CN103391998A - 用于重组蛋白表达的载体和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一系列的真核表达载体，所述真核表达载体利用转录连读事件的减少来建立稳定且高产的重组蛋白表达用细胞系。所述载体包含一个以上的多腺苷酸化信号、或者一个或多个多腺苷酸化信号外加其它DNA片段，已知所述DNA片段增强转录终止来控制选择标记的表达水平，所述载体具有的配置可转录最低水平的全长双顺反子mRNA来表达选择标记，所述载体可用于建立高表达水平的稳定细胞系，而不需要药物选择或药物介导的基因扩增。

Description

用于重组蛋白表达的载体和方法

相关申请的交叉参考

本申请要求2010年7月26日提交的美国序列号61/367,661的优先权权益。前述申请的全部内容和公开通过参考结合到本申请中。

技术领域

本发明涉及在真核细胞中表达重组蛋白。

背景技术

重组DNA在哺乳动物细胞中的表达允许生产多种复杂的用于临床应用的糖基化蛋白（例如单克隆抗体）。往往需要作出重大努力来建立以高水平（超过20pg蛋白/细胞/天）稳定表达这样的蛋白的细胞系。然而，大多数稳定细胞系中的表达水平往往是低（小于1pg/天/细胞）且不稳定的（随着时间推移以及在大规模培养中降低）。因此，需要对许多单个克隆进行筛选（往往在数千个克隆的量级上），以便获得少数20pg/细胞/天的高表达克隆（Levinson和Goeddel，1990；Andersen和Krummen，2002；Wurm，2004）。

存在两种使用选择标记来帮助产生稳定的细胞的载体设计：在第一种载体设计中，目的基因和选择标记基因的表达是由两个独立的启动子驱动的，而在第二种载体设计中，这两个基因的表达是由单个启动子（双顺反子）驱动的。在第一种设计中，利用强启动子（例如CMV启动子）来驱动靶基因的表达（产物）并利用弱启动子（例如SV40启动子）来表达选择标记。中国仓鼠卵巢（CHO）DHFR缺陷的细胞（例如DG44）和可扩增的选择标记二氢叶酸还原酶（DHFR）被常规用于产生用于制造治疗性重组蛋白的细胞系。利用这种设计是希望强启动子可以产生与选择标记蛋白相比高得多的水平的目的蛋白。高表达克隆的选择过程是繁琐且费时的，并往往需要数月至一年，因为只有一小部分的稳定克隆可以以这样的高水平进行表达。

目的基因的表达水平往往可以通过在甲氨喋呤（MTX）中选择而得到明显提高（Urlab和Chasin，1980；Kaufman和Sharp，1982；Gasser等，1982；Page和Sydenham，1991）。往往需要MTX扩增程序来产生高表达细胞（超过20pg/细胞/天）。然而，该扩增是费时的，并往往引起在细胞系的表达水平方面表现出不稳定性。最近，谷氨酰胺合成酶（GS）选择系统被用于在3个月内建立高表达细胞系（超过20pg蛋白/细胞/天）。据信，GS系统提供了更严格的选择压力。随之而来的是，只有少数抗性集落可以存活，其中相对高比例的抗性集落是高表达的细胞克隆。然而，这些高产细胞系在不存在L-蛋氨酸DL-亚砜亚胺（MSX）的条件下往往是不稳定的（Cockett等，1990）。

本发明公开的替代性设计涉及使用强启动子来表达目的基因和选择标记基因两者，同时确保选择标记基因的表达比目的蛋白的表达低得多。在这种情况下，内部核糖体进入位点（IRES）位于目的基因与下游选择标记基因之间。尽管使用减弱的IRES可以降低选择标记基因的表达并提高目的蛋白的表达水平，但是，在这种类型的载体中选择标记基因的表达仍然未导致足够高的严格的选择压力，并产生了太多的低表达克隆。而且，含有目的基因和选择标记基因两者的mRNA比原始形式的mRNA（即启动子只驱动靶蛋白的编码区，而不驱动IRES外加选择标记的编码区）长得多，并由于mRNA翻译效率低而影响了细胞最大化生产目的蛋白的能力。

Lucas等（1996）报道了一种通过差异剪接从单个初级转录本产生选择标记和目的蛋白两者的表达载体设计。他们表明，大部分的初级转录本被剪接成产生用于表达目的蛋白而不表达任何选择标记的成熟形式的mRNA，而小部分的初级转录（不成熟的mRNA）逃脱剪接过程并只表达选择标记（而不表达目的基因）。该载体已被用在使用二氢叶酸还原酶（DHFR）的稳定的CHO细胞系中来产生数种对多种重组蛋白具有高表达水平的稳定细胞系。这些结果表明，为了增加选择压力（以使较少的克隆在经历选择过程后仍存活），同时提高在经历选择过程后仍存活的细胞中高表达（目的蛋白）的可能性，需要提高编码目的蛋白的mRNA与编码选择标记蛋白的mRNA的比率。

最近，McGrew报道了一种表达载体，其中内部多腺苷酸化信号被插入在编码目的蛋白的DNA序列与编码选择标记的DNA序列之间，所述表达载体允许单个启动子来产生单顺反子信息和双顺反子信息两者（美国专利6,632,637）。该选择方法的原理是基于使用“渗漏（leaky）mRNA”来表达选择标记。尽管多腺苷酸化信号作为终止mRNA的转录单元起作用，但小部分的转录单元可以绕过多腺苷酸化信号来产生更长的RNA（渗漏mRNA）。这种选择方法具有数个优点。第一，单个启动子驱动目的基因和选择标记两者。第二，选择压力可能增加。McGrew证实，转染有替代性多腺苷酸化载体的细胞具有对照的约8倍高的IL-4R特异性mRNA，并且DHFR的量相对于对照降低3.5倍。转染的细胞通过多种浓度的MTX（50、100、150和200nM）得到扩增，并导致IL-4表达水平提高。McGrew提出，可以通过改变与选择标记基因相邻的IRES接合处或附近的IRES序列来操控选择标记基因的翻译效率。因此，降低标记基因的翻译进一步增加了选择压力，并只允许具有更高的启动子活性的细胞克隆存活。结果，在这些选择的克隆中更高的启动子活性增强目的基因的表达。

已知，一些多腺苷酸化信号（例如逆转录病毒中的Poly+(A)信号）不足以使转录终止（渗漏）并引起了连读，从而产生更长的mRNA。通过这样做，逆转录病毒使用渗漏转录单元来激活并表达来自于宿主基因组的细胞癌基因。在逆转录病毒的情况下，渗漏转录本只占所产生的总mRNA转录本的1-2%或更少。如果单个细胞每天产生超过20pg的重组蛋白，则目的基因的转录本将只占细胞中总mRNA的约2-10%。如果连读事件仅以所产生的用于靶蛋白的总mRNA转录本的1%的比率发生，根据McGrew的发明，那也将有大量的渗漏mRNA产生不希望的高水平的选择标记。如果不进一步减少替代性Poly+(A)载体的连读事件，则这种类型的载体可能会证明不能用于选择和产生高表达细胞系。因此，需要找到一种途径，通过增强对单个Poly+(A)信号的连读的阻断以使其最小化来进一步降低渗漏mRNA的表达，但仍可以允许细胞在选择压力下存活。

发明内容

在本发明的一种实施方案中，提供了一种表达载体，所述表达载体包含编码第一蛋白的DNA序列，所述编码第一蛋白的DNA序列可操作地连接于编码第二蛋白的DNA序列，其中编码至少两个或更多个多腺苷酸化信号序列的DNA序列被插入在编码第一目的蛋白的DNA与编码第二蛋白的DNA之间。在一种实施方案中，第二蛋白是选择标记。通常已知的选择标记包括但不限于二氢叶酸还原酶（DHFR）、抗生素抗性标记和谷氨酰胺合成酶。

内部多腺苷酸化DNA片段含有至少两种独立的多腺苷酸化信号。在一种实施方案中，第一多腺苷酸化信号是牛生长激素多腺苷酸化信号（BGHpA），其连接于另一种多腺苷酸化信号或具有与多腺苷酸化信号类似的功能并作用于或增强转录终止的DNA序列，所述另一种多腺苷酸化信号例如病毒多腺苷酸化信号（例如SV40pA和TKpA）、细胞多腺苷酸化信号（例如牛生长激素和β-球蛋白）或其它人造的多腺苷酸化信号。

在一种实施方案中，所述表达载体还可以包含内部核糖体进入位点（IRES）序列，所述内部核糖体进入位点（IRES）序列在编码第一蛋白的DNA与编码第二蛋白的DNA（选择标记基因）之间，与这两者可操作地连接并在内部多个多腺苷酸化位点的下游。在一种实施方案中，所述IRES是突变的IRES例如EMCV的突变的IRES，以便去除潜在的启动子起始位点（转录起始点）。

所述表达载体还可以包含选择标记DNA序列，所述选择标记DNA序列位于IRES的下游。在一种实施方案中，在或不在同一阅读框内的附加的ATG序列位于选择标记ATG的上游。例如，在或不在同一阅读框内的附加的翻译终止密码子位于IRES的下游但位于选择标记基因的上游。这样，双顺反子配置中的选择标记基因对于翻译而言将是效率较低的。

在本发明的另一种实施方案中，提供了一组用于重组抗体表达的载体。例如，载体可以包含两个转录单元。第一转录单元顺序包含启动子DNA、单克隆抗体（mAb）轻链DNA、内部多个多腺苷酸化位点、IRES DNA、选择标记基因DNA和单个多腺苷酸化位点。第二转录单元包含启动子DNA、mAb重链DNA以及单个或多个多腺苷酸化位点DNA序列。所述IRES序列在内部多个多腺苷酸化位点的下游，或者基本上如Lucas等（1996）所描述的在mRNA剪接供体和受体位点的下游，且可操作地连接于内部多个多腺苷酸化位点和编码第二蛋白/选择标记的DNA。表达增强序列元件也可以被包含在克隆位点的上游，可操作地连接于所述克隆位点。

本发明还提供了转染有本文中公开的表达载体的宿主细胞，产生了稳定的转染细胞库。因此，本发明的另一种实施方案提供了转染的宿主细胞；又一种实施方案提供了稳定的转染有本发明的表达载体的细胞库。还提供了从转染细胞库克隆的细胞系。在一种实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在另一种实施方案中，宿主细胞是CHO细胞。

本发明还提供了用于获得重组蛋白的方法，所述方法包括用本文中公开的表达载体转染宿主细胞，在促进所述蛋白表达的条件下培养转染的宿主细胞，以及回收所述蛋白。McGrew的专利（美国专利6,632,637）没有提到内部多个多腺苷酸化信号可用于增加选择压力。与使用单个多腺苷酸化信号相比，多个多腺苷酸化信号提供了一种强有力的方法来降低渗漏mRNA的水平，以便进一步增强选择压力。在通常的应用中，用两个选择步骤对转染的宿主细胞系进行选择，第一个步骤是对表达显性的可扩增标记的细胞进行选择，第二个步骤是针对标记基因以及目的基因的高表达水平和/或扩增。常用的选择剂或扩增剂是甲氨喋呤，甲氨喋呤是DHFR的抑制剂，已被表明可引起内源性DHFR基因以及转染的DHFR序列的扩增。在本发明的一种实施方案中，不需要用MTX进行选择或扩增。用DHFR选择载体转染宿主细胞（例如CHO DG44），可以通过不含HT的培养基直接选择高产的细胞系而无需任何MTX扩增。

总而言之，使用一个启动子的配置（双顺反子），McGrew的一个多腺苷酸化信号仍允许有太多的连读，尤其是在启动子活性恰好非常高的情况下。不能施加严格的选择。使用本发明的载体，大幅减少的连读导致选择标记的mRNA拷贝较少，因此，严格的选择可以有助于只获得具有高启动子活性的克隆。此外，由于高度严格的选择，存活的克隆已表达高水平的目的蛋白，而无需使用MTX来扩增。

附图说明

图1示出了载体设计的一种实施方案，其中在一个启动子-两个编码序列的载体中多腺苷酸化信号被插入在IRES之前。

图2示出了载体设计的另一种实施方案，其中表达重组单克隆抗体并且DHFR作为选择标记。

发明详述

在一种实施方案中，本发明公开了真核表达载体，所述真核表达载体在两个编码序列（两种肽产物）之间具有大于一个的顺序的多腺苷酸化信号序列[Poly+(A)]、或者一个或多个[Poly+(A)]信号外加任何已知有助于减少连读的DNA片段（称为增强的终止单元），所述编码序列可操作地连接于位于第一编码序列之前的一个启动子[双顺反子，即，启动子-第一编码序列-多个Poly+(A)-IRES-第二编码序列]，其中第二编码序列是任何选择标记，包括但不限于二氢叶酸还原酶（DHFR）、抗生素抗性标记（例如新霉素、嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、潮霉素和博莱霉素抗性）和谷氨酰胺合成酶（GS）。

下面的术语将用于描述本发明。在不存在本文所阐述的具体定义的情况下，用于描述本发明的术语将具有本领域普通技术人员所理解的常见含义。

在本文中使用时，表述MTX是指甲氨喋呤。

在本文中使用时，表述GS是指谷氨酰胺合成酶。

在本文中使用时，表述pA或poly+(A)是指多腺苷酸化信号。

在本文中使用时，表述pcd是指pg/细胞/天。

在本文中使用时，表述Her是指赫赛汀（herceptin）单克隆抗体。

在本文中使用时，表述L是指单克隆抗体轻链。

在本文中使用时，表述H是指单克隆抗体重链。

在本文中使用时，表述DH是指DHFR。

在本文中使用时，表述Sy是指合成的。

本发明提供了真核表达载体，所述真核表达载体包含第一启动子和增强的终止单元，所述第一启动子可操作地连接于第一编码序列，所述增强的终止单元包含两个或更多个多腺苷酸化信号序列，在所述增强的终止单元之后跟随有内部核糖体进入位点（IRES）和第二编码序列。在一种实施方案中，所述第一编码序列编码单克隆抗体肽。在另一种实施方案中，所述第二编码序列编码选择标记。选择标记的实例包括但不限于二氢叶酸还原酶（DHFR）、抗生素抗性标记或谷氨酰胺合成酶。一般而言，所述抗生素抗性标记可以是新霉素、嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、潮霉素或博莱霉素。在一种实施方案中，所述表达载体具有SEQ ID NO:1的序列。

在一种实施方案中，所述多腺苷酸化信号序列可以是病毒多腺苷酸化信号、细胞多腺苷酸化信号、改性的病毒多腺苷酸化信号或改性的细胞多腺苷酸化信号。例如，所述多腺苷酸化信号序列可以具有SEQID NO:l的核苷酸1472-1783、1941-2335、3369-3673或5854-6160的序列。多腺苷酸化信号序列通常是本领域公知的；代表性的实例包括但不限于GenBank登录号M14147、V00111、M12890、D14486、D00683和D00684。此外，有许多关于RNA3'端加工的综述文章；例如，Neilson和Sandberg，Exp.Cell Res.316:1357-64(2010)；Millevoi和Vagner，Nucleic Acids Res.38:2757-74(2010)；Licatalosi和Darnell，Nat.Rev.Genet.11:75-87(2010)。在另一种实施方案中，所述多腺苷酸化信号可以是人造的多腺苷酸化信号。本领域普通技术人员会容易地构建许多人造的多腺苷酸化信号。例如，人造的多腺苷酸化信号可以具有SEQ IDNO:l的核苷酸1784-1940的序列。

在另一种实施方案中，在所述一个或多个多腺苷酸化信号序列之后跟随有DNA片段，所述DNA片段具有减少连读的功能。具有减少连读的功能的DNA序列通常是本领域已知的。

在一种实施方案中，所述内部核糖体进入位点（IRES）是突变的IRES。例如，所述突变的IRES可以具有SEQ ID NO:l的核苷酸2336-2804的序列。本领域普通技术人员会容易地突变或改变IRES序列以供本发明的实践用。在另一种实施方案中，所述IRES被插入在多腺苷酸化信号序列与所述第二编码序列之间，使得所述IRES可操作地连接于所述第二编码序列，并且附加的ATG或外加的终止密码子位于所述第二编码序列的上游。

在另一种实施方案中，在所述表达载体中，在所述第二编码序列之后跟随有第二启动子，所述第二启动子可操作地连接于第三编码序列（参见例如图2）。在一种实施方案中，所述第三编码序列编码单克隆抗体肽。

本发明还提供了转染有本文中公开的表达载体的细胞或细胞系。在一种实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞或真核细胞。转染的细胞的实例包括但不限于CHO-K1、CHO DG44、DXB11、NS0、BHK、Vero、Per C6或HEK293细胞。在一种实施方案中，所述细胞是二氢叶酸还原酶缺陷的细胞。

在整个本申请中，引用了各种参考文献或出版物。这些参考文献或出版物的公开内容在此以其全文通过参考结合到本申请中，以便更全面地描述本发明所属领域的状态。

应注意的是，过渡性术语“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，它是包含性或开放式的，并且不排除另外的未列举的元素或方法步骤。

实施例1

在本发明中，焦点在于连读事件对选择标记基因表达的影响。据信，在双顺反子配置中，频率为0.1-10%的连读事件在总mRNA中产生0.1-1%的双顺反子转录RNA。McGrew（美国专利6,632,637）报道了一种表达载体，其中一个内部多腺苷酸化信号被插入在编码目的蛋白的DNA与编码选择标记的DNA之间，所述表达载体允许单个启动子来产生单顺反子信使RNA（正常产物）和双顺反子信使RNA（连读产物）两者。转染有替代性多腺苷酸化载体的细胞具有对照的约8倍高的IL-4R特异性信使RNA（目的蛋白），并且DHFR的量相对于对照降低3.5倍，这表明，发生了频率为25%的连读事件，并在总mRNA中产生了25%的双顺反子mRNA，所述双顺反子mRNA含有选择标记。在McGrew的实验中，整体选择压力似乎仍相对较低，正如由大量连读事件所证实的。有必要通过使用更有效的pA信号、更多的pA信号或外加的已知增强pA终止功能的其它DNA片段来减少连读事件、降低选择标记mRNA的产生并提高目的蛋白mRNA与选择标记mRNA的比率。

构建了数种表达载体，所述表达载体含有不同的pA信号（SV40晚期pA、牛生长激素pA以及合成的pA），其中绿色荧光蛋白（GFP）作为报告基因。如果发生了连读事件，则会产生更长的双顺反子mRNA序列，并且会通过IRES表达GFP。使用Lipofectin2000（Invitrogen）将这些表达载体转染到293T细胞中。为了对转染的细胞的荧光信号进行定量，在转染后48小时进行荧光活化细胞分选（FACS）分析。将连读事件量化，并与对照载体的连读事件进行比较。下表示出了转染的细胞的荧光信号以及与用无内部pA信号的载体转染的细胞的荧光信号相比而言的信号降低比率。数据表明，在不同的pA信号中，连读事件的频率是不同的，并且在1-6%之间的范围内，这与以前的报道（美国专利6,632,637）一致。在所测试的3种pA信号中，牛生长激素（BGH）pA具有最少的连读。数据表明，一个牛生长激素pA信号与3个合成的pA信号的组合使GFP水平大幅降低1175倍，其中荧光信号水平下降至接近背景水平（720对680）。这些数据清楚地证实，多个内部pA信号可以显著减少连读事件，而单个内部pA信号是不够的。

为了获得高产的哺乳动物细胞系，往往需要对大量克隆进行筛选。这主要是由于低选择严格性产生了许多低蛋白生产性的克隆而引起的。为了克服这个问题并改善高产克隆的选择过程的效率，需要开发一种表达载体系统，所述表达载体系统可以赋予转染的细胞一种使其能承受非常高严格的选择过程的手段，以致只有

白生产性的克隆会存活。有可能的是，多个内部pA信号可以产生更严格的选择压力，因为与利用单个内部pA信号的系统相比，源自于双顺反子mRNA的选择标记mRNA可以被大幅降低。

为了检验该假说，用DHFR基因代替单个或多个pA载体的GFP基因。这些载体被命名为pCMV-Her-SV40pA-DHFR、pCMV-Her-BHGpA-DHFR、pCMV-Her-BHGpA-SypA-DHFR和pCMV-Her-BGHpA-3SypA-DHFR。使用Lipofectamine 2000系统将这些载体转染到CHO DG44细胞中。在转染48小时后，通过ELISA测定赫赛汀（目的蛋白）的表达水平，并将10,000,000个转染的细胞放入10个96孔板（10,000个细胞/孔）中并在选择培养基中生长。在选择20天后，在显微镜下确定抗性集落的数目。将抗性集落以培养形式生长在96孔板中。将来自于原始的96孔板的各个集落培养物重新接种在第二个96孔板中，并在96孔板中进一步分离成两个培养物以供分析用：一个培养物用于使用终端培养来分析表达水平，另一个培养物用于测定各个集落的细胞生长。在培养14天后，大部分的克隆因为缺乏营养而死亡。通过ELISA确定终端培养条件下这些克隆中赫赛汀的表达水平。培养基中2.5μg/ml的表达水平被认为是阳性的，而50μg/ml被认为是高的。表2示出了抗性克隆、阳性克隆和高表达克隆的数目。这些数据表明，通过增加内部pA信号的数目，抗性克隆的数目下降。源自于4个内部pA载体的抗性克隆的数目比单个内部pA载体的抗性克隆的数目低3倍（136对412），这表明，多个pA载体集合了增加的选择压力。

重要的是，ELISA数据显示，源自于4个内部pA载体（pCMV-Her-BGHpA-3SypAs-DHFR）的这些抗性克隆中有5%（7/136）表达超过50μg/ml的赫赛汀，而源自于单个内部pA载体（pCMV-Her-BGHpA-DH）的抗性克隆中仅有1%（4/412）达到50μg/ml的赫赛汀水平，这表示，多个pA载体使获得高表达克隆的机会或百分率增加。存在的趋势是，随着表达载体中使用的Poly+(A)信号增加，可获得更多的高表达克隆。

在选择后，在转染有4个内部pA载体的细胞中抗体mRNA（短mRNA）与含有选择标记的长的渗漏mRNA的比率被假定为比单个pA载体的高得多。这与以前的数据一致：与单个pA载体相比，4个pA载体使GFP水平降低高达20倍。还假定4个pA载体不仅可以增加选择压力，而且还上调启动子活性，从而产生足够的DHFR以支持细胞的存活。因为这一点，通过靶蛋白与选择标记的表达比率增加以及高选择压力介导的启动子活性上调而极大地提高了靶蛋白的表达。这个观点得到了分别收集的两组数据的支持。使用McGrew的单个pA载体，在无MTX介导的扩增的情况下在选择培养基中培养后从10,000,000个转染的细胞中未获得超过20pg/细胞/天的高表达克隆，而使用本发明的载体（多个pA）的数个克隆则存活。这些数据表明，为了实现多个pA克隆中的高水平表达，启动子活性必须被推得更高，这可能归因于选择严格性增强，或者扩增已经存在于在选择培养基中培养的过程中。然而，当用定量聚合酶链反应（PCR）对基因组中的载体拷贝数进行定量时，发现了相同范围（1-10个拷贝/细胞）的整合载体。因此，综合这些数据，所有证据都证实，多个pA载体不仅通过增强双顺反子连读的终止来降低选择标记的表达而增加了选择压力，而且还为了存活进一步造成由于选择压力（负反馈）引起的启动子活性增加直至达到平衡。这根本不同于单个pA载体，其中如在McGrew的专利中所报道的目的基因的表达增加，是由于与所选择的对较低的选择压力有抗性的细胞群相比，所选择的对相对较高的选择压力有抗性的克隆组具有更高的表达而引起的。

所选择的该新型系统允许我们以两种方式操纵选择压力：使用多个PA信号（两个或三个PA信号）控制连读双顺反子mRNA的量，以及使用减弱的IRES改变双顺反子mRNA的翻译效率。首先，使IRES区的第一个136bp（它不是IRES功能所必需的）缺失。其次，将终止密码子插入到第一启动起始密码子区中（ATG GCG TAA ATG，SEQ IDNO:2），或者将阅读框移位（ATG GCG GAT G），这可以降低双顺反子mRNA的翻译（以表达DHFR）效率，即增加选择压力。另外，在IRES区内有两个TATA盒样基序（81，331）。这些基序可以发挥启动子的功能来转录mRNA以表达选择标记基因，而不依赖于双顺反子mRNA。将331位的TATAA基序突变成TAAAA基序。含有多个突变的这种IRES被称为m2S-IRES。将这种突变体IRES插入到pCMV-Her-BGHpA-3SypAs-DH中的合成的PA信号与DHFR基因之间，并被命名为pCMV-HER-4pAs-DH（含有ATG GTT）或pCMV-Her-4pAs-2SDH（含有ATG GCG TAA ATG GTT，SEQ ID NO:3）或pCMV-Her-4pAs-2aaDH（含有ATG GCG G ATG GTT，SEQ IDNO:4）。将源自于这些载体的10,000,000个转染的细胞放入10个96孔板（10,000个细胞/孔）中并在选择培养基中生长。在选择20天后，在显微镜下对每孔的抗性细胞数目进行计数。这些抗性克隆被分成两组：一组用于使用终端培养来分析表达水平，另一组用于使细胞生长。在培养14天后，通过ELISA确定终端培养条件下这些克隆中的表达水平。数据显示，有98个来自于pCMV-Her-4pAs-DH的抗性克隆，而pCMV-Her-4pAs-2SDH产生了21个集落。pCMV-Her-4pAs-2aa-DHFR未产生抗性克隆，这表明，多个pA与减弱的IRES的组合引起选择压力增加，导致抗性克隆的数目大幅减少或者甚至无抗性克隆。ELISA数据显示，与单独的多个pA载体（pCMV-Her-4pAs-DHFR）相比，源自于减弱的IRES载体（pCMV-Her-4pAs-2SDHFR）的高表达克隆的数目显著减少（2对9）。该数据表明，这些表达克隆可能无法在选择培养基中存活，因为转染有这些减弱的IRES载体的细胞的选择压力过高。因此，使用本发明的设计，可以实现最大的选择压力。在一个实验中观察到，4个集落产生超过1μg/ml的抗体。尽管抗性数目和阳性集落（超过1μg/ml）两者都显著减少，但一个集落（鉴定为373-6）表达非常高的水平（23μg/ml）。在没有任何MTX扩增的情况下，373-6细胞系的单细胞产量为20.4pg/天/细胞。该形式的pA载体显著降低抗性集落的频率（7倍）。这些数据表明，本发明的载体可以显著增加选择压力，以减少筛选的抗性集落的量。这表示，使用该新型载体系统在没有任何MTX扩增的情况下可以在选择培养基中产生高抗体生产性的DG44细胞系。

本发明的载体和方法也可用于开发多顺反子载体。多顺反子表达载体允许协同表达两个或更多个基因（参见例如Fussenegger等，1997）。在第一顺反子之后插入多腺苷酸化位点会导致第一顺反子的高水平表达以及任何后续顺反子的较低水平的表达。该技术的潜在应用将是促进表达大量治疗性蛋白（或其它需要的重组蛋白）以及较少量的其它蛋白例如选择标记、转录因子、参与蛋白质折叠的酶以及调节细胞代谢和表达的其它蛋白。

在另一种实施方案中，多腺苷酸化位点被插入在第二或第三（或后续）顺反子之后。这将允许前两个（或三个或更多个）顺反子的高表达，然后是跟随在内部多腺苷酸化位点之后的顺反子的较低的表达。该实施方案可用于例如重组抗体的合成，其中独立地以高水平合成重链和轻链。构建三顺反子载体，其中重链和轻链由前两个顺反子编码。多腺苷酸化位点被插入在第二顺反子之后，以允许高水平表达前两个顺反子。可选择的标记表达自第三顺反子（即，在多腺苷酸化位点之后），并且将以较低的水平表达。

在整个本申请中，引用了各种参考文献或出版物。这些参考文献或出版物的公开内容在此以其全文通过参考结合到本申请中，以便更全面地描述本发明所属领域的状态。应注意的是，过渡性术语“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，它是包含性或开放式的，并且不排除另外的未列举的元素或方法步骤。

参考文献

Andersen,D.C.和Krummen,L.2002.用于治疗应用的重组蛋白表达（Recombinant protein expression for therapeutic applications）Curr.Opin.Biotechnol.,13:117-123。

Cockett,M.I.,Bebbington,C.R.和Yarranton,G.T.1990.使用谷氨酰胺合成酶基因扩增在中国仓鼠卵巢细胞中高水平表达金属蛋白酶的组织抑制因子（High level expression of tissue inhibitor ofmetalloproteinases in Chinese hamster ovary cells using glutaminesynthetase gene amplification）.BioTechnology,8:662-667

Fussenegger等,Biotechnol Prog13:733;1997。

Gasser,C.S.,Simonsen,C.S.,Schilling,J.W.和Schmike,R.T.1982.Proc.Natl Acad.Sci.USA,79:6522-6526。

Kaufman,R.J.和Sharp,P.,J.1982.Mol.Biol,159:601-621。

Levinson,A.D.和Goeddel,D.C.1990.Methods Enzymol.,185:485-487。

Licatalosi和Darnell.2010.RNA加工及其调节：对生物学网络的整体洞察（RNA processing and its regulation:global insights intobiological networks）.Nat.Rev.Genet.11:75-87。

Lucas.B.K.,Giere.LM.,DeMarco.R.A,Shen.A,Chisholm.V CrowleyC.W.1996.使用双顺反子DHFR内含子表达载体在CHO细胞中高水平生产重组蛋白（High-level production of recombinant proteins in CHOcells using a dicistronic DHFR intron expression vector）.Nucleic AcidsResearch,24:1774-1779。

McGrew,J.T.用于重组蛋白表达的载体和方法（Vectors andmethods for recombinant protein expression），美国专利号6,632,637。

Millevoi和Vagner.2010.真核前mRNA3'端加工调节的分子机制（Molecular mechanisms of eukaryotic pre-mRNA3'end processingregulation）.Nucleic Acids Res.38:2757-74。

Neilson和Sandberg,2010.哺乳动物RNA3'端形成的异质性（Heterogeneity in mammalian RNA3'end formation）.Exp.Cell Res.316:1357-64。

Page,M.J.和Sydenham,M.A.1991.人源化单克隆抗体CAMPATH-1H在中国仓鼠卵巢细胞中的高水平表达（High levelexpression of the humanized monoclonal antibody CAMPATH-1H inChinese hamster ovary cells）,BioTechnology,9:64-68。

Urlab,G.和Chasin,L.A.1980.分离二氢叶酸还原酶活性缺陷的中国仓鼠卵巢细胞突变体（Isolation of Chinese hamster ovary cell mutantdeficient in dihydrofolate reductase activity）,Proc.Natl Acad.Sci.USA,77:4216-4220。

Wurm,F.M.,2004.在培养的哺乳动物细胞中生产重组蛋白治疗剂（Production of Recombinant protein therapeutics in cultivatedmammalian cells Nature Biotechnol）,22:1393-1398。

Claims (16)

1.真核表达载体，其包含第一启动子和增强的终止单元，所述第一启动子可操作地连接于第一编码序列，所述增强的终止单元包含两个或更多个多腺苷酸化信号序列，在所述增强的终止单元之后跟随有内部核糖体进入位点（IRES）和第二编码序列。

2.权利要求1的表达载体，其中所述第二编码序列编码选择标记。

3.权利要求2的表达载体，其中所述选择标记是二氢叶酸还原酶（DHFR）、抗生素抗性标记或谷氨酰胺合成酶。

4.权利要求3的表达载体，其中所述抗生素抗性标记是新霉素、嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、潮霉素或博莱霉素。

5.权利要求1的表达载体，其中所述第一编码序列编码单克隆抗体肽。

6.权利要求1的表达载体，其中所述多腺苷酸化信号序列选自病毒多腺苷酸化信号、细胞多腺苷酸化信号、改性的病毒多腺苷酸化信号、改性的细胞多腺苷酸化信号以及人造的多腺苷酸化信号。

7.权利要求1的表达载体，其中在一个或多个多腺苷酸化信号序列之后跟随有DNA片段，所述DNA片段具有减少连读的功能。

8.权利要求1的表达载体，其中所述载体具有SEQ ID NO:l的序列。

9.权利要求1的表达载体，其中所述内部核糖体进入位点（IRES）是突变的IRES。

10.权利要求1的表达载体，其中所述IRES被插入在多腺苷酸化信号序列与第二编码序列之间，使得所述IRES可操作地连接于第二编码序列，并且附加的ATG或外加的终止密码子位于第二编码序列的上游。

11.权利要求1的表达载体，其中在所述第二编码序列之后跟随有第二启动子，所述第二启动子可操作地连接于第三编码序列。

12.权利要求11的表达载体，其中所述第三编码序列编码单克隆抗体肽。

13.细胞或细胞系，所述细胞或细胞系转染有权利要求1-12任一项的表达载体。

14.权利要求13的细胞或细胞系，其中所述细胞是哺乳动物细胞或真核细胞。

15.权利要求13的细胞或细胞系，其中所述细胞选自CHO-K1、CHO DG44、DXB11、NS0、BHK、Vero、Per C6和HEK293细胞。

16.权利要求13的细胞或细胞系，其中所述细胞是二氢叶酸还原酶缺陷的细胞。

Images