TWI475109B - 通過抑制報告基因表現量的手段進行高產量細胞株選殖之策略 - Google Patents

Description

通過抑制報告基因表現量的手段進行高產量細胞株選殖之策略

本發明所揭示之技術大體而言係關於生物技術及分子生物學，且詳言之係關於細胞純系之大量篩選。

本申請案主張2009年6月11日申請之美國臨時申請案第61/213,459號的優先權，該案之全文以引用的方式併入本文中。

在生產重組蛋白之細胞株的產生中，關鍵步驟在於將相關之基因併入宿主細胞之後選擇有效純系。對於工業規模生物生產而言，極需一種產物基因穩定嵌合且大量生產蛋白產物之純系。

在異質群體中，重組基因嵌合至宿主基因體為隨機度頗高之事。含有多個穩定嵌合基因拷貝之細胞較彼等具有低拷貝數之細胞比例來的少。高產量之次選殖系較罕見且易於被生長較快的非生產細胞或低產量細胞給稀釋。因此，為分離高生產率的次選殖系，需要多次篩選及測試。一般而言，限數稀釋法(limited dilution methods)係過於冗長且耗時。

使用流式細胞儀及細胞分選之篩選方法一般認為可顯著增加篩選細胞之效率。幾百萬個細胞可在短時間內被篩選，且即便在混合細胞群體中出現的頻率低達10^-6 ，亞群及單一細胞亦可自其中分離。

流式細胞儀搭配非螢光報導蛋白以便能在早期快速識別生產大量目標蛋白之純系。藉由細胞表面蛋白表現，抗體及配位體結合螢光染料，而使得分離細胞的技術變得容易進行。舉例而言，通常不表現於宿主細胞上的細胞表面蛋白可與目標蛋白一起共表現而作為報導體。

在細胞表面蛋白表現與生產率不相關之情況下，可基於細胞內蛋白質之含量使用諸如綠色螢光蛋白(GFP)之報導分子來分離細胞。GFP已成為基因表現及基於誘導性基因產物選擇細胞的重要報導體。在哺乳動物細胞株中，GFP已用於與重組蛋白共表現來篩選高產量純係，而該篩選係基於螢光的強度。已在若干表現各種重組蛋白之細胞株中發現GFP螢光強度與重組蛋白產量的相關性。然而，此等篩選標記之表現會增加細胞中蛋白表現機構之負荷且減少了目標蛋白之產量。

本發明之一態樣係關於一種篩選具高目標蛋白表現量之細胞的方法。該方法包括將具有編碼目標蛋白及宿主細胞內源性篩選標記之抑制子兩者的DNA構築體引入至數個宿主細胞內，針對內源性篩選標記之表現來篩選含有DNA構築體的宿主細胞，及分離篩選標記表現量低的細胞。DNA構築體系配置為可於在宿主細胞內表現目標蛋白及抑制子兩者。

在一實施例中，抑制子係選自由小干擾RNA(siRNA)、小髮夾狀RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、miRNA與shRNA之雜合體及反義RNA組成之族群。

在另一實施例中，抑制子係shRNA。

在另一實施例中，內源性篩選標記係螢光標記且分離步驟包含用螢光活化細胞分選儀(FACS)分選細胞。

在另一實施例中，DNA構築體進一步編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)且宿主細胞為DHFR缺陷型細胞。

本發明之另一態樣係關於一種選擇轉殖基因表現細胞之高產能篩選方法。該方法包括用載有至少一種轉殖基因及抑制螢光蛋白表現之干擾RNA的載體轉染表現螢光蛋白之宿主細胞；量測經轉染細胞中之螢光強度；及分離螢光強度低於未經轉染細胞之螢光強度的細胞。

在一實施例中，螢光蛋白為綠色螢光蛋白(GFP)。

在另一實施例中，干擾RNA為mir-30 based之shRNA。

在另一實施例中，分離步驟包含用FACS進行分選細胞。

在另一實施例中，表現螢光蛋白之細胞為DHFR缺陷型CHO細胞。

在另一實施例中，至少一種轉殖基因經由內部核糖體進入位點(IRES)連接於編碼DHFR之基因。

本發明之另一態樣係關於一種表現載體，其用於高產能篩選含有表現載體之細胞。該表現載體包含編碼目標蛋白的第一核苷酸序列、編碼宿主細胞外源性篩選標記的第二核苷酸序列、編碼宿主細胞內源性篩選標記之抑制子的第三核苷酸序列、及一或多個控制宿主細胞內第一核苷酸序列、第二核苷酸序列及第三核苷酸序列表現的調控元件。第一核苷酸序列經由內部核糖體進入位點(IRES)連接於第二核苷酸序列。

在一實施例中，表現載體另外包含一或多個抗阻遏子元件。

在一相關實施例中，一或多個抗阻遏子元件包括部分小鼠抗阻遏子元件40。

在另一實施例中，抑制子為干擾RNA。

在一相關實施例中，干擾RNA為miR-30 based之shRNA。

在另一實施例中，內源性篩選標記為螢光蛋白。

在一相關實施例中，螢光蛋白為綠色螢光蛋白。

在另一實施例中，外源性篩選標記為二氫葉酸還原酶。

在另一實施例中，一或多個調控元件包括CMV IE增強子。

本發明揭示一種篩選外源性蛋白高表現量之細胞的方法。在一實施例中，該方法包括以下步驟：將具有編碼目標蛋白及宿主細胞內源性篩選標記之抑制子兩者的DNA構築體引入至數個宿主細胞中，其中該構築體經配置成可於宿主細胞內表現目標蛋白及抑制子兩者；針對內源性篩選標記之表現來篩選含有DNA構築體的宿主細胞；及分離內源性篩選標記表現量低的細胞。

如下文所用，術語「細胞」/「宿主細胞」及「細胞株」/「宿主細胞株」通常分別定義為真核細胞及其均質群體，其可藉由技術領域中已知之方法以細胞培養維持，且具有表現異源蛋白的能力。在一實施例中，該等細胞為CHO細胞。在另一實施例中，該等細胞為表現GFP作為內源性篩選標記的CHO細胞。在另一實施例中，該等細胞為缺乏DHFR基因且表現GFP作為內源性篩選標記的CHO細胞。

如下文所用，術語「表現」通常用於指細胞中一或多種特異性RNA產物或一或多種特異性蛋白的生產。在RNA產物的情況下，其係指轉錄過程。在蛋白產物的情況下，其係指轉錄、轉譯及視情況存在的後轉譯修飾過程。在分泌蛋白的情況下，其係指轉錄、轉譯及視情況存在的後轉譯修飾(例如糖基化、二硫鍵形成等)及隨後的分泌過程。在多聚體蛋白(multimeric protein)的情況下，其包括多肽單體形成多聚體結構的組裝。相應於名詞「表現」之動詞具有與名詞類似的意義。

如下文所用，術語「篩選標記」通常用於指可在細胞中直接或間接偵測到其存在的基因及/或蛋白，例如使篩選劑失活且保護宿主細胞免受該篩選劑之致死效應或生長抑制效應影響的基因及/或蛋白(例如抗生素抗性基因及/或蛋白)。另一可能性為可誘導螢光或顏色沈積物之篩選標記(例如綠色螢光蛋白及衍生物、螢光素酶或鹼性磷酸酶)。術語「內源性篩選標記」係指在DNA構築體引入至宿主細胞之前即已存在於宿主細胞中之聚核苷酸所編碼的篩選標記。「內源性篩選標記」的編碼序列可為嵌入形式(亦即嵌合至細胞基因組中)或以游離形式存在。

如下文所用，術語「DNA構築體」係指表現或轉型構築體。DNA構築體包含至少一個表現單元或表現卡匣。術語「表現單元或表現卡匣」在本文中定義為能表現編碼序列或開放閱讀框架之單元。「表現單元或表現卡匣」通常包含一或多個調控元件可操作地連接於編碼相關之分子(亦即多肽或聚核苷酸)之轉殖基因。

「調控元件」為藉由可操作地連接於編碼序列而調控轉殖基因表現之核酸序列。調控序列之實例包括(但不限於)適當的轉錄起始序列、終止序列、啟動子序列及增強子序列；有效的RNA加工信號，諸如剪接信號及聚腺苷酸化信號；穩定細胞質mRNA的序列；提高轉譯效率的序列(亦即Kozak一致性序列)；增強蛋白穩定性的序列；及當需要時，增加蛋白分泌的序列。調控序列可以順式組態或以反式組態，或在一定距離處起作用以控制相關之基因。

「轉殖基因」為有待傳遞或轉移至哺乳動物細胞之核酸序列。轉殖基因可編碼適於用作標記、報導體或治療分子之蛋白質、肽或多肽。轉殖基因亦可編碼適用於蛋白生產、診斷檢定或用於活體外或活體內之任何暫時或穩定基因轉移的蛋白質、多肽或肽。或者，轉殖基因可編碼功能性聚核苷酸，諸如miRNA、RNAi、shRNA、反義RNA、核糖核酸酶或其他調控核酸。轉殖基因亦包括用於誘導DNA重組及基因修復之DNA序列。

當一核酸序列與另一核酸序列呈功能性關係時，前者「可操作地連接」於後者。舉例而言，若前序列或分泌性前導肽之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白，則該DNA可操作地連接於多肽之DNA；若啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，則其可操作地連接於該序列；或若核糖體結合位點經定位以促進轉譯，則其可操作地連接於編碼序列。通常，「可操作地連接」意謂所連接的DNA序列為連續的，且在分泌性前導序列之情況下為連續的並處於閱讀階段。然而，增強子不需要連續。連接係藉由在適宜限制位點上接合來達成。若不存在該等位點，則以傳統方式使用合成寡核苷酸接附子或連接子。

「篩選標記之抑制子」可為直接或間接抑制篩選標記之表現或活性的多肽或聚核苷酸。在一實施例中，抑制子為抑制宿主細胞內篩選標記之表現的聚核苷酸，諸如小干擾RNA(siRNA)、小髮夾狀RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、miRNA與shRNA之雜合體或反義RNA分子。在另一實施例中，抑制子為抑制宿主細胞內選擇標記之表現的多肽，諸如轉錄調控子。在另一實施例中，抑制子為抑制選擇標記之生物活性的多肽，諸如抗體。

如本文所用，術語「siRNA」係指長度為約10-50個核苷酸(術語「核苷酸」包括核苷酸類似物)、較佳約15-25個核苷酸、更佳約17、18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸之RNA劑，較佳為雙股劑，該等股視情況具有包含例如1、2或3個突出核苷酸(或核苷酸類似物)之突出末端，其能指示或介導RNA干擾。天然存在之siRNA係藉由細胞之RNA干擾(RNAi)機構自較長dsRNA分子(例如長度>25個核苷酸)產生。

如本文所用，術語「RNA干擾」或「RNAi」通常係指導致目標分子(例如目標基因、蛋白或RNA)向下調節之序列特異性或選擇性過程。在特定實施例中，「RNA干擾」或「RNAi」過程之特徵為RNA分子(例如細胞內之RNA分子)之降解，該降解由RNA劑觸發。降解由酶RNA誘導沉默複合物(RISC)來催化。RNAi係自然存在於細胞中以移除外來RNA(例如病毒RNA)。天然RNAi源自於可將降解機制導入其他類似RNA序列之游離dsRNA分解之片段。或者，RNAi可藉由將小干擾RNA分子引入至細胞中以使目標基因之不表現而引發。

如下文所用，術語「shRNA」係指具有莖-環結構之RNA劑，其包含互補序列之第一區域及第二區域，該等區域之互補程度及取向足以使該等區域之間發生鹼基配對，第一區域與第二區域經由環區域連接，該環係因為在環區域內核苷酸(或核苷酸類似物)之間缺少鹼基配對而產生。shRNA髮夾狀結構由細胞機構分解為siRNA，其接著結合於RNA誘導沉默複合物(RISC)。此複合物結合及分解與siRNA相配對且與之結合的mRNA。

DNA構築體可在其構築期間另外包含用於細菌中複製及篩選之質體元件。DNA構築體亦可含有其他篩選標記以促進DNA構築體在宿主細胞內擴增。由DNA構築體編碼之篩選標記被視為外源性篩選標記。外源性選擇標記之實例包括(但不限於)抗生素抗性(例如編碼G418抗性之新黴素(neomycin)基因)或酶類似物抗性(例如編碼甲胺喋呤抗性之二氫葉酸還原酶基因)。

在一實施例中，DNA構築體含有雙效(bicistronic)表現卡匣，其中相關之蛋白之開放閱讀框架經由內部核糖體進入位點(IRES)，連接於外源性篩選標記或內源性篩標抑制子的編碼序列，以使其在同一mRNA中轉錄但獨立轉譯。因為其均來自共同的mRNA，所以外源性篩選標記或抑制子之表現量可準確地預測各純系之相關之蛋白的相對表現量。較佳地，雙效表現卡匣中相關之蛋白之開放閱讀框架位於外源性篩選標記或內源性篩選標記抑制子的編碼序列的上游。

舉例而言，為改良多輪甲胺喋呤(MTX)擴增之精確度及產量，編碼治療蛋白(諸如抗體輕鏈)之基因在3'端經由IRES連接於外源性篩選標記(諸如DHFR)，以使其在同一mRNA中轉錄但獨立轉譯。相對於5'帽(5' cap)-介導之轉譯而為效率較低的IRES介導轉譯可確保細胞資源主要用於生產治療蛋白而非DHFR蛋白。然而，因為其來自同一mRNA，所以對於各純系而言，DHFR擴增量可準確地預測治療蛋白的相對表現量。

在另一實施例中，DNA構築體另外含有一或多個對抗染色質相關阻遏之抗阻遏子元件(ARE)。如下文所用，ARE(或抗阻遏子序列，其在本文中互換使用)為具有阻斷轉殖基因阻遏之能力，而自真核基因組中分離的天然存在之DNA元件。ARE具有可影響基因順式轉錄及/或提供穩定效應及/或增強效應的能力。已證實當ARE側接轉殖基因時，隨機選擇之重組細胞株之轉殖基因表現量可增加至接近轉殖基因啟動子之最大可能表現量。此外，轉殖基因之表現量歷經多個細胞世代保持穩定，且不顯現隨機靜默(silencing)。因此，ARE賦予轉殖基因在習知轉殖基因系統的情況下不可能實現的位置獨立性表現。位置獨立性意謂轉殖基因嵌入至可導致轉殖基因靜默之基因組位置，在ARE保護下維持轉錄活性狀態。在一實施例中，ARE為部分小鼠ARE40片段。在另一實施例中，DNA構築體含有多個部分小鼠ARE40片段。

將DNA構築體引入至細胞中之方法已為此項技術所熟知。該等方法之實例包括(但不限於)電穿孔、脂質體轉染、磷酸鈣或氯化鈣共沈澱及DEAE-葡聚糖介導之轉染。DNA構築體亦可由病毒載體引入至細胞中。常用病毒載體包括(但不限於)腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、疱疹病毒載體及反轉錄病毒載體。

針對外源性及內源性篩選標記之表現來篩選經DNA構築體轉染之細胞。DNA構築體中之篩選標記抑制子之高表現量可導致內源性篩選標記之表現量及/或活性降低。接著分離篩選標記表現降低的細胞並進行次選殖，以測定轉殖基因表現之量及穩定性。

在某些實施例中，內源性篩選標記為可經誘導而發出螢光之蛋白。在此等實施例中，篩選步驟及分離步驟可利用螢光活化細胞分選儀(FACS)同時進行。

在其他實施例中，首先用外源性標記對經DNA構築體轉染之細胞進行一或多輪篩選(例如篩選抗G418及/或抗甲胺喋呤純系)。篩選出的細胞接著再篩選出內源性篩選標記表現及/或活性低者。

本發明亦揭示一種DNA構築體，其經配置成可使含有該DNA構築體之細胞高產量篩選。在一實施例中，該DNA構築體含有目標蛋白之編碼序列及宿主細胞內源性篩選標記抑制子之編碼序列，其中該DNA構築體經配置成可於宿主細胞內表現目標蛋白及抑制子兩者。

在一實施例中，抑制子為抑制宿主細胞內源性篩選標記表現的小干擾RNA(siRNA)、小髮夾狀RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、miRNA與shRNA之雜合體或反義RNA分子。

在另一實施例中，抑制子為抑制宿主細胞內源性篩選標記表現的多肽，諸如轉錄調控子。

在另一實施例中，抑制子為抑制內源性篩選標記之生物活性的多肽，諸如抗體。

在另一實施例中，內源性選擇標記為可誘發螢光的蛋白。

在另一實施例中，DNA構築體另外包含一或多個抗阻遏子元件。

本發明所述之技術能自經轉染細胞之異質群體中快速識別及分離高產量的純系，從而減少標準限數稀釋選殖法相關的工作及時間。此外，因為此項技術可識別群體中罕見的欲得細胞，所以其可藉由減少在分離高產純系之前池擴增(pool amplification)之輪數或藉由先分離用於藥物擴增及次選殖之高產純系，來縮短發展時間。

實例

綠色螢光蛋白(GFP)/螢光活化細胞分選儀(FACS)之篩選方法的簡易性及有效性已在先前研究中得到證實。在此等先前報導中，GFP使用內部核糖體進入位點(IRES)或雙啟動子系統(two promoter system)併入，作為融合蛋白之一部分或作為雙效構築體之一部分。具有高GFP含量之細胞與相關之蛋白產物之高含量有關。此可歸因於高拷貝數之重組基因的穩定嵌合或該基因已嵌合至具有極高轉錄活性之位點。雖然此等方法已顯示有效，但在使用含有GFP之細胞株製造人類治療劑方面可能存在某些掛慮。此外，似乎不必要使細胞之代謝機構在分離亞群之後加諸GFP生產的負擔。此細胞資源可潛在地轉為增加細胞生長或重組蛋白產量。以下實例描述一種相反地使用GFP作為篩選標記，併用FACS分選來篩選高產細胞純系的新穎技術。

圖1 為顯示基於GFP之篩選過程的示意圖。簡言之，將含有編碼GFP之cDNA的質體載體轉染入DHFR缺陷型CHO細胞。成功獲得所要載體之細胞具有螢光。GFP表現細胞設定為用於重組蛋白表現之親本宿主細胞。

為生產欲得之重組蛋白，用含有shRNAmir^eGFP 之載體轉染親本宿主細胞，接著進行FACS分選以篩選低螢光強度的細胞。在若干輪遞增MTX攻毒之後，對細胞培養進行反覆多輪分選及擴增。GFP螢光強度最低的細胞純系對應於轉殖基因表現最高的純系。最後，擴增所選擇之純系且測試其產量及穩定性。因為FACS能輕易地篩選大量細胞，所以獲得高產純系之機會相比於限數稀釋法將大大提高。此外，該程序較不耗費人力且可顯著縮短產生用於生物生產之純系所需的時間。

實例1：建立CHO ^+GFP/-dhfr 細胞株

將中國倉鼠卵巢二氫葉酸還原酶缺陷型細胞株(CHQ/^dhfr- )培養於補充有HT(0.1 mM次黃嘌呤鈉及0.016 mM胸苷，Gibco，目錄號11067)、10% FBS(Biological Industries，目錄04-001-1A)及2 μM甲胺喋呤水合物(MTX，Sigma，SI-M8407)之伊思考夫氏改良杜爾貝可氏培養基(Iscove's modified Dulbecco's medium，IMDM，Gibco，目錄號12200)中。

用5 μg含有編碼GFP之cDNA的質體載體(pFLAg-eGFP-IRES-Puro)及脂染胺(lipofectamine)根據Lipofectamine^TM Invitrogen Puls^TM 試劑(目錄號11514-015)說明書轉染CHO/^dhfr- 細胞。用5 μg/ml嘌呤黴素二鹽酸鹽(puromycin dihydrochloride)(Sigma，SI-P8833)篩選經轉染之細胞。在補充有HT、10% FBS、2 μM MTX及篩選抗生素的IMDM培養基中篩選10天之後，將細胞培養於上述培養基中。選殖表現GFP之CHO^-dhfr 細胞(CHO^+GFP/-dhfr 細胞)且將其設定為重組蛋白表現之親本宿主。

實例2：構築表現載體 (1) pScinoDP-DHFR載體

藉由用IRES-DHFR融合基因取代pEGFP-N1(Clontech)質體骨架中之EGFP基因，且將額外的SV40聚腺苷酸尾(polyA tail)及CMV-IE啟動子插入pEGFP-N1(Clontech)質體骨架中，來構築pScinoDP-DHFR質體。簡言之，藉由使用pCEP4質體(Invetrogen)作為模板進行PCR擴增來獲得聚腺苷酸尾及CMV-IE啟動子序列。藉由重疊延伸PCR(OL-PCR)來建立融合聚腺苷酸尾-啟動子之融合序列SV40polA-CMV-IE(約1.2 kb)。用XhoI/BglII消化融合序列且將其插入經XhoI/BglII消化之pEGFP-N1載體。所得構築體命名為pScinoDP。

藉由用pIRES2-EGFP及pSV2-DHFR質體作為模板進行PCR擴增來獲得IRES序列及DHFR基因。藉由重疊延伸PCR(OL-PCR)來產生IRES序列片段及DHFR基因片段(IRES2-DHFR)之雜合體。用AgeI/NotI消化雜合體片段(約1.1 kb)且將其插入經AgeI/NotI消化之pEGFP-N1中以取代pEGFP-N1載體中之EGFP基因。所得構築體命名為pIRES2-DHFR。進行定點突變以消除IRES序列中之ApaLI位點。

用AgeI/NotI消化在IRES序列中具有突變限制酶ApaLI位點的質體pIRES2-DHFR，且將含有IRES序列及整個DHFR編碼區基因的1.2 kb片段接合至經AgeI/NotI消化之pScinoDP，產生pScinoDP-DHFR(圖2 )。所有構築體藉由限制酶分析及/或藉由核苷酸定序來驗證。

(2) pScinoDP3-DHFR載體

pScinoDP3-DHFR載體設計為基於載有hEF1α啟動子及CMV-IE增強子的pScinoDP-DHFR之載體。簡言之，hEF1α啟動子係自pBudCE4.1載體(Invitrogen)擴增而來。經由在pEGFP-N1上在CMV-IE增強子之後次選殖hEF1α啟動子以形成pCMVe-hEF1α-EGFP載體，來獲得含有hEF1α啟動子及CMV-IE增強子序列之雜合體。CMV^e -hEF1α片段係自pCMV^e -hEF1α-EGFP載體PCR擴增且用於置換pScionDP-DHFR載體中之2個CMV啟動子。所得載體命名為pScinoDP3-DHFR(圖3 )。

(3) pScinoDP3mir-DHFR載體

使用以下合成骨架DNA及引子利用所述PCR產生單股97 nt「mir30樣」shRNAi^GFP 寡聚物：單股97 nt「shRNAi^GFP 」DNA寡聚物

加下劃線之斜體序列表示側接mir30序列，且未加下劃線之斜體序列表示mir30環結構。有義及反義篩選之目標序列樣本分別用粗體及加下劃線之粗體顯示。mir30樣shRNAi^GFP 係以單股DNA寡聚核苷酸形式合成，其具有與內源性mir30 miRNA側接序列之一部分相對應的常見末端。

mirFWD- AgeI 引子序列(40個基體)：

mirREV-HindIII 引子序列(37個基體)：

以加下劃線之斜體序列顯示之側接區用做通用側接序列以引發反應，藉此整個mir30樣shRNAi^GFP 得以擴增，產生可選殖至接受載體中之PCR產物。

利用PlatinumPfx DNA聚合酶及以下概況來進行PCR：95℃持續3分鐘，接著95℃持續30秒，54℃持續30秒，75℃持續30秒，總共35個循環。將所得PCR產物(AgeI-shRNAi^GFP )選殖至經修飾之pEGFP-N1載體中(AgeI位點已破壞，且在新黴素基因後有其他AgeI位點及EcoRV位點)。所得構築體命名為pEGFP-N1-shRNAi^GFP 。此等AgeI-shRNAi^GFP 序列亦由DNA定序來驗證。

用ApaLI-NotI消化pEGFP-N1-shRNAi^GFP 載體。用來自pScinoDP3-DHFR之ScinoDP3-DHFR片段置換CMV-IE-GFP片段。所得構築體命名為pScinoDP3mir-DHFR(圖4) 。

(4) pScinoDP8mir-DHFR載體

pScinoDP8mir-DHFR載體含有調控DNA元件mARE40。諸如源自管家基因之抗阻遏元件的調控元件顯示可正向影響由細胞株產生之重組蛋白的特異性生產率。質體pEGFP-N1用作此構築體之骨架。簡言之，使用以下合成骨架DNA及引子利用所述重疊PCR產生部分小鼠抗阻遏子元件40片段：mARE40-L1(+)骨架DNA：

mARE40-L1(-)骨架DNA：

mARE40-R1(+)骨架DNA：

mARE40-R1(-)骨架DNA：

mARE40-5'引子：

mARE40-3'AseI引子：

mARE40-3'AflII引子：

mARE40-3'SpeI引子：

(SEQ ID NO:11)

利用PlatinumPfx DNA聚合酶及以下概況來進行PCR：95℃持續3分鐘，接著95℃持續30秒，58℃持續30秒，75℃持續30秒，總共35個循環。將所得PCR產物(mARE40-AseI及mARE40-AflII)分別選殖至經修飾之pEGFP-N1(AgeI位點已破壞，且在AgeI前有其他EcoRV，且在AflII位點前有ScaI位點)載體中以形成pmARE40-EGFP-N1，且將(mARE40-SpeI)選殖至pScinoDP3-DHFR(在SpeI位點前有其他EcoRV位點)載體中以形成pScinoDP3-DHFR-F2。用AseI-BamHI消化pmARE40-EGFP-N1載體，且用來自pScinoDP3-DHFR載體之約1.6 kb AseI-CMV^e -hEF1α-BamHI片段置換CMV-IE啟動子。所得構築體命名為pFmARE40ScinoDP3-EGFP-N1。用BamHI-NotI消化pFmARE40ScinoDP3-EGFP-N1載體，且用來自pScinoDP3-DHFR-F2之約1.6 kb BamHI-SV40polA-mARE40-DP3-IRES-DHFR-NotI片段置換EGFP基因。所得構築體命名為pScinoDP8-DHFR。用ApaLI-NotI消化pEGFP-N1-shRNAiGFP載體，且用來自pScinoDP8-DHFR之ScinoDP8-DHFR片段置換CMV-IE-GFP片段。所得構築體命名為pScinoDP8mir-DHFR(圖5 )。以下顯示已選殖之部分小鼠抗阻遏子元件40片段的完整序列：

(5) pScinoDP9mir-DHFR載體

使用類似於構築pScinoDP8mir-DHFR載體所用者之程序，且用CAG啟動子(與雞β肌動蛋白啟動子融合之CMV-IE增強子)取代pScinoDP8mir-DHFR中之兩個CMV增強子，來構築pScinoDP9mir-DHFR載體(圖6) 。pScinoDP9mir-DHFR之完整序列以SEQ ID NO:13 顯示。

pScinoDP9mir-DHFR在MCSII與二氫葉酸還原酶(DHFR)編碼區之間含有腦心肌炎病毒(ECMV)之內部核糖體進入位點(IRES)。此特徵允許相關基因(例如選殖至MCSII中之輕鏈)及DHFR基因自單一雙效mRNA轉譯。側接DHFR之序列已轉化為Kozak一致性轉譯起始位點以進一步提高真核細胞中之轉譯效率。pScinoDP9mir-DHFR中之MCSI位於CMV之即刻早期啟動子(PCMV IE)與SV40聚腺苷酸化信號序列之間。MCSI下游的SV40聚腺苷酸化信號指導第一次轉錄的3'端的正確加工。pScinoDP-dhfr中之MCSII位於細胞巨大病毒之第二即刻早期啟動子(PCMV IE)與IRES序列之間。DHFR基因下游的SV40聚腺苷酸化信號指導雙效mRNA之3'端的正確加工。

因為pScinoDP9mir-DHFR源自pEGFP-N1載體，所以其含有表現SV40 T抗原之哺乳動物細胞中的SV40複製起點。由SV40早期啟動子、Tn5之新黴素/康黴素(kanamycin)抗性基因及疱疹單純型病毒胸苷激酶(HSV TK)基因之聚腺苷酸化信號組成的新黴素抗性卡匣(Neo^r )容許利用G418來篩選已穩定轉染之真核細胞。此卡匣上游之細菌啟動子在大腸桿菌中表現康黴素抗性。pScinoDP-DHFR骨架亦含有用於在大腸桿菌中擴增之pUC複製起點及用於單股DNA生產之f1起點。

(6) pGFP/嘌呤黴素載體

藉由使用pIRES2-EGFP及pLKO-AS3w-puro質體作為模板進行PCR擴增來獲得IRES序列及DHFR基因。藉由重疊延伸PCR(OL-PCR)來獲得IRES序列片段及嘌呤黴素基因片段(IRES2-嘌呤黴素)之雜合體。將IRES2-嘌呤黴素片段插入經SalI-BamHI消化之pFLAG-CMV2載體(Kodak)。所得構築體命名為pIRES2-Puro。自pEGFP-N1載體獲得EGFP基因且將其插入pIRES-Puro載體以形成pGFP/嘌呤黴素載體。

(7) pScinoDP9mir-賀癌平(Herceptin)-DHFR載體

pScinoDP9mir-賀癌平-DHFR載體之構築在圖7 中顯示。簡言之，自寡聚合成骨架片段PCR擴增4-1前導序列及4-2前導序列，同時自含有人類IgG₁ 序列之重組質體獲得人類IgG₁ 之重鏈恆定區序列(hIgG₁ C_H )及人類IgG₁ 之輕鏈恆定區序列(hIgG₁ C_L )。藉由將hIgG₁ 恆定區藉助於定向鍵聯次選殖至含有前導序列之載體中來獲得前導序列及hIgG₁ 恆定區序列載體雜合體。

接著，經由自寡聚合成骨架片段進行反覆重疊PCR來產生重鏈可變區(V_H )及輕鏈可變區(V_L )，且將其次選殖至p4-1前導序列-hIgG₁ C_H 載體或p4-2前導序列-hIgG₁ C_L 載體。在校正PCR錯誤及移除在選殖過程中引入之額外序列之後，藉由定序來檢驗前導序列-肽-賀癌平VC序列之正確度。

最後，將4-1前導序列-賀癌平重鏈雜合體(4-1-賀癌平VC_H )及4-2前導序列-賀癌平輕鏈(4-2-賀癌平VC_L )個別地選殖至pScinoDP9mir-DHFR載體中之MCSI位點及MCSII位點以形成pScinoDP9mir-賀癌平-DHFR載體(圖7 )。

抗HER2重鏈1之可變區的胺基酸序列及核苷酸序列分別以SEQ ID NO:14及15 顯示。用於重鏈可變區(V_H )的骨架片段及PCR引子具有以下序列：

骨架片段：

賀癌平V_H -L₁ (+)(108個基體)

賀癌平V_H -L2(-)(105個基體)

賀癌平V_H -R1(+)(105個基體)

賀癌平V_H -R2(-)(108個基體)

用於擴增的引子：

賀癌平-V_H -5HindIII(30個基體)(有義)

賀癌平-V_H -3ApaI(30個基體)(反義)

抗HER2輕鏈1之可變區的胺基酸序列及核苷酸序列分別以SEQ ID NO:22及23 顯示。用於輕鏈可變區(V_L )的骨架片段及PCR引子具有以下序列：

骨架片段：

賀癌平V_L -L1(+)(93個基體)

賀癌平V_L -L2(-)(95個基體)

賀癌平V_L -R1(+)(94個基體)

賀癌平V_L -R2(-)(93個基體)

用於擴增的引子

賀癌平-V_L -5HindIII(30個基體)(有義)

賀癌平-V_L -3HindIII(30個基體)(反義)

實例3：建立賀癌平/CHO ^+GFP/-dhfr 細胞株

將CHO^/+GFP/-dhfr 細胞懸浮於PBS緩衝液中。向細胞中添加40 μg線性化質體(pScinoDP9mir-賀癌平-DHFR)DNA且在冰上培育10分鐘。接著藉由在750 V之電壓設定及25 μF之電容設定下之兩個脈衝(具有電容擴充器之Gene Pulser II，及購自Bio-Rad之脈衝控制器)對細胞進行電穿孔。將經電穿孔之細胞塗在含有25 mL培養基(補充有HT、10% FBS、2 μM MTX及5 μg/ml嘌呤黴素二鹽酸鹽之IMDM)之T-175燒瓶中歷時24小時。接著使用800 μg/ml G418硫酸鹽(Calbiochem，目錄號345810)於補充有10% D-FBS(Gibco，目錄號30067-334)及5 μg/ml嘌呤黴素二鹽酸鹽的最低必需培養基α培養基(α-MEM，Gibco，目錄號12000)中篩選細胞。在補充有10% D-FBS及選擇抗生素之α-MEM培養基中篩選14天之後，對細胞進行遞增濃度MTX處理以擴增基因。

FACS分選細胞以篩選低GFP螢光強度的細胞。因為目標基因及shRNA^GFP 的表現會導致CHO^+GFP/-dhfr 細胞中之GFP產量降低，所以綠色螢光最少的(GFP陰性)細胞具有最高的目標基因表現量。利用裝配有Summit軟體之MoFlo^TM XDP(Beckman Coulter)、在488 nm下發出之雷射及細胞保存單元進行FACS分選。

利用FACS使單一細胞保存至含有220 μl補充有10% D-FBS、G418、嘌呤黴素二鹽酸鹽及MTX之α-MEM的96孔細胞培養盤中來分選低螢光及高螢光細胞群體。在37℃及5%二氧化碳下在含濕氣培育箱中培育純系12天。

實例4：賀癌平/CHO ^+GFP/-dhfr 細胞株之表徵 (1)藉由免疫染色偵測表面抗體

將經胰蛋白酶處理之賀癌平/CHO^+GFP/-dhfr 細胞在200 rpm下離心5分鐘。用PBS洗滌細胞2次且將其再懸浮於PBS中，達到約1×10⁷ 細胞/毫升之最終濃度。接著用藻紅素(PE)結合小鼠抗人類IgG(Fc)(Beckman Coulter，目錄號736007)，根據製造商之建議，以各種稀釋度在4℃在黑暗中培育細胞30分鐘，用PBS洗滌2次且保持於冰上以用於FACS分析。

(2)藉由ELISA偵測分泌抗體

簡言之，用在0.05 M碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液(pH 9.7)中稀釋之抗人類IgG抗體(Sigma：I 1886)塗佈96孔盤，且在4℃培育16小時。在37℃下用阻斷緩衝液(10 mM Tris、0.15 M NaCl、1%脫脂牛奶，pH 8.0)阻斷孔盤30分鐘。將培養上清液加入於孔洞中且在37℃下培育2小時。辣根過氧化酶結合抗人類IgG-F(c)抗體(Abcam：ab7499)，根據製造商之建議在稀釋緩衝液(10 mM Tris、0.15 M NaCl、0.05% Tween 20，pH 8.0)中稀釋，且在37℃下培育1小時。利用受質(1-step^TM ultra TMB-ELISA，Pierce，目錄號34028)偵測反應且在微量板讀取儀(Bio-Rad)上讀取孔盤。

(3)結果

圖8 呈現利用FACS在不同螢光強度下分選之賀癌平(CHO^/+GFP/-dhfr )細胞的直方圖曲線。圖A顯示賀癌平CHO^/+GFP/-dhfr 細胞群中之GFP螢光。基於螢光強度將細胞分成若干亞群(R2、R3及R4)。圖B-D顯示各亞群中之GFP表現量。圖E顯示群及各亞群中之抗賀癌平抗體效價。數據顯示最低GFP螢光含量的細胞(賀癌平/R4/(CHO^/+GFP/-dhfr ))具有最高抗賀癌平效價。

圖9 顯示當用含有目標蛋白(賀癌平)及shRNAi^GFP 之DNA構築體轉染時，CHO^/+GFP/-dhfr 細胞中之GFP表現量降低。FACS曲線顯示在兩輪MTX攻毒之後GFP表現量進一步降低(圖C及D)。此等結果表明目標基因擴增量與GFP表現量及基因擴增強度有關。

圖10 顯示經PE結合小鼠抗人類IgG(Fc)染色之賀癌平/CHO^/+GFP/-dhfr 細胞的代表性FACS分析。結果顯示抗體產生細胞(亦即PE染色較深的細胞)展現低GFP表現量。

圖11A 顯示賀癌平(CHO^/+GFP/-dhfr )細胞之直方圖曲線。橫條及陰影區域指示用於單一細胞分析的低螢光及高螢光細胞群體。圖11B 顯示18個低螢光細胞純系中有8個產生大於0.3之ELISA值，而18個高螢光細胞純系中僅有2個產生大於0.3之ELISA值。此等結果顯示低螢光細胞群體含有較高頻率之高產量抗體產生細胞，且證實了基於GFP之反向篩選策略。

圖12 顯示CHO^+GFP/-dhfr 細胞中之GFP表現因編碼賀癌平(圖A-C)及shRNA^GFP 之DNA構築體之轉染而降低。

(4)結論

使用shRNAmir^eGFP 併用流式細胞儀可實質上改良細胞株發展的兩個關鍵點之精確度及效率。首先，就早期純系篩選而言，FACS方法相較於分析培養基中之治療蛋白效價，為更好的純系生產率預測法。其次，藉由在擴增階段所觀測之螢光增加，可容易地識別轉殖基因表現不穩定的純系。因此，本發明方法提供精確96-孔純系篩選法相較於傳統方法之新穎益處：其可在發展過程之較早階段識別良好候選者以供進一步發展及去除不穩定純系。

此等結果顯示本發明之DNA構築體及篩選方法可靠地得到高表現純系同源蛋白製劑。由於並非藉由限數稀釋技術來篩選多個個別純系，以分離能夠高產率表現重組抗體的哺乳動物細胞株，所以該程序耗費較少人力且可顯著縮短產生用於生物生產之純系所需的時間。該程序不需要額外試劑來選擇純系且額外提供了監測基因組穩定性之益處。目標基因之表現量亦與擴增基因之強度具有更大相關性。雙效設計容許兩個外來基因在同一染色體中同時表現。抑制性方法藉由降低報導基因擴增之強度來增強目標基因擴增之強度。使用ARE可藉由消除由外來基因插入不同染色體區域之抑制作用所引起的差異來增加外來重組蛋白之表現。

圖1 為基於GFP之篩選策略進行高轉殖基因表現細胞純系之圖。

圖2 為表現載體pScinoDP-DHFR之圖譜。

圖3 為表現載體pScinoDP3-DHFR之圖譜。

圖4 為表現載體pScinoDP3mir-DHFR之圖譜。

圖5 為表現載體pScinoDP8mir-DHFR之圖譜。

圖6 為表現載體pScinoDP9mir-DHFR之圖譜。

圖7 為顯示表現載體pScinoDP9mir-賀癌平-DHFR之構築的圖。

圖8 為顯示賀癌平-CHO^+GFP /^-dhfr 細胞中之GFP表現及抗體表現的複合圖。圖A為賀癌平-CHO^/+GFP/-dhfr 細胞之FACS直方圖曲線。圖B-C為在不同螢光強度下分選之賀癌平-CHO^/+GFP/-dhfr 細胞的FACS直方圖曲線。圖E為自不同螢光群體分選之細胞之抗體產量的ELISA分析。

圖9 為顯示在多輪篩選之後賀癌平-CHO^+GFP /^-dhfr 細胞中之GFP表現的複合圖。圖A為在GFP表現之後CHO^/-dhfr 細胞的FACS直方圖曲線。圖B為在G418選擇之後賀癌平-CHO^/+GFP/-dhfr 細胞的FACS直方圖曲線。圖C為在第一輪MTX(100 nM)擴增之後賀癌平-CHO^/+GFP/-dhfr 細胞的FACS直方圖曲線。圖D為在第二輪MTX(200 nM)擴增之後賀癌平-CHO^/+GFP/-dhfr 細胞的FACS直方圖曲線。

圖10 為顯示用PE結合抗人類IgG(Fc)抗體染色之賀癌平-CHO^+GFP /^-dhfr 細胞的FACS分析的圖。根據實驗設計，分泌抗體之細胞呈PE陽性及GFP陰性，且在左上方之圖中顯示。螢光信號由FACS測定且由標準補償方案來校正。

圖 11 顯示賀癌平-CHO^+GFP /^-dhfr 細胞之FACS分選程序的主要特徵，及ELISA結果。圖A為賀癌平(CHO/+GFP/-dhfr)細胞的FACS直方圖曲線。橫條及灰色區域指示用於單一細胞分析的低螢光及高螢光細胞群體。圖B為選自低螢光或高螢光群體之各個別純系藉由ELISA偵測之抗體表現量。

圖12 為顯示經編碼shRNA^GFP 及賀癌平之DNA構築體轉染的細胞中GFP表現的FACS分析的複合圖(圖C)。

<110> 台灣神隆股份有限公司

<120> 通過抑制報告基因表現量的手段進行高產量細胞株選殖之策略

<130> TBA

<140> 099128012

<141> 2010-08-20

<160> 29

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工

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<223> 合成寡聚物

<400> 1

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

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<223> 合成寡聚物

<400> 2

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<212> DNA

<213> 人工

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<212> DNA

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<223> 合成寡聚物

<400> 5

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<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡聚物

<400> 6

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<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡聚物

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<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡聚物

<400> 8

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<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡聚物

<400> 9

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<212> DNA

<213> 人工

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<223> 合成寡聚物

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<212> DNA

<213> 人工

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<223> 合成寡聚物

<400> 11

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<211> 370

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 12

<210> 13

<211> 9729

<212> DNA

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<220>

<223> 質體

<400> 13

<210> 14

<211> 124

<212> PRT

<213> 人類

<400> 14

<210> 15

<211> 372

<212> DNA

<213> 人類

<400> 15

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<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡聚物

<400> 16

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<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡聚物

<400> 17

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<211> 105

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡聚物

<400> 18

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<212> DNA

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<210> 20

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<212> DNA

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<400> 20

<210> 21

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<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成寡聚物

<400> 21

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<212> PRT

<213> 人類

<400> 22

<210> 23

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<212> DNA

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<212> DNA

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<223> 合成寡聚物

<400> 29

(無元件符號說明)

Claims (20)

1. 一種篩選目標蛋白高表現量之細胞之方法，其包含：將具有編碼目標蛋白及宿主細胞內源性篩選標記之抑制子兩者的DNA構築體引入至複數個宿主細胞中，其中該DNA構築體經配置成於該宿主細胞內表現該目標蛋白及該抑制子兩者；針對該內源性篩選標記之表現來篩選含有該DNA構築體之宿主細胞；及分離該篩選標記表現量低的細胞。
2. 如請求項1之方法，其中該抑制子係選自由小干擾RNA(siRNA)、小髮夾狀RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、miRNA與shRNA之雜合體及反義RNA組成之群。
3. 如請求項1之方法，其中該抑制子為shRNA。
4. 如請求項1之方法，其中該內源性選擇標記為螢光標記，且其中該分離步驟包含用螢光活化細胞分選儀(FACS)分選細胞。
5. 如請求項1之方法，其中該DNA構築體進一步編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)，且其中該等宿主細胞為DHFR缺陷型細胞。
6. 一種篩選轉殖基因表現細胞之高產能篩選方法，其包含：用載有至少一種轉殖基因及抑制螢光蛋白表現之干擾RNA的載體轉染該等細胞；量測該等經轉染之細胞中之螢光強度；及 分離螢光強度低於未經轉染細胞之螢光強度之細胞。
7. 如請求項6之方法，其中該螢光蛋白為綠色螢光蛋白(GFP)。
8. 如請求項6之方法，其中該干擾RNA為mir-30-baesd之shRNA。
9. 如請求項6之方法，其中該分離步驟包含使用螢光活化細胞分選儀(FACS)分選細胞。
10. 如請求項6之方法，其中該等表現螢光蛋白之細胞為二氫葉酸還原酶(DHFR)缺陷型CHO細胞。
11. 如請求項6之方法，其中該至少一種轉殖基因經由內部核糖體進入位點(IRES)連接於編碼DHFR之基因。
12. 一種表現載體，其用於高產能篩選含有該表現載體之細胞，其包含：包含編碼治療分子之蛋白質、肽或多肽之轉殖基因之第一核苷酸序列；編碼宿主細胞外源性篩選標記之第二核苷酸序列；編碼宿主細胞內源性篩選標記之抑制子之第三核苷酸序列；及一或多個控制該第一核苷酸序列、該第二核苷酸序列及該第三核苷酸序列在該宿主細胞中表現的調控元件；其中該第一核苷酸序列經由內部核糖體進入位點(IRES)連接於該第二核苷酸序列，及其中該第三核苷酸序列位於3’非編碼區之前。
13. 如請求項12之表現載體，其另外包含一或多個抗阻遏子 元件。
14. 如請求項13之表現載體，其中該一或多個抗阻遏子元件包括部分小鼠抗阻遏子元件40。
15. 如請求項12之表現載體，其中該抑制子為干擾RNA。
16. 如請求項15之表現載體，其中該干擾RNA為miR-30-based之shRNA。
17. 如請求項12之表現載體，其中該內源性篩選標記為螢光蛋白。
18. 如請求項17之表現載體，其中該螢光蛋白為綠色螢光蛋白。
19. 如請求項12之表現載體，其中該外源性篩選標記為二氫葉酸還原酶。
20. 如請求項12之表現載體，其中該一或多個調控元件包括CMV IE增強子。