CN108315351A

CN108315351A - 一种用于工业生产的哺乳动物细胞表达载体

Info

Publication number: CN108315351A
Application number: CN201810326492.1A
Authority: CN
Inventors: 孙冰
Original assignee: Ji'nan Bay Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Ji'nan Bay Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2018-04-12
Filing date: 2018-04-12
Publication date: 2018-07-24
Anticipated expiration: 2038-04-12
Also published as: CN108315351B

Abstract

本发明提供了一种用于哺乳动物宿主细胞表达蛋白/多肽的表达载体，包含标记基因和用于插入目的基因的限制性内切酶酶切位点，目的基因后的Poly(A)加尾信号数量为2个或2个以上，标记基因的启动元件仅为TATA框。本发明提供的表达载体的选择标记基因的上游含有两个或以上的Poly(A)加尾信号，使上游强启动子对下游TATA框活性的干扰最小化，以驱动选择标记基因表达。本发明的表达载体可在短时间内产生用于重组蛋白质表达的稳定且高产的细胞系，并且基因扩增不需要药物选择/介导，可以在没有任何药物诱导扩增的条件下直接选择，这些细胞系可长期稳定表达高水平的重组蛋白，非常适用于工业化生产蛋白或多肽。

Description

一种用于工业生产的哺乳动物细胞表达载体

技术领域

本发明属于分子生物学与生物医药领域，具体涉及一种用于哺乳动物细胞表达蛋白/多肽的表达载体，特别涉及一种能够用于工业化生产的表达重组免疫毒素的表达载体。

背景技术

抗癌药制药业中规模最大，增长最快的市场之一；市场在全球范围内不断扩大，对更有效且耐受性更好的癌症疗法的需求也越来越高。靶向药市场一直在以显着的速度增长，并且在发达和新兴地区市场上持续增长的潜力很大。单克隆抗体（Monoclonalantibody，mAb）比小分子（化学）药物（化学疗法）具有很大的优势，可高度特异性识别癌细胞表面标记。因此，单克隆抗体副作用通常较少或较温和，特别是人源化单抗，会带来更好的生活质量（如体重和脱发方面）。

赫赛汀（注射用曲妥珠单抗，Herceptin）是由Genentech Inc.（基因泰克）开发的市场上的单克隆抗体，其靶向Her-2用于治疗乳腺癌患者。2016年，这种药在美国每年产生超过30亿美元的收入。但是抗体本身不杀死癌细胞；因此赫赛汀的功效是有限的。Her-2阳性乳腺癌患者中仅有一小部分（约15％）对该药物有反应。尤其是单独使用的临床结果不理想，最终的生存率并没有改变；由于存在免疫妥协宿主，同时也造成了疗效有限；由于mAb生产使用哺乳动物细胞使得生产成本非常高。虽然开发单克隆抗体可以获得高额利润，但是单位产品（以克为单位）价格很高，普通健康保险不会涵盖此类药物，因此，从长远来看其社会经济效益不好。

基因泰克公司进一步开发了赫赛汀与化学毒素（DTM1）的结合物，引领了下一代基于单克隆抗体的疗法的开发，该疗法在成功进行III期临床试验后获得了FDA批准。许多其他制药公司也开始开发mAb-化学毒素偶联物（Antibody Drug Conjugates，ADC）直接特异的杀死癌细胞。但单克隆抗体和化学毒素的结合需要一个额外的步骤而且还需要纯化；mAb-毒素结合物在体内不稳定，降解后会释放游离的化学毒素，释放的化学毒素可以扩散到细胞内，杀死正常的非癌细胞，造成严重的副作用。因此，重组免疫毒素（rIT）是最终的选择。

重组免疫毒素是通过使用与蛋白质毒素偶联或融合的抗体或抗体片段进行靶向治疗的实例。蛋白质毒素只进入与抗体结合的特定细胞，然后杀死这些细胞，而在细胞外无毒性作用。如果靶细胞表面分子或表位限于特定细胞类型如癌细胞，则这种类型的药物是高度细胞类型特异性的。而且rIT可以直接在大肠杆菌，巴斯德毕赤酵母或哺乳动物细胞中产生，一次性生产、不需要再合成，成本要低得多；而针对癌细胞的细胞毒性要比化学毒素高得多；同时，rIT是单分子蛋白，在体内不会产生游离出非靶标的毒素。降解后的毒素片段也不能直接进入到细胞内。

由Ligand Pharmaceuticals开发的一种基于DT（白喉毒素）的免疫毒素Ontak已经被FDA批准用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤。目前，抗-CD3免疫毒素正在Scott和White MemorialHospital（IND号100712，临床试验标识符NCT00611208）的CD3+T细胞白血病/淋巴瘤患者中进行I期剂量递增试验。NIH-AstraZeneca公司的BL-22（抗-CD22-PE38）和NIH公司的SS1（dsFv-PE38）等临床前期临床研究或临床评估。基于DT的免疫毒素与其他不同之处在于毒素部分是截短的白喉毒素（DT390），其具有非常高的效力并且抗体部分是二价的，被组装为单链融合蛋白。与相应的单价免疫毒素相比，二价实现了20倍的亲和力增加，这转化为更高的靶细胞杀伤和非特异性系统毒性的降低。免疫毒素已在工程化毕赤酵母（Pichiapastoris）中表达。

目前，已经能够在哺乳动物细胞中生产复杂的糖基化重组蛋白（例如单克隆抗体）用于临床治疗。但是，获得短时间内大量生产重组蛋白，如治疗性多肽的哺乳动物细胞的克隆仍然面临着巨大的困难和挑战；高水平（> 20pg /天/细胞）稳定表达的细胞系的构建仍然很困难。然而，大多数细胞系中的表达水平通常较低且不稳定（<1pg /天/细胞）。因此，为了获得高产稳定的克隆，需要对许多细胞克隆进行筛选。

目前，常用的表达方法有两种：一种是使用两种不同的启动子表达目的基因和标记基因，另一种是使用一个启动子和IRES（Internal ribosome entry site，内部核糖体进入位点）表达两种基因。第一种方法是在设计表达载体时，使用强启动子（如CMV启动子）启动目的基因和弱启动子以表达标记基因（如SV40启动子用于DHFR（Dihydrofolatereductase，二氢叶酸还原酶））。强启动子能够产生更高水平的目的蛋白。虽然DHFR是选择转染克隆的良好选择标记，但通常需要添加MTX进一步扩增。 DHFR是使用NADPH作为电子供体将二氢叶酸还原成四氢叶酸的酶，其可以转化为用于1-碳转移化学的四氢叶酸辅因子的种类，为从头合成嘌呤胸苷酸和某些氨基酸所需的一碳基团。四氢叶酸及其衍生物对于嘌呤和胸苷酸合成是必不可少的，这对于细胞增殖和细胞生长是重要的。DHFR在核酸前体的合成中起着核心作用，完全缺乏DHFR的突变细胞需要甘氨酸和胸苷才能生长。缺乏DHFR的CHO细胞（DG44，中国仓鼠卵巢细胞）是生产重组蛋白最常用的细胞系。将这些细胞用携带DHFR基因的质粒和重组蛋白质的基因在单一表达系统中转染，然后在缺乏胸苷的培养基中进行选择性培养，结果是只有具有外源DHFR基因和目的基因的细胞才能存活。

聚腺苷酸化信号（Poly（A）加尾信号）是终止mRNA转录的信号，但小部分转录单位可能绕过聚腺苷酸化信号产生更长的RNA，造成通读（Reading through）。没有Poly（A）尾部的这些渗漏RNA不具有任何功能，并迅速在核中降解。尤其是当表达载体插入宿主基因组的高活性区域时，目的重组产物的高表达通常会因为通读导致下游标记基因如DHFR的弱启动子由于通读而关闭。结果，这些克隆无法在选择过程中幸存下来。如果标记基因的选择活性强的启动子，则无论表达载体是插入高活性还是低活性宿主基因组区域，细胞都将获得足够的选择压力抗性。结果，许多低产量克隆将在最初的选择过程中幸存，使得优化过程非常难以处理并且昂贵，也筛选不到高表达的细胞株。

发明内容

针对高产细胞中存在通读与高产细胞需要用诱导物进一步扩增等问题，本发明提供一种新的蛋白/多肽的表达载体，可以有效避免通读，并且不需要进一步扩增，能够在很短时间内筛选获得高产量的重组细胞株，非常适合获得工业化生产蛋白/多肽用的细胞株。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种用于哺乳动物细胞表达蛋白/多肽的表达载体，包含标记基因和限制性内切酶酶切位点，可插入目的基因，目的基因后的Poly(A)加尾信号数量为2个或2个以上，标记基因的启动元件为TATA框。

所述启动子或TATA框选自但不限于CMV或SV40的启动子或TATA框。

所述Poly(A)加尾信号选自病毒、原核/真核生物的，修饰或改造的病毒、原核/真核生物的和人工合成的Poly(A)加尾信号中的至少一种。

所述目的基因后的Poly(A)加尾信号数量优选为3个。在本发明的一个实施例中，选择了3种不同的Poly(A)加尾信号。

所述标记基因选自DHFR（二氢叶酸还原酶）基因、GS（谷氨酰胺合成酶）基因或耐抗生素基因，如G418耐新霉素、耐嘌呤霉素、耐潮霉素、耐博来霉素。

所述哺乳动物细胞选自CHO细胞系（中国仓鼠卵巢细胞），如CHO DG44或CHO K1，NSO（骨髓瘤细胞），BHK（幼地鼠肾细胞系），Vero（非洲绿猴肾细胞系），PER C6（大鼠脑胶质瘤细胞系）或HEK293细胞系（人肾上皮细胞系）。优选为对白喉毒素（DT）或绿脓杆菌毒素（PE）具有抵抗性的CHO细胞系或HEK293细胞系。

所述限制性内切酶酶切位点，用于插入目的基因。所述限制性内切酶为基因工程常用限制性内切酶，如EcoRI酶、EcoRV酶、BglII酶、BamHI酶、SalI酶、XhoI酶。

所述目的基因包括编码蛋白/多肽的基因；所述编码蛋白/多肽的基因包括但不限于单链抗体、配体蛋白（Ligand）、激素、外毒素、干扰素和融合蛋白的基因。优选为表达单链抗体的基因、多肽配体基因或表达单链抗体或多肽配体和外毒素融合蛋白（重组免疫毒素）的重组基因。所述单链抗体为scFv（单链抗体）或scdsFv（二硫键稳定单链抗体）。所述单链抗体为单价或二价；所述二价单链抗体为单价单链抗体通过连接肽串联。所述外毒素的编码基因为失去与细胞结合能力的截短基因或突变/修饰基因。所述外毒素优选为外泌型的细胞毒素，更优选为去除非特异性结合位点的截短白喉毒素，如DT390。

所述目的基因中还包括信号肽的编码序列；所述信号肽位于目的蛋白/多肽N端之前，用于将目的蛋白/多肽分泌到细胞外，优选为Herceptin的信号肽的编码序列。

进一步的，为了方便免疫毒素的表达，本发明所述的表达载体在限制性内切酶酶切位点之前包括带有外泌信号肽的失去与细胞直接结合能力的截短白喉毒素的编码基因。相应的目的基因为表达单链抗体或多肽配体的基因。

本发明还包括利用上述载体转染哺乳细胞系获得的哺乳细胞系以及通过该哺乳细胞系分泌获得的蛋白质或多肽。上述蛋白质或多肽可用以制备药物或作为医药中间体。如在本发明的实施例中，获得的抗人血小板糖蛋白VI抗体可制备治疗或预防血栓药物或用于检测人血小板糖蛋白VI；获得的重组免疫毒素可以用于制备抗肿瘤或治疗癌症或免疫功能紊乱性疾病的药物。

本发明具有以下优点：

本发明提供的表达载体的选择标记基因的上游含有两个或以上的转录终止信号——Poly(A)加尾信号，使上游强启动子对下游启动元件（TATA框）活性的干扰最小化，以驱动选择标记基因表达。本发明的表达载体可在短时间内产生用于重组蛋白质表达的稳定且高产的细胞系，并且基因扩增不需要药物选择/介导，可以在没有任何药物诱导扩增的条件下直接选择，这些细胞系可长期稳定表达高水平的重组蛋白，非常适用于工业化生产蛋白或多肽。

附图说明

图1为载体的设计示意图；

图2为表达免疫毒素的载体的设计示意图；

图3为重组免疫毒素的示意图；

图4为抗GPVI mAb OM-2与抗GPVI scFv阻断GPVI-β-gal的重组膜与纤维胶原结合的比较；

图5为表达抗EGFRvIII 免疫毒素的DG44细胞与常规DG44细胞的上清液对表达EGFRvIII的U87细胞的杀伤作用的比较；

图6为用抗EGFRvIII 免疫毒素与对照处理对神经胶质瘤（表达EGFRvIII的U87细胞）异种移植物的大小；

图7为移植神经胶质瘤（表达EGFRvIII的U87细胞）的小鼠用抗EGFRvIII 免疫毒素（右）和未经处理（左）的照片；

图8为抗EGFRvIII 免疫毒素（左）与仅用mAb处理（右）对表达EGFRvIII的U87细胞的异种移植物大小的比较；

图9为用抗EGFRvIII 免疫毒素与对照处理对肺癌异种移植物（表达EGFRvIII的A549细胞）大小的比较；

图10为用抗EGFRvIII 免疫毒素与对照处理岁乳腺癌异种移植物（表达EGFRvIII的MDA-MB231细胞）大小的比较；

图11为用抗EGFRvIII免疫毒素与对照处理前列腺癌异种移植物（表达EGFRvIII的DU145细胞）大小的比较；

图12为用HPLC，HIC，透析和尺寸排阻纯化后，抗-Her2免疫毒素对表达Her2的肝癌细胞HCC-1008的细胞毒性作用；

图13为抗-Her2免疫毒素对表达Her2的乳腺癌细胞ZR7530的细胞毒性作用；

图14为抗Her2免疫毒素对表达EGFR的（A431）细胞或表达EGFRvIII的U87细胞的细胞毒性作用。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 载体的构建

通过GenBank获得CMV启动子及其TATA框、鼠DHFR、BGH polyA（BGHpA）、beta-globinpolyA（bGpA）、TK polyA（TKpA）的序列，再按照5’到3’依次为GAATTC（EcoRI酶切位点）-CMV启动子-Kozak序列-BamHI和SalI酶切位点-BGHpA-SynpA-bGpA-CMV TATA框-DHFR-TKpA-GAATTC（XhoI酶切位点）的顺序整理后，由人工合成如SEQ No. 5所示的DNA片段；EcoRI和XhoI酶切后插入pUC19质粒中，经检验成功插入上述DNA片段的质粒即为用于哺乳细胞中表达蛋白的载体。

实施例2 GFP（绿色荧光蛋白）的表达。

2.1 载体的构建与表达

以GFP为目的蛋白构建4种不同的载体：a）pCMV- GFP- SV40- DHFR- TKpA、b）pCMV-GFP- BGHpA- SynpA- bGpA- SV40- DHFR- TKpA、c）pCMV- GFP- BGHpA- TATA- DHFR-TKpA和d）pCMV- GFP- BGHpA- SynpA- bGpA- TATA- DHFR- TKpA，步骤如下：参考GenBank获得GFP（LN515608.1）、SV40启动子（DM063619.1）的序列，然后按照上述设计的序列在5’端加序列GAATTC（EcoRI酶切位点）、3’端加序列GAATTC（XhoI酶切位点）然后由人工合成；EcoRI和XhoI酶切后插入pUC19质粒中，经检验成功插入上述DNA片段的质粒再转染CHO细胞（DG44），载体中CMV启动子、CMV启动子TATA框、DHFR、BGHpA、SynpA、bGpA、TKpA的序列如实施例1。

2.2 载体表达的比较

从克隆数量（存活的）、阳性克隆数量（有荧光）、高表达克隆数量（有强荧光）、是否需要MTX和表达稳定性（荧光强度在去除MTX的培养情况下出现下降为不稳定）比较上述4种表达载体，结果如表1所示。由表1结果可知，转染结构为pCMV- GFP- BGHpA- SynpA- bGpA-TATA- DHFR- TKpA的表达载体的细胞高表达克隆数最多，而且不需要使用MTX诱导扩增，同时可以稳定表达。

表1 4种表达GFP的载体的表达比较

实施例3 抗人血小板糖蛋白VI单链抗体（anti-GPVI scFv）的表达与活性。

3.1 单链抗体表达载体的构建与表达

从患有血小板减少性紫癜（由血小板胶原蛋白受体GPVI缺乏引起）病人的血（在输入正常人血后）作为来源，分离出对血小板有亲和性的有核白细胞（B lymphocyte），即分离出病人表达GPVI抗体的B淋巴细胞。然后，利用单细胞RT-PCR、人免疫球蛋白IgG的重链可变区和轻链可变区的特异性引物，克隆出抗GPVI抗体的轻链可变区与重链可变区的DNA序列，两者间通过DNA序列连接；轻链可变区序列前加Herceptin信号肽DNA序列；5’端添加GGATCC（BamHI酶切位点）3’端添加AAGTCGAC（SalI酶切位点），然后进行人工合成，然后BamHI和SalI双酶切后插入同样双酶切的实施例1中获得的载体中，获得表达抗人血小板糖蛋白VI单链抗体的载体，然后转染DG44细胞，采用缺少胸苷的培养基筛选后获得可表达抗GPVI单链抗体的细胞系S3、S5、S9、S11和S13，培养后培养基中含抗GPVI单链抗体，其氨基酸序列如SEQ No. 1所示。培养基3000转/分离心获得上清液，再以50K分子筛排阻纯化后获得抗GPVI单链抗体纯品。

3.2 单链抗体的活性

分别使用抗GPVI 单克隆抗体OM-2（单价）（2.5μg/mL）和含抗GPVI scFv的上清液稀释液（稀释倍数分别为100、1000和10000倍）对两者抑制GPVI-β-gal重组细胞膜与纤维状胶原的结合效果进行比较：纤维状胶原包被96孔板后以BSA-PBS封闭，然后加入GPVI-β-GAL重组膜与OM-2或抗GPVI scFv温育，以等量缓冲液为对照，观察凝集覆盖率，结果如图4所示，纵坐标为占对照的覆盖率。由图4可知，抗GPVI单链抗体可以阻断GPVI-β-GAL重组膜与GPVI特异性结合，S3、S5、S9、S11、S13几株细胞系培养基上清液在稀释100倍时活性均高于2.5μg/mL的OM-2。

实施例4 anti-EGFRvIII scFv-DT390重组免疫毒素的表达与活性。

4.1 scFv -DT390表达载体的构建与表达

DHFR缺陷型CHO细胞（DG44）以300μg/mL的EMS（甲基磺酸乙酯）处理18h，然后正常培养5天恢复，再放入含有0.8 MLD/mL的DT培养基中筛选（已知5.9×10^-3 MLD/mL可以将野生型DG44细胞全部杀死杀死），获得单细胞，然后扩大培养，最终获得抗DT的DG44细胞，用于后续试验。

通过GenBank获得DT 390的DNA序列，再将DT390中可能发生糖基化突变的氨基酸的密码子由丙氨酸的密码子替换，最终序列：CMV启动子、DHFR、BGHpA、bGpA、TKpA、SynpA的DNA序列如实施例1，再按照5’到3’依次为GAATTC（EcoRI酶切位点）-CMV启动子-Kozak序列-DT390序列-BamHI和SalI酶切位点-BGHpA-SynpA-bGpA-CMV TATA框-DHFR-TKpA-GAATTC（XhoI酶切位点）的顺序整理后，由人工合成如SEQ No. 6所示的DNA片段；EcoRI和XhoI酶切后插入同样酶切的pUC19质粒中，经检验成功插入上述DNA片段的质粒即为用于哺乳细胞中表达重组免疫毒素的载体。

4.1.1 鼠源性抗人EGFRvIII scFv-DT390重组免疫毒素的构建与表达

鼠源性抗人EGFRvIII抗体轻链可变区与重链可变区序列参考Matthew C. Franklin等. Structure 19, 1097-1107, 2011中3S34_H的肽链设计轻链可变区与重链可变区的核酸序列，5’和3’端分别添加BamHI和SalI酶切位点后再人工合成，经BamHI和SalI双酶切后插入同样酶切的上述用于哺乳细胞中表达重组免疫毒素的载体中，转染抗DT的DG44细胞，采用缺少胸苷的培养基筛选后，经检验可表达氨基酸序列如SEQ No. 2所示的目的蛋白的细胞株即为anti-EGFRvIII scFv-DT390细胞株，其培养基内含有双价的重组免疫毒素。所述重组免疫毒素Herceptin信号肽与轻链可变区之间、轻链可变区与重链可变区之间、重链可变区与下个轻链可变区之间通过连接肽连接。

4.1.2 人源性抗人EGFRvIII scFv-DT390重组免疫毒素的构建与表达

人源性抗EGFRvIII抗体轻链可变区与重链可变区序列参照文献J. Meng等. CancerBiol. Ther. 2015, 16, 1764-1774设计核酸序列，方法同4.1.1，获得氨基酸序列如SEQNo. 3所示的抗EGFRvIII的重组免疫毒素和分泌相应蛋白的细胞株。所述重组免疫毒素Herceptin信号肽与轻链可变区之间、轻链可变区与重链可变区之间、重链可变区与下个轻链可变区之间通过连接肽连接。

4.2 重组免疫毒素的活性

4.2.1 对U87ED4细胞毒性

分别将含anti-EGFRvIII scFv-DT390重组免疫毒素的培养基上清液和不表达重组免疫毒素的DG44细胞的培养基上清液加入U87ED4细胞（ED4标示此细胞表面表达EGFRvIII）后，结果见图5，左侧为加入不含重组免疫毒素的上清液的细胞形态，右侧为加入含重组免疫毒素的上清液的细胞形态。加入含anti-EGFRvIII scFv-DT390重组免疫毒素的培养基上清液的U87ED4细胞死亡，而由不含重组免疫毒素的普通上清液则对U87ED4细胞没有任何影响。

4.2.2 对移植脑瘤（U87ED4）小鼠的作用

选取20只SHO（SCID Hairless Outbred）小鼠，移植脑瘤后2天，随机分成两组，一组为对照组，一组为治疗组，治疗组使用4.1.1抗人EGFRvIII scFv-DT390重组免疫毒素静脉注射治疗，注射剂量为70μg/kg，注射量为100μL；前五次为每天一次，之后隔天一次，直到移植28天后注射最后一次；对照组采用生理盐水同样操作。观察两组小鼠的肿瘤大小，对照组观察至28天，治疗组观察至42天。肿瘤大小结果如图6所示，横坐标为移植后天数，纵坐标为肿瘤大小（mm³）。图6可知，治疗组小鼠的肿瘤明显小于对照组，甚至有5只小鼠的肿瘤消失了；即使在停药后，肿瘤的生长速度也比较慢。第11天每组随机选取4只小鼠比对肿瘤大小，如图7所示。由图7可知，对照组小鼠肿瘤较大，突起明显；治疗组小鼠肿瘤较小，平均体积仅269 mm³，无明显突起肿瘤块。表明anti-EGFRvIII scFv-DT390重组免疫毒素可以有效杀死脑瘤细胞。

选取23只SHO小鼠，平均体重为30克，移植平均大小为40mm³的脑瘤（U87ED4细胞）后2天，随机分成两组，一组为对照组（11只），一组为治疗组（12只），治疗组使用4.1.1鼠源性抗人EGFRvIII scFv-DT390重组免疫毒素静脉注射治疗，前五次注射剂量为50μg/kg，注射量为100μL，每天一次；于第44天起对仍然还存在肿瘤的6只小鼠隔天一次，注射剂量为60μg/kg，注射量为100μL，注射5次；对照组采用生理盐水同样操作至28天。观察两组小鼠的肿瘤大小，对照组观察至28天，治疗组观察至60天。肿瘤大小结果如图8上图所示，横坐标为移植后天数，纵坐标为肿瘤大小（mm³）。图8下图为单克隆抗体对脑瘤（U87ED4细胞）的抗肿瘤活性（B. Rodney等， Cancer Res. 2001. 61:5355-5361.Fig 4-B）。由图8可知，在移植肿瘤后28内，每只小鼠只需使用1-2μg的重组免疫毒素就能达到较好的一直肿瘤生长的作用，优于单克隆抗体1mg的抗肿瘤效果。

4.2.3 对移植肺癌肿瘤（A549ED4细胞）小鼠的作用

将SHO小鼠移植平均大小为358 mm³的肺癌肿瘤，移植1天后，随机分成两组，一组为对照组（7只），一组为治疗组（7只），治疗组使用4.1.1鼠源性抗人EGFRvIII scFv-DT390重组免疫毒素静脉注射治疗，前12天为每天一次，注射剂量为50μg/kg，注射量为100μL，从第13天开始1天2次，注射剂量为30μg/kg，注射量为100μL；直到移植22天后注射最后一次；对照组采用100μL生理盐水静脉注射，每天一次至移植21天后。观察两组小鼠的肿瘤大小至23天，结果如图9所示，横坐标为移植后天数，纵坐标为肿瘤大小（mm³）。由于治疗组有2只小鼠分别在第8天和第21天意外死亡，因此图9仅包含5只治疗组小鼠数据。由图9可知，治疗组小鼠的肿瘤大小基本没有发生变化；而对照组小鼠的肿瘤持续生长。表明EGFRvIII scFv-DT390重组免疫毒素可以有效抑制肺癌肿瘤生长。

4.2.4 对移植乳腺癌（MD-AM231ED4细胞）小鼠的作用

将SHO小鼠移植平均大小为138 mm³的乳腺癌肿瘤，移植1天后，随机分成两组，一组为对照组（9只），一组为治疗组（10只），治疗组使用4.1.1鼠源性抗人EGFRvIII scFv-DT390重组免疫毒素静脉注射治疗，注射剂量为50μg/kg，注射量为100μL，每天1次至移植后27天；对照组注射100μL生理盐水。观察两组小鼠的肿瘤大小至27天，数据采用双侧t-检验，结果如图10所示，横坐标为移植后天数，纵坐标为肿瘤大小（mm³），#表示p<0.01，两组间肿瘤大小差异极显著，*表示p<0.05，两组间肿瘤大小差异显著。由于治疗组有1只小鼠在第4天死亡，对照组有1只小鼠第20天死亡，因此图10仅包含8只对照组与9只治疗组小鼠数据。由图10可知，治疗组小鼠的肿瘤大小呈现减小趋势；而对照组小鼠的肿瘤持续生长；从第5天起，两组肿瘤大小在统计学上出现显著差异。表明EGFRvIII scFv-DT390重组免疫毒素可以有效抑制乳腺癌肿瘤生长。

4.2.5 对移植前列腺癌（DU145ED4细胞）小鼠的作用

将SHO小鼠移植平均大小为200 mm³的乳腺癌肿瘤，移植1天后，随机分成两组，一组为对照组（8只），一组为治疗组（8只），治疗组使用4.1.1鼠源性抗人EGFRvIII scFv-DT390重组免疫毒素静脉注射治疗，注射剂量为50μg/kg，注射量为100μL，每天1次至移植后27天；对照组注射100μL生理盐水。观察两组小鼠的肿瘤大小至27天，数据采用双侧t-检验，结果如图11所示，横坐标为移植后天数，纵坐标为肿瘤大小（mm³），*表示p<0.05，两组间肿瘤大小差异显著。由图11可知，治疗组小鼠的肿瘤大小呈现减小趋势，其中6只小鼠的肿瘤消失；而对照组小鼠的肿瘤持续生长；从第11天起至试验结束，两组肿瘤大小在统计学上出现显著差异。表明anti-EGFRvIII scFv-DT390重组免疫毒素可以有效抑制前列腺癌肿瘤生长。

实施例5 anti-Her-2 scFv-DT390重组免疫毒素的表达与活性。

5.1 表达载体的构建与表达

anti-Her-2 scFv的轻链可变区与重链可变区的DNA序列参考GenBank中KY199430.1设计，方法同4.1.1，获得氨基酸序列如SEQ No. 4所示的抗Her-2的重组免疫毒素和分泌相应蛋白的细胞株，所述重组免疫毒素为双价的，其Herceptin信号肽与轻链可变区之间、轻链可变区与重链可变区之间、重链可变区与下个轻链可变区之间通过连接肽连接。将培细胞株培养，再将培养基离心获得上清液，再分别以50K分子筛排阻纯化、HIC（疏水作用色谱）纯化、透析（50 kD）和高效液相色谱获得anti-Her-2 scFv-DT390重组免疫毒素，分别标示为50K、HIC、Dialysis和HPLC-18。

5.2 重组免疫毒素的活性

以表达Her-2的HCC-1008（肝癌细胞）和ZR7530（乳腺癌细胞），表达EGFRvIII的U87-ED4（脑胶质瘤细胞）和A431（表皮癌细胞系）共四种细胞系为试验对象，测定anti-Her-2 scFv-DT390重组免疫毒素的细胞毒性。

5.2.1 对HCC-1008的细胞毒性

将4种纯化方式获得的anti-Her-2 scFv-DT390重组免疫毒素分别测定其不同浓度对HCC-1008细胞系的毒性：在96孔板中分别加入HCC-1008细胞悬浮液，每孔5×10³个，再将不同浓度的anti-Her-2 scFv-DT390重组免疫毒素加入96孔板中，以加入等量缓冲液为对照，72h后测定每孔中剩余细胞密度，结果如图12所示，横坐标为anti-Her-2 scFv-DT390重组免疫毒素的浓度，纵坐标为占对照细胞密度的百分比。计算4种纯化方式获得的anti-Her-2scFv-DT390重组免疫毒素对HCC-1008细胞的EC₅₀，50K为1.09×10^-12 mol/L，HIC为1.064×10^-12 mol/L，Dialysis为5.578×10^-13 mol/L，HPLC-18为8.438×10^-13 mol/L。

5.2.2 对HCC-1008的细胞毒性

测定HIC和HPLC-18不同浓度对ZR7530细胞系的毒性，方法同5.2.1，结果如图13所示；计算得HIC的EC₅₀为6.306×10^-13 mol/L，HPLC-18的EC₅₀为1.441×10^-12 mol/L。

5.2.3 对U87-ED4和A431的细胞毒性

分别测定HIC不同浓度对U87-ED4或A431细胞系的毒性，测定anti-Her-2 scFv-DT390重组免疫毒素对U87-ED4细胞系的毒性，方法同5.2.1，结果如图14所示。由图14可知，anti-Her-2 scFv-DT390重组免疫毒素对表达EGFRvIII的细胞系无细胞毒性，而抗EGFRvIII抗体对U87-ED4具有很强的细胞毒性。尽管A431细胞表达很高的EGFR（Her-2和EGFR都是EGF的受体），但Her-2 scFv-DT390重组免疫毒素对A431细胞也无毒性。可知，anti-Her-2 scFv-DT390重组免疫毒素仅对表达Her-2的细胞有特异性。

序列表

<110> 济南海湾生物工程有限公司

<120> 一种用于工业生产的哺乳动物细胞表达载体

<130> 20180310

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

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gtcccaaaat atggggattg gcaagaacgg agacctaccc tggcctccgc tcaggaacga 1740

gttcaagtac ttccaaagaa tgaccacaac ctcttcagtg gaaggtaaac agaatctggt 1800

gattatgggt aggaaaacct ggttctccat tcctgagaag aatcgacctt taaaggacag 1860

aattaatata gttctcagta gagaactcaa agaaccacca cgaggagctc attttcttgc 1920

caaaagtttg gatgatgcct taagacttat tgaacaaccg gaattggcaa gtaaagtaga 1980

catggtttgg atagtcggag gcagttctgt ttaccaggaa gccatgaatc aaccaggcca 2040

cctcagactc tttgtgacaa ggatcatgca ggaatttgaa agtgacacgt ttttcccaga 2100

aattgatttg gggaaatata aacttctccc agaataccca ggcgtcctct ctgaggtcca 2160

ggaggaaaaa ggcatcaagt ataagtttga agtctacgag aagaaagact aagtcgaggt 2220

tcgctgatgg gggaggctaa ctgaaacacg gaaggagaca ataccggaag gaacccgcgc 2280

tatgacggca ataaaaagac agaataaaac gcacgggtgt tgggtcgttt gttcataaac 2340

gcggggttcg gtcccagggc tggcactctg tcgatacccc accgagaccc cattggggcc 2400

aatacgcccg cgtttcttcc ttttccccac cccacccccc aagttcgggt gaaggcccag 2460

ggctcgcagc caacgtcggg gcggcaggcc ctgccatagc tcgag 2505

<210> 6

<211> 3762

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> vector2

<400> 6

gaattctaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 60

tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 120

atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 180

ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 240

gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc 300

ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc 360

tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa 420

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tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct 540

gttttgacct ccatagaaga caccgggacc gatccagcct ccgcggccgg gaacggtgca 600

ttggaacgcg gattccccgt gccaagagtg acgtaagtac cgcctatagg ctctataggc 660

acaccccttt ggctcttatg catgaattaa gacagactgt tcctttcctg ggtcttttct 720

gcaggcaccg gaagatctgc caccatggag accgacaccc tgctgctgtg ggtgctgctg 780

ctgtgggtgc ccggcagcac cggcgccggg gcagacgatg tggtggattc aagcaagtca 840

tttgtcatgg agaacttcgc aagctatcac ggaactaagc caggttatgt ggattctatc 900

cagaagggga ttcagaagcc caaaagtggg actcagggta attacgacga tgactggaaa 960

ggcttctatt ccaccgataa caagtacgac gccgctgggt attccgtgga taacgagaat 1020

cccctgagcg gtaaagctgg cggagtggtc aaggtgacat accctggcct gactaaagtg 1080

ctggcactga aggtggacaa tgccgaaact atcaagaaag agctgggcct gtccctgacc 1140

gaaccactga tggagcaagt gggaacagag gagttcatca agcgatttgg ggacggtgct 1200

tctcgtgtgg tcctgagtct gcccttcgcc gaaggctcca gctctgtcga gtatatcaac 1260

aattgggaac aggcaaaagc cctgagcgtg gagctggaaa ttaattttga gaccagaggc 1320

aagcgcggac aggatgccat gtacgaatat atggctcagg catgcgcagg aaatcgggtg 1380

aggcgatcag tcggaagttc actgtcctgt atcaacctgg attgggacgt gattcgcgac 1440

aagactaaaa ccaagatcga atcactgaaa gagcacggcc ccatcaagaa caagatgtct 1500

gagagtcccg ctaagacagt gagcgaggaa aaagcaaagc agtacctgga ggagttccac 1560

cagactgctc tggagcatcc tgaactgtct gagctgaaaa cagtgactgg gaccaaccca 1620

gtctttgctg gtgcaaatta tgcagcctgg gctgtgaacg tcgcacaggt catcgatagt 1680

gagaccgccg acaatctgga aaagaccaca gctgcactga gcatcctgcc tggcattgga 1740

tctgtgatgg ggatcgcaga tggtgccgtc caccataaca cagaggaaat cgtggcccag 1800

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ccaaaatatg gggattggca agaacggaga cctaccctgg cctccgctca ggaacgagtt 3000

caagtacttc caaagaatga ccacaacctc ttcagtggaa ggtaaacaga atctggtgat 3060

tatgggtagg aaaacctggt tctccattcc tgagaagaat cgacctttaa aggacagaat 3120

taatatagtt ctcagtagag aactcaaaga accaccacga ggagctcatt ttcttgccaa 3180

aagtttggat gatgccttaa gacttattga acaaccggaa ttggcaagta aagtagacat 3240

ggtttggata gtcggaggca gttctgttta ccaggaagcc atgaatcaac caggccacct 3300

cagactcttt gtgacaagga tcatgcagga atttgaaagt gacacgtttt tcccagaaat 3360

tgatttgggg aaatataaac ttctcccaga atacccaggc gtcctctctg aggtccagga 3420

ggaaaaaggc atcaagtata agtttgaagt ctacgagaag aaagactaag tcgaggttcg 3480

ctgatggggg aggctaactg aaacacggaa ggagacaata ccggaaggaa cccgcgctat 3540

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gggttcggtc ccagggctgg cactctgtcg ataccccacc gagaccccat tggggccaat 3660

acgcccgcgt ttcttccttt tccccacccc accccccaag ttcgggtgaa ggcccagggc 3720

tcgcagccaa cgtcggggcg gcaggccctg ccatagctcg ag 3762

Claims

1.一种用于哺乳动物宿主细胞表达蛋白/多肽的表达载体，包含标记基因和用于插入目的基因的限制性内切酶酶切位点，其特征在于，目的基因后的Poly(A)加尾信号数量为2个或2个以上，标记基因的启动元件仅为TATA框。

2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，限制性内切酶酶切位点前还包括带有外泌信号肽的且失去与细胞直接结合能力的截短白喉毒素的编码基因；目的基因为单链抗体基因或多肽类配体基因。

3.据权利要求1或2所述的表达载体，其特征在于，启动子或TATA框选自但不限于CMV或SV40的启动子或TATA框。

4.根据权利要求1或2所述的表达载体，其特征在于，所述Poly(A)加尾信号选自病毒、原核/真核生物的，修饰或改造的病毒、原核/真核生物的和人工合成的Poly(A)加尾信号中的至少一种；数量优选为3个。

5.根据权利要求1或2所述的表达载体，其特征在于，标记基因选自但不限于DHFR基因、GS基因或耐抗生素基因。

6.根据权利要求1或2所述的表达载体，其特征在于，哺乳动物宿主细胞为CHO细胞系，NSO细胞系，BHK细胞系，Vero细胞系，PER C6细胞系或HEK 293细胞系。

7.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，哺乳动物宿主细胞为对相应的毒素有抵抗力的CHO细胞系或HEK 293细胞系。

8.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述目的基因包括但不限于编码单链抗体、激素、外毒素、干扰素和融合蛋白的基因。

9.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，目的基因为单链单价抗人血小板糖蛋白VI抗体。

10.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，融合蛋白为外泌型的含有截短白喉毒素的具有与Her2或EGFRvIII受体特异性结合的免疫毒素。