CN102648288B - 基于抑制的对细胞克隆的高通量筛选方法 - Google Patents

基于抑制的对细胞克隆的高通量筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于筛选对靶蛋白具有高水平表达的细胞的方法。所述方法包括向多个宿主细胞引入DNA构建体，所述DNA构建体编码靶蛋白和针对所述宿主细胞中的内源性可选标记物的抑制剂；筛选带有该DNA构建体的宿主细胞，用于表达所述内源性可选标记物；和分离出所述可选标记物表达降低的细胞。本发明还公开了构造为在该宿主细胞中表达该靶蛋白和该抑制剂的DNA构建体。

Description

基于抑制的对细胞克隆的高通量筛选方法
相关申请
本申请要求2009年6月11日提交的美国临时申请61/213,459的优先权，这里通过引用并入其全部内容。
技术领域
本发明涉及生物技术和分子生物学，特别涉及细胞克隆的高通量筛选。
背景技术
生成产生重组蛋白的细胞系的一个关键步骤是在将感兴趣的基因掺入宿主细胞后存活克隆的选择。为了工业规模的生物生产，迫切需要稳定地结合了产品基因并产生大量蛋白产物的克隆。
在异质种群中，重组基因结合到宿主基因组中是非常随机的事件。含有高拷贝数稳定结合的基因的细胞的比例会小于含有低拷贝数结合基因的细胞。高产的亚克隆稀有并易于被更快生长的非产或低产细胞所稀释。因此，需要筛选并测试许多孔(well)以分离具有增加的生产率的亚克隆。通常，有限的稀释方法冗长且耗时。
使用流式细胞术和细胞分选的选择方法的出现显著提高了可被筛选的细胞的数目。可以在短时间内筛选数百万细胞，并且可以从混合细胞群中分离亚群和单个细胞，即使其在该群中的频度低至10-6。
流式细胞术与非荧光报告蛋白配合，用于对产生高水平靶蛋白的克隆的快速早期识别。已基于细胞表面蛋白表达，通过使用能够实现细胞分离的抗体和与配体结合的荧光染料，使其更加便利。例如，可以将细胞表面蛋白(不是通常地在宿主细胞表达)与作为报告分子(reporter)的靶蛋白协调表达。
在表面表达和产率之间的相关性不存在的情况下，可使用如绿色荧光蛋白(GFP)等报告分子，基于胞内蛋白的水平来分离细胞。GFP已成为重要的报告分子，用于基因表达和基于可诱导的基因产物的选择。在哺乳动物细胞系中，GFP已被用于通过与重组蛋白协调表达和基于荧光强度的选择来选择高产克隆。已经观察到表达不同重组蛋白的几个细胞系的GFP荧光强度和重组蛋白生产之间的关联性。然而，这些可选标记物的表达增加了对细胞中的蛋白表达机器的负担，并减少了靶蛋白的产生。
发明内容
本发明的一个方面涉及用于筛选对靶蛋白具有高水平表达的细胞的方法。该方法包括向多个宿主细胞引入DNA构建体，所述DNA构建体编码靶蛋白和针对所述宿主细胞中的内源性可选标记物的抑制剂；筛选带有(harboring)该DNA构建体的宿主细胞，用于表达所述内源性可选标记物；和分离出所述可选标记物表达降低的细胞。所述DNA构建体构造为在该宿主细胞内表达该靶蛋白和该抑制剂。
在一个实施方式中，所述抑制剂选自由小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、miRNA与shRNA的杂种、和反义RNA组成的组。
在另一个实施方式中，所述抑制剂为shRNA。
在另一个实施方式中，所述内源性可选标记物为荧光标记物，且所述分离步骤包括用荧光活化细胞分选器(FACS)分选细胞。
在另一个实施方式中，所述DNA构建体进一步编码二氢叶酸还原酶(DHFR)，且所述宿主细胞为DHFR-缺陷细胞。
本发明的另一方面涉及用于选择转基因表达细胞的高通量筛选方法。该方法包括用负载至少一种转基因和抑制荧光蛋白表达的干扰RNA的载体转染表达该荧光蛋白的宿主细胞；测定被转染细胞中的荧光强度；和分离其荧光强度低于未转染的细胞的荧光强度的细胞。
在一个实施方式中，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白(GFP)。
在另一个实施方式中，所述干扰RNA为基于mir-30的shRNA。
在另一个实施方式中，所述分离步骤包括用FACS分选细胞。
在另一个实施方式中，所述表达荧光蛋白的细胞为DHFR缺陷CHO细胞。
在另一个实施方式中，所述至少一种转基因通过内部核糖体进入位点(IRES)与编码DHFR的基因连接。
本发明的另一方面涉及表达载体，该表达载体用于高通量筛选带有该表达载体的细胞。所述表达载体包括第一核苷酸序列，其编码靶蛋白；第二核苷酸序列，其编码用于宿主细胞的外源性可选标记物；第三核苷酸序列，其编码针对宿主细胞中的内源性可选标记物的抑制剂，和一种或多种调控元件，其控制第一、第二、和第三核苷酸序列在宿主细胞中的表达。所述第一核苷酸序列通过内部核糖体进入位点(IRES)与第二核苷酸序列连接。
在一个实施方式中，所述表达载体进一步包括一种或多种抗阻抑物元件。
在相关的实施方式中，所述一种或多种抗阻抑物元件包括部分小鼠抗阻抑物元件40。
在另一个实施方式中，所述抑制剂为干扰RNA。
在相关的实施方式中，所述干扰RNA为基于miR-30的shRNA。
在另一个实施方式中，所述内源性可选标记物为荧光蛋白。
在相关的实施方式中，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白。
在另一个实施方式中，所述外源性可选标记物为二氢叶酸还原酶。
在另一个实施方式中，所述一种或多种调控元件包括CMV IE增强子。
附图说明
图1为表示基于GFP的对转基因高表达细胞克隆进行筛选的方法的示意图。
图2为表达载体pScinoDP-DHFR的图谱。
图3为表达载体pScinoDP3-DHFR的图谱。
图4为表达载体pScinoDP3mir-DHFR的图谱。
图5为表达载体pScinoDP8mir-DHFR的图谱。
图6为表达载体pScinoDP9mir-DHFR的图谱。
图7A和图7B为构建表达载体pScinoDP9mir-Herceptin(赫赛汀)-DHFR的示意图。
图8为表示herceptin-CHO+GFP/-dhfr细胞中GFP表达和抗体表达的组图。图A：herceptin-CHO+GFP/-dhfr细胞的FACS直方图。图B-C：以不同荧光强度水平分选的herceptin-CHO+GFP/-dhfr细胞的FACS直方图。图E：从不同荧光群(fluorescent populations)分选的细胞的抗体生产的ELISA分析。
图9为表示在多轮选择之后herceptin-CHO+GFP/-dhfr细胞中GFP表达的示意图。图A：GFP表达后的CHO/-dhfr细胞的FACS直方图。图B：G418选择后herceptin-CHO+GFP/-dhfr细胞的FACS直方图。图C：第一轮MTX(100nM)扩增后的herceptin-CHO+GFP/-dhfr细胞的FACS直方图。图D：第二轮MTX(100nM)扩增后的herceptin-CHO+GFP/-dhfr细胞的FACS直方图。
图10表示由与PE结合的抗人IgG(Fc)抗体染色的herceptin--CHO+GFP/-dhfr细胞的FACS分析。根据实验设计和左上的图，分泌抗体的细胞(Cells secreting antibodies)为PE阳性和GFP阴性。荧光信号通过FACS测定，并用标准补偿协议(standard compensationprotocol)校准。
图11表示herceptin-CHO+GFP/-dhfr细胞FACS分选步骤的重要特征和ELISA结果。图A：Herceptin-CHO+GFP/-dhfr细胞的FACS直方图。水平条和灰色区域表示用于单细胞分析的低荧光和高荧光细胞群。图B：通过ELISA检测到的从低荧光或高荧光群中选择的克隆个体的抗体表达水平。
图12表示用DNA构建体编码shRNAGFP和Herceptin转染的细胞中的GFP表达的FACS分析组图。
具体实施方式
本发明公开了用于筛选对外源性蛋白具有高水平表达的细胞的方法。在一个实施方式中，所述方法包括以下步骤：向多个宿主细胞引入DNA构建体，其编码靶蛋白和针对宿主细胞中的内源性可选标记物的抑制剂，其中所述构建体构造成在宿主细胞内部表达靶蛋白和抑制剂；筛选带有DNA构建体的用于表达内源性可选标记物的宿主细胞；和分离出内源性可选标记物表达减少的细胞。
以下，术语″细胞″/″宿主细胞″和″细胞系″/″宿主细胞系″分别定义为真核细胞及其同源细胞群，所述同源细胞群通过本领域已知的方法在细胞培养中保持，并能够表达异源蛋白。在一个实施方式中，所述细胞为CHO细胞。在另一个实施方式中，该细胞为表达作为内源性选择标记物的GFP的CHO细胞。在另一个实施方式中，该细胞为DHFR基因有缺陷且表达作为内源性选择标记物的GFP的CHO细胞。
以下，术语″表达″一般是指在细胞中一个或多个具体RNA产物或一个或多个具体蛋白质的生产。在RNA产物的情况下，它是指转录过程。在蛋白产物的情况下，它是指转录、转译、任选的转译后修饰(例如，糖基化，双硫键形成，等)，然后分泌的过程。在多亚基蛋白的情况下，其包括从多肽单体装配多亚基结构。名词“表达”对应的动词具有与名词类似的含义。
以下，术语″可选标记物″一般是指细胞内可以直接或间接检测其存在的基因和/或蛋白，例如，使选择剂失活并保护宿主细胞免受该试剂的致死或生长抑制影响的基因和/或蛋白(例如耐抗生素基因和/或蛋白)。另一个可能是可选标记物诱导荧光或色素沉淀(例如，绿色荧光蛋白和衍生物、荧光酶、或碱性磷酸酶)。术语“内源性可选标记物”是指被在将DNA构建体引入宿主细胞前存在于宿主细胞中的多核苷酸编码的可选标记物。“内源性可选标记物”的编码序列可以以结合的形式存在(即，结合到细胞基因组中)或以游离态存在。
以下，术语“DNA构建体”是指表达或转化构建体。DNA构建体包括至少一个表达单元或表达盒。术语″表达单元或表达盒″这里定义为能够表达编码序列或开放阅读框的单元。″表达单元或表达盒″一般包括可操作地连接到编码感兴趣分子(即，多肽或多核苷酸)的转基因的一种或多种调控元件。
“调控元件”是通过可操作地连接到编码序列而调控转基因表达的核酸序列。调控序列的实例包括但不限于适当的转录起始序列、终止序列、启动子序列和增强子序列；高效的RNA加工信号(processingsignals)，例如剪接和多腺苷酸化信号；能稳定细胞质mRNA的序列；能提高翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；能提高蛋白稳定性的序列；和如果需要，能增强蛋白分泌的序列。调控序列可以以顺式或反式构型起作用，或远程(at a distance)控制感兴趣基因。
″转基因″为待传递或转移到哺乳动物细胞的核酸序列。转基因可以编码用作标记物、报告分子或治疗分子的蛋白、肽或多肽。转基因还可以编码用于蛋白生产、诊断分析的蛋白、肽或多肽或用于瞬时基因或稳定基因在体外或体内的基因转移的蛋白、肽或多肽。作为选择，转基因可以编码功能性多核苷酸，如miRNA、RNAi、shRNA、反义RNA、核酶或其他调控核酸。转基因还包括用于诱导DNA重组和基因修复的DNA序列。
核酸序列″可操作地连接″到另一个核酸序列，当使前者置于与后者的功能性关系中时。例如，用作前序列或分泌前导肽的DNA可操作地连接到用于多肽的DNA，如果所述用作前序列或分泌前导肽的DNA被表达为参与该多肽(hepolypeptide)分泌的前体蛋白；启动子或增强子可操作地连接到编码序列，如果该启动子或增强子影响该序列的转录；或核糖体结合位点可操作地连接到编码序列，如果该核糖体结合位点的位置便于翻译。一般而言，″可操作地连接″的意思是被连接的DNA序列是相邻的，在分泌先导(secretory leader)的情况下，为相邻的且为阅读相(reading phase)。然而，增强子并不一定是相邻的。连接通过在方便的限制性位点进行连接(ligation)而实现。如果没有这样的位点，可按照常规方法使用合成寡核苷酸接头(adaptor)或连接子(linker)。
“针对可选标记物的抑制剂”可以是直接或间接抑制该可选标记物的表达或活性的多肽或多核苷酸。在一个实施方式中，所述抑制剂为多核苷酸，如小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、miRNA与shRNA的杂种、或反义RNA分子，所述多核苷酸抑制宿主细胞中该可选标记物的表达。在另一个实施方式中，抑制剂为多肽，如转录调控子，所述多肽抑制宿主细胞中该可选标记物的表达。在另一个实施方式中，抑制剂为多肽，如抗体，所述多肽抑制该可选标记物的生物活性。
这里所用的术语″siRNA″是指具有约10～50核苷酸长度的RNA试剂(术语″核苷酸″包括核苷酸类似物)，优选为双链试剂，优选约15～25核苷酸长度，更优选约17、18、19、20、21、22、23、24或25核苷酸长度，所述链任选具有突出端(overhanging ends)，包括例如1、2或3个突出(overhanging)核苷酸(或核苷酸类似物)，其能够引导或介导RNA干扰。自然存在的siRNAs通过细胞的RNA干扰(RNAi)机制从较长dsRNA分子(例如，＞25核苷酸长度)生成。
这里所用的术语″RNA干扰″或″RNAi″一般是指序列特异性或序列选择过程，靶分子(例如，靶基因，蛋白或RNA)通过该过程被下调。在具体的实施方式中，″RNA干扰″过程或″RNAi″在RNA分子(例如在细胞中的RNA分子)的降解中起重要作用，所述降解通过RNA试剂触发。降解通过酶促RNA诱导的沉默复合体(RISC)催化。RNAi自然地发生在细胞中，以除去外来RNA(例如，病毒RNA)。天然RNAi通过从将降解机制导向其他相似RNA序列的游离dsRNA切出的片段来进行。另选地，RNAi可通过将小干扰RNA分子引入细胞以使靶基因的表达沉默而引发。
以下，术语″shRNA″是指具有茎环结构的RNA试剂，其包括互补序列的第一和第二区域，区域的互补度和取向足以使在区域之间发生碱基配对。第一和第二区域通过环区结合，在环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺少碱基配对而造成环。shRNA发夹结构可通过细胞机制而被切成siRNA，然后siRNA与由RNA诱导的沉默复合体(RISC)结合。此复合体与mRNA结合并切割mRNA，所述mRNA为与所结合的该siRNA匹配的mRNA。
DNA构建体可进一步含有在该DNA构建体构建期间，在细菌中的用于复制和选择的质粒元件。DNA构建体还可以含有利于DNA构建体在宿主细胞中的扩增的其他选择标记物。DNA构建体编码的选择标记物被认为是外源性选择标记物。外源性选择标记物的实例包括但不限于耐抗生素(例如编码抗G418的新霉素基因)或酶的类似物(例如，编码抗甲氨蝶呤的二氢叶酸还原酶基因)。
在一个实施方式中，所述DNA构建体含有双顺反子表达盒，其中感兴趣蛋白的开放阅读框通过内部核糖体进入位点(IRES)与外源性选择标记物的编码序列连接，或与内源性标记物的抑制剂连接，使其转录到相同的mRNA中，并独立地翻译。由于其各自源于共同的mRNA，外源性选择标记物或抑制剂的表达水平准确地预见各个克隆的感兴趣蛋白的相关表达水平。优选地，双顺反子表达盒中的感兴趣蛋白的开放阅读框位于外源性选择标记物的编码序列或内源性可选标记物的抑制剂的上游。
例如，为了改善甲氨蝶呤(MTX)多轮扩增的准确性和通量，编码治疗蛋白(如抗体的轻链)的基因通过IRES在3’端连接到外源性可选标记物(如DHFR)，使得其转录到相同的mRNA中，但独立翻译。IRES介导的翻译的效率低于5’帽介导的翻译，这确保了细胞资源主要用于生产该治疗蛋白，而不是DHFR蛋白。然而，由于其源自相同的mRNA，DHFR扩增水平准确预见各个克隆的治疗蛋白的相对表达水平。
在另一个实施方式中，DNA构建体进一步含有对抗染色质相关的阻抑的一种或多种抗阻抑物元件(ARE)。以下，ARE(或抗阻抑物序列，本文可交换使用)是天然存在的基于其阻碍转基因阻抑的能力分离自真核基因组的DNA元件。ARE包括影响顺式基因转录的能力和/或提供稳定和/或增强效果的能力。已经证明，当ARE侧翼(flank)转基因时，随机选择的重组细胞系的转基因表达水平能够提高到接近转基因启动子的最高可能表达的水平。而且，转基因的表达水平可历经数代细胞而保持稳定，且没有显示随机的沉默。因此，ARE为转基因提供了与位置无关的表达度，这种表达度用常规的转基因体系是不可能达到的。与位置无关的意思是，在ARE的保护下，可使结合到原本会导致转基因沉默的基因组位置的转基因维持转录活性状态。在一个实施方式中，所述ARE为部分小鼠ARE40片段。在另一个实施方式中，DNA构建体含有多重部分小鼠ARE40片段。
将DNA构建体引入细胞的方法为本领域已知。这样方法的实例包括但不限于电穿孔、脂质体转染、磷酸钙或氯化钙共沉淀和DEAE-葡聚糖-介导转染。DNA构建体还可以通过病毒载体引入到细胞中。通常所用的病毒载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体、疱疹病毒载体和逆转录病毒载体。
筛选用DNA构建体转染的细胞，用于外源性和内源性可选标记物的表达。可选标记物抑制剂从DNA构建体高水平表达会导致内源性可选标记物的表达和/或活性降低。然后分离并亚克隆可选标记物表达降低的细胞，以测定转基因表达的水平和稳定性。
在某些实施方式中，内源性可选标记物是可以被诱导发荧光的蛋白。在这些实施方式中，筛选步骤和分离步骤可以用荧光活化细胞分选器(FACS)同时进行。
在其他实施方式中，用DNA构建体转染的细胞先用外源性标记物进行一轮或多轮选择(例如，选择耐G418和/或耐甲氨蝶呤的克隆)。然后筛选所选择的细胞中具有降低的表达和/或活性的内源性可选标记物的细胞。
所公开的还有一种DNA构建体，该DNA构建体构造成使得带有该DNA构建体的细胞可以进行高通量筛选。在一个实施方式中，所述DNA构建体含有用于靶蛋白的编码序列和用于针对宿主细胞中的内源性可选标记物的抑制剂的编码序列，其中DNA构建体构造成使得可以在该宿主细胞中同时表达所述靶蛋白和所述抑制剂。
在一个实施方式中，所述抑制剂为抑制宿主细胞中内源性可选标记物的表达的小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、miRNA与shRNA的杂种或反义RNA分子。
在另一个实施方式中，抑制剂为多肽，如转录调控子，所述多肽抑制宿主细胞中内源性可选标记物的表达。
在另一个实施方式中，抑制剂为多肽，如抗体，所述多肽抑制内源性可选标记物的生物活性。
在另一个实施方式中，内源性可选标记物为诱导荧光的蛋白。
在另一个实施方式中，DNA构建体进一步包括一种或多种抗阻抑物元件。
本发明所描述的技术能够从转染细胞的异质群中快速识别和分离高产克隆，减少与标准的有限稀释克隆方法相关的劳力和时间。另外，由于该技术可以识别在该群中作为稀有事件的所需细胞，其可以通过在分离高产克隆前减少池扩增的轮数，或者通过先分离用于药物扩增和亚克隆的高产克隆而缩短发育时间轴。
实施例
基于绿色荧光蛋白(GFP)/荧光活化细胞分选器(FACS)的筛选方法的简易性和效率已被之前的研究所证实。在之前的这些报道中，GFP作为使用内部核糖体进入位点(IRES)或双启动子体系之一的融合蛋白的一部分或双顺反子构建体的一部分被结合。具有高水平GFP的细胞与高水平的感兴趣蛋白产物相关。这能被归于高拷贝数重组基因的稳定整合或是将基因整合到具有非常高转录活性的位点。虽然这些方法已被显示有效，但是对于使用含有GFP的细胞系用于人治疗剂的制造会有一些顾虑。进而，在亚群分离之后，似乎不需要使细胞代谢机制负担GFP生产。此细胞源有可能被转成增加细胞生长或重组蛋白生产。以下的实施例描述了用于选择高产细胞克隆的新技术，其结合FACS分选，反向地使用GFP作为选择标记物。图1为表示基于GFP的选择过程的示意图。简言之，含有编码GFP的cDNA的质粒载体被转染到DHFR缺陷CHO细胞中。成功获得该所需载体的细胞是发荧光的。GFP表达细胞作为亲本宿主细胞用于重组蛋白表达。
为了需要的重组蛋白生产，用含shRNAmireGFP的载体转染亲本宿主细胞，然后对其进行FACS分选以筛选具有低荧光强度的细胞。对经过数轮渐增的MTX挑战之后的细胞培养物进行重复几轮分选和扩展。GFP荧光强度最低的细胞克隆将与转基因表达最高的克隆对应。最终，扩展并测试所选择的克隆的生产和稳定性。由于FACS能够简易地筛选大量细胞，因此与有限稀释方法相比，得到高产克隆的机会将显著增加。而且，该程序劳动强度较低，且可显著降低产生用于生物生产的克隆所需的时间。
实施例1：建立CHO+GFP/-dhfr细胞系
将中国仓鼠卵巢二氢叶酸还原酶缺陷细胞系(CHO/dhfr-)保持在IMDM细胞培养基(Iscove’s modified Dulbecco’s medium)(IMDM，Gibco，Cat.No.12200)中，所述IMDM细胞培养基补充了HT(0.1mM次黄嘌呤钠和0.016mM胸腺嘧啶，Gibco，Cat No.11067)、10％FBS(Biological Industries，Cat.04-001-1A)和2μM甲氨蝶呤水合物(MTX，Sigma，SI-M8407)。
根据LipofectamineTM Invitrogen PulsTM Reagent(Cat.No.11514-015)的说明书使用lipofectamine，用含有编码GFP的cDNA的5ug质粒载体(pFLAg-eGFP-IRES-Puro)转染CHO/dhfr-细胞。使用5μg/ml嘌呤毒素二盐酸盐(Sigma，SI-P8833)选出转染的细胞。在补充了HT、10％FBS、2μM MTX和选择性抗生素的IMDM培养基中选择了10天之后，细胞保留在上述培养基中。表达GFP的CHO-dhfr细胞(CHO+GFP/-dhfr细胞)被克隆并作为用于重组蛋白表达的亲本宿主。
实施例2：表达载体的构建
(1)pScinoDP-DHFR载体
通过用IRES-DHFR融合基因取代pEGFP-N1(Clontech)质粒主链中的EGFP基因，并在pEGFP-N1(Clontech)质粒主链插入SV40polyA尾和CMV-IE启动子而构建pScinoDP-DHFR质粒。简言之，通过使用pCEP4质粒(Invitrogen)作为模板的PCR扩增得到polyA尾和CMV-IE启动子序列。融合的polyA尾-启动子融合序列SV40polA-CMV-IE(约1.2kb)通过PCR的重叠延伸(OL-PCR)而产生。用XhoI/BglII消化融合序列，并插入到XhoI/BglII消化的pEGFP-N1载体中。所得构建体命名为pScinoDP。
通过使用pIRES2-EGFP和pSV2-DHFR质粒作为模板的PCR扩增得到IRES序列和DHFR基因。IRES序列片段与DHFR基因片段(IRES2-DHFR)的杂种通过PCR的重叠延伸(OL-PCR)而产生。用AgeI/NotI消化杂种的片段(～1.1kb)并插入到AgeI/NotI消化的pEGFP-N1中，以取代pEGFP-N1载体中的EGFP基因。所得构建体命名为pIRES2-DHFR。进行定点突变以消除IRES序列中的ApaLI位点。
将在IRES序列具有突变的限制酶ApaLI位点的质粒pIRES2-DHFR用AgeI/NotI和含有IRES序列的1.2kb片段消化，将整个DHFR编码区基因连接至由AgeI/NotI消化的pScinoDP，产生pScinoDP-DHFR(图2)。所有构建体均通过限制性分析和/或核苷酸测序确认。
(2)pScinoDP3-DHFR载体
pScinoDP3-DHFR载体是基于pScinoDP-DHFR的载体，其负载具有CMV-IE增强子的hEF1α启动子。简言之，hEF1α启动子从pBudCE4.1载体(Invitrogen)扩增。通过CMV-IE增强子在pEGFP-N1上形成pCMVe-hEF1α-EGFP载体后，亚克隆hEF1α启动子而得到带有hEF1α启动子的杂种CMV-IE增强子序列。CMVe-hEF1α片段是从pCMVe-hEF1α-EGFP载体PCR扩增的，并用于代替pScionDP-DHFR载体中的两种CMV启动子。所得载体名命为pScinoDP3-DHFR(图3)。
(3)pScinoDP3mir-DHFR载体
使用如下的合成骨架DNA和引物，利用所描述的PCR产生单链97nt “mir30-like”shRNAiGFP寡核苷酸(oligo)：
单链97nt“shRNAiGFP DNA寡核苷酸
5’-
带下划线的斜体序列代表侧翼mir30序列，没带下划线的斜体序列代表mir30环结构。作为样品的正义和反义-选择靶序列分别示为黑体和黑体加下划线。所合成的mir30-like shRNAiGFP是作为与内源mir30 miRNA侧翼序列部分具有共同端的单链DNA寡核苷酸。
mirFWD-引物序列(40mers)：
5’-CAGAAGGACCGGTAAGGTATAT
mirREV-HindIII引物序列(37mers)：
5’-CTAAAGTAGCCCCTT
带下划线的斜体序列中所示的侧翼区，被用作通用的侧翼以引发反应，由此扩增整个mir30-like shRNAiGFP以生产能够被克隆到受体载体中的PCR产物。
使用PlatinumPfx DNA聚合酶，按照如下方法进行PCR：95℃进行3min，然后95℃进行30s，54℃进行30s，75℃进行30s，总共进行35轮。将所得PCR产物(AgeI-shRNAiGFP)克隆到修饰过的pEGFP-N1载体(AgeI位点损毁且在新霉素基因之后附加AgeI和EcoRV位点)中。所得构建体命名为pEGFP-N1-shRNAiGFP。通过DNA测序确认这些AgeI-shRNAiGFP序列。
用ApaLI-NotI消化pEGFP-N1-shRNAiGFP载体。用从pScinoDP3-DHFR得来的ScinoDP3-DHFR片段代替CMV-IE-GFP片段。所得构建体命名为pScinoDP3mir-DHFR(图4)。
(4)pScinoDP8mir-DHFR载体
pScinoDP8mir-DHFR载体含有调控DNA元件mARE40。调控元件，如源自看家基因的抗阻抑元件，已证明可积极影响从细胞系产生的重组蛋白的特异性生产。质粒pEGFP-N1用作这个构建体的主链。简言之，使用如下的合成骨架DNA和引物，利用所描述的重叠-PCR产生部分小鼠抗阻抑物元件40片段：
mARE40-L1(+)骨架DNA：
5’-TTGCTCTGAGCCAGCCCACCAGTTTGGAATGACTCCTTTTTATGACTTGAATTTTCAAGTATAAAGTCTAGTGCTAAATTTAATTTGAACAACTGTATAGTTTTTG-3’
mARE40-L1(-)骨架DNA：
5’-TTAGAAATCCTCACACACAACAAGTTTTCATTTCACTTCTAATTCTGAAAAAAACACTGCCACCATTTTTTTTCCTTCCCCCAACCAGCAAAAACTATACAGTTGT-3’
mARE40-R1(+)骨架DNA
5’-GTGTGTGAGGATTTCTAATGACATGTGGTGGTTGCATACTGAGTGAAGCCGGTGAGCATTCTGCCATGTCACCCCCTCGTGCTCAGTAATGTACTTTACAGAAATC-3’
mARE40-R1(-)骨架DNA
5’-TGGCAGAAATGCAGGCTGAGTGAGACTACCCAGAGAAGAGACCGGATATACACAAGAAGCATGGTTTATATCAATCTTTTGAGTTTAGGATTTCTGTAAAGTACAT-3’
mARE40-5’引物：5’-TTGCTCTGAGCCAGCCCACCAGTTT-3’
mARE40-3’AseI引物：
5’-GTTATTAATTGGCAGAAATGCAGGCTGAGT-3’
mARE40-3’AflII引物：
5’-CCCACATGTTGGCAGAAATGCAGGCTGAGT-3’
mARE40-3’SpeI引物：
5’-GGACTAGTTGGCAGAAATGCAGGCTGAGTG-3’
用PlatinumPfx DNA聚合酶按照以下方式进行PCR：95℃进行3min，然后95℃进行30s，58℃进行30s，且75℃进行30s，总共35轮。所得PCR产物(mARE40-AseI和mARE40-AflII)分别克隆到修饰过的pEGFP-N1(AgeI位点损毁，在AseI之前附加EcoRV，在AflII位点之前附加ScaI位点)载体以形成pmARE40-EGFP-N1，且(mARE40-SpeI)被克隆到pScinoDP3-DHFR(SpeI位点前附加EcoRV位点)载体以形成pScinoDP3-DHFR-F2。用AseI-BamHI消化pmARE40-EGFP-N1载体，并用来自pScinoDP3-DHFR载体的～1.6kbAseI-CMVe-hEF1α-BamHI片段代替CMV-IE启动子。所得构建体命名为pFmARE40ScinoDP3-EGFP-N1。用BamHI-NotI消化pFmARE40ScinoDP3-EGFP-N1载体，并用来自pScinoDP3-DHFR-F2的～1.6kb BamHI-SV40polA-mARE40-DP3-IRES-DHFR-NotI片段代替EGFP基因。所得构建体命名为pScinoDP8-DHFR。用ApaLI-NotI消化pEGFP-N1-shRNAiGFP载体，并用来自pScinoDP8-DHFR的ScinoDP8-DHFR片段代替CMV-IE-GFP片段。所得构建体命名为pScinoDP8mir-DHFR(图5)。克隆的部分小鼠抗阻抑物元件40片段的完整序列如下：
5’-TTgCTCTgAgCCAgCCCACCAgTTTggAATgACTCCTTTTTATgACTTgAATTTTCAAgTATAAAgTCTAgTgCTAAATTTAATTTgAACAACTgTATAgTTTTTgCTggTTgggggAAggAAAAAAAATggTggCAgTgTTTTTTTCAgAATTAgAAgTgAAATgAAAACTTGTTgTgTgTgAggATTTCTAATgACATgTggTggTTgCATACTgAgTgAAgCCggTgAgCATTCTgCCATgTCACCCCCTCgTgCTCAgTAATgTACTTTACAgAAATCCTAAACTCAAAAgATTgATATAAACCATgCTTCTTgTgTATATCCggTCTCTTCTCTGGGTAgTCTCACTCAgCCTgCATTTCTgCCA-3’
(5)pScinoDP9mir-DHFR载体
pScinoDP9mir-DHFR载体(图6)是通过与构建pScinoDP8mir-DHFR载体相似的程序构建的，并用CAG启动子(与鸡β-actin启动子融合的CMV-IE增强子)取代pScinoDP8mir-DHFR的两个CMV增强子。pScinoDP9mir-DHFR的完整序列如 中所示。
pScinoDP9mir-DHFR在MCSII和二氢叶酸还原酶(DHFR)编码区之间含有脑心肌炎病毒(ECMV)的内部核糖体进入位点(IRES)。其使得感兴趣基因(例如：克隆到MCSII中的轻链)和DHFR基因得以从单个双顺反子mRNA翻译。序列侧翼DHFR已经转化为Kozak一致翻译起始位点(consensus translation initiation site)以进一步提高真核细胞的翻译效率。pScinoDP9mir-DHFR中的MCSI在即刻早期启动子CMV(PCMV IE)和SV40多聚核苷酸化信号序列之间。MCSI的SV40多聚核苷酸化信号下游指引第一转录的3′端的合适加工。pScinoDP-dhfr中的MCSII在巨细胞病毒的第二即刻早期启动子(PCMV IE)和IRES序列之间。DHFR基因的SV40多聚核苷酸化信号下游指引双顺反子mRNA的3′端的合适加工。
由于pScinoDP9mir-DHFR源自pEGFP-N1载体，其含有用于在表达SV40 T抗原的哺乳动物细胞中复制的SV40来源(origin)。耐新霉素盒(Neor)由SV40早期启动子、耐新霉素/卡那霉素基因Tn5、和来自单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV TK)基因的多聚核苷酸化信号组成，其使得可以使用G418对稳定转染的真核细胞进行选择。这个盒的细菌启动子上游在E.coli中表达卡那霉素耐性。pScinoDP-DHFR主链也含有用于在E.coli中增殖的复制pUC来源和用于单链DNA生产的f1来源。
(6)pGFP/嘌呤霉素载体
通过使用pIRES2-EGFP和pLKO-AS3w-puro质粒作为模板的PCR扩增得到IRES序列和DHFR基因。IRES序列片段与嘌呤霉素基因片段的杂种(IRES2-嘌呤霉素)通过利用PCR的重叠延伸(OL-PCR)而得到。将IRES2-嘌呤霉素片段插入到SalI-BamHI消化的pFLAG-CMV2载体(Kodak)中。所得构建体命名为pIRES2-Puro。EGFP基因由pEGFP-N1载体得到，并插入到pIRES-Puro载体中以形成pGFP/嘌呤霉素载体。
(7)pScinoDP9mir-Herceptin-DHFR载体
pScinoDP9mir-Herceptin-DHFR载体的构建如图7A和图7B所示。简言之，4-1Leader序列和4-2Leader序列由寡聚-合成骨架片段的PCR扩增，同时人IgG1(hIgG1CH)的重链恒定区序列和人IgG1(hIgG1CL)的轻链恒定区序列由含有人IgG1序列的重组质粒得到。先导序列与hIgG1恒定区序列载体的杂种通过将hIgG1恒定区利用定向连接(orientationlinkage)亚克隆到含有载体的先导序列而得到。
然后，重链(VH)和轻链(VL)的变异区通过重复的重叠PCR从寡聚-合成骨架片段而产生，并亚克隆到p4-1Leader-hIgG1CH或p4-2Leader-hIgG1CL载体中。修正了PCR的错误并除去在克隆过程中引入的附加序列之后，通过测序检验前导肽-HerceptinVC序列的正确性(图7A)。
最终，将4-1Leader-Herceptin重链(4-1-HerceptinVCH)与4-2Leader-Herceptin轻链(4-2-HerceptinVCL)的杂种各自亚克隆到pScinoDP9mir-DHFR载体的MCSI和MCSII位点，以形成pScinoDP9mir-Herceptin-DHFR载体(图7B)。
用于anti-HER2重链1的变异区的氨基酸和核苷酸序列分别示于中。用于重链(VH)的变异区的骨架片段和PCR引物具有如下序列：
骨架片段：
HerceptinVH-L1(+)(108mer)
5’-gAggTgCAgCTCgTggAgAgTggTggCgggTTggTCCAgCCAggCgggTCTCTgCgATTgAgCTgTgCTgCCTCTggATTTAACATCAAAgACACgTACATCCATTgg-3’
HerceptinVH-L2(-)(105mer)
5’-TTTAACgCTATCAgCgTATCTggTgTAgCCgTTAgTgggATAgATTCTAgCTACCCATTCAAggCCCTTgCCgggggCCTgTCTCACCCAATggATgTACgTgTC-3’
HerceptinVH-R1(+)(105mer)
5’-TACgCTgATAgCgTTAAAggAAggTTTACTATTTCTgCCgACACCTCCAAgAATACCgCATATCTACAgATgAACTCCCTgCgCgCTgAggACACCgCTgTgTAT-3’
HerceptinVH-R2(-)(108mer)
5’-CTTAgTAgAgCACTgCTAACTgTCACTAAggTACCCTggCCCCAgTAgTCCATTgCgTAgAATCCgTCTCCCCCCCAACgTgAgCAgTAATACACAgCggTgTCCTC-3’
用于扩增的引物：
Herceptin-VH-5HindIII(30mer)(正义)
5’-gCCAAgCTTgAggTgCAgCTCgTggAgAgT-3’
Herceptin-VH-3ApaI(30mer)(反义)
5’-AgggggCCCTTAgTAgAggCACTgCTAACT-3’
用于anti-HER2轻链1的变异区的氨基酸和核苷酸序列分别如所示。用于轻链(VL)的变异区的骨架片段和PCR引物具有如下序列：
骨架片段：
HerceptinVL-L1(+)(93mer)
5’-gATATACAgATgACACAgTCTCCgTCAAgTCTgAgCgCAAgCgTgggCgACCggGTAACAATTACCTgTAgAgCCAgCCAggACgTAAATACA-3’
HerceptinVL-L2(-)(95mer)
5’-CCgCTATAAAggAACgAggCAgAgTAgATCAgAAgCTTAggAGCTTTACCAggTTTTTgCTgATACCAggCCACggCTgTATTTACgTCCTggCT-3’
HerceptinVL-R1(+)(94mer)
5’-CTCgTTCCTTTATAgCggggTgCCAAgCCgCTTCTCCggATCTAggTCTggAACAgACTTTACTCTgACCATTTCCAgTCTCCAgCCCgAAgAC-3’
HerceptinVL-R2(-)(93mer)
5’-CTTgATCTCgACCTTggTgCCCTgCCCAAATgTgggTggAgTCgTgTAATgTTgCTggCAATAgTAggTAgCAAAgTCTTCgggCTggAgACT-3’
用于扩增的引物
Herceptin-VL-5HindIII(30mer)(正义)
5’-gCCAAgCTTgATATACAgATgACACAgTCT-3’
Herceptin-VL-3BamHI(30mer)(反义)
5’-CgCggATTCCTTgATCTCgACCTTggTgCC-3’
实施例3：建立herceptin/CHO+GFP/-dhfr细胞系
将CHO/+GFP/-dhfr细胞悬浮在PBS缓冲液中。将40μg线性化的质粒(pScinoDP9mir-Herceptin-DHFR)DNA加入到细胞中，并在冰上培育10min。然后在电压750V、电容25μF条件下通过两脉冲对细胞进行电穿孔(具有电容扩充器的Gene Pulser II，和Bio-Rad的脉冲控制器)。将经过电穿孔的细胞在T-175烧瓶中用25mL培养基(IMDM，补充了HT、10％FBS、2μM MTX和5μg/ml嘌呤毒素二盐酸盐)覆盖24h。然后用800μg/ml G418硫酸盐(Calbiochem，Cat#345810)，在补充了10％D-FBS(Gibco，Cat.No.30067-334)和5μg/ml嘌呤毒素二盐酸盐的α-最低必须培养基(Alpha-MEM，Gibco，Cat.No.12000)中选择细胞。经过在补充了10％D-FBS和选择抗生素的Alpha-MEM培养基中14天的选择，以递增的浓度对细胞进行MTX处理，用于基因扩增。
细胞被FACS分选以筛出具有低GFP荧光强度的细胞。由于靶基因和shRNAGFP的表达会导致在CHO+GFP/-dhfr细胞中GFP生产降低，具有最少绿色荧光(GFP阴性)的细胞将具有最高水平的靶基因表达。使用MoFloTM XDP(Beckman Coulter)进行FACS，该设备装有Summit软件、488nm的激光发射和用于分选的细胞沉积单元。
使用FACS，使单细胞沉积，将低荧光和高荧光细胞群分选到含有补充了10％D-FBS、G418、嘌呤毒素二盐酸盐和MTX的220μlAlpha-MEM的96孔培养板中。在37℃和5％二氧化碳的湿润的培养箱中培育克隆12天。
实施例4：herceptin-CHO+GFP/-dhfr细胞系的表征
(1)用免疫染色检测表面抗体
将胰蛋白酶化的herceptin-CHO+GFP/-dhfr细胞在200rpm离心5min。用PBS将细胞洗两遍，并再悬浮到PBS中得到最终浓度约1×107细胞/ml。然后用结合了藻红蛋白(PE)的小鼠抗人IgG(Fc)(BeckmanCoulter，Cat.No.736007)按照生产者推荐的稀释，在4℃、黑暗下培育细胞30min，用PBS洗两遍，保持在冰上用于FACS分析。
(2)用ELISA检测分泌的抗体
简言之，用稀释在0.05M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH 9.7)中的抗人IgG抗体(Sigma：I1886)涂覆96孔板，并在4℃下培育16h。板用封闭液(10mM Tris、0.15M NaCl、1％脱脂乳、pH 8.0)在37℃下封闭30min。将培养物上清液装入孔中，并在37℃培育2h。按照生产者推荐的，将稀释在稀释缓冲液(10mM Tris、0.15M NaCl、0.05％Tween20、pH 8.0)中的结合有辣根过氧化物酶的抗人IgG-F(c)抗体(Abcam：ab7499)在37℃下培育1h。使用底物(1-stepTM ultra TMB-ELISA，Pierce，Cat.34028)检测反应，在酶标仪(Bio-Rad)上读取(read)该板。
(3)结果
图8表示使用FACS分选的不同荧光强度的Herceptin-CHO+GFP/-dhfr细胞的直方图。图A表示在Herceptin-CHO+GFP/-dhfr细胞池中的GFP荧光。基于荧光强度，细胞分成几个亚群(R2、R3和R4)。图B～图D表示各亚群的GFP表达水平。图E表示池中和各个亚群中的anti-herceptin抗体效价。数据显示，具有最低GFP荧光水平的细胞(Herceptin/R4/CHO+GFP/-dhfr)具有最高水平的anti-herceptin效价.
图9表示CHO+GFP/-dhfr细胞中GFP表达水平随着用含有靶蛋白(Herceptin)和shRNAiGFP的DNA构建体转染而降低。FACS图表明在两轮MTX挑战之后，GFP表达水平进一步降低(图C和图D)。这些结果表明靶基因扩增水平与GFP表达水平和基因扩增强度相关。
图10表示用结合PE的小鼠抗人IgG(Fc)染色的Herceptin-CHO+GFP/-dhfr细胞的代表性FACS分析。结果表明产生抗体的细胞(即，有较高PE染色的细胞)展现出低水平的GFP表达。
图11A表示Herceptin-CHO+GFP/-dhfr细胞的直方图。水平条和阴影区表示用于单细胞分析的低荧光和高荧光细胞群。图11B表示18个低荧光细胞克隆中8个产生大于0.3的ELISA值，同时18个高荧光细胞克隆中仅有2个产生大于0.3的ELISA值。这些结果表明低荧光细胞群含有较高频数的高产产生抗体细胞(antibody producing cell)，并且确认了这个基于GFP的反向筛选策略。
图12表示CHO+GFP/-dhfr细胞中的GFP表达因为转染编码Herceptin和shRNAGFP的DNA构建体而降低。
(4)总结
使用与流式细胞术结合的shRNAmireGFP实质性地改善了细胞系发育的准确性和效率的两个重要问题。首先，对于早期克隆筛选，FACS方法对克隆生产率的预测优于对治疗蛋白效价的条件培养基分析。其次，具有不稳定的转基因表达的克隆容易通过在扩增阶段荧光的表观增加而识别。因此，与传统方法相比，本发明的方法提供了对于准确的96孔克隆筛选的新的益处，可识别用于在早期阶段不稳定的克隆进一步的发育和消除的良好的候选物。
这些结果表明本发明的DNA构建体和筛选方法可靠地产生高表达克隆同源蛋白制剂。由于对能够高产率表达重组抗体的哺乳动物细胞系的分离并不是通过有限稀释技术筛选多倍个体克隆进行的，本方法劳动强度较低，且能显著降低产生用于生物生产的克隆所需的时间。该方法并不要求额外的用于克隆选择的试剂，并对监视基因组稳定性有额外的益处。靶基因的表达水平与扩增基因的强度更加相关。双顺反子设计允许在相同染色体中同时表达两个外来基因。通过降低报告基因扩增的强度，抑制方法(inhibitive approach)增强了靶基因扩增的强度。使用ARE，通过消除由抑制外来基因插入不同染色体区域而造成的差异，提高了外来重组蛋白的表达。

Claims (20)

1.用于筛选对靶蛋白具有高水平表达的细胞的方法，其包括：
向多个宿主细胞引入DNA构建体，所述DNA构建体编码靶蛋白和针对所述宿主细胞中的内源性可选标记物的抑制剂,其中，所述内源性可选标记物是被在将所述DNA构建体引入所述宿主细胞前存在于该宿主细胞中的多核苷酸编码的可选标记物，其中，所述DNA构建体构造为在所述宿主细胞内表达所述靶蛋白和所述抑制剂，并且其中所述靶蛋白的表达水平与所述抑制剂的表达水平相关;
筛选带有该DNA构建体的宿主细胞，用于表达所述内源性可选标记物,和
分离出所述内源性可选标记物表达降低的细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述抑制剂选自由小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、miRNA与shRNA的杂种、和反义RNA组成的组。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述DNA构建体进一步编码外源性可选标记物，而且其中，所述DNA构建体含有双顺反子表达盒，在所述双顺反子表达盒中，所述靶蛋白的开放阅读框通过内部核糖体进入位点(IRES)与所述外源性选择标记物的编码序列连接，使得编码所述靶蛋白的基因与编码所述外源性可选标记物的基因被转录到相同的mRNA中，并独立地翻译。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述靶蛋白是治疗蛋白，其中所述内源性可选标记物为荧光标记物，且其中分离步骤包括用荧光活化细胞分选器(FACS)分选细胞。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述DNA构建体进一步编码二氢叶酸还原酶(DHFR)，且其中所述宿主细胞为DHFR缺陷细胞。
6.用于选择转基因表达细胞的高通量筛选方法，该方法包括：
用负载至少一种转基因和抑制荧光蛋白表达的干扰RNA的载体转染表达所述荧光蛋白的细胞，其中所述至少一种转基因编码治疗分子，其中所述载体构造为在所述转染细胞内表达所述治疗分子和所述干扰RNA，且其中所述治疗分子的表达水平与所述干扰RNA的表达水平相关；
测定被转染细胞中的荧光强度；和
分离其荧光强度低于未转染的细胞的荧光强度的细胞。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白(GFP)。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述干扰RNA为基于mir-30的shRNA。
9.如权利要求6所述的方法，其中所述分离步骤包括用FACS分选细胞。
10.如权利要求6所述的方法，其中所述表达荧光蛋白的细胞为二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷CHO细胞。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述至少一种转基因通过内部核糖体进入位点(IRES)与编码DHFR的基因连接。
12.表达载体，其用于高通量筛选带有该表达载体的细胞，所述表达载体包括：
第一核苷酸序列，其中，所述第一核苷酸序列是编码治疗分子的转基因；
第二核苷酸序列，其编码用于宿主细胞的外源性可选标记物；
第三核苷酸序列，其编码针对所述宿主细胞中的内源性可选标记物的抑制剂，其中，所述内源性可选标记物是被在将所述表达载体引入所述宿主细胞前存在于该宿主细胞中的多核苷酸编码的可选标记物，其中所述治疗分子的表达水平与所述抑制剂的表达水平相关；和
一种或多种调控元件，其控制所述第一、第二和第三核苷酸序列在所述宿主细胞中的表达，
其中所述第一核苷酸序列通过内部核糖体进入位点(IRES)与所述第二核苷酸序列连接。
13.如权利要求12所述的表达载体，进一步包括一种或多种抗阻抑物元件。
14.如权利要求13所述的表达载体，其中所述一种或多种抗阻抑物元件包括部分小鼠抗阻抑物元件40。
15.如权利要求12所述的表达载体，其中所述抑制剂为干扰RNA。
16.如权利要求15所述的表达载体，其中所述干扰RNA为基于miR-30的shRNA。
17.如权利要求12所述的表达载体，其中所述内源性可选标记物为荧光蛋白。
18.如权利要求17所述的表达载体，其中所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白。
19.如权利要求12所述的表达载体，其中所述外源性可选标记物为二氢叶酸还原酶。
20.如权利要求12所述的表达载体，其中所述一种或多种调控元件包括CMV IE增强子。
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