JP5797192B2 - 細胞クローンのための阻害に基づくハイスループットスクリーニング方法 - Google Patents

細胞クローンのための阻害に基づくハイスループットスクリーニング方法 Download PDF

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Description

関連出願
本願は、２００９年６月１１日に出願された米国仮出願第６１／２１３，４５９号の優先権を主張するものであり、参照によりその全体を本明細書に組み入れるものとする。
開示される技術は、一般的に、バイオテクノロジー及び分子生物学に関し、特に、細胞クローンのハイスループットスクリーニングに関する。
組み換えタンパク質を産生する細胞系統の作製における重要なステップは、生きているクローンの選択と、それに続く、対象となる遺伝子の宿主細胞への取り込みである。工業規模でのバイオ生産のためには、生成物の遺伝子が安定して取り込まれており、高レベルでタンパク質生成物が得られることが非常に望ましい。
不均一な集団において、宿主ゲノム中への組み換え遺伝子の組み込みは、大部分はランダムなイベントである。安定して組み込まれた遺伝子を複数のコピー含む細胞の割合は、低いコピー数を含む細胞と比較して、小さいであろう。高産生サブクローンは珍しく、より速く増殖する無産生または低産生細胞によって希釈される傾向がある。したがって、産生率の増大したサブクローンを単離するためには、多くのウェルをスクリーニングし、調べる必要があり得る。一般的に、限界希釈法は単調であり、多大な時間を必要とする。
フローサイトメトリーおよび細胞選別を利用する選択方法の出現は、スクリーニングし得る細胞の数を大きく増加させた。数百万の細胞を短時間にスクリーニングすることができ、サブ集団および単一の細胞を、それらが集団内で10−6の低い頻度で存在する場合であっても、混合細胞集団内から単離することができる。
フローサイトメトリーは、高レベルで標的タンパク質を産生するクローンの迅速かつ初期段階での同定のために、非蛍光レポータータンパク質と組み合わせた。このことは、抗体を利用し得ることにより容易になり、リガンドを結合させた蛍光色素によって、細胞表面タンパク質の発現に基づく細胞の単離が可能となる。例えば、（通常、宿主細胞において発現されない）細胞表面タンパク質を、レポーターとして標的タンパク質と共に発現させてもよい。
表面での発現と生産性との間に相関性が存在しない場合、細胞は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等のレポーター分子を用いて、細胞内タンパク質のレベルに基づいて単離することができる。ＧＦＰは、遺伝子発現のための、ならびに、誘導性遺伝子産物に基づく細胞の選択のための重要なレポーターとなっている。哺乳動物細胞系統において、ＧＦＰは、組み換えタンパク質との共発現による高産生クローンの選択のため、ならびに、蛍光強度の基づく選択のために使用されている。ＧＦＰ蛍光強度と組み換えタンパク質産生との間の相関性は、様々な組み換えタンパク質を発現するいくつかの細胞系統について見られている。しかしながら、これらの選択マーカーの発現は、細胞中のタンパク質発現機構における負担を増大させ、標的タンパク質の産生を低下させる。
本発明の一態様は、標的タンパク質を高レベルで発現する細胞をスクリーニングするための方法に関する。本方法は、標的タンパク質と宿主細胞内の内因性選択マーカーに対する阻害物質の両方をコードするＤＮＡ構築物を複数の宿主細胞中に導入するステップと、内因性選択マーカーの発現についてＤＮＡ構築物を含む宿主細胞をスクリーニングするステップと、選択マーカーの発現が低下した細胞を単離するステップを含む。ＤＮＡ構築物は、宿主細胞内で標的タンパク質と阻害物質の両方を発現するように構成されている。
一実施形態において、阻害物質は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡとｓｈＲＮＡのハイブリッド、およびアンチセンスＲＮＡからなる群より選択される。
別の実施形態において、阻害物質は、ｓｈＲＮＡである。
別の実施形態において、内因性選択マーカーは、蛍光マーカーであり、かつ、単離ステップは、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いて細胞を選別するステップを含む。
別の実施形態において、ＤＮＡ構築物は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をさらにコードし、かつ、宿主細胞は、ＤＨＦＲ欠損細胞である。
本発明の別の態様は、導入遺伝子を発現する細胞を選択するためのハイスループットスクリーニング方法に関する。本方法は、少なくとも１つの導入遺伝子と蛍光タンパク質の発現を阻害する干渉ＲＮＡとを担持するベクターを用いて蛍光タンパク質を発現する宿主細胞をトランスフェクトするステップと、トランスフェクト細胞において蛍光強度を測定するステップと、非トランスフェクト細胞の蛍光強度よりも低い蛍光強度を有する細胞を単離するステップ、を含む。
一実施形態において、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。
別の実施形態において、干渉ＲＮＡは、ｍｉｒ−３０に基づくｓｈＲＮＡである。
別の実施形態において、単離ステップは、ＦＡＣＳを用いて細胞を選別するステップを含む。
別の実施形態において、蛍光タンパク質を発現する細胞は、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞である。
別の実施形態において、少なくとも１つの導入遺伝子は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって、ＤＨＦＲをコードする遺伝子と連結している。
本発明の別の態様は、発現ベクターを含む細胞をハイスループットスクリーニングするための発現ベクターに関する。発現ベクターは、標的タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列と、宿主細胞のための外因性選択マーカーをコードする第２のヌクレオチド配列と、宿主細胞内の内因性選択マーカーに対する阻害物質をコードする第３のヌクレオチド配列と、宿主細胞においてこれらの第１、第２および第３のヌクレオチド配列の発現を制御する１つ以上の調節エレメントを含む。第１のヌクレオチド配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって、第２のヌクレオチド配列と連結している。
一実施形態において、発現ベクターは、１つ以上の抗リプレッサーエレメントをさらに含む。
関連する実施形態において、１つ以上の抗リプレッサーエレメントは、部分的マウス抗リプレッサーエレメント４０を含む。
別の実施形態において、阻害物質は、干渉ＲＮＡである。
関連する実施形態において、干渉ＲＮＡは、ｍｉＲ−３０に基づくｓｈＲＮＡである。
別の実施形態において、内因性選択マーカーは、蛍光タンパク質である。
関連する実施形態において、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質である。
別の実施形態において、外因性選択マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼである。
別の実施形態において、１つ以上の調節エレメントは、ＣＭＶ ＩＥエンハンサーを含む。
図１は、導入遺伝子高発現細胞クローンのためのＧＦＰに基づくスクリーニング方法を示す図表である。 図２は、発現ベクターｐＳｃｉｎｏＤＰ−ＤＨＦＲのマップである。 図３は、発現ベクターｐＳｃｉｎｏＤＰ３−ＤＨＦＲのマップである。 図４は、発現ベクターｐＳｃｉｎｏＤＰ３ｍｉｒ−ＤＨＦＲのマップである。 図５は、発現ベクターｐＳｃｉｎｏＤＰ８ｍｉｒ−ＤＨＦＲのマップである。 図６は、発現ベクターｐＳｃｉｎｏＤＰ９ｍｉｒ−ＤＨＦＲのマップである。 図７Ａおよび図７Ｂは、発現ベクターｐＳｃｉｎｏＤＰ９ｍｉｒ−ハーセプチン−ＤＨＦＲの構築を示す図表である。 図７Ａおよび図７Ｂは、発現ベクターｐＳｃｉｎｏＤＰ９ｍｉｒ−ハーセプチン−ＤＨＦＲの構築を示す図表である。 図８は、ハーセプチン−ＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞におけるＧＦＰ発現および抗体発現を示す複合図である。パネルＡ：ハーセプチン−ＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞のＦＡＣＳヒストグラムプロファイル。パネルＢ−Ｃ：異なる蛍光強度レベルで選別されたハーセプチン−ＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞のＦＡＣＳヒストグラムプロファイル。パネルＥ：異なる蛍光群から選別された細胞の抗体産生のＥＬＩＳＡ分析。 図８は、ハーセプチン−ＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞におけるＧＦＰ発現および抗体発現を示す複合図である。パネルＡ：ハーセプチン−ＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞のＦＡＣＳヒストグラムプロファイル。パネルＢ−Ｃ：異なる蛍光強度レベルで選別されたハーセプチン−ＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞のＦＡＣＳヒストグラムプロファイル。パネルＥ：異なる蛍光群から選別された細胞の抗体産生のＥＬＩＳＡ分析。 図９は、複数回の選択後のハーセプチン−ＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞におけるＧＦＰ発現を示す複合図である。パネルＡ：ＧＦＰ発現後のＣＨＯ／−ｄｈｆｒ細胞のＦＡＣＳヒストグラムプロファイル。パネルＢ：Ｇ４１８選択後のハーセプチン−ＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞のＦＡＣＳヒストグラムプロファイル。パネルＣ：１回目のＭＴＸ（１００ｎＭ）増幅後のハーセプチン−ＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞のＦＡＣＳヒストグラムプロファイル。パネルＤ：２回目のＭＴＸ（２００ｎＭ）増幅後のハーセプチン−ＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞のＦＡＣＳヒストグラムプロファイル。 図９は、複数回の選択後のハーセプチン−ＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞におけるＧＦＰ発現を示す複合図である。パネルＡ：ＧＦＰ発現後のＣＨＯ／−ｄｈｆｒ細胞のＦＡＣＳヒストグラムプロファイル。パネルＢ：Ｇ４１８選択後のハーセプチン−ＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞のＦＡＣＳヒストグラムプロファイル。パネルＣ：１回目のＭＴＸ（１００ｎＭ）増幅後のハーセプチン−ＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞のＦＡＣＳヒストグラムプロファイル。パネルＤ：２回目のＭＴＸ（２００ｎＭ）増幅後のハーセプチン−ＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞のＦＡＣＳヒストグラムプロファイル。 図１０は、ＰＥを結合させた抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を用いて染色したハーセプチン−ＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞のＦＡＣＳ分析を示す図表である。抗体分泌細胞は、実験計画にしたがいＰＥ陽性、ＧＦＰ陰性であり、左上パネルに示した。蛍光シグナルは、ＦＡＣＳによって測定し、標準的補正プロトコールを用いて較正した。 図１１は、ハーセプチン−ＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞のＦＡＣＳ選別手順の重要な特徴およびＥＬＩＳＡの結果を示す。パネルＡ：ハーセプチン−ＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞のＦＡＣＳヒストグラムプロファイル。横棒および灰色の領域は、１回の細胞分析のために使用された低蛍光および高蛍光細胞群を示す。パネルＢ：低蛍光群または高蛍光群から選択されたそれぞれ個々のクローンについてのＥＬＩＳＡによって検出された抗体発現レベル。 図１２は、ｓｈＲＮＡＧＦＰおよびハーセプチンをコードするＤＮＡ構築物を用いてトランスフェクトした細胞におけるＧＦＰ発現のＦＡＣＳ分析を示す複合図である。
詳細な説明
外因性タンパク質を高レベルで発現する細胞をスクリーニングするための方法が開示される。一実施形態において、本方法は、標的タンパク質と宿主細胞内の内因性選択マーカーに対する阻害物質の両方をコードするＤＮＡ構築物を複数の宿主細胞中に導入するステップであって、この場合、ＤＮＡ構築物は、宿主細胞内で標的タンパク質と阻害物質の両方を発現するように構成されている、ステップと、内因性選択マーカーの発現についてＤＮＡ構築物を含む宿主細胞をスクリーニングするステップと、内因性選択マーカーの発現が低下した細胞を単離するステップ、
を含む。
以下本明細書において使用される場合、用語「細胞」／「宿主細胞」ならびに「細胞系統」／「宿主細胞系統」はそれぞれ、典型的には、当技術分野において公知の方法によって細胞培養中で維持され、異種タンパク質を発現する能力を有する、真核生物細胞およびその均一群として定義される。一実施形態において、細胞はＣＨＯ細胞である。別の実施形態において、細胞は、内因性選択マーカーとしてＧＦＰを発現するＣＨＯ細胞である。別の実施形態において、細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損し、内因性選択マーカーとしてＧＦＰを発現する、ＣＨＯ細胞である。
以下本明細書において使用される場合、用語「発現」は、典型的には、細胞における、特定のＲＮＡ産物もしくは複数の産物、または、特定のタンパク質もしくは複数のタンパク質の産生のことをいうために使用される。ＲＮＡ産物の場合、発現とは、転写のプロセスのことをいう。タンパク質産物の場合、発現とは、転写、翻訳、および、場合によっては、翻訳後修飾のプロセスのことをいう。分泌タンパク質の場合、発現とは、転写、翻訳、および、場合によっては、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、ジスルフィド結合形成等）と、それに続く、分泌のプロセスのことをいう。多量体タンパク質の場合、発現は、ポリペプチドモノマーからの多量体構造の組み立てを含む。名詞「発現」の対応する動詞は、名詞と類似の意味を有する。
以下本明細書において使用される場合、用語「選択マーカー」は、典型的には、その存在を細胞中で直接的または間接的に検出し得る遺伝子および／またはタンパク質、例えば、選択物質を不活性化し、その物質の致死性または増殖阻害性効果から宿主細胞を保護する遺伝子および／またはタンパク質（例えば、抗生物質耐性遺伝子および／またはタンパク質）のことをいうために使用される。別の可能性は、蛍光および呈色を引き起こす選択マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質および誘導体、ルシフェラーゼ、またはアルカリホスファターゼ）である。用語「内因性選択マーカー」とは、宿主細胞中へのＤＮＡ構築物の導入前に、宿主細胞中に存在するポリヌクレオチドによってコードされる選択マーカーのことをいう。「内因性選択マーカー」のコード配列は、組み込まれた形態（すなわち、細胞ゲノム中に組み込まれている）またはエピソーム形態のいずれかで存在し得る。
以下本明細書において使用される場合、用語「ＤＮＡ構築物」とは、発現または形質転換構築物のことをいう。ＤＮＡ構築物は、少なくとも１つの発現ユニットまたは発現カセットを含む。用語「発現ユニットまたは発現カセット」は、本明細書において、コード配列またはオープンリーディングフレームを発現し得る単位として定義される。「発現ユニットまたは発現カセット」は、典型的には、対象となる分子（すなわち、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）をコードする導入遺伝子と機能し得るように連結された１つ以上の調節エレメントを含む。
「調節エレメント」は、コード配列と機能し得るように連結させることにより、導入遺伝子の発現を調節する核酸配列である。調節配列の例としては、限定するものではないが、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；有効なＲＮＡプロセシングシグナル、例えば、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増大させる配列（すなわち、コザック共通配列）；タンパク質の安定性を増大させる配列；および、所望の場合、タンパク質分泌を増大させる配列が挙げられる。調節配列は、対象の遺伝子を制御するために、シス型もしくはトランス型立体配置で作用させてもよいし、または、少し離れて作用させてもよい。
「導入遺伝子」は、哺乳動物細胞に送達または移送される核酸配列である。導入遺伝子は、マーカー、レポーターまたは治療用分子として有用であるタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドをコードしてもよい。導入遺伝子はまた、タンパク質産生、診断アッセイのため、または、インビトロもしくはインビボでの任意の一過的もしくは安定的遺伝子の移送のために有用であるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードしてもよい。あるいは、導入遺伝子は、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたはその他の調節核酸等の機能性ポリヌクレオチドをコードしてもよい。導入遺伝子はまた、ＤＮＡ組み換えおよび遺伝子修復を引き起こすために使用されるＤＮＡ配列を含む。
核酸配列が別の核酸配列と機能的関係に配置されている時、核酸配列は、別の核酸配列と「機能し得るように連結」されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーペプチドのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのためのＤＮＡと機能し得るように連結されており；プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を与える場合、コード配列と機能し得るように連結されており；または、リボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置している場合、コード配列と機能し得るように連結されている。一般的に、「機能し得るように連結」とは、連結されるＤＮＡ配列が連続的であり、分泌リーダーの場合、連続的かつリーディングフェーズにあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続的である必要はない。連結は、便利な制限部位におけるライゲーションによって達成される。かかる部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の習慣にしたがって使用される。
「選択マーカーに対する阻害物質」は、選択マーカーの発現または活性を直接的または間接的に阻害するポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり得る。一実施形態において、阻害物質は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡとｓｈＲＮＡのハイブリッド、または、宿主細胞中で内因性選択マーカーの発現を阻害するアンチセンスＲＮＡ分子である。別の実施形態において、阻害物質は、宿主細胞中で選択マーカーの発現を阻害するポリペプチド（例えば、転写調節因子）である。さらに別の実施形態において、阻害物質は、選択マーカーの生物学的活性を阻害するポリペプチド（例えば、抗体）である。
本明細書において使用される場合、用語「ｓｉＲＮＡ」とは、約１０〜５０ヌクレオチド長（用語「ヌクレオチド」はヌクレオチドアナログを含む）、好ましくは、約１５〜２５ヌクレオチド長、より好ましくは、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長のＲＮＡ物質、好ましくは、二本鎖ＲＮＡ物質のことをいい、このＲＮＡ鎖は、場合によっては、ＲＮＡ干渉を指令または媒介し得る、例えば、１、２または３個のオーバーハングヌクレオチド（または、ヌクレオチドアナログ）を含むオーバーハング末端を有する。天然のｓｉＲＮＡは、細胞のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）機構によって、より長いｄｓＲＮＡ分子（例えば、２５ヌクレオチド長より長い分子）から生成される。
用語「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」とは、本明細書において使用される場合、標的分子（例えば、標的遺伝子、タンパク質またはＲＮＡ）がダウンレギュレートされることによる、配列特異的または配列選択的プロセスのことをいう。特定の実施形態において、「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」のプロセスは、ＲＮＡ分子（例えば、細胞内のＲＮＡ分子）の分解を特徴とし、この分解は、ＲＮＡ物質によって引き起こされる。分解は、酵素的ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって触媒される。ＲＮＡｉは、外来ＲＮＡ（例えば、ウイルスＲＮＡ）を除去するために、天然で細胞中において起こる。天然のＲＮＡｉは、その他の類似のＲＮＡ配列に対する分解的機構を指令する遊離のｄｓＲＮＡから切断された断片を介して進行する。あるいは、ＲＮＡｉは、標的遺伝子の発現をサイレンシングするために、細胞中へ低分子干渉ＲＮＡ分子を導入することにより開始させることができる。
以下本明細書において使用される場合、用語「ｓｈＲＮＡ」とは、第１の相補的配列領域と第２の相補的配列領域を含むステムループ構造を有するＲＮＡ物質のことをいい、相補性の程度および領域の方向性は、領域間で塩基対合が起こるのに十分であり、第１および第２の領域は、ループ領域によって結合されており、ループ領域は、ループ領域内のヌクレオチド（または、ヌクレオチドアナログ）間の塩基対合の欠如により生じる。ｓｈＲＮＡヘアピン構造は、細胞機構により切断されｓｉＲＮＡとなり、これは次に、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体は、ｍＲＮＡと結合してｍＲＮＡを切断し、これは、ｍＲＮＡと結合するｓｉＲＮＡと匹敵する。
ＤＮＡ構築物は、ＤＮＡ構築物の構築時に、細菌の複製および選択のためのプラスミドエレメントをさらに含んでもよい。ＤＮＡ構築物はまた、宿主細胞中でＤＮＡ構築物の増幅を促進するその他の選択マーカーを含んでもよい。ＤＮＡ構築物によってコードされる選択マーカーは、外因性選択マーカーと考えられる。外因性選択マーカーの例としては、限定するものではないが、抗生物質に対する耐性（例えば、Ｇ４１８に対する耐性をコードするネオマイシン遺伝子）または酵素アナログに対する耐性（例えば、メトトレキサート耐性をコードするジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子）が挙げられる。
一実施形態において、ＤＮＡ構築物は、２シストロン性発現カセットを含み、発現カセット中、対象となるタンパク質のオープンリーディングフレームは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって、外因性選択マーカーのコード配列または内因性マーカーの阻害物質のコード配列と連結しており、その結果、それらは、同じｍＲＮＡに転写されるが、独立して翻訳される。それらはそれぞれ共通のｍＲＮＡから生じるので、外因性選択マーカーの発現レベルまたは阻害物質の発現レベルは、各クローンについて対象となるタンパク質の相対的発現レベルを正確に予測する。好ましくは、２シストロン性発現カセット中の対象となるタンパク質のオープンリーディングフレームは、外因性選択マーカーのコード配列または内因性選択マーカーの阻害物質のコード配列の上流に位置する。
例えば、複数回のメトトレキサート（ＭＴＸ）増幅の正確性およびスループットを向上させるために、治療用タンパク質（例えば、抗体の軽鎖）をコードする遺伝子は、ＩＲＥＳによって、３’末端において外因性選択マーカー（例えば、ＤＨＦＲ）と連結し、その結果、それらは、同じｍＲＮＡに転写されるが、独立して翻訳される。５’キャップが介在する翻訳と比較して低い効率のＩＲＥＳが介在する翻訳は、細胞資源が、ＤＨＦＲタンパク質よりはむしろ治療用タンパク質の産生のために主として利用されることを確実にする。しかしながら、それらは、同じｍＲＮＡから生じるので、ＤＨＦＲの増幅レベルは、各クローンについて治療用タンパク質の相対的発現レベルを正確に予測する。
別の実施形態において、ＤＮＡ構築物は、クロマチンが関連する抑制を妨げる１つ以上の抗リプレッサーエレメント（ＡＲＥ）をさらに含む。以下本明細書において使用される場合、ＡＲＥ（または、抗リプレッサー配列、この語は、本明細書において互換的に使用される）は、導入遺伝子の抑制をブロックするその能力に基づいて真核生物ゲノムから単離される天然のＤＮＡエレメントである。ＡＲＥは、シス型立体配置にある遺伝子の転写に影響を及ぼす能力を有し、かつ／または、安定化および／または促進効果をもたらす。ＡＲＥが導入遺伝子と隣接する場合、ランダムに選択された組み換え細胞系統の導入遺伝子発現レベルは、導入遺伝子のプロモーターの最大限の潜在能力的発現に近づくレベルに増大され得ることが示されている。さらに、導入遺伝子の発現レベルは、長期に亘る細胞世代を通じて安定であり、確率論的サイレンシングを示さない。したがって、ＡＲＥは、従来のトランスジェニック系では不可能である、導入遺伝子に対する一定の割合の位置独立的発現を可能にする。位置独立性とは、導入遺伝子のサイレンシングを生じ得るゲノムの位置に組み込まれる導入遺伝子が、ＡＲＥの保護によって、転写的に活性な状態に維持されることを意味する。一実施形態において、ＡＲＥは、部分的マウスＡＲＥ４０断片である。別の実施形態において、ＤＮＡ構築物は、複数の部分的マウスＡＲＥ４０断片を含む。
ＤＮＡ構築物を細胞中へ導入するための方法は、当技術分野において周知である。かかる方法の例としては、限定するものではないが、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、およびＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクションが挙げられる。ＤＮＡ構築物はまた、ウイルスベクターによって細胞中に導入してもよい。一般的に使用されるウイルスベクターとしては、限定するものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターが挙げられる。
ＤＮＡ構築物を用いてトランスフェクトされた細胞は、外因性及び内因性選択マーカーの両方の発現についてスクリーニングされる。ＤＮＡ構築物からの選択マーカー阻害物質の発現が高レベルであれば、発現および／または活性が低下した内因性選択マーカーを生じるであろう。次に、導入遺伝子の発現のレベルおよび安定性を調べるために、選択マーカーの発現が低下した細胞が単離およびサブクローニングされる。
特定の実施形態において、内因性選択マーカーは、蛍光を照射するように誘導され得るタンパク質である。これらの実施形態において、スクリーニングステップおよび単離ステップは、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いることにより同時に行うことができる。
その他の実施形態において、ＤＮＡ構築物を用いてトランスフェクトした細胞は、最初に、外因性マーカーを用いた１回以上の選択に供する（例えば、Ｇ４１８耐性および／またはメトトレキサート耐性クローンの選択）。選択された細胞を、次に、発現および／または活性が低下した内因性選択マーカーについてスクリーニングする。
ＤＮＡ構築物を含む細胞のハイスループットスクリーニングを可能にするように構成されたＤＮＡ構築物も開示される。一実施形態において、ＤＮＡ構築物は、標的タンパク質のコード配列と、宿主細胞中の内因性選択マーカーに対する阻害物質のコード配列を含み、ＤＮＡ構築物は、宿主細胞内で標的タンパク質と阻害物質の両方を発現するように構成されている。
一実施形態において、阻害物質は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡとｓｈＲＮＡのハイブリッド、または、宿主細胞中で内因性選択マーカーの発現を阻害するアンチセンスＲＮＡ分子である。
別の実施形態において、阻害物質は、宿主細胞中で内因性選択マーカーの発現を阻害するポリペプチド（例えば、転写調節因子）である。
別の実施形態において、阻害物質は、内因性選択マーカーの生物学的活性を阻害するポリペプチド（例えば、抗体）である。
別の実施形態において、内因性選択マーカーは、蛍光を生じさせるタンパク質である。
別の実施形態において、ＤＮＡ構築物は、１つ以上の抗リプレッサーエレメントをさらに含む。
本発明において開示される技術は、不均一なトランスフェクト細胞群からの高産生クローンの迅速な同定および単離を可能にし、標準的な限界希釈クローニング方法に関連する労力と時間を減少させる。さらに、本技術は、細胞群中において稀有なイベント状態にある所望の細胞を同定し得ることから、高産生クローンの単離前にプール増幅の回数を減らすことにより、または、薬物による増幅およびサブクローニングについて高産生クローンを初めに単離することにより、進行スケジュールを短縮し得る。
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）／蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）をベースとしたスクリーニング方法の簡便性と効率性が、先の研究で立証されている。これらの先の報告中、融合タンパク質の一部として、または、ひとつの内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または２つのプロモーター系のいずれかを用いた２シストロン性の構築物の一部として、ＧＦＰが組み込まれた。これは、高コピー数の組み換え遺伝子が安定的に取り込まれること、または、遺伝子が非常に高い転写活性を有する部位に取り込まれたことに起因し得る。これらの方法が効果的であることが示されているにもかかわらず、ヒト治療薬の製造にＧＦＰを含有する細胞系統を用いることに関しては、何らかの懸念があり得る。さらに、サブ集団の単離後に細胞がＧＦＰの生産を伴う代謝機構を担うことは必要でないようにみえる。この細胞資源は、潜在的には、細胞増殖または組み換えタンパク質の生産へと転用され得るものである。以下の実施例は、ＦＡＣＳを通じての選別と組み合わせた、ＧＦＰを選択マーカーとして可逆的に用いる高生産クローンを選択するための新規な手法を記載する。図１は、ＧＦＰをベースとした選択プロセスのスキームを示す。手短にいえば、ＧＦＰをコードするｃＤＮＡを含有するプラスミドベクターをＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞へとトランスフェクトする。所望のベクターをうまく獲得した細胞は蛍光性である。ＧＦＰ発現細胞を、組み換えタンパク質発現のための親宿主細胞とした。
所望の組み換えタンパク質を生産するために、親宿主細胞を、ｓｈＲＮＡｍｉｒｅＧＦＰ含有ベクターにてトランスフェクトし、次いで蛍光強度の低い細胞を、ＦＡＣＳを用いて選別した。ＭＴＸを増加させながら数ラウンドのチャレンジを行った後の細胞培養物を、繰り返し数ラウンドの選別および増殖を行わせた。最も低いＧＦＰ蛍光強度を示す細胞クローンは、最も高い導入遺伝子発現を有するクローンに相当することとなる。最終的に、選択されたクローンを増殖させ、生産および安定性を試験する。ＦＡＣＳは多数の細胞を容易にスクリーニングすることができ、高生産性のクローンを取得する機会は、限定希釈法と比較して非常に増大する。さらに、この手法は作業量がより少なく、バイオ生産のためのクローンを創出するための時間を顕著に短縮し得る。
実施例１：ＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞系統の確立
ジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞系統（ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−）をＨＴ（０．１ｍＭ ヒポキサンチンナトリウムおよび０．０１６ｍＭ チミジン、Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ Ｎｏ．１１０６７）、１０％のＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｃａｔ．０４−００１−１Ａ）および２μＭのメトトレキサート水和物（ＭＴＸ、Ｓｉｇｍａ、ＳＩ−Ｍ８４０７）を添加したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ， Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１２２００）中で維持した。
ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標） Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐｕｌｓ（商標） Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｔ． Ｎｏ．１１５１４−０１５）の説明書に従って、リポフェタミンと共に、ＧＦＰ（ｐＦＬＡｇ−ｅＧＦＰ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ）をコードするｃＤＮＡを含有する５μｇのプラスミドベクターを用いてトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、５μｇ／ｍｌのピューロマイシン二塩酸塩（Ｓｉｇｍａ、ＳＩ−Ｐ８８３３）を用いて選択した。ＨＴ、１０％のＦＢＳ、２μＭのＭＴＸおよび選択的抗生物質を添加したＩＭＤＭ培地中での１０日間の選択の後、細胞を上記培地中で維持した。ＧＦＰを発現するＣＨＯ−ｄｈｆｒ細胞（ＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞）をクローン化し、組み換えタンパク質発現のための親宿主とする。
実施例２：発現ベクターの構築
（１）ｐＳｃｉｎｏＤＰ−ＤＨＦＲベクター
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）プラスミド骨格中のＥＧＦＰ遺伝子をＩＲＥＳ−ＤＨＦＲ融合遺伝子へと置換し、ＳＶ４０ポリＡ尾部およびＣＭＶ−ＩＥプロモーターの付加をｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）プラスミド骨格へと挿入することにより、ｐＳｃｉｎｏＤＰ−ＤＨＦＲプラスミドを構築した。手短にいえば、ポリＡ尾部およびＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列を、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をテンプレートとして用いたＰＣＲ増幅により取得した。ＰＣＲによるオーバーラップ伸張（ＯＬ−ＰＣＲ）を介して、融合されたポリＡ尾部−プロモーター融合配列ＳＶ４０ｐｏｌＡ−ＣＭＶ−ＩＥ（約１．２ｋｂ）を作製した。融合された配列をＸｈｏＩ／ＢｇｌＩＩで消化し、ＸｈｏＩ／ＢｇｌＩＩした消化ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターへと挿入した。得られた構築物をｐＳｃｉｎｏＤＰと名付けた。
ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰおよびｐＳＶ２−ＤＨＦＲプラスミドをテンプレートとして用いたＰＣＲ増幅により、ＩＲＥＳ配列およびＤＨＦＲ遺伝子を入手した。ＰＣＲによるオーバーラップ伸張（ＯＬ−ＰＣＲ）を介して、ＩＲＥＳ配列断片およびＤＨＦＲ遺伝子断片のハイブリッド（ＩＲＥＳ２−ＤＨＦＲ）を作製した。そのハイブリッド断片（〜１．１ｋｂ）をＡｇｅＩ／ＮｏｔＩを用いて消化し、ＡｇｅＩ／ＮｏｔＩ消化したｐＥＧＦＰ−Ｎ１へと挿入してｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター中のＥＧＦＰ遺伝子を置換した。得られた構築物をｐＩＲＥＳ２−ＤＨＦＲと名付けた。部位特異的突然変異誘発法を行って、ＩＲＥＳ配列中のＡｐａＬＩ部位を除去した。
ＩＲＥＳ配列中に変異させた制限酵素ＡｐａＬＩ部位を有するプラスミドｐＩＲＥＳ２−ＤＨＦＲをＡｇｅＩ／ＮｏｔＩにより消化して、ＩＲＥＳ配列および全長ＤＨＦＲのコード領域遺伝子を含む１．２ｋｂの断片を、ＡｇｅＩ／ＮｏｔＩ消化したｐＳｃｉｎｏＤＰに連結して、ｐＳｃｉｎｏＤＰ−ＤＨＦＲを作製した（図２）。全ての構築物を、制限分析および／またはヌクレオチド配列解析によって確認した。
（２）ｐＳｃｉｎｏＤＰ３−ＤＨＦＲベクター
ｐＳｃｉｎｏＤＰ３−ＤＨＦＲベクターは、ＣＭＶ−ＩＥエンハンサーを伴ったｈＥＦ１αプロモーターを有する、ｐＳｃｉｎｏＤＰ−ＤＨＦＲをベースとしたベクターである。手短に言えば、ｈＥＦ１αプロモーターをｐＢｕｄＣＥ４．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から増幅した。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１上のＣＭＶ−ＩＥエンハンサーの後ろにｈＥＦ１αプロモーターをサブクローニングしてｐＣＭＶｅ−ｈＥＦ１α−ＥＧＦＰベクターを形成させることを通じて、ｈＥＦ１αプロモーターを伴うハイブリッドＣＭＶ−ＩＥエンハンサー配列を得た。ＣＭＶｅ−ｈＥＦ１α断片をｐＣＭＶｅ−ｈＥＦ１α−ＥＧＦＰベクターからＰＣＲ増幅し、ｐＳｃｉｏｎＤＰ−ＤＨＦＲベクター中の両方のＣＭＶプロモーターを置換するために用いた。得られたベクターをｐＳｃｉｎｏＤＰ３−ＤＨＦＲと名付けた（図３）。
（３）ｐＳｃｉｎｏＤＰ３ｍｉｒ−ＤＨＦＲベクター
以下の合成骨格ＤＮＡおよびプライマーを用いて、記載されるように、ＰＣＲを用いて一本鎖９７ｎｔの「ｍｉｒ３０様」ｓｈＲＮＡｉＧＦＰオリゴを作製した：
一本鎖９７ｎｔの「ｓｈＲＮＡｉＧＦＰＤＮＡオリゴ
5’-TGCTGTTGACAGTGAGCGAGCACAAGCTGGAGTACAACTATAGTGAAGCCACAGATGTATAGTTGTACTCCAGCTTGTGCCTGCCTACTGCCTCGGA-3’ (配列番号1)
下線を引き斜体で示す配列は、隣接するｍｉｒ３０配列を示し、下線を引かず斜体で示す配列はｍｉｒ３０ループ構造を表す。サンプルのセンスおよびアンチセンスで選択される標的配列は、太字および下線を引いた太字でそれぞれ示される。ｍｉｒ３０様のｓｈＲＮＡｉＧＦＰは、内因性のｍｉｒ３０ ｍｉＲＮＡ隣接配列の部分に相当する共通の末端を有する一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドとして合成される。
ｍｉｒＦＷＤ−ＡｇｅＩプライマー配列（４０ｍｅｒ）：
5’-CAGAAGGACCGGTAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCG-3’ (配列番号2)
ｍｉｒＲＥＶ−ＨｉｎｄＩＩＩプライマー配列（３７ｍｅｒ）：
5’-CTAAAGTAGCCCCTTAAGCTTTCCGAGGCAGTAGGCA-3’ (配列番号3)
下線を引き、斜体で示される配列の隣接領域は、反応を準備するための普遍的な隣接部として用いられ、これにより全長ｍｉｒ３０様ｓｈＲＮＡｉＧＦＰが増幅され、受容側ベクターへとクローンされ得るＰＣＲ産物を生じる。
Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標） Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、以下のプロファイル：９５℃で３分間、次いで、９５℃で３０秒間、５４℃で秒間、および、７５℃で３０秒間、合計３５サイクルによりＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物（ＡｇｅＩ−ｓｈＲＮＡｉＧＦＰ）を修飾ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（ＡｇｅＩ部位が破壊され、ネオマイシン遺伝子の後ろにＡｇｅＩおよびＥｃｏＲＶ部位が追加）へとクローンした。得られた構築物をｐＥＧＦＰ−Ｎ１−ｓｈＲＮＡｉＧＦＰと名付けた。これらのＡｇｅＩ−ｓｈＲＮＡｉＧＦＰ配列も、ＤＮＡ配列解析により確認した。
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１−ｓｈＲＮＡｉＧＦＰベクターをＡｐａＬＩ−ＮｏｔＩにより消化した。ＣＭＶ−ＩＥ−ＧＦＰ断片をｐＳｃｉｎｏＤＰ３−ＤＨＦＲ由来のＳｃｉｎｏＤＰ３−ＤＨＦＲ断片で置換した。得られた構築物をｐＳｃｉｎｏＤＰ３ｍｉｒ−ＤＨＦＲと名付けた（図４）。
（４）ｐＳｃｉｎｏＤＰ８ｍｉｒ−ＤＨＦＲベクター
ｐＳｃｉｎｏＤＰ８ｍｉｒ−ＤＨＦＲベクターは、調節ＤＮＡエレメントｍＡＲＥ４０を含む。ハウスキーピング遺伝子由来の抗リプレッシングエレメント（ｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）等の調節エレメントは、細胞系統により産生される組み換えタンパク質の特異的な生産性に正の影響を与えることが示された。プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１は、この構築物の骨格として用いられた。手短に言えば、以下の合成骨格ＤＮＡおよびプライマーを用いて、記載されるオーバーラッピングＰＣＲを用いて、部分的マウス抗リプレッサーエレメント４０断片を作製した：
mARE40-L1(+)骨格DNA:
5’-TTGCTCTGAGCCAGCCCACCAGTTTGGAATGACTCCTTTTTATGACTTGAATTTTCAAGTATAAAGTCTAGTGCTAAATTTAATTTGAACAACTGTATAGTTTTTG-3’ (配列番号４)
mARE40-L1(-)骨格DNA:
5’-TTAGAAATCCTCACACACAACAAGTTTTCATTTCACTTCTAATTCTGAAAAAAACACTGCCACCATTTTTTTTCCTTCCCCCAACCAGCAAAAACTATACAGTTGT-3’ (配列番号５)
mARE40-R1(+)骨格DNA
5’-GTGTGTGAGGATTTCTAATGACATGTGGTGGTTGCATACTGAGTGAAGCCGGTGAGCATTCTGCCATGTCACCCCCTCGTGCTCAGTAATGTACTTTACAGAAATC-3’ (配列番号６)
mARE40-R1(-)骨格DNA
5’-TGGCAGAAATGCAGGCTGAGTGAGACTACCCAGAGAAGAGACCGGATATACACAAGAAGCATGGTTTATATCAATCTTTTGAGTTTAGGATTTCTGTAAAGTACAT-3’ (配列番号７)
mARE40-5’プライマー: 5’-TTGCTCTGAGCCAGCCCACCAGTTT-3’ (配列番号８)
mARE40-3’AseI プライマー: 5’-GTTATTAATTGGCAGAAATGCAGGCTGAGT-3’ (配列番号９)
mARE40-3’AflII プライマー: 5’-CCCACATGTTGGCAGAAATGCAGGCTGAGT-3’ (配列番号１０)
mARE40-3’SpeI プライマー: 5’-GGACTAGTTGGCAGAAATGCAGGCTGAGTG-3’ (配列番号１１)
Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標） Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、以下のプロファイル：９５℃で３分間、次いで、９５℃で３０秒間、５８℃で秒間、および、７５℃で３０秒間、合計３５サイクルによりＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物（ｍＡＲＥ４０−ＡｓｅＩおよびｍＡＲＥ４０−ｆｌＩＩ）を修飾ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（ＡｇｅＩ部位が破壊され、ＡｓｅＩの前にＥｃｏＲＶ、およびＡｆｌＩＩ部位の前にＳｃａＩ部位が追加）へと別々にクローンし、ｐｍＡＲＥ４０−ＥＧＦＰ−Ｎ１を形成し、（ｍＡＲＥ４０−ＳｐｅＩ）をｐＳｃｉｎｏＤＰ３−ＤＨＦＲベクター（ＳｐｅＩ部位の前にＥｃｏＲＶ部位が追加）へとクローンしてｐＳｃｉｎｏＤＰ３−ＤＨＦＲ−Ｆ２を形成した。ｐｍＡＲＥ４０−ＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターをＡｓｅＩ−ＢａｍＨＩを用いて消化し、ｐＳｃｉｎｏＤＰ３−ＤＨＦＲベクター由来の〜１．６ｋｂのＡｓｅＩ−ＣＭＶｅ−ｈＥＦ１α−ＢａｍＨＩ断片でＣＭＶ−ＩＥプロモーターを置換した。得られた構築物をｐＦｍＡＲＥ４０ＳｃｉｎｏＤＰ３−ＥＧＦＰ−Ｎ１と名付けた。ｐＦｍＡＲＥ４０ＳｃｉｎｏＤＰ３−ＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターをＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩで消化し、ＥＧＦＰ遺伝子をｐＳｃｉｎｏＤＰ３−ＤＨＦＲ−Ｆ２由来の〜１．６ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳＶ４０ｐｏｌＡ−ｍＡＲＥ４０−ＤＰ３−ＩＲＥＳ−ＤＨＦＲ−ＮｏｔＩ断片で置換した。得られた構築物をｐＳｃｉｎｏＤＰ８−ＤＨＦＲと名付けた。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１−ｓｈＲＮＡｉＧＦＰベクターを次いでＡｐａＬＩ−ＮｏｔＩで消化し、ＣＭＶ−ＩＥ−ＧＦＰ断片をｐＳｃｉｎｏＤＰ８−ＤＨＦＲ由来のＳｃｉｎｏＤＰ８−ＤＨＦＲ断片で置換した。得られた構築物をｐＳｃｉｎｏＤＰ８ｍｉｒ−ＤＨＦＲと名付けた（図５）。クローンされた部分的マウス抗リプレッサーエレメント４０断片の完全配列を以下に示す：
5’-TTgCTCTgAgCCAgCCCACCAgTTTggAATgACTCCTTTTTATgACTTgAATTTTCAAgTATAAAgTCTAgTgCTAAATTTAATTTgAACAACTgTATAgTTTTTgCTggTTgggggAAggAAAAAAAATggTggCAgTgTTTTTTTCAgAATTAgAAgTgAAATgAAAACTTGTTgTgTgTgAggATTTCTAATgACATgTggTggTTgCATACTgAgTgAAgCCggTgAgCATTCTgCCATgTCACCCCCTCgTgCTCAgTAATgTACTTTACAgAAATCCTAAACTCAAAAgATTgATATAAACCATgCTTCTTgTgTATATCCggTCTCTTCTCTGGGTAgTCTCACTCAgCCTgCATTTCTgCCA-3’ (配列番号１２)
（５）ｐＳｃｉｎｏＤＰ９ｍｉｒ−ＤＨＦＲベクター
ｐＳｃｉｎｏＤＰ８ｍｉｒ−ＤＨＦＲベクターの構築、および、ｐＳｃｉｎｏＤＰ８ｍｉｒ−ＤＨＦＲ中の２つのＣＭＶエンハンサーをＣＡＧプロモーターで置換する（ニワトリβ−アクチンプロモーターと融合させたＣＭＶ−ＩＥエンハンサー）手法と同様の手法を用いて、ｐＳｃｉｎｏＤＰ９ｍｉｒ−ＤＨＦＲベクター（図６）を構築した。ｐＳｃｉｎｏＤＰ９ｍｉｒ−ＤＨＦＲの完全配列を配列番号１３に示す。
ｐＳｃｉｎｏＤＰ９ｍｉｒ−ＤＨＦＲは、ＭＣＳＩＩおよびジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）のコード領域の間に、脳心筋炎ウイルス（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＥＣＭＶ）の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。このことが、対象遺伝子（実施例：ＭＣＳＩＩへとクローンした軽鎖）およびＤＨＦＲ遺伝子の両方が単一の２シストロン性ｍＲＮＡから翻訳されることを可能にする。ＤＨＦＲに隣接する配列は変換されてＫｏｚａｋコンセンサス翻訳開始部位となり、真核細胞における翻訳効率をさらに増大させる。ｐＳｃｉｎｏＤＰ９ｍｉｒ−ＤＨＦＲ中のＭＣＳＩは、ＣＭＶ（ＰＣＭＶ ＩＥ）の前初期プロモーターとＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列の間に存在する。ＭＣＳＩの下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが、最初の転写の３’末端における適切な処理へと導く。ｐＳｃｉｎｏＤＰ−ｄｈｆｒ中のＭＣＳＩＩは、サイトメガロウイルス（ＰＣＭＶ ＩＥ）の二番目の前初期プロモーターとＩＲＥＳ配列との間に存在する。ＤＨＦＲ遺伝子の下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが、２シストロン性ｍＲＮＡの３’末端における適切な処理へと導く。
ｐＳｃｉｎｏＤＰ９ｍｉｒ−ＤＨＦＲがｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターに由来するものであるため、それは、ＳＶ４０Ｔ抗原を発現する哺乳動物細胞を複製するためのＳＶ４０起源を含有する。ＳＶ４０初期プロモーター、Ｔｎ５のネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子、および、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ ＴＫ）遺伝子由来のポリアデニル化シグナルからなるネオマイシン−耐性カセット（Ｎｅｏｒ）は、安定的にトランスフェクトされた真核細胞がＧ４１８を用いて選択されることを可能にする。このカセットの上流に存在するバクテリアのプロモーターは、Ｅ．ｃｏｌｉ中でカナマイシン耐性を発現する。ｐＳｃｉｎｏＤＰ−ＤＨＦＲ骨格もまた、Ｅ．ｃｏｌｉ、および、一本鎖ＤＮＡ生産のためのｆ１起源において伝播するための複製のｐＵＣオリジンを含む。
（６）ｐＧＦＰ／ピューロマイシンベクター
ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰおよびｐＬＫＯ−ＡＳ３ｗ−ｐｕｒｏプラスミドをテンプレートとして用いて、ＩＲＥＳ配列およびＤＨＦＲ遺伝子を取得した。ＰＣＲによるオーバーラップ伸張（ＯＬ−ＰＣＲ）を通じて、ＩＲＥＳ配列断片およびピューロマイシン遺伝子断片のハイブリッド（ＩＲＥＳ２−ピューロマイシン）を取得した。ＩＲＥＳ２−ピューロマイシン断片を、ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ消化したｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ２ベクター（Ｋｏｄａｋ）へと挿入した。得られた構築物をｐＩＲＥＳ２−Ｐｕｒｏと名付けた。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターからＥＧＦＰ遺伝子を取得し、ｐＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏベクターへと挿入してｐＧＦＰ／ピューロマイシンベクターを構築した。
（７）ｐＳｃｉｎｏＤＰ９ｍｉｒ−ハーセプチン−ＤＨＦＲベクター
ｐＳｃｉｎｏＤＰ９ｍｉｒ−ハーセプチン−ＤＨＦＲベクターの構築を図７Ａおよび７Ｂに示す。手短に言えば、４−１リーダー配列および４−２リーダー配列をオリゴ合成骨格断片からＰＣＲ増幅し、一方、ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１ＣＨ）の重鎖定常領域配列およびヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１ＣＬ）の軽鎖定常領域配列を、ヒトＩｇＧ１配列を含む組み換えプラスミドから取得した。リーダー配列およびｈＩｇＧ１定常領域配列ベクターのハイブリッドは、配向性の連結手法によって、ｈＩｇＧ１定常領域を、リーダー配列を含むベクターへとサブクローンすることによって得た。
次いで、繰り返しのオーバーラッピングＰＣＲを通じて、オリゴ合成骨格断片から重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の変異領域（ｖａｒｉａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）を作製し、ｐ４−１リーダー−ｈＩｇＧ１ＣＨまたはｐ４−２リーダー−ｈＩｇＧ１ＣＬベクターへとサブクローンした。ＰＣＲのエラー修正、および、クローニング工程の間に導入された付加配列の除去後、リーダー−ペプチド−ハーセプチンＶＣ配列の正確性を配列解析によって評価した（図７Ａ）。
最終的に、ハイブリッド４−１リーダー−ハーセプチン重鎖（４−１−ハーセプチンＶＣＨ）、および４−２リーダー−ハーセプチン軽鎖（４−２−ハーセプチンＶＣＬ）をｐＳｃｉｎｏＤＰ９ｍｉｒ−ＤＨＦＲベクターのＭＣＳＩおよびＭＣＳＩＩ部位へと個々にサブクローンして、ｐＳｃｉｎｏＤＰ９ｍｉｒ−ハーセプチン−ＤＨＦＲベクターを構築した（図７Ｂ）。
抗ＨＥＲ２重鎖１の変異領域（ｖａｒｉａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸およびヌクレオチド配列を配列番号１４および１５にそれぞれ示す。重鎖の変異領域（ＶH）に用いられる骨格断片およびＰＣＲプライマーは以下の配列である：
骨格断片：
ハーセプチンVH-L1(+) (108 mer)
5’-gAggTgCAgCTCgTggAgAgTggTggCgggTTggTCCAgCCAggCgggTCTCTgCgATTgAgCTgTgCTgCCTCTggATTTAACATCAAAgACACgTACATCCATTgg-3’ (配列番号１６)
ハーセプチンVH-L2(-) (105 mer)
5’-TTTAACgCTATCAgCgTATCTggTgTAgCCgTTAgTgggATAgATTCTAgCTACCCATTCAAggCCCTTgCCgggggCCTgTCTCACCCAATggATgTACgTgTC-3’ (配列番号１７)
ハーセプチンVH-R1(+) (105 mer)
5’-TACgCTgATAgCgTTAAAggAAggTTTACTATTTCTgCCgACACCTCCAAgAATACCgCATATCTACAgATgAACTCCCTgCgCgCTgAggACACCgCTgTgTAT-3’ (配列番号１８)
ハーセプチンVH-R2(-) (108 mer)
5’-CTTAgTAgAgCACTgCTAACTgTCACTAAggTACCCTggCCCCAgTAgTCCATTgCgTAgAATCCgTCTCCCCCCCAACgTgAgCAgTAATACACAgCggTgTCCTC-3’ (配列番号１９)
増幅用プライマー：
ハーセプチン-VH-5HindIII (30 mer) (センス)
5’-gCCAAgCTTgAggTgCAgCTCgTggAgAgT-3’ (配列番号２０)
ハーセプチン-VH-3ApaI (30 mer) (アンチセンス)
5’-AgggggCCCTTAgTAgAggCACTgCTAACT-3’ (配列番号２１)
抗ＨＥＲ２軽鎖１の変異領域のアミノ酸およびヌクレオチド配列を配列番号２２および２３にそれぞれ示す。軽鎖の変異領域（ＶＬ）に用いられる骨格断片およびＰＣＲプライマーは以下の配列である：
骨格断片：
ハーセプチンVL-L1(+) (93 mer)
5’-gATATACAgATgACACAgTCTCCgTCAAgTCTgAgCgCAAgCgTgggCgACCggGTAACAATTACCTgTAgAgCCAgCCAggACgTAAATACA-3’ (配列番号２４)
ハーセプチンVL-L2(-) (95 mer)
5’-CCgCTATAAAggAACgAggCAgAgTAgATCAgAAgCTTAggAGCTTTACCAggTTTTTgCTgATACCAggCCACggCTgTATTTACgTCCTggCT-3’ (配列番号２５)
ハーセプチンVL-R1(+) (94 mer)
5’-CTCgTTCCTTTATAgCggggTgCCAAgCCgCTTCTCCggATCTAggTCTggAACAgACTTTACTCTgACCATTTCCAgTCTCCAgCCCgAAgAC-3’ (配列番号２６)
ハーセプチンVL-R2(-) (93 mer)
5’-CTTgATCTCgACCTTggTgCCCTgCCCAAATgTgggTggAgTCgTgTAATgTTgCTggCAATAgTAggTAgCAAAgTCTTCgggCTggAgACT-3’ (配列番号２７)
増幅用プライマー
ハーセプチン-VL-5HindIII (30 mer) (センス)
5’-gCCAAgCTTgATATACAgATgACACAgTCT-3’ (配列番号２８)
ハーセプチン-VL-3BamHI (30mer) (アンチセンス)
5’-CgCggATTCCTTgATCTCgACCTTggTgCC-3’ (配列番号２９)
実施例３：ハーセプチン／ＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞系統の確立
ＣＨＯ／＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞をＰＢＳ緩衝液中に懸濁させた。４０μｇの直鎖状プラスミド（ｐＳｃｉｎｏＤＰ９ｍｉｒ−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ−ＤＨＦＲ）のＤＮＡを前記細胞に加えて、氷上で１０分間インキュベートした。細胞を次いで、電圧設定７５０Ｖおよび電気容量２５μＦ（電気容量拡張機能を伴うＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ、および、Ｂｉｏ−Ｒａｄのパルスコントローラー）にて電気泳動した。電気泳動した細胞をＴ−１７５フラスコ中に撒き、２５ｍＬの培地（ＨＴ、１０％のＦＢＳ、２μＭのＭＴＸおよび５μｇ／ｍｌのピューロマイシン二塩酸塩を添加したＩＭＤＭ）と共に２４時間置いた。次いで細胞を、８００μｇ／ｍｌのＧ４１８硫酸塩（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｃａｔ＃３４５８１０）を用いて、１０％のＤ−ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ．Ｎｏ．３００６７−３３４）および５μｇ／ｍｌのピューロマイシン二塩酸塩を添加した最小必要培地α培地（Ａｌｐｈａ−ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１２０００）中で選択した。１０％のＤ−ＦＢＳおよび選択的抗生物質を添加したα−ＭＥＭ培地中での選択の１４日後、遺伝子増幅のため、濃度を増加させながらのＭＴＸ処理に細胞を供した。
細胞をＦＡＣＳで選別し、低ＧＦＰ蛍光強度を示す細胞をスクリーニングした。標的遺伝子およびｓｈＲＮＡＧＦＰの発現がＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞中でのＧＦＰ生産の低減を引き起こすため、緑色蛍光が最も少ない細胞（ＧＦＰネガティブ）が、最も高い標的遺伝子の発現を有する。ＦＡＣＳは、Ｓｕｍｍｉｔソフトウェア、４８８ｎｍにおけるレーザーエミッティング、および、選別のための細胞配置単位を装備したＭｏＦｌｏＴＭ ＸＤＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて行った。
ＦＡＣＳを用いて、１０％のＤ−ＦＢＳ、Ｇ４１８、ピューロマイシン二塩酸塩およびＭＴＸを添加した２２０μｌのα−ＭＥＭを含む９６穴ウェルの細胞培養プレート中へと単細胞を配置することにより、低蛍光および高蛍光の細胞群を選別した。クローンを、加湿されたインキュベーター中で１２日間、３７℃および５％の二酸化炭素にて、インキュベートした。
実施例４：ハーセプチン−ＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞系統の特性決定
（１）免疫染色による表面抗体の検出
トリプシン処理したハーセプチン−ＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞を、５分間、２００ ｒｐｍで遠心分離した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁して最終濃度約１×１０７細胞／ｍｌとした。細胞を次いで、製造者の推奨に従う濃度のフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗マウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｃａｔ． Ｎｏ．７３６００７）と共に、４℃、３０分間暗所でインキュベートし、ＰＢＳで２度洗浄して、ＦＡＣＳ分析のため氷上に保管した。
（２）ＥＬＩＳＡによる分泌抗体の検出
手短に言えば、９６穴ウェルプレートを抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ：Ｉ １８８６）を０．０５Ｍの炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．７）で希釈し、４℃にて１６時間インキュベートした。プレートをブロッキング緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１％スキムミルク、ｐＨ８．０）にて、３７℃、分間被覆した。培養物の上清をウェルに載せて３７℃、２時間インキュベートした。製造者の推奨に従って、希釈緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ８．０）中に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ−Ｆ（ｃ）抗体（Ａｂｃａｍ：ａｂ７４９９）を３７℃、１時間インキュベートした。基質を用いて反応物を検出し（１−ｓｔｅｐＴＭ ｕｌｔｒａ ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃａｔ．３４０２８）、プレートをマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に載せて読んだ。
（３）結果
図８は、ＦＡＣＳを用いた、異なる蛍光強度で選別されたハーセプチン−ＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞のヒストグラムプロファイルを示す。パネルＡは、ハーセプチン−ＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞のプールにおけるＧＦＰ蛍光を示す。細胞は、蛍光強度に基づいていくつかのサブ集団（Ｒ２、Ｒ３およびＲ４）に分割された。パネルＢ−Ｄは、各サブ集団中でのＧＦＰ発現レベルを示す。パネルＥは、プールおよび各サブ集団中での抗体ハーセプチン抗体の力価を示す。データは、最も低いＧＦＰ蛍光レベルを有する細胞（ハーセプチン／Ｒ４／ＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ）が最も高レベルのハーセプチン力価を有することを示す。
図９は、標的タンパク質（ハーセプチン）およびｓｈＲＮＡｉＧＦＰを含むＤＮＡ構築物でトランスフェクトしたときに、ＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞中でのＧＦＰ発現レベルが低減したことを示す。ＦＡＣＳプロファイルは、２ラウンドのＭＴＸチャレンジ後にはＧＦＰの発現レベルがさらに低減することを示す（パネルＣおよびＤ）。これらの結果は、標的遺伝子の増幅レベルがＧＦＰ発現レベルおよび遺伝子増幅の強度と相関することを立証する。
図１０は、ＰＥコンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）で染色したハーセプチン−ＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞の代表的なＦＡＣＳ分析を示す。結果は、抗体産生細胞（すなわち、より高度にＰＥ染色される細胞）が低レベルのＧＦＰ発現を示すことを立証する。
図１１Ａは、ハーセプチン−ＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞のヒストグラムプロファイルを示す。横軸および影をつけた領域は、単細胞分析に用いた蛍光が低い細胞群と蛍光が高い細胞群を示す。図１１Ｂは、蛍光が低い１８の細胞クローンのうち８つで０．３より大きいＥＬＩＳＡ値が得られ、一方、蛍光が高い１８の細胞のうち２つのみで０．３より大きい値が得られたことを示す。これらの結果は、蛍光の低い細胞群が高収量の抗体産生細胞を高頻度で含むことを立証し、かつ、ＧＦＰをベースとするスクリーニング戦略を裏づける。
図１２は、ハーセプチンおよびｓｈＲＮＡＧＦＰをコードするＤＮＡ構築物をトランスフェクトすることにより、ＣＨＯ＋ＧＦＰ／−ｄｈｆｒ細胞中でのＧＦＰの発現が低減することを示す。
（４）結論
フローサイトメトリーと組み合わせたｓｈＲＮＡｍｉｒｅＧＦＰの使用は、２つの重大な点において、細胞系統の開発の正確性および効率性を実質的に向上させる。第一に、クローンのスクリーニングにおける初期段階では、ＦＡＣＳ法は、治療用タンパク質の力価に関して調製培地における分析を行うよりも、クローンの生産性をよりよく予測する判断材料である。第二に、不安定な導入遺伝子発現を伴うクローンは、増幅ステージの間、蛍光の増加が観察されることにより容易に識別される。すなわち、本発明の方法は、さらなる開発、および、従来の方法よりも初期のステージで不安定なクローンを除去することに関し良い候補を同定するための、正確な９６ウェルのクローンスクリーニングにおける新たな利点を提供する。
これらの結果は、本発明のＤＮＡ構築物およびスクリーニング方法が、高発現のクローンの均質なタンパク質調製物を確実に取得できることを立証する。組み換え抗体の高収率な発現が可能な哺乳類細胞系統の単離は複数の個々のクローンを限界希釈法によりスクリーニングすることによって行われていないため、本手法は、必要な労働力がより少なくてすみ、バイオ生産のためのクローンを生産するのに要する時間を顕著に低減させることができる。本手法は、クローン選択のための付加的な試薬を必要とせず、ゲノムの安定性をモニターするための付加的な利益を提案する。また、標的遺伝子の発現レベルは、増幅遺伝子の強度との相関関係がより高い。2シストロン性の設計は、２つの外来遺伝子が同一の染色体内で同調発現することを可能にする。前記の阻害的アプローチは、レポーター遺伝子の増幅強度を低減することにより、標的遺伝子の増幅強度を促進する。AREの使用は、異なる染色体領域への外来遺伝子の挿入を阻害することにより引き起こされる差異をなくすことによって、外来組み換えタンパク質の発現を増大させる。

Claims (20)

  1. 標的タンパク質を高レベルで発現する細胞をスクリーニングするための方法であって、
    標的タンパク質と宿主細胞内の内因性選択マーカーに対する阻害物質の両方をコードするＤＮＡ構築物を複数の該宿主細胞中に導入するステップと、
    該内因性選択マーカーの発現について、ＤＮＡ構築物を含む該宿主細胞をスクリーニングするステップと、
    該内因性選択マーカーの発現が低下した細胞を単離するステップ、
    を含み、
    該内因性選択マーカーは該宿主細胞中への該ＤＮＡ構築物の導入前に該宿主細胞中に存在するポリヌクレオチドによってコードされる選択マーカーであり、該ＤＮＡ構築物は該宿主細胞内で該標的タンパク質と阻害物質の両方を発現するように構成されている、前記方法。
  2. 前記阻害物質が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡとｓｈＲＮＡのハイブリッド、およびアンチセンスＲＮＡからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記阻害物質が、ｓｈＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
  4. 前記内因性選択マーカーが蛍光マーカーであり、かつ、前記単離ステップが蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いて細胞を選別するステップを含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記ＤＮＡ構築物がジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をさらにコードし、かつ、前記宿主細胞がＤＨＦＲ欠損細胞である、請求項１に記載の方法。
  6. 導入遺伝子を発現する細胞を選択するためのハイスループットスクリーニング方法であって、
    少なくとも１つの導入遺伝子と蛍光タンパク質の発現を阻害する干渉ＲＮＡとを担持するベクターを用いて、該蛍光タンパク質を発現する細胞をトランスフェクトするステップと、
    該トランスフェクト細胞において蛍光強度を測定するステップと、
    非トランスフェクト細胞の蛍光強度よりも低い蛍光強度を有する該トランスフェクト細胞を単離するステップ、
    を含む、前記方法。
  7. 前記蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記干渉ＲＮＡがｍｉｒ−３０に基づくｓｈＲＮＡである、請求項６に記載の方法。
  9. 前記単離ステップがＦＡＣＳを用いて細胞を選別するステップを含む、請求項６に記載の方法。
  10. 前記蛍光タンパク質を発現する細胞がジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠損ＣＨＯ細胞である、請求項６に記載の方法。
  11. 前記少なくとも１つの導入遺伝子が、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって、ＤＨＦＲをコードする遺伝子と連結している、請求項６に記載の方法。
  12. 発現ベクターを含む細胞をハイスループットスクリーニングするための発現ベクターであって、
    標的タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列と、
    宿主細胞のための外因性選択マーカーをコードする第２のヌクレオチド配列と、
    宿主細胞内の内因性選択マーカーに対する阻害物質をコードする第３のヌクレオチド配列と、
    前記宿主細胞において前記第１、第２および第３のヌクレオチド配列の発現を制御する１つ以上の調節エレメントを含み、
    この場合、前記第１のヌクレオチド配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって第２のヌクレオチド配列と連結している、
    発現ベクター。
  13. １つ以上の抗リプレッサーエレメントをさらに含む、請求項１２に記載の発現ベクター。
  14. 前記１つ以上の抗リプレッサーエレメントが、部分的マウス抗リプレッサーエレメント４０を含む、請求項１３に記載の発現ベクター。
  15. 前記阻害物質が、干渉ＲＮＡである、請求項１２に記載の発現ベクター。
  16. 前記干渉ＲＮＡが、ｍｉＲ−３０に基づくｓｈＲＮＡである、請求項１５に記載の発現ベクター。
  17. 前記内因性選択マーカーが蛍光タンパク質である、請求項１２に記載の発現ベクター。
  18. 前記蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質である、請求項１７に記載の発現ベクター。
  19. 前記外因性選択マーカーがジヒドロ葉酸レダクターゼである、請求項１２に記載の発現ベクター。
  20. 前記１つ以上の調節エレメントが、ＣＭＶ ＩＥエンハンサーを含む、請求項１２に記載の発現ベクター。
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Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8710200B2 (en) 2011-03-31 2014-04-29 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids encoding a modified erythropoietin and their expression
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
WO2013151667A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides
WO2014152030A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Removal of dna fragments in mrna production process
US10138507B2 (en) 2013-03-15 2018-11-27 Modernatx, Inc. Manufacturing methods for production of RNA transcripts
EP2971161B1 (en) 2013-03-15 2018-12-26 ModernaTX, Inc. Ribonucleic acid purification
WO2014144767A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Ion exchange purification of mrna
SI3019619T1 (sl) 2013-07-11 2021-12-31 Modernatx, Inc. Sestave, ki zajemajo sintetične polinukleotide, ki kodirajo proteine, pozvezane s crispr, in sintetične sgrna, ter metode uporabe
US20160194368A1 (en) * 2013-09-03 2016-07-07 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
WO2015053523A1 (ko) * 2013-10-07 2015-04-16 한화케미칼 주식회사 항체 발현용 바이시스트로닉 발현벡터 및 이를 이용한 항체의 생산 방법
CN106574292B (zh) * 2014-01-10 2021-07-09 国立大学法人京都大学 利用作为指示剂的miRNA的表达区分期望的细胞类型的方法
US10286086B2 (en) 2014-06-19 2019-05-14 Modernatx, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
EP3169335B8 (en) 2014-07-16 2019-10-09 ModernaTX, Inc. Circular polynucleotides
CN107002031B (zh) * 2014-07-16 2021-09-14 国立大学法人京都大学 选择分化细胞的方法
CN105838736B (zh) * 2015-03-24 2019-06-25 广东东阳光药业有限公司 一种gs表达系统细胞株的筛选方法
WO2017049286A1 (en) 2015-09-17 2017-03-23 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides containing a morpholino linker
WO2018032464A1 (zh) * 2016-08-18 2018-02-22 广东东阳光药业有限公司 一种CHO-Dhfr表达系统细胞株的高通量筛选方法
CN106318970B (zh) * 2016-08-18 2019-06-25 广东东阳光药业有限公司 一种CHO-Dhfr表达系统细胞株的高通量筛选方法
US20230082584A1 (en) * 2020-03-31 2023-03-16 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for identifying host cell target proteins for treating rna virus infections
CN112063620A (zh) * 2020-06-16 2020-12-11 中国人民解放军陆军军医大学 抑制猪流行性腹泻病毒M基因表达的shRNA

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3806617A1 (de) * 1988-03-02 1989-09-14 Behringwerke Ag Erzeugung hochexprimierender, rekombinanter, eukaryotischer zellen
US5256568A (en) * 1990-02-12 1993-10-26 Regeneron Phamaceuticals, Inc. Vectors and transformed most cells for recombinant protein production with reduced expression of selectable markers
US5837464A (en) * 1996-01-29 1998-11-17 Virologic, Inc. Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening
US6448007B1 (en) * 1999-07-02 2002-09-10 Message Pharmaceuticals Functional genomic screen for post-transcriptional 5′ and 3′ regulatory elements
JP4488665B2 (ja) * 1999-11-19 2010-06-23 邦弘 松本 新規ｔａｂ２蛋白質
US7912651B2 (en) * 2000-03-06 2011-03-22 Bioseek Llc Function homology screening
CA2404511A1 (en) * 2000-03-31 2001-10-04 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Tlr/cd14 binding inhibitor
US20040038392A1 (en) * 2000-06-08 2004-02-26 Tatsurou Shibui Expression vector enabling screening of cells with high expression of recombinant protein, transformant with high expression of recombinant protein and utilization thereof
JP2001352984A (ja) * 2000-06-09 2001-12-25 Mitsubishi-Tokyo Pharmaceuticals Inc 組換え蛋白質を高発現する細胞をスクリーニングできる発現ベクター及びその利用
AU2001284454A1 (en) * 2000-09-08 2002-03-22 Chugai Research Institute For Molecular Medicine, Inc. Method of screening antitumor agent by using interaction between arf protein and hk33 protein
US7122181B2 (en) * 2000-12-19 2006-10-17 Research Development Foundation Lentiviral vector-mediated gene transfer and uses thereof
JP2003135078A (ja) * 2001-07-26 2003-05-13 Japan Tobacco Inc Ｃ型肝炎ウイルスｎｓ５ａタンパク質の変異体、およびその利用
WO2003044168A2 (en) * 2001-11-16 2003-05-30 University Of Massachusetts Facilitation of rna interference
AU2003250115B2 (en) * 2002-07-26 2009-03-12 Basf Plant Science Gmbh Inversion of the negative-selective effect of negative marker proteins using selection methods
US7384744B2 (en) * 2002-11-29 2008-06-10 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co., Kg Expression vector, methods for the production of heterologous gene products and for the selection of recombinant cells producing high levels of such products
US20050042641A1 (en) * 2003-05-27 2005-02-24 Cold Spring Harbor Laboratory In vivo high throughput selection of RNAi probes
WO2005056761A2 (en) * 2003-12-05 2005-06-23 Massachusetts Institute Of Technology REAGENTS AND METHODS FOR IDENTIFICATION OF RNAi PATHWAY GENES AND CHEMICAL MODULATORS OF RNAi
US20060258007A1 (en) * 2005-05-16 2006-11-16 Nicolaides Nicholas C Regulated vectors for selection of cells exhibiting desired phenotypes
CA2610265A1 (en) * 2005-05-31 2007-05-10 Cold Spring Harbor Laboratory Methods for producing micrornas
EP1760092A1 (en) * 2005-08-26 2007-03-07 Applied Research Systems ARS Holding N.V. System for screening cells for high expression of a protein of interest
PL1987150T3 (pl) * 2006-02-21 2011-10-31 Chromagenics Bv Selekcja komórek gospodarza wyrażających białka na wysokim poziomach
US20090217399A1 (en) * 2006-03-17 2009-08-27 Massachusetts Institute Of Technology Lentiviral Vectors That Provide Improved Expression And Reduced Variegation After Transgenesis

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