JP6563816B2 - 増強された導入遺伝子発現およびプロセシング - Google Patents

増強された導入遺伝子発現およびプロセシング Download PDF

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Description

本発明は、例えば、ＥＲ膜を横切る移行および／または細胞膜を横切る分泌などの細胞代謝を媒介するかまたは該細胞代謝に影響を及ぼす代謝経路に関与または作用する核酸構築物ならびにタンパク質を提供することに関し、および、細胞代謝に影響を及ぼすための方法を提供することにも関する。本発明はまた、例えば、多種多様な異種タンパク質（導入遺伝子発現産物）の移行／分泌が変更されている組換え哺乳類細胞の生産および使用にも関する。これらの方法、核酸構築物は、一般的に、導入遺伝子発現が向上するように設計される。
治療タンパク質の生物工学的生産ならびに遺伝子治療および細胞治療は、真核細胞に導入される導入遺伝子発現の成功に依存する。導入遺伝子発現の成功には、一般的に、導入遺伝子が宿主染色体に組込まれることが必要であり、また、導入遺伝子発現の成功は、とりわけ、組込まれた導入遺伝子のコピー数によって、ならびに、低い転写率もしくは不安定な転写および／または高いクローン変異性をもたらし得るエピジェネティック効果によって、制限される。導入遺伝子発現産物の細胞外への輸送の失敗または減少もまた、治療タンパク質の生産ならびに遺伝子治療および細胞治療を制限する場合が多い。
本発明を説明し、特に、実施に関するさらなる詳細を提供するために本明細書で使用される特許、特許出願および受託番号を含む出版物ならびに他の資料は、参照によりその全体が本明細書に組込まれる。
哺乳類細胞における導入遺伝子発現を増加および安定化させるために、エピジェネティック調節因子が、負の位置効果から導入遺伝子を保護するためにますます用いられている（Ｂｅｌｌ ａｎｄ Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ，１９９９）。これらのエピジェネティック調節因子には、境界またはインスレーターエレメント、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）、安定化および抗リプレッサー（ＳＴＡＲ）エレメント、遍在作用性クロマチンオープニング（ＵＣＯＥ）エレメントならびに前述のマトリックス結合領域（ＭＡＲ）が含まれる。これらのエピジェネティック調節因子の全ては、哺乳類細胞株における組換えタンパク質生産のため（Ｚａｈｎ−Ｚａｂａｌ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００４）および遺伝子治療のため（Ａｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｃａｓｔｉｌｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）に使用されている。
導入遺伝子発現産物は、プロセシングおよび細胞外への輸送中に、異なるボトルネックに遭遇する場合が多い。すなわち、生来のタンパク質をプロセシングおよび輸送するための機構が備わっているのみの細胞は、特定の種類の導入遺伝子発現産物の輸送によって容易に過負荷となることがあり、特に、この特定の種類の導入遺伝子発現産物がしばしば望まれるような異常に高いレベルで生成された場合に、それらの輸送によって容易に過負荷となり、これにより細胞内に産物が凝集し、および／または、例えば、機能タンパク質産物の適切な折りたたみが阻止される。
輸送およびプロセシングのボトルネックを克服するための別のアプローチが探求されている。例えば、分泌特性が改善されたＣＨＯ細胞は、膜性小胞輸送つまり分泌タンパク質のエキソサイトーシスの調節因子として機能するＳＭタンパク質のＭｕｎｃ１８ｃまたはＳｌｙ１の発現によって遺伝子操作された（米国特許公開第２００９０２４７６０９号）。分泌細胞分化ならびにＥＲの維持および拡大を調節する転写因子であるＸボックス結合タンパク質１（Ｘｂｐ１）、または様々なプロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）は、ＥＲストレスを減少させて、タンパク質分泌を増加させるために用いられてきた（Ｍｏｈａｎ ｅｔ ａｌ．２００７）。タンパク質分泌を増加させるための他の試みには、シャペロンであるＥＲｐ５７、カルネキシン、カルレティキュリンおよびＢｉＰ１のＣＨＯ細胞における発現が含まれていた（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４）。低温ショックによって誘導されるタンパク質の発現、特に、低温誘導性ＲＮＡ結合タンパク質（ＣＩＲＰ）の発現が、組換えγインターフェロンの収量を増加させることが示された。分泌複合体のタンパク質を過剰発現させる試みも行われた。しかし、例えば、ＷＴヒト細胞（例えば、低レベルでＳＲＰ１４を発現するようには遺伝子操作されていない細胞）における外因性ＳＲＰ１４の発現が、分泌型アルカリホスファターゼタンパク質の分泌効率を向上させなかったことがＬａｋｋａｒａｊｕら（２００８）によって報告された。
このように、効率的で信頼性の高い導入遺伝子発現、例えば、組換えタンパク質生産の必要性、および、遺伝子治療の必要性がある。導入遺伝子発現産物を細胞外に首尾よく輸送する必要性もある。
当技術分野における上記およびその他の必要性は、本発明の実施形態によって取り組まれる。
本発明は、一実施形態において、以下を含む組換え核酸分子に関する：
（ａ）５’および３’トランスポゾン特異的逆位末端配列（ＩＴＲ）、
（ｂ）該５’ＩＴＲと３’ＩＴＲの間に位置しかつプロモーターの制御下にあり、導入遺伝子発現プロセシング（ＴＥＰ）タンパク質またはＴＥＰ機能性ＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸配列、および
（ｃ）任意選択で、同様に該５’ＩＴＲと３’ＩＴＲの間に位置しかつ導入遺伝子プロモーターの制御下にある少なくとも１つの導入遺伝子（前記核酸分子は、任意で、ベクターの一部である）。
上記組換え核酸分子は、少なくとも１つのエピジェネティック調節エレメント、特に少なくとも１つのＭＡＲ（マトリックス結合領域）エレメントを含み得る。
上記ＭＡＲエレメントは、該５’ＩＴＲと３’ＩＴＲの間に位置し得る。任意で、さらなるプロモーターの制御下にある、抗生物質耐性遺伝子または免疫グロブリンをコードする遺伝子などの導入遺伝子は、該５’ＩＴＲとＭＡＲの間などの該５’ＩＴＲと３’ＩＴＲの間に位置し得る。
上記ＴＥＰタンパク質またはＴＥＰ機能性ＲＮＡは、核酸配列のゲノムへの組み込み、導入遺伝子のＲＮＡ産物のプロセシングもしくは翻訳に、直接的または間接的に関与するか、または、導入遺伝子発現産物などのタンパク質のＥＲ移行、分泌、プロセシング、折りたたみ、ＥＲ−ゴルジ−原形質膜輸送、グリコシル化および／または別の翻訳後修飾に関与する、タンパク質または機能性ＲＮＡであり得る。
上記ＴＥＰタンパク質は、タンパク質分泌経路のタンパク質、ＤＮＡ組換えもしくは修復経路のタンパク質、ＢｉＰなどのシャペロンを含むタンパク質プロセシングもしくは代謝に係るタンパク質、またはそれらの組合せであり得る。
上記ＴＥＰタンパク質は、タンパク質分泌経路の以下のタンパク質：ｈＳＲＰ１４、ｈＳｅｃ６１α１、ｈＳｅｃ６１β、ｈＳｅｃ６１γ、ｈＳＲＰ５４、ｈＳＲＰ９、ｈＳＲＰＲα、ｈＳＲＰβ、およびｈＣＡＮＸ、のうちの１つまたは複数であり得る。
上記ＴＥＰタンパク質はまた、タンパク質分泌経路のタンパク質の以下のアミノ酸配列：配列番号１３を有するｈＳＲＰ１４、配列番号１５を有するｈＳｅｃ６１α１、配列番号１７を有するｈＳｅｃ６１β、配列番号１９を有するｈＳｅｃ６１γ、配列番号２１を有するｈＳＲＰ５４、配列番号２３を有するｈＳＲＰ９、配列番号２５を有するｈＳＲＰＲα、配列番号２７を有するｈＳＲＰβ、および配列番号２９を有するｈＣＡＮＸのうちの１つまたは複数にも対応し得、および／または特定配列と８０％、９０％、９５％または９８％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列に対応し得る。
上記ＴＥＰタンパク質は、以下のタンパク質プロセシングまたは代謝に係るタンパク質：ｈＵＣＰ４、ｈＣＭＰＳＡＴ、ｒＳＴ６Ｇａｌ１、ｈＣＯＭＳＣ、ｈＴ−シンターゼ、ｈＰ４ＨＡ１、ｈＰ４ＨＢ、ｈＧＩＬＺ、ｈＣｙＰＢ、ｈＮＲＦ２、ｈＨＫ１、ｈＰＤＩ、ｈＰＩＮ１、ｈＳＥＰＷ１、ｈＣＡＬＲ、ｈＤＤＯＳＴ、ｈＨＳＰ４０、ｈＡＴＰ５Ａ１、ｈＳＥＲＣＡ２、ｈＰＤＩＡ４、ｈＨＳＣ７０／ＨＳＰＡ８、ｈＨＹＯＵ１、ｈＣＭＰ−ＳＡＳ、ｈベクリン−１、ｈＥＲｄｊ３、ＣＨＯ−ＡＧＥ、ｈＷｉｐ１、ｈＲＴＰ４、ｈＲＥＥＰ２、ｈＤＰＭ１およびｈＤＲｉＰ７８のうちの１つまたは複数であり得る。
上記ＴＥＰタンパク質はまた、以下のタンパク質プロセシングまたは代謝に係るタンパク質のアミノ酸配列：配列番号３１を有するｈＵＣＰ４、配列番号３３を有するｈＣＭＰＳＡＴ、配列番号３５を有するｒＳＴ６Ｇａｌ１、配列番号３７を有するｈＣＯＭＳＣ、配列番号３９を有するｈＴ−シンターゼ、配列番号４１を有するｈＰ４ＨＡ１、配列番号４３を有するｈＰ４ＨＢ、配列番号４５を有するｈＧＩＬＺ、配列番号４７を有するｈＣｙＰＢ、配列番号４９を有するｈＮＲＦ２、配列番号５１を有するｈＨＫ１、配列番号５３を有するｈＰＤＩ、配列番号５５を有するｈＰＩＮ１、配列番号５７を有するｈＳＥＰＷ１、配列番号５９を有するｈＣＡＬＲ、配列番号６２を有するｈＤＤＯＳＴ、配列番号６４を有するｈＨＳＰ４０、配列番号６６を有するｈＡＴＰ５Ａ１、配列番号６８を有するｈＳＥＲＣＡ２、配列番号７０を有するｈＰＤＩＡ４、配列番号７２を有するｈＨＳＣ７０／ＨＳＰＡ８、配列番号７４を有するｈＨＹＯＵ１、配列番号７６を有するｈＣＭＰ−ＳＡＳ、配列番号７８を有するｈベクリン−１、配列番号８０を有するｈＥＲｄｊ３、配列番号８２を有するＣＨＯ−ＡＧＥ、配列番号８４を有するｈＷｉｐ１、配列番号８６を有するｈＲＴＰ４、配列番号８８を有するｈＲＥＥＰ２、配列番号９０を有するｈＤＰＭ１および配列番号９２を有するｈＤＲｉＰ７８のうちの１つまたは複数にも対応し得、および／または特定配列と８０％、９０％、９５％または９８％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列に対応し得る。
上記ＴＥＰタンパク質は、シャペロンであり得、具体的には、ＢｉＰタンパク質、より具体的には、配列番号６０と８０％、９０％、９５％または１００％の配列同一性を有する遺伝子操作されたショウジョウバエＢＩＰタンパク質誘導体（ＤｒｏＢｉＰ）であり得る。
上記ＭＡＲエレメントは、配列番号１（ＭＡＲ １−６８）、配列番号２（ＭＡＲ １＿６）、配列番号３（ＭＡＲ Ｘ＿Ｓ２９）、配列番号４（ＭＡＲ Ｓ４）、配列番号５（ニワトリリゾチームＭＡＲ）から選択されてよく、または好ましくは、遺伝子操作された対応物、特に再構成された対応物であり、および／または、配列番号１〜５のいずれか１つもしくは配列番号６〜１０のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する。
前記細胞内の該ＴＥＰ機能性ＲＮＡは、ＤＮＡ組換えまたはＤＮＡ修復経路のタンパク質の少なくとも１つの発現を妨げる機能性ＲＮＡをコードする核酸配列、好ましくはｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをコードする核酸配列を含み得る、あるいは該核酸配列からなり得る。前記ＤＮＡ組換えまたはＤＮＡ修復経路のタンパク質としては、限定されるものではないが、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｂ、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｘｒｃｃ２、Ｘｒｃｃ３、Ｒａｄ５２、Ｒａｄ５４、Ｂｒｃａ１、Ｂｒｃａ２、サイクリンＤ１、Ｅｒｃｃ、ＭＤＣ１、Ｂａｒｄ１、リガーゼ１、Ｍｒｅ１１および／または５３ＢＰ１などがある。
上記ＴＥＰ機能性ＲＮＡはまた、配列番号９３を有するＲａｄ５１、配列番号９４を有するＲａｄ５１Ｂ、配列番号９５を有するＲａｄ５１Ｃ、配列番号９６を有するＲａｄ５１Ｄ、配列番号９９を有するＸｒｃｃ２、配列番号１００を有するＸｒｃｃ３、配列番号９７を有するＲａｄ５２、配列番号９８を有するＲａｄ５４、配列番号１０１を有するＢｒｃａ１、配列番号１０２を有するＢｒｃａ２、配列番号１０３を有するサイクリンＤ１、配列番号１０４を有するＥｒｃｃ１、配列番号１０５を有するＭＤＣ１、配列番号１０６を有するＢａｒｄ１、配列番号１０７を有するリガーゼ１、配列番号１０８を有するＭｒｅ１１および／または配列番号１０９を有する５３ＢＰ１と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する遺伝子の発現も妨げ得る。
上記組換え核酸分子は、少なくとも５０００、６０００、７０００、８０００、９００００または１００００ｂｐの長さであり得る。
上記５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、スリーピングビューティー（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ）トランスポゾンの、または好ましくはピギーバック（ＰｉｇｇｙＢａｃ）トランスポゾンの、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲであり得る。
哺乳類細胞へ導入する導入遺伝子を含む組換え核酸分子のうちの１つの第１のトランスフェクション、および、続いて行う導入遺伝子を含むさらなる組換え核酸分子の第２のトランスフェクションの際に、導入遺伝子の組込みおよび／または発現は、前記第１のトランスフェクションを行っていない細胞と比較して、前記細胞において増加し得る。
本明細書で言及した上記ＴＥＰコード配列またはＴＥＰ機能性ＲＮＡは、発現ベクターを含むベクターの一部であり得る。該ベクターは、単一ＭＡＲエレメント、２つ以上のＭＡＲエレメントを含み得、前記エレメント（複数可）は、該５’ＩＴＲと３’ＩＴＲの間に位置し得る。
例えば、該ベクターは、２つのＭＡＲエレメントを含み得る。第１のＭＡＲエレメントは上記ＴＥＰまたはＴＥＰ機能性ＲＮＡの上流に位置し得、第２のＭＡＲエレメントは上記ＴＥＰまたはＴＥＰ機能性ＲＮＡの下流に位置し得る。ここで、該第１のＭＡＲエレメントは、ＭＡＲ １＿６エレメントおよび／または配列番号２と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するエレメント、具体的には、ＭＡＲ １＿６に基づいた再構成ＭＡＲ、より具体的には、配列番号８（ＭＡＲ １＿６Ｒ２）と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するエレメントを含み得、該第２のＭＡＲエレメントは、ＭＡＲ １−６８エレメントおよび／または配列番号１と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するエレメントを含み得る。
該ベクターはまた、単一ＭＡＲエレメントも含み得る。該単一ＭＡＲエレメントは、該ＴＥＰまたはＴＥＰ機能性ＲＮＡの下流に位置し得る。ここで、該単一ＭＡＲエレメントは、ＭＡＲ １−６８もしくはＭＡＲ Ｘ−２９エレメントおよび／または配列番号１もしくは３と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するエレメント、具体的には、ＭＡＲ １−６８もしくはＭＡＲ Ｘ−２９に基づいた再構成ＭＡＲ、具体的には、配列番号６、配列番号７もしくは配列番号１０（ＭＡＲ １＿６８Ｒ、ＭＡＲ １＿６８Ｒ２もしくＭＡＲ Ｘ＿２９Ｒ３）または配列番号９と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するエレメントであり得、好ましくは、ＭＡＲ Ｘ＿２９エレメントおよび／または配列番号３と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するエレメントであり得る。
上記ＴＥＰまたはＴＥＰ機能性ＲＮＡは、ＥＦ１αプロモーターの制御下にあり得、任意選択で、その後にＢＧＨポリＡシグナルが続く。
該ベクターは、ＧＡＰＤＨ、ＳＶ４０ｐ、ＣＭＶ、ＣＨＯ ＥＦ１α、ＣＨＯ Ａｃｔｂおよび／またはＣＨＯ Ｈｓｐａ５などのプロモーター（複数可）、および／または、エンハンサー（複数可）、またはこれらの融合体、あるいはこれらの遺伝子操作された融合体、例えばＣＧＡＰＤＨなど、を含み得る。
該ベクターの一部である上記プロモーターは、配列番号１１１を有するＧＡＰＤＨ、配列番号１１４を有するＳＶ４０ｐ、配列番号１１３を有するＣＭＶｐ、配列番号１１２を有するＣＨＯ Ｅｆ１α、配列番号１１５を有するＣＨＯ Ａｃｔｂ、配列番号１１６を有するＣＨＯ Ｈｓｐａ５、および／またはこれらの融合体、例えば配列番号１１を有するＣＧＡＰＤＨなど、であり得るか、または特定配列と８０％、９０％、９５％もしくは９８％を超える配列同一性を有する核酸配列を有し得る。
本発明はまた、ＴＥＰまたはＴＥＰ機能性ＲＮＡを発現させるための発現方法にも関し、
該方法は、導入遺伝子を含む組換え哺乳類細胞を提供することを含み、
ベクターが該ＴＥＰまたはＴＥＰ機能性ＲＮＡを発現する発現ベクターであり、、前記ベクターによって発現した該ＴＥＰまたはＴＥＰ機能性ＲＮＡが、前記哺乳類細胞における導入遺伝子の発現を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％、任意に増加させることを特徴とする。
該ベクターは、単一ＭＡＲ Ｘ＿２９エレメントおよび／または配列番号３と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含んでよく、培養から４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４週間以上後に、前記ベクターによって発現した該ＴＥＰまたはＴＥＰ機能性ＲＮＡが、対象遺伝子の発現を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％増加させ得る。
本発明はまた、２０、１５、１０または５以下の組換え核酸分子を含む組換え哺乳類細胞、好ましくは、単一コピーとして細胞のゲノムに組込まれた該核酸分子を含む組換え哺乳類細胞にも関する。
上記のとおり、上記ＴＥＰタンパク質は、タンパク質分泌経路の以下のタンパク質：ｈＳＲＰ１４、ｈＳｅｃ６１α１、ｈＳｅｃ６１β、ｈＳｅｃ６１γ、ｈＳＲＰ５４、ｈＳＲＰ９、ｈＳＲＰＲα、ｈＳＲＰβ、およびｈＣＡＮＸ、のうちの１つまたは複数であり得る。
上記ＴＥＰタンパク質はまた、タンパク質分泌経路のタンパク質の以下のアミノ酸配列：配列番号１３を有するｈＳＲＰ１４、配列番号１５を有するｈＳｅｃ６１α１、配列番号１７を有するｈＳｅｃ６１β、配列番号１９を有するｈＳｅｃ６１γ、配列番号２１を有するｈＳＲＰ５４、配列番号２３を有するｈＳＲＰ９、配列番号２５を有するｈＳＲＰＲα、配列番号２７を有するｈＳＲＰβ、および配列番号２９を有するｈＣＡＮＸ、のうちの１つまたは複数にも対応し得、および／または特定配列と８０％、９０％、９５％または９８％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列に対応し得る。
上記ＴＥＰタンパク質は、以下のタンパク質プロセシングまたは代謝に係るタンパク質：ｈＵＣＰ４、ｈＣＭＰＳＡＴ、ｒＳＴ６Ｇａｌ１、ｈＣＯＭＳＣ、ｈＴ−シンターゼ、ｈＰ４ＨＡ１、ｈＰ４ＨＢ、ｈＧＩＬＺ、ｈＣｙＰＢ、ｈＮＲＦ２、ｈＨＫ１、ｈＰＤＩ、ｈＰＩＮ１、ｈＳＥＰＷ１、ｈＣＡＬＲ、ｈＤＤＯＳＴ、ｈＨＳＰ４０、ｈＡＴＰ５Ａ１、ｈＳＥＲＣＡ２、ｈＰＤＩＡ４、ｈＨＳＣ７０／ＨＳＰＡ８、ｈＨＹＯＵ１、ｈＣＭＰ−ＳＡＳ、ｈベクリン−１、ｈＥＲｄｊ３、ＣＨＯ−ＡＧＥ、ｈＷｉｐ１、ｈＲＴＰ４、ｈＲＥＥＰ２、ｈＤＰＭ１およびｈＤＲｉＰ７８、のうちの１つまたは複数であり得る。
上記ＴＥＰタンパク質はまた、以下のタンパク質プロセシングまたは代謝に係るタンパク質のアミノ酸配列：配列番号３１を有するｈＵＣＰ４、配列番号３３を有するｈＣＭＰＳＡＴ、配列番号３５を有するｒＳＴ６Ｇａｌ１、配列番号３７を有するｈＣＯＭＳＣ、配列番号３９を有するｈＴ−シンターゼ、配列番号４１を有するｈＰ４ＨＡ１、配列番号４３を有するｈＰ４ＨＢ、配列番号４５を有するｈＧＩＬＺ、配列番号４７を有するｈＣｙＰＢ、配列番号４９を有するｈＮＲＦ２、配列番号５１を有するｈＨＫ１、配列番号５３を有するｈＰＤＩ、配列番号５５を有するｈＰＩＮ１、配列番号５７を有するｈＳＥＰＷ１、配列番号５９を有するｈＣＡＬＲ、配列番号６２を有するｈＤＤＯＳＴ、配列番号６４を有するｈＨＳＰ４０、配列番号６６を有するｈＡＴＰ５Ａ１、配列番号６８を有するｈＳＥＲＣＡ２、配列番号７０を有するｈＰＤＩＡ４、配列番号７２を有するｈＨＳＣ７０／ＨＳＰＡ８、配列番号７４を有するｈＨＹＯＵ１、配列番号７６を有するｈＣＭＰ−ＳＡＳ、配列番号７８を有するｈベクリン−１、配列番号８０を有するｈＥＲｄｊ３、配列番号８２を有するＣＨＯ−ＡＧＥ、配列番号８４を有するｈＷｉｐ１、配列番号８６を有するｈＲＴＰ４、配列番号８８を有するｈＲＥＥＰ２、配列番号９０を有するｈＤＰＭ１および配列番号９２を有するｈＤＲｉＰ７８、のうちの１つまたは複数にも対応し得、および／または特定配列と８０％、９０％、９５％または９８％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列に対応し得る。
上記ＴＥＰタンパク質は、シャペロンであり得、具体的には、ＢｉＰタンパク質、より具体的には、配列番号６０と８０％、９０％、９５％または１００％の配列同一性を有する遺伝子操作されたショウジョウバエＢＩＰタンパク質誘導体（ＤｒｏＢｉＰ）であり得る。
上記組換え哺乳類細胞内の上記ＴＥＰ機能性ＲＮＡは、機能性ＲＮＡをコードする核酸配列（複数可）を含み得る、または該核酸配列からなり得る。ここで、該機能性ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであり、少なくとも１つの組換えタンパク質、好ましくは、限定されるものではないが、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｂ、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｘｒｃｃ２、Ｘｒｃｃ３、Ｒａｄ５２、Ｒａｄ５４、Ｂｒｃａ１、Ｂｒｃａ２、サイクリンＤ１、Ｅｒｃｃ１、ＭＤＣ１、Ｂａｒｄ１、リガーゼ１、Ｍｒｅ１１および／または５３ＢＰ１などのＨＲ遺伝子の発現を妨げる。これらの核酸は、配列番号９３を有するＲａｄ５１、配列番号９４を有するＲａｄ５１Ｂ、配列番号９５を有するＲａｄ５１Ｃ、配列番号９６を有するＲａｄ５１Ｄ、配列番号９９を有するＸｒｃｃ２、配列番号１００を有するＸｒｃｃ３、配列番号９７を有するＲａｄ５２、配列番号９８を有するＲａｄ５４、配列番号１０１を有するＢｒｃａ１、配列番号１０２を有するＢｒｃａ２、配列番号１０３を有するサイクリンＤ１、配列番号１０４を有するＥｒｃｃ１、配列番号１０５を有するＭＤＣ１、配列番号１０６を有するＢａｒｄ１、配列番号１０７を有するリガーゼ１、配列番号１０８を有するＭｒｅ１１および／または配列番号１０９を有する５３ＢＰ１と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。
上記組換え哺乳類細胞は、初代幹細胞、ハムスター細胞、例えば、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞またはヒト細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞であり得る。
本発明はまた、
ａ）少なくとも１つのＴＥＰ機能性ＲＮＡおよび／またはＴＥＰタンパク質をコードするかもしくはＴＥＰ機能性ＲＮＡをコードする少なくとも１つの組換え核酸配列、
ならびに、
ｂ）以下を含む組換え核酸分子：
（ｉ）少なくとも１つの所望の導入遺伝子、および
（ｉｉ）任意選択で、ＭＡＲエレメント、
を含む組換え哺乳類細胞にも関する。
上記のとおり、上記ＴＥＰタンパク質は、タンパク質分泌経路の以下のタンパク質：ｈＳＲＰ１４、ｈＳｅｃ６１α１、ｈＳｅｃ６１β、ｈＳｅｃ６１γ、ｈＳＲＰ５４、ｈＳＲＰ９、ｈＳＲＰＲα、ｈＳＲＰβ、およびｈＣＡＮＸ、のうちの１つまたは複数であり得る。
上記ＴＥＰタンパク質はまた、タンパク質分泌経路のタンパク質の以下のアミノ酸配列：配列番号１３を有するｈＳＲＰ１４、配列番号１５を有するｈＳｅｃ６１α１、配列番号１７を有するｈＳｅｃ６１β、配列番号１９を有するｈＳｅｃ６１γ、配列番号２１を有するｈＳＲＰ５４、配列番号２３を有するｈＳＲＰ９、配列番号２５を有するｈＳＲＰＲα、配列番号２７を有するｈＳＲＰβ、および配列番号２９を有するｈＣＡＮＸのうちの１つまたは複数にも対応し得、および／または特定配列と８０％、９０％、９５％または９８％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列に対応し得る。
上記ＴＥＰタンパク質は、以下のタンパク質プロセシングまたは代謝に係るタンパク質：ｈＵＣＰ４、ｈＣＭＰＳＡＴ、ｒＳＴ６Ｇａｌ１、ｈＣＯＭＳＣ、ｈＴ−シンターゼ、ｈＰ４ＨＡ１、ｈＰ４ＨＢ、ｈＧＩＬＺ、ｈＣｙＰＢ、ｈＮＲＦ２、ｈＨＫ１、ｈＰＤＩ、ｈＰＩＮ１、ｈＳＥＰＷ１、ｈＣＡＬＲ、ｈＤＤＯＳＴ、ｈＨＳＰ４０、ｈＡＴＰ５Ａ１、ｈＳＥＲＣＡ２、ｈＰＤＩＡ４、ｈＨＳＣ７０／ＨＳＰＡ８、ｈＨＹＯＵ１、ｈＣＭＰ−ＳＡＳ、ｈベクリン−１、ｈＥＲｄｊ３、ＣＨＯ−ＡＧＥ、ｈＷｉｐ１、ｈＲＴＰ４、ｈＲＥＥＰ２、ｈＤＰＭ１およびｈＤＲｉＰ７８、のうちの１つまたは複数であり得る。
上記ＴＥＰタンパク質はまた、以下のタンパク質プロセシングまたは代謝に係るタンパク質のアミノ酸配列：配列番号３１を有するｈＵＣＰ４、配列番号３３を有するｈＣＭＰＳＡＴ、配列番号３５を有するｒＳＴ６Ｇａｌ１、配列番号３７を有するｈＣＯＭＳＣ、配列番号３９を有するｈＴ−シンターゼ、配列番号４１を有するｈＰ４ＨＡ１、配列番号４３を有するｈＰ４ＨＢ、配列番号４５を有するｈＧＩＬＺ、配列番号４７を有するｈＣｙＰＢ、配列番号４９を有するｈＮＲＦ２、配列番号５１を有するｈＨＫ１、配列番号５３を有するｈＰＤＩ、配列番号５５を有するｈＰＩＮ１、配列番号５７を有するｈＳＥＰＷ１、配列番号５９を有するｈＣＡＬＲ、配列番号６２を有するｈＤＤＯＳＴ、配列番号６４を有するｈＨＳＰ４０、配列番号６６を有するｈＡＴＰ５Ａ１、配列番号６８を有するｈＳＥＲＣＡ２、配列番号７０を有するｈＰＤＩＡ４、配列番号７２を有するｈＨＳＣ７０／ＨＳＰＡ８、配列番号７４を有するｈＨＹＯＵ１、配列番号７６を有するｈＣＭＰ−ＳＡＳ、配列番号７８を有するｈベクリン−１、配列番号８０を有するｈＥＲｄｊ３、配列番号８２を有するＣＨＯ−ＡＧＥ、配列番号８４を有するｈＷｉｐ１、配列番号８６を有するｈＲＴＰ４、配列番号８８を有するｈＲＥＥＰ２、配列番号９０を有するｈＤＰＭ１および配列番号９２を有するｈＤＲｉＰ７８、のうちの１つまたは複数にも対応し得、および／または特定配列と８０％、９０％、９５％または９８％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列に対応し得る。
上記ＴＥＰタンパク質はまた、シャペロンであり得、具体的には、ＢｉＰタンパク質、より具体的には、配列番号６０と８０％、９０％、９５％または１００％の配列同一性を有する人工ショウジョウバエＢＩＰタンパク質誘導体（ＤｒｏＢｉＰ）であり得る。
上記機能性ＲＮＡは、一過的にトランスフェクトされたｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであり得、前記の少なくとも１つの単離核酸配列から転写されるが、該ｓｉＲＮＡまたは該プロセシングされたｓｈＲＮＡは、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡである。該アンチセンスＲＮＡは、少なくとも１つの標的遺伝子のｍＲＮＡの２０、２１、２２、２３、２４または２５個の連続したヌクレオチドと完全に相補的である。該標的遺伝子は、ＮＨＥＪ（非相同末端結合（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ−ｊｏｉｎｉｎｇ））、ＨＲ（相同組換え）、ＭＭＥＪ（マイクロホモロジー媒介末端結合）組換え経路の一部であるか、またはＭＤＣ１（ＤＮＡ損傷チェックポイント１のメディエーター）などのＤＮＡ修復タンパク質である。
上記少なくとも１つの標的遺伝子は、以下の一部分であり得る：
−上記ＤＮＡ修復およびＮＨＥＪについては、
５３ＢＰ１（腫瘍抑制因子ｐ５３結合タンパク質１）であり、
−上記ＨＲについては、
Ｒａｄ５１（ＤＮＡ修復タンパク質ＲＡＤ５１）、Ｒａｄ５１Ｂ（ＤＮＡ修復タンパク質ＲＡＤ５１ホモログ２）、Ｒａｄ５１Ｃ（ＤＮＡ修復タンパク質ＲＡＤ５１ホモログ３）、Ｒａｄ５１Ｄ（ＤＮＡ修復タンパク質ＲＡＤ５１ホモログ４）、Ｒａｄ５２（ＤＮＡ修復タンパク質ＲＡＤ５２）、Ｒａｄ５４（ＤＮＡ修復および組換えタンパク質ＲＡＤ５４）、
Ｘｒｃｃ２（チャイニーズハムスター細胞２におけるＸ線修復補完欠損修復）、
Ｘｒｃｃ３（チャイニーズハムスター細胞３におけるＸ線修復補完欠損修復）、
Ｂｒｃａ１（乳癌１、早発性）、
Ｂｒｃａ２（乳癌２、早発性）、
Ｂａｒｄ１（ＢＲＣＡ１結合性ＲＩＮＧドメイン１）であり、
−ＭＭＥＪについては、
Ｅｒｃｃ１（げっ歯類修復欠損をクロス補完する除去修復、相補群１）、
Ｍｒｅ１１（減数分裂組換え１１）、
リガーゼ１（ＤＮＡリガーゼ１）であり、
および／または
ＤＮＡ修復タンパク質ＭＤＣ１である。
上記標的遺伝子は、配列番号９３を有するＲａｄ５１、配列番号９４を有するＲａｄ５１Ｂ、配列番号９５を有するＲａｄ５１Ｃ、配列番号９６を有するＲａｄ５１Ｄ、配列番号９９を有するＸｒｃｃ２、配列番号１００を有するＸｒｃｃ３、配列番号９７を有するＲａｄ５２、配列番号９８を有するＲａｄ５４、配列番号１０１を有するＢｒｃａ１、配列番号１０２を有するＢｒｃａ２、配列番号１０３を有するサイクリンＤ１、配列番号１０４を有するＥｒｃｃ１、配列番号１０５を有するＭＤＣ１、配列番号１０６を有するＢａｒｄ１、配列番号１０７を有するリガーゼ１、配列番号１０８を有するＭｒｅ１１および／または配列番号１０９を有する５３ＢＰ１と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する核酸であり得る。
少なくとも１つの導入遺伝子は、免疫グロブリンなどの治療タンパク質、エリスロポエチンなどのホルモン、または成長因子を発現してもよい。ここで、任意に、上記組換え哺乳類細胞において、導入遺伝子の組込みおよび／または発現が、前記組換え核酸分子（複数可）を含まない細胞と比較して増加する。
上記組換え哺乳類細胞は、少なくとも２つのＴＥＰ機能性ＲＮＡを含み得、該ＴＥＰ ＲＮＡの１つまたは両方は、一過的にトランスフェクトされたｓｉＲＮＡであるか、またはＴＥＰ機能性ＲＮＡをコードする前記単離核酸配列（複数可）によって発現する。
上記組換え哺乳類細胞は、ＭＡＲエレメントを含み得る。
本発明は、哺乳類細胞、特に、ハムスター細胞をトランスフェクトするためのトランスフェクト方法にも関する。該方法は、以下のもので前記哺乳類細胞を、任意選択で第１のトランスフェクションにおいて、トランスフェクトすることを含む：（ｉ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載の前記組換え核酸分子のうちの少なくとも１つ、および／または
（ｉｉ）少なくとも１つの単離ＴＥＰ機能性ＲＮＡおよび少なくとも１つの導入遺伝子
（ここで、該導入遺伝子は、任意に組換え核酸分子の一部であり、該組換え核酸分子は、任意選択で単離核酸またはｍＲＮＡと共に、任意選択で続く第２のトランスフェクションにおいてトランスフェクトされ、該単離核酸または該ｍＲＮＡは、上記５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲを認識するトランスポゼースを発現する）。
上記組換え哺乳類細胞は、１より多く（少なくとも２つ、少なくとも３つ、または、少なくとも４つ、を包含する）の前記組換え核酸分子でトランスフェクトされ得る。該組換え核酸分子は、ｈＳＲＰ１４、ｈＳｅｃ６１α１、ｈＳｅｃ６１β、ｈＳｅｃ６１γ、ｈＳＲＰ５４、ｈＳＲＰ９、ｈＳＲＰＲα、ｈＳＲＰβ、およびｈＣＡＮＸのうちの１つ、２つもしくは３つをコードする。
上記組換え哺乳類細胞はまた、配列番号１３を有するｈＳＲＰ１４、配列番号１５を有するｈＳｅｃ６１α１、配列番号１７を有するｈＳｅｃ６１β、配列番号１９を有するｈＳｅｃ６１γ、配列番号２１を有するｈＳＲＰ５４、配列番号２３を有するｈＳＲＰ９、配列番号２５を有するｈＳＲＰＲα、配列番号２７を有するｈＳＲＰβ、および配列番号２９を有するｈＣＡＮＸで、および／または特定配列と８０％、９０％、９５％または９８％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列でもトランスフェクトされ得る。
任意の上記組換え核酸分子はベクターの一部であり得、該ベクターはコトランスフェクトされ得る。
いくつかのＴＥＰタンパク質をコードするベクターの上記コトランスフェクション、好ましくは、タンパク質ＳＲＰ１４、ＳＲＰ９およびＳＲＰ５４をコードする組換え核酸分子のコトランスフェクションは、このようなコトランスフェクションを行っていない細胞と比較して、前記細胞において導入遺伝子の組込みおよび／または発現を増加させ得る。配列番号１２、配列番号２２、配列番号２０の少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または１００％を有する核酸配列を含むベクターのコトランスフェクションも本発明の範囲内である。
前記ＴＥＰタンパク質またはＴＥＰ機能性ＲＮＡを安定に発現する前記哺乳類細胞のいくつかは、組換え哺乳類細胞を取得するために取得されてもよく、前記いくつかの組換え哺乳類細胞は、前記ＭＡＲエレメントの存在から独立していてよい。該哺乳類細胞は、２回および任意選択で３回、トランスフェクトされ得る。
好ましくは、前記哺乳類細胞の少なくとも３０％、４０％または４５％は、組換え哺乳類細胞となってよく、および前記導入遺伝子を発現してよい。
上記哺乳類細胞は、前記少なくとも１つの単離ＴＥＰ機能性ＲＮＡ、ならびに、前記少なくとも１つの導入遺伝子と、任意選択で前記少なくとも１つの導入遺伝子に隣接する３’ＩＴＲおよび５’ＩＴＲとを含むベクターで、任意選択で該５’ＩＴＲおよび該３’ＩＴＲを認識するトランスポゼースを発現する単離核酸またはｍＲＮＡと共に、トランスフェクトされ得る。
上記導入遺伝子は、免疫グロブリン、ホルモン、サイトカインまたは成長因子などの治療タンパク質であり得る。
上記組換え核酸分子は、任意選択で選択マーカーを含んでいてよく、
（ａ）前記マーカーについての選択なしで、または
（ｂ）前記マーカーについての、例えば培地中に含まれる選択剤による選択を行うことによって、および
（ｃ）トランスポゼースの非存在下で、または
（ｄ）トランスポゼースの存在下で、
少なくとも１つの導入遺伝子が発現される。
上記ＴＥＰ機能性ＲＮＡは、ｓｈＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡをコードする組換え核酸配列によってコードされてよく、あるいは、上記ＴＥＰ機能性ＲＮＡは、限定されるものではないがＲａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｂ、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｘｒｃｃ２、Ｘｒｃｃ３、Ｒａｄ５２、Ｒａｄ５４、Ｂｒｃａ１、Ｂｒｃａ２、サイクリンＤ１、Ｅｒｃｃ１、ＭＤＣ１、Ｂａｒｄ１、リガーゼ１、Ｍｒｅ１１および／または５３ＢＰ１などの少なくとも１つのＨＲ遺伝子の発現を妨げるｓｉＲＮＡを含んでいて／からなっていてよい。
上記ＴＥＰ機能性ＲＮＡはまた、配列番号９３を有するＲａｄ５１、配列番号９４を有するＲａｄ５１Ｂ、配列番号９５を有するＲａｄ５１Ｃ、配列番号９６を有するＲａｄ５１Ｄ、配列番号９９を有するＸｒｃｃ２、配列番号１００を有するＸｒｃｃ３、配列番号９７を有するＲａｄ５２、配列番号９８を有するＲａｄ５４、配列番号１０１を有するＢｒｃａ１、配列番号１０２を有するＢｒｃａ２、配列番号１０３を有するサイクリンＤ１、配列番号１０４を有するＥｒｃｃ１、配列番号１０５を有するＭＤＣ１、配列番号１０６を有するＢａｒｄ１、配列番号１０７を有するリガーゼ１、配列番号１０８を有するＭｒｅ１１および／または配列番号１０９を有する５３ＢＰ１と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する遺伝子の発現も妨げ得る。
このような細胞における上記導入遺伝子の組込みおよび／または発現は、前記単離核酸分子および／または前記少なくとも１つの前記単離ＴＥＰ機能性ＲＮＡでトランスフェクトされていない細胞と比較して増加し得る。
本発明はまた、請求項１〜１３に記載の組換え核酸分子のうちのいずれか１つを含む少なくとも１つのベクターを１つの容器内に含み、互換性のあるトランスポゼースをコードするベクターを第２の任意の容器に含み、ならびに、該ベクター（複数可）の使用法についての説明書を別の容器内に含むキットにも関する。
上記のキットに関し、２種類以上のベクターは１つまたは複数の容器に入った状態で提供され、上記ＴＥＰタンパク質は、シャペロン、ＳＲＰ１４、ＳＲＰ９、ＳＲＰ５４、ＳＲもしくはトランスロコンのうちの少なくとも２つである。
上記のキットに関し、前記ベクター（複数可）中の上記ＴＥＰ機能性ＲＮＡ（複数可）は、限定されるものではないがＲａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｂ、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｘｒｃｃ２、Ｘｒｃｃ３、Ｒａｄ５２、Ｒａｄ５４、Ｂｒｃａ１、Ｂｒｃａ２、サイクリンＤ１、Ｅｒｃｃ１、ＭＤＣ１、Ｂａｒｄ１、リガーゼ１、Ｍｒｅ１１および／または５３ＢＰ１などの少なくとも１つのＨＲ遺伝子の発現を妨げるｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをコードする核酸配列を含み／からなり、好ましくは、限定されるものではないがＲａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｂ、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｘｒｃｃ２、Ｘｒｃｃ３、Ｒａｄ５２、Ｒａｄ５４、Ｂｒｃａ１、Ｂｒｃａ２、サイクリンＤ１、Ｅｒｃｃ１、ＭＤＣ１、Ｂａｒｄ１、リガーゼ１、Ｍｒｅ１１および／または５３ＢＰ１などの少なくとも１つのＨＲ遺伝子の発現を妨げるｓｉＲＮＡ（複数可）を別の容器内に含む。
上記ＨＲ遺伝子は、配列番号９３を有するＲａｄ５１、配列番号９４を有するＲａｄ５１Ｂ、配列番号９５を有するＲａｄ５１Ｃ、配列番号９６を有するＲａｄ５１Ｄ、配列番号９９を有するＸｒｃｃ２、配列番号１００を有するＸｒｃｃ３、配列番号９７を有するＲａｄ５２、配列番号９８を有するＲａｄ５４、配列番号１０１を有するＢｒｃａ１、配列番号１０２を有するＢｒｃａ２、配列番号１０３を有するサイクリンＤ１、配列番号１０４を有するＥｒｃｃ１、配列番号１０５を有するＭＤＣ１、配列番号１０６を有するＢａｒｄ１、配列番号１０７を有するリガーゼ１、配列番号１０８を有するＭｒｅ１１および／または配列番号１０９を有する５３ＢＰ１と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または１００％の配列同一性を有する核酸に対応し得る。
本発明はまた、本明細書に開示する組換え核酸および／または本明細書に開示する組換え哺乳類細胞の使用、好ましくは導入遺伝子の組換えおよび／または発現を増加させるための該使用、にも関する。
本発明は、
（ａ）上流側でプロモーターと、下流側でポリアデニル化シグナルと隣接する導入遺伝子、
（ｂ）ポリアデニル化シグナルの下流側の単一ＭＡＲエレメント、または
（ｃ）目的の導入遺伝子の上流側の第１のＭＡＲエレメントおよび前記導入遺伝子組込み部位の下流側の第２のＭＡＲエレメント
を含む発現ベクターにも関する。
上記単一または第１および第２のＭＡＲエレメントは、ＭＡＲエレメント１＿６８、１＿６、１＿６Ｒ２、１＿６８Ｒ、１＿６８Ｒ２、Ｘ＿２９Ｒ３もしくはＸ＿２９、または配列番号１、２、３、６、７、８、９もしくは１０と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するエレメントから選択され得る。
上記単一または第１および第２のＭＡＲ（複数可）は、再構成ＭＡＲエレメント１＿６Ｒ２、１＿６８Ｒ、１＿６８Ｒ２もしくはＸ＿２９Ｒ３、または配列番号６、７、８、もしくは１０と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するエレメントから選択されてよい。ここで、任意選択で、該ＭＡＲエレメント（複数可）は、該ＭＡＲエレメントの再構成されていない対応物と比較して、目的の導入遺伝子の発現を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％増加させる。
上記プロモーターは、ＥＦ１αプロモーターであってよく、上記ポリアデニル化シグナルはＢＧＨポリＡシグナルである。
上記ベクターは、ＧＡＰＤＨ、ＣＧＡＰＤ、ＣＳＶ４０ｐ、ＣＭＶｐ、ＣＨＯ Ｅｆ１α、ＣＨＯ ＡｃｔｂまたはＣＨＯ Ｈｓｐａ５などのプロモーター（複数可）および／またはエンハンサー（複数可）、またはそれらの融合体を含み得る。
上記プロモーターは、配列番号１１１を有するＧＡＰＤＨ、配列番号１１を有するＣＧＡＰＤＨ、配列番号１１４を有するＳＶ４０ｐ、配列番号１１３を有するＣＭＶｐ、配列番号１１２を有するＣＨＯ ＥＦ１α、配列番号１１５を有するＣＨＯ Ａｃｔｂおよび／または配列番号１１６を有するＣＨＯ Ｈｓｐａ５、ならびに、特定配列と８０％、９０％、９５％もしくは９８％を超える配列同一性を有する核酸配列であり得る。
上記プロモーターは、ＧＡＰＤＨプロモーターであってよく、かつＣＭＶエンハンサーを含む。
上記第１および／または第２のＭＡＲ、エンハンサー、プロモーター、目的の導入遺伝子ならびにポリアデニル化シグナルは、５’ＩＴＲと３’ＩＴＲの間に位置し得る。
特定の実施形態において、上記発現ベクターは、
（ａ）ポリアデニル化シグナルの下流側の単一ＭＡＲエレメント（ここで、前記単一ＭＡＲエレメントは、好ましくはＭＡＲ １−６８もしくはＭＡＲＸ−２９エレメントおよび／または配列番号１もしくは３と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するエレメント、具体的には、ＭＡＲ １−６８もしくはＭＡＲＸ−２９に基づく再構成ＭＡＲ、具体的には、配列番号６、７もしくは１０（ＭＡＲ １＿６８Ｒ、１＿６８Ｒ２もしくはＸ＿２９Ｒ３）または配列番号９と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するエレメントであり、好ましくは、ＭＡＲ Ｘ−２９エレメントであり、および／または配列番号３と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する単一ＭＡＲエレメントである）、あるいは
（ｂ）目的の導入遺伝子の上流側の第１のＭＡＲエレメントおよび目的の前記導入遺伝子の下流側の第２のＭＡＲエレメント（ここで、該第１のＭＡＲエレメントは、好ましくは１＿６エレメントを含み、および／または、該第１のＭＡＲエレメントは、配列番号２と、具体的には、ＭＡＲ １−６に基づく再構成ＭＡＲと少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有し、具体的には、配列番号８（ＭＡＲ １＿６Ｒ２）と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するエレメントであり、ならびに、該第２のＭＡＲエレメントは、好ましくは、ＭＡＲ １−６８エレメントを含み、および／または、該第２のＭＡＲエレメントは配列番号１と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する）
を含み得る。
上記発現ベクターは単一ＭＡＲエレメントを含んでいてよく、この単一ＭＡＲエレメントは、ポリアデニル化部位の下流側に位置していてよく、および、該単一ＭＡＲエレメントは、ＭＡＲ １−６８またはＭＡＲ Ｘ−２９であり、および／または、配列番号１または３と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有し、具体的には、ＭＡＲ １−６８もしくはＭＡＲ Ｘ−２９に基づく再構成ＭＡＲであり、具体的には、配列番号６、７もしくは１０（ＭＡＲ １＿６８Ｒ、１＿６８Ｒ２もしくはＸ＿２９Ｒ３）または配列番号９と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するエレメントであり、また、好ましくはＭＡＲ Ｘ−２９由来のエレメントであり得、および／または、配列番号３と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する。
上記第１のＭＡＲエレメントは上記目的導入遺伝子の上流側にあってよく、第２のＭＡＲエレメントは前記目的導入遺伝子の下流側にあってよい。ここで、該第１のＭＡＲエレメントは、ＭＡＲ １＿６エレメントを含んでいてよく、および／または、配列番号２と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有していてよく、該第２のＭＡＲエレメントは、ＭＡＲ １＿６８エレメントを含んでいてよく、および／または、配列番号１と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有していてよい。
本発明はまた、導入遺伝子を発現させるための発現方法にも関する。該発現方法は、
前記導入遺伝子を含む上記のベクターのうちの１つを含む組換え哺乳類細胞を提供すること、および、該導入遺伝子を発現させることを含む。ここで、前記ＭＡＲエレメント（複数可）は、該導入遺伝子の発現を好ましくは少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％増加させ得る。該ベクターは、単一ＭＡＲ Ｘ＿２９エレメント、および／または、配列番号３と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有し得る核酸を含んでいてよく、ならびに、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４週を超える培養後に、該ＭＡＲエレメントは、該目的導入遺伝子の発現を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％増加させ得る。
トランスポゾンベクターの構築。ＭＡＲエレメントのＰＢ（ピギーバック）トランスポゾンへの付加が転移効率および導入遺伝子発現に対して作用するか否かを調べるために、ならびに、構築物中の該ＭＡＲの位置がこれらの作用に影響を及ぼすか否かを評価するために、ＧＦＰ遺伝子およびピューロマイシン耐性（Ｐｕｒｏ）遺伝子を含む一連のトランスポゾンドナー構築物を設計した。このとき、ＭＡＲ １＿６８または対照の中立スペーサーＤＮＡ配列をプラスミド中の異なる位置に挿入した。この挿入が実施されていない親Ｐｕｒｏ−ＧＦＰトランスポゾンプラスミドを転移の対照として用い、ＭＡＲまたはスペーサー配列付加の作用と比較して、増加したトランスポゾンサイズの影響を識別した。 トランスポゾンベクター：転移効率。様々なトランスポゾン構築物の転移効率を、（Ａ）トランスフェクション、および選択用抗生物質の非存在下での培養３週間後に、ＧＦＰ発現細胞のパーセンテージを評価することによって、ならびに、（Ｂ）ピューロマイシン耐性コロニーを数えることによって、測定した。 トランスポゾンベクター：転移効率。様々なトランスポゾン構築物の転移効率を、（Ａ）トランスフェクション、および選択用抗生物質の非存在下での培養３週間後に、ＧＦＰ発現細胞のパーセンテージを評価することによって、ならびに、（Ｂ）ピューロマイシン耐性コロニーを数えることによって、測定した。 トランスポゾンベクター：発現レベル。トランスポゼース発現プラスミド存在下（＋ＰＢ）、または、非存在下（−ＰＢ）でトランスフェクトされた異なるトランスポゾンベクターによってもたらされた発現レベルの解析は、ピューロマイシン耐性選択剤の非存在下（Ａ）または存在下（Ｂ）での培養３週間後に、ＧＦＰ陽性細胞の蛍光のみを考慮して、ＣＨＯ細胞のＧＦＰ蛍光レベルを調べることによって行った。 トランスポゾンベクター：発現レベル。トランスポゼース発現プラスミド存在下（＋ＰＢ）、または、非存在下（−ＰＢ）でトランスフェクトされた異なるトランスポゾンベクターによってもたらされた発現レベルの解析は、ピューロマイシン耐性選択剤の非存在下（Ａ）または存在下（Ｂ）での培養３週間後に、ＧＦＰ陽性細胞の蛍光のみを考慮して、ＣＨＯ細胞のＧＦＰ蛍光レベルを調べることによって行った。 導入遺伝子のゲノムへの組込みに及ぼすＭＡＲおよびトランスポゼースの効果。組込まれたＧＦＰ導入遺伝子のコピー数を、ｑＰＣＲを用いて決定し、また、非選別ＣＨＯ細胞（Ａ）、または図１〜３の説明文に記載したような方法で作製したピューロマイシン耐性細胞（Ｂ）から単離したゲノムＤＮＡを用いて、細胞内のＢ２Ｍ遺伝子を基準にを正規化した。値は、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。＊Ｐ＜０．０５。 導入遺伝子のゲノムへの組込みに及ぼすＭＡＲおよびトランスポゼースの効果。組込まれたＧＦＰ導入遺伝子のコピー数を、ｑＰＣＲを用いて決定し、また、非選別ＣＨＯ細胞（Ａ）、または図１〜３の説明文に記載したような方法で作製したピューロマイシン耐性細胞（Ｂ）から単離したゲノムＤＮＡを用いて、細胞内のＢ２Ｍ遺伝子を基準にを正規化した。値は、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。＊Ｐ＜０．０５。 導入遺伝子あたりの導入遺伝子発現。ピューロマイシン選別なし（Ａ）およびあり（Ｂ）の場合における、ゲノムへの組込み傾向とは独立した、ベクター固有の発現能の評価。 導入遺伝子あたりの導入遺伝子発現。ピューロマイシン選別なし（Ａ）およびあり（Ｂ）の場合における、ゲノムへの組込み傾向とは独立した、ベクター固有の発現能の評価。 組換えタンパク質（導入遺伝子）発現に対する転移性ベクターおよびプラスミドベクターからの分泌タンパク質の発現の効果。分泌タンパク質ＳＲＰ９、ＳＲＰ１４、ＳＲＰ５４、ＳＲＰ受容体αおよびβのサブユニット（ＳＲ）、またはトランスロコンを発現させるために、転移性ベクターまたは標準的なプラスミドベクターを構築した。本明細書に記載したようなインフリキシマブ抗体を発現する細胞クローンにおいて、転移性ベクターをピギーバックトランスポゼースベクターと共にコトランスフェクトし（右のパネル）、非転移性プラスミドベクターを単独でトランスフェクトした（左のパネル）。選択剤の存在下（左のパネル）または選択剤の非存在下（右のパネル）での培養３週間後に、細胞培養上清における分泌されたインフリキシマブ抗体のレベルを評価した。図から分かるとおり、導入遺伝子発現プロセシング（ＴＥＰ）タンパク質またはＴＥＰ機能性ＲＮＡをコードする配列を含む細胞の相対的発現である比生産性は、該トランスポゾン（転移因子）ベクターを用いた場合、ＴＥＰなしの親細胞と比較して、それぞれ０．２５〜１．５から１〜２．５まで増加した。 電気穿孔したＣＨＯ−Ｍ細胞の懸濁液からの組換えタンパク質発現。（Ａ）ピギーバックトランスポゼースの存在下（＋ＰＢ）または非存在下（−ＰＢ）における、ＭＡＲ Ｘ−２９を有するＧＦＰ発現トランスポゾンベクターを用いて１回または２回電気穿孔したＣＨＯ−Ｍ細胞。選択剤の非存在下において実施した培養の３週間後のＧＦＰ安定発現細胞のパーセンテージを示す。 電気穿孔したＣＨＯ−Ｍ細胞の懸濁液からの組換えタンパク質発現。（Ｂ）ＧＦＰ陽性細胞のＧＦＰ蛍光の平均値。 電気穿孔したＣＨＯ−Ｍ細胞の懸濁液からの組換えタンパク質発現。（Ｃ）ベバシズマブ（Ｂｅｖａ）、アダリムマブ（Ａｄａｌ）およびリツキシマブ（Ｒｉｔｕ）の抗体の免疫グロブリン軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡを、ＧＦＰの代わりにＭＡＲ Ｘ２９含有トランスポゾンプラスミドに導入した。軽鎖および重鎖トランスポゾン構築物を、ＣＨＯ−Ｍ細胞にピギーバックトランスポゼース発現ベクターを用いて１２日間間隔で３回電気穿孔した。選択剤の非存在下で培養したポリクローナル細胞プールの培養上清中に分泌された免疫グロブリンレベルを示す（白色の棒グラフ）。あるいは、その表面に免疫グロブリンを提示している細胞を、磁気マイクロビーズを用いてパニングすることによって、非選別ポリクローナル細胞集団を選別した。非選別集団の分泌された免疫グロブリンのレベルを示す（黒色の棒グラフ）。 電気穿孔したＣＨＯ−Ｍ細胞の懸濁液からの組換えタンパク質発現。（Ｄ）免疫グロブリン発現コロニーを、コロニー採集装置を用いてトランスフェクトした細胞集団から選別し、３種類の免疫グロブリンのそれぞれを発現する２つのクローンを、スピンチューブバイオリアクター内での流加培養によって培養した。分泌された免疫グロブリンのレベルを示す。なお、分泌された免疫グロブリンのレベルは、パネル（Ｃ）と同様の方法で決定した。 ＳＲＰ１４の異種発現はトラスツズマブ分泌を向上させ、および、インフリキシマブ分泌を回復させる。ＳＲＰ１４発現ベクターで安定的に再トランスフェクト（ｒｅ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）され、トラスツズマブ免疫グロブリン（Ａ）またはインフリキシマブ免疫グロブリン（Ｂ）を最高取得レベルで発現するＣＨＯ−Ｋ１ ＨＰおよびＣＨＯ−Ｋ１ ＬＰクローン、ならびにモノクローナル抗体群を単離した。Ａ〜Ｅと表示した派生サブクローンを、回分培養条件での細胞増殖および産生について評価した。培養７日間中のそれぞれの試料採取日の細胞密度（細胞／ｍｌ）およびＩｇＧ抗体価（μｇ／ｍｌ）をプロットした。（Ｃ）ＳＲＰ１４発現ベクターでのトランスフェクション後のトラスツズマブサブクローン（ＨＰ）およびインフリキシマブサブクローン（ＬＰ）の比生産性分布（Ｓの列）と、その親のＨＰクローンおよびＬＰクローンの比生産性分布（−の列）との比較。（Ｄ）ＳＲＰ１４ ｍＲＮＡの相対レベルを、５つの個々のＳＲＰ１４−ＬＰ サブクローンＡ〜Ｅについておよびその親である対照ＬＰクローンについて決定し、４つの培養試験区におけるＩｇＧ比生産性と比較してプロットした。ｍＲＮＡならびに比生産性の平均値および標準偏差の値を、該ＬＰ対照クローンの値に対する倍率で表す。 ＳＲＰ１４の異種発現はトラスツズマブ分泌を向上させ、および、インフリキシマブ分泌を回復させる。ＳＲＰ１４発現ベクターで安定的に再トランスフェクト（ｒｅ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）され、トラスツズマブ免疫グロブリン（Ａ）またはインフリキシマブ免疫グロブリン（Ｂ）を最高取得レベルで発現するＣＨＯ−Ｋ１ ＨＰおよびＣＨＯ−Ｋ１ ＬＰクローン、ならびにモノクローナル抗体群を単離した。Ａ〜Ｅと表示した派生サブクローンを、回分培養条件での細胞増殖および産生について評価した。培養７日間中のそれぞれの試料採取日の細胞密度（細胞／ｍｌ）およびＩｇＧ抗体価（μｇ／ｍｌ）をプロットした。（Ｃ）ＳＲＰ１４発現ベクターでのトランスフェクション後のトラスツズマブサブクローン（ＨＰ）およびインフリキシマブサブクローン（ＬＰ）の比生産性分布（Ｓの列）と、その親のＨＰクローンおよびＬＰクローンの比生産性分布（−の列）との比較。（Ｄ）ＳＲＰ１４ ｍＲＮＡの相対レベルを、５つの個々のＳＲＰ１４−ＬＰ サブクローンＡ〜Ｅについておよびその親である対照ＬＰクローンについて決定し、４つの培養試験区におけるＩｇＧ比生産性と比較してプロットした。ｍＲＮＡならびに比生産性の平均値および標準偏差の値を、該ＬＰ対照クローンの値に対する倍率で表す。 ＳＲＰ１４の異種発現はトラスツズマブ分泌を向上させ、および、インフリキシマブ分泌を回復させる。ＳＲＰ１４発現ベクターで安定的に再トランスフェクト（ｒｅ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）され、トラスツズマブ免疫グロブリン（Ａ）またはインフリキシマブ免疫グロブリン（Ｂ）を最高取得レベルで発現するＣＨＯ−Ｋ１ ＨＰおよびＣＨＯ−Ｋ１ ＬＰクローン、ならびにモノクローナル抗体群を単離した。Ａ〜Ｅと表示した派生サブクローンを、回分培養条件での細胞増殖および産生について評価した。培養７日間中のそれぞれの試料採取日の細胞密度（細胞／ｍｌ）およびＩｇＧ抗体価（μｇ／ｍｌ）をプロットした。（Ｃ）ＳＲＰ１４発現ベクターでのトランスフェクション後のトラスツズマブサブクローン（ＨＰ）およびインフリキシマブサブクローン（ＬＰ）の比生産性分布（Ｓの列）と、その親のＨＰクローンおよびＬＰクローンの比生産性分布（−の列）との比較。（Ｄ）ＳＲＰ１４ ｍＲＮＡの相対レベルを、５つの個々のＳＲＰ１４−ＬＰ サブクローンＡ〜Ｅについておよびその親である対照ＬＰクローンについて決定し、４つの培養試験区におけるＩｇＧ比生産性と比較してプロットした。ｍＲＮＡならびに比生産性の平均値および標準偏差の値を、該ＬＰ対照クローンの値に対する倍率で表す。 ＳＲＰ１４の異種発現はトラスツズマブ分泌を向上させ、および、インフリキシマブ分泌を回復させる。ＳＲＰ１４発現ベクターで安定的に再トランスフェクト（ｒｅ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）され、トラスツズマブ免疫グロブリン（Ａ）またはインフリキシマブ免疫グロブリン（Ｂ）を最高取得レベルで発現するＣＨＯ−Ｋ１ ＨＰおよびＣＨＯ−Ｋ１ ＬＰクローン、ならびにモノクローナル抗体群を単離した。Ａ〜Ｅと表示した派生サブクローンを、回分培養条件での細胞増殖および産生について評価した。培養７日間中のそれぞれの試料採取日の細胞密度（細胞／ｍｌ）およびＩｇＧ抗体価（μｇ／ｍｌ）をプロットした。（Ｃ）ＳＲＰ１４発現ベクターでのトランスフェクション後のトラスツズマブサブクローン（ＨＰ）およびインフリキシマブサブクローン（ＬＰ）の比生産性分布（Ｓの列）と、その親のＨＰクローンおよびＬＰクローンの比生産性分布（−の列）との比較。（Ｄ）ＳＲＰ１４ ｍＲＮＡの相対レベルを、５つの個々のＳＲＰ１４−ＬＰ サブクローンＡ〜Ｅについておよびその親である対照ＬＰクローンについて決定し、４つの培養試験区におけるＩｇＧ比生産性と比較してプロットした。ｍＲＮＡならびに比生産性の平均値および標準偏差の値を、該ＬＰ対照クローンの値に対する倍率で表す。 ＳＲＰ１４の異種発現は、産生プロセスにおいて難発現免疫グロブリンの高収率を媒介する。図８で分析したように、ＳＲＰ１４ベクターでトランスフェクトしたトラスツズマブＨＰサブクローンＢ（Ａ）およびインフリキシマブＬＰサブクローンＥ（Ｂ）を、１２５ｍｌ容量の換気式振盪フラスコ容器において、稼働容量２５ｍｌで流加培養で培養し、生存細胞密度およびＩｇＧ抗体価を１１日間にわたって経時的に測定した。 ＳＲＰ１４の異種発現は、産生プロセスにおいて難発現免疫グロブリンの高収率を媒介する。図８で分析したように、ＳＲＰ１４ベクターでトランスフェクトしたトラスツズマブＨＰサブクローンＢ（Ａ）およびインフリキシマブＬＰサブクローンＥ（Ｂ）を、１２５ｍｌ容量の換気式振盪フラスコ容器において、稼働容量２５ｍｌで流加培養にてで培養し、生存細胞密度およびＩｇＧ抗体価を１１日間にわたって経時的に測定した。 ＣＨＯ細胞クローンによる、軽鎖の凝集を消失させるＳＲＰ１４の発現。（Ａ）Ｔｘ１００−透過処理細胞の上澄み液及びペレットを遠心分離により回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。Ｔｘ−１００可溶およびＴｘ−１００不溶と表示されたパネルに示されているように、ＬＰ由来のＳＲＰ１４−ＬＰサブクローンＥおよびＨＰ由来ＷＲＰ１４−ＨＰサブクローンＢ（Ｓの列）、または対照のＧＦＰタンパク質を発現するＣＨＯサブクローン（Ｇの列）について分析を行った。矢印は誤ってプロセシングされた遊離のＬＣおよび凝集した（Ａｇｇｒ）ＬＣを示す。 ＣＨＯ細胞クローンによる、軽鎖の凝集を消失させるＳＲＰ１４の発現。（Ｂ）ＳＲＰ１４−ＬＰクローンＥおよびＬＰ−対照クローンＥによって産生された様々なＬＣ、ＨＣおよびＩｇＧアセンブリ中間体種の追跡分析を行った。また、結果を示す。 組み合わされたＳＲＰ、ＳＲおよびトランスロコンのサブユニットの発現が免疫グロブリン分泌に及ぼす効果。（Ａ）ＳＲＰ、ＳＲおよびトランスロコン転移性発現ベクターの様々な組合せを用いて、インフリキシマブＬＰクローンＥを再トランスフェクトした。得られた細胞プールの比生産性を、その後、回分培養において評価し、ＬＰ−対照細胞のｐｃｄ値として％で示した。独立して実施したそれぞれの培養試験区において３日目に測定した、正規化比生産性の中央値、四分位数を、ボックスプロットで示した。 組み合わされたＳＲＰ、ＳＲおよびトランスロコンのサブユニットの発現が免疫グロブリン分泌に及ぼす効果。（Ｂ）ＳＲＰ１４発現インフリキシマブ産生細胞サブクローンＥを、様々なＳＲおよびトランスロコン転移性発現ベクターの組合せを用いて再トランスフェクトした。細胞プールの比生産性を、パネルＡと同様の方法で示す。 ＳＲＰ１４発現クローンからのインフリキシマブ分泌修復モデル。ＳＲＰ／トランスロコンサブユニット過剰発現前（Ａ）および後（Ｂ）の低産生性クローンによる、ＩｇＧの折りたたみならびに分泌のモデル。このデータは、低産生性クローンによって産生された、新規合成ＬＣが不適切なプロセシングおよび折りたたみ状態をもたらすことを示す。インフリキシマブＬＣにおけるシグナルペプチドの誤ったプロセシングが、ＥＲ同時翻訳転移機構の飽和をもたらし得る（パネルＡ、番号１）。ＥＲにおける、ＩｇＧアセンブリ能を有しない塊状ＬＣの中の凝集（パネルＡ、番号２）は、ＥＲストレスを誘導し、オートファゴソーム様構造の形成を誘発する（パネルＡ、番号３）。ＳＲＰ１４および他のＳＲＰ／トランスロコン成分タンパク質の過剰発現は、インフリキシマブＩｇＧのプロセンシングおよび分泌を完全に修復した（パネルＢ）。ＳＲＰ１４の伸長停止作用が、もしかしたら、そのｍＲＮＡの翻訳中にＬＣ ＥＲ移行を遅らせるのかもしれない（パネルＢ、番号１）。このことは、同様に、該ＬＣの正しいプロセシングおよび該ＬＣのＥＲ折りたたみシャペロンとの適切な相互作用にとって好都合であるだろう（パネルＢ、番号２）。したがって、ＩｇＧアセンブリが可能な状態における該新規合成ＬＣの維持は、完全にアセンブリされた抗体の高収率分泌（ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）を回復させる（パネルＢ、番号３）。 ＳＲＰ１４発現クローンからのインフリキシマブ分泌修復モデル。ＳＲＰ／トランスロコンサブユニット過剰発現前（Ａ）および後（Ｂ）の低産生性クローンによる、ＩｇＧの折りたたみならびに分泌のモデル。このデータは、低産生性クローンによって産生された、新規合成ＬＣが不適切なプロセシングおよび折りたたみ状態をもたらすことを示す。インフリキシマブＬＣにおけるシグナルペプチドの誤ったプロセシングが、ＥＲ同時翻訳転移機構の飽和をもたらし得る（パネルＡ、番号１）。ＥＲにおける、ＩｇＧアセンブリ能を有しない塊状ＬＣの中の凝集（パネルＡ、番号２）は、ＥＲストレスを誘導し、オートファゴソーム様構造の形成を誘発する（パネルＡ、番号３）。ＳＲＰ１４および他のＳＲＰ／トランスロコン成分タンパク質の過剰発現は、インフリキシマブＩｇＧのプロセンシングおよび分泌を完全に修復した（パネルＢ）。ＳＲＰ１４の伸長停止作用が、もしかしたら、そのｍＲＮＡの翻訳中にＬＣ ＥＲ移行を遅らせるのかもしれない（パネルＢ、番号１）。このことは、同様に、該ＬＣの正しいプロセシングおよび該ＬＣのＥＲ折りたたみシャペロンとの適切な相互作用にとって好都合であるだろう（パネルＢ、番号２）。したがって、ＩｇＧアセンブリが可能な状態における該新規合成ＬＣの維持は、完全にアセンブリされた抗体の高収率分泌（ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）を回復させる（パネルＢ、番号３）。 発現に対するＨＲおよびＮＨＥＪのｓｉ−ＲＮＡノックダウンの効果。（ここでは１．０として示したＧＦＰ対照プラスミドでトランスフェクトした細胞に関する）ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージにおける倍率の違いは、未処理細胞（モック）、陰性ｓｉＲＮＡ（ｓｉＮｅｇ）で処理した細胞、ＮＨＥＪ因子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＫｕ７０＋８０＋ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）で処理した細胞および抗ＨＲ ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲａｄ５１）で処理した細胞における組換えイベントの頻度を示す。ＧＦＰの列は、ＧＦＰ発現細胞の陽性対照を示す。ＨＲ未消化およびＮＨＥＪ未消化と表示された列は、陰性対照細胞、すなわち環状ＨＲおよびＮＨＥＪレポートプラスミド（ｒｅｐｏｒｔ ｐｌａｓｍｉｄ）でトランスフェクトした細胞を示す。ＨＲ Ｉ−ＳｃｅｌおよびＮＨＥＪ Ｉ−Ｓｃｅｌと表示された列は、相同組換えまたは非相同末端結合それぞれによるＤＮＡ切断修復においてＧＦＰ発現を回復するＳｃｅｌ切断レポータープラスミドでトランスフェクトした細胞を示す。図は、ｄｓＲｅｄ−陽性細胞を基準に正規化し、ＧＦＰ対照細胞のパーセントを１と設定してこれに対する倍率として表示した、ＧＦＰ陽性細胞のパーセントで示される、ＨＲまたはＮＨＥＪを阻害するｓｉＲＮＡの有効性を示す。３回の実験の平均値であり、エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。統計的有意性は、対応のないスチューデントｔ−検定によって決定し、有意レベルはＰ＜０．０５（＊）およびｐ＜０．０１（＊＊）であった。 ＮＨＥＪのｓｉＲＮＡノックダウンにおけるＭＡＲの効果。ＮＨＥＪ因子に対するｓｉＲＮＡで処理し、かつＧＦＰまたはＭＡＲ−ＧＦＰプラスミドで再トランスフェクトしたＣＨＯ細胞におけるＧＦＰ発現および組込みの増加の割合（倍）を示す。平均ＧＦＰ蛍光、コピー数およびＧＦＰコピーあたりの蛍光を、ＧＦＰプラスミドでトランスフェクトした（「モック」として示されている）未処理細胞から得られた結果に対する倍率として示す。Ａ）フローサイトメトリーの結果、Ｂ）ｑＰＣＲによるゲノム中のＧＦＰコピー数の分析、Ｃ）組込まれた各ＧＦＰ遺伝子の蛍光の平均値（発現とコピー数との比として各実験について計算した）。３回以上の実験の平均値が示されており、統計的有意性は対応のないスチューデントｔ−検定によって決定した。アスタリスクは、ｓｉＲＮＡ処理試料と対応する未処理対照との間の有意差を示す；有意レベル：Ｐ＜０．０５（＊）およびｐ＜０．０１（＊＊）；エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 ＮＨＥＪのｓｉＲＮＡノックダウンにおけるＭＡＲの効果。ＮＨＥＪ因子に対するｓｉＲＮＡで処理し、かつＧＦＰまたはＭＡＲ−ＧＦＰプラスミドで再トランスフェクトしたＣＨＯ細胞におけるＧＦＰ発現および組込みの増加の割合（倍）を示す。平均ＧＦＰ蛍光、コピー数およびＧＦＰコピーあたりの蛍光を、ＧＦＰプラスミドでトランスフェクトした（「モック」として示されている）未処理細胞から得られた結果に対する倍率として示す。Ａ）フローサイトメトリーの結果、Ｂ）ｑＰＣＲによるゲノム中のＧＦＰコピー数の分析、Ｃ）組込まれた各ＧＦＰ遺伝子の蛍光の平均値（発現とコピー数との比として各実験について計算した）。３回以上の実験の平均値が示されており、統計的有意性は対応のないスチューデントｔ−検定によって決定した。アスタリスクは、ｓｉＲＮＡ処理試料と対応する未処理対照との間の有意差を示す；有意レベル：Ｐ＜０．０５（＊）およびｐ＜０．０１（＊＊）；エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 ＮＨＥＪのｓｉＲＮＡノックダウンにおけるＭＡＲの効果。ＮＨＥＪ因子に対するｓｉＲＮＡで処理し、かつＧＦＰまたはＭＡＲ−ＧＦＰプラスミドで再トランスフェクトしたＣＨＯ細胞におけるＧＦＰ発現および組込みの増加の割合（倍）を示す。平均ＧＦＰ蛍光、コピー数およびＧＦＰコピーあたりの蛍光を、ＧＦＰプラスミドでトランスフェクトした（「モック」として示されている）未処理細胞から得られた結果に対する倍率として示す。Ａ）フローサイトメトリーの結果、Ｂ）ｑＰＣＲによるゲノム中のＧＦＰコピー数の分析、Ｃ）組込まれた各ＧＦＰ遺伝子の蛍光の平均値（発現とコピー数との比として各実験について計算した）。３回以上の実験の平均値が示されており、統計的有意性は対応のないスチューデントｔ−検定によって決定した。アスタリスクは、ｓｉＲＮＡ処理試料と対応する未処理対照との間の有意差を示す；有意レベル：Ｐ＜０．０５（＊）およびｐ＜０．０１（＊＊）；エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 ＨＲのｓｉＲＮＡノックダウンにおけるＭＡＲの効果。ＨＲ因子に対するｓｉＲＮＡで処理し、かつＧＦＰまたはＭＡＲ−ＧＦＰプラスミドで再トランスフェクトしたＣＨＯ細胞におけるＧＦＰ発現および組込みの増加の割合（倍）。平均ＧＦＰ蛍光、コピー数およびＧＦＰコピーあたりの蛍光を、ＧＦＰプラスミドでトランスフェクトした（「モック」として示されている）未処理細胞から得られた結果に対する倍率として示す。Ａ）フローサイトメトリーの結果、Ｂ）ｑＰＣＲによるゲノム中のＧＦＰコピー数の分析、Ｃ）組込まれた各ＧＦＰ遺伝子の蛍光の平均値（発現とコピー数との比として各実験について計算した）。３回以上の実験の平均値が示されており、統計的有意性は対応のないスチューデントｔ−検定によって決定した。アスタリスクは、ｓｉＲＮＡ処理試料と対応する未処理対照との間の有意差を示す；有意レベル：Ｐ＜０．０５（＊）およびｐ＜０．０１（＊＊）；エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 ＨＲのｓｉＲＮＡノックダウンにおけるＭＡＲの効果。ＨＲ因子に対するｓｉＲＮＡで処理し、かつＧＦＰまたはＭＡＲ−ＧＦＰプラスミドで再トランスフェクトしたＣＨＯ細胞におけるＧＦＰ発現および組込みの増加の割合（倍）。平均ＧＦＰ蛍光、コピー数およびＧＦＰコピーあたりの蛍光を、ＧＦＰプラスミドでトランスフェクトした（「モック」として示されている）未処理細胞から得られた結果に対する倍率として示す。Ａ）フローサイトメトリーの結果、Ｂ）ｑＰＣＲによるゲノム中のＧＦＰコピー数の分析、Ｃ）組込まれた各ＧＦＰ遺伝子の蛍光の平均値（発現とコピー数との比として各実験について計算した）。３回以上の実験の平均値が示されており、統計的有意性は対応のないスチューデントｔ−検定によって決定した。アスタリスクは、ｓｉＲＮＡ処理試料と対応する未処理対照との間の有意差を示す；有意レベル：Ｐ＜０．０５（＊）およびｐ＜０．０１（＊＊）；エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 ＨＲのｓｉＲＮＡノックダウンにおけるＭＡＲの効果。ＨＲ因子に対するｓｉＲＮＡで処理し、かつＧＦＰまたはＭＡＲ−ＧＦＰプラスミドで再トランスフェクトしたＣＨＯ細胞におけるＧＦＰ発現および組込みの増加の割合（倍）。平均ＧＦＰ蛍光、コピー数およびＧＦＰコピーあたりの蛍光を、ＧＦＰプラスミドでトランスフェクトした（「モック」として示されている）未処理細胞から得られた結果に対する倍率として示す。Ａ）フローサイトメトリーの結果、Ｂ）ｑＰＣＲによるゲノム中のＧＦＰコピー数の分析、Ｃ）組込まれた各ＧＦＰ遺伝子の蛍光の平均値（発現とコピー数との比として各実験について計算した）。３回以上の実験の平均値が示されており、統計的有意性は対応のないスチューデントｔ−検定によって決定した。アスタリスクは、ｓｉＲＮＡ処理試料と対応する未処理対照との間の有意差を示す；有意レベル：Ｐ＜０．０５（＊）およびｐ＜０．０１（＊＊）；エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。 ＭＭＥＪのｓｉＲＮＡノックダウンにおけるＭＡＲの効果。ＭＭＥＪ因子（およびいくつかのＨＲ因子）に対するｓｉＲＮＡで処理し、かつＧＦＰ（Ａ）またはＭＡＲ−ＧＦＰプラスミド（Ｂ）で再トランスフェクトしたＣＨＯ細胞におけるＧＦＰ発現および組込みを示す。平均ＧＦＰ蛍光、コピー数およびＧＦＰコピーあたりの蛍光を、ＧＦＰプラスミドでトランスフェクトした（「モック」として示されている）未処理細胞から得られた結果に対する倍率として示す。図はフローサイトメトリーの結果を示す。値は、図の下に示されている実験数における平均値示す。ｓｉＭＤＣ１でトランスフェクトした細胞は、ＭＡＲがなくとも、ｓｉＭＤＣでトランスフェクトされていない細胞の１１．８倍という高い比率でＧＦＰを発現した。特に優れた結果は、ＭＡＲを含む特定のプラスミド、すなわちｓｉＢａｒｄ１およびｓｉＬｉｇｌでも得ることができた。 ＭＭＥＪのｓｉＲＮＡノックダウンにおけるＭＡＲの効果。ＭＭＥＪ因子（およびいくつかのＨＲ因子）に対するｓｉＲＮＡで処理し、かつＧＦＰ（Ａ）またはＭＡＲ−ＧＦＰプラスミド（Ｂ）で再トランスフェクトしたＣＨＯ細胞におけるＧＦＰ発現および組込みを示す。平均ＧＦＰ蛍光、コピー数およびＧＦＰコピーあたりの蛍光を、ＧＦＰプラスミドでトランスフェクトした（「モック」として示されている）未処理細胞から得られた結果に対する倍率として示す。図はフローサイトメトリーの結果を示す。値は、図の下に示されている実験数における平均値示す。ｓｉＭＤＣ１でトランスフェクトした細胞は、ＭＡＲがなくとも、ｓｉＭＤＣでトランスフェクトされていない細胞の１１．８倍という高い比率でＧＦＰを発現した。特に優れた結果は、ＭＡＲを含む特定のプラスミド、すなわちｓｉＢａｒｄ１およびｓｉＬｉｇｌでも得ることができた。 ＨＲタンパク質のｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンの効果。この図は、ＧＦＰおよび免疫グロブリンのより高い発現が、Ｒａｄ５１指向性ｓｈＲＮＡを安定発現するＣＨＯ−Ｍ細胞から達成できることを示す。ＣＨＯ−Ｍ細胞を、ピギーバック由来の転移性Ｒａｄ５１ ｓｈＲＮＡ発現ベクターでトランスフェクトし、ポリクローナル細胞プールならびにそれ由来の細胞クローンを、親のＣＨＯ−Ｍ細胞と共にＧＦＰ発現プラスミドで再トランスフェクトした。親ＣＨＯ−Ｍ、Ｒａｄ５１−ｓｈＲＮＡ発現細胞プールおよびそれ由来のクローンのＧＦＰ蛍光を、ＧＦＰおよびピューロマイシン耐性遺伝子の安定発現についての選択の１０日後に評価した。最も蛍光を発するクローンのうちの２つのクローンの蛍光プロファイルを、細胞プールおよび親細胞の蛍光プロファイルの隣に示し（Ａ）、加えて、ピューロマイシン耐性についての選別の１０日後のＭ１、Ｍ２およびＭ３セクター中の細胞のパーセンテージを示す（Ｂ）。ここで、Ｍ１、Ｍ２およびＭ３セクターは、パネルＡ中の１、２および３と表示した水平バーで示した。親ＣＨＯ−Ｍ細胞と比較してより高くて、より安定な発現がｓｈＲＮＡ発現細胞クローンから取得できることを示すために、高発現しているＭ３細胞の一部を、選択剤非存在下において６８日間さらに培養した（Ｃ）。あるいは、インフリキシマブ抗体の軽鎖および重鎖をコードする発現プラスミドを代表クローンにトランスフェクトし、分泌される免疫グロブリンの比生産性を、選別後の抗生物質の非存在下でのさらなる３週間の培養中に評価した。 ＨＲタンパク質のｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンの効果。この図は、ＧＦＰおよび免疫グロブリンのより高い発現が、Ｒａｄ５１指向性ｓｈＲＮＡを安定発現するＣＨＯ−Ｍ細胞から達成できることを示す。ＣＨＯ−Ｍ細胞を、ピギーバック由来の転移性Ｒａｄ５１ ｓｈＲＮＡ発現ベクターでトランスフェクトし、ポリクローナル細胞プールならびにそれ由来の細胞クローンを、親のＣＨＯ−Ｍ細胞と共にＧＦＰ発現プラスミドで再トランスフェクトした。親ＣＨＯ−Ｍ、Ｒａｄ５１−ｓｈＲＮＡ発現細胞プールおよびそれ由来のクローンのＧＦＰ蛍光を、ＧＦＰおよびピューロマイシン耐性遺伝子の安定発現についての選択の１０日後に評価した。最も蛍光を発するクローンのうちの２つのクローンの蛍光プロファイルを、細胞プールおよび親細胞の蛍光プロファイルの隣に示し（Ａ）、加えて、ピューロマイシン耐性についての選別の１０日後のＭ１、Ｍ２およびＭ３セクター中の細胞のパーセンテージを示す（Ｂ）。ここで、Ｍ１、Ｍ２およびＭ３セクターは、パネルＡ中の１、２および３と表示した水平バーで示した。親ＣＨＯ−Ｍ細胞と比較してより高くて、より安定な発現がｓｈＲＮＡ発現細胞クローンから取得できることを示すために、高発現しているＭ３細胞の一部を、選択剤非存在下において６８日間さらに培養した（Ｃ）。あるいは、インフリキシマブ抗体の軽鎖および重鎖をコードする発現プラスミドを代表クローンにトランスフェクトし、分泌される免疫グロブリンの比生産性を、選別後の抗生物質の非存在下でのさらなる３週間の培養中に評価した。 ＨＲタンパク質のｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンの効果。この図は、ＧＦＰおよび免疫グロブリンのより高い発現が、Ｒａｄ５１指向性ｓｈＲＮＡを安定発現するＣＨＯ−Ｍ細胞から達成できることを示す。ＣＨＯ−Ｍ細胞を、ピギーバック由来の転移性Ｒａｄ５１ ｓｈＲＮＡ発現ベクターでトランスフェクトし、ポリクローナル細胞プールならびにそれ由来の細胞クローンを、親のＣＨＯ−Ｍ細胞と共にＧＦＰ発現プラスミドで再トランスフェクトした。親ＣＨＯ−Ｍ、Ｒａｄ５１−ｓｈＲＮＡ発現細胞プールおよびそれ由来のクローンのＧＦＰ蛍光を、ＧＦＰおよびピューロマイシン耐性遺伝子の安定発現についての選択の１０日後に評価した。最も蛍光を発するクローンのうちの２つのクローンの蛍光プロファイルを、細胞プールおよび親細胞の蛍光プロファイルの隣に示し（Ａ）、加えて、ピューロマイシン耐性についての選別の１０日後のＭ１、Ｍ２およびＭ３セクター中の細胞のパーセンテージを示す（Ｂ）。ここで、Ｍ１、Ｍ２およびＭ３セクターは、パネルＡ中の１、２および３と表示した水平バーで示した。親ＣＨＯ−Ｍ細胞と比較してより高くて、より安定な発現がｓｈＲＮＡ発現細胞クローンから取得できることを示すために、高発現しているＭ３細胞の一部を、選択剤非存在下において６８日間さらに培養した（Ｃ）。あるいは、インフリキシマブ抗体の軽鎖および重鎖をコードする発現プラスミドを代表クローンにトランスフェクトし、分泌される免疫グロブリンの比生産性を、選別後の抗生物質の非存在下でのさらなる３週間の培養中に評価した。 ＨＲタンパク質のｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンの効果。この図は、ＧＦＰおよび免疫グロブリンのより高い発現が、Ｒａｄ５１指向性ｓｈＲＮＡを安定発現するＣＨＯ−Ｍ細胞から達成できることを示す。ＣＨＯ−Ｍ細胞を、ピギーバック由来の転移性Ｒａｄ５１ ｓｈＲＮＡ発現ベクターでトランスフェクトし、ポリクローナル細胞プールならびにそれ由来の細胞クローンを、親のＣＨＯ−Ｍ細胞と共にＧＦＰ発現プラスミドで再トランスフェクトした。親ＣＨＯ−Ｍ、Ｒａｄ５１−ｓｈＲＮＡ発現細胞プールおよびそれ由来のクローンのＧＦＰ蛍光を、ＧＦＰおよびピューロマイシン耐性遺伝子の安定発現についての選択の１０日後に評価した。最も蛍光を発するクローンのうちの２つのクローンの蛍光プロファイルを、細胞プールおよび親細胞の蛍光プロファイルの隣に示し（Ａ）、加えて、ピューロマイシン耐性についての選別の１０日後のＭ１、Ｍ２およびＭ３セクター中の細胞のパーセンテージを示す（Ｂ）。ここで、Ｍ１、Ｍ２およびＭ３セクターは、パネルＡ中の１、２および３と表示した水平バーで示した。親ＣＨＯ−Ｍ細胞と比較してより高くて、より安定な発現がｓｈＲＮＡ発現細胞クローンから取得できることを示すために、高発現しているＭ３細胞の一部を、選択剤非存在下において６８日間さらに培養した（Ｃ）。あるいは、インフリキシマブ抗体の軽鎖および重鎖をコードする発現プラスミドを代表クローンにトランスフェクトし、分泌される免疫グロブリンの比生産性を、選別後の抗生物質の非存在下でのさらなる３週間の培養中に評価した。 ＦＡＣＳ解析による２つのＭＡＲ構築物中のＧＦＰ蛍光について評価したときの、高産生細胞および非常に高い産生細胞の百分率（％Ｍ３／Ｍ２）に対する上流の様々なヒト組換え型ＭＡＲの効果。（Ａ）構築物の名前に示されるように、ＭＡＲエレメントはＭＡＲ Ｘ−２９（Ｘ＿２９Ｒ２（配列番号９）、Ｘ＿２９Ｒ３（配列番号１０）、ＭＡＲ １−４２（１＿４２Ｒ２Ｂｉｓ、１＿４２Ｒ３）、ＭＡＲ １−６（１＿６Ｒ２（配列番号８）、１＿６Ｒ３）またはＭＡＲ １−６８（１＿６８Ｒ２（配列番号７）の再構成誘導体であった。（Ｂ）最高の上流ＭＡＲエレメント（ＭＡＲ １−６８Ｒ（配列番号６））について得られた典型的なＦＡＣＳプロファイル。 ＦＡＣＳ解析による２つのＭＡＲ構築物中のＧＦＰ蛍光について評価したときの、高産生細胞および非常に高い産生細胞の百分率（％Ｍ３／Ｍ２）に対する上流の様々なヒト組換え型ＭＡＲの効果。（Ａ）構築物の名前に示されるように、ＭＡＲエレメントはＭＡＲ Ｘ−２９（Ｘ＿２９Ｒ２（配列番号９）、Ｘ＿２９Ｒ３（配列番号１０）、ＭＡＲ １−４２（１＿４２Ｒ２Ｂｉｓ、１＿４２Ｒ３）、ＭＡＲ １−６（１＿６Ｒ２（配列番号８）、１＿６Ｒ３）またはＭＡＲ １−６８（１＿６８Ｒ２（配列番号７）の再構成誘導体であった。（Ｂ）最高の上流ＭＡＲエレメント（ＭＡＲ １−６８Ｒ（配列番号６））について得られた典型的なＦＡＣＳプロファイル。 ２つのＭＡＲベクターにおける発現の安定性。１＿６８Ｒ２、１＿６Ｒ２およびＸ＿２９Ｒ３ ＭＡＲを含むベクターから構築されたポリクローナル集団を、選択剤非存在下での培養で５週間にわたって試験し、ＧＦＰ蛍光をこの期間にわたって毎週評価した。Ｍ３亜集団の百分率を評価した：上流ＭＡＲとして１＿６Ｒ２エレメントおよび下流ＭＡＲとして再構成していないＭＡＲ １−６８が、２つのＭＡＲとベクターとの試験した組合せの中で、最高の組合せであった。Ｍ１およびＭ２亜集団も示す。 単一遺伝子エレメントを含む発現ベクター。ＭＡＲ １＿６８およびＸ＿２９を試験し、ＬｍｎＢ２複製開始点と組み合わせて使用した。ＭＡＲは、導入遺伝子発現カセットの下流側に位置し、２ヶ月間にわたり導入遺伝子トランスフェクションアッセイで評価した。安定的にトランスフェクトされた細胞のポリクローナル集団を、２週間抗生物質耐性について選別し、７週間蛍光励起セルソーター（ＦＡＣＳ）解析によってＧＦＰ蛍光について試験した。高産生Ｍ３細胞の比率を（Ａ）に示し、典型的なＦＡＣＳプロファイルを（Ｂ）に示す。 単一遺伝子エレメントを含む発現ベクター。ＭＡＲ １＿６８およびＸ＿２９を試験し、ＬｍｎＢ２複製開始点と組み合わせて使用した。ＭＡＲは、導入遺伝子発現カセットの下流側に位置し、２ヶ月間にわたり導入遺伝子トランスフェクションアッセイで評価した。安定的にトランスフェクトされた細胞のポリクローナル集団を、２週間抗生物質耐性について選別し、７週間蛍光励起セルソーター（ＦＡＣＳ）解析によってＧＦＰ蛍光について試験した。高産生Ｍ３細胞の比率を（Ａ）に示し、典型的なＦＡＣＳプロファイルを（Ｂ）に示す。 単一遺伝子エレメントを含む発現ベクター：Ｘ−２９。Ｘ−２９ベクターの安定性アッセイ：発現カセットの下流側に単一Ｘ−２９を含む発現ベクターは、培養１４週（２７継代）後でも安定で、非常に高い百分率のＭ２およびＭ３亜集団を与えることが示されている。 安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ集団の抗生物質選別の２４週後の比較分析。発現カセットの下流側に単一Ｘ＿２９ ＭＡＲを有するベクター（ピューロ＿ＣＧＡＰＤ＿ＧＦＰ＿ガストリン＿Ｘ２９）は、上流ＭＡＲとして１＿６Ｒ２および下流ＭＡＲとして１＿６８を有する２つのＭＡＲを有するベクターと比較してＧＦＰ高発現細胞の出現を増加させ、経時的な発現の安定性も増加させる。
本発明の文脈で使用される導入遺伝子は、単離デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）配列であり、該ＤＮＡ配列は、所定の成熟タンパク質をコードし（本明細書ではタンパク質をコードするＤＮＡともいう。）、前駆体タンパク質をコードし、または、タンパク質をコードしない機能性ＲＮＡ（非コードＲＮＡ）をコードする。導入遺伝子は単離され、細胞に導入され、導入遺伝子生成物を生成する。本発明に係るいくつかの好ましい導入遺伝子は、免疫グロブリン（Ｉｇ）およびＦｃ融合タンパク質ならびに他のタンパク質、特に、治療活性のあるタンパク質（「バイオ治療薬」）をコードする導入遺伝子である。例えば、インフリキシマブ（レミケード）などの特定の免疫グロブリンまたは凝固因子ＶＩＩＩなどの他の分泌タンパク質は、ほとんど解明されていない細胞のボトルネックのために、とりわけ発現させることが困難である。本発明の組換え核酸分子、ベクターおよび方法のおかげで、これらのボトルネックは特定されおよび／または明らかにされ得る。これは、一般に、産生され得る治療タンパク質の量および／または例えば、それらのプロセシングおよびグリコシル化などの翻訳後修飾の均一性などのそれらの質を高める。本明細書で使用する導入遺伝子という用語は、タンパク質をコードするＤＮＡとの関連で、ＲＮＡ転写開始シグナル、ポリアデニル化付加部位、プロモーターまたはエンハンサーなどの非翻訳隣接領域を含まない。他の好ましい導入遺伝子には、機能性ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列が含まれる。したがって、導入遺伝子という用語は、本発明の文脈において、（本発明の文脈において、形質導入、すなわちウイルスベクターによる導入も含む）トランスフェクションによって真核宿主細胞などの細胞に導入され、および「導入遺伝子発現産物」、例えば、「異種タンパク質」としても本明細書で言及される目的の生成物をコードするＤＮＡ配列について言及するときに使用される。導入遺伝子は、シグナルペプチドコード配列に機能的に付加されるであろう。該シグナルペプチドコード配列は、シグナルペプチドをコードし、その後該シグナルペプチドは、転移、および／または、小胞体／およびまたは原形質膜を横切る分泌を、媒介および／または促進し、分泌前または分泌中に取り除かれる。
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、２本鎖の標準的なＲＮＡ分子で、一般的に２０〜２５塩基対の長さであり、相補的ヌクレオチド配列を有する特定の遺伝子の発現を妨げることによってＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）において役割を果たす。ｓｉＲＮＡは、細胞に直接導入でき、またはベクターを介して細胞内で発現させることができる。本明細書で言及する単離ＴＥＰ ｓｉＲＮＡは、そのような２０〜２５塩基対の長さのｓｉＲＮＡであり、該２０〜２５塩基対の長さのｓｉＲＮＡは通常、細胞に直接導入される、すなわち、細胞に導入された核酸を介して発現することなしに導入される。
小／短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ＲＮＡｉによる標的遺伝子発現のサイレンシングのために用いることができる、タイトなヘアピンカーブを形成するＲＮＡの配列である。細胞内のｓｈＲＮＡ発現は、典型的には、プラスミドまたはレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターの送達によって達成される。ｓｈＲＮＡを作製するために、ｓｉＲＮＡ配列は、通常、ｓｉＲＮＡの２本鎖の間に短いループを導入するように修飾される。次いで、ｓｈＲＮＡをコードする核酸は、ベクターによって細胞内に送達され、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）に転写され、その通常の方法であるダイサー（Ｄｉｃｅｒ）によって機能的ｓｉＲＮＡに処理され得る。
ｓｉ／ｓｈＲＮＡは、標的遺伝子の発現を配列特異的に低下させることが可能である。ｓｈＲＮＡは標的遺伝子の産物をコードするｍＲＮＡ転写物の領域にハイブリダイズし得、それによって、ＲＮＡ干渉によって標的遺伝子発現を阻害する。二機能性ｓｈＲＮＡは、２つ以上の標的、例えば、ｍＲＮＡの翻訳領域および特定の非翻訳領域を有する。細胞ゲノムへの組込みは、長期持続的または恒常的な遺伝子サイレンシングを促進するが、これは子孫細胞へ伝えられ得る。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、小さいＲＮＡ分子で、例えば、２０〜２４個、特に２２個のヌクレオチドの長さであり、ｍＲＮＡ内の相補配列とペアになることによって遺伝子発現の転写調節および転写後調節において機能する。遺伝子サイレンシングは、導入遺伝子の転写抑制、ｍＲＮＡ分解、またはｍＲＮＡが翻訳されないように防止すること、のいずれかによって生じ得る。ｍｉＲＮＡは、プラスミドまたはレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターの送達によって発現できる。あるいは、ｍｉＲＮＡを阻害または模倣するＲＮＡ分子を合成し、細胞内に直接トランスフェクトできる。
「導入遺伝子発現プロセシング（ＴＥＰ）タンパク質またはＴＥＰ機能性ＲＮＡをコードする配列」は、細胞内に移動した後、所定のＴＥＰタンパク質の発現または増加した発現を可能にするが、非コード機能性ＲＮＡをコードする配列は、それぞれ細胞タンパク質の発現を阻害する。ＴＥＰタンパク質は、細胞タンパク質と同一もしくは同類であり得るか、または異なる細胞もしくは種由来のタンパク質であり得る。発現が、例えば、機能性ＲＮＡによって阻害される細胞タンパク質は、機能性ＲＮＡが導入される細胞の構成タンパク質である。該ＴＥＰタンパク質はまた、別の細胞タンパク質の発現を補い、結果として、好ましくは、導入遺伝子の発現を高めることができる。タンパク質は、組換え、ｍＲＮＡ翻訳プロセス、ＥＲ移行、ポリペプチドの分泌、プロセシングもしくは折りたたみ、ＥＲ−ゴルジ−原形質膜輸送、グリコシル化および／または別の翻訳後修飾に関与し得る。機能性ＲＮＡには、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ラリアット構造にスプライスされたＲＮＡ、短い一時的なセンスＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）、リボザイムＲＮＡおよび他のＲＮＡ、特に標的遺伝子発現をノックダウンすることができるＲＮＡが含まれる。特に好ましい実施形態において、これらのタンパク質は、「タンパク質分泌経路」または「組換え経路」に関与し、しかしまた、後記する特定のタンパク質プロセシングまたは代謝に係るタンパク質も含む。
ＴＥＰ機能性ＲＮＡは、上記の核酸配列から発現され得るだけでなく、細胞内に直接導入され得る。これは、特に、単離されたＴＥＰ ｓｉＲＮＡについて言えることである。
「単離された核酸分子」という用語は、本発明の文脈において、「組換え核酸分子」、すなわち、自然界にこの形態では存在しない核酸分子と同等であるが、自然界に存在する部分をベースにして構築されたものである。
例えば、２つの１本鎖ＤＮＡ鎖または２つの１本鎖ＲＮＡ鎖のヌクレオチドが、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の間の水素結合などの安定な水素結合を形成することができる場合、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸分子は、別のＤＮＡまたはＲＮＡに相補的である。細胞内で、相補的な塩基のペアリングは、例えば、細胞が一方の世代から別の世代へ情報をコピーするのを可能にする。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）において、相補的な塩基のペアリングは、特定の標的遺伝子のサイレンシングまたは完全なノックダウンを可能にする。基本的には、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの配列は、単一ＲＮＡ鎖（例えば、ｓｉＲＮＡ中のアンチセンス鎖）をＲＮＡ、特に宿主細胞のｍＲＮＡと整列させることによって、標的遺伝子の発現を特異的に減少またはノックダウンする。２つの核酸鎖間の相補性の程度は、完全な相補性（各ヌクレオチドはその相手の向かい側にある）から部分的な相補性（５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％）と異なり得る。相補性の程度は、複合体の安定性を決定し、ひいては、遺伝子を、例えばどのくらいうまくノックアウトできるかを決定する。したがって、完全相補性または少なくとも９５％の相補性が好ましい。
ＲＮＡｉにおけるｓｉＲＮＡの活性は、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）へのその結合能に大いに依存する。２本鎖ｓｉＲＮＡのＲＩＳＣへの結合の後に、エンドヌクレアーゼによるセンス鎖の巻き戻しおよび切断が続く。その後、残存アンチセンス鎖−ＲＩＳＣ複合体は、転写サイレンシングを開始するために、標的ｍＲＮＡに結合することができる。
本発明の文脈において、上記で定義した導入遺伝子は、一般的に、例えば、薬学的用途のために大量の産生が望まれるタンパク質を発現するが、ＴＥＰタンパク質／機能性ＲＮＡをコードする配列、または機能的ＲＮＡそれ自体は、直接的または間接的にこのような導入遺伝子の発現を支援するように設計される。「トランスポゾンベクターを用いて発現させたＴＥＰタンパク質の代表的なリスト」を表Ａに列挙する。当業者が理解するとおり、これらのタンパク質の大多数は当技術分野において開示されており、表Ａは、それぞれのタンパク質とそれらのタンパク質をコードする核酸配列の両方のＮＣＢＩ参照配列番号を開示する。最後の列は、これらの配列のいくつかの配列識別子を提供する。当業者は、タンパク質の変異体ならびに８０％、９０％、９５％または９８％を超える配列同一性を有する配列が本発明の一部であることを理解するであろう。
「例えば特異的ピギーバックトランスポゾンベクターを用いて発現させたｓｈＲＮＡの代表的なリスト」を表Ｂに列挙する。当業者が理解するとおり、このようなｓｈＲＮＡは、標的遺伝子が選択されたときに容易に構築できる。例えば、組換え経路の既知の遺伝子の任意の１つが格好の標的遺伝子である。しかし、表Ａに記載のタンパク質の遺伝子などの他の遺伝子は、それらのｓｈＲＮＡから作製されたｓｉＲＮＡに対する格好の標的であり得る。表Ｃは、ｓｉＲＮＡ（センス鎖）の例および対応するｓｉＲＮＡから作製したｓｈＲＮＡの例のリストである。最終的にｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を用いて、細胞ｍＲＮＡの分解を阻止および／または誘発する。これは、一般的に、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベルを低下させる。
同一性は、全配列および完全配列などのこのような配列の２本鎖間の一致の同一性によって決定されるような２つのヌクレオチド配列間の配列関連性の程度を意味する。同一性は容易に計算できる。２つのヌクレオチド配列間の同一性を測定するためのいくつかの方法が存在するが、「同一性」という用語は、当業者によく知られている（計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．（編）、オックスフォード大学プレス、ニューヨーク、１９８８；バイオコンピューティング：インフォマティックスおよびゲノムプロジェクト（Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．（編）、アカデミックプレス、ニューヨーク、１９９３；配列データのコンピューター解析、パートＩ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．（編）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー州、１９９４；分子生物学の配列解析、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、アカデミックプレス、１９８７；ならびに配列解析用プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．（編）、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９１）。２つの配列間の同一性を決定するために一般に用いられる方法には、巨大コンピューターへのガイド（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ）、Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ（編）、アカデミックプレス、サンディエゴ、１９９４、ならびにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，および Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８：１０７３（１９８８）に開示される方法が含まれるが、これらに限定されない。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される２つの配列間で最大の一致を与えるように設計される。このような方法は、コンピュータープログラムに体系化されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータープログラム法には、ＧＣＧ（遺伝学コンピューターグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ），ウィスコンシン州マディソン）プログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）．３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７））が含まれるが、これらに限定されない。よく知られているＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するために用いられ得る。
実例として、参照ヌクレオチド配列と例えば少なくとも９５％の「同一性」を有するヌクレオチド配列を含む核酸とは、ヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり最大５個の点変異を含み得ることを除いて、核酸のヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意味する。言い換えると、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが欠失している、もしくは別のヌクレオチドと置換されていてもよく、または参照配列中の全ヌクレオチドの最大５％までの多くのヌクレオチドが参照配列に挿入されていてもよい。これらの参照配列の変異は、参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端位、またはこれらの末端位の間の任意の場所で生じてよく、参照配列中のヌクレオチド間または参照配列中の１つもしくは複数の隣接グループの中のヌクレオチド間のいずれかで、個々に散在する。本明細書に開示した（例えば、配列番号によっておよび／または受託番号によって開示した）任意の配列について約６０％、約７０％、約７５％、約８５％または約９０％を超える配列同一性も、本発明の範囲内である。
別の核酸配列と実質的に同一性を有する核酸配列は、本明細書に記載の各方法に全くもしくはほとんど影響を及ぼさない配列内に点変異、欠失または付加を有する配列を指し、１００塩基対における１、２、３または４個の変異によって示される場合が多い。
本発明は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変異型の両方に関する。「変異型」とは、開示されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、それらの基本的な特性を保持するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。一般的に、変異型は全体的に非常に類似しており、多くの領域において本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと同一である。
変異型は、翻訳領域、非翻訳領域、またはその両方の中に変化を含み得る。サイレント置換、付加、または欠失をもたらすが、コードされるポリヌクレオチドの性質または活性を変更させない、変形を含むポリヌクレオチド変異型が特に好ましい。遺伝コードの縮重によるサイレント置換によって生じるヌクレオチド変異型が好ましい。さらに、本明細書に開示される５〜１０、１〜５、または１〜２個のアミノ酸が任意の組み合わせで置換、欠失、または付加されている変異型も好ましい。
本発明は、前記ポリヌクレオチドの対立遺伝子変異型も包含する。対立遺伝子変異型は、同じ染色体座を占める遺伝子の２以上の代替型のいずれかを意味する。対立遺伝子変異は、自然に突然変異を介して生じ、集団内に多型をもたらし得る。遺伝子変異は、サイレントであり得る（コードされるポリペプチド中に変化がない）か、またはアミノ酸配列が変化したポリペプチドをコードし得る。ポリペプチドの対立遺伝子変異型は、遺伝子の対立遺伝子変異型がコードするポリペプチドである。本明細書に開示される核酸分子のいずれかの変異型は本発明の一部である。
プロモーター配列または単にプロモーターは、特定の核酸配列の発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列である。プロモーター配列は、ポリヌクレオチドの発現を調節する転写制御配列を含む。該プロモーターは、変異型、切断型、およびハイブリッドのプロモーターを含む、選択された宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であり得、宿主細胞に対して同種もしくは異種である細胞外もしくは細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から取得できる。本発明によるプロモーターには、誘導性および非誘導性プロモーターが含まれる。核酸配列はプロモーターの制御下にあり、プロモーターは前記核酸上でその機能を発揮する。
ＣＧＡＰＤＨ（本明細書ではＣ＿ＧＡＰＤＨともいう。）は、ヒトＧＡＰＤＨプロモーターおよびヒトＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサーを含むエンハンサー−プロモーター融合体である。一実施形態において、ＣＧＡＰＤＨを生成するために、ヒトＧＡＰＤＨプロモーターおよびその５’ＵＴＲを、ヒトＨＥＫ２９３細胞のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。生成物をヒトＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサーの下流側に配置した。代表的な配列については、配列番号１１を参照されたい。配列番号１１と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列も本発明の範囲内である。他の望ましいプロモーター（複数可）および／またはエンハンサー（複数可）またはその融合体は、限定されるものではないが、ＣＭＶ ＩＥエンハンサー、ヒトＧＡＰＤＨプロモーター、ヒトＥｆ１αプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＨＯ ＡｃｔｂプロモーターまたはＣＨＯ Ｈｓｐａ５プロモーターである。これらのエレメントは当技術分野においてよく知られており、サンプル配列を配列番号１１０〜１１６の下に列挙する。当業者に理解されるとおり、その変異型は本発明の一部でもあり、配列番号１１０〜１１６のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有するエレメントでもある。
「トランスポゾン」は、「カット アンド ペースト」または「コピー アンド ペースト」機構によって、ベクターと染色体の間を効率的に転移する可動遺伝エレメントである。転移中、トランスポゼース（例えば、ピギーバックトランスポゾンシステム中のＰＢトランスポゼース）は、トランスポゾン（全てのトランスポゾンシステムに対して５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲがある）の両末端上に位置するトランスポゾン特異的逆位末端配列（ＩＴＲ）を認識し、元の部位から内容物を移動させ、それらをＴＴＡＡ染色体部位などの染色体部位に組込む。ピギーバックトランスポゾンシステムの強力な活性が、該２つのＩＴＲ間の目的の遺伝子を標的ゲノム内に容易に動員するのを可能にする。ピギーバックトランスポゾンシステムは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組込まれる２０１０／０１５４０７０内に記載されている。
ＭＡＲエレメント（ＭＡＲ構築物、ＭＡＲ配列、Ｓ／ＭＡＲまたは単にＭＡＲ）は、ｃＨＳ４などの境界またはインスレーターエレメント、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）、安定化および抗リプレッサー（ＳＴＡＲ）エレメント、遍在作用性クロマチンオープニング（ＵＣＯＥ）エレメントまたはヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）などのヒストン修飾因子も含むエピジェネティック調節因子エレメント（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｅｌｅｍｅｎｔ）の広いグループに属する。
ＭＡＲエレメントは、それらの主なベースになっている同定されたＭＡＲに基づいて定義され得、したがって、ＭＡＲ Ｓ４構築物はヌクレオチドの大部分（５０％以上、好ましくは６０％、７０％または８０％）がＭＡＲ Ｓ４に基づくＭＡＲエレメントである。例えばＡおよびＴの含有量が高いいくつかの単純配列モチーフが、多くの場合ＭＡＲ内に見出されている。一般に見出される他のモチーフは、脊椎動物またはショウジョウバエのＡボックス、Ｔボックス、ＤＮＡ巻き戻しモチーフ、ＳＡＴＢ１結合部位（Ｈボックス、Ａ／Ｔ／Ｃ２５）およびコンセンサストポイソメラーゼＩＩ部位である。
ＭＡＲは、一般的に、核マトリックスが結合している真核生物の染色体のＤＮＡ中の配列として特徴付けられている。ＭＡＲの特性は、一次構造によって部分的にのみ定義されている。例えば、ＡＴリッチ領域などのＭＡＲエレメント内に見出される典型的な一次構造は、三次構造、すなわち、ＭＡＲの機能を定義する特定の屈曲をもたらすことが知られている。したがって、ＭＡＲは、多くの場合、それらの一次構造だけでなく、それらの二次構造、三次構造、例えば、屈曲度および／または融点などの物理的性質によって定義される。
一般にＭＡＲエレメント内に見出されるようなＡＴ／ＴＡ−ジヌクレオチドリッチベントＤＮＡ領域は、特にＡＴおよびＴＡジヌクレオチドの形態で多数のＡおよびＴを含むベントＤＮＡ領域である。好ましい実施形態において、このベントＤＮＡ領域は、隣接する１００塩基対のストレッチ上にジヌクレオチドＴＡを少なくとも１０％、および／またはジヌクレオチドＡＴを少なくとも１２％含み、好ましくは、隣接する１００塩基対のストレッチ上（またはＡＴリッチ領域がより短い長さの場合は、それぞれより短いストレッチ上）にジヌクレオチドＴＡを少なくとも３３％、および／またはジヌクレオチドＡＴを少なくとも３３％含むが、ベント２次構造を有する。しかし、「ＡＴリッチ領域」は、約３０ヌクレオチド以下程度の短さであり得るが、好ましくは、約５０ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０もしくは約４００ヌクレオチド長またはそれ以上である。
いくつかの結合部位は、ＳＡＴＢ１結合部位（Ｈボックス、Ａ／Ｔ／Ｃ２５）および脊椎動物のコンセンサストポイソメラーゼＩＩ部位（ＲＮＹＮＮＣＮＮＧＹＮＧＫＴＮＹＮＹ）またはショウジョウバエのコンセンサストポイソメラーゼＩＩ部位（ＧＴＮＷＡＹＡＴＴＮＡＴＮＮＲ）などの比較的高いＡＴ含有量を有する場合も多い。しかし、結合部位のクラスターを含む結合部位領域（モジュール）、特に、ＴＦＢＳ領域は、領域の屈曲パターンの比較によって、ＡおよびＴ含有量の高いＭＡＲエレメントからのＡＴおよびＴＡジヌクレオチドリッチ領域（「ＡＴリッチ領域」）を容易に区別できる。例えば、ヒトＭＡＲ １＿６８については、後者の平均屈曲度は約３．８または約４．０を超えるが、ＴＦＢＳ領域の平均屈曲度は約３．５または約３．３を下回ることもある。特定されたＭＡＲ領域は、限定されないが、本明細書のどこかに記載のとおり、相対融点などの代替手段によっても確認できる。しかし、このような値は、種特異的であり、したがって、種間で異なり得、例えば、より低いことがある。したがって、それぞれのＡＴおよびＴＡジヌクレオチドリッチ領域は、約３．２〜約３．４もしくは約３．４〜約３．６または約３．６〜約３．８などのより低い屈曲度を有し得、ＴＦＢＳ領域は、約２．７未満、約２．９未満、約３．１未満、約３．３未満などの比例的により低い屈曲度を有し得る。ＳＭＡＲスキャンＩＩにおいて、それぞれより低いウィンドウサイズが当業者によって選択される。
本発明に係るＭＡＲエレメント、ＭＡＲ構築物、ＭＡＲ配列、Ｓ／ＭＡＲまたは単にＭＡＲは、天然に存在する「ＳＡＲ」または「ＭＡＲ」と、上記のものなどの１つまたは複数（２、３または４つなど）の特徴を共有するヌクレオチド配列である。好ましくはこのようなＭＡＲエレメント、ＭＡＲ構築物、ＭＡＲ配列、Ｓ／ＭＡＲまたは単にＭＡＲは、前記ＭＡＲによって影響を受ける任意の遺伝子のタンパク質発現を促進する少なくとも１つの性質を有する。ＭＡＲエレメントは、一般に、単離および／または精製された核酸である特徴も有し、好ましくはＭＡＲ活性を示す、特に、転写調節、好ましくは増強活性を示すだけでなく、例えば、発現安定化活性および／または他の活性も示す。
ＭＡＲエレメント、ＭＡＲ構築物、ＭＡＲ配列、Ｓ／ＭＡＲまたは単にＭＡＲという用語は、特定の実施形態において、本発明に係るＭＡＲ構築物がベースとなり得る天然に存在するＭＡＲおよび／または特定されたＭＡＲを上回る増強をもたらす性質を有する増強されたＭＡＲ構築物も含む。このような性質には、完全長の天然に存在するＭＡＲおよび／または特定されたＭＡＲと比較して減少した長さ、遺伝子の発現／転写の増強、発現の安定性の増強、組織特異性、誘導性またはそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。したがって、増強されるＭＡＲエレメントは、例えば、特定されたＭＡＲ配列のヌクレオチド数の約９０％未満、好ましくは約８０％未満、さらにより好ましくは約７０％未満、約６０％未満、または約５０％未満を含み得る。ＭＡＲエレメントは、前記構築物での適切な細胞の形質転換の際に、導入遺伝子の発現および／または転写を増強し得る。
ＭＡＲエレメントは、好ましくは、所望の遺伝子が作動可能に連結されるか、または作動可能に連結できるプロモーター領域の上流に挿入される。しかし、特定の実施形態において、ＭＡＲエレメントは、所望の遺伝子／ヌクレオチド配列の上流および下流またはすぐ下流に位置づけられることが都合がよい。シスおよび／またはトランスの両方の他の複数のＭＡＲ配置も本発明の範囲内である。
ＭＡＲエレメントの文脈において使用する場合、合成ＭＡＲとは、その設計が特定されたＭＡＲまたはベースとなるＭＡＲの配列／領域もしくは部分領域の単純な再組換え、複製および／または欠失にとどまらずに関与するＭＡＲを指す。特に、合成ＭＡＲ／ＭＡＲエレメントは、一般に、特定されたＭＡＲの１つまたは複数の、好ましくは１つの領域を含むが、好ましい実施形態において合成によって生成される単一もしくは一連のＴＦＢＳなどの、特定の実施形態において合成または修飾されるだけでなく、特異的に設計され、十分に特徴づけられたエレメントであってよい。これらのデザイナーエレメントは、多くの実施形態において比較的短く、特に、一般的に約３００塩基長以下、好ましくは約１００、約５０、約４０、約３０、約２０または約１０塩基長以下である。これらのエレメントは、特定の実施形態において、多量体化され得る。このような合成ＭＡＲエレメントは本発明の一部でもあり、一般的に、本明細書が「ＭＡＲエレメント」に適用されるといわれるものは合成ＭＡＲエレメントに同様に適用されると理解され得ると理解されるべきである。
上記のＭＡＲエレメントの機能を維持する限り、特定のＭＡＲエレメントのヌクレオチド配列の機能的断片も含まれる。
いくつかの好ましい特定のＭＡＲエレメントには、これらのおよび他のＭＡＲエレメントの配列の開示について参照により本出願に明確に組込まれるＷＯ２００５０４０３７７および米国特許公開第２００７０１７８４６９号に開示されるような全てのそれらの並び替えを含むＭＡＲ １＿６８、ＭＡＲ Ｘ＿２９、ＭＡＲ １＿６、ＭＡＲ Ｓ４、ＭＡＲ Ｓ４６が含まれるが、これらに限定されない。ニワトリのリゾチームＭＡＲも好ましい実施形態である（また、特にそのＭＡＲエレメントの開示について本明細書に明確に組込まれる米国特許第７，１２９，０６２号を参照されたい）。
ベクターが単一ＭＡＲを含むと言われる場合、これは、このベクター中に１つのＭＡＲがあり、同じもしくは異なる種類または同じもしくは異なる構造のいずれかのベクター内に他のＭＡＲがないことを意味する。
本発明の特定の実施形態において、同じもしくは異なる種類または同じもしくは異なる構造であり得、全てが所望の遺伝子の下流に位置付けられ得る複数のＭＡＲがある。これは、単一ＭＡＲクラスターと呼ばれる。
ポリペプチドを安定発現する細胞の数などのあるものが、例えば、配列の存在から「独立している」と言われる場合、この配列は、（例えば、ポリペプチドを安定発現する細胞の数に）任意の統計的に有意な程度までは影響しない。
本発明の導入遺伝子または導入遺伝子発現プロセシングタンパク質もしくは機能性ＲＮＡをコードする配列は、ベクターの一部である場合が多い。
本発明に係るベクターは、このベクターによって発現し、ベクターに連結された、一般的に組込まれた導入遺伝子などの別の核酸を輸送できる核酸分子である。例えば、プラスミドはベクターの一種であり、レトロウイルスまたはレンチウイルスは別の種類のベクターである。本発明の好ましい実施形態において、ベクターはトランスフェクション前に線形化される。発現ベクターは、調節エレメントを含むか、または発現ベクターによって運ばれる核酸配列の転写および／または発現を促進するように設計されるこのような調節エレメントの制御下にある。調節エレメントは、エンハンサーおよび／またはプロモーターだけでなく、本明細書に記載の様々な他のエレメントも含む（「ベクター設計」も参照されたい）。
ベクターのベクター配列は、導入遺伝子およびＭＡＲエレメントなどの遺伝因子などの任意の「他の」核酸をのぞくベクターのＤＮＡまたはＲＮＡ配列である。
組換え哺乳類細胞／真核生物宿主細胞などの哺乳類細胞を含む、本発明に係る真核細胞は、細胞培養条件下で維持できる。この種の細胞の非限定例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）などの非霊長類真核生物宿主細胞が挙げられる。霊長類真核生物宿主細胞には、例えば、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）で形質転換されたヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）およびサル腎臓ＣＶ１株が含まれる。組換え真核生物宿主細胞または組換え哺乳類細胞は、例えば、トランスジェニック配列でのトランスフェクションおよび／または変異によって改変された細胞を表す。真核生物宿主細胞または組換え哺乳類細胞は、前記細胞によって発現されるタンパク質の転写後修飾を実行できる。本発明の特定の実施形態において、真核生物（例えば、非霊長類）宿主細胞の細胞対応物は完全に機能的であり、すなわち、例えば、変異によって不活性化されていない。むしろ、（例えば、霊長類の）トランスジェニック配列は、（例えば、非霊長類の）その細胞対応物に加えて発現する。
本発明に係るトランスフェクションは、例えば限定されないが、電気穿孔法、リポフェクション、一般的に非ウイルスベクター（ベクター媒介トランスフェクション）によるか、またはポリカチオン性脂質に関与する手段を含む化学的手段によるレシピエント真核細胞への核酸の導入である。非ベクター媒介トランスフェクションには、例えば、単離ＴＥＰ ｓｉＲＮＡの細胞への直接導入が含まれる。一過的にトランスフェクトされた細胞において、例えば、ｓｉＲＮＡのみ一過的に残る。本発明の文脈において、導入遺伝子発現プロセシング（ＴＥＰ）タンパク質またはＴＥＰ機能性ＲＮＡをコードする配列を有する少なくとも１つ核酸分子での第１のトランスフェクションによるか、またはもう１つの方法としてＴＥＰ機能性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）での直接トランスフェクションおよび導入遺伝子をコードする核酸での第２のその後のトランスフェクションがあってよい。第１および第２のトランスフェクションの両方は反復可能である。例えば、ｓｉＲＮＡは、第１のトランスフェクション中に導入され、組換えタンパク質（トランスフェクト細胞において組換え事象に関与するタンパク質）に作用、特に阻害する。この後、導入遺伝子は、第２のその後のトランスフェクション中に導入される。
転写とは、ＤＮＡ鋳型からＲＮＡを合成することを意味する。「転写活性」は、例えば、転写される導入遺伝子を指す。翻訳は、ＲＮＡからタンパク質が作られるプロセスである。
分泌の増強は、それぞれのトランスジェニック配列を含まない対照細胞から得られる値と比較して測定される。対照の値に対する任意の統計的に有意な増強は、促進として認定される。
選択マーカーは、生成物が選択剤の抗生物質（例えば、クロラムフェニコール、アンピシリン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、カナマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシン）に対する抵抗性または選択培地（例えば、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素））上で成長する能力を付与する遺伝子を含む核酸である。
シャペロンとして知られるタンパク質のクラスは、別のタンパク質の他の不安定な立体構造異性体に結合し、安定化するタンパク質として定義されており、制御された結合および遊離によって、生体内でのその正しい運命、すなわち、折りたたみ、オリゴマーアセンブリ、特定の細胞内区画への輸送、または分解による廃棄を促進する。ＢｉＰ（酵母においてＧＲＰ７８、Ｉｇ重鎖結合タンパク質およびＫａｒ２Ｐとしても知られる）は、ｈｓｐ７０ファミリーの豊富な約７０ｋＤａのシャペロンであり、小胞体（ＥＲ）中に存在し、他の機能の中では、分泌系での輸送を支援し、タンパク質を折りたたむ働きをしている。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）はシャペロンタンパク質であり、ＥＲに存在して、タンパク質の翻訳後プロセシング中のジスルフィド結合形成の触媒作用に関与する。
細胞代謝エンジニアリング
細胞代謝エンジニアリングで、例えば、発現細胞に固有のプロセスが変更される。例えば、分泌経路の特定のタンパク質が、例えば、過剰発現する。あるいは、組換え経路に影響を与えることによって、組換えイベントが変更される。
タンパク質分泌経路
タンパク質の分泌は、３つの界全ての生物に共通するプロセスである。この複雑な分泌経路は、特に、細胞質ゾルから細胞の細胞膜を横切るタンパク質の移行を必要とする。タンパク質をその最終目的地に到着させるのに複数のステップおよび様々な因子が必要とされる。哺乳類細胞において、この分泌経路には、シグナル識別粒子（ＳＲＰ）および分泌複合体（Ｓｅｃ複合体またはトランスロコン）である２つの主な巨大分子アセンブリが関与する。ＳＲＰは、９、１４、１９、５４、６８および７２ｋＤａの質量を有する６つのタンパク質ならびに７Ｓ ＲＮＡで構成されており、該トランスロコンは、Ｓｅｃ６１αβγ、Ｓｅｃ６２およびＳｅｃ６３で構成されるドーナツ形粒子である。これらのタンパク質のいくつかのヒト版の受託番号（括弧内）は以下のとおりである：ｈＳＲＰ１４（受託番号Ｘ７３４５９．１）；ｈＳＲＰ９（ＮＭ＿００１１３０４４０）；ｈＳＲＰ５４（ＮＭ＿００３１３６）；ｈＳＲＰＲα（ＮＭ＿００３１３９）；ｈＳＲＰＲβ（ＮＭ＿０２１２０３）；ｈＳＥＣ６１α１（ＮＭ＿０１３３３６）；ｈＳＥＣ６１β（Ｌ２５０８５．１）；ｈＳＥＣ６１γ（ＡＫ３１１８４５．１）。
タンパク質分泌における第１のステップはシグナルペプチドに依存し、新生タンパク質が膜を横切って、小胞体（ＥＲ）の内腔に移行するのを媒介する、ポリペプチドのアミノ末端にある特定のペプチド配列を含む。このステップ中、主要な翻訳リボソームから派生するシグナルペプチドは、シグナルペプチドを認識するＳＲＰ粒子のサブユニット、すなわちＳＲＰ５４と相互作用する。シグナルペプチドへのＳＲＰ結合は、新生ポリペプチドのさらなる伸長を阻止し、翻訳停止をもたらす。ＳＲＰ９およびＳＲＰ１４タンパク質は、伸長停止に必要である（Ｗａｌｔｅｒ ａｎｄ Ｂｌｏｂｅｌ １９８１）。第２のステップにおいて、リボソーム−新生ポリペプチド−ＳＲＰ複合体は、ＳＲＰ５４とＳＲＰ受容体（ＳＲ）の相互作用を介してＥＲ膜に結合する（Ｇｉｌｍｏｒｅ，Ｂｌｏｂｅｌ ｅｔ ａｌ．１９８２；Ｐｏｏｌ，Ｓｔｕｍｍ ｅｔ ａｌ．２００２）。該ＳＲは、ＧＴＰアーゼ活性を示すＳＲαおよびＳＲβの２つのタンパク質を含むヘテロ二量体複合体である（Ｇｉｌｍｏｒｅ，Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．１９８２）。ＳＲとＳＲＰ５４の相互作用は、ＧＴＰの結合に依存する（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｒａｐｉｅｊｋｏ ｅｔ ａｌ．１９９１）。該ＳＲは、リボソーム−新生ポリペプチド複合体からのＳＲＰの放出およびリボソームの出口部位とＳｅｃ６１複合体（トランスロコン）との会合を調整する。成長しつつある新生ポリペプチドはトランスロコンチャネルを通ってＥＲに入り、翻訳がその正常速度で再開する。リボソームは、翻訳が完了するまで、トランスロコンの細胞質表面上に結合したままである。リボソームに加えて、トランスロコンは、細胞質表面上のリボホリンならびにカルレティキュリンおよびカルネキシンなどのシャペロン、ならびに内腔面上のプロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）およびオリゴサッカリルトランスフェラーゼと密接に結びついている。成長している新生ポリペプチドがＥＲの内腔中につきだした後、シグナルペプチドは、シグナルペプチダーゼと呼ばれる酵素によりプレタンパク質から切断され、それにより成熟タンパク質をＥＲ中に放出する。翻訳後修飾、正しい折りたたみおよび多量体化後に、タンパク質はＥＲを出て、ゴルジ装置へ、次いで分泌小胞へと移動する。分泌小胞の細胞膜との融合により、小胞の内容物は細胞外環境中に放出される。
注目すべきことに、分泌タンパク質は、細胞膜を横切るそれら自身の移行に非常に適した特定のシグナル配列を有するように進化した。異なるシグナルペプチドとして見いだされる様々な配列は、独特の方法で分泌装置と相互作用する可能性がある。シグナル配列は、主に、本来は疎水性であり、この特性は新生ペプチドを分泌タンパク質へと向かわせることに関与し得る。アミノ酸の疎水性ストレッチに加えて、多くの一般的な配列特性は、大部分の哺乳類分泌シグナルによって共有されている。異なるシグナルペプチドは異種タンパク質を分泌させる効率が異なるが、異種組換えタンパク質を分泌させるために用いることができるいくつかの分泌シグナルペプチド（すなわち、インターロイキンシグナル配列、免疫グロブリンシグナル配列、組織適合性受容体シグナル配列などの分泌シグナルペプチド）が同定されている。類似しているにもかかわらず、天然のシグナルペプチドが天然の状況から離れて正しく機能することができないか、または宿主細胞もしくは分泌プロセスに関連する相違のために、これらの配列は、難発現タンパク質の効率的な分泌を促進するのに最適でない。異種タンパク質の効率的な分泌に適するシグナル配列の選択は、切断されたシグナルペプチド内の配列と成熟タンパク質の他の部分との相互作用によってさらに複雑になり得る（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９３）。
組換え経路
ＤＮＡ組換え経路としても知られる組換え経路は、染色体２本鎖切断後のＤＮＡ分子の末端接合などのＤＮＡ損傷修復、ならびに例えば、減数分裂時の染色体交差またはリンパ球細胞における免疫グロブリン遺伝子の再構成などの染色体ＤＮＡ分子と非染色体ＤＮＡ分子の間でのＤＮＡ配列の交換もしくは融合をもたらす細胞経路である。３つの主要な組換え経路は、相同組換え経路（ＨＲ）、非相同末端結合経路（ＮＨＥＪ）およびマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）経路ならびに代替末端結合（Ａｌｔ−ＥＪ）経路である。
相同組換え（ＨＲ）、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）およびマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）の機構
導入遺伝子は２本鎖切断位置で宿主ゲノムへ組込むために組換え機構を使用する
２本鎖切断（ＤＳＢ）は、ゲノム損傷の生物学的に最も有害な種類であり、細胞死または多種多様な遺伝子再構成をもたらす可能性がある。正確な修復が、遺伝情報の維持および伝播の成功に必須である。
非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換え（ＨＲ）の２つの主要なＤＳＢ修復機構がある。マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）と呼ばれる第３の機構は、２つの主要なＤＳＢ修復機構が失敗したときに機能する場合が多い。相同組換えは相同性を共有するＤＮＡ配列間の遺伝子交換のためのプロセスであり、主に細胞周期のＳ／Ｇ２期中に作動し、ＮＨＥＪは、通常は配列相同性のない２つの切断されたＤＮＡ末端を単に統合し、細胞周期の全期で機能するが、有糸分裂細胞のＧ０〜Ｇ１および初期Ｓ期中が特に重要である（Ｗｏｎｇ ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８５；Ｄｅｌａｃｏｔｅ ａｎｄ Ｌｏｐｅｚ，２００８）。脊椎動物において、ＨＲ、ＮＨＥＪおよびＭＭＥＪは、ＤＳＢ修復に差次的に寄与し、ＤＳＢの性質および細胞周期の時期に依存する（Ｔａｋａｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。
ＮＨＥＪ：基本的機構
概念的に、ＮＨＥＪプロセスの分子機構は、１）一組の酵素が切断されたＤＮＡ分子を捕捉し、２）２つのＤＮＡ末端をつなぎ合わせて、分子ブリッジを形成し、３）切断された分子を再結合するというように、単純であると考えられている。このような反応を実行するために、哺乳類細胞におけるＮＨＥＪ機構には、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ（ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼの触媒サブユニット）に結合したヘテロ二量体Ｋｕ８０／Ｋｕ７０およびその補助因子ＸＲＣＣ４（Ｘ線補完チャイニーズハムスター遺伝子４（Ｘ−ｒａｙ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｇｅｎｅ ４））と結合したＤＮＡリガーゼＩＶの２つのタンパク質複合体、ならびにアルテミス（Ａｒｔｅｍｉｓ）およびＸＬＦ（ＸＲＣＣ４様因子、またはケルヌンノス（Ｃｅｒｎｕｎｎｏｓ））などの多くのタンパク質因子が関与する（Ｄｅｌａｃｏｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００２）。ＮＨＥＪは、通常は配列相同性のない２つの切断されたＤＮＡ末端を単につなぎ合わせ、小さな挿入および欠失を生じさせるので、たびたびエラープローンＤＳＢ修復と見なされる（Ｍｏｏｒｅ ａｎｄ Ｈａｂｅｒ，１９９６；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。ＮＨＥＪは、細胞周期全体にわたってＤＳＢ修復機構を提供するが、有糸分裂細胞のＧ０〜Ｇ１および初期Ｓ期中が特に重要である（Ｔａｋａｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｄｅｌａｃｏｔｅ ａｎｄ Ｌｏｐｅｚ，２００８）。ＮＨＥＪによるＤＳＢの修復は、細菌から哺乳類に及ぶ生物で観察されており、進化の間、保存されていることを示す。
ＤＳＢ形成後、ＮＨＥＪ修復経路における重要なステップは、切断されたＤＮＡ末端の物理的並立である。ＮＨＥＪは、Ｋｕ７０／８０ヘテロ二量体タンパク質複合体の切断されたＤＮＡ分子の両端への会合により開始され、末端を捕捉し、つなぎ合わせ、他のＮＨＥＪの重要な因子のアセンブリのための足場を作製する。ＤＮＡ結合Ｋｕヘテロ二量体複合体は、ＰＩＫＫ（タンパク質キナーゼのホスホイノシチド３−キナーゼ様ファミリー）に属する４６０ｋＤａのタンパク質であるＤＳＢへＤＮＡ−ＰＫｃｓを動員し（Ｇｏｔｔｌｉｅｂ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ，１９９３）、そのセリン／トレオニンキナーゼ機能を活性化させる（Ｙａｎｅｖａ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。２つのＤＮＡ−ＰＫｃｓ分子はＤＳＢ全体にわたって相互作用し、したがって切断されたＤＮＡ両端間で分子ブリッジを形成し、それらの分解を阻止する（ＤｅＦａｚｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００２）。その後、ＤＮＡ末端を直接ライゲートすることができるが、ＤＳＢから生じる末端のほとんどは、ライゲーション前に適切に処理されなければならない（Ｎｉｋｊｏｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。切断の性質に応じて、ギャップを埋め、損傷を受けたＤＮＡまたは切断周囲の二次構造を除去することによって、プロセッシング酵素の種々の組合せの作用が適合性のあるオーバーハングを作製するのに必要とされ得る。ＮＨＥＪプロセスにおけるこのステップは、ＮＨＥＪ修復に関連するヌクレオチドの偶発的損失の原因であると考えられる。哺乳類のＮＨＥＪにおける１つの重要な末端プロセッシング酵素は、酵素のメタロ−β−ラクタマーゼスーパーファミリーのメンバーであるアルテミス（Ａｒｔｅｍｉｓ）であり、これは、放射線感受性の重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）患者の大多数において変異遺伝子として発見された（Ｍｏｓｈｏｕｓ ｅｔ ａｌ．， ２００１）。アルテミスは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性と、ＤＮＡ含有ｄｓ−ｓｓ転移およびＤＮＡヘアピンに対するＤＮＡ−ＰＫｃｓ依存性エンドヌクレアーゼ活性の両方を有する（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，２００２）。その活性はまた、ＡＴＭによって調節される。したがって、アルテミスは、複数のＤＮＡ−損傷応答に関与する可能性があると考えられている。しかし、ＤＳＢ修復における主な欠陥はアルテミス欠損細胞では観察されなかったので、ＤＮＡ病巣のサブセットのみがアルテミスによって修復されると考えられている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｄａｒｒｏｕｄｉ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
修復を可能にするためにはＤＮＡギャップが埋められなければならない。ヌクレオチドのＤＳＢへの付加は、ポリメラーゼμおよびλに限定される（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｃａｐｐ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＸＲＣＣ４との相互作用により、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）もＤＮＡ末端へ動員され、ＤＮＡ重合およびライゲーションの両方が可能になる（Ｋｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００４）。最後に、ＮＨＥＪは、ＸＲＣＣ４、ＤＮＡリガーゼＩＶおよびＸＬＦを含む複合体により実施されるステップであるＤＮＡ末端のライゲーションにより完成する（Ｇｒａｗｕｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。ＮＨＥＪはＸＲＣＣ４およびリガーゼＩＶの非存在下で起こり得るので、他のリガーゼはＤＮＡリガーゼＩＶを部分的に置換することができる（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）。さらに、研究により、ＸＲＣＣ４およびリガーゼＩＶはＮＨＥＪの外側では役に立たないが、対照的に、ＫＵは転写、アポトーシス、およびミクロ環境に対する反応などの他のプロセスで作用することが示された（Ｍｏｎｆｅｒｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｄｏｗｎｓ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ，２００４）。
様々な方法でＮＨＥＪを減少または停止させることができ、それらの多くは、上述したタンパク質（例えば、ヘテロ二量体Ｋｕ８０／Ｋｕ７０、ＤＮＡ−ＰＫｃｓであるが、特にＤＮＡリガーゼＩＶ、ＸＲＣＣ４、アルテミスおよびＸＬＦ（ＸＲＣＣ４様因子；またはケルヌンノス）、ＰＩＫＫ（タンパク質キナーゼのホスホイノシチド３−キナーゼ様ファミリー）に直接影響を与える。
ＨＲ：基本的機構
相同性組換え（ＨＲ）は非常に正確な修復機構である。相同染色分体は切断された鎖の修復のための鋳型として役割を果たす。ＨＲは、姉妹染色分体が利用可能である場合、細胞周期のＳおよびＧ２期中で起こる。古典的ＨＲは主に３つのステップ：１）切断された末端の５’の切除、２）鎖の侵入および相同性のあるＤＮＡ２重鎖との交換、ならびに３）組換え中間体の分解、によって特徴付けられる。異なる経路は、鎖の侵入を実行する能力に依存してＤＳＢ修復を完了することができ、合成依存性の鎖のアニーリング（ＳＤＳＡ）経路、古典的２本鎖切断修復（ＤＳＢＲ）（Ｓｚｏｓｔａｋ ｅｔ ａｌ，１９８３）、切断により誘発される複製（ＢＩＲ）、および、あるいは、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）経路を含む。全てのＨＲ機構は、相互接続し、多くの酵素ステップを共有する。
全てのＨＲ反応の第１ステップは、ＭＲＮ複合体（ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＮＢＮ（以前はナイミーヘン染色体不安定症候群１のＮＢＳ１））およびＣｔＩＰ（ＣｔＢＰ相互作用タンパク質）の助けを借りたヌクレアーゼによる５’末端切断ＤＮＡ鎖の切除に相当する（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｗｈｉｔｅ ａｎｄ Ｈａｂｅｒ，１９９０）。結果としての３’一本鎖ＤＳＢの生成は、相同性配列を探索することができる。相同性２重鎖の侵入は、ＲＡＤ５１リコンビナーゼタンパク質でコーティングされた３’ｓｓ−ＤＮＡで構成されるヌクレオフィラメントによって行われる（Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。真核生物においてｓｓＤＮＡに関連したＤＮＡ代謝プロセスに関与するヘテロ三量体ｓｓＤＮＡ結合ンパク質である複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）の要件（Ｗｏｌｄ，１９９７）は、ＲＡＤ５１フィラメントのアセンブリに必要である（Ｓｏｎｇ ａｎｄ ｓｕｎｇ，２０００）。次いで、ＲＡＤ５１は環状構造を有するＲＡＤ５２と相互作用し（Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、ＲＰＡ分子を置換し、ＲＡＤ５１ローディングを促進する（Ｓｏｎｇ ａｎｄ ｓｕｎｇ，２０００）。Ｒａｄ５２は、酵母における組換えプロセスに重要である（Ｓｙｍｉｎｇｔｏｎ，２００２）。しかし、脊椎動物では、ＲＡＤ５２よりむしろＢＲＣＡ２（乳癌２型感受性タンパク質）が鎖の侵入および交換で重要な役割を果たすと考えられている（Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ，２００７；Ｅｓａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＲＡＤ５１／ＲＡＤ５２相互作用は、ＲＡＤ５４の結合により安定化される。ＲＡＤ５４は、Ｄループ形成後の組換え中間体の成熟においても役割を果たす（Ｂｕｇｒｅｅｖ ｅｔ ａｌ．，２００７）。他方で、ＢＲＣＡ１（乳癌１）はＢＡＲＤ１（ＢＲＣＡ１関連ＲＩＮＧドメイン１）およびＢＡＣＨ１（ＢＴＢおよびＣＮＣ相同１）と相互作用して、それぞれリガーゼおよびヘリカーゼＤＳＢ修復活性を発揮する（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ＢＲＣＡ１はまた、ＣＤＫに依存した方法でＣｔＩＰと相互作用し、かつＤＮＡ損傷に反応してユビキチン化を受ける（Ｌｉｍｂｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）。結果として、ＢＲＣＡ１、ＣｔＩＰおよびＭＲＮ複合体は、細胞周期のＳおよびＧ２期におけるＤＮＡのＨＲ介在性修復の活性化において役割を果たす。
ヌクレオフィラメントの侵入は、置換ループ（Ｄループ）と呼ばれるヘテロ２重鎖の形成をもたらし、侵入する鎖による２本鎖のうちの１本鎖の置換および他の鎖との対合に関与する。次いで、いくつかのＨＲ経路は鋳型として相同性配列を用いて修復を完了して、ＤＳＢを取り巻く配列を置換することができる。使用される機構に応じて、相同性の鋳型と切断されたＤＮＡ分子との間の相互交換（クロスオーバー）は、ＨＲ修復と関連しても、または関連しなくてもよい。クロスオーバーは、ゲノム再構成またはヘテロ接合の損失などの重要な遺伝的意義を有し得る。
５つのＲａｄ５１パラログであるＸｒｃｃ２、Ｘｒｃｃ３、Ｒａｄ５１Ｂ、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｒａｄ５１Ｄも相同組換えに関与する（Ｓｕｗａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。Ｒａｄ５１パラログは、２種類の複合体を形成し、一方はＢＣＤＸ２と命名され、Ｒａｄ５１Ｂ、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｒａｄ５１ＤおよびＸｒｃｃ２を含み、他方は、Ｒａｄ５１ＣおよびＸｒｃｃ３（ＣＸ３）を含む（Ｍａｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）。第１の複合体は、Ｒａｄ５１−ＤＮＡ複合体の形成および／または安定化に関与すると考えられている（Ｍａｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）。第２の複合体の役割は、分岐点移動およびホリデイ構造の分解であると考えられている（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
以前に報告されたように、ＮＨＥＪに対するＨＲの増加（参照によりその全体が本明細書に組込まれる米国特許公開第２０１２０２３１４４９号参照）を用いて、導入遺伝子の発現を増強および／または促進することができる。
本発明は、ＨＲの減少または停止に取り組む。ＨＲは、様々な方法で減少または停止させることができ、それらの多くは、上述のタンパク質（例えば、ＭＲＮ複合体（ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＮＢＮ（以前はナイミーヘン染色体不安定症候群１のＮＢＳ１）のタンパク質）およびＣｔＩＰ（ＣｔＢＰ相互作用タンパク質）、ＲＡＤ５１、複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）、Ｒａｄ５２、ＢＲＣＡ２（乳癌２型感受性タンパク質）、ＲＡＤ５４、ＢＡＲＤ１（ＢＲＣＡ１結合ＲＩＮＧドメイン１）と相互作用するＢＲＣＡ１（乳癌１）、ＢＡＣＨ１（ＢＴＢおよびＣＮＣ相同１）に直接影響を与える。本発明は、この目的を達成するために、ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡの産生に取り組む。
マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）
他の組換え経路が失敗するかまたは作用しない場合、ＤＳＢは、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）と呼ばれる別のエラープローン修復機構によって修復できる。この経路は、依然として十分に解明される必要性があり、代替末端結合（ａｌｔ−ＥＪ）とも称される場合があるが、これらの２つのプロセスが同じ機構に基づくか否かは明らかではない。ＮＨＥＪと区別するこの経路の最も特徴的な特性は、切断されたＤＮＡ鎖のアライメント中に、５〜２５塩基対のマイクロホモロジーを使用することである（ＭｃＶｅｙ ａｎｄ Ｌｅｅ，２００８）。
ＭＭＥＪは、細胞周期の全ての時期に生じることができ、ＮＨＥＪおよびＨＲのコア因子、すなわち、Ｋｕ７０、リガーゼＩＶおよびＲａｄ５２遺伝子に依存しない（Ｂｏｂｏｉｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｙｕ ａｎｄ ＭｃＶｅｙ，２０１０；Ｌｅｅ ａｎｄ Ｌｅｅ，２００７；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，２００３）。それどころか、ＭＭＥＪの開始はそれ自体のタンパク質セットに依存し、最も重要なことは、ＨＲの第１のステップにも関与するＭｒｅ１１、Ｒａｄ５０およびＮｂｓ１（酵母ではＸｒｓ２）を含むＭＲＮ複合体（酵母ではＭＲＸ）の構成成分であることである（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＭＲＮ複合体は別として、多くの他の因子、例えば、ＣＴＢＰ相互作用タンパク質（ＣｔＩＰ；Ｙｕｎ ａｎｄ Ｈｉｏｍ，２００９）、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ１）、リガーゼＩＩＩ／Ｘｒｃｃ１複合体、リガーゼＩ（Ａｕｄｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００４）、ＤＮＡポリメラーゼθ（Ｙｕ ａｎｄ ＭｃＶｅｙ，２０１０）、およびＥＲＣＣ１／ＸＰＦ複合体（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，２００３）が、ＭＭＥＪに関与すると考えられてきた。しかし、より多くのタンパク質がこのプロセスに関与している。
他のＤＮＡ末端結合タンパク質（ＫｕまたはＲａｄ５１など）が存在しない場合、ＤＳＢは、ＰＡＲＰ１によって認識され、次いで、ＭＭＥＪを介してそれらの修復を開始することが示唆されている（ＭｃＶｅｙ ａｎｄ Ｌｅｅ，２００８）。ＨＲに似た修復プロセスは、５’から３’末端切断を開始し、切断部のそれぞれの側にある短い相同領域を曝す。このプロセシングステップは、ＭＲＮ複合体によって行われ、ＣｔＩＰによって調節されている（Ｍｌａｄｅｎｏｖ ａｎｄ Ｉｌｉａｋｉｓ，２０１１）。（３’ｓｓＤＮＡ断片に存在する）相補領域がペアを形成し、おそらくＥＲＣＣ１／ＸＰＦ複合体によって非相補セグメント（フラップ）が除去される（Ｙｕ ａｎｄ ＭｃＶｅｙ，２０１０）。次いで、ギャップ（存在する場合）がポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼθまたはδ（Ｙｕ ａｎｄ ＭｃＶｅｙ，２０１０；Ｌｅｅ ａｎｄ Ｌｅｅ，２００７））によって埋められ、切断部がリガーゼＩまたはリガーゼＩＩＩ／Ｘｒｃｃ１複合体によって結合される。
ＤＮＡ末端にマイクロホモロジー領域が存在しない場合、ほとんどの場合そうであるが、修復される分子のより遠い断片は正確なＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ポリメラーゼθ）を用いてコピーされ得る。次いで、この複製された領域がＤＮＡ末端のアライメントに関与し、作製される分岐点に挿入をもたらす。このより複雑なマイクロホモロジー媒介性修復の変形は、合成依存性ＭＭＥＪ（ＳＤ−ＭＭＥＪ）と命名されている（Ｙｕ ａｎｄ ＭｃＶｅｙ，２０１０）。
ＭＭＥＪは、別の組換え修復経路として機能すると考えられているが、Ｂリンパ球におけるＩｇＨクラススイッチ組換えプロセスにおいて非常に効率的であることが示されており（Ｂｏｂｏｉｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、バックアップ機構よりも効率的であると示唆される。いくつかのＤＳＢ、例えば、（ＮＨＥＪおよび／またはＨＲの標的になりにくい）適合しないオーバーハングまたは平滑末端は、ＭＭＥＪによってより効率的に修復される可能性もある（Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｐａｕｌｌ，２００５）。
表Ｄに、３つの経路のそれぞれに影響を与えるのに重要な標的でもある、３つの経路のそれぞれの中の重要遺伝子のいくつかをまとめる（参照によりその全体が本明細書に組込まれる米国特許公開第２０１２０２３１４４９号も参照されたい）。ＭＤＣ１およびＭＨＳ２などのＤＮＡ修復タンパク質も表に含まれる。ＭＤＣ１は、ＤＮＡ損傷に応答して、Ｓ期およびＧ２／Ｍ期の細胞周期チェックポイント中に活性化する必要がある。しかし、ＭＤＣ１はまた、クロマチンにＲａｄ５１を保持することによって、Ｒａｄ５１媒介性相同組換えにおいても機能する。
本発明の文脈における「ノックダウン」は、標的遺伝子の発現を、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上減少させることを意味する。完全ノックダウンは、標的遺伝子の発現が全く検出できないことを意味する。表Ｄはまた、特定のノックダウン標的を用いて得られた結果も示す。当業者が理解するとおり、標的の核酸配列に変化があるので、遺伝子の変異型、特に８０％、９０％または９５％の配列同一性を示す変異型は本発明の一部である。
タンパク質プロセシングおよび代謝に係るタンパク質
細胞代謝エンジニアリングのために使用できるこのカテゴリーのタンパク質は、タンパク質分泌経路にも組換え経路にも属さないが、別の方法で発現細胞において固有のプロセスに影響を与える。
タンパク質プロセシングまたは代謝に係るタンパク質は、シャペロン（上記のシャペロンの定義参照）、タンパク質イソメラーゼ、糖付加酵素（例えば、シアリルもしくはグリコシルトランスフェラーゼ）またはホスファターゼなどの酵素である場合が多いか、または細胞のエネルギーレベルもしくはミトコンドリア機能を制御する。
表Ａに、副題「タンパク質プロセシングおよび代謝に係るタンパク質」の下に、発現（ｅｘｐ）したか、および／またはその発現が「ノックダウン」（ＫＤ）されたタンパク質のリストを記載する。
ベクターの設計
非ウイルスベクターの中で、宿主ゲノム内の複数の遺伝子座に高頻度でＤＮＡ配列の単一コピーを組込む活性により、トランスポゾンが特に魅力的である。ウイルスベクターと異なり、いくつかのトランスポゾンは、優先的に細胞遺伝子の近くには組込まれないと報告されており、したがって、それらは有害変異を導入しそうにない。さらに、トランスポゾンは容易に生成および操作でき、一般に、逆位反復配列が隣接するカーゴＤＮＡを含むトランスポゾンドナープラスミドおよびトランスポゼース発現ヘルパープラスミドまたはｍＲＮＡを含む。いくつかのトランスポゾンシステムは、内因性トランスポゾンコピーに干渉することなく、様々な細胞株においてＤＮＡを動員するように開発された。例えば、ピギーバック（ＰＢ）トランスポゾンは、最初にキャベツルーパー蛾から単離され、様々な哺乳類細胞に効率的にカーゴＤＮＡを転移させる。
プラスミドベクター上の導入遺伝子近くに配置された場合、エピジェネティック調節エレメントを用いて、不必要なエピジェネティック効果からカーゴＤＮＡを保護することができる。例えば、マトリックス結合領域（ＭＡＲ）と呼ばれるエレメントは、有力なヒトＭＡＲ１−６８によって例示されるように、カーゴＤＮＡのゲノム組込みおよび転写を増加させるが、ヘテロクロマチンサイレンシングを阻止すると考えられていた。マトリックス結合領域は、インスレーターとしても作用し、それによって、隣接する細胞遺伝子の活性化を阻止することができる。したがって、ＭＡＲエレメントは、プラスミドまたはウイルスベクターの文脈において高発現および持続発現を媒介するために用いられてきた。
本明細書に示すとおり、正しいベクター設計により、エピジェネティック調節因子、特にＭＡＲエレメントの好ましい性質を、トランスポゾンベクターの好ましい性質と組合せてもよい。
トランスポゾンおよび本発明のトランスポゾンベースのベクターを、細胞代謝エンジニアリングで用いて、例えば、本明細書に記載の異なる分泌経路の分泌タンパク質を発現させることができる。これらはまた、複数ラウンドのカーゴＤＮＡ導入を必要とする場合に、特に有用である。このことは、細胞の分泌経路の複数のタンパク質を試験したときに確かめられた。ここで該分泌経路は、複数のベクターのトランスフェクションおよび／または複数の連続的なトランスフェクションサイクルが利用できる抗生物質または他の選択法を使い尽くし得る細胞の分泌経路である。例えば、複数の治療タンパク質候補をスクリーニング目的のために発現させなければならない場合に、トランスフェクション後２〜３週間で大量のタンパク質を非選別細胞集団から取得することができるので、抗生物質選択を必要とせずに治療タンパク質を早急に発現させる能力も特に興味深い。したがって、特に、ＭＡＲ含有トランスポゾンベクターは、現在利用可能な発現ベクターの蓄積への有望な追加物となる。
選択される実験的アプローチは、（抗生物質に基づいたアッセイに依存するアプローチとは対照的に）（１）カーゴＤＮＡコピー数に基づく効果と（２）カーゴＤＮＡ発現レベルに基づく効果との区別を可能にした。
ＭＡＲ１−６８は、ピギーバックトランスポゾンのＩＴＲ間の中心に置かれた場合、転移効率を減少させなかったので特に効果的であった。ＭＡＲ Ｘ−２９も転移効率または発現減少させることなくトランスポゾンの端で十分に機能した。
興味深いことに、転移させる遺伝子のＭＡＲ媒介性活性化の程度は、自然なプラスミド組込みの程度と比較した場合に減少した。さらに、例えば、導入遺伝子のコピーを基準に正規化したときの発現レベルは、トランスポゼースの非存在下で、自然なプラスミド組込みから得られるレベルよりもトランスポゾンから得られるレベルの方が高かった。この効果は、構築物のサイズ、ＭＡＲの存在またはプロモーターの長さに関係なく観察された。これは、例えば、オープンクロマチン構造がトランスポゼースおよび転写因子の両方に接近しやすい可能性があるので、発現が比較的許容されるゲノムの遺伝子座で転移が生じることが多い場合に期待される。この点において、以前の研究では、サイレンシングのより低い傾向により、トランスポゾンが遺伝子のイントロン内、プロモーター、またはゲノム遺伝子座に優先的に組込まれ得ることが示唆されたが、このことは議論の対象となってきた。もう１つ方法として、自然の組込みイベントによって生じるような同じ遺伝子座における多くのプラスミドコピーの同時組込みは、ＭＡＲが対抗するヘテロクロマチンの形成および反復配列のサイレンシングをもたらすことができるが、単一コピーのトランスポゾン組込みは、このようなクロマチン媒介性サイレンシングを受けにくい場合がある。さらに、複数の独立したゲノム遺伝子座におけるトランスポゾンの組込みは、少なくとも１つのコピーが好ましいゲノム環境中に入り、発現する可能性があるが、プラスミド組込みは主にたった１つのゲノム遺伝子座で生じることが判明した。
強力なプロモーターと結合させた場合に、カーゴＤＮＡ、例えば、導入遺伝子／ＴＥＲあたりの最高発現レベルがＭＡＲ含有トランスポゾンから得られた。驚くべきことに、高発現レベルが、例えば、２０、１５、１０、または５以下のいくつかの転移したカーゴＤＮＡコピーから得られることが明らかになった。例えば、ほとんど組込まれていない場合で、それにもかかわらず、高い生産性が得られる場合に、導入遺伝子の１つまたはそのサブセットにおける点変異の発生確率を減少させ、自然変異原性イベントから誘発されるので、カーゴＤＮＡコピーが都合がよい。さらに、トランスポゾン媒介性組込みイベントは、ＤＮＡ修復および自然プラスミド組込みに関与する組込み機構よりも変異原性が低く、不完全なまたは再構成された導入遺伝子コピーをもたらし得る。
標的細胞の量が制限される場合に、例えば、細胞ベースの治療または再生医療のためのクローン集団を作製するために、例えば、初代幹細胞への治療遺伝子の非ウイルス性転移にとって、ピギーバック（ＰＢ）トランスポゾンによる高効率ゲノム組込みも好ましい。これに関連して、抗生物質耐性遺伝子の使用および／または信頼できない、例えば、導入遺伝子発現が安全上の懸念を提起し得るので、いくつかの転移したカーゴＤＮＡコピーからの生理的発現レベルおよび転移イベントの続発、ひいては抗生物質選別の必要性の除去は都合がよい。
転移効率に対するＭＡＲ介在物の影響
抗生物質耐性は必ずしも効率的に導入遺伝子発現を反映しないので、強力なＧＡＰＤＨ細胞プロモーター誘導体から発現する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を指標として用いた。ＭＡＲエレメントのＰＢトランスポゾンへの付加が転移効率および導入遺伝子発現に影響し得るか否かを試験するために、かつ構築物中のＭＡＲの位置がこれらの効果に影響するか否かを評価するために、一連のトランスポゾンドナー構築物をＧＦＰおよびピューロマイシン耐性（Ｐｕｒｏ）遺伝子を含有するように設計し、ＭＡＲ１−６８または対照の中性スペーサーＤＮＡ配列をプラスミドの異なる位置に挿入した（図１）。挿入していない親のＰｕｒｏ−ＧＦＰトランスポゾンプラスミドを転移の対象として用いて、ＭＡＲの効果またはスペーサー配列付加に比べて増加したトランスポゾンサイズの影響を区別した。
トランスポゼースの存在下で、予想されたとおり、ＭＡＲが中心部に位置する場合に、非選別細胞から最高レベルのＧＦＰ発現が観察されたが、ＭＡＲがＧＦＰコード配列の下流側に位置する場合には発現は観察されず、また転移した配列の外側に挿入された場合にも観察されなかった（図３Ａ）。ピューロマイシン選択剤の存在下で、ＭＡＲに媒介される活性化はトランスポゼースの有無に関わらず低下したが、ＧＦＰ発現の平均値は１桁増加した（図３Ｂ）。このことから、上記の転移イベントの定量試験から提案されるように、ピューロマイシン選択により最高発現レベルを示す少数の細胞のみが生じることが確証された。さらに、中央にＭＡＲが位置する転移性ベクターは、トランスポゼースなしでトランスフェクトされたそれらのプラスミドの対応物と比較した場合に、同様の発現レベルをもたらすことが示された。
組込まれたトランスポゾンのコピー数に対するＭＡＲ含有物の影響
導入遺伝子の転写の増加および／またはより多い導入遺伝子コピーの組込みにより、より高いＧＦＰ蛍光レベルが得られ得る。これを、様々な種類のベクターに由来するゲノム組込み導入遺伝子の数を定量することによって評価した。非選別集団からの蛍光細胞の細胞蛍光測定選別後またはピューロマイシン耐性についての選別後のいずれかに、全ゲノムＤＮＡをプールした細胞集団から単離した。細胞β２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子に対する導入遺伝子のコピー数を、ＧＦＰコード配列の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）解析によって決定した。抗生物質選択剤の非存在下における、トランスポゼースまたは細胞組換え酵素のいずれかによって組込まれた導入遺伝子の平均数は同等であり、ゲノムあたり約１〜６コピーであり、ＭＡＲまたは対照配列によって著しい影響は受けなかった（図４Ａ）。しかし、ＭＡＲがトランスポゾンの端に含まれる場合に、最低コピー数が得られ、この位置においてＭＡＲは転移を減少させるという本発明者らの以前の結論を支持する。ピューロマイシンを用いた高発現細胞の選別後に、転移した導入遺伝子の数は同様に２〜７コピーの範囲であった（図４Ｂ）。しかし、トランスポゼースの非存在下で組込まれた導入遺伝子のコピー数は、一般に非常に高く、６〜１４コピーに及んだ。これは、自然発生的な組込みが通常、単一ゲノム遺伝子座において複数のプラスミドコピーのコンカテマーの組込みをもたらすとう事実（結果は示しめしていない）、ならびに、サイレンシング効果に供した細胞を抗生物質選別によって除去した場合に、より高い導入遺伝子コピー数がより高い発現レベルをもたらすはずであるという事実によって容易に説明できる。抗生物質選別によって優先的に高発現細胞が得られるという以前の結論と合わせて、これは、自然発生的なプラスミド組込みが転移性ベクターよりも様々な数の導入遺伝子コピーをもたらすことも示した。
次いで、遺伝子コピー数を基準にＧＦＰ発現を正規化し、ゲノム内に組込まれる傾向とは独立したベクター固有の発現可能性を評価した。全体的に、導入遺伝子コピーあたりのより低い発現が、非選別細胞から、またはトランスポゼースもしくは中央に位置するＭＡＲの非存在下でトランスフェクトした抗生物質選別細胞から得られたことは、導入遺伝子発現がエピジェネティック調節エレメントの包含および導入遺伝子組込み方法の両方によって影響されることを示す（図５）。様々なベクターおよびエレメントの組合せから評価した場合、遺伝子コピーあたりの発現は、一般に、トランスポゼースによって増加し、このことは、抗生物質選別の有無に関わらず観察された。導入遺伝子コピーあたりの最高レベルの発現が、中央に位置するＭＡＲエレメントを含むトランスポゾンベクターを用いて、トランスポゼースの存在下で作製した細胞から抗生物質選別後に得られた。発現の絶対レベルについて先に述べたように、ＧＦＰコード配列のすぐ下流側にＭＡＲを含めても導入遺伝子発現を著しく増加させなかった。
最後に、発現に対するＭＡＲ１−６８の好ましい効果が本明細書で用いた強力なヒトＧＡＰＤＨプロモーターに特異的であり得るか否か、または他のプロモーターでも生じるか否かを評価した。したがって、本発明者らは、ヒトＧＡＰＤＨプロモーター駆動ＧＦＰ発現をより弱いシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーターに置換した。より弱いプロモーターを使用すると、同程度の数のＧＦＰ陽性細胞および組込まれた導入遺伝子が得られることは、転移効率が導入遺伝子発現によって変化しないことを示す（結果を示さず。図２Ａおよび図４Ｂ）。しかし、ＳＶ４０プロモーターを用いると、絶対レベルの発現はより低かった（図示せず対図３Ｂ）。さらに、トランスポゾンコピー数を基準に正規化した発現は、ＭＡＲの非存在下でＳＶ４０プロモーターを使用することによって４．６倍減少し、ＭＡＲ１−６８を用いると３．１倍減少した（結果は図示せず）。このことは、トランスポゼースが存在する時でさえ、ＭＡＲが完全ではないが部分的に、より弱いプロモーターの使用による発現の減少を防ぐことができることを示す。全体的に、いくつかの組込まれたコピーはトランスポゾンからの高い導入遺伝子発現を得るのに十分であること、かつこの文脈において、ＭＡＲ−６８が強力なプロモーターの上流側に位置する場合、導入遺伝子あたりの最高発現が得られることを示すことができた。
ＣＨＯ−Ｍ細胞を、単一導入遺伝子ＭＡＲ Ｘ＿２９含有転移性ベクターで１回または２回電気穿孔した。転移効率は電気穿孔後に最高であった（細胞の３０％〜４５％が安定発現を示した）。しかし、導入遺伝子発現レベルは化学的トランスフェクションと同等であり、これはより低い陽性細胞を示し、これによりより低い転移効率を示した。図７は、ＭＡＲ Ｘ＿２９の上流側に挿入される治療免疫グロブリンの軽鎖および重鎖を用いた結果を示し、１〜８μｇ／ｍｌの範囲の抗体価が得られた。レベルは、発現細胞を選別することによって２３〜５５μｇ／ｍｌまでさらに増加した（図７Ｃ）。
導入遺伝子の発現はまた、多くの場合、特定のベクター設計によるトランスポゾンの使用とは無関係に、特に、特定の位置における特定のＭＡＲエレメント（複数可）の使用によって、好ましくはそれらのＭＡＲエレメント（複数可）とプロモーター、エンハンサーまたはその融合体の組合せの使用により、導入遺伝子と比較して実質的に増加させることもできる。
それぞれのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＭＡＲを含んでもよい。例えば、ベクターは、例えば、上流側のＭＡＲ（１つもしくは複数）および下流のＭＡＲ（１つもしくは複数）、例えば、導入遺伝子発現カセットの上流側に位置付けられた１つのＭＡＲおよび下流側に位置付けられた１つのＭＡＲを含んでもよい（図１８Ａ、図１８Ｂ、図１９）。該ベクターは、ＳＶ４０プロモーターの制御下に組込まれたピューロマイシン耐性遺伝子を含んでもよい。導入遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子エンハンサーに結合されたヒトＧＡＰＤＨプロモーター（特に、上記のＣＧＡＰＤ融合プロモーター）の制御下にあってもよい。
ＦＡＣＳ解析によりＧＦＰ蛍光について評価したときに、高いおよび非常に高い生産細胞の最高の百分率（％ Ｍ３／Ｍ２）および最小の変異性が、１＿６Ｒ２、１＿６８Ｒ２およびＸ＿２９Ｒ３を上流ＭＡＲとして用いて、得ることができた（８０％を超える、８０％以上）。したがって、高いおよび非常に高い生産細胞の、７０％を超える、７５％を超える、または８０％超える百分率（％ Ｍ３／Ｍ２）は十分に本発明の範囲内である。当業者が理解するとおり、これらのＭＡＲの特定配列からのある程度の逸脱は容認できる。したがって、配列番号６、７、８、９および１０と８０％、８５％、９０％、９５％を超える配列同一性を有する核酸配列を含有するベクターは本発明の範囲内である（図１８Ａ、図１８Ｂ）。
バイオリアクター中の、かつ／または選択圧の非存在下での発現の喪失は、目的のタンパク質の回収を制限する場合が多い。上流ＭＡＲとして１＿６８Ｒ２、１＿６Ｒ２およびＸ＿２９Ｒ３ ＭＡＲ誘導体を含有するベクターを選択剤の非存在下、５週間にわたる培養で試験し、この期間ＧＦＰ蛍光を毎週評価した。Ｍ３亜集団の百分率を考慮すると、少なくとも１つの上流ＭＡＲおよび少なくとも１つの下流ＭＡＲの２つを有するベクターにおいて、上流ＭＡＲとして１＿６Ｒ２エレメントおよび下流ＭＡＲとして再構成していないＭＡＲ１−６８が試験した最高の組合せである（２、３、４週を過ぎた後８０％を十分に超える）ことが判明した（図１９を参照されたい）。
同様に設計されたベクターはまた、上流ＭＡＲを含めず、例えば、すぐ下流側のＭＡＲ（１つまたは複数）、例えば、導入遺伝子発現カセットの下流に位置付けられた１つのＭＡＲを含んでもよい（図２０Ａ、図２０Ｂ、図２１および図２２）。この場合、ベクターはまた、ＳＶ４０プロモーターの制御下に組込まれたピューロマイシン耐性遺伝子を含んでもよい。導入遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子エンハンサーに結合されたヒトＧＡＰＤＨプロモーターの制御下にあってもよい。例えば、配列番号１１および８０％、８５％、９０％または９５％を超える配列同一性を有する他のものを参照されたい。ＭＡＲとしてＸ＿２９を有するこのような単一ＭＡＲ群においてすばらしい結果が得られた。ＧＦＰ高発現細胞の百分率（上記のように決定した）および経時的な発現安定性（上記のように決定した）も、例えば、ＭＡＲが導入遺伝子発現カセットに隣接する高性能ベクター、すなわち、上流にＭＡＲ １＿６Ｒ２を、下流に再構成していないＭＡＲ１−６８を含むベクターのそれよりも良好であった（図２２を参照されたい）。この知見は、ＭＡＲが導入遺伝子に隣接する場合に最も効率的であるという十分に確立された仮説と対比する（米国特許第５，７３１，１７８号を参照されたい）。発現の安定性は、特定の期間後、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４週を超えた後でも匹敵する速度（２０％以下、１０％または５％未満）で目的ののＤＮＡ、例えば、導入遺伝子を細胞集団が発現し、発現開始の２週間までは特にさらに高いことを意味する。安定発現は、高い百分率（例えば、８０％を超える）または高発現の細胞亜集団と関係する場合が多い。
細胞代謝エンジニアリング：分泌タンパク質
ＩｇＧなどの異種タンパク質の分泌は、ＣＨＯ細胞などの培養細胞における不適切なポリペプチドプロセシングおよび低いＩｇＧ産生によって縮小される。ＢｉＰのようなストレス誘導性シャペロンの発現が誘導され、かつこのシャペロンが正しくＥＲに局在して、ＩｇＧ前駆鎖と相互作用できることが観察された。しかし、それにもかかわらず、インフリキシマブで見られるものなどの特定の可変配列を含有するＩｇＧは正しくプロセシングおよびアセンブルされず、不十分な分泌をもたらす。したがって、これらの細胞におけるＵＰＲ応答の活性化は、著しいレベルの免疫グロブリンの修復に依然として効果がない。
ＳＲＰ１４は、外因性タンパク質を過剰発現するＣＨＯ細胞において制限されている分泌経路の分子ステップに関与することが示された。興味深いことに、この律速段階はまた、容易に高発現クローンをもたらす発現が容易なトラスツズマブについても生じる。この結論に続き、ヒトＳＲＰ１４の発現がＬＰクローンの発現を容易に回復させるが、易発現ＩｇＧの分泌も増加させたという知見が得られた。ＳＲＰ１４発現は、ＬＣおよびＨＣ前駆体のプロセシングならびに利用能を増強させ、両方の種類のＩｇＧについて同レベルの分泌をもたらすことが明らかになった。全体的に、ＳＲＰ１４が一般に、ＩｇＧなどの分泌タンパク質をＣＨＯ細胞で過剰発現させる場合に制限され得ることが示された。
本研究で観察されるようなＣＨＯ細胞におけるＳＲＰ１４の発現から得られる強力な効果は予想外で、ＳＲＰ１４が生成困難なＩｇＧ生産クローンにおいてＬＣ伸長の遅延の延長を引き起こすことが示唆された（図１２Ｂ、ポイント１）。
従来の研究では、翻訳リボソームから現れるシグナルペプチドは最初にＳＲＰ粒子のＳＲＰ５４サブユニットと相互作用し、ＳＲＰ９とＳＲＰ１４との結合が新生ポリペプチドのさらなる伸長を阻止して、翻訳停止をもたらし得ることが示された（Ｗａｌｔｅｒ ａｎｄ Ｂｌｏｂｅｌ １９８１）。第２のステップにおいて、リボソーム−新生ポリペプチド−ＳＲＰ複合体がＳＲ受容体との相互作用を介してＥＲ膜にドッキングする（Ｇｉｌｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８２；Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２）。その後、ＳＲは、リボソーム−新生ポリペプチド複合体からのＳＲＰの放出およびリボソームの出口部位とトランスロコンチャネルの結合を調整し得、これを通して、成長している新生ポリペプチドがＥＲに入る（Ｌａｋｋａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．，２００８）。その後、翻訳と連動した移行が再開され、シグナルペプチドの除去ならびに正しくプロセシングおよぶ分泌されたポリペプチドの合成をもたらし得る。
新生ペプチドの好ましくない構造により、ＩｇＧ可変ドメインおよびシグナルペプチド配列の特定の組合せに対してＥＲ上へのドッキングの動態が遅くなり得る場合、難発現ＩｇＧの正しいプロセシングは、通常長い翻訳休止を必要とする可能性がある。したがって、順に、正しいＥＲドッキングおよびｐｒｅ−ＬＣの移行を向上させ、したがって、シグナルペプチドの効率的なプロセシングを回復させるように、外因性ヒトＳＲＰ１４成分の発現による翻訳停止動態の調節が考えられた（図１２Ｂ、ポイント２）。一貫して、ヒト細胞におけるＳＲＰ１４レベルが低下するとポリソームにおける翻訳伸長遅延が欠如し、臨界長を越える新生ポリペプチドの過剰発現が生じ得、その後、ＳＲＰは、ＥＲに分泌されるタンパク質を適切に標的にし得ない。したがって、ＣＨＯ細胞のＳＲＰ１４、およびおそらくＳＲＰ５４も異種ヒトインフリキシマブタンパク質のシグナル配列に対する親和性を低下させ、不正確なＥＲドッキングおよび／または正しいドッキングが生じる前の新生ペプチドの伸長がもたらされるだろう。これはヒトＳＲＰ１４の過剰発現によって補正され、ＥＲゲートで生じる過剰発現したＩｇＧタンパク質の「分子混雑（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｊａｍ）」にも関わらず、停止したリボソーム−ＳＲＰ複合体がＥＲ上の適切に編成されたドッキング部位を探索できる期間が延長される。
一貫して、移行に関するＥＲ能力を増加させ得るＳＲおよびトランスロコンの過剰発現はまた、ヒトＳＲＰ１４が過剰発現していなくても分泌を向上させる。最後に、ヒトＳＲＰ、トランスロコンおよびＳＲサブユニットの組合せの共発現によって、分泌経路の代謝エンジニアリングが、タンパク質分泌細胞能のさらなる向上をもたらし、さらにより高い分泌レベルを生じさせることが示された。まとめると、ＳＲＰタンパク質、その受容体およびトランスロコンは、一般的にヒト免疫グロブリンなどの分泌タンパク質がＣＨＯ細胞によって過剰発現する時に制限され得ると結論付けられた。
分泌タンパク質および異なる細胞型におけるリボソームと比較して、ＳＲＰおよびＥＲ膜成分の存在量についてはほとんど知られていないが、おそらく、移行の欠陥は大量の組換えタンパク質を発現する細胞で生じ得る。例えば、ＳＲおよび／またはトランスロコンは、分泌タンパク質が異常な高レベルで発現するか、またはＳＲＰ１４がＣＨＯ細胞で他のＳＲＰサブユニットと比較してサブ化学量論的なレベルで生じる場合に制限されるようになる可能性がある。一貫して、ＳＲＰ９およびＳＲＰ１４は、霊長類細胞内で他のＳＲＰタンパク質よりも２０倍過剰に存在し、しかし、マウス細胞では過剰に存在することはなく、正常ヒト細胞におけるヒトＳＲＰ１４の過剰発現はアルカリホスファターゼの分泌効率を増加させなかった。さらに、ヒトＳＲＰ１４は、そのＣ末端にげっ歯類ＳＲＰ１４に見られないアラニンに富む尾部を含むので、そのげっ歯類対応物よりも長い。したがって、ＣＨＯ ＳＲＰにおけるより長いヒトＳＲＰ１４の組込みは、ドミナントポジティブ効果においてより高い活性を有する機能性ＳＲＰキメラの形成をもたらし得る。
ＳＲＰ１４などの細胞質ＳＲＰ成分の発現は、ＣＨＯ細胞内で過剰発現したタンパク質の効率的なプロセシングおよび分泌をもたらす、という知見は、組換えタンパク質収率を向上させるために用いることができるボトルネックを指摘する。このボトルネックは、組換え治療タンパク質の圧倒的に最も豊富なクラスを構成する別個の関連のないＩｇＧの発現を制限し、ならびに、おそらく多数の組換え治療タンパク質のうちずばぬけて最も豊富なクラスを構成する他のモノクローナル抗体および誘導体の発現も制限する。
分泌中間体および可能性のある細胞ストレス反応を分析し、その後にこのようなストレス反応を引き起こす上流の制限活性を系統的に探索し、ＣＨＯ細胞分泌代謝のエンジニアリングによって試験を終了することで、これらの細胞の代謝制限およびそれらをどのように対処するかについてより良い理解が得られてきた。
ＳＲＰ１４の異種発現は分泌およびＬＣプロセシングを回復させる
ＩｇＧのＨＰ（高産生）およびＬＰ（低産生）クローンを、ＳＲＰのＳＲＰ１４成分をコードするベクターおよびネオマイシン耐性プラスミドでコトランスフェクトした。ネオマイシン耐性プール中の個々の細胞を限界希釈法によって分離し、その後、振盪培養皿のバッチ内での成長および免疫グロブリン分泌について試験した。ＳＲＰ１４を発現するＬＰ由来サブクローンは、培養の間中、それらの親対応物よりも著しく多量の抗体を分泌し、ＨＰ ＳＲＰ１４−発現サブクローンとして同様の免疫グロブリン抗体価をもたらした（図８Ａおよび８Ｂ、左のパネル）。
ＳＲＰ１４の発現は、細胞生存率に影響を与えないが、ＨＰ細胞培養物の成長を遅くさせ、同様の細胞密度まで延長するように思われた（図８Ａおよび８Ｂ、右のパネル）。様々なサブクローンの培養上清を収集し、抗体濃度について分析した。図８Ｃに示すとおり、ＳＲＰ１４発現は、ＬＰ細胞からの分泌を増強し、ＩｇＧの比生産性を７倍増加させた。さらに、ＳＲＰ１４の外因性発現はまた、ＨＰサブクローンからのＩｇＧ分泌を向上させ、比生産性を３０％増加させた。興味深いことに、ＳＲＰ１４を発現する個々のサブクローンは、実質的に同一の平均速度で難発現ＩｇＧおよび易発現ＩｇＧを分泌し、比生産性の中央値は、細胞あたりおよび１日あたりで３０ピコグラム（ｐｃｄ）を超えた。これらの非常に高いＩＧ分泌レベルは６ヶ月を越える培養の間維持され、ＳＲＰ１４発現細胞の安定した特性であることが示された。
ＳＲＰ１４発現とＩｇＧ産生性との間の関係をさらに調べるために、５つの個別のＳＲＰ１４発現ＬＰサブクローンのＳＲＰ１４ ｍＲＮＡレベルを相対定量ＰＣＲによって分析した。図８Ｄに示すとおり、サブクローンは、内因性ＣＨＯ細胞のＳＲＰ１４ ｍＲＮＡのレベルに対して５０〜約２００倍の範囲のレベルでＳＲＰ１４を過剰発現した。これと同時に、ＬＰ対照細胞クローンと比較して４〜６倍増強したＩｇＧ分泌が生じた。興味深いことに、最高の比生産性が、中間レベルでＳＲＰ１４を過剰発現するサブクローンから得られ、ＣＨＯ細胞の内因性ＳＲＰ１４ ｍＲＮＡに対して約１００倍であった（ＳＲＰ１４−ＬＰサブクローンＥ、示さず）。これは、内因性発現レベルを１００倍上回る増加に相当するＳＲＰ１４の閾値レベルまでのＳＲＰ１４過剰発現レベルおよびＩｇＧ比生産性の相互依存関係を示す。これにより、順に、分泌経路の他の成分がＳＲＰ１４を非常に高いレベルで制限するようになり得ること、かつこの経路の構成成分のバランスのとれた発現が最適なＩｇＧ発現に必要であり得ることが示唆された。
クローン細胞株の評価中に得られた比生産性の増加が生産工程に適用できるか否かを試験するために、最良のＨＰおよびＬＰ ＳＲＰ１４発現サブクローンを流加条件下で、振盪培養皿の中で試験した（すなわち、図８のＬＰサブクローンＥおよびＨＰサブクローンＢ）。ＳＲＰ１４発現ＬＰサブクローンは、同様に、ＳＲＰ１４発現ＨＰサブクローンよりも高い生存細胞数および免疫グロブリン抗体価を生じ、それらは生産工程の終了時には最大８×１０６細胞／ｍｌおよび１Ｌあたり２ｇを超えていた（図９Ａおよび図９Ｂ）。
次に、これらの２つのサブクローンの免疫グロブリン合成に対するＳＲＰ１４過剰発現の影響を試験した。これにより、ＬＰ由来のサブクローンにおけるヒトＳＲＰ１４の発現が、折りたたみおよびＩｇＧアセンブリのための正常にプロセシングされて成熟したＬＣ構成成分をもたらしたことが明らかになった（図１０Ａ、ＬＰＳの列 対 −の列）。遊離ＨＣの移動が影響されなかったことは、ＳＲＰ１４発現が、難発現タンパク質の誤ってプロセシングされたＬＣに特異的に作用したことを示した。驚くべきことに、ＳＲＰ１４発現は、トリトンＸ−不溶性画分中で凝集したＬＣの蓄積を完全に無くした（図９Ａ、下のパネル）。対照ＧＦＰタンパク質の発現は、タンパク質溶解性も向上させず、ＬＣの適切なプロセシングも回復しなかった（図１０Ａ、ＬＰ細胞についてのＧの列）。ＳＲＰ１４の発現は、ＨＰサブクローンから得られたＨＣおよびＬＣの移動パターンに影響を与えず、かつ対照と比較して、遊離鎖および完全にアセンブルしたＩｇＧの量に対する効果もほとんど観察されなかった（図１０Ａ、ＨＰ細胞についてのＧの列）。
シクロヘキシミドベースの追跡アッセイを行い、ＳＲＰ１４を発現するインフリキシマブ生産サブクローンにおけるＩｇＧの折りたたみおよびアセンブリ動態ならびにＩｇＧ凝集体の運命を調べた。ＩｇＧアセンブリ能を有さないＬＣの凝集を示す親ＬＰ細胞と対照的に、ＳＲＰ１４発現ＬＰサブクローンは、もはやＴｘ−１００不溶性ＬＣを蓄積しなかった（図９Ｂ、下のパネル）。しかし、ＨＰ細胞についても記載したとおり、遊離ＬＣは遊離ＨＣと比較して少量にとどまったことは、遊離ＬＣがＨＣ−ＬＣ二量体および成熟ＩｇＧ中にすばやく取り込まれることを示し、かつＩｇＧアセンブリを制限している可能性があることを示す（図９Ａおよび９Ｂ）。まとめると、これらの結果は、ＳＲＰ１４がＬＰ細胞によってＬＣプロセシングにおいて重要な役割を果たし得ることを示唆し、かつ追加のＳＲＰタンパク質発現は、難発現ＩｇＧおよび易発現ＩｇＧの分泌を同等レベルまで向上させることができることを示唆した。
ＥＲ移行のエンジニアリングは組換えＩｇＧ分泌を向上させる
異種ＳＲＰ１４の過剰発現が所定の閾値までＩｇＧ分泌を増加させたことを考慮すると、ＳＲＰ１４と直接的または間接的に相互作用する分泌経路の他の構成成分が、ＳＲＰ１４−ＬＰサブクローンにおける制限になり得ると考えるのは妥当であった。したがって、本発明者らは、分泌経路の他の構成成分の過剰発現が、単独でまたはＳＲＰ１４との組合せのいずれかで、ＩｇＧ発現も改善し得るか否かを調べた。これらには、ＳＲＰ１４、ＳＲＰ受容体（ＳＲ）のサブユニットならびにトランスロコンのＳｅｃ６１α、βおよびγサブユニットと共にＳＲＰ複合体を構成するヒトＳＲＰ９およびＳＲＰ５４タンパク質が含まれる。
第１の実験セットにおいて、最高性能ＬＰクローン、すなわち、図１のＬＰクローンＥを、ＳＲＰタンパク質またはトランスロコンタンパク質をコードする発現ベクターを単独または組合せて用いて、トランスフェクトした。次いで、得られたＬＰポリクローナル細胞プールについて、回分培養におけるＩｇＧ産生を評価した。ＳＲＰ構成成分またはトランスロコンタンパク質の発現は、これらの再トランスフェクトしたＬＰポリクローナル細胞プールからの免疫グロブリン分泌を増加させた（図１１Ａ、およびデータ示さず）。ＳＲＰ１４発現単独と比較して、ＳＲＰタンパク質の組合せの過剰発現またはトランスロコンの過剰発現が、トランスフェクトしたＬＰポリクローナル細胞プールの比生産性をさらに２０％〜４０％向上させた（図１１Ａ、中央値の比較）。これらの結果は、インフリキシマブ分泌を回復させるのに、３つのＳＲＰポリペプチドおよびその受容体（ＳＲ）の発現、またはＳＲおよびトランスロコンの過剰発現からなるものなどの特定の組合せが、ＳＲＰ１４発現単独よりも有力であることをはっきり示した。
ＳＲＰ１４発現ＬＰサブクローンＥが、ＳＲおよび／またはトランスロコンの組合せの発現によってさらに最適化できるか否かも評価した。ＳＲＰ１４−ＬＰサブクローンＥの３０ｐｃｄと比較して、ＳＲタンパク質およびトランスロコンでトランスフェクトした後に選抜したポリクローナル細胞プールから、難発現免疫グロブリンについて６０ｐｃｄを上回る比生産性が得られた（図１０Ｂ）。ＳＲタンパク質およびトランスロコン発現ベクターが、ＳＲＰ１４−ＬＰクローンＥと比較して比生産性が増加したクローンを作製することに使用でき、かつ一連の連続したトランスフェクションおよび選択サイクルに基づくアプローチが十分に適用され得ると結論付けられた。
細胞代謝エンジニアリング：組換え経路ならびにＴＥＰおよびＴＥＰ機能性ＲＮＡの発現のノックダウン
組換えに影響を与えるために、重要なＤＮＡ組換え遺伝子をサイレンシングできる。ノックダウンの標的は、文献から哺乳類における特定の組換え修復経路に不可欠であると知られる遺伝子である（表Ｄ）。これらの遺伝子のほとんどが細胞の生存および発達に必要であるので、これらの永久的なサイレンシングが細胞生存率を低下させた。したがって、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を一過的に用いるこれらの標的遺伝子のサイレンシングが好ましい。
ＮＨＥＪ、すなわち、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０およびＤＮＡ−ＰＫｃｓの第１のステップに関与する因子に対するｓｉＲＮＡの混合物（タンパク質あたり１つのｓｉＲＮＡ２重鎖）で処理した細胞において、ＮＨＥＪイベントの頻度は、未処理の細胞よりも著しく低かった。代わりに、ＨＲはこれらの細胞においてより効率的であり、ＨＲに対するＮＨＥＪの比が低下した（２．７：１〜１．３：１）。逆に、重要なＨＲ因子のＲａｄ５１を標的化するｓｉＲＮＡで処理した細胞において、ＨＲ依存性ＧＦＰ再構成は、ほとんど完全に無くなり、ＮＨＥＪ：ＨＲの比が５：１まで増加した。これらの結果は、ＨＲおよびＮＨＥＪリポーターアッセイが染色体外の形で用いられるのに十分な感度があることを示すように思われる。さらに、これらの結果はまた、以前に使用されたＣＨＯ変異細胞株の信頼性を検証する（特に、５１Ｄ１細胞は、当所、ＨＲ陰性細胞として公表されたが、一見したところ、このアッセイによるとＨＲを実行であるようだ−データ示さず）。
ＭＡＲの存在下でのＧＦＰの発現および組込みの増加。並行実験において、異なる抗ＨＲまたは抗ＮＨＥＪ ｓｉＲＮＡで処理したＣＨＯ細胞を、ＧＦＰまたはＭＡＲ−ＧＦＰ含有プラスミドでトランスフェクトした。抗生物質選抜後２週間の時点で、これらの細胞をＧＦＰの発現および組込みについて、それぞれＦＡＣＳおよびｑＰＣＲによってアッセイした。試験した全条件において、ＭＡＲの付加は、ＭＡＲを含まないプラスミドでトランスフェクトした細胞と比較してＧＦＰ発現を４〜５倍増加させ（図１３、図１４Ａ）、このことは以前の報告と一致する（Ｇｒａｎｄｊｅａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。この増加と同時に、ＭＡＲを含まないベクターを受け取った細胞と比較して、ＭＡＲ−ＧＦＰプラスミドでトランスフェクトした細胞において組込まれたＧＦＰコピー数が約３倍増加した（図１３、図１４Ｂ）。おそらく、（例えば、ユークロマチンに富む領域中の）組込み部位のより好ましい局在化により、遺伝子コピーあたりのＧＦＰ蛍光の平均値も２倍増加した（図１３、図１４Ｃ）。したがって、ＭＡＲエレメントは、遺伝子発現を許容するゲノム遺伝子座に遺伝子を導く能力を有すると仮定できた。抗ＨＲ ｓｉＲＮＡとＭＡＲの組合せ（ｓｉＲＮＡ：ＲＡＤ５１、Ｒａｄ５１ＣおよびＢｒｃａ１）により、ＧＦＰ発現の平均値の変化の割合が１１倍を超え、唯一の抗ＨＲ−ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：Ｒａｄ５１）の変化の割合は９倍を下回った。ｓｉＭＭＥＪ ｓｉＲＮＡとＭＡＲの組合せなどの他の組合せも単一ｓｉＲＮＡと比較して発現を向上させた（結果を示さず）。したがって、同じまたは異なる代謝経路、特に、組換え経路中の標的からの異なるｓｉＲＮＡ（２、３、４、５、６、８、９、１０）の組合せは、本発明の範囲内である。
導入遺伝子の発現および組込みに対するＮＨＥＪ遺伝子ノックダウンの効果はない。ＮＨＥＪタンパク質に対するｓｉＲＮＡでの処理は、導入遺伝子の安定発現に著しい影響を与えないように思われた。未処理細胞と比較したゲノム中のＧＦＰコピー数にも著しい変化はなかった（抗５３ＢＰ１ ｓｉＲＮＡで処理した細胞の場合を除く。ただし、ＭＡＲの非存在下でのみ、おそらく、ＮＨＥＪ経路による組換えとは異なる効果を指摘する）。
ＨＲ因子の非存在下での導入遺伝子の発現および組込みの増加。ＮＨＥＪ因子のノックダウンとは対照的に、ＨＲタンパク質に対するｓｉＲＮＡの存在は、未処理の細胞と比較してＧＦＰの安定発現を著しく増加させる場合が多かった（Ｂｒｃａ２を除く、これについては、著しく低下させるが、やはりＭＡＲの非存在下の時のみ）（図１５Ａ）。ＮＨＥＪ遺伝子のサイレンシングの場合と同様に、ＭＡＲの存在は、安定なＧＦＰの発現および組込みならびに遺伝子コピーあたりの発現を増加させた。しかし、今回は、ＨＲ因子のサイレンシングはこの効果を５〜７倍増強させ（最も印象的なのは、７．４倍高いＧＦＰ発現レベルに達するＲａｄ５１のノックダウンである）（図１５Ａ）、このことは、ＨＲタンパク質が導入遺伝子発現におけるＭＡＲエレメントのプラス効果を相殺することを示す可能性がある。ＭＡＲの非存在下で、ＧＦＰ発現の増加は、ゲノム中のＧＦＰコピー数の増加と相関した（結果は示さず）。驚くべきことに、これは、ＭＡＲの存在下ではそうではなく、ＭＡＲ媒介型のコピー数の増加は、（Ｒａｄ５１Ｄ ｓｉＲＮＡを除く）ＨＲタンパク質ノックダウンによって影響されないことを示した。機能的なＨＲ修復経路が存在しないと、ＭＡＲによって促進される組換えイベントの数は増えないことを示唆するように思われる。代わりに、ＨＲ修復経路は、そのより効率的な発現を可能にするより好ましい遺伝子座へのＭＡＲおよび導入遺伝子の組込みを刺激する可能性がある。この見解はまた、抗ＨＲ ｓｉＲＮＡで処理した細胞中のＭＡＲの存在下での個々のＧＦＰコピーの発現増強によっても支持される（図１４Ｃ）。ゲノム内に組込まれるプラスミドコピー数は、（本明細書で使用したプラスミドＤＮＡ量を有する）対照細胞においてすでにその最大値に達しており、ＭＡＲにとってより有益な条件下でさえさらに増加できないという別の可能性がある。
まとめると、これらの結果は、ＭＡＲ媒介型導入遺伝子組込みのプロセスは、その構成成分のノックダウンが組込みまたは発現に影響しないので、おそらくＮＨＥＪではないだろうが、相同組換えに対抗する経路によって優先的に媒介されることを示唆する。この代替経路は機能的ＨＲ経路の存在下においては活性が低いが、ＨＲが機能しない場合にはより重要になるという仮説をたてることができた。
治療タンパク質の発現を増加させるための抗ＨＲ ｓｈＲＮＡの発現
３つのｓｉＲＮＡ標的Ｒａｄ５１を、ヘアピン構造を形成できるｓｈＲＮＡ配列に変換し、ｓｈＲＮＡコード配列を、ピギーバックトランスポゾンベクターに挿入した。該ピギーバックトランスポゾンベクターは、抗生物質選択遺伝子を欠くものの、ＧＡＰＤＨエンハンサーおよびＣＭＶプロモーター融合物の制御下にあり、これに続いてＭＡＲ Ｘ−２９が制御する。懸濁液に適応したＣＨＯ−Ｍ細胞をトランスポゾンドナープラスミドおよびトランスポゼース発現ベクターで３回トランスフェクトし、その後３０個の個々の細胞クローンを、ＣｌｏｎｅＰｉｘ装置を用いて無作為に採取した。親細胞ならびにｓｈＲＮＡ発現細胞プールおよびクローンプールをＧＦＰ発現プラスミド（すなわちＰｕｒｏ−ＧＦＰ−ＭＡＲ Ｘ＿２９構築物）と再トランスフェクトし、その後に、ＧＦＰ発現細胞のポリクローナルプールのピューロマイシン選択を行った。ＧＦＰ蛍光プロファイルの比較により、親ＣＨＯ−Ｍ細胞と比較して中くらいから強い蛍光を発するより高い割合の細胞（Ｍ２細胞集団）または非常に強い蛍光を発する細胞（Ｍ３細胞集団）が、ｓｈＲＮＡベクターでトランスフェクトした細胞プールから得られたことが示された（図１７Ａ）。
クローン１６およびクローン２６によって示されるとおり、いくつかのｓｈＲＮＡ発現クローンは非常に高いＧＦＰレベルを媒介し、トランスフェクション後１０日目には抗生物質耐性細胞の８０％超が強い蛍光を発するＭ３亜集団中に存在した（図１７Ａおよび１７Ｂ）。高レベルのＧＦＰ蛍光が選択剤の非存在下における培養の３５日後にこれらの２つのクローン中で維持されていた（図１７Ｃ）。対照的に、クローン１７は１０日目に非常に高いレベルのＧＦＰを発現せず、ＧＦＰ発現は不安定であるように思われた（図１７Ｂおよび１７Ｃ）。中間の発現レベルおよび安定性がクローン８およびクローン２２から得られた。これらのクローンを、難発現インフリキシマブ治療抗体の軽鎖および重鎖をコードする発現プラスミドでもトランスフェクトした。前述のとおり、クローン１６およびクローン２６が最高レベルの抗体を産生し、その後にクローン８およびクローン２２が続くが、クローン１７は親ＣＨＯ−Ｍ細胞から取得されるのと同じ０．５〜１ｐｃｄの量の免疫グロブリンを発現させた（図１７Ｄ、およびデータは示さず）。最も著しく低下したＲａｄ５１ｍＲＮＡレベルを示す細胞クローンが、ＧＦＰおよびインフリキシマブ免疫グロブリンの両方を高発現させたが、これにより導入遺伝子発現の増加は組換えタンパク質の発現の低下に起因することが示された（結果は示さず）。
したがって、インフリキシマブなどの分泌される治療用タンパク質のより高く、より安定な産生レベルは、Ｒａｄ５１標的ｓｈＲＮＡを発現する細胞またはＲａｄ５１標的ｓｉＲＮＡなどのｓｉＲＮＡにより一過的にトランスフェクトされた細胞から得ることができる。
材料および方法
プラスミドおよびＤＮＡベクター
ＰＢトランスポゼース発現ベクターｐＣＳ２＋Ｕ５Ｖ５ＰＢＵ３は、アフリカツメガエルのβグロビン遺伝子の５’および３’非翻訳末端領域（ＵＴＲ）によって囲まれたＰＢトランスポゼースコード配列を含む。このプラスミドを以下のように構築した：ｐＢＳＳＫ／ＳＢ１０の３’ＵＴＲ３１７塩基対断片（Ｓ．Ｉｖｉｃｓ博士から快く提供された）をｐＣＳ２＋Ｕ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ペーズリー、英国）に挿入し、ｐＣＳ２＋Ｕ５Ｕ３を得た。ＰＢトランスポゼースコード配列（２０６７塩基対、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＦ５８７６９８）は、ＡＴＧ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ社（Ｍｅｒｚｈａｕｓｅｎ、ドイツ）によって合成してもらい、２つのＵＴＲ間のｐＣＳ２＋Ｕ５Ｕ３骨格にクローニングした。ＰＢ対照ベクターは、変更していないｐＣＳ２＋Ｕ５プラスミドに相当する（図１、左のパネル）。ＡＴＧ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ社（Ｍｅｒｚｈａｕｓｅｎ、ドイツ）によって合成されたＰＢ２３５塩基対３’および３１０塩基対５’逆位末端反復配列（ＩＴＲ）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−プラスミドに導入することによって、この研究で用いる異なるトランスポゾンベクターを作製した（ｐＢＳＫ ＩＴＲ３’−ＩＴＲ５’、図１、右のパネル）。次いで、ｐＲｃ／ＲＳＶプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）のＳＶ４０プロモーターの制御下にあるピューロマイシン耐性遺伝子（Ｐｕｒｏ（登録商標））を２つＩＴＲの間に挿入した。この研究で用いるＭＡＲ １−６８およびＭＡＲ Ｘ−２９エレメント、ピューロマイシン耐性遺伝子ならびにＧＦＰ遺伝子は、前述のとおりである。免疫グロブリン発現ベクターおよびＳＲＰ９、ＳＲＰ１４、ＳＲＰ５４、ＳＲＰＲα、ＳＲＰＲβ、ＳＥＣ６１Ａ１、ＳＥＣ６１ＢおよびＳＥＣ６１Ｇコード配列は、Ｌｅ Ｆｏｕｒｎら（Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，Ｅｐｕｂ ２０１３ Ｆｅｂ １）によって説明されたとおりであった。
ＧＦＰ、免疫グロブリンまたは分泌タンパク質は、コード配列の上流側がヒトＣＭＶエンハンサーおよびヒトＧＡＰＤＨプロモーターで構成され、続いてＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ヒトガストリン転写終結コドンおよびＳＶ４０エンハンサーで構成された真核生物発現カセットを用いて発現させた（Ｌｅ Ｆｏｕｍ ｅｔ ａｌ．，２０１３を参照されたい）。発現カセットおよび／またはＭＡＲエレメントを、標準的なクローニング法を用いて、図１および図の説明中に示すようにＩＴＲ配列間に挿入するか、または細菌ベクター骨格中に挿入した。
細胞培養およびトランスフェクション分析
ＣＨＯ ＤＧ４４細胞株を、ヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ、Ｇｉｂｃｏ社）および１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社）を補充したＤＭＥＭ：Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ社）で培養した。製造業者の取扱説明書に従って、ＰＥＩ（ＪｅｔＰＲＩＭＥ、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ社）を用いてトランスフェクションを行った。滴定実験において細胞を、様々な量（０〜１５００ｎｇの範囲）のＰＢトランスポゼースのｐＤＮＡ源でトランスフェクトし、または細胞を３００ｎｇのＰＢトランスポゼース発現プラスミドと３００ｎｇのトランスポゾンドナープラスミドの最適な比でコトランスフェクトした。トランスフェクション後２日目に、実験に応じて細胞をいくつかのペトリ皿に移した。非選択トランスフェクトＣＨＯ細胞の分析については、抗生物質選択剤の非存在下で３週間細胞を再播種し、蛍光細胞の百分率およびＧＦＰ陽性細胞の蛍光強度を、ＣｙＡｎ ＡＤＰフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用いるＦＡＣＳ解析によって決定した。非選択細胞の遺伝子コピー数の分析については、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩを用いて安定ＧＦＰ陽性ＣＨＯ細胞を選別した。抗生物質耐性コロニー計数アッセイについては、５０，０００個のトランスフェクト細胞を１００ｍｍプレートに播種し、２週間、５μｇ／ｍｌのピューロマイシンで選択した。次いで、耐性コロニーを固定し、７０％ ＥｔＯＨ、０．７％メチレンブルーで１０分間染色し、直径が０．５ｍｍを超えるコロニーを計数した。ＧＦＰ発現研究については、上記のとおりＧＦＰ蛍光ＦＡＣＳ解析の前に細胞を２週間選択した。
ＣＨＯ−Ｍ細胞を、Ｌ−グルタミン（ＰＡＡ社、オーストリア）およびＨＴ栄養補助剤（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を補充したＳＦＭ４ＣＨＯハイクローン社製無血清培地（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）中、懸濁培養で、加湿空気中３７℃、５％ＣＯ２で維持した。トランスポゾンドナープラスミドを、製造業者の推奨する方法従って電気穿孔（Ｎｅｏｎ ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によりこれらの細胞に導入した。以前記載された方法のとおり、回分培養物からの免疫グロブリン分泌の定量を行った（Ｌｅ Ｆｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３を参照されたい）。簡単に説明すると、５０ｍｌのミニバイオリアクターチューブ（ＴＰＰ社、スイス）中の回分培養における免疫グロブリン発現細胞集団を、７日間、５％ＣＯ２加湿インキュベーター中３７℃にて評価した。細胞培養上清中の免疫グロブリン濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。
ｑＰＣＲ遺伝子コピー数アッセイ
製造業者のプロトコールに従って、ＤＮｅａｓｙ組織キット（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いて転移アッセイ後のＣＨＯ安定細胞プールから全ＤＮＡを単離した。ゲノムに組込まれた導入遺伝子のコピー数を、６ｎｇのゲノムＤＮＡを用いて、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社のＳＹＢＲグリーン−ＴａｑポリメラーゼキットおよびＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ ＰＣＲ機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いる定量ｑＰＣＲにより評価した。ＧＦＰ−フォワード：ＡＣＡＴＴＡＴＧＣＣＧＧＡＣＡＡＡＧＣＣおよびＧＦＰ−リバース：ＴＴＧＴＴＴＧＧＴＡＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＡＧＴＴＧプライマーを用いてＧＦＰ遺伝子を定量し、Ｂ２Ｍ−フォワード：ＡＣＣＡＣＴＣＴＧＡＡＧＧＡＧＣＣＣＡおよびＢ２Ｍ−リバース：ＧＧＡＡＧＣＴＣＴＡＴＣＴＧＴＧＴＣＡＡプライマーを用いて、β−２ミクログロブリン遺伝子を増幅した。Ｂ２Ｍプライマーによって作製した増幅産物については、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴソフトウェアを用いて本発明者らのＣＨＯゲノムアセンブリに対するアライメント後に、ＣＨＯハプロイドゲノムあたり１つのヒットが見出された。ＣＨＯは２倍体に近い細胞なので、Ｂ２Ｍはゲノムあたり２コピーで存在すると推定された。前述のとおり、Ｂ２Ｍ参照遺伝子の割合と比較したＧＦＰ標的遺伝子コピー数の割合を計算した。
免疫グロブリン発現細胞の選別およびアッセイ
ＩｇＧ発現細胞を磁気選別するため、トランスフェクトされたＣＨＯ−Ｍ細胞を、８ｍＭのＬ−グルタミンおよび１×ＨＴ栄養補助剤（共にＧｉｂｃｏ社から）を補充し、完全培地とも称されるＳＦＭ４ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）中、１ｍｌあたり３×１０５細胞の細胞密度で播種した。培養４日後に、２×１０６細胞を洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、事前に洗浄した３０μｌのＭｙＯｎｅ Ｔ１ストレプトアビジンコーティングダイナビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と共に、３μｇ／ｍｌの最終濃度のビオチン化ヒトＩｇＧ（ＫＰＬ２１６−１００６）と室温で３０分間、回転ホイール上でインキュベートした。次いで、細胞およびビーズ混合物を磁石上に置き、標識細胞と非標識細胞を分けた。ビーズをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液で４回洗浄した。最後のＰＢＳ洗浄後、これらのビーズおよび細胞を予熱した５００μｌの完全培地に再懸濁し、２４ウェルプレートに移し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。２４時間後、磁気選別したポリクローナル細胞をビーズから分離し、５０ｍＬのＴＰＰスピンチューブバイオリアクター（ＴＥＣＨＮＯ ＰＬＡＳＴＩＣ ＰＲＯＤＵＣＴＳ ＡＧ社、スイス）の中で細胞が十分な増殖密度に達するまでインキュベーションを続けた。
もう１つの方法として、２つのクローンを、ＣｌｏｎｅＰｉｘ装置を用いて３種類のＩｇＧのそれぞれを発現する非選別で非選択の集団から単離した。簡単に説明すると、半固体培地を用いて、単一細胞を固定し、多量のＩｇＧを分泌するコロニーを包埋後１０日目に採取した。これらの細胞株を、スピンチューブバイオリアクター中３〜４日ごとに、ペプトン含有増殖培地（８ｍＭのグルタミンを補充したハイクローン社製ＳＦＭ４ＣＨＯ）中、３×１０５細胞／ｍｌの密度で、３７℃、５％ＣＯ２に維持された加湿インキュベーター中、１８０ｒｐｍの軌道振盪により継代した。
ポリクローナル細胞集団を評価するときに、１ｍｌあたり１×１０５細胞密度で播種し、５０ｍｌのスピンチューブバイオリアクター中５ｍｌの完全培地で６日間培養した細胞からＩｇＧ抗体価を決定した。もう１つの方法として、クローン集団の振盪フラスコ培養物を、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地中３×１０５細胞／ｍｌの密度で接種し、流加生成プロセスを開始した。１２５ｍｌの振盪フラスコ中２５ｍｌ培養液量または５０ｍｌのＴＰＰ培養チューブ中５ｍｌ培養液量で、３７℃、５％ＣＯ２で維持し、１５０ｒｐｍ（１２５ｍｌの振盪フラスコおよびスピンチューブ）で振盪した加湿インキュベーターの中で流加生成アッセイを行った。０日目、３日目および６〜８日目に化学的に定義された濃縮供給物（ハイクローン社製、セルブースト（Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ）５、５２ｇ／ｌ）の初期培養容量の１６％を供給することによって、１０日間産生を行った。培養中は、グルタミンもグルコースも供給しなかった。培養物の生存能力および生存細胞密度（ＶＣＤ）を、ＧＵＡＶＡ機（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて毎日測定した。２重のサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用いて、培地中に分泌されるＭＡｂ濃度を決定した。
プラスミドおよび相対定量ＰＣＲ解析
この研究で用いるクローニングベクターは、Ｓｅｌｅｘｉｓ社の哺乳類発現ベクターＳＬＸｐｌａｓｍｉｄ＿０８２である。ｐＧＬ３対照ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のルシフェラーゼ配列を、真核生物発現カセットと置換した。該真核生物発現カセットは、ＥＧＦＰコード配列の上流側のヒトＣＭＶエンハンサーおよびヒトＧＡＰＤＨプロモーター、およびこれに続く、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ヒトガストリン転写終結コドンおよびＳＶ４０エンハンサーで構成されていた。２つのヒトＭＡＲ由来の遺伝エレメントは、発現カセットおよびＳＶ４０プロモーターから発現するピューロマイシン耐性遺伝子に隣接しているが、ＳＬＸプラスミド＿０８２は、発現カセットの上流側に位置するＭＡＲエレメントの種類によって異なる（ｈＭＡＲ １−６８およびｈＭＡＲ Ｘ−２９；Ｇｉｒｏｄ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
トラスツズマブおよびインフリキシマブ重鎖および軽鎖のｃＤＮＡを、発現ベクターにクローニングし、ＥＧＦＰを置換した。それぞれのＩｇＧの重鎖および軽鎖発現カセットの両方を保有するベクターは、１つのプラスミドベクター上で重鎖と軽鎖の発現カセットを組合せることによって作製した。全ての重鎖および軽鎖のシグナルペプチド配列は同一で、軽鎖の定常部分も同一である。重鎖の定常部分は、いくつかのアミノ酸の位置で異なる（ＤＥＬ対ＥＥＭ変異型）。
ＳＲＰ９、ＳＲＰ１４、ＳＲＰ５４、ＳＲＰＲα、ＳＲＰＲβ、ＳＥＣ６１Ａ１およびＳＥＣ６１ＢのｃＤＮＡのＰＣＲ増幅プライマーおよびＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、本明細書の他の場所にリストしている。分泌タンパク質をコードするＰＣＲ産物をベクターにクローニングし、ＥＧＦＰ配列を置換した。複数の分泌タンパク質を共発現させたときは、ピギーバックトランスポゾンの逆位末端配列を、発現カセットをまとめるためにベクターに組込み、得られたベクターを、導入遺伝子組込みを向上させ、抗生物質選択の必要性を排除するためにピギーバックトランスポゼース発現ベクターとコトランスフェクトした。
典型的なＰＢトランスポゼース発現ベクターは、関連実験で用いたアフリカツメガエルβグロビン遺伝子の５’および３’非翻訳末端領域（ＵＴＲ）によって囲まれたＰＢトランスポゼースコード配列を含むｐＣＳ２＋Ｕ５Ｖ５ＰＢＵ３である。このプラスミドは以下のように構築した：ｐＢＳＳＫ／ＳＢ１０の３’ＵＴＲ３１７塩基対断片をｐＣＳ２＋Ｕ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ペーズリー、英国）に挿入し、ｐＣＳ２＋Ｕ５Ｕ３を得た。ＰＢトランスポゼースコード配列（２０６７塩基対、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＦ５８７６９８）は、ＡＴＧ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ社（Ｍｅｒｚｈａｕｓｅｎ、ドイツ）によって合成してもらい、２つのＵＴＲ間のｐＣＳ２＋Ｕ５Ｕ３骨格にクローニングした。ＰＢ対照ベクターは、変更していないｐＣＳ２＋Ｕ５プラスミドに相当する。
ＡＴＧ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ社（Ｍｅｒｚｈａｕｓｅｎ、ドイツ）によって合成されたＰＢ２３５塩基対の３’ 逆位末端反復配列および３１０塩基対の５’逆位末端反復配列（ＩＴＲ）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−プラスミドに導入することによって、異なるトランスポゾンベクターを作製した（ｐＢＳＫ ＩＴＲ３’−ＩＴＲ５’）。次いで、ｐＲｃ／ＲＳＶプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）のＳＶ４０プロモーターの制御下にあるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ（登録商標））を２つＩＴＲの間に挿入した。この研究で用いたＭＡＲ １−６８およびＭＡＲ Ｘ−２９エレメント、ピューロマイシン耐性遺伝子およびＧＦＰ遺伝子は、以前に記載されたとおりである（Ｇｉｒｏｄ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｇｒａｎｄｊｅａｎ ｅｔ ａｌ．２０１１；Ｈａｒｔ ａｎｄ Ｌａｅｍｍｌｉ １９９８）。免疫グロブリン発現ベクターおよびＳＲＰ９、ＳＲＰ１４、ＳＲＰ５４、ＳＲＰＲα、ＳＲＰＲβ、ＳＥＣ６１Ａ１およびＳＥＣ６１Ｂコード配列は、本明細書に記載のとおりである。コード配列の上流のヒトＣＭＶエンハンサーおよびヒトＧＡＰＤＨプロモーター、続いて、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ヒトガストリン転写終結コドンおよびＳＶ４０エンハンサーで構成された真核生物発現カセットを用いて分泌タンパク質を発現させた。発現カセットおよび／またはＭＡＲエレメントを、標準的なクローニング法を用いてＩＴＲ配列間または細菌ベクター骨格中に挿入した。
適切な３’および５’ＩＴＲを含むピギーバックトランスポゾンシステムならびにトランスポゼースは、例えば、ＳＹＳＴＥＭ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ社から利用可能である。
相対定量ＰＣＲ解析については、全ＲＮＡを１×１０５細胞から抽出し、製造業者の取扱説明書に従って、ＦａｓｔＬａｎｅ細胞ｃＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。ＳＲＰ１４およびＧＡＰＤＨの発現を、捕捉の表Ｓ１に記載のプライマーを用いてＲｏｔｏｒ Ｇｅｎｅ Ｑ（Ｑｉａｇｅｎ社）およびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ ＳＹＢＲグリーンＩマスター（Ｒｏｃｈｅ）を用いるｑＰＣＲによって定量した。ＳＲＰ１４のメッセンジャーＲＮＡレベルをＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ Ｑシリーズソフトウェア（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＧＡＰＤＨのメッセンジャーＲＮＡを基準に正規化した。
ＣＨＯ細胞株の細胞培養、安定的トランスフェクションおよびサブクローニング
懸濁チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）をＬ−グルタミン（ＰＡＡ社、オーストリア）およびＨＴ栄養補助剤（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を補充したＳＦＭ４ＣＨＯハイクローン無血清培地（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）中で、加湿空気中３７℃、５％ＣＯ２で維持した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、製造業者の推奨する方法に従って電気穿孔（Ｎｅｏｎ ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により、ピューロマイシン耐性遺伝子を保有するトラスツズマブまたはインフリキシマブの重鎖および軽鎖発現ベクターでトランスフェクトした。２日後、これらの細胞をＴ７５プレート中の１０μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む培地に移し、これらの細胞を２週間選択剤の存在下でさらに培養した。次いで、トラスツズマブまたはインフリキシマブのＩｇＧを発現する個々の安定細胞クローンを限界希釈法により作製し、増殖させ、増殖能およびＩｇＧ産生レベルについて分析した。最高レベルのＩｇＧを発現するトラスツズマブまたはインフリキシマブＩｇＧ産生細胞クローンを、さらなる生化学実験のために選択した。次いで、これらのクローンのいくつかを、電気穿孔法によりＳＲＰ１４発現ベクターおよびネオマイシン耐性遺伝子を保有するプラスミドでコトランスフェクトした。次いで、上記のとおり、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地中で細胞を２週間培養した。安定クローンを限界希釈法により単離し、生化学分析のための培養増殖前にＱ−ＰＣＲアッセイによってＳＲＰ１４発現を確かめた。
回分培養および流加培養
５０ｍｌのミニバイオリアクター（ＴＰＰ社、スイス）において、トラスツズマブまたはインフリキシマブを発現する個々のクローンの増殖能および産生能を、３７℃、５％ＣＯ２加湿インキュベーター中７日間の流加培養で評価した。細胞培養の３日目、４日目、および７日目に、細胞の密度および生存率をＧｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメトリーシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて評価した。細胞培養上清中のＩｇＧ抗体価をサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。示したプロセス時間のサンプリング日における細胞密度（Ｃｖ／ｍｌ）およびＩｇＧ抗体価（μｇ／ｍｌ）の値をプロットした。トラスツズマブまたはインフリキシマブ発現クローンのＩｇＧ比生産性を、３日目〜７日目（産生段階）に計算したＩｇＧ濃度対生存細胞の整数（ＩＶＣＤ）の勾配として決定し、細胞あたりおよび１日あたりのｐｇ（ｐｃｄ）として表した。
流加産生培養については、１２５ｍｌの振盪フラスコ中の２５ｍｌのＳＦＭ４ＣＨＯハイクローン無血清培地に０．３×１０６細胞／ｍｌで細胞を播種した。攪拌しながら培養物を３７℃、５％ＣＯ２で維持した。市販のハイクローン供給装置（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて毎日、培養物に供給した。細胞密度およびＩｇＧ産生を毎日評価した。
タンパク質の発現および凝集の解析
可溶性細胞質タンパク質を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ社）の存在下でＰＢＳ緩衝液中１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いて細胞を透過処理することによって抽出した。氷上で３０分インキュベーションした後、細胞を１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を「可溶性細胞質およびＥＲタンパク質」画分と命名した。ペレットを尿素Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（６２．５ｍＭのＴｒｉｓ、２％ ＳＤＳ、８Ｍ尿素、５％グリセロール、ブロモフェノールブルー色素）中で超音波処理により溶解し、凝集した小胞の不溶性タンパク質画分を得た。次いで、可溶性画分および不溶性画分を２−メルカプトエタノールを含むまたは含まないＬａｅｍｍｌｉ緩衝液で調整し、８分間９５℃で煮沸た。還元試料および非還元試料を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド遺伝子電気泳動（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｎｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって、それぞれ１０％または４〜１０％勾配のアクリルアミドゲルで分離した。
次いで、タンパク質をニトロセスロース膜上にブロットした。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で希釈した５％ミルク中でブロッキングした後、異なるタンパク質について該膜を以下の１次光体を用いて分析した：抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ結合ロバ抗体（ＪＫ ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社、カタログ番号７０９ ０３５ １４９、１：５０００）、抗ヒトＢｉＰウサギポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、ＢｉＰ、Ｃ５０Ｂ１２、１：２０００）、抗ヒトＣＨＯＰマウスモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、ＣＨＯＰ、Ｌ６３Ｆ７、１：５００）、抗ヒトＧＡＰＤＨヤギポリクローナル抗体。一晩４℃でインキュベーションした後、各ブロットをＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧまたは抗マウスＩｇＧ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、１：２００００）で調べた。各抗体によって認識される特異的タンパク質を、ＥＣＬ試薬を用いて検出し、ＥＣＬフィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にさらした。
シクロヘキシミドベースのタンパク質追跡実験
高（ＨＰ）および低（ＬＰ）ＩｇＧ生産ＣＨＯ−Ｋ１クローン上でシクロヘキシミドベースの追跡実験を行った。同数の細胞を６ウェルプレート中の１００μＭ シクロヘキシミド（Ｓｉｇｍａ社）を補充した完全培地に播種した。様々な時点で細胞を採取し、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００含有ＰＢＳに溶解した。次いで、Ｔｘ可溶性画分およびＴｘ不溶性画分を４〜１０％アクリルアミド非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、抗ヒトＩｇＧ抗体で免疫ブロットした。
ディファレンシャル界面活性剤画分アッセイ
膜タンパク質由来の細胞質の分画を、細胞ペレットのディファレンシャル界面活性剤抽出によって行った。最初に細胞を１ｍｌのＰＢＳで洗浄し、ＨＰおよびＬＰ細胞の細胞膜を、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の存在下または非存在下で、０．０１％ジギトニン（Ｓｉｇｍａ社）を含むＫＨＭ緩衝液（１１０ｍＭ ＫＡｃ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．２）で１０分間透過処理した。半透過細胞をＫＨＭ緩衝液で１回洗浄し、トリプシンを室温で１０分間かけて５０μｇ／ｍｌまで添加し、可溶性タンパク質を消化した。トリプシン消化を１ｍＭ ＰＭＳＦおよび４ｍＭのＡＥＢＳＦの添加によって停止した。セクション２．４に記載のとおり、細胞を遠心分離によって収集し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００およびプロテアーゼインヒビターの存在下で可溶性タンパク質を抽出した。２−メルカプトエタノールを含むＬａｅｍｍｌｉ還元緩衝液をペレットおよび上清画分に添加し、次いで、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。免疫ブロットを行い、ＩｇＧおよびＢｉＰタンパク質を検出した。
タンパク質の架橋およびウエスタンブロット解析
インフリキシマブＬＰ細胞をＰＢＳ中で１回洗浄し、氷上で３０分間、１ｍＭのジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）（ＤＳＰ）架橋剤（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の存在下および非存在下でインキュベートした。５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）の添加によって架橋結合を１０分間停止し、その後、タンパク質の抽出を１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００含有ＰＢＳ緩衝液中で行った。微量遠心管で１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００不溶性画分または全タンパク質抽出物を還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、免疫ブロットし、抗ＢｉＰ抗体および抗ＬＣ抗体を用いて調べた。等量のＴｘ不溶性画分のタンパク質を並行して分析した。
本発明の方法および組成物は様々な実施形態に組み入れることができると理解されるであろう。本明細書に開示したのは、その中のほんのいくつかのみである。他の実施形態が存在し、本発明の趣旨から逸脱しないことは当業者には明らかとなるであろう。したがって、記載した実施形態は説明目的のものであり、これらに制限するものとして解釈されるべきではない。
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Claims (11)

  1. ５’および３’トランスポゾン特異的逆位末端反復配列（ＩＴＲ）と、
    前記５’ＩＴＲと３’ＩＴＲの間に位置し且つプロモーターの制御下にある、導入遺伝子発現プロセシング（ＴＥＰ）機能性ＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸配列と、
    前記５’ＩＴＲと３’ＩＴＲの間に位置する少なくとも１つのマトリックス結合領域（ＭＡＲ）エレメントと、
    を含む組換え核酸分子であって、
    前記ＴＥＰ機能性ＲＮＡは、ＤＮＡ組換え経路のタンパク質の少なくとも１つの発現を妨げるｓｈＲＮＡであり、
    前記ＭＡＲエレメントは、ＭＡＲ １−６８もしくはＭＡＲ Ｘ−２９エレメントから選択されるか、または配列番号１もしくは３と少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有し、
    前記ＤＮＡ組換え経路のタンパク質の少なくとも１つは、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｘｒｃｃ２、Ｘｒｃｃ３、Ｒａｄ５２、Ｒａｄ５４、Ｂｒｃａ１、サイクリンＤ１、Ｅｒｃｃ、Ｂａｒｄ１、リガーゼ１、Ｍｒｅ１１または５３ＢＰ１である、
    組換え核酸分子。
  2. 前記５’ＩＴＲと３’ＩＴＲの間に位置する少なくとも１つの導入遺伝子をさらに含み、前記導入遺伝子が導入遺伝子プロモーターの制御下にある、請求項１に記載の組換え核酸分子。
  3. 前記組換え核酸分子がベクターの一部である、請求項１または２に記載の組換え核酸分子。
  4. 前記ベクターが、単一ＭＡＲエレメント、または２つ以上のＭＡＲエレメントを含み、前記エレメント（複数可）が前記５’ＩＴＲと３’ＩＴＲの間に位置する、請求項３に記載の組換え核酸分子。
  5. 前記ベクターが、２つのＭＡＲエレメントを含み、第１のＭＡＲエレメントがＴＥＰ機能性ＲＮＡの上流側に位置し、第２のＭＡＲエレメントがＴＥＰ機能性ＲＮＡの下流側に位置し、前記第１のＭＡＲエレメントが、ＭＡＲ １＿６エレメント、および／または配列番号２と少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するエレメントを含み、前記第２のＭＡＲエレメントが、ＭＡＲ １−６８エレメント、および／または配列番号１と少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するエレメントを含む、請求項３に記載の組換え核酸分子。
  6. 前記ベクターが、単一ＭＡＲエレメントを含み、前記単一ＭＡＲエレメントが、ＴＥＰ機能性ＲＮＡの下流側に位置し、前記単一ＭＡＲエレメントが、ＭＡＲ １−６８もしくはＭＡＲ Ｘ−２９エレメントおよび／または配列番号１もしくは３と少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するエレメントである、請求項３に記載の組換え核酸分子。
  7. ２０、１５、１０または５以下の請求項１または２に記載の組換え核酸分子を含む、組換え哺乳類細胞。
  8. ａ）少なくとも１つの導入遺伝子発現プロセシング（ＴＥＰ）機能性ＲＮＡ、および／または、ＴＥＰ機能性ＲＮＡをコードする少なくとも１つの組換え核酸配列、ならびに、
    ｂ）（ｉ）少なくとも１つの目的の導入遺伝子と、（ｉｉ）ＭＡＲエレメントと、を含む組換え核酸分子、
    を含む組換え哺乳類細胞であって、
    前記ＴＥＰ機能性ＲＮＡは、ＤＮＡ組換え経路のタンパク質の少なくとも１つの発現を妨げるｓｈＲＮＡであり、
    前記ＭＡＲエレメントは、ＭＡＲ １−６８もしくはＭＡＲ Ｘ−２９エレメントから選択されるか、配列番号１もしくは３と少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有し、
    前記ＤＮＡ組換え経路のタンパク質の少なくとも１つは、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｘｒｃｃ２、Ｘｒｃｃ３、Ｒａｄ５２、Ｒａｄ５４、Ｂｒｃａ１、サイクリンＤ１、Ｅｒｃｃ、Ｂａｒｄ１、リガーゼ１、Ｍｒｅ１１または５３ＢＰ１である、
    組換え哺乳類細胞。
  9. 哺乳類細胞をインビトロでトランスフェクトするための方法であって、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つの請求項１または２に記載の組換え核酸分子で前記哺乳類細胞をトランスフェクトすることを含む、方法。
  10. 哺乳類細胞をインビトロでトランスフェクトするための方法であって、
    少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つの単離された導入遺伝子発現プロセシング（ＴＥＰ）機能性ＲＮＡおよび少なくとも１つの導入遺伝子
    で前記哺乳類細胞をトランスフェクトすることを含み、
    前記ＴＥＰ機能性ＲＮＡが、ＤＮＡ組換え経路のタンパク質の少なくとも１つの発現を妨げるｓｈＲＮＡであり、
    前記ＤＮＡ組換え経路のタンパク質の少なくとも１つは、Ｒａｄ５１、Ｂｒｃａ１、ＥｒｃｃまたはＭＤＣ１である、
    方法。
  11. 請求項１または２に記載の組換え核酸分子を含む少なくとも１つのベクターを１つの容器内に含み、前記ベクター（複数可）の使用法についての説明書をさらに別の容器内に含む、キット。
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Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104975009B (zh) * 2014-04-01 2019-10-18 三生国健药业（上海）股份有限公司 一种新型的含mar核心片段的动物细胞表达载体
CN105154473B (zh) * 2015-09-30 2019-03-01 上海细胞治疗研究院 一种高效安全的转座子整合系统及其用途
JP6871679B2 (ja) * 2016-03-23 2021-05-12 国立大学法人 岡山大学 遺伝子発現用カセット及びその産生物
WO2017061354A1 (ja) * 2015-10-06 2017-04-13 国立大学法人 岡山大学 遺伝子発現用カセット及びその産生物
JP2017070224A (ja) * 2015-10-06 2017-04-13 国立大学法人 岡山大学 遺伝子発現用カセット及びその産生物
JP7370702B2 (ja) 2015-12-24 2023-10-30 セレクシス エス．エー． タンパク質製造用の改善された真核細胞およびそれらの作製方法
ITUA20161610A1 (it) * 2016-03-14 2017-09-14 Angela Anna Messina Composto peptidico farmacologicamente attivo, procedimento per la sua preparazione e suo uso.
EP3219800A1 (en) * 2016-03-15 2017-09-20 Max-Delbrück-Centrum Für Molekulare Medizin A transposon-based transfection system for primary cells
EP3219803A1 (en) * 2016-03-15 2017-09-20 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin Enhanced sleeping beauty transposons, kits and methods of transposition
ES2938626T3 (es) * 2016-05-03 2023-04-13 Lonza Ag Modulación del metabolismo de los lípidos para la producción de proteínas
JP7382138B2 (ja) 2016-10-03 2023-11-16 第一三共株式会社 Ｈｓｐａ５遺伝子のプロモーター
US11278570B2 (en) 2016-12-16 2022-03-22 B-Mogen Biotechnologies, Inc. Enhanced hAT family transposon-mediated gene transfer and associated compositions, systems, and methods
KR102523318B1 (ko) 2016-12-16 2023-04-18 비-모젠 바이오테크놀로지스, 인크. 증진된 ｈＡＴ 패밀리 트랜스포존 매개 유전자 전달 및 연관된 조성물, 시스템, 및 방법
WO2018224162A1 (en) * 2017-06-09 2018-12-13 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Methods for characterizing loss of antigen presentation
WO2019066548A2 (ko) * 2017-09-29 2019-04-04 (주)벳바젠 심부전의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
CN109929839B (zh) * 2017-12-18 2021-02-12 华东师范大学 拆分型单碱基基因编辑系统及其应用
CN108504692B (zh) * 2018-03-26 2021-07-23 安徽大学 一种基因敲除cho细胞株的构建方法及其在治疗性重组蛋白表达中的应用
US20210214747A1 (en) * 2018-05-18 2021-07-15 Sorbonne Universite Molecular tools and methods for transgene integration and their transposition dependent expression
WO2019246486A2 (en) 2018-06-21 2019-12-26 B-Mogen Biotechnologies, Inc. ENHANCED hAT FAMILY TRANSPOSON-MEDIATED GENE TRANSFER AND ASSOCIATED COMPOSITIONS, SYSTEMS, AND METHODS
RU2686102C1 (ru) * 2018-08-07 2019-04-24 Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) Рекомбинантный вектор для создания плазмидных генетических конструкций, обладающих повышенной длительностью экспрессии целевых генов
US20210343368A1 (en) * 2018-09-05 2021-11-04 Max-Delbrück-Centrum Für Molekulare Medizin In Der Helmholtz-Gemeinschaft Method for Engineering Synthetic Cis-Regulatory DNA
US20210380661A1 (en) * 2018-10-16 2021-12-09 Texas Tech University System Method to Express, Purify, and Biotinylate Eukaryotic Cell-Derived Major Histocompatibility Complexes
WO2020084528A1 (en) 2018-10-24 2020-04-30 Selexis Sa Expression systems, recombinant cells and uses thereof
EP3902910A1 (en) * 2018-12-24 2021-11-03 Selexis S.A. Characterization and inactivation of endogenous retroviruses in chinese hamster ovary cells
US20220088158A1 (en) 2019-01-23 2022-03-24 Aceragen, Inc. Method of ameliorating a pro-inflammatory immunophenotype in farber disease subjects by repeated administration of a recombinant human acid ceramidase
IT201900002321A1 (it) * 2019-02-18 2020-08-18 Univ Degli Studi Padova Peptidi con attivita' antitumorale
TWI818166B (zh) * 2019-03-27 2023-10-11 美商菲尼克斯組織修復公司 用於生產膠原蛋白7組合物之系統及方法
CN110006866B (zh) * 2019-04-16 2022-04-22 杭州迈尔德生物科技有限公司 一种阿片类活性物质的通用检测方法及其检测试剂盒
WO2020228721A1 (en) * 2019-05-13 2020-11-19 Lin Mei Chun Method and kit for monitoring cancer
WO2021069675A1 (en) * 2019-10-10 2021-04-15 The Regents Of The University Of California Methods to stabilize mammalian cells
IL270306A (en) 2019-10-30 2021-05-31 Yeda Res & Dev Prevention and treatment of pre-myeloid and myeloid malignancies
CN110863008B (zh) * 2019-11-22 2020-10-16 昆明学院 Mar序列调控弱启动子构建高效表达载体的方法
US20230046668A1 (en) 2019-12-24 2023-02-16 Selexis S.A. Targeted integration in mammalian sequences enhancing gene expression
CN111500629B (zh) * 2020-04-17 2021-11-19 安徽中盛溯源生物科技有限公司 一种高表达层粘连蛋白-511变体的方法及其应用
WO2021231569A1 (en) * 2020-05-14 2021-11-18 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Dual promoter systems
US20220010332A1 (en) * 2020-07-08 2022-01-13 Neuracle Genetics Inc. Intron fragments
CN113881703B (zh) * 2021-10-11 2022-06-21 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种提高cho细胞同源重组效率的方法及其相关产品和应用
CN116440269B (zh) * 2022-01-10 2024-02-09 华中农业大学 Slc35a1基因作为靶点在防治猪流行性腹泻病中的应用
CN114958914B (zh) * 2022-06-06 2023-09-26 新乡医学院 一种人类及哺乳动物细胞附着体表达载体、构建方法和应用

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5731178A (en) 1990-03-21 1998-03-24 Behringwerke Aktiengesellschaft Attachment-elements for stimulation of eukaryotic expression systems
JP3656277B2 (ja) * 1995-05-17 2005-06-08 味の素株式会社 組換えｄｎａ法によるトランスグルタミナーゼの効率的製造法
ATE437233T1 (de) 2001-01-26 2009-08-15 Selexis Sa Matrix-anheftungsregionen und verfahren zu deren verwendung
US20040235011A1 (en) * 2002-06-26 2004-11-25 Cooper Richard K. Production of multimeric proteins
WO2004065581A2 (en) * 2003-01-15 2004-08-05 Discovery Genomics, Inc. Transposon-insulator element delivery systems
US7244616B2 (en) * 2003-06-27 2007-07-17 Bayer Pharmaceuticals Corporation Use of molecular chaperones for the enhanced production of secreted, recombinant proteins in mammalian cells
WO2005040377A2 (en) 2003-10-24 2005-05-06 Selexis S.A. High efficiency gene transfer and expression in mammalian cells by a multiple transfection procedure of matrix attachment region sequences
ES2292271B1 (es) * 2004-05-20 2009-02-16 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Un vector hibrido adenovirus-alfavirus para la administracion eficaz y expresion de genes terapeuticos en celulas tumorales.
JP2008543283A (ja) * 2005-06-10 2008-12-04 ジェネンテック・インコーポレーテッド インスレーターエレメントを含むベクターを使用する抗体発現の改良
DK3156414T3 (da) * 2007-09-26 2020-03-09 Intrexon Corp Syntetisk 5'utrs ekspressionsvektorer og fremgangsmåder til øgning af transgen ekspression
US20090247609A1 (en) 2007-12-20 2009-10-01 Hitto Kaufmann Sm-protein based secretion engineering
US20100105140A1 (en) * 2008-07-16 2010-04-29 Fahrenkrug Scott C Plaice dna transposon system
WO2010118360A1 (en) * 2009-04-09 2010-10-14 The Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Production of proteins using transposon-based vectors
SG178940A1 (en) 2009-09-18 2012-04-27 Selexis Sa Products and methods for enhanced transgene expression and processing

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