。然后，将抗性集落固定并且在70％EtOH、0.7％亚甲蓝中染色10分钟，并且对直径>0.5mm的集落进行计数。对于GFP表达研究，在GFP荧光FACS分析之前，如上文所述，将细胞选择两周。

将CHO-M细胞在37℃、含5％CO₂的加湿空气下在补充有L-谷氨酰胺(奥地利的PAA公司(PAA,Austria))和HT补充剂(Gibco公司/英杰生命科学公司)的SFM4CHOHyclone无血清培养基(赛默科技公司(ThermoScientific))中维持悬浮培养。通过根据制造商的建议(Neon装置，英杰公司)进行电穿孔将转座子供体质粒转移到这些细胞中。如先前所述对分批培养物进行免疫球蛋白分泌的定量(参见LeFourn等,2013)。简单地说，在37℃下在5％CO₂加湿孵育箱中在50ml微型生物反应管(瑞士的TPP公司(TPP,Switzerland))中分批培养7天来评价表达免疫球蛋白的细胞群体。通过夹心ELISA测量细胞培养上清液中的免疫球蛋白浓度。

qPCR基因拷贝数测定

遵循转座测定，使用DNeasy组织试剂盒(德国希尔登的快而精公司(Qiagen,Hilden,Germany))根据制造商的方案将总DNA从CHO稳定细胞池中分离。使用6ng的基因组DNA，通过定量PCR，使用来自Eurogentec公司的SYBR绿色-Taq聚合酶试剂盒和ABIPrism7700PCR机(应用生物系统公司(AppliedBiosystems))来评估基因组整合的转基因的拷贝数。使用GFP正向引物：ACATTATGCCGGACAAAGCC和GFP反向引物：TTGTTTGGTAATGATCAGCAAGTTG来对GFP基因进行定量，而使用B2M正向引物：ACCACTCTGAAGGAGCCCA和B2M反向引物：GGAAGCTCTATCTGTGTCAA扩增β-2微球蛋白基因。对于由B2M引物产生的扩增子，在使用NCBIBLAST软件与我们的CHO基因组组装进行比对后每个CHO单倍体基因组发现一次命中。由于CHO是近二倍体细胞，因此据估计，B2M以每个基因组2个拷贝存在。相对于B2M参考基因计算GFP靶基因拷贝数的比率，如先前所述。

表达免疫球蛋白的细胞的分选和测定

为了对表达IgG的细胞进行磁力分选，将转染的CHO-M细胞在补充有8mML-谷氨酰胺和1×HT补充剂(均来自Gibco公司)的SFM4CHO培养基(赛默科技公司)(被称为完全培养基)中以每毫升3×10⁵个细胞的细胞密度接种。在培养4天之后，将2×10⁶个细胞洗涤，重悬于PBS中并且在室温下与3μg/ml的最终浓度的生物素化的人类IgG(KPL216-1006)连同30μl预先洗涤的MyOneT1涂有链霉抗生物素蛋白的Dynabead磁珠(英杰公司)一起在转轮上孵育30分钟。然后将细胞和珠粒的混合物放置到磁体上以分离标记的细胞与未标记的细胞。将珠粒用磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液洗涤4次。在最终的PBS洗涤之后，将珠粒和细胞重悬于500μl预先温热的完全培养基中，转移到24孔培养板中并且在37℃下在5％CO₂下孵育。在24小时之后，使磁力分选的多克隆细胞与珠粒分离并且在50mLTPP旋管式生物反应器(瑞士的TECHNO塑料制品公司(TECHNOPLASTICPRODUCTSAG,Switzerland))中继续孵育直到细胞具有足够的密度以进行扩增为止。

或者，使用ClonePix装置从表达这三种IgG中的每一种的未经过分选的并且未经过选择的群体中分离两种克隆。简单地说，使用半固体培养基固定单细胞，并且在包埋后的十天时挑取分泌高量IgG的集落。每3-4天将这些细胞系在旋管式生物反应器中以3×10⁵个细胞/毫升的密度在含有蛋白胨的生长培养基(补充有8mM谷氨酰胺的HycloneSFM4CHO)中在维持在37℃和5％CO₂的加湿孵育箱中，在以180rpm轨道振荡下传代一次。

在评估多克隆细胞群体时，测定在50ml旋管式生物反应器中在5ml完全培养基中以每毫升1×10⁵个细胞的细胞密度接种的并且培养6天的细胞的IgG滴度。或者，将克隆群体的摇瓶培养物以3×10⁵个细胞/毫升的密度接种到SFM4CHO培养基中以开始补料分批生产过程。在维持在37℃和5％CO₂的加湿孵育箱中，在以150rpm振荡下使用125ml摇瓶中的25ml培养体积或50mlTPP培养管中的5ml培养体积进行补料分批生产测定(125ml的摇瓶和旋管)。通过在第零天、第三天以及第六天至第八天补给初始培养体积的16％的化学成分确定的浓缩进料(Hyclone公司，CellBoost5，52g/l)进行生产十天。在培养运行期间不施加谷氨酰胺和葡萄糖补料。每天使用GUAVA机(密理博公司(Millipore))测量培养物的活力和活细胞密度(VCD)。使用双夹心ELISA测定来测定分泌到培养基中的MAb浓度。

质粒和相对定量PCR分析

这项研究中所使用的克隆载体是Selexis哺乳动物表达载体SLX质粒_082。将pGL3-对照载体(普洛麦格公司(Promega))的荧光素酶序列替换为真核细胞表达盒，所述真核细胞表达盒由EGFP编码序列上游的人类CMV增强子和人类GAPDH启动子，所述EGFP编码序列后面的SV40多聚腺苷酸化信号、人类胃泌素终止子以及SV40增强子构成。两个人类MAR衍生的遗传元件侧接所述表达盒和由SV40启动子表达的嘌呤霉素抗性基因，而SLX质粒_082的区别在于位于表达盒上游的MAR元件的类型(hMAR1-68和hMARX-29；Girod等,2007)。

将曲妥珠单抗和英夫利昔单抗的重链和轻链cDNA克隆到表达载体中以代替EGFP。带有每一种IgG的重链和轻链这两者的表达盒的载体是通过将重链表达盒和轻链表达盒共同组合在一个质粒载体上而制成的。所有重链和轻链的信号肽序列是相同的，轻链的恒定部分也是相同的。重链的恒定部分在若干个氨基酸位置处不同(DEL变体对比EEM变体)。

SRP9、SRP14、SRP54、SRPRα、SRPRβ、SEC61A1以及SEC61BcDNA的PCR扩增引物和基因库登录号列于本文别处。将编码分泌蛋白的PCR产物克隆到载体中以代替EGFP序列。当多种分泌蛋白共表达时，将piggyBac转座子的反向末端序列整合到载体中以将表达盒围在一起，并且将所得载体与piggyBac转座酶表达载体一起共转染以提高转基因整合并且避免对抗生素选择的需要。

在相关实验中使用典型的PB转座酶表达载体，即pCS2+U5V5PBU3，它含有由非洲爪蟾β-球蛋白基因的5'端非翻译末端区域(UTR)和3'端非翻译末端区域围绕的PB转座酶编码序列。这种质粒是如下构建的：将来自pBSSK/SB10的3'端UTR317bp片段插入pCS2+U5(英国佩斯利的英杰/生命科技公司)中以产生pCS2+U5U3。PB转座酶编码序列(2067bp，基因库登录号：EF587698)是由ATG生物合成公司(德国的梅尔茨豪森)合成的并且克隆到pCS2+U5U3骨架中两个UTR之间。PB对照载体对应于未经过修饰的pCS2+U5质粒。

不同的转座子载体是通过将由ATG生物合成公司(德国的梅尔茨豪森)合成的PB235bp3'端反向末端重复序列(ITR)和310bp5'端反向末端重复序列引入到pBluescriptSK-质粒中而产生的(pBSKITR3'-ITR5')。然后将来自pRc/RSV质粒(英杰/生命科技公司)的在SV40启动子控制下的新霉素磷酸转移酶基因(Neo^R)插入到这两个ITR之间。在这项研究中所使用的MAR1-68和MARX-29元件、嘌呤霉素抗性基因以及GFP基因如先前所述(Girod等,2007；Grandjean等,2011；Hart和Laemmli,1998)。免疫球蛋白表达载体和SRP9、SRP14、SRP54、SRPRα、SRPRβ、SEC61A1以及SEC61B编码序列描述于本文中。使用真核细胞表达盒表达分泌蛋白，所述真核细胞表达盒由编码序列上游的人类CMV增强子和人类GAPDH启动子，所述编码序列后面的SV40多聚腺苷酸化信号、人类胃泌素终止子以及SV40增强子构成。使用标准克隆方法将表达盒和/或MAR元件插入ITR序列之间或细菌载体骨架中。

包括适当的3'端ITR和5'端ITR以及转座酶的PiggyBac转座子系统是例如可从SYSTEMBIOSCIENCE公司获得的。

对于相对定量PCR分析，将总RNA从1×10⁵个细胞中提取并且使用FastLane细胞cDNA试剂盒(快而精公司)根据制造商的说明书逆转录成cDNA。通过qPCR，使用RotorGeneQ(快而精公司)和480SYBR绿色I主混合物(罗氏公司(Roche))，使用附表S1中所列的引物来定量SRP14和GAPDH的表达。使用Rotor-GeneQ系列软件(快而精公司)将SRP14的信使RNA水平针对GAPDH的水平归一化。

CHO细胞系的细胞培养、稳定转染以及亚克隆

将悬浮的中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)在37℃、含5％CO₂的加湿空气下维持在补充有L-谷氨酰胺(奥地利的PAA公司)和HT补充剂(Gibco公司/英杰生命科学公司)的SFM4CHOHyclone无血清培养基(赛默科技公司)中。通过电穿孔，根据制造商的建议(Neon装置，英杰公司)将CHO-K1细胞用带有嘌呤霉素抗性基因的曲妥珠单抗或英夫利昔单抗重链和轻链表达载体转染。在两天后，将细胞转移到T75培养板中含有10μg/ml嘌呤霉素的培养基中，并且将细胞进一步在选择下培养两周。然后通过有限稀释法产生表达曲妥珠单抗和英夫利昔单抗IgG的稳定的单个细胞克隆，使它们扩增并且分析生长性能和IgG产生水平。选择表达最高的IgG水平的曲妥珠单抗和英夫利昔单抗IgG产生细胞克隆进行进一步生化实验。然后通过电穿孔将这些克隆中的一些用SRP14表达载体和带有新霉素抗性基因的质粒共转染。然后将细胞在含有300μg/ml的G418的培养基中培养两周，如上文所述。通过有限稀释法分离稳定的克隆并且在培养物扩增以进行生化分析之前通过Q-PCR测定确认SRP14表达。

分批培养和补料分批培养

在37℃下在5％CO₂加湿孵育箱中在50ml微型生物反应管(瑞士的TPP公司)中分批培养7天来评价表达曲妥珠单抗和英夫利昔单抗的单个克隆的生长和生产性能。在细胞培养的第3天、第4天以及第7天，使用GuavaEasyCyte流式细胞系统(密理博公司)测定细胞密度和活力。通过夹心ELISA测量细胞培养上清液中IgG的滴度。绘制在所示的处理时间，即采样日的细胞密度(Cv.ml^-1)和IgG滴度值(μg.ml^-1)的曲线。表达曲妥珠单抗和英夫利昔单抗的克隆的IgG单位生产率被确定为从第3天到第7天(生产阶段)所计算的IgG浓度与活细胞(IVCD)的整数的关系曲线的斜率，并且表示为每天每个细胞的皮克数(pcd)。

对于补料分批生产培养，将细胞以0.3×10⁶个细胞/毫升接种到125ml摇瓶中25mlSFM4CHOHyclone无血清培养基中。将培养物在搅拌下维持在37℃和5％CO₂下。每天使用市售的Hyclone进料(赛默科技公司)对培养物进行补料。每天评价细胞密度和IgG产生。

蛋白质表达和聚集分析

通过使用含1％TritonX-100的PBS缓冲液在蛋白酶抑制剂混合液(罗氏公司)存在下使细胞透化来提取可溶性胞浆蛋白。在冰上孵育30分钟之后，将细胞以14,000rpm离心10分钟。上清液被称为“可溶性胞质和ER蛋白”级分。将沉淀物通过在脲Laemmli缓冲液(62.5mMTris、2％SDS、8M脲、5％甘油、溴酚蓝染料)中超声处理来溶解，从而产生聚集的和泡状不溶性蛋白质级分。然后将可溶性级分和不溶性级分在含有2-巯基乙醇或不含2-巯基乙醇的Laemmli缓冲液中调节并且在95℃煮沸8分钟。将还原样品和非还原样品分别在10％或4％-10％梯度的丙烯酰胺凝胶上通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺基因电泳(SDS-PAGE)分离。

然后将蛋白质吸印到硝酸纤维素膜上。在TBS-Tween(20mMTris、0.5MNaCl、0.1％Tween20)中稀释的5％奶中封闭之后，使用以下一抗针对不同的蛋白质对膜进行分析：抗人类IgG(H+L)-HRP缀合的驴抗体(JK免疫研究公司(JKimmunoresearch)，#709035149，1:5000)、抗人类BiP兔多克隆抗体(细胞信号转导公司(Cellsignaling)，BiP，C50B12，1:2000)、抗人类CHOP小鼠单克隆抗体(细胞信号转导公司，CHOP，L63F7，1:500)、抗人类GAPDH山羊多克隆抗体。在4℃下孵育过夜之后，使用HRP缀合的抗兔IgG或抗小鼠IgG(细胞信号转导公司，1:20000)对每一个印迹进行探测。将由每一种抗体识别的特异性蛋白质使用ECL试剂检测并且暴露于ECL膜(阿默舍姆生物科学公司(AmershamBiosciences))。

基于放线菌酮的蛋白质追踪实验

对IgG高产(HP)和低产(LP)CHO-K1克隆进行基于放线菌酮的追踪实验。将相等数目的细胞在补充有100μM放线菌酮(西格玛公司(Sigma))的完全培养基中接种到6孔培养板中。在各个时间点，将细胞收获并且在PBS、1％TritonX-100中裂解。然后将Tx可溶性级分和不溶性级分在4％-10％丙烯酰胺非还原SDS-PAGE上拆分并且使用抗人类IgG抗体进行免疫印迹。

差示洗涤剂分级分离测定

通过对细胞沉淀物进行差示洗涤剂提取来进行来自膜蛋白的胞质的分级分离。将细胞首先在1mlPBS中洗涤，并且将Hp细胞和LP细胞的质膜在含有0.01％毛地黄皂苷(西格玛公司)的KHM缓冲液(110mMKAc、20mMHEPES、2mMMgCl₂，pH7.2)中在存在或不存在1％TritonX-100的情况下透化10分钟。将半透化的细胞在KHM缓冲液中洗涤一次并且在室温下添加胰蛋白酶达到50μg/ml，持续10分钟以消化可溶性蛋白质。通过添加1mMPMSF和4mMAEBSF来停止胰蛋白酶消化。通过离心收集细胞并且在TritonX-100和蛋白酶抑制剂存在下提取可溶性蛋白质，如部分2.4中所述。将含有2-巯基乙醇的还原Laemmli缓冲液添加到沉淀物和上清液级分中，然后对它们进行8％的SDS-PAGE。进行免疫印迹以检测IgG和BiP蛋白质。

蛋白质的交联和蛋白质印迹分析

将英夫利昔单抗LP细胞在PBS中洗涤一次并且在存在或不存在1mM的二硫代双(丁二酰亚胺基丙酸酯)(DSP)交联剂(赛默科技公司)的情况下在冰上孵育30分钟。通过添加50mM的Tris-HCl(pH7.4)，持续10分钟来使交联终止，之后在含有1％TritonX-100的PBS缓冲液中进行蛋白质提取。在微量离心管中以14,000rpm离心10分钟之后，将TritonX-100不溶性级分或整个蛋白质提取物通过SDS-PAGE在还原条件下分析，进行免疫印迹并且使用抗BiP抗体和抗LC抗体探测。并行地分析等量的Tx不溶性级分蛋白质。

将了解的是，本发明的方法和组合物可以被并入多个实施方案的形式中，这些实施方案中只有几个在本文公开。对于本领域技术人员将显而易见的是，其它实施方案存在并且没有脱离本发明的精神。因此，所述的实施方案具有说明性并且不应当被视为具有限制性。

表A：使用转座子载体表达的TEP蛋白的示例性列表

1.Exp表示所示的人类蛋白质的表达，而KD表示CHO蛋白质的敲落。术语Selexis表示由本发明的申请人工程化的先前未知的序列。

2.除非表达变体序列，否则所表达的蛋白质的序列如由所述的NCBI条目所示，并且变异示于序列变异下。N/A表示由本发明的申请人工程化的先前未知的序列。

表B：使用例如特异性PIGGYBAC转座子载体所表达的shRNA的示例性列表

表C：siRNA(正义链)的实例和由相应siRNA产生的shRNA的实例的列表

53BP1_1UCAGAAUGAUGACAAAGUA

53BP1_2GAGCAAGGAGACAAUAAUA

53BP1_3CAAAGACAUCCCUGUUACA

Brca1_1CCACGUAACUGAAAUUAUA

Brca1_2AAGGCUGAGUUCUAUAAUA

Brca1_3AGAGCCAAAUGAACAAAGA

Brca2_1GAAGCUGUUUACAGAAUGA

Brca2_2CAAUGACUAUACAGACAAA

Brca2_3AACAGACGGUUGCCAUAAA

cycD1_1UGGAACUCCUUCUGGUGAA

cycD1_2CGCACUUUCUUUCCAGAGU

cycD1_3UGCCAGAGGCGGAUGAGAA

DNA-PKcs_1GGAUCGAGCUGUUCAGAAA

DNA-PKcs_2AGAUGAUGUUCACUCUAAA

DNA-PKcs_3AUCCAUCGGUAUCUUUAAA

Ku70_1GGUGCCCUUUACUGAGAAA

Ku70_2AAAGCCCAAGGUAGAGUUA

Ku70_3ACAUUUCCAAGACACAAUU

Ku80_1GAAACUGUCUAUUGCUUAA

Ku80_2CCAUAGGGAAGAAGUUUGA

Ku80_3GGAUUCCUAUGAGUGUUUA

LigIV_1AGAGCCUCCUUCAGUUAAU

LigIV_2CUAUACAGCAGGUAAAUGA

LigIV_3AGAGGUAUGAUAUCCUUAA

Rad51_1GUGCCAAUGAUGUGAAGAA

*相应的Rad51shRNA编码序列：

ACAAGCTTGTGCCAATGATGTGAAGAATTCAAGAGA TCTAGAGTCGGGGCGGCCGGCC

Rad51_2GGGAAUUAGUGAAGCCAAA

**相应的Rad51shRNA编码序列：

ACAAGCTTGGGAATTAGTGAAGCCAAATTCAAGAGA TCTAGAGTCGGGGCGGCCGGCC

Rad51_3GGCGUUCAGAAAUCAUACA

**相应的Rad51shRNA编码序列：

ACAAGCTTGGCGTTCAGAAATCATACATTCAAGAGA TCTAGAGTCGGGGCGGCCGGCC

Rad51b_1ACAGCCUAUGAUAUAAAGA

Rad51b_2CAAGUUCUUGGCCAAACAA

Rad51b_3GUACCUGGCUGAGGAAUUU

Rad51c_1UGAUCAGCCUGGCAAAUAA

Rad51c_2AGAGGAAGCUUUAGAAACU

Rad51c_3GGAUGAAGAACACCAGAAA

Rad51d_1ACGGAGCAGACCUAUAUGA

Rad51d_2CCCAAGAUGAGGAGAAACA

Rad51d_3GCCUGGACAAACUACUUGA

Rad52_1UGAGAUGUUUGGUUACAAU

Rad52_2ACUGCAUUCUGGACAAAGA

Rad52_3CCCUGAAGACAACCUUGAA

Rad54_1AGAAGACCUGCUAUAUUUA

Rad54_2CAUCAGAUAUCCUCUCUAA

Rad54_3GAAGCUAUGUAACCAUCCA

Xrcc2_1GAAGUGUUCUCAGCUCCUA

Xrcc2_2CAACACAAAGUCUAAUGCA

Xrcc2_3AUCAGAGGGUGGACUGCAA

Xrcc3_1CCACAUCUUCAUCGAGCAU

Xrcc3_2ACGGUGGAGGAGCAAGAGU

Xrcc3_3GAUCAGAUUCAGCAACCAC

Xrcc4_1AUAUGCUGAUGAAUUGAGA

Xrcc4_2CUGAAAGAUGUCUCAUUUA

Xrcc4_3AUGAGCACCUGCAGAAAGA

阴性对照1AGGUAGUGUAAUCGCCUUG

阴性对照2GACGACUCACAUACGUAAA

阴性对照3GAAUAUAUCGCGAAAUGUA

(*)(**)(***)使用靶向Rad51的分子作为实例说明了来自所列的siRNA序列的shRNA编码DNA序列的结构。对应于所示的siRNA链的DNA序列加下划线，而允许形成发夹结构的互补序列加了两条下划线。

表D：某些重组途径的所选基因

¹敲落对GFP转基因表达的影响的类型；+正面影响，++统计显著性正面影响(p<0.05)，+++统计高度显著性正面影响(p<0.01)，-负面影响，--统计显著性负面影响(p<0.05)，---统计高度显著性负面影响(p<0.01)。

Claims

1.一种重组核酸分子，所述重组核酸分子包含：

(a)5′端转座子特异性反向末端重复序列(ITR)和3′端转座子特异性反向末端重复序列，

(b)至少一个编码转基因表达加工(TEP)蛋白或TEP功能性RNA的核酸序列，所述核酸序列位于所述5′端ITR与所述3′端ITR之间并且在启动子的控制下，以及

(c)任选的至少一种转基因，所述转基因也位于所述5′端ITR与所述3′端ITR之间并且在转基因启动子的控制下，其中所述核酸分子任选地是载体的一部分。

2.根据权利要求1所述的重组核酸分子，所述重组核酸分子还包含至少一个表观遗传调节元件，特别是至少一个MAR(基质附着区)元件。

3.根据权利要求2所述的重组核酸分子，其中所述MAR元件位于所述5′端ITR与所述3′端ITR之间，并且其中任选地，任选地在另一个启动子控制下的诸如抗生素抗性基因或编码免疫球蛋白的基因之类的转基因位于所述5′端ITR与所述3′端ITR之间，如所述5′端ITR与所述MAR之间。

4.根据前述权利要求中任一项所述的重组核酸分子，其中所述TEP蛋白或TEP功能性RNA是如下的蛋白质或功能性RNA，所述蛋白质或功能性RNA直接地或间接地涉及核酸序列向基因组中的整合、转基因RNA产物的加工或翻译，或涉及诸如转基因表达产物之类的蛋白质的ER易位、分泌、加工、折叠、ER-高尔基体-质膜转运、糖基化和/或另外的翻译后修饰。

5.根据前述权利要求中任一项所述的重组核酸分子，其中所述TEP蛋白是蛋白质分泌途径的蛋白质、重组途径的蛋白质、包括诸如BiP的伴侣蛋白的蛋白质加工或代谢蛋白、或其组合。

6.根据权利要求5所述的重组核酸分子，其中所述TEP蛋白是所述蛋白质分泌途径的以下蛋白质中的一种或多种：hSRP14、hSec61α1、hSec61β、hSec61γ、hSRP54、hSRP9、hSRPRα、hSRPβ、以及hCANX。

所述TEP蛋白还可以对应于所述蛋白质分泌途径的蛋白质的下列氨基酸序列中的一个或多个：具有SEQIDNO：13的hSRP14、具有SEQIDNO：15的hSec61α1、具有SEQIDNO：17的hSec61β、具有SEQIDNO：19的hSec61γ、具有SEQIDNO：21的hSRP54、具有SEQIDNO：23的hSRP9、具有SEQIDNO：25的hSRPRα、具有SEQIDNO：27的hSRPβ、和具有SEQIDNO：29的hCANX以及与所述所指定的序列具有大于80％、90％、95％或98％序列同一性的氨基酸序列。

7.根据权利要求1至5所述的重组核酸分子，其中所述TEP蛋白是以下蛋白质加工或代谢蛋白中的一种或多种：hUCP4、hCMPSAT、rST6Gal1、hCOMSC、hT-合酶、hP4HA1、hP4HB、hGILZ、hCyPB、hNRF2、hHK1、hPDI、hPIN1、hSEPW1、hCALR、hDDOST、hHSP40、hATP5A1、hSERCA2、hPDIA4、hHSC70/HSPA8、hHYOU1、hCMP-SAS、hBeclin-1、hERdj3、CHO-AGE 、hWip1、hRTP4、hREEP2、hDPM1以及hDRiP78。

8.根据权利要求1至5所述的重组核酸分子，其中所述TEP蛋白是伴侣蛋白，特别是BiP蛋白质，更特别是与SEQIDNO.：60具有80％、90％、95％或100％序列同一性的合成BIP蛋白质衍生物(DroBiP)。

9.根据前述权利要求中任一项所述的重组核酸分子，其中所述MAR元件选自SEQIDNO：1(MAR1-68)、2(MAR1_6)、3(MARX_S29)、4(MARS4)、5(鸡溶菌酶MAR)，是工程化的，特别是重排的对应物和/或与SEQIDNO：1至5中的任一个具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％的序列同一性。

10.根据前述权利要求中任一项所述的重组核酸分子，其中所述细胞内的所述TEP功能性RNA包含如下的核酸序列/由如下的核酸序列组成，所述核酸序列编码功能性RNA，优选地miRNA或shRNA，所述功能性RNA干扰重组途径的至少一种蛋白质的表达，所述蛋白质诸如但不限于Rad51、Rad51B、Rad51C、Rad51D、Xrcc2、Xrcc3、Rad52、Rad54、Brca1、Brca2、细胞周期蛋白D1、Ercc、MDC1、Bard1、连接酶1、Mre11和/或53BP1。

11.根据前述权利要求中任一项所述的重组核酸分子，其中所述核酸分子具有至少5000bp、6000bp、7000bp、8000bp、90000bp、或10000bp的长度。

12.根据前述权利要求中任一项所述的重组核酸分子，其中所述5′端ITR和3′端ITR是SleepingBeauty转座子或优选地PiggyBac转座子的5′端ITR和3′端ITR。

13.根据前述权利要求中任一项所述的重组核酸分子，其中在向哺乳动物细胞中第一次转染所述重组核酸分子并且第二次后续转染含有转基因的另外的重组核酸分子之后，在所述细胞中，相对于没有接受所述第一次转染的细胞，转基因整合和/或表达增加。

14.根据前述权利要求中任一项所述的重组核酸分子，其中所述重组核酸分子是载体的一部分。

15.根据权利要求15所述的重组核酸分子，其中所述载体包含单个MAR元件、两个或更多个MAR元件，其中所述元件位于所述5′端ITR与所述3′端ITR之间。

16.根据权利要求14所述的重组核酸，其中所述载体包含两个MAR元件，其中第一MAR元件被定位在所述TEP或TEP功能性RNA的上游并且第二MAR元件被定位在所述TEP或TEP功能性RNA的下游，其中所述第一MAR元件包含MAR1_6元件和/或与SEQIDNO.2具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的元件，特别是基于MAR1-6的重排MAR，更特别是与SEQIDNO.：8(MAR1_6R2)具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的元件并且所述第二MAR元件包含MAR1-68元件和/或与SEQIDNO.1具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的元件。

17.根据权利要求14所述的重组核酸分子，其中所述载体包含所述单个MAR元件，其中所述单个MAR元件被定位在所述TEP或TEP功能性RNA的下游，其中所述单个MAR元件是MAR1-68或MARX-29元件和/或与SEQIDNO.1或3具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的元件，特别是基于MAR1-68或MARX-29的重排MAR，特别是与SEQIDNO：6、7或10(MAR1_68R、MAR1_68R2或MARX_29R3)或9具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的元件，并且优选地是MARX-29元件和/或与SEQIDNO.3具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的元件。

18.根据权利要求14至17所述的重组核酸分子，其中所述TEP或TEP功能性RNA在EF1α启动子的控制下并且任选地后面是BGH多聚腺苷酸化信号。

19.根据权利要求14至18中任一项所述的重组核酸分子，其中所述载体包含一个或多个启动子和/或一个或多个增强子或其融合体，如GAPDH、CGAPDH、SV40p、CMVp、CHOEf1α、CHOActb和/或CHOHspa5。

20.一种用于表达TEP或TEP功能性RNA的方法，所述方法包括：

提供包含转基因的重组哺乳动物细胞，并且所述载体是根据权利要求14至19中任一项所述的表达所述TEP或TEP功能性RNA的载体，其中经由所述载体表达的所述TEP或TEP功能性RNA任选地使所述哺乳动物细胞中转基因的表达增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或至少70％。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述载体包含单个MARX-29元件和/或与SEQIDNO.3具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列并且其中在培养超过4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周或14周之后，经由所述载体表达的所述TEP或TEP功能性RNA使所关注的基因的表达增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或至少70％。

22.一种重组哺乳动物细胞，所述重组哺乳动物细胞包含不超过20种、15种、10种或5种根据权利要求1至14所述的重组核酸分子，所述重组核酸分子优选地作为单拷贝被整合到所述细胞的基因组中。

23.根据权利要求22所述的重组哺乳动物细胞，其中所述细胞内的所述一个或多个编码TEP蛋白的核酸序列包含如下的核酸序列/由如下的核酸序列组成，所述核酸序列编码根据权利要求6、7和/或8所述的蛋白质。

24.根据权利要求23所述的重组哺乳动物细胞，其中所述细胞内的所述一个或多个编码所述TEP功能性RNA的核酸序列包含如下的一个或多个核酸序列/由如下的一个或多个核酸序列组成，所述核酸序列编码功能性RNA，优选地miRNA或shRNA，所述功能性RNA干扰至少一种重组蛋白，优选地HR基因的表达，所述重组蛋白诸如但不限于Rad51、Rad51B、Rad51C、Rad51D、Xrcc2、Xrcc3、Rad52、Rad54、Brca1、Brca2、细胞周期蛋白D1、Ercc1、MDC1、Bard1、连接酶1、Mre11和/或53BP1。

25.根据权利要求22至24中任一项所述的重组哺乳动物细胞，其中所述细胞是原代干细胞；仓鼠细胞，例如CHO(中国仓鼠卵巢)细胞；或人类细胞，例如HEK293细胞。

26.一种重组哺乳动物细胞，所述重组哺乳动物细胞包含：

a)至少一种TEP功能性RNA和/或至少一个重组核酸序列，所述重组核酸序列编码TEP蛋白或编码TEP功能性RNA，

以及

b)重组核酸分子，所述重组核酸分子包含：

(i)至少一种所关注的转基因，以及

(ii)任选的MAR元件。

27.根据权利要求26所述的重组哺乳动物细胞，其中所述TEP蛋白是根据权利要求6、7或8所述的至少一种TEP。

28.根据权利要求26或27所述的重组哺乳动物细胞，其中所述功能性RNA是从所述至少一个分离的核酸序列转录的瞬时转染的siRNA或shRNA，其中所述siRNA或所述经过加工的shRNA是具有20个、21个、22个、23个、24个或25个碱基对长度的反义RNA，所述反义RNA与至少一种靶基因的mRNA的20个、21个、22个、23个、24个或25个连续核苷酸完全互补，所述靶基因是NHEJ(非同源末端连接)、HR(同源重组)、MMEJ(微同源介导的末端连接)重组途径的一部分或是DNA修复蛋白，如MDC1(DNA损伤检验点介质1)。

29.根据权利要求28所述的重组哺乳动物细胞，其中所述至少一种靶基因是以下各项的一部分：

-所述NHEJ，所述至少一种靶基因是53BP1(肿瘤抑制因子p53结合蛋白1)；

-所述HR，所述至少一种靶基因是

Xrcc2(中国仓鼠细胞X射线修复互补缺陷修复基因2)，

Xrcc3(中国仓鼠细胞X射线修复互补缺陷修复基因3)，

Brca1(早发性乳腺癌基因1)，

Brca2(早发性乳腺癌基因2)，

Bard1(BRCA1相关环状结构域1)；

-所述MMEJ，所述至少一种靶基因是

Ercc1(切除修复交叉互补啮齿动物修复缺陷基因，互补群1)，

Mre11(减数分裂重组基因11)，

连接酶1(DNA连接酶1)，

和/或

所述至少一种靶基因是DNA修复蛋白MDC1。

30.根据权利要求26至29中任一项所述的重组哺乳动物细胞，其中所述至少一种转基因表达治疗性蛋白质，如免疫球蛋白；激素，如促红细胞生成素；或生长因子，并且其中任选地，在所述重组哺乳动物细胞中，相对于不包含所述一种或多种重组核酸分子的细胞，转基因整合和/或表达增加。

31.根据权利要求26至30中任一项所述的重组哺乳动物细胞，其中所述细胞包含至少两种TEP功能性RNA，其中所述TEPRNA中的一种或这两种是瞬时转染的siRNA，或由所述一个或多个编码TEP功能性RNA的分离的核酸序列表达。

32.根据权利要求26至31中任一项所述的重组哺乳动物细胞，其中所述重组哺乳动物细胞包含MAR元件。

33.一种用于转染哺乳动物细胞，特别是仓鼠细胞的方法，所述方法包括：

(i)根据权利要求1至13中任一项所述的重组核酸分子中的至少一种、至少两种、至少三种或至少四种，和/或

(ii)至少一种、至少两种、至少三种或至少四种分离的TEP功能性RNA和至少一种转基因，所述转基因任选地是重组核酸分子的一部分，所述重组核酸分子任选地在第二次后续的转染中，任选地连同表达识别所述5′端ITR和所述3′端ITR的转座酶的分离的核酸或mRNA一起转染。

34.根据权利要求33所述的方法，其中将所述细胞用编码权利要求6中所指定的所述TEP蛋白中的一种、两种或三种的所述重组核酸分子中的超过一种，包括至少两种、至少三种或至少四种在内来转染。

35.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述核酸分子中的每一种均是载体的一部分，并且将所述载体共转染。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述共转染，优选地编码蛋白质SRP14、SRP9以及SRP54的重组核酸分子的共转染使所述细胞中转基因的整合和/或表达相对于没有接受这种共转染的细胞增加。

37.根据权利要求33或任何后续权利要求所述的方法，其中获得一定数目的所述稳定表达所述TEP蛋白或TEP功能性RNA的哺乳动物细胞以获得重组哺乳动物细胞并且其中重组哺乳动物细胞的所述数目与所述MAR元件的存在无关。

38.根据权利要求33或任何后续权利要求所述的方法，其中将所述哺乳动物细胞第二次转染。

39.根据权利要求33所述的方法，其中所述哺乳动物细胞中有至少30％、40％或45％变成重组哺乳动物细胞并且表达所述转基因。

40.根据权利要求33所述的方法，其中将所述哺乳动物细胞用所述至少一种分离的TEP功能性RNA和包含所述至少一种转基因和任选的侧接所述至少一种转基因的3′端ITR和5′端ITR的载体，任选地连同表达识别所述5′端ITR和所述3′端ITR的转座酶的分离的核酸或mRNA一起转染。

41.根据权利要求33或任何后续权利要求所述的方法，其中所述转基因是治疗性蛋白质，如免疫球蛋白、激素、细胞因子或生长因子。

42.根据权利要求33或任何后续权利要求所述的方法，其中所述重组核酸分子任选地包含选择标记并且其中所述至少一种转基因在以下情况下表达：

(a)在没有针对所述标记进行选择的情况下，或

(c)在不存在转座酶的情况下，或

(d)在转座酶存在下。

43.根据权利要求33所述的方法，其中所述TEP功能性RNA由编码shRNA的重组核酸序列编码，或包含siRNA/由siRNA组成，所述siRNA干扰至少一种HR基因的表达，所述HR基因诸如但不限于Rad51、Rad51B、Rad51C、Rad51D、Xrcc2、Xrcc3、Rad52、Rad54、Brca1、Brca2、细胞周期蛋白D1、Ercc1、MDC1、Bard1、连接酶1、Mre11和/或53BP1。

43.根据权利要求33或任何后续权利要求所述的方法，其中在这种细胞中，相对于没有经过所述分离的核酸分子和/或所述分离的TEP功能性RNA中的所述至少一种转染的细胞，转基因整合和/或表达增加。

44.一种试剂盒，所述试剂盒包含在一个容器中的至少一种载体，所述载体包含根据权利要求1至13所述的重组核酸分子中的任一种；以及在第二任选的容器中的编码相容的转座酶的载体，和在另一个容器中的如何使用所述一种载体或多种载体的说明书。

45.根据权利要求44所述的试剂盒，其中在一个或多个容器中提供超过一种载体，并且其中所述TEP蛋白是以下各项中的至少两种：伴侣蛋白、SRP14、SRP9、或SRP54。

46.根据权利要求44所述的试剂盒，其中所述一种或多种载体内的所述一种或多种TEP功能性RNA包含如下的核酸序列/由如下的核酸序列组成，所述核酸序列编码干扰至少一种HR基因的表达的miRNA、siRNA或shRNA，所述HR基因诸如但不限于Rad51、Rad51B、Rad51C、Rad51D、Xrcc2、Xrcc3、Rad52、Rad54、Brca1、Brca2、细胞周期蛋白D1、Ercc1、MDC1、Bard1、连接酶1、Mre11和/或53BP1，以及任选地在另一个容器中的干扰至少一种HR基因的表达的一种或多种siRNA，所述HR基因诸如但不限于Rad51、Rad51B、Rad51C、Rad51D、Xrcc2、Xrcc3、Rad52、Rad54、Brca1、Brca2、细胞周期蛋白D1、Ercc1、MDC1、Bard1、连接酶1、Mre11和/或53BP1。

47.根据权利要求1至13所述的重组核酸和/或根据权利要求22至31所述的重组哺乳动物细胞优选地用于提高转基因整合和/或表达的用途。

48.一种表达载体，所述表达载体包含：

(b)在所述多聚腺苷酸化信号下游的单个MAR元件，或

(c)在所述所关注的转基因上游的第一MAR元件和在所述转基因整合位点下游的第二MAR元件。

49.根据权利要求48所述的表达载体，其中所述单个MAR元件或所述第一MAR元件和所述第二MAR元件选自MAR元件1_68、1_6、1_6R2、1_68R、1_68R2、X_29R3或X_29或者与SEQIDNO：1、2、3、6、7、8、9或10具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的元件。

50.根据权利要求48所述的表达载体，其中所述单个MAR或所述第一MAR和所述第二MAR选自重排的MAR元件1_6R2、1_68R、1_68R2或X_29R3或者与SEQIDNO：6、7、8或10具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的元件，其中任选地，所述MAR元件相对于它们的非重排对应物使所述所关注的转基因的表达增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或至少70％。

51.根据权利要求48至50所述的表达载体，其中所述启动子是EF1α启动子并且所述多聚腺苷酸化信号是BGH多聚腺苷酸化信号。

52.根据权利要求48至51所述的表达载体，其中所述载体包含一个或多个启动子和/或一个或多个增强子或其融合体，如GAPDH、CGAPDH、CSV40p、CMVp、CHOEf1α、CHOActb或CHOHspa5。

53.根据权利要求52所述的表达载体，其中所述启动子是GAPDH启动子并且包含CMV增强子。

54.根据权利要求48至53所述的表达载体，其中所述一个MAR或第一MAR和第二MAR、增强子、启动子、所关注的转基因以及多聚腺苷酸化信号位于5′端ITR与3′端ITR之间。

55.根据权利要求48至54所述的表达载体，所述表达载体包含

(a)处于所述多聚腺苷酸化信号下游的单个MAR元件，其中所述单个MAR元件优选地是MAR1-68或MARX-29元件和/或与SEQIDNO.1或3具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的元件，特别是基于MAR1-68或MARX-29的重排MAR，特别是与SEQIDNO：6、7或10(MAR1_68R、MAR1_68R2或MARX_29R3)或SEQIDNO：9具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的元件，并且优选地是MARX-29元件和/或与SEQIDNO.3具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％的序列同一性，或

(b)位于所述所关注的转基因上游的第一MAR元件和位于所述所关注的转基因下游的第二MAR元件，其中所述第一MAR元件优选地包含1_6元件和/或与SEQIDNO.2具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％的序列同一性，特别是基于MAR1-6的重排MAR，特别是与SEQIDNO：8(MAR1_6R2)具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％的序列同一性的元件并且所述第二MAR元件优选地包含MAR1-68元件和/或与SEQIDNO.1具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％的序列同一性。

56.根据权利要求55所述的表达载体，所述表达载体包含所述单个MAR元件，其中所述单个MAR元件被定位在所述多聚腺苷酸化位点的下游并且是MAR1-68或MARX-29和/或与SEQIDNO.1或3具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性，特别是基于MAR1-68或MARX-29的重排MAR，特别是与SEQIDNo：6、7或10(MAR1_68R、MAR1_68R2或MARX_29R3)或9具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的元件，并且优选地是MARX-29衍生的元件和/或与SEQIDNO.3具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性。

57.根据权利要求55所述的表达载体，所述表达载体包含在所述转基因的上游的第一MAR元件和在所述所关注的转基因下游的第二MAR元件，其中所述第一MAR元件包含MAR1_6元件和/或与SEQIDNO2具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性并且所述第二MAR元件包含MAR1_68元件和/或与SEQIDNO.1具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性。

58.一种用于表达转基因的方法，所述方法包括：

提供包含根据权利要求48至57所述的载体中的一种的重组哺乳动物细胞，所述载体包含所述转基因，以及使所述转基因表达，其中所述一个或多个MAR元件使所述转基因的表达优选地增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或至少70％。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述载体包含单个MARX_29元件和/或与SEQIDNO.3具有至少80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的核酸并且其中在培养超过4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周或14周之后，所述MAR元件使所述所关注的转基因的表达增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或至少70％。