ES2940433T3 - Expresión transgénica y procesamiento potenciados - Google Patents

Abstract

Se describen construcciones y métodos para expresar ADN de interés en particular en células huésped eucariotas no primates que muestran ventajas con respecto a la cantidad y calidad de la expresión, incluida una alta estabilidad de expresión y, si corresponde, el transporte del producto de expresión fuera de la célula. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Expresión transgénica y procesamiento potenciados

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención está dirigida a proporcionar construcciones de ácidos nucleicos y proteínas que participan o actúan en rutas metabólicas que median o influyen en el metabolismo celular, p. ej., translocación a través de la membrana del ER (siglas inglesas de retículo endoplasmático) y/o secreción a través de la membrana citoplásmica, así como a métodos para influir en el metabolismo celular. La invención también está dirigida a la producción y uso de células recombinantes de mamíferos en las que, p. ej., se altera la translocación/secreción de una amplia diversidad de proteínas heterólogas (productos de expresión transgénica). Los métodos, las construcciones de ácido nucleico se diseñan generalmente para mejorar la expresión transgénica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La producción biotecnológica de proteínas terapéuticas, así como la terapia génica y celular dependen de la expresión satisfactoria de transgenes introducidos en una célula eucariótica. La expresión transgénica exitosa requiere generalmente la integración del transgén en el cromosoma huésped y está limitada, entre otros, por el número de copias del transgén integrado y por los efectos epigenéticos que pueden provocar una transcripción baja o inestable y/o una alta variabilidad clonal. El transporte defectuoso o reducido del producto de expresión transgénica fuera de la célula también limita a menudo la producción de proteínas terapéuticas, así como la terapia génica y celular.

Para aumentar y estabilizar la expresión transgénica en células de mamíferos se utilizan cada vez más reguladores epigenéticos para proteger a transgenes de efectos de posición negativa (Bell y Felsenfeld, 1999). Estos reguladores epigenéticos incluyen elementos de contorno o aislantes, regiones de control de locus (LCR, por sus siglas en inglés), elementos estabilizadores y antirrepresores (STAR, por sus siglas en inglés), elementos de apertura de cromatina de acción ubicua (UCOE, por sus siglas en inglés) y las regiones de unión de matriz (MARs, por sus siglas en inglés) antes mencionadas. Todos estos reguladores epigenéticos se han utilizado para la producción de proteínas recombinantes en líneas celulares de mamíferos (Zahn- Zabal et al., 2001; Kim et al., 2004) y para terapias génicas (Agarwal et al., 1998; Allen et al., 1996; Castilla et al., 1998).

El producto de expresión transgénica topa a menudo con diferentes cuellos de botella durante el procesamiento y el transporte fuera de la célula: La célula que solo está equipada con la maquinaria para procesar y transportar sus proteínas innatas puede sobrecargarse fácilmente por el transporte de determinados tipos de productos de expresión transgénica, especialmente cuando se producen a niveles anormalmente altos como se desea a menudo, dejando que el producto se agregue dentro de la célula y/o, p. ej., impidiendo el plegamiento adecuado de un producto de proteína funcional.

Se han buscado diferentes enfoques para superar los cuellos de botella de transporte y procesamiento. Por ejemplo, se diseñaron células CHO con propiedades de secreción mejoradas mediante la expresión de las proteínas SM Munc18c o Sly1, que actúan como reguladores del tráfico de vesículas membranosas y, por lo tanto, secretan exocitosis de proteínas (Publicación de Patente de EE.UU. 20090247609). La proteína 1 de unión a la caja X (Xbp1), un factor de transcripción que regula la diferenciación de las células secretoras y el mantenimiento y la expansión del ER, o diversas proteínas disulfuro isomerasas (PDI), se han utilizado para disminuir el estrés del ER y aumentar la secreción de proteínas (Mohan et al. 2007). Otros intentos de aumentar la secreción de proteínas incluyeron la expresión de las chaperonas ERp57, calnexina, calreticulina y BiP1 en células CHO (Chung et al., 2004). Se demostró que la expresión de una proteína inducida por choque frío, en particular la proteína de unión a ARN inducible por frío (CIRP, por sus siglas en inglés), aumenta el rendimiento de Y-interferón recombinante. También se hicieron intentos para sobre-expresar proteínas de los complejos secretores. Sin embargo, por ejemplo, Lakkaraju et al. (2008) informaron que la expresión exógena de SRP14 en células humanas WT (siglas inglesas de Tipo Salvaje) (p. ej., en células que no se diseñaron para expresar niveles bajos de SRP14) no mejoró la eficiencia de secreción de la proteína fosfatasa alcalina secretada.

Por lo tanto, existe la necesidad de una expresión transgénica eficaz y fiable, p. ej., producción de proteínas recombinantes y terapia génica. También existe la necesidad de transportar con éxito el producto de expresión transgénica fuera de la célula.

Realizaciones de la presente invención abordan esta y otras necesidades de la técnica.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención, en una realización, está dirigida a una molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicación 1. La molécula de ácido nucleico recombinante comprende:

(a) una repetición terminal invertida (ITR, por sus siglas en inglés) específica de transposón en 5' y una en 3', (b) al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de procesamiento de expresión transgénica (TEP, por sus siglas en inglés), ubicada entre las ITRs 5' y 3' y que está bajo el control de un promotor, y

(c) al menos un transgén también ubicado entre las ITRs 5' y 3' y que está bajo el control de un promotor transgénico, en donde dicha molécula de ácido nucleico es opcionalmente parte de un vector.

La molécula de ácido nucleico recombinante comprende al menos un elemento MAR (región de unión a la matriz).

El elemento MAR está situado entre las ITRs 5' y 3'. Opcionalmente, un transgén tal como un gen de resistencia a antibióticos o un gen que codifica una inmunoglobulina, opcionalmente bajo el control de un promotor adicional, puede estar ubicado entre la ITR 5' y una ITR 3' tal como entre ITR 5’ y la MAR.

La TEP expresada a través de dicha molécula de ácido nucleico y el elemento MAR son capaces de aumentar la expresión del transgén en una célula de mamífero en al menos un 10 %.

La proteína TEP es hSERCA2, hNRF2, hCOSMC, hGILZ , hHK1, hBeclin-1 o hW ipl.

La proteína TEP es una proteína que está, directa o indirectamente, implicada en la integración de secuencias de ácido nucleico en un genoma, en el procesamiento o la traducción del producto de ARN transgénico o está implicada en la translocación ER, secreción, el procesamiento, plegamiento, transporte de ER-Golgi-membrana plasmática, glicosilación y/u otra modificación post-traduccional de proteínas tales como productos de expresión transgénica.

El elemento MAR se puede seleccionar de SEQ ID NO: 1 (MAR 1-68), 2 (MAR 1_6), 3 (MAR X_S29), 4 (MAR S4), 5 (MAR de lisozima de pollo), o es un homólogo modificado, en particular reorganizado y tiene al menos 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1 a 5.

La molécula de ácido nucleico recombinante puede tener una longitud de al menos 5000, 6000, 7000, 8000, 90000 o 10000 pbs.

Las ITR 5' y 3' pueden ser ITRs 5' y 3' del Transposón de la Bella Durmiente o preferiblemente del Transposón PiggyBac.

Tras una primera transfección de una de las moléculas de ácido nucleico recombinante y una segunda transfección posterior de una molécula de ácido nucleico recombinante adicional que contiene un transgén en una célula de mamífero, la integración y/o expresión del transgén puede incrementarse en dicha célula con respecto a una célula no sujeta a dicha primera transfección.

La secuencia codificante de TEP de acuerdo con la invención, como se mencionó anteriormente, puede ser parte de un vector que incluye un vector de expresión. El vector puede comprender un elemento MAR singular, dos o más elementos MAR, en donde dicho(s) elemento(s) puede(n) estar ubicado(s) entre las ITRs 5' y 3'.

P. ej., el vector puede comprender dos elementos MAR. Un primer elemento MAR puede colocarse aguas arriba del TEP o ^a Rⁿ funcional de TEP y un segundo elemento MAR puede colocarse aguas abajo de la TEP o del ARN funcional de TEP, en donde el primer elemento MAR puede comprender un elemento MAR 1_6 y/o un elemento que tiene al menos 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO. 2, en particular una MAR reorganizada en base a MAR 1 -6, más en particular elementos que tienen al menos 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 8 (MARs 1_6R2 ) y el segundo elemento MAR puede comprender un elemento MAR 1-68 y/o un elemento que tiene al menos un 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO. 1.

El vector también puede comprender un elemento MAR singular. El elemento MAR singular puede colocarse aguas debajo de la TEP o del ARN funcional de TEP, en donde el elemento MAR singular puede ser un elemento MAR 1 -68 o MAR X-29 y/o un elemento que tiene al menos 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NOs. 1 o 3, en particular un MAR reorganizado en base a MAR 1-68 o un MAR X-29, en particular un elemento que tiene al menos 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 6, 7 o 10 (MARs 1_68R, 1_68R2 o X_29R3) o 9, y puede ser preferiblemente un elemento MAR X-29 y/o un elemento que tenga al menos 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO. 3.

La TEP puede estar bajo el control de un promotor EF1 alfa y, opcionalmente, va seguido de una señal poliA de BGH.

El vector puede comprender promotor(es) y/o potenciador(es) o fusiones de los mismos, tales como GAPDH, SV40p, CMV, CHO EF1 alfa, CHO Actb y/o CHO Hspa5, o fusiones manipuladas de los mismos tales como CGAPDH.

Los promotores que son parte del vector pueden ser GAPDH que tiene la SEQ ID NO: 111, SV40p que tiene la SEQ ID NO: 114, CMVp que tiene la SEQ ID NO: 113, CHO Ef1 alfa que tiene la SEQ ID NO: 112, CHO Actb que tiene la SEQ ID NO: 115, CHO Hspa5 que tiene la SEQ ID NO: 116, y/o fusiones de los mismos tales como CGAPDH que tiene la SEQ ID NO: 11, o puede tener secuencias de ácido nucleico que tienen más del 80 %, 90 %, 95 % o 98 % identidad de secuencia con las secuencias especificadas.

La invención también se dirige a un método para expresar una TEP in vitro, que comprende: proporcionar una célula de mamífero recombinante que comprende un transgén e introducir un vector de acuerdo con la invención como se mencionó arriba, que es un vector de expresión que expresa la TEP, en donde la TEP expresada a través de dicho vector aumenta la expresión de un transgén en dicha célula de mamífero en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 % o al menos un 70 %.

El vector puede comprender un elemento MAR X-29 singular y/o una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 3 y en donde, después de más de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 semanas de cultivo, la TEP expresada a través de dicho vector puede aumentar la expresión de un gen de interés en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 % o al menos un 70 %.

La invención también está dirigida a una célula de mamífero recombinante que comprende no más de 20, 15, 10 o 5 de la molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención como se mencionó arriba, preferiblemente integrada en el genoma de la célula como copias individuales.

La invención también está dirigida a una célula de mamífero recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención como se describe arriba.

La célula de mamífero recombinante puede ser una célula madre primaria, una célula de hámster, p. ej., CHO (ovario de hámster chino), o una célula humana, p. ej., HEK293.

El al menos un transgén puede expresar una proteína terapéutica tal como una inmunoglobulina, una hormona tal como eritropoyetina o un factor de crecimiento y en donde, opcionalmente, en la célula de mamífero recombinante la integración y/o expresión del transgén aumenta con respecto a una célula que no comprende dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico recombinante.

La invención también se dirige a un método in-vitro para transfectar células de mamífero, en particular células de hámster, que comprende:

transfectar, opcionalmente en una primera transfección, dichas células de mamífero con al menos uno de al menos dos, al menos tres o al menos cuatro moléculas de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención como se ha descrito arriba.

Cualquiera de las moléculas de ácido nucleico recombinante puede formar parte de un vector, en donde los vectores pueden co-transfectarse. Dicha co-transfección, preferiblemente una co-transfección de moléculas de ácido nucleico recombinante que codifican SRP14, SRP9 y SRP54, puede aumentar la integración y/o expresión del transgén en dicha célula con respecto a una célula no sujeta a una co-transfección de este tipo.

La co-transfección de vectores que codifican varias proteínas TEP, preferiblemente una co-transfección de moléculas de ácido nucleico recombinante que codifican las proteínas SRP14, SRP9 y SRP54, puede aumentar la integración y/o expresión transgénica en dicha célula con respecto a una célula no sujeta a una co-transfección de este tipo. La cotransfección de vectores que comprenden secuencias de ácido nucleico que tienen al menos 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % de la SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 20 también está dentro del alcance de la presente invención.

Se puede obtener un número de dichas células de mamífero que expresan de forma estable dicha proteína TEP para obtener células de mamífero recombinantes y en donde dicho número de células de mamífero recombinantes puede ser independiente de la presencia de dicho elemento MAR. Las células de mamífero pueden transfectarse una segunda y opcionalmente una tercera vez. Preferiblemente, al menos el 30 %, el 40 % o el 45 % de dichas células de mamífero pueden convertirse en células de mamífero recombinantes y expresar dicho transgén.

El transgén puede ser una proteína terapéutica, tal como una inmunoglobulina, una hormona, una citoquina o un factor de crecimiento.

La molécula de ácido nucleico recombinante puede comprender opcionalmente un marcador de selección y en donde se expresa al menos un transgén

(a) sin selección para dicho marcador, o

(b) con selección para dicho marcador, p. ej., a través de un agente de selección contenido en un medio de cultivo, y

(c) en ausencia de transposasa, o

(d) en presencia de transposasa.

La integración y/o expresión del transgén puede incrementarse en una célula de este tipo con respecto a una célula no transfectada con dichas moléculas de ácido nucleico aisladas.

La invención también se dirige a un kit que comprende en un recipiente al menos un vector que comprende una cualquiera de las moléculas de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención como se mencionó arriba y, en un segundo recipiente opcional, un vector que codifica una transposasa compatible y en una instrucción más del recipiente de cómo utilizar el vector o los vectores.

La invención también se dirige al uso de los ácidos nucleicos recombinantes de acuerdo con la invención como se describe arriba y/o las células de mamífero recombinantes de acuerdo con la invención como se describe arriba para aumentar la integración y/o expresión transgénica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Construcción del Vector del Transposón

Para testar si añadir un elemento MAR al transposón PB (PiggyBac) puede afectar la eficiencia de la transposición y la expresión transgénica, y para evaluar si la ubicación de la MAR en la construcción tuvo alguna influencia en estos efectos, se diseñaron una serie de construcciones de donantes de transposones que contenían la GFP (siglas inglesas de proteína verde fluorescente) y el gen de resistencia a la puromicina (Puro), en las que se insertó MAR 1_68 o una secuencia de ADN espaciador neutral de control en diferentes posiciones en el plásmido. El plásmido de transposón Puro-GFP parental sin una inserción se utilizó como un control de la transposición, para distinguir el impacto del aumento del tamaño del transposón en relación con el efecto de la adición de la secuencia espaciadora o MAR.

Fig. 2. Vectores de Transposones: Eficacia de la Transposición

La eficacia de la transposición de las diversas construcciones de transposones se midió evaluando (A) el porcentaje de células que expresan GFP después de la transfección y tres semanas de cultivo sin selección de antibióticos y (B) contando las colonias resistentes a puromicina.

Fig. 3 Vectores de Transposones: Nivel de Expresión

Análisis del nivel de expresión permitido por diferentes vectores de Transposones transfectados con (+PB) o sin (-PB) plásmido de expresión de transposasa, sondeando los niveles de fluorescencia por GFP de las células CHO después de 3 semanas de cultivo sin (A) o con (B) secreción para la resistencia a la puromicina después de la transfección, teniendo en cuenta la fluorescencia de las células positivas para GFP solamente.

Fig. 4. Efecto de la MAR y transposasa en la integración genómica del transgén

El número de copias del transgén GFP integrado se determinó utilizando la qPCR y los valores se normalizaron con respecto al gen B2M celular, utilizando ADN genómico aislado de células CHO no seleccionadas (A) o células resistentes a la puromicina (B) generadas como se describe en las leyendas de las Figs. 1-3. Los valores representan las medias ± ETM (n = 3). *P < 0,05.

Fig. 5. Expresión transgénica por transgén

Evaluación del potencial de expresión intrínseco de los vectores, independientemente de su propensión a integrarse en el genoma, sin (A) y con (B) selección de puromicina.

Fig. 6. Efecto de la expresión de proteínas de secreción de vectores transponibles y de plásmidos sobre la expresión de proteínas recombinantes (transgén). Se construyeron vectores de plásmidos transponibles o regulares para expresar las proteínas de secreción SRP9, SRP14, SRP54, las subunidades alfa y beta del receptor SRP (SR) o el Translocón. Los vectores transponibles se co-transfectaron con el vector de transposasa PiggyBac (panel derecho), mientras que los vectores plasmídicos no transponibles se transfectaron solos (panel izquierdo), en un clon celular que expresa el anticuerpo Infliximab como se describe en esta memoria. Después de tres semanas de cultivo con selección (panel izquierdo) o sin selección (panel derecho), se analizaron los niveles de anticuerpo infliximab secretado a partir de sobrenadantes de cultivos celulares. Como puede verse, la productividad específica, es decir, la expresión relativa de una célula que contiene una secuencia que codifica una proteína de procesamiento de expresión transgénica (TEP) o ARN funcional de TEP, aumentó cuando se utilizó el vector de transposón, de entre 0,25 y 1,5 a entre 1 y 2,5, respectivamente, con respecto a la célula parental sin una TEP.

Fig.7: Expresión de proteína recombinante de suspensiones de células CHO-M electroporadas (A) Células CHO-M que se sometieron a electroporación una o dos veces con el vector de transposón de expresión de GFP portador de MAR X-29 en presencia (+PB) o ausencia (-PB) de la transposasa piggyBac. Se muestra el porcentaje de células que expresan GFP estables después de 3 semanas de cultivo realizado en ausencia de selección.

(B) Media de la fluorescencia por GFP de las células positivas para GFP.

(C) Los ADNc que codifican las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina del anticuerpo Bevacizumab (Beva), Adalimumab (Adal) y Rituximab (Ritu) se introdujeron en plásmidos de transposones que contenían MAR X29 en lugar de GFP. Las construcciones de transposones de cadena ligera y pesada se sometieron a electroporación tres veces a intervalos de 12 días con el vector de expresión de transposasa piggyBac en células CHO-M. Se muestran los niveles de inmunoglobulina secretada en los sobrenadantes de cultivo de agrupaciones de células policlonales cultivadas sin selección (barras en blanco). Alternativamente, las poblaciones de células policlonales no seleccionadas se clasificaron mediante la adsorción de células que presentaban inmunoglobulinas en su superficie utilizando microesferas magnéticas: se muestran los niveles de inmunoglobulinas secretadas para las poblaciones no clasificadas (barras en negro).

(D) Colonias que expresan inmunoglobulinas se clasificaron a partir de poblaciones de células transfectadas utilizando un dispositivo de selección de colonias, y dos clones que expresan cada una de las tres inmunoglobulinas se cultivaron en cultivos por lotes alimentados en biorreactores de tubo giratorio. Se muestran los niveles de inmunoglobulinas secretadas y se determinaron como para el panel (C).

Fig.8. La expresión heteróloga de SRP14 mejora la secreción de Trastuzumab y restaura la secreción de Infliximab Clones CHO-K1 HP y LP que expresan las inmunoglobulinas Trastuzumab (A) o Infliximab (B) en los niveles más altos obtenidos, se re-transfectaron de forma estable con el vector de expresión SRP14 y se aislaron poblaciones monoclonales. Los subclones derivados, marcados A a E, se evaluaron para el crecimiento y la producción celular en condiciones de cultivo por lotes. Se representaron gráficamente la densidad celular (células/ml) y el título de IgG (pg/ml) para cada uno de los días de muestreo durante los 7 días de cultivo. (C) Distribución de la productividad específica de los subclones TrastuzuMab (HP) e InflixiMab (LP) después de la transfección con el vector de expresión SRP14 (pistas S) en comparación con la de los clones parentales HP y LP (-). (D) Los niveles relativos de ARNm de SRP14 se determinaron para los 5 subclones SRP14-LP A-E individuales y el clon LP de control parental, y se representaron con respecto a la productividad de IgG específica de 4 ciclos de cultivo. Los valores de ARNm y productividad específica media y desviación estándar se expresan como el aumento en veces con respecto a los del clon de control LP.

Fig. 9 La expresión heteróloga de SRP14 media en un alto rendimiento de la inmunoglobulina difícil de expresar en un procedimiento de producción.

El subclon B (A) de HP Trastuzumab y el subclon E (B) de LP Infliximab transfectados con el vector SRP14, según se analizan en la Fig. 8, se cultivaron en un recipiente de matraz de agitación ventilado de 125 ml con un volumen de trabajo de 25 ml en cultivos semicontinuos, y se determinaron la densidad de células viables y el título de IgG durante un curso de tiempo de 11 días.

Fig. 10. La expresión de SRP14 suprime la agregación de cadenas ligeras por clones de células CHO

(A) Los sobrenadantes y sedimentos de células permeabilizadas con Tx100 recogidas por centrifugación se analizaron mediante SDS-PAGE, como se representa en los paneles marcados con Tx-100 soluble y Tx-100 insoluble, respectivamente. para el subclon E de SRP14-LP derivado de LP y el subclon B de SRP14-HP derivado de HP (pistas S), o para los subclones de CHO que expresan una proteína GFP de control (pistas G). Las puntas de flecha muestran la LC libre mal procesada y la LC agregada (Agr.). (B) Se realizó un análisis de persecución de las diversas especies intermedias de ensamblaje de LC, HC e IgG producidas por el clon E de SRP14-LP y el clon E de control de LP y se muestran los resultados.

Fig. 11. Efecto de la expresión combinada de las subunidades SRP, SR y translocón sobre la secreción de inmunoglobulina

(A) Se volvió a transfectar un clon E de Infliximab LP con diversas combinaciones de vectores de expresión transponibles SRP, SR y translocón. A continuación, se evaluó la productividad específica de las agrupaciones de células resultantes en el cultivo por lotes y se representó como un % de los valores pcd de las células de control LP. Los diagramas de caja representan los cuartiles mediano, superior e inferior de las productividades específicas normalizadas determinadas el día 3 de ensayos de cultivos independientes. (B) El subclon E de células productoras de infliximab que expresan SRP14 se volvió a transfectar con diversas combinaciones de vectores de expresión transponibles SR y translocón. La productividad específica de las agrupaciones de células se representa como en el panel A.

Fig. 12. Modelo para el rescate de la secreción de Infliximab de clones que expresan SRP14

Modelo del plegamiento y la secreción de IgG por clones de baja producción antes (A) y después de la sobre-expresión de subunidades SRP/ Translocón (B). Los datos indican que el LC neosintetizado producido por clones de baja producción exhiben un procesamiento y un estado de plegamiento inadecuados. El procesamiento incorrecto del péptido señal de Infliximab LC puede conducir a la saturación de la maquinaria de translocación co-traduccional del ER (panel A, número 1). Su agregación en el ER dentro de formas de LC agregadas competentes de ensamblaje de IgG (panel A, número 2) induce estrés en el ER y desencadena la formación de una estructura similar a un autofagosoma (panel A, número 3). La sobre-expresión de SRP14 y otras proteínas componentes de SRP/translocón rescató por completo el procesamiento y la secreción de la IgG InflixiMab (panel B). La actividad de detención de elongación de SRP14 posiblemente retrasa la translocación de LC ER durante la traducción de su ARNm (panel B, número 1). Esto favorecería a su vez el correcto procesamiento del LC y su adecuada interacción con las chaperonas plegables del ER (panel B, número 2). El mantenimiento del LC neosintetizado en un estado de ensamblaje de IgG competente restaura así la secreción de alto rendimiento de anticuerpos completamente ensamblados (panel B, número 3).

Fig. 13. Efecto de la reducción de siARN de HR y NHEJ en la expresión

Diferencias de veces en el porcentaje de células positivas para GFP (con respecto a las células transfectadas con un plásmido de control de GFP que se muestra aquí como 1,0) que representan las frecuencias de eventos de recombinación en células no tratadas (mock), células tratadas con siARN negativo (siNeg), siARN contra factores NHEJ (siKu70+80+ADN-PKcs) y siARN anti-HR (siRad51). Las pistas de GFP muestran un control positivo de células que expresan GFP. El HR sin digerir y NHEJ sin digerir - las pistas marcadas muestran células de control negativo, es decir, células transfectadas con plásmidos indicadores circulares HR y NHEJ. Las pistas marcadas con HR I-Scel y NHEJ I-Scel indican células transfectadas con plásmidos indicadores escindidos con Scel que restauran la expresión de GFP tras la reparación de la escisión del ADN mediante recombinación homóloga o unión de extremos no homólogos, respectivamente. La figura muestra la eficacia del ARNsi para inhibir HR o NHEJ, como lo indica el porcentaje de células positivas para GFP, que se normalizó al porcentaje de células positivas para dsRed y se expresó como el cambio múltiplo de pliegue sobre el porcentaje de células de control GFP, que se estableció en 1. Media de 3 experimentos, las barras de error muestran el error estándar de la media. Significancia estadística determinada por el test t de Student para datos no apareados; nivel de significancia p < 0,05 (*) y p < 0,01 (**).

Fig. 14. Efecto de las MARs en la reducción de ARNsi de NHEJ

Se muestra el aumento múltiplo en la expresión e integración de GFP en células CHO tratadas con siARN contra factores NHEJ y retransfectadas con plásmidos GFP o MAR-GFP. La fluorescencia promedio de GFP, el número de copias y la fluorescencia por copia de GFP se muestran como un aumento de veces sobre el resultado obtenido de las células no tratadas (marcadas como 'mock (simuladas)') transfectadas con el plásmido GFP. A) Resultados de la citometría de flujo, B) análisis del número de copias de GFP en el genoma mediante qPCR, C) fluorescencia promedio de cada uno de los genes de GFP integrados (calculados para cada uno de los experimentos como una relación entre la expresión y el número de copias). Media de 3 o más experimentos; significancia estadística determinada por el test t de Student para datos no apareados. Los asteriscos indican diferencias significativas entre la muestra tratada con ARNsi y el control no tratado correspondiente; niveles de significancia: p < 0,05 (*), p < 0,01 (**); las barras de error muestran el error estándar de la media.

Fig. 15 Efecto de las MARs en la reducción de ARNsi de HR

El aumento múltiplo en la expresión e integración de GFP en células CHO tratadas con ARNsi contra factores HR y retransfectadas con plásmidos GFP o MAR-GFP. La fluorescencia promedio de GFP, el número de copias y la fluorescencia por copia de GFP se muestran como un aumento múltiplo sobre el resultado obtenido de células no tratadas (marcadas como 'mock (simuladas)') transfectadas con el plásmido GFP. A) Resultados de la citometría de flujo, B) análisis del número de copias de GFP en el genoma mediante qPCR, C) fluorescencia promedio de cada uno de los genes de GFP integrados (calculado para cada experimento como una relación entre la expresión y el número de copias). Media de 3 o más experimentos; significancia estadística determinada por el test t de Student para datos no apareados. Los asteriscos indican diferencias significativas entre la muestra tratada con ARNsi y el control no tratado correspondiente; niveles de significancia: p < 0,05 (*), p < 0,01 (**); las barras de error muestran el error estándar de la media.

Fig. 16. Efecto de las MARs en la reducción de ARNsi de MMEJ

La expresión e integración de GFP en células CHO tratadas con ARNsi contra factores MMEJ (y algunos factores HR) y retransfectadas con un plásmido GFP (A) o MAR-GFP (B). La fluorescencia promedio de GFP, el número de copias y la fluorescencia por copia de GFP se muestran como un aumento de veces sobre el resultado obtenido de células no tratadas (marcadas como '(mock)simuladas')) transfectadas con el plásmido GFP. Las figuras muestran los resultados de la citometría de flujo. Se muestra la media del número de experimentos indicados en la parte inferior. Las células transfectadas con siMDC1 expresaron GFP incluso sin MAR, a una tasa 11,8 veces más alta que las células no transfectadas con siMDC. También se pudieron lograr resultados particularmente buenos con determinados plásmidos que contenían MAR, a saber, siBard1 y siLigl.

Fig. 17. Efecto de la reducción de una proteína HR mediada por siARN

La figura muestra que se puede lograr una mayor expresión de GFP e inmunoglobulina a partir de células CHO-M que expresan de manera estable un shARN (siglas inglesas de ARN pequeño de horquilla) dirigido por Rad51. Células CHO-M se transfectaron con un vector de expresión de shARN Rad51 transponible derivado de PiggyBac, y la agrupación de células policlonales, así como los clones de células derivados del mismo, se volvieron a transfectar con un plásmido de expresión de GFP junto con las células CHO-M parentales. La fluorescencia de GFP de CHO-M parental, de la agrupación de células que expresan shARN de Rad51 y de los clones derivados se evaluó 10 días después de la selección para determinar la expresión estable de los genes de resistencia a GFP y puromicina. Los perfiles de fluorescencia de dos de los clones más fluorescentes se muestran junto a los de la agrupación de células y las células parentales (A), así como el porcentaje de células en los sectores M1, M2 y M3 10 días después de la selección por resistencia a la puromicina (B), como se muestra en las barras horizontales marcadas como 1,2 y 3 en el panel A. Se siguió la proporción de células M3 de alta expresión durante 68 días de cultivo adicional sin selección para mostrar que se puede obtener una expresión más alta y más estable de los clones celulares que expresan shARN en comparación con las células CHO_M parentales (C). Alternativamente, se transfectaron plásmidos de expresión que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo Infliximab en clones representativos, y se evaluó la productividad específica de la inmunoglobulina secretada después de la selección durante tres semanas de cultivo adicional sin antibiótico.

Figura 18 Efecto de diversas MARs aguas arriba recombinantes humanos en el percentil alto y muy alto (% M3/M2) ^{de células productoras, de acuerdo con lo evaluado para la fluorescencia de GFP mediante análisis} F^aC^{s en una construcción de dos m}A^r. ^{(A) Los elementos MAR fueron derivados reorganizados de MAR X-29 (X_29R2 (SEQ ID NO:} 9), X_29R3 (SEQ ID NO: 10), MAR 1-42 (1_42R2Bis, 1_42R3), MAR 1-6 (1_6R2 (SEQ ID NO: 8), 1_6R3) o MAR 1-68 (1_68R2 (SEQ ID NO: 7), como se indica en los nombres de las construcciones. (B) Perfiles FACS típicos obtenidos para los mejores elementos MAR aguas arriba (MAR 1_68R (SEQ ID NO: 6)).

Fig. 19 Estabilidad de la expresión en un vector de dos MARs

Poblaciones policlonales construidas a partir de vectores que contenían los derivados de MAR 1_68R2, 1_6R2 y X_29R3 se testaron durante un período de 5 semanas de cultivo sin selección y la fluorescencia de GFP se evaluó semanalmente durante este período. Se evaluó el percentil de la subpoblación M3: el elemento 1_6R2 como el MAR aguas arriba y el MAR 1-68 no reorganizado como el MAR aguas abajo fueron la mejor combinación testada de vector con dos MARs. También se muestran las subpoblaciones M1 y M2.

Fig. 20. Vectores de expresión que contienen un solo elemento genético

MAR 1_68 y X_29 se testaron y utilizaron en combinación con el replicador LmnB2. Las MARs se colocaron aguas abajo del casete de expresión transgénica y se evaluaron en un ensayo de transfección transgénica a lo largo de un período de dos meses. La población policlonal de células transfectadas de forma estable se seleccionó por su resistencia a los antibióticos durante dos semanas y se testó la fluorescencia de GFP mediante análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) durante siete semanas. La proporción de células M3 de alto productor se muestra en (A), mientras que los perfiles típicos de FACS se muestran en (B).

Fig. 21. Vectores de expresión que contienen un solo elemento genético: X-29

Ensayo de estabilidad del vector X_29: el vector de expresión que contiene un solo X_29 aguas abajo del casete de expresión se demuestra que es estable y da un percentil muy alto de subpoblaciones M2 y M3 incluso después de 14 semanas de cultivo (27 pasajes).

Fig. 22. Análisis comparativo de poblaciones de CHO transfectadas de forma estable después de 24 semanas de selección de antibióticos

Un vector con una sola X_29 MAR aguas abajo del casete de expresión (Puro_CGAPD_GFP_gastrina_X29) aumenta la aparición de células que expresan GFP alta y también la estabilidad de la expresión a lo largo del tiempo en comparación con el vector con dos MARs con 1_682 como MAR aguas arriba y 1_68 como MAR aguas abajo (Pu ro_1 _6 R2_CGAPD_GFP_gastrina_1 _68).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE DIVERSAS REALIZACIONES PREFERIDAS

Un transgén, tal como se utiliza en el contexto de la presente invención, es una secuencia de desoxirribonucleótido (ADN) aislado que codifica una proteína madura dada (a la que también se alude en esta memoria como ADN que codifica una proteína), una proteína precursora o un ARN funcional que no codifica una proteína (ARN no codificante). Se aísla un transgén y se introduce en una célula para producir el producto transgénico. Algunos transgenes preferidos de acuerdo con la presente invención son transgenes que codifican inmunoglobulinas (Igs) y proteínas de fusión Fc y otras proteínas, en particular proteínas con actividad terapéutica ("bioterapéuticos"). Por ejemplo, determinadas inmunoglobulinas tales como Infliximab (Remicade) u otras proteínas secretadas tales como el factor VIII de la coagulación son notablemente difíciles de expresar debido a cuellos de botella celulares en su mayoría no caracterizados. Con ayuda de las moléculas de ácido nucleico recombinante, vectores y métodos de la presente invención, estos cuellos de botella pueden identificarse y/o abrirse. Esto aumenta generalmente la cantidad de proteínas terapéuticas que se pueden producir y/o su calidad tal como, p. ej., su procesamiento y la homogeneidad de las modificaciones postraduccionales tales como la glicosilación.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término transgén, en el contexto de un ADN que codifica una proteína, no incluirá regiones flanqueantes no transcritas tales como señales de iniciación de la transcripción de ARN, sitios de adición de poliadenilación, promotores o potenciadores. Otros transgenes preferidos incluyen secuencias de ADN que codifican ARNs funcionales. Por lo tanto, el término transgén se utiliza en el presente contexto cuando se hace referencia a una secuencia de ADN que se introduce en una célula, tal como una célula huésped eucariótica, mediante transfección (lo que incluye en el contexto de la presente invención también la transducción, es decir, la introducción a través de vectores virales) y que codifica el producto de interés al que también se alude en esta memoria como el "producto de expresión transgénica", p. ej., "proteínas heterólogas". El transgén podría fijarse funcionalmente a una secuencia codificante de péptido señal, que codifica un péptido señal que a su vez media en y/o facilita la translocación y/o secreción a través del retículo endoplasmático y/o la membrana citoplasmática y se elimina antes o durante la secreción.

Los ARN de interferencia pequeños (siARN) son moléculas de ARN de doble cadena, generalmente de 20-25 pares de bases de longitud, que juegan un papel en la interferencia de ARN (ARNi) al interferir con la expresión de genes específicos con secuencia de nucleótidos complementaria. Un ARNsi puede introducirse directamente en las células o puede expresarse en la célula a través de un vector. Un siARN de TEP aislado como se menciona en esta memoria es un siARN de 20-25 pares de bases de longitud que habitualmente se introduce directamente en la célula, es decir, sin expresarse a través de un ácido nucleico que ha sido introducido en la célula.

Un ARN de horquilla pequeño/corto (shARN) es una secuencia de ARN que hace un giro de horquilla cerrado que se puede utilizar para silenciar la expresión del gen diana a través de ARNi. La expresión de shARN en las células se logra típicamente mediante la administración de plásmidos o vectores virales tales como vectores retrovirales. Para crear shARN, una secuencia de siARN se modifica habitualmente para introducir un bucle corto entre las dos cadenas del siARN. Luego, un ácido nucleico que codifica el shARN se administra a través de un vector a la célula y se transcribe en ARN de horquilla corta (shARN), que puede ser procesado en un siARN funcional por Dicerin de la manera habitual.

Un si/shARN es capaz de reducir de forma específica la secuencia de la expresión de un gen diana. El shARN se puede hibridar a una región de un transcrito de ARNm que codifica el producto del gen diana, inhibiendo con ello la expresión del gen diana a través del ARN de interferencia. Los shARN bifuncionales tienen más de una diana, p. ej., la región codificante, así como determinadas regiones no traducidas de un ARNm. La integración en el genoma celular facilita el silenciamiento génico constitutivo o de larga duración que puede transmitirse a las células de la progenie.

Un microARN (miARN) es una molécula de ARN pequeña, p. ej., de 20 a 24, en particular de 22 nucleótidos de longitud, que funciona en la regulación transcripcional y post-transcripcional de la expresión génica a través del emparejamiento con secuencias complementarias dentro de los ARNm. El silenciamiento génico puede ocurrir a través de la inhibición de la transcripción transgénica, la degradación del ARNm o la prevención de la traducción del ARNm. Los miARN se pueden expresar mediante el suministro de plásmidos o vectores virales tales como vectores retrovirales. Alternativamente, las moléculas de ARN que inhiben o imitan miARN pueden sintetizarse y transfectarse directamente en las células.

Una "Secuencia que codifica una proteína de procesamiento de expresión transgénica (TEP) o ARN funcional de TEP" permite la expresión o la expresión incrementada de la proteína TEP dada después de su transferencia a una célula, mientras que la secuencia que codifica un ARN funcional no codificante inhibe la expresión de proteínas celulares, respectivamente. Las proteínas TEP pueden ser idénticas o similares a las proteínas celulares, o pueden ser proteínas de una célula o especie distinta. Las proteínas celulares cuya expresión es inhibida, p. ej., por ARN funcionales son proteínas constituyentes de la célula en la que se introducen los ARN funcionales. La proteína TEP también puede complementar la expresión de otra proteína celular y como resultado, preferiblemente, potenciar la expresión de un transgén. Las proteínas pueden estar implicadas en la recombinación; en procesos de traducción de ARNm; en la translocación del ER, en la secreción, el procesamiento o plegamiento de polipéptidos, en el transporte ER-Golgimembrana plasmática, glicosilación y/u otra modificación post-traduccional. ARN funcionales incluyen, p. ej., siARN, shARN, microARN, ARN cortado y empalmado en forma de lazo, ARN de sentido temporal corto (stARN), ARN antisentido (ARNa), ARN de ribozima y otros ARN, en particular aquellos que pueden reducir la expresión del gen diana. En una realización preferida particular, estas proteínas están implicadas en "La vía de secreción de Proteínas" o en "Las vías de Recombinación", pero también incluyen determinadas proteínas de procesamiento o proteínas metabólicas como se describe a más adelante.

ARNs funcionales de TEP no solo pueden expresarse a partir de una secuencia de ácido nucleico como se describe arriba, sino que pueden introducirse directamente en la célula. Esto, en particular, es cierto para los siARN de TEP aisladas.

La expresión una "molécula de ácido nucleico aislada" en el contexto de la presente invención es equivalente a una "molécula de ácido nucleico recombinante", es decir, una molécula de ácido nucleico que no existe en esta forma en la naturaleza, pero que ha sido construida a partir de partes que existen en la naturaleza.

Una secuencia de ácido nucleico, tal como ADN o ARN, es complementaria a otro ADN o ARN, si los nucleótidos de, p. ej., dos cadenas de ADN sencillas se mantienen o dos cadenas de ARN sencillas pueden formar enlaces hidrógeno estables tal como un enlace hidrógeno entre guanina (G) con citosina (C). En la célula, el apareamiento de bases complementarias permite, p. ej., que las células copien información de una generación a otra. En el ARN de interferencia (iARN), el apareamiento de bases complementarias permite silenciar o eliminar por completo determinados genes diana. Esencialmente, la secuencia de siARN, shARN o miARN reduce o elimina específicamente la expresión de un gen diana al tener una sola cadena de ARN (p. ej., la cadena antisentido en siARN) alineada con el ARN, en particular el ARNm de la célula huésped. El grado de complementariedad entre dos cadenas de ácido nucleico puede variar, desde la complementariedad completa (cada uno de los nucleótidos está enfrente de su opuesto) hasta la complementariedad parcial (50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %). El grado de complementariedad determina la estabilidad del complejo y, por lo tanto, el éxito con el que se puede inactivar un gen, p. ej. Por lo tanto, se prefieren una complementariedad completa o de al menos un 95%.

La actividad de los siARN en iARN depende en gran medida de su capacidad de unión al complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC, por sus siglas en inglés). A la unión del siARN dúplex a RISC le sigue el desenrollamiento y la escisión de la cadena sentido con endonucleasas. El complejo cadena antisentido-RISC restante puede unirse a los ARNm diana para iniciar el silenciamiento transcripcional.

Dentro del contexto de la presente invención, los transgenes, como se define anteriormente, expresan generalmente proteínas cuya producción en grandes cantidades se desea, p. ej., para uso farmacéutico, mientras que las secuencias que codifican proteínas TEP/ARNs funcionales, o los propios ARNs funcionales, están diseñados para ayudar a la expresión de transgenes de este tipo ya sea directa o indirectamente. En la TABLA A se incluye una "lista ejemplar de proteínas TEP expresadas utilizando vectores de transposones". Como apreciará la persona experta en la técnica, la inmensa mayoría de estas proteínas se ha descrito en la técnica y la Tabla A describe tanto los números de secuencia de referencia del NCBI para las proteínas respectivas como la secuencia de ácido nucleico que las codifica. La última columna proporciona identificadores de secuencia para algunas de esas secuencias.

En la TABLA B se incluye una "lista ejemplar de shARN expresados utilizando, p. ej., vectores de transposón piggybac específicos". Como apreciará la persona experta en la técnica, shARN de este tipo se pueden construir fácilmente cuando se ha seleccionado un gen diana. Por ejemplo, uno cualquiera de los genes conocidos de la vía de recombinación es un gen diana listo para usar. Sin embargo, otros genes, tales como los genes para las proteínas recogidas en la Tabla A, pueden ser dianas listas para los siARN generados a partir de esos shARN. La TABLA C es una lista de ejemplos de siARN (cadena sentido) y ejemplos de shARN creados a partir de los correspondientes siARN. La cadena antisentido del siARN se utiliza finalmente para bloquear y/o provocar la degradación de un ARNm celular. Esto conduce generalmente a niveles reducidos de la proteína codificada por el ARNm.

Identidad significa el grado de relación de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos según se determina por la identidad de la coincidencia entre dos cadenas de secuencias de este tipo, tales como la secuencia entera y completa. La identidad se puede calcular fácilmente. Si bien existe un cierto número de métodos para medir la identidad entre dos secuencias de nucleótidos, el término "identidad" es bien conocido por los expertos (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje , G., Academic Press, 1987 y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991). Métodos comúnmente empleados para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a los descritos en Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, y Carillo, H. y Lipman, D., SIAM J Applied Math. 48: 1073 (1988). Métodos preferidos para determinar la identidad están diseñados para dar la mayor coincidencia entre las dos secuencias testadas. Métodos de este tipo están codificados en programas informáticos. Métodos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan al paquete de programas GCG (Genetics Computer Group, Madison Wis.) (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1). 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Altschul et al. (1990); Altschul et al. (1997)). El conocido algoritmo de Smith Waterman también se puede utilizar para determinar la identidad.

Como ilustración, por un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos, por ejemplo, 95 % de "identidad" con una secuencia de nucleótidos de referencia significa que la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia de nucleótidos puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un nucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos idéntica en al menos un 95 % a una secuencia de nucleótidos de referencia, se puede eliminar o sustituir hasta el 5 % de los nucleótidos de la secuencia de referencia con otro nucleótido, o un número de nucleótidos de hasta el 5% del total de nucleótidos en la secuencia de referencia puede insertarse en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

Una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad sustancial con otra secuencia de ácido nucleico se refiere a una secuencia que tiene mutaciones, deleciones o adiciones puntuales en su secuencia que tienen una influencia marginal o nula en el método respectivo descrito y, a menudo, se refleja en uno, dos, tres o cuatro mutaciones en 100 bps. Una "variante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que difiere del polinucleótido o polipéptido descrito, pero que conserva sus propiedades esenciales. Generalmente, las variantes son, en general, muy similares y en muchas regiones, idénticas al polinucleótido o polipéptido de la presente invención.

Las variantes pueden contener alteraciones en las regiones codificantes, las regiones no codificantes o ambas. Son especialmente preferidas variantes de polinucleótidos que contienen alteraciones que producen sustituciones, adiciones o deleciones silenciosas, pero que no alteran las propiedades o actividades del polipéptido codificado. Se prefieren variantes de nucleótidos producidas por sustituciones silenciosas debidas a la degeneración del código genético. Además, también se prefieren las variantes en las que se sustituyen, eliminan o añaden en cualquier combinación 5-10, 1-5 o 1-2 aminoácidos descritos en esta memoria.

La invención también abarca variantes alélicas de dichos polinucleótidos. Una variante alélica designa cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación y puede resultar en polimorfismo dentro de las poblaciones. Las mutaciones genéticas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

Una secuencia de promotor o simplemente un promotor es una secuencia de ácido nucleico que es reconocida por una célula huésped para la expresión de una secuencia de ácido nucleico específica. La secuencia de promotor contiene secuencias de control transcripcional que regulan la expresión del polinucleótido. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico que muestre actividad transcripcional en la célula huésped elegida, incluyendo los promotores mutantes, truncados e híbridos, y puede obtenerse de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares homólogos o heterólogos a la célula huésped. Promotores de acuerdo con la presente invención incluyen promotores inducibles y no inducibles. Una secuencia de ácido nucleico está bajo el control de un promotor si el promotor ejerce su función sobre dicho ácido nucleico.

CGAPDH (a la que también se alude en esta memoria como C_GAPDH) es una fusión de potenciador-promotor, que comprende el promotor GAPDH humano y el potenciador del gen temprano inmediato del CMV humano. En una realización, para producirlo, el promotor GAPDH humano y su UTR 5’ se amplificaron mediante PCR a partir de ADN genómico de células HEK293 humanas. El producto se colocó aguas abajo del potenciador génico temprano inmediato de CMV humano. Véase la SEQ ID NO: 11 para una secuencia representativa. Secuencias que tienen al menos 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 11 también están dentro del alcance de la presente invención. Otro(s) promotor(es= y/o potenciador(es) deseable(s) o fusiones de los mismos son, pero no se limitan al potenciador CMV IE, el promotor GAPDH humano, el promotor humano Ef1 alfa, el promotor CMV, el promotor SV40, el promotor CHO Actb o el promotor CHO Hspa5. Estos elementos son bien conocidos en la técnica y las secuencias de muestra se enumeran bajo las SEQ ID NOs: 110 a 116.

Un "transposón" es un elemento genético móvil que se transpone eficientemente entre vectores y cromosomas a través de un mecanismo de "cortar y pegar" o "copiar y pegar". Durante la transposición, la transposasa (p. ej., la transposasa PB en el sistema de transposones PiggyBac) reconoce las secuencias repetidas terminales invertidas (ITRs, por sus siglas en inglés) específicas del transposón ubicadas en ambos extremos del transposón (existe una ITR 5' y 3' para cualquier sistema de transposón) y mueve los contenidos de los sitios originales y los integra en sitios cromosómicos tales como los sitios cromosómicos TTA^a . La poderosa actividad del sistema de transposones PiggyBac permite que los genes de interés entre las dos ITRs se movilicen fácilmente en genomas diana. El sistema de transposones PiggyBac se describe, p. ej., en 2010/0154070.

Los elementos MAR (construcciones MAR, secuencias MAR, S/MAR o simplemente MAR) pertenecen a un grupo más amplio de elementos reguladores epigenéticos que también incluyen elementos límite o aislantes tales como cHS4, regiones de control de locus (LCRs), elementos estabilizadores y antirrepresores (STAR), elementos de apertura de la cromatina de acción ubicua (UCOE) o modificadores de histonas tales como la histona desacetilasa (HDAC).

Los elementos MAR pueden definirse en función del MAR identificado en el que se basan principalmente: Una construcción MAR S4 es, por consiguiente, un elemento MAR cuya mayoría de nucleótidos (50 % más, preferiblemente 60 %, 70 % u 80 %) se basan en MAR S4. Varios motivos de secuencia simple tales como un alto contenido de A y T se han encontrado a menudo dentro de las MARs. Otros motivos que se encuentran comúnmente son el A-box, el T-box, motivos de desenrollamiento de ADN, sitios de unión a SATB1 (H-box, A/T/C25) y sitios consenso de topoisomerasa II para vertebrados o Drosophila.

Las MARs se caracterizan generalmente como secuencias en el ADN de cromosomas eucarióticos donde se une la matriz nuclear. Las propiedades de MAR están definidas, solo en parte, por su estructura primaria. Por ejemplo, se sabe que una estructura primaria típica que se encuentra en los elementos MAR tales como las regiones ricas en AT da como resultado estructuras terciarias, a saber, en determinadas curvaturas que definen la función de la MAR. Por lo tanto, las MARs se definen a menudo no solo por su estructura primaria, sino también por su estructura secundaria y terciaria, p. ej., su grado de curvatura y/o propiedades físicas tales como la temperatura de fusión.

Una región de ADN plegada rica en dinucleótidos AT/TA (en lo sucesivo denominada "región rica en AT"), como se encuentra comúnmente en los elementos MAR, es una región de ADN plegada que comprende un gran número de As y Ts, en particular en forma de los dinucleótidos AT y TA. En una realización preferida, contiene al menos un 10 % de dinucleótido TA, y/o al menos un 12 % de dinucleótido AT en un tramo de 100 pares de bases contiguos, preferiblemente al menos un 33 % de dinucleótido TA y/o al menos un 33 % de dinucleótido AT en un tramo de 100 pares de bases contiguos (o en un tramo más corto respectivo cuando la región rica en AT es de longitud más corta), mientras que tiene una estructura secundaria plegada. Sin embargo, las "regiones ricas en AT" pueden ser tan cortas como de aproximadamente 30 nucleótidos o menos, pero preferiblemente son de aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 75 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos, aproximadamente 150, aproximadamente 200, aproximadamente 250, aproximadamente 300, aproximadamente 350 o aproximadamente 400 nucleótidos de longitud o más.

Algunos sitios de unión también tienen a menudo un contenido de A y T relativamente alto, tales como los sitios de unión de SATB1 (H-box, A/T/C25) y los sitios consenso de Topoisomerasa II para vertebrados (RNYNNCNNGYNGKTNYNY) o Drosophila (GTNWAYATTNATNNR). Sin embargo, una región del sitio de unión (módulo), en particular una región TFBS, que comprende un grupo de sitios de unión, puede distinguirse fácilmente de las regiones ricas en dinucleótidos AT y TA ("regiones ricas en AT") de los elementos MAR con alto contenido de A y contenido de T por una comparación del patrón de plegamiento de las regiones. Por ejemplo, para MAR 1_68 humana, esta última podría tener un grado medio de curvatura superior a aproximadamente 3,8 o aproximadamente 4,0, mientras que una región TFBS podría tener un grado medio de curvatura por debajo de aproximadamente 3,5 o aproximadamente 3,3. Las regiones de una MAR identificada también se pueden determinar por medios alternativos tales como, pero no limitados a temperaturas de fusión relativas, como se describe en otra parte de esta memoria. Sin embargo, valores de este tipo son específicos para la especie y, por lo tanto, pueden variar de una especie a otra y, p. ej., pueden ser más bajos. Por lo tanto, las respectivas regiones ricas en dinucleótidos AT y TA pueden tener grados de curvatura más bajos, tales como de aproximadamente 3,2 a aproximadamente 3,4 o de aproximadamente 3,4 a aproximadamente 3,6 o de aproximadamente 3,6 a aproximadamente 3,8, y las regiones TFBS pueden tener grados de curvatura proporcionalmente más bajos, tal como por debajo de aproximadamente 2,7, por debajo de aproximadamente 2,9, por debajo de aproximadamente 3,1, por debajo de aproximadamente 3,3. En SMAR Scan II, el experto seleccionará respectivamente tamaños de ventana más bajos.

Un elemento MAR, una construcción MAR, una secuencia MAR, un S/MAR o simplemente un MAR de acuerdo con la presente invención es una secuencia de nucleótidos que comparte una o más (tal como dos, tres o cuatro) características como las arriba descritas con un "SAR" o "MAR" que se produce de forma natural. Preferiblemente, un elemento MAR, una construcción MAR, una secuencia MAR, un S/MAR o simplemente una MAR de este tipo tiene al menos una propiedad que facilita la expresión de la proteína de cualquier gen influenciado por dicha MAR. Un elemento MAR tiene generalmente también la característica de ser un ácido nucleico aislado y/o purificado que exhibe preferiblemente actividad MAR, en particular, exhibe modulación de la transcripción, preferiblemente actividad de mejora, pero también exhibe, p. ej., actividad de estabilización de la expresión y/u otras actividades.

Las expresiones elemento MAR, construcción MAR, secuencia MAR, S/MAR o simplemente MAR también incluyen, en determinadas realizaciones, construcciones MAR potenciadas que tienen propiedades que constituyen una mejora sobre una MAR natural y/o identificada en la que se puede basar una construcción MAR de acuerdo con la presente invención. Propiedades de este tipo incluyen, pero no se limitan a longitud reducida en relación con la MAR que se produce de forma natural y/o identificada de longitud completa, mejora de la transcripción/expresión génica, mejora de la estabilidad de la expresión, especificidad tisular, inducibilidad o una combinación de las mismas. Por consiguiente, un elemento MAR que está mejorado puede, p. ej., comprender menos de aproximadamente 90 %, preferiblemente menos de aproximadamente 80 %, incluso más preferiblemente menos de aproximadamente 70 %, menos de aproximadamente 60 % o menos de aproximadamente 50 % del número de nucleótidos de una secuencia MAR identificada. Un elemento MAR puede potenciar la expresión génica y/o la transcripción de un transgén tras la transformación de una célula apropiada con dicha construcción.

Preferiblemente, un elemento MAR se inserta aguas arriba de una región de promotor a la que está o puede estar unido operativamente un gen de interés. Sin embargo, en determinadas realizaciones, es ventajoso que un elemento MAR esté ubicado aguas arriba así como aguas abajo o simplemente aguas abajo de una secuencia de gen/ácido de nucleótido de interés. Otras disposiciones MAR múltiples tanto en cis como en trans también están dentro del alcance de la presente invención.

Sintético, cuando se utiliza en el contexto de un elemento MAR, se refiere a una MAR cuyo diseño implicó más que una simple transposición, duplicación y/o deleción de secuencias/regiones o regiones parciales, de MARs identificadas o MARs basadas en ellas. En particular, las MARs sintéticas/elementos MAR comprenden generalmente una o más, preferiblemente una región de una MAR identificada que, sin embargo, podría sintetizarse o modificarse en determinadas realizaciones, así como elementos bien caracterizados y diseñados específicamente, como un solo o una serie de TFBSs que, en una realización preferida, se producen sintéticamente. Estos elementos de diseño son en muchas realizaciones relativamente cortos, en particular, generalmente no tienen más de aproximadamente 300 pbs de longitud, preferiblemente no más de aproximadamente 100, aproximadamente 50, aproximadamente 40, a aproximadamente 30, aproximadamente 20 o aproximadamente 10 pbs de longitud. Estos elementos pueden, en determinadas realizaciones, estar multimerizados. Elementos MAR sintéticos de este tipo también son parte de la presente invención y debe entenderse que, en general, la presente descripción puede entenderse que cualquier cosa que se diga que se aplica a un "elemento MAR" se aplica igualmente a un elemento MAR sintético.

Fragmentos funcionales de secuencias de nucleótidos de elementos MAR identificados también se incluyen siempre que mantengan las funciones de un elemento MAR como se describe arriba.

Algunos elementos MAR identificados preferidos incluyen, pero no se limitan a MAR 1_68, MAR X_29, MAR 1_6, MAR S4, MAR S46, incluyendo todas sus permutaciones tal como se describe en el documento WO2005040377 y la publicación de patente de EE.UU. 20070178469.

La lisozima MAR de pollo también es una realización preferida (véase la Patente de EE.UU. N° 7.129.062).

Si se dice que un vector comprende una MAR singular, esto significa que en este vector existe una MAR y no existen otras MARs dentro del vector, ya sea del mismo o diferente tipo o estructura. En determinadas realizaciones de la invención, existen múltiples MARs que pueden ser del mismo tipo o estructura o de diferente tipo y que pueden estar ubicadas aguas abajo de un gen de interés. Esto se llama un grupo MAR singular.

Si se dice que algo, tal como un número de células que expresan de manera estable un polipéptido, es "independiente" de la presencia de, p. ej., una secuencia, entonces la secuencia no influye (p. ej., el número de células que expresan de manera estable un polipéptido) en cualquier medida estadísticamente significativa. Un transgén o secuencia que codifica una proteína de procesamiento de la expresión de transgén o ARN funcional de la presente invención es a menudo parte de un vector.

Un vector de acuerdo con la presente invención es una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico, tal como un transgén, que ha de ser expresado por este vector, al que se ha unido, generalmente en el que se ha integrado. Por ejemplo, un plásmido es un tipo de vector, un retrovirus o lentivirus es otro tipo de vector. En una realización preferida de la invención, el vector se lineariza antes de la transfección. Un vector de expresión comprende elementos reguladores o está bajo el control de elementos reguladores de este tipo que están diseñados para fomentar la transcripción y/o expresión de una secuencia de ácido nucleico transportada por el vector de expresión. Elementos reguladores comprenden potenciadores y/o promotores, pero también una diversidad de otros elementos descritos en esta memoria (véase también "Diseño del Vector").

La secuencia de vector de un vector es la secuencia de ADN o ARN del vector excluyendo cualquier "otro" ácido nucleico tal como transgenes, así como elementos genéticos tales como elementos MAR.

Una célula eucariótica, que incluye una célula de mamífero, tal como una célula huésped recombinante de mamífero/célula eucariótica, de acuerdo con la presente invención es capaz de mantenerse en condiciones de cultivo celular. Ejemplos no limitativos de este tipo de células son células huésped eucarióticas no de primates, tales como células de ovario de hámster chino (CHOs) y células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10). Las células huésped eucarióticas de primates incluyen, p. ej., células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2) y la línea CV1 de riñón de mono transformada con SV40 (COS-7, ATCC CRL-1587). Una célula huésped eucariótica recombinante o célula de mamífero recombinante significa una célula que ha sido modificada, p. ej., mediante transfección con, p. ej., una secuencia transgénica y/o por mutación. Las células huésped eucarióticas o las células recombinantes de mamífero son capaces de realizar modificaciones postranscripcionales de las proteínas expresadas por dichas células. En determinadas realizaciones de la presente invención, el homólogo celular de la célula huésped eucariótica (p. ej., no de primate) es totalmente funcional, es decir, no ha sido, p. ej., inactivada por mutación. Más bien, la secuencia transgénica (p. ej., primate) se expresa además de su equivalente celular (p. ej., no primate).

Transfección de acuerdo con la presente invención es la introducción de un ácido nucleico en una célula eucariótica receptora, tal como, pero no limitado a por electroporación, lipofección, generalmente a través de un vector no viral (transfección mediada por vector) o por medios químicos que incluyen aquellos que implican a lípidos policatiónicos. La transfección no mediada por vector incluye, por ejemplo, la introducción directa de un ARNsi de TEP aislado en una célula. En una célula transfectada de forma transitoria, por ejemplo, el siARN solo permanece de forma transitoria. En el contexto de la presente invención, puede haber una primera transfección con al menos una molécula de ácido nucleico con una secuencia que codifica una proteína de procesamiento de expresión transgénica (TEP) o un ARN funcional de TEP o, alternativamente, directamente con un ARN funcional de TEP (por ejemplo, un siARN) y una segunda transfección posterior con un ácido nucleico que codifica el transgén. Tanto la primera como la segunda transfección pueden repetirse. El, por ejemplo, siARN que se introduce durante la primera transfección, actúa, en particular inhibe, una proteína de recombinación (una proteína que está involucrada en los eventos de recombinación en la célula transfectada). Después de esto, el transgén se introduce durante la segunda transfección posterior.

Transcripción significa la síntesis de ARN a partir de un molde de ADN. “Transcripcionalmente activo” se refiere, p. ej., a un transgén que se está transcribiendo. Traducción es el proceso por el cual el ARN produce proteínas.

Se mide un aumento de la secreción en relación con un valor obtenido de una célula de control que no comprende la secuencia transgénica respectiva. Cualquier mejora estadísticamente significativa en relación con el valor de un control califica como una promoción.

Un marcador de selección es un ácido nucleico que contiene un gen cuyo producto confiere resistencia a un agente de selección antibiótico (p. ej., cloranfenicol, ampicilina, gentamicina, estreptomicina, tetraciclina, kanamicina, neomicina, puromicina) o la capacidad de crecer en medios selectivos (p. ej., DHFR (dihidrofolato reductasa).

La clase de proteínas conocidas como chaperonas se ha definido como una proteína que se une a y estabiliza un confórmero de otro modo inestable de otra proteína y, mediante la unión y liberación controladas, facilita su destino correcto in vivo, ya sea plegamiento, ensamblaje oligomérico, transporte a un compartimiento subcelular particular o eliminación por degradación. BiP (también conocida como GRP78, proteína de unión a cadena pesada de Ig y Kar2p en levaduras) es una chaperona abundante de aproximadamente 70 kDa de la familia hsp 70, residente en el retículo endoplasmático (ER) que, entre otras funciones, sirve para ayudar en el transporte en el sistema secretor y plegar proteínas. La proteína disulfuro isomerasa (PDI) es una proteína chaperona residente en el ER que está implicada en la catálisis de la formación de enlaces disulfuro durante el procesamiento post-traduccional de las proteínas.

INGENIERÍA METABÓLICA CELULAR

En la ingeniería metabólica celular, p. ej., se alteran los procesos inherentes en la célula que se expresa. Por ejemplo, determinadas proteínas de la vía de secreción están, p. ej., sobre-expresadas. Alternativamente, los eventos de recombinación se alteran al influir en las vías de recombinación.

LA VÍA DE SECRECIÓN DE PROTEÍNAS

La secreción de proteínas es un proceso común a los organismos de los tres reinos. Esta vía de secreción compleja requiere sobre todo la translocación de proteínas desde el citosol a través de la membrana citoplasmática de la célula. Se requieren múltiples etapas y una diversidad de factores para que la proteína llegue a su destino final. En las células de mamíferos, esta vía de secreción implica dos ensamblajes macromoleculares principales, la partícula de reconocimiento de señales (SRP, por sus siglas en inglés) y el complejo secretor (complejo Sec o translocón). La SRP está compuesta por seis proteínas con masas de 9, 14, 19, 54, 68 y 72 kDa y un ARN 7S y el translocón es una partícula en forma de rosquilla compuesta por Sec61 apY, Sec62 y Sec63. Los números de acceso (entre paréntesis) para la versión humana de algunas de estas proteínas son los siguientes: hSRP14 (Acc. N° X73459.1); hSRP9 (NM_001130440); hSRP54 (NM_003136 ); hSRPRa (NM_003139); hSRPRp (NM_021203); hSEC61a1 (NM_013336); hSEC61 p (L25085.1); hSEC61Y (AK311845.1).

La primera etapa en la secreción de proteínas depende de los péptidos señal, que comprenden una secuencia de péptidos específica en el extremo amino del polipéptido que media en la translocación de la proteína naciente a través de la membrana y hacia la luz del retículo endoplasmático (ER). Durante esta etapa, el péptido señal que emerge del ribosoma de traducción principal interactúa con la subunidad de la partícula SRP que reconoce el péptido señal, a saber, SRP54. La unión de SRP al péptido señal bloquea el alargamiento adicional del polipéptido naciente, lo que da como resultado la detención de la traducción. Las proteínas SRP9 y -14 son necesarias para la detención del alargamiento (Walter y Blobel 1981) . En una segunda etapa, el complejo ribosoma-polipéptido naciente-SRP se acopla a la membrana del ER mediante la interacción de SRP54 con el receptor SRP (SR) (Gilmore, Blobel et al. 1982; Pool, Stumm et al. 2002). El SR es un complejo heterodimérico que contiene dos proteínas, SRa y SRp, que exhiben actividad GTPasa (Gilmore, Walter et al.

1982) . La interacción de SR con SRP54 depende de la unión de ^g T^p (Connolly, Rapiejko et al. 1991). El SR coordina la liberación de SRP del complejo ribosoma-polipéptido naciente y la asociación del sitio de salida del ribosoma con el complejo Sec61 (translocón). El polipéptido naciente en crecimiento se introduce en el ER a través del canal de translocón y la traducción se reanuda a su velocidad normal. El ribosoma permanece unido a la cara citoplasmática del translocón hasta que se completa la traducción. Además de los ribosomas, los translocones están estrechamente asociados con la riboforina en la cara citoplasmática y con chaperonas, tales como calreticulina y calnexina, y las proteínas disulfuro isomerasas (PDI) y la oligosacaril transferasa en la cara luminal. Después de la extrusión del polipéptido naciente en crecimiento hacia la luz del ER, el péptido señal se escinde de la pre-proteína mediante una enzima denominada peptidasa señal, liberando con ello la proteína madura en el ER. Después de la modificación post-traduccional, el plegamiento correcto y la multimerización, las proteínas abandonan el ER y migran al aparato de Golgi y luego a las vesículas secretoras. La fusión de las vesículas secretoras con la membrana plasmática libera el contenido de las vesículas en el entorno extracelular.

Sorprendentemente, las proteínas secretadas han evolucionado con secuencias señal particulares que son muy adecuadas para su propia translocación a través de la membrana celular. Las diversas secuencias encontradas como péptidos señal distintos podrían interactuar en formas únicas con el aparato de secreción. Las secuencias señal son de naturaleza predominantemente hidrófoba, una característica que puede estar implicada en la dirección del péptido naciente hacia las proteínas secretoras. Además de un tramo hidrófobo de aminoácidos, señales de secreción de mamíferos comparten un cierto número de características de secuencia comunes. Los diferentes péptidos señal varían en la eficacia con la que dirigen la secreción de proteínas heterólogas, pero se han identificado varios péptidos señal de secreción (es decir, los de la secuencia señal del receptor de histocompatibilidad, interleuquina, inmunoglobulina, etc.) que pueden utilizarse para dirigir la secreción de proteínas heterólogas recombinantes. A pesar de las similitudes, estas secuencias no son óptimas para fomentar la secreción eficiente de algunas proteínas que son difíciles de expresar, porque el péptido señal nativo puede no funcionar correctamente fuera del contexto nativo, o por diferencias ligadas con la célula huésped o con el proceso de secreción. La elección de una secuencia señal apropiada para la secreción eficiente de una proteína heteróloga puede complicarse adicionalmente por la interacción de secuencias dentro del péptido señal escindido con otras partes de la proteína madura (Johansson, Nilsson et al. 1993).

LAS VÍAS DE RECOMBINACIÓN

Las vías de recombinación, también conocidas como vías de recombinación de ADN, son vías celulares que conducen a la reparación de daños en el ADN, tales como la unión de extremos de moléculas de ADN después de roturas de doble cadena cromosómica, y al intercambio o fusión de secuencias de ADN entre cromosomas y moléculas de ADN no cromosómicas, tales como, p. ej., el entrecruzamiento de cromosomas en la meiosis o el reordenamiento de genes de inmunoglobulina en células linfocíticas. Las tres principales vías de recombinación son la vía de recombinación homóloga (HR, por sus siglas en inglés), la vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ, por sus siglas en inglés) y la vía de unión de extremos mediada por microhomología (MMEJ, por sus siglas en inglés) y la vía unión de extremos alternativa (Alt-EJ, por sus siglas en inglés).

LOS MECANISMOS DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA (HR), UNIÓN DE EXTREMOS NO HOMÓLOGOS (NHEJ) Y UNIÓN DE EXTREMOS MEDIADA POR MICROHOMOLOGÍA (MMEJ) Los transgenes utilizan las maquinarias de recombinación para integrarse en una ruptura de doble cadena en el genoma huésped.

Las roturas de doble cadena (DSBs, por sus siglas en inglés) son el tipo de daño genómico biológicamente más perjudicial que conduce potencialmente a la muerte celular o a una amplia diversidad de reordenamientos genéticos. La reparación precisa es esencial para el mantenimiento y la propagación exitosos de la información genética.

Existen dos mecanismos principales de reparación de DSB: unión de extremos no homólogos (NHEJ) y recombinación homóloga (HR). Un tercer mecanismo, llamado unión de extremos mediada por microhomología (MMEJ) tiene a menudo efecto cuando fallan los dos principales mecanismos de reparación de DSB. La recombinación homóloga es un proceso de intercambio genético entre secuencias de ADN que comparten homología y opera predominantemente durante las fases S/G2 del ciclo celular, mientras que la NHEJ simplemente une dos extremos de ADN rotos, habitualmente sin homología de secuencia, y funciona en todas las fases del ciclo celular, pero es de particular importancia durante G0-G1 y la fase S temprana de las células mitóticas (Wong y Capecchi, 1985; Delacot y Lopez, 2008). En vertebrados, HR, NHEJ y MMEJ contribuyen de manera diferencial en la reparación de DSB, dependiendo de la naturaleza de la DSB y la fase del ciclo celular (Takata et al., 1998).

NHEJ: mecanismos básicos

Conceptualmente, el mecanismo molecular del proceso NHEJ parece ser simple: 1) un conjunto de enzimas capturan la molécula de ADN rota, 2) se forma un puente molecular que une los dos extremos de ADN y 3) las moléculas rotas son re­ ligadas. Para realizar reacciones de este tipo, la maquinaria NHEJ en células de mamífero implica dos complejos de proteínas, el heterodímero Ku80/Ku70 asociado con DNA-PKcs (subunidad catalítica de proteína quinasa dependiente de ADN) y ADN ligasa IV con su cofactor XRCC4 (rayos X como complemento del gen 4 de hámster chino) y muchos factores proteicos, tales como Artemis y XLF (factor similar a XRCC4; o Cernunnos) (Delacóte et al., 2002). NHEJ se considera con frecuencia como la reparación de DSB propensa a errores, porque simplemente une dos extremos de ADN rotos, habitualmente sin homología de secuencia y genera pequeñas inserciones y deleciones (Moore y Haber, 1996; Wilson et al., 1999). NHEJ proporciona un mecanismo para la reparación de DSBs a lo largo del ciclo celular, pero es de particular importancia durante G0-G1 y la fase S temprana de las células mitóticas (Takata et al., 1998; Delacote y Lopez, 2008). La reparación de DSBs por NHEJ se observa en organismos que van desde bacterias hasta mamíferos, lo que indica que se ha conservado durante la evolución.

Después de la formación de DSB, la etapa clave en la vía de reparación de NHEJ es la yuxtaposición física de los extremos de ADN rotos. NHEJ se inicia mediante la asociación del complejo proteico heterodímero Ku70/80 a ambos extremos de la molécula de ADN rota para capturar, unir los extremos y crear un armazón para el ensamblaje de los otros factores clave de NHEJ. El complejo de heterodímero Ku unido a ADN recluta ADN- PKcs al DSB, una proteína de 460 kDa que pertenece a la PIKK (familia de proteínas quinasas tipo fosfoinositida 3-quinasa) (Gottlieb y Jackson, 1993) y activa su función de serina/treonina quinasa (Yaneva et al., 1997). Dos moléculas de ADN- PKcs interactúan juntas a través de la DSB, formando así un puente molecular entre ambos extremos rotos del ADN e inhibiendo su degradación (DeFazio et al., 2002). Luego, los extremos del ADN se pueden ligar directamente, aunque la mayoría de los extremos generados a partir de DSB deben procesarse correctamente antes del ligamiento (Nikjoo et al., 1998). Dependiendo de la naturaleza de la rotura, puede ser necesaria la acción de diferentes combinaciones de enzimas de procesamiento para generar colgantes compatibles, rellenando huecos, eliminando el ADN dañado o las estructuras secundarias que rodean la rotura. Se considera que esta etapa en el proceso de NHEJ es la responsable de la pérdida ocasional de nucleótidos asociada con la reparación de NHEJ. Una enzima de procesamiento final clave en la NHEJ de mamíferos es Artemis, un miembro de la superfamilia de enzimas metalo-p-lactamasa, que se descubrió como el gen mutado en la mayoría de los pacientes con inmunodeficiencia combinada grave (SCID, por sus siglas en inglés) radiosensible (Moshous et al., 2001). Artemis tiene una actividad de exonucleasa 5'—^ 3' y una actividad de endonucleasa dependiente de ADN- PKcs hacia transiciones dsss que contienen ADN y horquillas de ADN (Ma et al., 2002). Su actividad también está regulada por ATM. Por lo tanto, parece probable que Artemis esté implicada en múltiples respuestas al daño del ADN. Sin embargo, Artemis solo parece reparar un subconjunto de lesiones de ADN, ya que no se observaron defectos importantes en la reparación de DSB en células que carecen de Artemis (Wang et al., 2005, Darroudi et al., 2007).

Los huecos de ADN deben rellenarse para permitir la reparación. La adición de nucleótidos a una DSB está restringida a las polimerasas p y A (Lee et al., 2004; Capp et al., 2007). Mediante la interacción con XRCC4, la polinucleótido quinasa (PNK) también se recluta en los extremos del ADN para permitir tanto la polimerización como el ligamiento del ADN (Koch et al., 2004). Finalmente, NHEJ se completa mediante ligamiento de los extremos del ADN, una etapa llevada a cabo por un complejo que contiene XRCC4, ADN ligasa IV y XLF (Grawunder et al., 1997). Otras ligasas pueden sustituir parcialmente a la ADN ligasa IV, porque la NHEJ puede producirse en ausencia de XRCC4 y Ligasa IV (Yan et al., 2008). Además, estudios demostraron que XRCC4 y Ligasa IV no tienen funciones fuera de la NHEJ, mientras que, por el contrario, KU actúa en otros procesos, tales como la transcripción, la apoptosis y las respuestas al microentorno (Monferran et al., 2004; Müller et al., 2005); Downs y Jackson, 2004).

La NHEJ puede disminuir o cerrarse de diferentes maneras, muchas de las cuales afectan directamente a las proteínas arriba referenciadas (p. ej., el heterodímero Ku80/Ku70, ADN-PKcs, pero en particular ADN ligasa IV, XRCC4, Artemis y XLF (factor similar a XRCC4; o Cernunnos), PIKK (familia de proteínas quinasas tipo fosfoinositida 3-quinasa).

HR: mecanismos básicos

La recombinación homóloga (HR) es un mecanismo de reparación muy preciso. Una cromátida homóloga sirve como molde para la reparación de la cadena rota. La HR tiene lugar durante las fases S y G2 del ciclo celular, cuando las cromátidas hermanas están disponibles. La HR clásica se caracteriza principalmente por tres etapas: 1) resección del 5' de los extremos rotos, 2) invasión e intercambio de cadenas con un dúplex de ADN homólogo y 3) resolución de componentes intermedios de recombinación.

Diferentes vías pueden completar la reparación de DSB, dependiendo de la capacidad para realizar la invasión de cadenas, e incluyen la vía de reasociación de cadenas dependiente de la síntesis (SDSA, por sus siglas en inglés), la reparación clásica de la rotura de la doble cadena (DSBR, por sus siglas en inglés) (Szostak et al, 1983), la replicación inducida por la rotura (BIR, por sus siglas en inglés) y, alternativamente, la vía de reasociación de cadena sencilla (SSA, por sus siglas en inglés). Todos los mecanismos de HR están interconectados y comparten muchas etapas enzimáticas.

La primera etapa de todas las reacciones de HR corresponde a la resección de la cadena de ADN rota en el extremo 5' por nucleasas con la ayuda del complejo MRN (MRE11, RAD50, NBN (anteriormente NBS1, para el síndrome de rotura de Nijmegen 1)) y CtIP (proteína que interactúa con CtBP) (Sun et al., 1991; White y Haber, 1990). La generación resultante de una DSB de la cadena sencilla en 3' es capaz de buscar una secuencia homóloga. La invasión del dúplex homólogo la realiza un nucleofilamento compuesto por el 3' ADNss recubierto con la proteína recombinasa RAD51 (Benson et al., 1994). El requerimiento de la proteína de replicación A (RPA), una proteína heterotrimérica de unión a ADNss , implicada en procesos metabólicos de ADN vinculados a ADNss en eucariotas (Wold, 1997), es necesario para el ensamblaje del filamento RAD51 (Song y Sung, 2000). Luego, RAD51 interactúa con RAD52, que tiene una estructura similar a un anillo (Shen et al., 1996) para desplazar las moléculas de RPA y facilitar la carga de RAD51 (Song y Sung, 2000). Rad52 es importante para los procesos de recombinación en levaduras (Symington, 2002). Sin embargo, en los vertebrados, BRCA2 (proteína de susceptibilidad al cáncer de mama tipo 2) en lugar de RAD52 parece desempeñar un papel importante en la invasión e intercambio de cadenas (Davies y Pellegrini, 2007; Esashi et al., 2007). La interacción RAD51/RAD52 se estabiliza mediante la unión de RAD54. RAD54 también juega un papel en la maduración de los componentes intermedios de recombinación después de la formación del bucle D (Bugreev et al., 2007). Por otro lado, BRCA1 (cáncer de mama 1) interactúa con BARD1 (dominio 1 de RING asociado a BRCA1) y BACH1 (homología 1 de BTB y CNC) para realizar la actividad de reparación de la DSB por ligasa y helicasa, respectivamente (Greenberg et al., 2006). BRCA1 también interactúa con CtIP de manera dependiente de CDK y sufre ubiquitinación en respuesta al daño en el ADN (Limbo et al., 2007). Como consecuencia, BRCA1, CtIP y el complejo MRN desempeñan un papel en la activación de la reparación del ADN mediada por HR en las fases S y G2 del ciclo celular.

La invasión del nucleofilamento da como resultado la formación de un heterodúplex denominado bucle de desplazamiento (bucle D) e implica el desplazamiento de una cadena del dúplex por la cadena invasora y el emparejamiento con la otra. Luego, varias vías de HR pueden completar la reparación, utilizando la secuencia homóloga como molde para reemplazar la secuencia que rodea a la DSB. Dependiendo del mecanismo utilizado, intercambios recíprocos (cruces) entre el molde homólogo y la molécula de ADN rota pueden o no estar asociados con la reparación de HR. Los cruces pueden tener consecuencias genéticas importantes, tales como reordenamientos del genoma o pérdida de heterocigosidad.

Los cinco parálogos Rad51 están también implicados en la recombinación homóloga: Xrcc2, Xrcc3, Rad51 B, Rad51 C, Rad51 D (Suwaki et al., 2011). Los parálogos Rad51 forman dos tipos de complejos: uno denominado BCDX2 comprende Rad51 B, Rad51C, Rad51 D y Xrcc2; el otro contiene Rad51C y Xrcc3 (CX3) (Masson et al., 2001). Se ha propuesto que el primer complejo participa en la formación y/o estabilización del complejo Rad51-ADN (Masson et al., 2001). El papel del segundo complejo parece ser la migración de ramas y la resolución del cruce de Holliday (Liu et al., 2007).

Como se reseñó anteriormente, se puede utilizar el aumento de la HR con respecto a la NHEJ (véase la publicación de patente de EE.UU. 20120231449) para potenciar y/o facilitar la expresión del transgén.

La presente invención se centra en disminuir o suprimir la HR. La HR puede disminuir o suprimirse de diferentes maneras, muchas de las cuales afectan directamente a las proteínas arriba referenciadas (p. ej., proteínas del complejo MRN (MRE11, RAD50, NBN (anteriormente NBS1, para el síndrome de rotura de Nijmegen 1)) y CtIP (proteína que interactúa con CtBP), RAD51, la proteína de replicación A (RPA), Rad52, BRCA2 (proteína de susceptibilidad al cáncer de mama tipo 2), RAD54, BRCA1 (cáncer de mama 1) interactúa con BARD1 (dominio 1 de RING asociado a BRCA1), BACH1 (BTB y homología de CNC 1)).

Unión de extremos mediada por microhomología (MMEJ)

Cuando las otras vías de recombinación fallan o no están activas, los DSB pueden repararse mediante otro mecanismo de reparación propenso a errores denominado unión de extremos mediada por microhomología (MMEJ). Esta vía aún debe caracterizarse por completo y, a veces, también se la denomina unión final alternativa (alt-EJ), aunque no está claro si estos dos procesos se basan en el mismo mecanismo. El rasgo más característico de esta vía, que la distingue de la NHEJ, es el uso de microhomologías de 5-25 pb durante el alineamiento de las hebras de ADN rotas (McVey y Lee, 2008).

La MMEJ se puede producir en cualquier momento del ciclo celular y es independiente de los factores centrales NHEJ y HR, es decir, los genes Ku70, Ligasa IV y Rad52 (Boboila et al., 2010; Yu y McVey, 2010; Lee y Lee, 2007; Ma et al., 2003). En cambio, la iniciación de la MMEJ se basa en su propio conjunto de proteínas, siendo las más importantes los componentes del complejo MRN (MRX en levaduras) que comprende Mre11, Rad50 y Nbs1 (Xrs2 en levaduras), también implicados en las primeras etapas de HR (Ma et. al., 2003). Además del complejo MRN, se ha propuesto que muchos otros factores participen en la MMEJ, p. ej., la proteína que interactúa con CTBP (CtIP; Yun y Hiom , 2009), poli(ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP1), el complejo ligasa III/Xrcc1, ligasa I (Audebert et al ., 2004), ADN polimerasa 0 (Yu y McVey, 2010) y el complejo ERCC1/XPF (Ma et al., 2003). Sin embargo, muchas más proteínas participan en este proceso.

Se ha sugerido que en ausencia de otras proteínas de unión al extremo del ADN (tales como Ku o Rad51) las DSBs son reconocidas por PARP1 que luego inicia su reparación a través de la MMEJ (McVey y Lee, 2008). El proceso de reparación, de forma similar a HR, comienza con una resección del extremo de 5' a 3', que expone regiones cortas de homología a cada lado de la ruptura. Esta etapa de procesamiento lo lleva a cabo el complejo MRN y está regulado por CtIP (Mladenov e Iliakis, 2011). Las regiones complementarias (presentes en los fragmentos 3' de ADNss) se emparejan y los segmentos no complementarios (flaps) se eliminan (Yu y McVey, 2010), probablemente por el complejo ERCC1/XPF. A continuación, los huecos (si los hay) se rellenan con una polimerasa (p. ej., ADN polimerasa 0 o 5 (Yu y McVey, 2010; Lee y Lee, 2007)) y se unen las roturas mediante el complejo ligasa I o ligasa III/Xrcc1.

En ausencia de regiones de microhomología inmediatas en los extremos del ADN, que es el caso más frecuente, se puede copiar un fragmento más distante de la molécula reparada utilizando una ADN polimerasa precisa (p. ej., polimerasa 0). Esta región duplicada participa luego en el alineamiento de los extremos del ADN, lo que resulta en una inserción en la unión creada. Esta variante más compleja de reparación mediada por microhomología se ha denominado MMEJ dependiente de síntesis (SD-MMEJ, por sus siglas en inglés) (Yu y McVey, 2010).

Aunque se pensaba que MMEJ actuaba como una vía de reparación de recombinación alternativa, se ha demostrado que es muy eficaz en el proceso de recombinación de cambio de clase de IgH en linfocitos B (Boboila et al., 2010), lo que sugiere que podría ser más que un mecanismo de respaldo. También es posible que algunas DSB, p. ej., colgantes incompatibles o extremos romos (que son objetivos deficientes de NHEJ y/o HR) puedan ser reparados de manera más eficiente por parte de MMEJ (Zhang y Paull, 2005). La TABLA D enumera algunos de los genes clave en cada una de las tres vías, que por lo tanto también son objetivos clave para influir en cada una de las tres vías (véase también la Publicación de Patente de EE.UU. 20120231449). También se incluyen en la tabla proteínas de reparación de ADN, tales como MDC1 y MHS2. Se requiere MDC1 para activar los puntos de control del ciclo celular de la fase intra-S y la fase G2/M en respuesta al daño del ADN. Sin embargo, MDC1 también funciona en la recombinación homóloga mediada por Rad51 al retener Rad51 en la cromatina.

"Reducción" transmite que la expresión del gen diana se reduce tal como en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más. Reducción completa significa que ya no existe expresión detectable del gen diana. La TABLA D muestra también los resultados obtenidos con determinadas dianas de reducción. Como apreciará la persona experta en la técnica, existen variaciones en las secuencias de ácido nucleico de las dianas, de modo que variantes de los genes.

PROCESAMIENTO DE PROTEÍNAS Y PROTEÍNAS METABÓLICAS

Esta categoría de proteínas que se pueden utilizar para la ingeniería metabólica celular no pertenece a la vía de secreción de proteínas ni a la vía de recombinación, pero por lo demás influye en los procesos inherentes a la célula que se expresa.

Las proteínas de procesamiento o metabólicas son a menudo enzimas tales como chaperonas (véanse las definiciones de chaperonas anteriores), proteínas isomerasas, enzimas que añaden azúcar (p. ej., sialil o glicosil transferasas) o fosfatasas, o controlan el nivel de energía celular o la función mitocondrial.

La TABLA A recoge una lista de proteínas que se han expresado (exp) y/o cuya expresión se ha "reducido" (KD) bajo el subtítulo " proteínas de procesamiento y proteínas metabólicas".

DISEÑO DEL VECTOR

Entre los vectores no virales, los transposones son particularmente atractivos debido a su capacidad de integrar copias únicas de secuencias de ADN con alta frecuencia en múltiples loci dentro del genoma huésped. A diferencia de los vectores virales, se informó que algunos transposones no se integran preferentemente cerca de los genes celulares y, por lo tanto, es menos probable que introduzcan mutaciones perjudiciales. Además, los transposones se producen y manipulan fácilmente y comprenden generalmente un plásmido donante de transposones que contiene el ADN de carga flanqueado por secuencias repetidas invertidas y un plásmido auxiliar o ARNm que expresa transposasa. Se desarrollaron varios sistemas de transposones para movilizar el ADN en una diversidad de líneas celulares sin interferir con las copias de transposones endógenos. Por ejemplo, el transposón PiggyBac (PB) originalmente aislado de la polilla de la col transpone eficientemente el ADN de carga en una diversidad de células de mamíferos.

Pueden utilizarse elementos reguladores epigenéticos para proteger el ADN de carga de efectos epigenéticos no deseados cuando se colocan cerca del transgén en vectores plasmídicos. Por ejemplo, se propusieron elementos denominados región de unión a la matriz (MAR) para aumentar la integración y la transcripción genómica del ADN de carga al tiempo que evitar el silenciamiento de la heterocromatina, como lo ejemplifica la potente MAR 1-68 humana. También pueden actuar como aislantes y, por lo tanto, evitar la activación de genes celulares vecinos. Por lo tanto, los elementos MAR se han utilizado para mediar en una expresión alta y sostenida en el contexto de vectores plasmídicos o virales.

Como se muestra en esta memoria, con el diseño de vector adecuado, las propiedades favorables de los reguladores epigenéticos, en particular los elementos MAR, pueden combinarse con las de los vectores transponibles.

Transposones y vectores basados en transposones de la presente invención se pueden utilizar en ingeniería metabólica celular, por ejemplo, para expresar proteínas de secreción de diferentes vías de secreción descritas en esta memoria. También son particularmente útiles cuando se requieren múltiples rondas de introducción de ADN de carga. Esto se confirmó cuando se testaron múltiples proteínas de la vía secretora de la célula, en que la transfección de múltiples vectores y/o múltiples ciclos de transfección sucesivos pueden agotar los antibióticos u otros métodos de selección disponibles. La capacidad de expresar rápidamente proteínas terapéuticas sin necesidad de selección de antibióticos también es de particular interés, por ejemplo, cuando se deben expresar múltiples candidatos a proteínas terapéuticas con fines de detección, ya que se pueden obtener cantidades significativas de proteínas a partir de poblaciones celulares no seleccionadas 2-3 semanas después de la transfección. En particular, vectores de transposones que contienen MAR son, por lo tanto, una adición prometedora al arsenal de vectores de expresión actualmente disponible.

Los enfoques experimentales elegidos permitieron (a diferencia de los enfoques que se basan en ensayos basados en antibióticos), una distinción entre efectos basados en (1) número de copias de ^a Dⁿ de carga y efectos basados en (2) niveles de expresión de ADN de carga.

MAR 1 -68 fue particularmente eficiente cuando se localizó centralmente entre las ITRs de un transposón PiggyBac, ya que no disminuyó la eficiencia de transposición. MAR X-29 también funcionó bien en los bordes del transposón sin disminuir la expresión o la eficiencia de la transposición.

Curiosamente, el grado de la activación mediada por MAR de genes transpuestos se redujo en comparación con la integración espontánea de plásmidos. Además, el nivel de expresión, cuando se normalizó a, p. ej., copias transgénicas, fue mayor a partir de los transposones que los obtenidos a partir de la integración espontánea de los plásmidos en ausencia de la transposasa. Este efecto se observó independientemente del tamaño de las construcciones, de la presencia de la MAR o de la fuerza del promotor. Esto sería de esperar si la transposición pudiera producirse a menudo en loci genómicos que son relativamente permisivos para la expresión, por ejemplo, porque las estructuras abiertas de cromatina pueden ser más accesibles tanto para la transposasa como para los factores de transcripción. A este respecto, estudios previos han sugerido que los transposones pueden integrarse preferentemente dentro de los intrones de genes, en los promotores o en loci genómicos con menor propensión al silenciamiento, aunque esto sigue siendo un tema de debate. Alternativamente, la co-integración de muchas copias de plásmidos en el mismo locus genómico, provocada por eventos de integración espontáneos, puede conducir a la formación de heterocromatina y al silenciamiento de secuencias repetitivas, a lo que se opondría MAR, mientras que la integración de transposones de una sola copia puede ser menos propenso a un silenciamiento mediado por cromatina de este tipo. Además, la integración de transposones en múltiples loci genómicos independientes hace probable que al menos una copia aterrice en un entorno genómico favorable y se exprese, mientras que se encontró que la integración del plásmido se produce predominantemente en un solo locus genómico.

Los niveles de expresión más altos por parte de ADN de carga, p. ej., transgén/TER, se obtuvieron de un transposón que contenía MAR cuando se acoplaba a un promotor fuerte. Fue sorprendente encontrar que se podían obtener altos niveles de expresión a partir de unas pocas copias de ADN de carga transpuestas, p. ej., no más de 20, 15, 10 o 5. Si, no obstante, se pueden obtener productividades altas, son ventajosas menos copias integradas, p. ej., de ADN de carga, ya que disminuye la probabilidad de que se produzca una mutación puntual en uno o en un subconjunto de los transgenes, como se obtiene a partir de eventos mutagénicos espontáneos. Además, los eventos de integración mediados por transposasa son menos mutagénicos que los mecanismos de reparación y recombinación del ADN implicados en la integración espontánea de plásmidos, lo que puede conducir a copias de transgenes incompletas o reorganizadas.

La alta eficacia de la integración genómica por el transposón piggyBac (PB) también es favorable cuando la cantidad de células diana es limitante, por ejemplo, para la transferencia no viral de genes terapéuticos en células madre primarias para generar poblaciones clonales para, p. ej., terapias basadas en células o medicina regenerativa. En este contexto, los niveles de expresión fisiológica de unas pocas copias de ADN de carga transpuestas y la ocurrencia frecuente de eventos de transposición, obviando así la necesidad de selección de antibióticos, son ventajosos, ya que el uso de genes de resistencia a los antibióticos y/o la expresión transgénica no fiable, p. ej., puede plantear problemas de seguridad.

Efecto de la inclusión de MAR en la eficiencia de transposición

Dado que la resistencia a los antibióticos no refleja necesariamente la expresión eficaz del transgén, se utilizó como indicador la proteína fluorescente verde (GFP) expresada a partir de un derivado del promotor celular fuerte de GAPDH. Para testar si añadir un elemento MAR al transposón PB puede afectar la eficiencia de transposición y la expresión transgénica, y para evaluar si la ubicación de la MAR en la construcción tuvo alguna influencia en estos efectos, se diseñaron una serie de construcciones de donantes de transposones que contenían la GFP y gen de resistencia a puromicina (Puro), en el que se insertó la MAR 1-68 o una secuencia de ADN espaciador neutra de control en diferentes posiciones en el plásmido (Figura 1). El plásmido de transposón Puro-GFP parental sin una inserción se utilizó como control de la transposición, para distinguir el impacto del aumento del tamaño del transposón en relación con el efecto de la adición de la secuencia espaciadora o MAR.

En presencia de la transposasa, el nivel más alto de expresión de GFP de células no seleccionadas se observó cuando la MAR estaba ubicada en el centro, pero no cuando la MAR se colocó aguas abajo de la secuencia codificante de GFP, ni cuando se insertó fuera de la secuencia transpuesta como era de esperar (Figura 3A). En presencia de selección de puromicina, se redujo la activación mediada por MAR, con o sin la transposasa, mientras que los promedios de expresión de GFP aumentaron en un orden de magnitud (Figura 3B). Esto confirmó que la selección de puromicina produjo solo la minoría de las células que exhiben los niveles de expresión más altos, como se propuso arriba a partir de la cuantificación de los eventos de transposición. Indicó, además, que los vectores transponibles que contenían una MAR ubicada centralmente produjeron niveles de expresión similares cuando se compararon con su homólogo de plásmido transfectado sin la transposasa.

Efecto de la inclusión de MAR en el número de copias del transposón integrado

Los niveles de fluorescencia de GFP más altos pueden resultar de una transcripción aumentada de los transgenes y/o por la integración de más copias de transgenes. Esto se evaluó cuantificando el número de copias transgénicas integradas en el genoma resultantes de los diversos tipos de vectores. El ADN genómico total se aisló de poblaciones de células agrupadas, ya sea después de la clasificación citofluorométrica de células fluorescentes de poblaciones no seleccionadas o después de la selección por resistencia a la puromicina. El número de copias del transgén se determinó mediante el análisis de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR, por sus siglas en inglés) de la secuencia codificante de GFP con respecto al gen |32-microglobulina (B2M) celular. En ausencia de selección de antibióticos, el número promedio de transgenes integrados por la transposasa o por las enzimas de recombinación celular fue similar, alrededor de 1-6 copias por genoma, y no se vieron afectados significativamente por la MAR o la secuencia de control (Fig. 4A). Sin embargo, el número de copias más bajo se obtuvo cuando la MAR se incluyó en el borde del transposón, lo que respalda la conclusión anterior de los autores de la invención de que disminuye la transposición en esta ubicación. Después de la selección de células de alta expresión con puromicina, el número de transgenes transpuestos estaba en un intervalo similar de 2-7 copias (Fig. 4B). Sin embargo, el número de copias de transgenes integradas en ausencia de la transposasa fue generalmente significativamente mayor, con un intervalo de 6 a 14 copias. Esto se puede explicar fácilmente por el hecho de que la integración espontánea da como resultado habitualmente la integración de concatémeros de múltiples copias de plásmidos en un solo locus genómico (resultados no mostrados), y que un mayor número de copias de transgenes debería conducir a niveles de expresión más altos cuando las células se someten a efectos de silenciamiento que se han eliminado mediante la selección de antibióticos. Tomado junto con la conclusión anterior de que la selección de antibióticos produce preferentemente células de alta expresión, esto también indica que la integración espontánea de plásmidos da como resultado un número más variable de copias de transgenes que los vectores transponibles.

A continuación, la expresión de GFP se normalizó al número de copias del gen para evaluar el potencial de expresión intrínseco de los vectores, independientemente de su propensión a integrarse en el genoma. En general, se obtuvo una expresión más baja por copia de transgén de células no seleccionadas o de células seleccionadas con antibióticos transfectadas sin transposasa o MAR central, lo que indica que la expresión transgénica está influenciada tanto por la inclusión del elemento regulador epigenético como por el modo de integración del transgén (Fig. 5). La transposasa aumentó generalmente la expresión por copia del gen, cuando se evaluó a partir de diversos vectores y combinación de elementos, y esto se observó con o sin una selección de antibióticos. Los niveles más altos de expresión por copia de transgén se obtuvieron después de la selección de antibióticos de las células generadas con el vector de transposón que contenía el elemento MAR ubicado centralmente y en presencia de la transposasa. La inclusión de la MAR inmediatamente aguas abajo de la secuencia codificante de GFP no aumentó significativamente la expresión del transgén, como se señaló anteriormente para los niveles absolutos de expresión.

Finalmente, se evaluó si el efecto favorable de MAR 1 -68 sobre la expresión puede ser específico para el promotor fuerte de GAPDH humano utilizado aquí, o si también ocurriría con otros promotores. Por lo tanto, los autores de la invención reemplazaron el promotor de GAPDH humano que impulsa la expresión de GFP por el promotor temprano más débil del virus simio 40 (SV40). El uso del promotor más débil produjo números equiparables de células positivas para GFP y de transgenes integrados, lo que indica que la eficiencia de la transposición no se ve alterada por la expresión transgénica (resultados no mostrados y Fig. 2A y Fig. 4B). Sin embargo, los niveles absolutos de expresión fueron menores con el promotor de SV40 (no mostrado frente a la Fig.3B). Además, la expresión normalizada al número de copias del transposón disminuyó 4,6 veces con el uso del promotor SV40 en ausencia de la MAR, y 3,1 veces con la MAR 1-68 (resultados no mostrados). Esto indicó que MAR podría prevenir parcial, pero no completamente, la disminución de la expresión resultante del uso de un promotor más débil, incluso en presencia de la transposasa. En general, se pudo demostrar que unas pocas copias integradas son suficientes para obtener una expresión transgénica alta a partir de transposones, y que la expresión más alta por transgén se obtiene cuando, en este contexto, MAR-68 se coloca aguas arriba del promotor fuerte.

Células CHO-M se electroporaron una vez o dos veces con un único vector transposable que contenía el transgén MAR X_29. La eficiencia de la transposición fue máxima después de la electroporación (30 %-45 % de las células mostraron una expresión estable). Sin embargo, los niveles de expresión del transgén fueron similares a los de la transfección química, que mostró células positivas más bajas y, por lo tanto, una eficiencia de transposición más baja. La Fig.7 muestra los resultados con cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas terapéuticas insertadas aguas arriba del MAR X_29 y se obtuvieron títulos que oscilaban entre 1 y 8 gg/ml. Los niveles se aumentaron adicionalmente hasta 23-55 gg/ml clasificando las células que expresan (Fig.7C).

La expresión de transgenes también se puede aumentar sustancialmente, a menudo independientemente del uso de transposones mediante diseños de vectores específicos, en particular mediante el uso de elemento(s) MAR específicos en ubicaciones específicas con respecto al transgén y, preferiblemente, una combinación de esos elemento(s) MAR con promotores, potenciadores o fusiones de los mismos.

Un vector respectivo puede contener MARs que flanquean el casete de expresión del transgén. Por ejemplo, el vector puede contener, p. ej., MARs aguas arriba (una o más) y MARs aguas abajo (una o más), p. ej., una MAR ubicada aguas arriba y una MAR ubicada aguas abajo de un casete de expresión transgénica (Fig. 18A, Fig. 18B, Fig. 19). El vector puede contener un gen de resistencia a la puromicina integrado bajo el control del promotor de SV40. El transgén puede estar bajo el control del promotor de GAPDH humano condensado con el potenciador de genes inmediato temprano de citomegalovirus humano (CMV) (en particular, el promotor de fusión de CGAPD como se comentó arriba).

El percentil más alto de células productoras altas y muy altas (% M3/M2), según se evaluó para la fluorescencia de GFP mediante análisis FACS y la menor variabilidad, podría obtenerse utilizando 1_6R2, 1_68R2 y X_29R3 como la MAR aguas arriba (más de 80 %, 80% y más del 80%). Como comprenderá la persona experta en la técnica, son permisibles determinadas desviaciones de la secuencia específica de estas MARs. Por consiguiente, se ilustran vectores que contienen secuencias de ácido nucleico que tienen más del 80 %, 85 %, 90 %, 95 % de identidades de secuencia con las SEQ ID NOs: 6, 7, 8, 9 y 10 (Fig. 18A, Fig. 18B).

La pérdida de expresión en el biorreactor y/o en ausencia de presión de selección limita a menudo la recuperación de la proteína de interés. Vectores que contenían los derivados de MAR 1_68R2, 1_6R2 y X_29R3 como la MAR aguas arriba se testaron a lo largo de un período de 5 semanas de cultivo sin selección, y la fluorescencia de GFP se evaluó semanalmente a lo largo de este período. Al considerar el percentil de la subpoblación M3, se encontró que el elemento 1_6R2 como una MAR aguas arriba y la MAR 1-68 sin reordenar como una MAR aguas abajo fueron la mejor combinación testada en vectores con al menos una MAR aguas arriba y una aguas abajo (bien por encima del 80 % después de más de 2, 3, 4 semanas) (véase la Fig. 19).

Un vector diseñado de manera similar también puede contener, p. ej., solamente MARs aguas abajo (una o más), p. ej., una MAR situada aguas abajo de un casete de expresión de transgenes (Figs.20A, 20B, 21 y 22) y ninguna MAR aguas arriba. El vector también puede contener en este caso un gen de resistencia a la puromicina integrado bajo el control del promotor de SV40. El transgén puede estar bajo el control del promotor de GAPDH humano condensado con el potenciador de genes inmediato temprano de citomegalovirus humano (CMV). Véase, p. ej., la SEQ ID NO: 11 son otros que tienen identidades de secuencia de más del 80 %, 85 %, 90 % o 95 %. Se lograron excelentes resultados en una sola constelación de MAR con X_29 como una MAR. El percentil alto de células que expresan GFP (determinado como antes) y también la estabilidad de la expresión a lo largo del tiempo (determinada como antes) es mejor que, p. ej., el de vectores de alto comportamiento en los que las MARs flanqueaban el casete de expresión del transgén, a saber, un vector que comprende una MAR 1_6R2 aguas arriba y una MAR 1 -68 no reordenada aguas abajo (véase la Fig.22). Este hallazgo contrasta con las suposiciones bien establecidas de que las MARs son más eficaces cuando flanquean al transgén (véase la patente de EE.UU. 5.731.178). Estabilidad de la expresión significa que un ADN de interés, p. ej., un transgén, es expresado por una población celular incluso después de un determinado período de tiempo, p. ej., después de más de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 semanas a una tasa equiparable (no más del 20 %, 10 o 5 % menos) y particularmente incluso más alta hasta dos semanas después del comienzo de la expresión. A menudo, la expresión estable se asocia con un percentil alto (p. ej., más del 80 %) o una subpoblación de células de alta expresión.

INGENIERÍA METABÓLICA CELULAR: PROTEÍNAS DE SECRECIÓN

La secreción de proteínas heterólogas tales como las IgGs, se ve empequeñecida por el procesamiento polipeptídico inadecuado y la baja producción de IgG en células cultivadas tales como células CHO.

Se observó que se induce la expresión de chaperonas inducidas por estrés tales como BiP y que la chaperona está correctamente localizada en el ER y es capaz de interactuar con las cadenas precursoras de IgG. Sin embargo, las IgGs que contienen secuencias variables particulares, como las que se encuentran en Infliximab, se procesan y ensamblan incorrectamente, lo que conduce a una secreción deficiente. Por lo tanto, la activación de la respuesta UPR en estas células sigue siendo ineficaz para rescatar un nivel significativo de inmunoglobulina.

Se demostró que SRP14 estaba implicada en una etapa molecular de la vía de secreción que es limitante en células CHO que sobre-expresan una proteína exógena. Curiosamente, esta etapa limitante también se produce para el Trastuzumab fácil de expresar que conduce fácilmente a clones de alta expresión. Esta conclusión siguió al hallazgo de que la expresión de SRP14 humana restauraba fácilmente la expresión de los clones LP, pero que también aumentaba la secreción de la IgG que se expresa fácilmente. Se descubrió que la expresión de SRP14 aumenta el procesamiento y la disponibilidad de precursores de LC y HC y produce niveles equiparables de secreción para ambos tipos de IgGs. En general, demostró que SRP14 puede ser generalmente limitante cuando las proteínas secretadas, tales como las IgGs, se sobre-expresan en las células CHO.

El fuerte efecto obtenido de la expresión de SRP14 en células CHO como se observó en este estudio fue inesperado y sugirió que SRP14 provoca un retraso prolongado del alargamiento de LC en los clones productores de IgG difíciles de producir (Fig. 12B, punto 1).

El trabajo previo indicó que el péptido señal que emerge de un ribosoma de traducción primero interactúa con la subunidad SRP54 de la partícula SRP, mientras que la asociación con SRP9 y SRP14 puede bloquear una elongación adicional del polipéptido naciente, lo que da como resultado la detención de la traducción (Walter y Blobel 1981). En una segunda etapa, el complejo ribosoma-polipéptido naciente-SRP se acopla a la membrana del ER a través de su interacción con el receptor del SR (Gilmore et al., 1982; Walter et al., 1982). El SR puede luego coordinar la liberación del SRP del complejo ribosomapolipéptido naciente y la asociación del sitio de salida del ribosoma con el canal de translocón, a través del cual el polipéptido naciente en crecimiento penetra en el ER (Lakkaraju et al., 2008). Luego puede reanudarse la translocación acoplada a la traducción, lo que conduce a la eliminación del péptido señal y a la síntesis de polipéptidos secretados y procesados adecuadamente.

El procesamiento adecuado de las IgGs difíciles de expresar podría requerir una pausa en la traducción inusualmente larga, si la cinética de acoplamiento en el ER puede ser más lenta para combinaciones particulares de dominio variable de IgG y secuencias de péptido señal, debido a estructuras desfavorables del péptido naciente. Por lo tanto, la modulación de la cinética de detención de la traducción mediante la expresión del componente SRP14 humano exógeno se consideró a su vez que mejora el acoplamiento adecuado de ER y la translocación de la pre-LC y, por lo tanto, restaura un procesamiento eficiente del péptido señal (Fig. 12B, punto 2). Consistentemente, la reducción de los niveles de SRP14 en las células humanas conduce a una falta de retraso en el alargamiento de la traducción en los polisomas, lo que puede resultar en la sobre-extensión de los polipéptidos nacientes más allá de una longitud crítica, después de lo cual es posible que el SRP ya no fije adecuadamente como objetivo la proteína secretada al ER. Por lo tanto, células CHO SRP14, y posiblemente también SRP54, tendrían una afinidad reducida por las secuencias señal de la proteína Infliximab humana heteróloga, lo que conduciría a un acoplamiento en el ER incorrecto y/o al alargamiento del péptido naciente antes de que se produzca el acoplamiento adecuado. Esto se corregiría con la sobre-expresión de SRP14 humana, alargando el período de tiempo durante el cual el complejo ribosoma-SRP detenido puede buscar un sitio de acoplamiento debidamente organizado en el ER, a pesar del "atasco molecular" de proteínas IgG sobre-expresadas que se produce en las puertas del ER.

Consistentemente, la sobre-expresión de SR y translocón, que puede aumentar la capacidad del ER en términos de translocación, también resultó en una mejora de la secreción, incluso en ausencia de sobre-expresión de SRP14 humano. Finalmente, se demostró que la ingeniería metabólica de la vía secretora, mediante la co-expresión de combinaciones de subunidades SRP, translocón y SR humanas, conduce a una mejora adicional de la capacidad celular de secreción de proteínas, produciendo niveles de secreción incluso más altos. En general, se concluyó que las proteínas SRP, su receptor y el translocón pueden ser generalmente limitantes cuando las células CHO sobre-expresan las proteínas secretadas, tales como las inmunoglobulinas humanas.

Se ha sabido poco sobre la abundancia de componentes de la membrana de SRP y ER con respecto a las proteínas secretadas y a los ribosomas en diferentes tipos de células, pero es posible que surjan defectos de translocación en células que expresan grandes cantidades de una proteína recombinante. Por ejemplo, el SR y/o el translocón pueden volverse limitantes cuando las proteínas secretadas se expresan a niveles anormalmente altos, o SRP14 se puede producir a niveles subestequiométricos en células CHO con respecto a otras subunidades de SRP. Consistentemente, SRP9 y SRP14 están presentes en un exceso de 20 veces frente a otras proteínas SRP en células de primates, pero no en células de ratón, y la sobre-expresión de SRP14 humana en células humanas normales no aumentó la eficiencia de la secreción de la fosfatasa alcalina. Además, la SRP14 humana es más grande que su homólogo de roedor, ya que contiene una cola rica en alanina en su extremo C que no se encuentra en la SRP14 de roedor. Por lo tanto, la incorporación de la SRP14 humana más grande en la SRP de CHO podría conducir a la formación de una quimera de SRP funcional de mayor actividad, en un efecto dominante positivo.

El hallazgo de que la expresión de componentes citosólicos de SRP tales como SRP14 conduce a un procesamiento y una secreción eficientes de proteínas sobre-expresadas en células CHO apunta a un cuello de botella que puede utilizarse para mejorar los rendimientos de proteína recombinante. Este cuello de botella limita la expresión de IgGs distintas y no relacionadas, y posiblemente también de los numerosos otros anticuerpos monoclonales y derivados que constituyen, con mucho, la clase más abundante de proteínas terapéuticas recombinantes.

El análisis de los componentes intermedios de la secreción y de las posibles respuestas de estrés celular, seguido de la búsqueda sistemática de las actividades limitantes aguas arriba que provocan una respuesta de estrés de este tipo, y luego finalizado por la ingeniería del metabolismo de secreción de células CHO, ha conducido a una mejor comprensión de las limitaciones metabólicas de estas células y cómo abordarlas.

La expresión heteróloga de SRP14 restaura la secreción y el procesamiento de LC

Se co-transfectaron clones HP (alta producción) y LP (baja producción) de IgG con un vector que codifica el componente SRP14 de SRP y con un plásmido de resistencia a neomicina. Las células individuales en la agrupación resistente a la neomicina se separaron mediante dilución limitante y, posteriormente, se testaron el crecimiento y la secreción de inmunoglobulina en lotes de placas de cultivo agitadas. Los subclones derivados de LP que expresan SRP14 secretaron cantidades de anticuerpos significativamente más altas que sus homólogos parentales a lo largo del cultivo, y produjeron títulos de inmunoglobulina similares a los de los subclones que expresan HP SRP14 (Fig. 8A y 8B, paneles de la izquierda).

La expresión de SRP14 no afectó a la viabilidad celular, pero pareció ralentizar y prolongar el crecimiento de los cultivos de células HP hasta densidades celulares similares (Fig. 8A y 8B, paneles de la derecha). Los sobrenadantes de cultivo de los diversos subclones se recogieron y analizaron para determinar la concentración de anticuerpos. Como se muestra en la Fig. 8C, la expresión de SRP14 potenció la secreción de células LP, lo que condujo a un aumento de 7 veces la productividad específica de IgG. Además, la expresión exógena de SRP14 también mejoró la secreción de IgG de los subclones de HP, lo que condujo a un aumento del 30 % de la productividad específica. Curiosamente, los subclones individuales que expresan SRP14 secretaron las IgGs difíciles y fáciles de expresar a tasas promedio esencialmente idénticas, con productividades específicas medianas que superan los 30 picogramos por célula y por día (pcd). Estos niveles de secreción de IgG muy altos se mantuvieron durante más de 6 meses de cultivo, lo que indica que es una propiedad estable de las células que expresan SRP14.

Para investigar adicionalmente la relación entre la expresión de SRP14 y la productividad de IgG, los niveles de ARNm de SRP14 de los 5 subclones de LP que expresan SRP14 individuales se analizaron mediante PCR cuantitativa relativa. Como se muestra en la Fig.8D, los subclones sobre-expresaron SRP14 a niveles que oscilaron entre 50 y casi 200 veces por encima del ARNm de SRP14 de células CHO endógenas. Esto estuvo acompañado por un aumento de la secreción de IgG de 4 a 6 veces en comparación con el clon de células de control LP. Curiosamente, la productividad específica más alta se obtuvo de un subclón que sobre-expresa SRP14 a un nivel intermedio, aproximadamente 100 veces más que el ARNm de SRP14 endógeno de células CHO (subclón E de SRP14-LP, no mostrado). Esto implicaba una interdependencia del nivel de sobre-expresión de SRP14 y la productividad específica de IgG hasta un nivel umbral de SRP14 correspondiente a un aumento de 100 veces sobre el nivel de expresión endógena. Esto sugirió que otros componentes de la vía secretora pueden, a su vez, volverse limitantes a niveles muy altos de SRP14, y que puede ser necesaria una expresión equilibrada de los componentes de la vía para una expresión óptima de IgG.

Para testar si la productividad específica aumentada obtenida durante la evaluación de la línea celular clonal podría aplicarse a un proceso de producción, los mejores subclones que expresan HP y LP SRP14 se testaron en placas de cultivo agitadas en condiciones semi-continuas (es decir, subclon E de LP y subclon B de HP de la Fig.8). El subclón de LP que expresa SRP14 produjo un número similar de células viables y títulos de inmunoglobulina que el subclón de HP que expresa SRP14, con un máximo de 8 x 106 células/ml y más de 2 g por litro al final de la producción (Fig. 9A y B).

Seguidamente se testó el impacto de la sobre-expresión de SRP14 en la síntesis de inmunoglobulina para estos dos subclones. Esto reveló que la expresión de SRP14 humana en el subclón derivado de LP condujo a una LC madura y normalmente procesada competente para el plegamiento y el ensamblaje de IgG (Fig. 10A, LP pista S frente a pista -). La migración de la HC libre no se vio afectada, lo que indica que la expresión de SRP14 actuó específicamente en la LC mal procesada de la proteína difícil de expresar. Sorprendentemente, la expresión de SRP14 eliminó por completo la acumulación de LC agregada en la fracción insoluble de Triton X (Fig. 9A, panel inferior). La expresión de la proteína GFP de control no mejoró la solubilidad de la proteína ni restauró el procesamiento adecuado de la LC (Fig. 10A, pista G de células LP). La expresión de SRP14 no tuvo efecto sobre el patrón de migración de HC y LC obtenido del subclón de HP, y se observó poco efecto sobre la cantidad de las cadenas libres e IgG completamente ensamblada en comparación con los controles (Fig. 10A, pista G de células HP).

Se realizaron ensayos de seguimiento basados en cicloheximida para investigar el plegamiento de IgG y la cinética de ensamblaje, así como el destino de los agregados de IgG en el subclón productor de Infliximab que expresa SRP14. En contraste con las células LP parentales que exhibían LC agregadas incompetentes para el ensamblaje de IgG, el subclón LP que expresaba SRP14 ya no acumulaba LC insoluble Tx-100 (Fig. 9B, panel inferior). Sin embargo, la LC libre permaneció en pequeñas cantidades con respecto a la HC libre, como también se observó en las células HP, lo que indica que se incorporó rápidamente a los dímeros HC-LC y la IgG madura y que puede estar limitando el ensamblaje de la IgG (Fig. 9A y 9B). Colectivamente, estos resultados implicaron que SRP14 puede desempeñar un papel esencial en el procesamiento de LC por parte de las células LP, y que la expresión adicional de la proteína SRP podría mejorar la secreción de IgGs difíciles y fáciles de expresar hasta niveles similares.

La ingeniería de la translocación de ER mejora la secreción de IgG recombinante

Dado que la sobre-expresión de SRP14 heteróloga aumentó la secreción de IgG hasta un umbral dado, se razonó que otros componentes de la vía de secreción que interactúan directa o indirectamente con SRP14 pueden volverse limitantes en los subclones de SRP14-LP. Por lo tanto, los autores de la invención exploraron si la sobre-expresión de otros componentes de la vía de secreción también puede mejorar la expresión de IgG, ya sea solo o en combinación con SRP14. Estos incluían las proteínas SRP9 y SRP54 humanas que constituyen el complejo SRP junto con SRP14, y subunidades del receptor SRP (SR) y las subunidades Sec61a, p y ^y del translocón.

En un primer conjunto de experimentos, el clon LP de mejor comportamiento, a saber, el clon E derivado de LP de la Fig. 1, se transfectó con vectores de expresión que codifican proteínas SRP o proteínas translocón solas o en combinaciones. A continuación, se evaluó la producción de IgG en cultivo discontinuo en las agrupaciones de células policlonales LP resultantes. La expresión de componentes de SRP o de proteínas translocón aumentó la secreción de inmunoglobulina de estas agrupaciones de células policlonales LP re-transfectadas (Fig. 11A y datos no mostrados). En comparación con la expresión de SRP14 sola, la sobre-expresión de las combinaciones de proteínas SRP o del translocón mejoró la productividad específica de agrupaciones de células policlonales transfectadas LP en un 20 % a 40 % adicional (Fig. 11A, comparación de valores medianos). Estos resultados indicaron claramente que combinaciones particulares eran más potentes para restablecer la secreción de Infliximab que la expresión de SRP14 sola, como las que consistían en la expresión de los tres polipéptidos de SRP y su receptor (SR), o la co-expresión del SR y del translocón (Fig. 11A).

También se evaluó si el subclón E de LP que expresa SRP14 podría optimizarse adicionalmente mediante la expresión de combinaciones de SR y/o translocón. En comparación con los 30 pcd del subclon E de SRP14-LP, los grupos de células policlonales seleccionados después de la transfección con las proteínas SR y el translocón produjeron productividades específicas superiores a 60 pcd para la inmunoglobulina difícil de expresar (Fig. 10B). Se concluyó que las proteínas SR y los vectores que expresan translocón también se pueden utilizar para generar clones con productividades específicas aumentadas en comparación con el clon E de SRP14-LP, y que se puede aplicar con éxito un enfoque basado en una serie de ciclos consecutivos de transfección y selección.

INGENIERÍA METABÓLICA CELULAR: Reducción de vías de recombinación y expresión de TEPs y ARN funcional de TEP

Para influir en la recombinación, se pueden silenciar genes de recombinación de ADN cruciales. Los objetivos para la reducción son genes conocidos de la bibliografía como cruciales para vías de reparación de recombinación particulares en mamíferos (Tabla D). Dado que la mayoría de estos genes son necesarios para la supervivencia y el desarrollo celular, su silenciamiento permanente podría resultar en una viabilidad celular reducida. Por lo tanto, se prefiere silenciar estos genes diana de forma transitoria utilizando ARN de interferencia (iARN).

En células tratadas con una mezcla de siARN contra factores implicados en las primeras etapas de la NHEJ, es decir, Ku 70, Ku80 y ADN- PKcs (un dúplex de siARN por proteína), la frecuencia de eventos de la NHEJ fue significativamente menor que en las células no tratadas. En cambio, la HR fue más eficiente en estas células, lo que resultó en una relación reducida de NHEJ a HR (de 2,7:1 a 1,3:1). Por el contrario, en las células tratadas con siARN fijado como objetivo contra un factor HR esencial - Rad51, la reconstitución de GFP dependiente de HR se eliminó casi por completo, lo que aumentó la relación NHEJ:HR a 5:1. Estos resultados parecen indicar que el ensayo informador de HR y NHEJ es lo suficientemente sensible como para ser utilizado en la forma extracromosómica. También desafían adicionalmente la fiabilidad de las líneas celulares mutantes CHO utilizadas anteriormente (en particular, las células 51D1, publicadas originalmente como células negativas para HR, pero aparentemente capaces de realizar HR de acuerdo con este ensayo - datos no mostrados).

Aumento de la expresión e integración de GFP en presencia de MAR. En experimentos paralelos, células CHO tratadas con diferentes siARN anti-HR o anti-NHEJ se transfectaron con plásmidos que contenían GFP o MAR-GFP. Después de dos semanas de selección de antibióticos, las células se ensayaron mediante FACS y qPCR en cuanto a la expresión e integración de GFP, respectivamente. En todas las condiciones testadas, la adición de la MAR resultó en un aumento de 4-5 veces de la expresión de GFP en comparación con las células transfectadas con un plásmido sin MAR (Fig. 13, Fig. 14A), que está en línea con informes previos (Grandjean etal., 2011). Este aumento fue acompañado por un aumento aprox. de 3 veces el número de copias de GFP integrado en células transfectadas con el plásmido MAR-GFP en comparación con las células que recibieron el vector no-MAR (Fig. 13, Fig. 14B). También hubo un aumento de 2 veces en la fluorescencia promedio de GFP por copia de gen (Fig. 13, Fig. 14C), posiblemente debido a una localización más favorable del sitio de integración (p. ej., en una región rica en eucromatina). Por lo tanto, podría plantearse la hipótesis de que los elementos MAR poseen la capacidad de dirigir genes a loci genómicos que permitan la expresión génica. Una combinación de siARNs antiHR con MAR (siARN: RAD51, Rad51C y Brca1) dio como resultado un cambio en la expresión media de GFP superior a 11, mientras que un siARN antiHR singular (siARN: Rad51 condujo a un cambio múltiplo inferior a 9. Otras combinaciones tales como una combinación de siARNs de siMMEJ con MAR también condujeron a una expresión mejorada con respecto al siARN singular (resultados no mostrados).

Ningún efecto de la reducción del gen NHEJ en la expresión e integración transgénicas. El tratamiento con siARN contra las proteínas NHEJ no pareció influir significativamente en la expresión transgénica estable. Tampoco hubo cambios significativos en el número de copias de la GFP en el genoma en comparación con las células no tratadas (excepto en células tratadas con los siARN anti-53BP1, pero solo en ausencia de la MAR, lo que posiblemente apunta a un efecto diferente a la recombinación por la vía NHEJ).

Aumento de la expresión e integración transgénicas en ausencia de factores HR. En contraste con la reducción de los factores NHEJ, la presencia de siARN contra las proteínas HR resultó a menudo en un aumento significativo de la expresión estable de la GFP en comparación con las células no tratadas (excepto para Brca2, para la cual hubo una disminución significativa, pero nuevamente solo en ausencia de la MAR) (Fig. 15A). Como fue el caso con el silenciamiento de los genes NHEJ, la presencia de la MAR dio como resultado una expresión incrementada e integración estable de la GFP, así como la expresión por copia del gen. Esta vez, sin embargo, el silenciamiento de factores HR potenció este efecto de 5 a 7 veces (siendo el más sorprendente la reducción de Rad51 que alcanzó niveles de expresión de GFP 7,4 veces más altos) (Fig. 15A), lo que podría indicar que las proteínas HR contrarrestan el efecto positivo del elemento MAR en la expresión transgénica. En ausencia de la MAR, el aumento en la expresión de GFP se correlacionó con un número elevado de copias de GFP en el genoma (resultados no mostrados) . Sorprendentemente, este no fue el caso en presencia de MAR, lo que indica que el aumento en el número de copias mediado por MAR no se vio afectado por la reducción de la ^proteína H^{r (excepto para el siARN de Rad51 D). Esto parece sugerir que la ausencia de una vía de reparación de HR} funcional no aumenta el número de eventos de recombinación fomentados por la MAR. En cambio, podría estimular la integración de la MAR y el transgén en un locus más favorable que permita su expresión más eficiente. Este punto de vista también está respaldado por la expresión elevada de copias individuales de GFP en presencia de la MAR en células tratadas con siARNs anti-HR (Fig. 14C). Otra posibilidad es que el número de copias de plásmido integradas en el genoma ya sea máximo en las células de control (con la cantidad de ADN de plásmido utilizado aquí) y no pueda aumentarse más incluso en condiciones más beneficiosas para la MAR.

En conjunto, estos resultados sugieren que el proceso de integración del transgén mediado por MAR está mediado preferentemente por una vía opuesta a la recombinación homóloga, aunque probablemente no NHEJ, ya que la reducción de sus componentes no tuvo efecto sobre la integración o la expresión. Podría plantearse la hipótesis de que esta vía alternativa es menos activa en presencia de una vía de HR funcional, pero se vuelve más importante si la HR está deshabilitada.

EXPRESIÓN DE shARNs ANTI-HR PARA AUMENTAR LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS

Tres siARN que fijan como objetivo a Rad51 se convirtieron en secuencias de shARN que pueden formar estructuras de horquilla, y la secuencia que codifica shARN se insertó en un vector de transposón piggyBac bajo el control de un potenciador de GAPDH y un promotor de CMV y seguida por MAR X-29, pero desprovisto de un gen de selección de antibióticos. Células CHO-M adaptadas a la suspensión se transfectaron tres veces con el plásmido donante de transposones y el vector de expresión de la transposasa, después de lo cual se seleccionaron al azar 30 clones de células individuales utilizando un dispositivo ClonePix. Las células parentales, así como la agrupación de células que expresan shARN y los clones, se volvieron a transfectar con un plásmido de expresión de GFP (a saber, la construcción Puro-GFP-MAR X_29), seguido de la selección con puromicina de agrupaciones policlonales de células que expresan GFP. La comparación del perfil de fluorescencia de GFP indicó que se obtuvieron una mayor proporción de células de fluorescencia media a alta (población de células M2) o células muy fluorescentes (población de células M3) de la agrupación de células transfectadas con el vector shARN en comparación con las células CHO-M parentales (Fig. 17A).

Varios clones que expresan shARN mediaron en niveles muy altos de GFP, siendo más del 80 % de las células resistentes a los antibióticos en la subpoblación M3 altamente fluorescente 10 días después de la transfección, como se ejemplifica en el clon 16 y el clon 26 (Fig. 17A y B). Se mantuvieron altos niveles de fluorescencia de GFP en estos dos clones después de 35 días de cultivo adicional sin selección (Fig. 17C). Por el contrario, el clon 17 no expresó niveles muy altos de GFP el día 10 y la expresión de GFP parecía ser inestable (Fig. 17B y C). Se obtuvieron niveles de expresión intermedios y estabilidad a partir del clon 8 y el clon 22. Estos clones también se transfectaron con plásmidos de expresión que codifican la cadena ligera y pesada del anticuerpo terapéutico Infliximab difícil de expresar. Como antes, los clones 16 y 26 produjeron los niveles más altos del anticuerpo, seguidos de los clones 8 y 22, mientras que el clon 17 expresó cantidades de inmunoglobulina que fueron similares al 0,5 a 1 pcd obtenido de las células CHO-M parentales (Fig. 17D y datos no mostrados). Los clones de células que exhibían los niveles de ARNm de Rad51 que se redujeron más significativamente produjeron una alta expresión tanto de GFP como de la inmunoglobulina Infliximab, lo que indica que el aumento de la expresión transgénica resultó de la disminución de la expresión de la proteína de recombinación (resultados no mostrados).

Por lo tanto, se pueden lograr niveles de producción más altos y más estables de proteínas terapéuticas secretadas tales como Infliximab a partir de células que expresan un shARN que fija como objetivo a Rad51 o de células transfectadas transitoriamente por siARNs tales como el siARN que fija como objetivo a Rad51.

MATERIALES Y MÉTODOS

Plásmidos y vectores de ADN

El vector pCS2+U5V5PBU3 de expresión de transposasa PB contiene la secuencia codificante de transposasa PB rodeada por las regiones terminales no traducidas (UTR) 5' y 3' del gen de la p-globina de Xenopus laevis. Este plásmido se construyó de la siguiente manera: el fragmento 3' UTR de 317 pb de pBSSK/SB10 (amablemente proporcionado por el Dr. S. Ivics) se insertó en pCS2+U5 (Invitrogen/Life Technologies, Paisley, Reino Unido) para producir pCS2+U5U3. La secuencia codificante de la transposasa PB (2067 pb, número de acceso de GenBank: EF587698) se sintetizó mediante ATG:biosynthetic ( Merzhausen , Alemania) y se clonó en la cadena principal de pCS2+U5U3 entre las dos UTRs. El vector de control PB corresponde al plásmido pCS2+U5 no modificado (Figura 1, panel izquierdo).

Los diferentes vectores de transposones utilizados en este estudio se generaron introduciendo las repeticiones terminales invertidas (ITRs) de PB de 235 pb 3' y de 310 pb 5', sintetizadas por ATG:biosynthetic (Merzhausen, Alemania), en el plásmido pBluescript SK (pBSK ITR3'-ITR5', Figura 1, panel derecho). El gen de resistencia a la puromicina (PuroR), bajo el control del promotor SV40 del plásmido pRc/RSV (Invitrogen/Life Technologies), se insertó luego entre las dos ITRs. Los elementos MAR 1 -68 y MAR X-29, la resistencia a la puromicina y los genes GFP utilizados en este estudio fueron como se describió previamente. Los vectores de expresión de inmunoglobulina y las secuencias codificantes de SRP9, SRP14, SRP54, SRPRalfa, SRPRbeta, SEC61A1, SEC61B y SEC61G fueron como se describe por Le Fourn et al. (Metab. Eng., Epub 1 de febrero de 2013).

La GFP, la inmunoglobulina o las proteínas de secreción se expresaron utilizando un casete de expresión eucariótico compuesto por un potenciador de CMV humano y un promotor de GAPDH humano aguas arriba de la secuencia codificante, seguido de una señal de poliadenilación de SV40, el terminador de gastrina humana y un potenciador de SV40 (véase Le Fourn et al., 2013). Se insertaron casetes de expresión y/o elementos MAR entre las secuencias de ITR o en la cadena principal del vector bacteriano como se ilustra en la Figura 1 y en las leyendas de las figuras utilizando métodos de clonación estándares.

Análisis de cultivo celular y transfección

La línea celular CHO DG44 se cultivó en DMEM: F12 (Gibco) complementado con Hipoxantina/Timidina (HT, Gibco) y suero bovino fetal al 10 % (FBS, Gibco). Las transfecciones se realizaron utilizando PEI (JetPRIME, Polyplus Transfection), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se transfectaron con diversas cantidades de fuentes de pADN de transposasa PB (que varía entre 0 y 1500 ng) para experimentos de titulación o se co-transfectaron con la relación óptima de 300 ng de plásmido de expresión de transposasa PB y 300 ng de plásmido donante de transposones. Dos días después de la transfección, las células se transfirieron a varias placas de Petri de acuerdo con el experimento. Para el análisis de células CHO transfectadas no seleccionadas, las células se volvieron a sembrar sin selección de antibióticos durante 3 semanas y el porcentaje de células fluorescentes y la intensidad de fluorescencia de las células positivas para GFP se determinaron mediante análisis FACS utilizando un citómetro de flujo CyAn ADP (Beckman Coulter). Para el análisis del número de copias del gen de las células no seleccionadas, las células CHO positivas para GFP estables se clasificaron utilizando un FACSAriall. Para ensayos de recuento de colonias resistentes a antibióticos se sembraron 50.000 células transfectadas en placas de 100 mm y se seleccionaron con 5 pg/ml de puromicina durante 2 semanas. Luego, las colonias resistentes se fijaron y tiñeron en EtOH al 70 % y Azul de Metileno al 0,7 % durante 10 min, y se contaron las colonias de > 0,5 mm de diámetro. Para los estudios de expresión de GFP, las células se seleccionaron durante dos semanas antes del análisis FACS de fluorescencia de GFP como se describe arriba.

Las células CHO-M se mantuvieron en cultivo en suspensión en medio sin suero SFM4CHO Hyclone (TermoScientific) complementado con L-glutamina (PAA, Austria) y complemento HT (Gibco, Invitrogen life sciences) a 37 °C, 5 % de CO2 en aire humidificado. Los plásmidos donantes de transposones se transfirieron a estas células mediante electroporación de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Neon devices, Invitrogen). La cuantificación de la secreción de inmunoglobulina se realizó a partir de cultivos discontinuos como se describió previamente (véase Le Fourn et al., 2013). Brevemente, poblaciones de células que expresan inmunoglobulinas se evaluaron en cultivo discontinuo en tubos de minibiorreactores de 50 ml (TPP, Suiza) a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2 al 5 % durante 7 días. Las concentraciones de inmunoglobulina en los sobrenadantes de cultivos celulares se midieron mediante ELISA tipo sándwich.

Ensayos de número de copias del gen qPCR

Se aisló ADN total de agrupaciones de células estables de CHO después de los ensayos de transposición utilizando el kit de tejido DNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El número de copias de los transgenes integrados en el genoma se evaluó utilizando 6 ng de ADN genómico mediante PCR cuantitativa utilizando el kit de polimerasa SYBR Green- Taq de Eurogentec Inc y la máquina ABI Prism 7700 PCR (Applied Biosystems). Los cebadores GFP-Directo: ACATTATGCCGGACAAAGCC y GFP-Reverso: TTGTTTGGTAATGATCAGCAAGTTG se utilizaron para cuantificar el gen GFP, mientras que los cebadores B2M-Directo: ACCACTCTGAAGGAGCCCA y B2M-Reverso: GGAAGCTCTATCTGTGTCAA se utilizaron para amplificar el gen de la microglobulina Beta-2. Para el amplicón generado por los cebadores B2M, se encontró un resultado por genoma haploide de CHO después del alineamiento con el ensamblaje del genoma de CHO de los autores de la invención utilizando el software NCBI BLAST. Como las CHO son células casi diploides, se estimó que B2M está presente en 2 copias por genoma. Las relaciones del número de copias del gen diana de GFP se calcularon con respecto al gen de referencia B2M, como se describió previamente.

Clasificación y ensayo de células que expresan inmunoglobulina

Para clasificar magnéticamente las células que expresan IgG, se sembraron células CHO-M transfectadas a una densidad celular de 3 x 105 células por ml en medio SFM4CHO (Thermo Scientific) complementado con L-glutamina 8 mM y complemento 1x HT (ambos de Gibco), al que se alude como Medio Completo. Después de 4 días en cultivo, se lavaron 2 x 106 células, se resuspendieron en PBS y se incubaron con una IgG humana biotinilada (KPL216-1006) a una concentración final de 3 pg/ml, junto con 30 pl de Dynabeads recubiertas con estreptavidina MyOne T1 prelavadas (Invitrogen), en una rueda giratoria durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, la mezcla de células y perlas se colocó en un imán para separar las células marcadas de las no marcadas. Las perlas se lavaron 4 veces con una solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después del lavado final con PBS, las perlas y las células se volvieron a suspender en 500 pl de Medio Completo precalentado, se transfirieron a una placa de 24 pocillos y se incubaron a 37 °C con CO2 al 5 %. Después de 24 h, las células policlonales clasificadas magnéticamente se separaron de las perlas y la incubación continuó hasta que las células tuvieron una densidad suficiente para la expansión en biorreactores de tubo giratorio TPP de 50 mL (TECHNO PLASTIC PRODUCTS AG, Suiza).

Alternativamente, se aislaron dos clones de poblaciones no clasificadas y no seleccionadas que expresaban cada una de las tres IgGs utilizando un dispositivo ClonePix. Brevemente, se utilizaron medios semisólidos para inmovilizar células individuales, y las colonias que secretaban grandes cantidades de IgG se recogieron diez días después de la incrustación. Estas líneas celulares se pasaron cada 3-4 días en biorreactores de tubo giratorio a una densidad de 3 x 105 células/ml en un medio de crecimiento que contenía peptona (Hyclone SFM4CHO complementado con glutamina 8 mM) en una incubadora humidificada mantenida a 37 °C y 5 % de CO2, con agitación orbital a 180 rpm.

Los títulos de IgG se determinaron a partir de células sembradas a una densidad celular de 1 x 105 células por ml y se cultivaron durante 6 días en 5 ml de Medio Completo en biorreactores de tubo giratorio de 50 ml al evaluar las poblaciones de células policlonales. Alternativamente, se inocularon cultivos en matraz agitado de poblaciones clonales a una densidad de 3 x 105 células/ml en medio SFM4CHO para iniciar el proceso de producción semi-discontinuo. Los ensayos de producción semi-discontinua se realizaron con 25 ml de volumen de cultivo en matraces de agitación de 125 ml o 5 ml en tubos de cultivo TPP de 50 ml en incubadoras humidificadas mantenidas a 37 °C y 5 % de CO2 con agitación a 150 rpm (matraz de agitación de 125 ml y tubos giratorios). La producción se llevó a cabo durante diez días alimentando el 16 % del volumen de cultivo inicial de alimento concentrado químicamente definido (Hyclone, Cell Boost 5, 52 g/l) en los días cero, tres y seis a ocho. No se aplicó suministro de glutamina y glucosa durante el ciclo de cultivo. La viabilidad y densidad de células viables (VCD, por sus siglas en inglés) del cultivo se midió diariamente utilizando una máquina GUAVA (Millipore). Se utilizó un ensayo ELISA de doble sándwich para determinar las concentraciones de MAb secretados en los medios de cultivo.

Plásmidos y análisis PCR cuantitativos relativos

Los vectores de clonación utilizados en este estudio son los vectores de expresión de mamíferos Selexis SLXplasmid_082. La secuencia de luciferasa del vector de control pGL3 (Promega) se reemplazó por un casete de expresión eucariota compuesto por un potenciador de CMV humano y un promotor de GAPDH humano aguas arriba de la secuencia codificante de EGFP, seguido de una señal de poliadenilación de SV40, el terminador de gastrina humana y un potenciador de SV40. Dos elementos genéticos humanos derivados de MAR flanquean el casete de expresión y un gen de resistencia a la puromicina expresado a partir del promotor SV40, mientras que el SLXplasmid_082 se diferencia por el tipo de elemento MAR ubicado aguas arriba del casete de expresión (hMAR 1 -68 y hMAR X-29); Girod et al., 2007).

ADNc de las cadenas pesada y ligera de trastuzumab e infliximab se clonaron en un vector de expresión para reemplazar EGFP. Se preparó un vector que llevaba el casete de expresión tanto de cadena ligera como pesada de cada IgG combinando casetes de expresión de cadena ligera y pesada en un vector de plásmido. La secuencia del péptido señal de todas las cadenas pesadas y ligeras es idéntica, al igual que las porciones constantes de las cadenas ligeras. Las porciones constantes de las cadenas pesadas difieren en varias posiciones de aminoácidos (variantes DEL frente a EEM).

Los cebadores de amplificación por PCR y los números de acceso de GenBank de los ADNc de SRP9, SRP14, SRP54, SRPRalfa, SRPRbeta, SEC61A1 y SEC61B se enumeran en otra parte de esta memoria. Los productos de la PCR que codifican las proteínas de secreción se clonaron en un vector para reemplazar la secuencia de EGFP. Cuando se co­ expresaron múltiples proteínas de secreción, las secuencias terminales invertidas del transposón piggyBac se integraron en vectores para enmarcar el casete de expresión, y los vectores resultantes se co-transfectaron con un vector de expresión de transposasa piggyBac para mejorar la integración transgénica y obviar la necesidad de selección de antibióticos.

Un vector de expresión de transposasa PB típico es pCS2+U5V5PBU3 que contiene la secuencia codificante de transposasa PB rodeada por las regiones terminales no traducidas (UTR) 5' y 3' del gen de la p-globina de Xenopus laevis que se utilizó en experimentos relacionados. Este plásmido se construyó como sigue: el fragmento 3' UTR de 317 pb de pBSSK/SB10 se insertó en pCS2+U5 (Invitrogen/Life Technologies, Paisley, Reino Unido) para producir pCS2+U5U3. La secuencia codificante de la transposasa PB (2067 pb, número de acceso de GenBank: EF587698) se sintetizó mediante ATG:biosynthetic (Merzhausen, Alemania) y se clonó en la cadena principal de pCS2+U5U3 entre las dos UTRs. El vector de control PB corresponde al plásmido pCS2+U5 no modificado.

Se generaron diferentes vectores de transposones introduciendo las repeticiones terminales invertidas (ITRs) PB de 235 pb 3' y de 310 pb 5', sintetizadas por ATG:biosynthetic (Merzhausen, Alemania), en el plásmido pBluescript SK (pBSK ITR3'- ITR5'). El gen de la neomicina fosfotransferasa (NeoR), bajo el control del promotor SV40 del plásmido pRc/RSV (Invitrogen/Life Technologies), se insertó luego entre las dos ITRs. Los elementos MAR 1-68 y MAR X-29, la resistencia a la puromicina y los genes GFP utilizados en este estudio fueron los descritos previamente (Girod et al. 2007; Grandjean et al. 2011; Hart y Laemmli 1998). Los vectores de expresión de inmunoglobulina y las secuencias codificantes de SRP9, SRP14, SRP54, SRPRalfa, SRPRbeta, SEC61A1 y SEC61B se describen en esta memoria. Las proteínas de secreción se expresaron utilizando un casete de expresión eucariótica compuesto por un potenciador de CMV humano y un promotor de GAPDH humano aguas arriba de la secuencia codificante, seguido de una señal de poliadenilación de SV40, el terminador de gastrina humana y un potenciador de SV40. Se insertaron casetes de expresión y/o elementos MAR entre las secuencias ITR o en la cadena principal del vector bacteriano utilizando métodos de clonación estándares.

Sistemas de transposones PiggyBac que incluyen las ITRs 3' y 5' apropiadas, así como la transposasa, están disponibles, p. ej., de SYSTEM BIOSCIENCE.

Para el análisis por PCR cuantitativa relativo, se extrajo el ARN total de 1 x 105 células y se transcribió inversamente en ADNc utilizando el kit FastLane Cell cDNA (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las expresiones de SRP14 y GAPDH se cuantificaron mediante qPCR utilizando Rotor Gene Q (Qiagen) y LightCycler® 480 SYBR Green I Master (Roche) utilizando los cebadores enumerados en Supl. Tabla S1. Los niveles de ARN mensajero de SRP14 se normalizaron a los de GAPDH utilizando el software Rotor-Gene Q Series (Qiagen).

Cultivo celular, transfección estable y subclonación de líneas celulares CHO

Células de ovario de hámster chino (CHO-K1) en suspensión se mantuvieron en medio sin suero SFM4CHO Hyclone (TermoScientific) complementado con L-glutamina (PAA, Austria) y complemento HT (Gibco, Invitrogen life sciences) a 37 °C, 5 % de CO2 en aire humidificado. Células CHO-K1 se transfectaron con vectores de expresión de cadenas pesadas y ligeras de trastuzumab o infliximab que portaban el gen de resistencia a la puromicina mediante electroporación de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Neon devices, Invitrogen). Dos días más tarde, las células se transfirieron a placas T75 en medio que contenía 10 pg/ml de puromicina y las células se cultivaron adicionalmente bajo selección durante dos semanas. A continuación, se generaron clones de células individuales estables que expresaban IgG Trastuzumab e Infliximab mediante dilución limitante, se expandieron y analizaron para determinar el rendimiento del crecimiento y los niveles de producción de IgG. Se seleccionaron clones de células productoras de IgG trastuzumab e infliximab que expresaban los niveles más altos de IgG para experimentos bioquímicos adicionales. A continuación, algunos de estos clones se co-transfectaron con el vector que expresa SRP14 y un plásmido que porta el gen de resistencia a la neomicina mediante electroporación. A continuación, las células se cultivaron en medio que contenía 300 pg/ml de G418 durante dos semanas como se describe anteriormente. Los clones estables se aislaron mediante dilución limitada y la expresión de SRP14 se confirmó mediante ensayos de Q-PCR antes de la expansión del cultivo para el análisis bioquímico.

Cultivo discontinuo y semi-discontinuo

Se evaluaron los rendimientos de crecimiento y producción de clones individuales que expresan trastuzumab e infliximab en cultivo discontinuo en un minibiorreactor de 50 ml (TPP, Suiza) a 37 °C en una incubadora humidificada con 5 % de CO2 durante 7 días. El día 3, el día 4 y el día 7 del cultivo celular, se determinaron la densidad celular y la viabilidad utilizando el sistema de citometría de flujo Guava EasyCyte (Millipore). El título de IgG en los sobrenadantes de cultivos celulares se midió mediante ELISA tipo sándwich. La densidad celular (Cv.ml-1) y los valores de título de IgG (pg.ml-1) se representaron en el día de muestreo del tiempo de proceso indicado. La productividad específica de IgG de los clones que expresan Trastuzumab e Infliximab se determinó como la pendiente de la concentración de IgG frente al número integral de células viables (IVCD) calculada desde el día 3 hasta el día 7 (fase de producción) y expresada como pg por célula y por día (pcd).

Para cultivos de producción semi-discontinua, las células se sembraron a razón de 0,3 x 106 células/ml en matraces de agitación de 125 ml en 25 ml de medio exento de suero SFM4CHO Hyclone. Los cultivos se mantuvieron a 37°C y 5 % de CO2 bajo agitación. Los cultivos se alimentaron diariamente con Hyclone Feed comercial (TermoScientific). Se evaluaron diariamente las densidades celulares y la producción de IgG.

Análisis de Agregación y Expresión de Proteínas

Proteínas citoplásmicas solubles se extrajeron permeabilizando las células con Triton X-100 al 1 % en tampón PBS en presencia de un cóctel inhibidor de proteasas (Roche, inc.). Después de una incubación de 30 min en hielo, las células se centrifugaron durante 10 min a 14.000 rpm. Al sobrenadante se le aludió como la fracción de "proteínas citosólicas y ER solubles". El sedimento se disolvió mediante tratamiento con ultrasonidos en tampón de urea Laemmli (Tris 62,5 mM, SDS al 2 %, urea 8 M, glicerol al 5 %, colorante azul de bromofenol), proporcionando la fracción de proteína insoluble agregada y vesicular. Las fracciones soluble e insoluble se ajustaron luego en tampón Laemmli que contenía o no 2-mercaptoetanol y se hirvieron durante 8 min a 95°C. Las muestras reductoras y no reductoras se separaron en geles de acrilamida con un gradiente de 10 % o 4-10 % mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), respectivamente.

A continuación, las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Después del bloqueo en leche al 5 % diluida en TBS-Tween (Tris 20 mM, NaCl 0,5 M, Tween 20 al 0,1 %), se analizaron las membranas para detectar diferentes proteínas utilizando los siguientes anticuerpos primarios: IgG anti-humana (H+L)-HRP conjugado anticuerpo de burro (JK immunoresearch, n° 709035149, 1:5000), anticuerpo policlonal de conejo BiP anti-humano (Cell Signaling, BiP, C50B12, 1:2000), anticuerpo monoclonal de ratón CHOP anti-humano (Cell Signaling, CHOP, L63F7, 1:500), anticuerpo policlonal de cabra GAPDH anti-humano. Después de una incubación durante la noche a 4 °C, cada uno de los borrones de transferencia se sondeó con IgG anti-conejo conjugada con HRP o IgG anti-ratón (Cell Signaling, 1:20000). Se detectaron proteínas específicas reconocidas por cada uno de los anticuerpos utilizando reactivos ECL y exposición a película ECL (Amersham Biosciences).

Experimentos de Búsqueda de Proteínas basados en Cicloheximida

Se llevaron a cabo experimentos de búsqueda basados en cicloheximida en clones de CHO-K1 productores de IgG alta (HP) y baja (LP). Se sembraron números iguales de células en placas de 6 pocillos en medio de cultivo completo complementado con 100 pM de cicloheximida (Sigma). En diversos momentos, las células se recolectaron y lisaron en PBS, Triton X-100 al 1 %. A continuación, las fracciones soluble e insoluble en Tx se resolvieron en SDS-PAGE no reductora de acrilamida al 4-10 % y se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpo IgG anti-humano.

Ensayos Diferenciales de Fraccionamiento de Detergente

El fraccionamiento de proteínas citosólicas de las proteínas de membrana se realizó mediante extracción diferencial con detergente del sedimento celular. Las células se lavaron primero en 1 ml de PBS y la membrana plasmática de las células Hp y LP se permeabilizó en tampón KHM (KAc 110 mM, HEPES 20 mM, MgCl22 mM, pH 7,2) que contenía digitonina al 0,01 % (Sigma) durante 10 min en presencia de o no de Triton X-100 al 1 %. Las células semipermeabilizadas se lavaron una vez en tampón KHM y se añadió Tripsina a razón de 50 pg/ml durante 10 min a temperatura ambiente para digerir las proteínas solubles. La digestión con Tripsina se detuvo mediante la adición de PMSF 1 mM y AEBSF 4 mM. Las células se recolectaron por centrifugación y las proteínas solubles se extrajeron en presencia de Triton X-100 e inhibidores de proteasa como se describe en la sección 2.4. Se añadió tampón de Laemmli reductor que contenía 2-mercaptoetanol a las fracciones de sedimento y sobrenadante, que luego se sometieron a SDS-PAGE al 8 %. Se realizó inmunotransferencia para detectar proteínas IgG y BiP.

Reticulación de proteínas y análisis de transferencia Western

Células LP de Infliximab se lavaron una vez en PBS y se incubaron con o sin 1 mM del reticulante de ditiob¡s(prop¡onato de succinimidilo) (DSP) (ThermoScientific ) durante 30 min en hielo. La reticulación se extinguió mediante la adición de Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) durante 10 min antes de la extracción de proteínas en tampón PBS que contenía Triton X-100 al 1 %. Después de centrifugar durante 10 min a 14.000 rpm en una microcentrífuga, la fracción insoluble de Triton X-100 o el extracto de proteína completa se analizaron mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras, se sometieron a inmunotransferencia y se sondaron con anticuerpos anti-BiP y anti-LC. Se analizaron en paralelo cantidades iguales de proteínas de la fracción insoluble en Tx.

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TABLA B: LISTA EJEMPLAR DE shARN EXPRESADOS UTILIZANDO, P. EJ., VECTORES DE TRANSPOSÓN

PIGGYBAC ESPECÍFICOS

TABLA C: LISTA DE EJEMPLOS DE siARN (CADENA SENTIDO) Y EJEMPLOS DE shARN CREADOS A PARTIR DE LOS CORRESPONDIENTES siARN

53BP1_1 UCAGAAUGAUGACAAAGUA

53BP1_2 GAGCAAGGAGACAAUAAUA

53BP1_3 CAAAGACAUCCCUGUUACA

Brca1_1 CCACG UAACUGAAAU UAUA

Brca1_2 AAGGCUGAGUUCUAUAAUA

Brca1 3 AGAGCCAAAUGAACAAAGA

Brca2_1 GAAGCUGUUUUACAGAAUGA

Brca2_2 CAAUGACUAUACAGACAAA

Brca2_3 AACAGACGGUGCCAUAAA

cycD1_1 CUBIERTA DE BLOQUEO

cycD1_2 CGCACUUUCUCCAGAGU

cycD1_3 UGCCAGAGGCGGAUGAGAA

ADN-PKcs_1 GGAUCGAGCUGUUCGAAA

ADN-PKcs_2 AGAUGAUGUUCACUCUAAAA

ADN-PKcs_3 AUCCAUCGGUAUCUUAAAA

Ku70_1 GGUGCCCUUUACUGAGAAA

Ku70_2 AAAGCCCCAAGGUAGGUA

Ku70_3ACAUUUCCAAGACACAAU U

Ku80_1 GAAACUGUCUUAUUGCUUAA

Ku80_2 CCAUAGGGAAGAAGUUUGA

Ku80_3 GGAUUCCUAUGAGUGUUUUA

LigIV_1 AGAGCCUCCUCAGUAAU

LigIV_2 CUAUACAGCAGGUAAAUGA

LigIV_3 AGAGGUAUCCUUAA

Rad51_1 GUGCCAAUGAUGUGAAAGAA

*Secuencia codificante de shARN de Rad51 correspondiente:

ACAAG CTTG TGCCAAT 6AT GT GAAGAATT C AAG AGATT CTT C AC AT CATT G G CACTCTAGAG TCGGGGCGGCCGGCC

Rad51_2 GGGAAUUAGGUAAGCCAAA

**Secuencia codificante de shARN de Rad51 correspondiente:

ACAAGCTTGGGAATTAGTGAAGCCAAATTCAAGAGATTTGGCTTCACTAATTCCCTCTAGAG TCGGGGCGGCCGGCC

Rad51_3 GGCCUCAGAAAUCAUACA

**Secuencia codificante de shARN de Rad51 correspondiente:

ACAAG CTTG G CGTT C AGAAAT CATACATT C AAGAGAT GTAT G ATTT CTGAACGCCTCTAGAG TCGGGGCGGCCGGCC

Rad51b_1 ACAGCCUAUGAUAUAAAGA

Rad51b_2 PRECAUCIÓN

Rad51b_3 GUACCUGGCUGAGGAUUU

Rad51 c_1 UGAUCAGCCUGGCAAUAA

Rad51c_2 AGAGGAAGCUUUAACU

Rad51c_3 GGAUGAAGAACACCAGAAA

Rad51d_1 ACGGAGCAGACCUAUAUGA

Rad51d_2 CCCAAGAUGAGGAGAAACA

Rad51d_3 GCCUGGACAAACUACUUGA

Rad52_1 UGAGAUGUUUUGGUUACAAU

Rad52_2 ACUGCAUUCUGGACAAAGA

Rad52_3 CCCUGAAGACAACCUUGAA

Rad54_1 AGAAGACCUGCUAUAUUUA

Rad54_2 CAUCAGAUAUCCUCUCUAA

Rad54 3 GAAGCUAUGUAACCAUCCA

Xrcc2_1 GAAGGUUUCUCAGCUCCUA

Xrcc2_2 CAACACAAAAGUCUAAUGCA

Xrcc2_3 AUCAGAGGGGUGACUGCAA

Xrcc3_1 CCACAUCUUCAUCGAGCAU

Xrcc3_2 ACGGUGGAGGAGCAAGAGU

Xrcc3_3 GAUCAGAUUCAGCAACCAC

Xrcc4_1 AUAUGCUGAUGAAUUGAGA

Xrcc4_2 CUGAAAGAUGUCUCAUUUA

Xrcc4_3 AUGAGCACCUGCAGAAAGA

Control 1 Neg. AGGUAGUGUAAUCGCCUUG

Control 2 Neg. GACGACUCACAUACGUAAA

Control 3 Neg.GAAUAUAUCGCGAAAUGUA

( * ) ( ** ) ( *** ) ilustran la estructura de una secuencia de ADN que codifica shARN de las secuencias de siARN enumeradas utilizando las moléculas que fijan como objetivo a Rad51 como ejemplos. La secuencia de ADN correspondiente a la cadena de siARN mostrada está subrayada, mientras que la secuencia complementaria que permite la formación de horquilla está subrayada dos veces.

TABLA D: GENES SELECCIONADOS DE CIERTAS VÍAS DE RECOMBINACIÓN

(continúa)

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico recombinante, que comprende:

una repetición terminal invertida (ITR) específica de transposón en 5' y una en 3',

al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de procesamiento de expresión transgénica (TEP), ubicada entre las ITRs 5' y 3' y que está bajo el control de un promotor, y

al menos un elemento de región de unión a la matriz (MAR) ubicado entre las ITRs 5’ y 3’,

al menos un transgén ubicado entre las ITRs 5' y 3', estando el transgén bajo el control de un promotor transgénico,

en donde dicha proteína TEP es hSERCA2, hNRF2, hCOSMC, hCILZ, hHK1, hBeclin-1 o hW ipl; y en donde dicho elemento MAR se selecciona de las SEQ ID n O: 1 (mAr 1-68), 2 (MAR 1_6), 3 (Ma RX_S29), 4 (MARS4), 5 (MAR de lisozima de pollo), o es un homólogo reorganizado que tiene al menos 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1 a 5; y

en donde la TEP expresada a través de dicha molécula de ácido nucleico y el elemento MAR son capaces de aumentar la expresión del transgén en una célula de mamífero en al menos un 10 %.

2. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicación 1.

3. El vector de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el vector comprende un elemento MAR singular, o dos o más elementos MAR, en donde dicho(s) elemento(s) están ubicados entre las ITRs 5' y 3'.

4. El vector de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el vector comprende dos elementos MAR, en donde un primer elemento MAR está posicionado aguas arriba de la TEP y un segundo elemento MAR está posicionado aguas debajo de la TEP, en donde el primer elemento MAR comprende un elemento MAR 1_6 o un elemento que tiene al menos 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO.2, en particular ^m A^rs reorganizados basados en MAR 1-6, más en particular elementos que tienen al menos 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO 8 (MARs 1_6R2) y el segundo elemento MAR comprende un elemento MAR 1-68 o un elemento que tiene al menos 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 1.

5. El vector de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el vector comprende el elemento MAR singular, en donde el elemento MAR singular está posicionado aguas debajo de la TEP, en donde el elemento MAR singular es un elemento MAR 1-68 o un elemento MAR X-29 o un elemento que tiene al menos 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con las SEQ ID Nos: 1 o 3, en particular un MAR reordenado basado en MAR 1-68 o un MAR X-29, en particular un elemento que tiene al menos 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NOs: 6, 7 o 10 (MARs 1_68R, 1_68R2 o X_29R3) o 9, y es preferiblemente un elemento MAR X-29 o un elemento que tiene al menos 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 3.

6. Un método para expresar un transgén y una proteína de procesamiento de expresión transgénica (TEP) in vitro que comprende:

proporcionar una célula de mamífero recombinante, que comprende un transgén e introducir un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en la célula de mamífero recombinante, que expresa el transgén y la TEP, en donde la TEP expresada a través de dicho vector aumenta la expresión de un transgén en dicha célula de mamífero en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60% o al menos un 70%.

7. El método de la reivindicación 6, en el que el vector comprende un elemento MAR X-29 singular o una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 3 y en el que, después de más de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 semanas de cultivo, la TEP expresada a través de dicho vector aumenta la expresión de un gen de interés en al menos un 10 %, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60% o al menos un 70%.

8. Una célula de mamífero recombinante que comprende no más de 20, 15, 10 o 5 moléculas de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, preferiblemente integradas en el genoma de la célula como copias individuales.

9. Una célula de mamífero recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicación 1.

10. La célula de mamífero recombinante de la reivindicación 9, en donde al menos un transgén expresa una proteína terapéutica tal como una inmunoglobulina, una hormona tal como eritropoyetina o un factor de crecimiento y en donde en la célula de mamífero recombinante se incrementa la integración y/o expresión del transgén con respecto a una célula que no comprende dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico recombinante.

11. La célula de mamífero recombinante de la reivindicación 9 o 10, en donde la célula es una célula madre primaria, una célula de hámster, p. ej., CHO o una célula humana, tal como HEK293.

12. Un método para transfectar in-vitro células de mamífero, en particular células de hámster, que comprende: transfectar, opcionalmente en una primera transfección, dichas células de mamífero con al menos una, al menos dos, al menos tres o al menos cuatro moléculas de ácidos nucleicos recombinantes de acuerdo con la reivindicación 1.

13. Un kit que comprende en un recipiente al menos un vector que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 y, en un segundo recipiente opcional, un vector que codifica una transposasa compatible y en un recipiente adicional instrucciones sobre cómo utilizar el vector o vectores.

14. Uso in vitro de un ácido nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 y/o una célula de mamífero recombinante de acuerdo con la reivindicación 9 o 10 para aumentar la integración y/o expresión transgénica.