CN113439123A - 溶瘤病毒用于治疗癌症的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及溶瘤病毒(例如，修饰的HSV‑1病毒)用于治疗各种类型癌症的用途。此外，本发明涉及关于溶瘤病毒的此类用途的组合物和试剂盒。

Description

溶瘤病毒用于治疗癌症的用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年3月5日提交的美国临时申请号62/813,961的优先权和权益，将其通过引用以其全文并入本文。
参考序列表
本申请包含计算机可读形式的序列表。序列表以标题为A-2353-WO-PCT_SeqListing_ST25.txt的文本文件提供，该文件创建于2020年1月10日，大小为37,667字节。电子格式的序列表中的信息通过引用以其全文并入本文。
背景技术
在许多形式的癌症的治疗上的最新进展极大地改善了男性和女性对于最常见类型的癌症(例如肺癌、结肠癌、乳腺癌和前列腺癌)的存活期。成功地引导患者的免疫系统攻击某些形式的癌症的检查点抑制剂的出现极大地改善了患者对于某些癌症的存活期。例如，已证明伊匹单抗(抗CTLA-4抗体)、派姆单抗和纳武单抗(抗PD-1抗体)和阿特珠单抗(抗PD-L1抗体)等检查点抑制剂对多种肿瘤类型均具有功效。参见Grosso等人,Cancer Immun.[癌症免疫],13:5(2013)；Pardoll,Nat Rev Cancer[自然癌症评论],12:252-264(2012)；和Chen等人,Immunity[免疫力],39:1-10(2013)。
溶瘤病毒还已经显示出在治疗某些形式的癌症中具有临床功效。溶瘤病毒通常经过基因工程化以优先在癌细胞(相较于健康细胞)中复制，并包含可用于增强抗肿瘤应答的“有效载荷”。此类基因工程最初集中于使用无复制能力的病毒，以防止病毒诱导的对非肿瘤细胞的损害。最近，溶瘤病毒的基因工程已经集中于“条件复制型”病毒的生成，以避免全身感染，同时允许病毒传播到其他肿瘤细胞。
目前，在美国和欧洲唯一批准的基于溶瘤病毒的药物是拉他莫金(talimogenelaherparepvec，
Figure BDA0003210744360000011
)。拉他莫金是衍生自临床毒株JS1的HSV-1(保藏于欧洲细胞培养物保藏中心(European collection of cell cultures，ECAAC)，保藏号01010209)。在拉他莫金中，编码ICP34.5和ICP47的HSV-1病毒基因已功能性缺失。ICP47的功能性缺失导致US11的较早表达，US11是促进肿瘤细胞中病毒生长而不降低肿瘤选择性的基因。另外，人GM-CSF的编码序列已插入病毒基因组中的ICP34.5基因前位点处。参见Liu等人,GeneTher.[基因疗法],10:292-303,2003。
已经探索了溶瘤病毒和检查点抑制剂的治疗性组合。例如，目前正在黑色素瘤(NCT01740297和NCT02263508)和头颈部鳞状细胞癌(NCT02626000)的临床试验中研究拉他莫金和免疫疗法(例如伊匹单抗和派姆单抗)的组合。
尽管溶瘤病毒在癌症的治疗中已显示出巨大的前景，但仍然需要开发这样的溶瘤病毒，此类溶瘤病毒不仅限制它们复制和对癌细胞的裂解损伤，而且还能够帮助建立和维持稳健的全身性抗肿瘤免疫应答。
本发明解决这些和其他需求。
发明内容
本发明涉及溶瘤病毒，其包含编码异源树突细胞生长因子的核酸和编码第一异源细胞因子的核酸。异源树突细胞生长因子和第一异源细胞因子可以通过多顺反子(polycistronic)接头元件连接。在一些实施例中，多顺反子接头元件是猪捷申病毒2a(P2A)或内部核糖体进入位点(IRES)。溶瘤病毒可以是单纯疱疹病毒，例如单纯疱疹1型病毒。在一个特定的实施例中，溶瘤病毒衍生自HSV-1毒株JS1。
溶瘤病毒可以被进一步修饰，以使其缺乏功能性ICP 34.5基因并缺乏功能性ICP47基因。
另外，溶瘤病毒可进一步包含启动子，其中编码树突细胞生长因子和第一细胞因子的核酸序列均在同一启动子的控制下。在其他实施例中，溶瘤病毒可包含第一启动子，其中编码树突细胞生长因子的核酸序列在第一启动子的控制下；和第二启动子，其中编码第一细胞因子的核酸序列在第二启动子的控制下。
第一异源细胞因子可以是白介素，例如白介素-12(IL12)。异源树突细胞生长因子可以是第二细胞因子，例如Fms相关酪氨酸激酶3配体(FLT3L)。
在一个特定的实施例中，本发明的溶瘤病毒包含HSV-1(其缺乏功能性ICP34.5编码基因且缺乏功能性ICP47编码基因)，包含编码FLT3L的核酸，并且还包含编码IL12的核酸。在一些实施例中，编码IL12的核酸和编码FLT3L的核酸存在于ICP34.5编码基因的前位点中。在一个实施例中，编码IL12的核酸和编码FLT3L的核酸通过P2A连接。
编码IL12、FLT3L和P2A的核酸可以以[Flt3L]-[P2A]-[IL12]存在，其中[Flt3L]-[P2A]-[IL12]构建体在单个启动子控制下，并且该构建体存在于ICP34.5编码基因的前位点中。合适的启动子包括：巨细胞病毒(CMV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、人延伸因子1α启动子(EF1a)、猿猴病毒40早期启动子(SV40)、磷酸甘油酸激酶1启动子(PGK)、泛素C启动子(UBC)和鼠干细胞病毒(MSCV)。在一个特定的实施例中，启动子是CMV。
本发明的溶瘤病毒可以包含牛生长激素聚腺苷酸化信号序列(BGHpA)。本发明的溶瘤病毒还可包含增强哺乳动物翻译的核酸。在一些实施例中，增强哺乳动物翻译的核酸是Kozak序列或共有Kozak序列。在一个特定的实施例中，共有Kozak序列在SEQ ID NO:20中列出。
在一个实施例中，溶瘤病毒包含编码[CMV]-[Kozak]-[Flt3L]-[P2A]-[IL12]-[BGHpA]的一种或多种核酸(也称为构建体或表达盒)。在另一个实施例中，IL12以[P40亚基]-[GGGGS]-[P35亚基]存在。在另一个实施例中，IL12 P35亚基中的信号肽是不存在的。在另一个实施例中，溶瘤病毒包含编码[CMV]-[Kozak]-[Flt3L]-[P2A]-[IL12(p40-GGGGS-No SP-p35)]-[BGHpA]的一种或多种核酸。在又另一个实施例中，构建体存在于ICP34.5编码基因的前位点。图9显示了用于生成HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12的构建体在ICP34.5编码基因的前位点中的取向，但可生成/利用表达盒在ICP34.5编码基因的前位点中的多个取向。
在一些实施例中，溶瘤病毒包含含有SEQ ID NO:1的FLT3L序列和含有SEQ ID NO:7的IL12序列。
在一些实施例中，溶瘤病毒包含含有SEQ ID NO:24的CMV启动子，含有SEQ ID NO:20的Kozak序列，含有SEQ ID NO:1的FLT3L序列，含有SEQ ID NO:17的P2A序列(GSG-P2A)，含有SEQ ID NO:7的IL12序列和含有SEQ ID NO:21的BGHpA序列。
本发明还包括使用本发明的溶瘤病毒治疗癌症的方法。另外，本发明包括治疗有效量的溶瘤病毒，用于在治疗癌症中使用。
本发明还包括药物组合物，用于在治疗癌症中使用。药物组合物可以进一步包含检查点抑制剂。
在一些实施例中，本发明包括包含本发明的溶瘤病毒的试剂盒。
附图说明
图1.图1显示了针对IL12p35和IL12p40链融合产生单链细胞因子产物而评估的接头的计算机建模。
图2.图2显示了针对IL12p35和IL12p40链融合而评估的接头的能量构象建模。
图3.图3显示了IL12融合蛋白的工程化，以优化表达，包括评估链的取向，信号肽的放置以及所用的接头。
图4.图4显示了用猪2A病毒(P2A)序列或内部核糖体进入位点(IRES)序列表达时，FLT3L和单链IL12的表达。
图5.图5显示了将KOZAK序列掺入DNA构建体中对产生的细胞因子产物水平的影响。
图6.图6显示了P2A氨基酸添加对于FLT3L对其同源受体FLT3的活性和FLT3L与其同源受体FLT3的受体结合的结构影响。
图7.图7显示了在体外报告基因测定中重组人IL12(A)和由FLT3L-P2A-IL12构建体产生的单链IL12(B)的活性。
图8.图8显示了在体外细胞增殖测定中重组人FLT3L(A)和由FLT3L-P2A-IL12构建体产生的FLT3L(B)的活性。
图9.图9显示了同源重组方法，以产生包含插入到HSV1基因组的两个34.5座位中的FLT3-IL12序列的工程化病毒。
图10.图10显示了HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12病毒在VERO(A)和A375(B)细胞系中的体外复制能力。
图11.图11显示了HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12病毒在小鼠CT26细胞(A)以及人HT-29(B)、SK-MEL-5(C)、FADU(D)和BxPC-3细胞系(E)中的体外感染和裂解能力。
图12.图12显示了来自HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12病毒的FLT3L和IL12在受感染的人VERO、SK-MEL-5和A375细胞中的表达。
图13.图13显示了IL12当被在体外感染了HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12病毒的人SK-MEL-5(A)或A375(B)细胞表达时的活性。
图14.图14显示了FLT3L当被在体外感染了HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12病毒的人SK-MEL-5(A)或VERO(B)细胞表达时的活性。
图15.图15显示了来自植入BALB/c动物和经瘤内注射HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12的1e6 PFU/动物的A20肿瘤细胞的小鼠FLT3L和IL12的体内表达。
图16.图16显示了来自植入C57BL6动物和经瘤内注射HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12的5e6 PFU/动物的B16F10肿瘤细胞的小鼠FLT3L和IL12的体内表达。
图17.图17显示了由于注射HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF或HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12病毒而产生的抗肿瘤T细胞应答。
图18.图18显示了HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12在双侧小鼠同系B细胞淋巴瘤(A20细胞系)肿瘤模型中的抗肿瘤功效，其中病毒通过瘤内仅递送至其中一个肿瘤(右侧)，而另一个肿瘤未经处理(左侧)。
图19.图19显示了HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12在双侧小鼠同系神经母细胞瘤(Neuro2A细胞系)肿瘤模型中的抗肿瘤功效，其中病毒通过瘤内仅递送至其中一个肿瘤(右侧)，而另一个肿瘤未经处理(左侧)。
图20.图20显示了HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12在双侧小鼠同系结直肠(CT26细胞系)肿瘤模型中的抗肿瘤功效，其中病毒通过瘤内仅递送至其中一个肿瘤(右侧)，而另一个肿瘤未经处理(左侧)。
图21.图21显示了HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12结合检查点阻断(抗PD1mAb)在双侧小鼠同系结直肠(MC38细胞系)肿瘤模型中的抗肿瘤功效，其中病毒通过瘤内仅递送至其中一个肿瘤(右侧)，而另一个肿瘤未经处理(左侧)。
图22.图22显示了HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12在单个小鼠同系结直肠(CT26细胞系)肿瘤模型中的细胞因子/有效载荷产生，其中病毒经瘤内递送至肿瘤(右侧)。
图23.图23显示了在双侧小鼠同系结直肠(MC38细胞系)肿瘤模型中单独注射HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12或结合抗PD1抗体所产生的抗肿瘤应答(通过ELISpot测量)。X轴下方的线表示在线的起点和终点指示的各组之间的统计分析结果(双尾学生T检验)。P值表示如下：*是p≤0.05；**是p≤0.01，***是p≤0.001，****是p≤0.0001
图24.图24显示了HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12结合抗4-1BB激动剂抗体在双侧小鼠同系结直肠(MC38细胞系)肿瘤模型中的抗肿瘤功效，其中病毒通过瘤内仅递送至其中一个肿瘤(右侧)，而另一个肿瘤未经处理(左侧)。
具体实施方式
本文中所使用的部分标题仅出于组织目的，而不应被视为限制所描述的主题内容。在本说明书正文中引用的所有参考文献都通过引用以其全文明确地并入。
除非本文中另外定义，否则结合本申请所使用的科学及技术术语具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语将包括复数且复数术语将包括单数。
一般而言，结合本文中所描述的细胞及组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质及核酸化学及杂交而使用的命名法及其技术是本领域中众所周知且通常使用的那些命名法及技术。除非另外指示，否则本申请的方法及技术可根据本领域中众所周知的常规方法且如贯穿本说明书所引用及论述的各种通用及更特定参考文献中所描述来进行。参见，例如，Sambrook等人.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3rded.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)[分子克隆:实验室手册,第3版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约洲(2001)]；Ausubel等人.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)[分子生物学现代方法,格林出版联合公司(1992)]；以及Harlow和Lane Antibodies:ALaboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)[抗体:实验室手册,冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州(1990)]，将这些文献通过引用并入本文中。酶促反应及纯化技术是根据制造商的说明书、如本领域中通常所实现或如本文中所描述来进行。结合本文中所描述的分析化学、合成有机化学以及医学及药物化学而使用的术语及其实验程序及技术是本领域中众所周知且通常使用的那些术语以及实验程序及技术。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制品及递送、以及治疗患者。
应理解，本发明不限于本文中所描述的特定方法、方案及试剂等且因而可能变化。本文中所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而不意欲限制本披露的范畴，本披露的范畴将仅由权利要求书来限定。
除了操作实例中或另外指示的情况，表述本文中所使用的成分的量或反应条件的所有数字均应理解为在所有情况下均由术语“约”加以修饰。术语“约”当结合百分比使用时可意指±1％。
以任何方式都比由本文特定段落所定义的变型范围更窄的所有实施例应被认为包括在本披露中。例如，某些方面被描述为一类，并且应当理解，属于一类的每个成员可以分别是实施例。同样，被描述为一类的方面或选择属于一类的成员应被理解为包括该类中两个或更多个成员的组合。还应理解，虽然说明书中的多个实施例是使用“包含”语言呈现的，但在多种情况下，也可以使用“由……组成”或“基本上由……组成”语言来描述相关的实施例。
定义
当涉及基因时，术语“功能性缺失”是指该基因被修饰(例如，通过部分或完全缺失、替换、重排或以其他方式改变该基因)，使得功能性蛋白不再由该基因表达。在单纯疱疹病毒(例如溶瘤病毒)的情况下，当病毒基因在单纯疱疹基因组中被修饰，从而单纯疱疹病毒不再由该基因表达功能性病毒蛋白时，该基因发生“功能性缺失”。
当涉及病毒基因组中存在的核酸(或由核酸编码的蛋白质)时，术语“异源”是指病毒中非天然存在的核酸(或由病毒非天然产生的蛋白质)。例如，相对于HSV-1，编码人IL12的核酸或编码人FLT3L的核酸是“异源的”。
术语“溶瘤病毒”是指天然地或由于修饰而相对于非癌细胞优先感染并杀死癌细胞的病毒。
如本文所用，术语“患者”或“受试者”可互换使用并且意指哺乳动物，包括但不限于人或非人哺乳动物(如牛、马、犬、绵羊或猫)。优选地，患者是人。
术语“HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12”是指衍生自毒株JS1的修饰的HSV-1，其中HSV-1缺乏功能性ICP34.5编码基因，缺乏功能性ICP47编码基因，包括插入ICP34.5基因前位点的以下：[CMV]-[Kozak]-[Flt3L]-[P2A]-[IL12(p40-GGGGS-NoSP-p35)]-[BGHpA]。
溶瘤病毒
任何病毒都可以用于产生本发明的溶瘤病毒。通常，可以对病毒进行修饰，例如以调节其复制(例如，相对于在健康细胞中，优先在肿瘤细胞中复制)、其被宿主的免疫系统检测的能力，以及包括外源核酸。
在一些实施例中，溶瘤病毒是单纯疱疹病毒(HSV)。在其他实施例中，溶瘤病毒是单纯疱疹1型病毒(HSV-1)。在又其他实施例中，溶瘤病毒衍生自JS1(HSV-1)。JS1保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ECAAC)，保藏号为01010209。
在一些实施例中，溶瘤病毒是其中编码ICP34.5的病毒基因功能性缺失的HSV-1。在HSV感染期间充当毒力因子的ICP34.5的功能性缺失限制了在非分裂细胞中的复制并使得病毒呈非致病性。ICP34.5功能性缺失的HSV的安全性已在多项临床研究中得到证明(MacKie等人,Lancet[柳叶刀]357:525-526,2001；Markert等人,Gene Ther[基因疗法]7:867-874,2000；Rampling等人,Gene Ther[基因疗法]7:859-866,2000；Sundaresan等人,J.Virol[病毒学杂志]74:3822-3841,2000；Hunter等人,J Virol[病毒学杂志]，八月；73(8):6319-6326,1999)。
在其他实施例中，溶瘤病毒是HSV-1，其中编码ICP47的病毒基因(其阻止病毒抗原呈递给主要的组织相容性复合物I和II类分子)功能性缺失。ICP47的功能性缺失也导致US11的较早表达，US11是促进肿瘤细胞中病毒生长而不降低肿瘤选择性的基因。
在一些实施例中，编码ICP34.5的病毒基因缺失。在一些实施例中，编码ICP47的病毒基因缺失。在一些实施例中，编码ICP34.5的病毒基因和编码ICP47的病毒基因均缺失。在一些实施例中，编码ICP34.5的病毒基因和编码ICP47的病毒基因均缺失，并且ICP47的缺失导致US11的较早表达。
疱疹病毒株以及如何制备这些毒株描述于美国专利号US 5824318、US 6764675、US 6,770,274、US 7,063,835、US 7,223,593、US 7749745、US 7744899、US 8273568、US8420071、US 8470577，WIPO公开号：WO 199600007、WO 199639841、WO 199907394、WO200054795、WO 2006002394、WO 201306795，中国专利号：CN 128303、CN 10230334和CN10230335，Varghese和Rabkin,(2002)Cancer Gene Therapy[癌症基因疗法]9:967-97以及Cassady和Ness Parker,(2010)The Open Virology Journal[开放病毒学杂志]4:103-108中，其每一篇均通过引用并入本文。
本发明的溶瘤病毒也被修饰，使得它们包含编码蛋白质的外源核酸。合理地选择此类蛋白质以增强病毒的免疫刺激能力。增加免疫刺激能力使溶瘤病毒引起更稳健的抗肿瘤应答。因此，一方面，溶瘤病毒包含编码异源树突细胞生长因子、第一异源细胞因子或两者的核酸。FLT3L增强树突细胞，特别是cDC1子集的增殖和存活，这对于肿瘤抗原向T细胞的交叉呈递是至关重要的。此外，IL12增强了1型T辅助细胞(Th1)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的功能，得到最大肿瘤杀伤活性。不受理论的束缚，认为这两组属性的组合将产生具有令人惊讶的例如诱导对癌细胞的全身免疫应答能力的溶瘤病毒。
在特定的实施例中，溶瘤病毒包含编码异源树突细胞生长因子的核酸和编码第一异源细胞因子的核酸(有时称为“有效载荷”)。第一异源细胞因子的实例包括白介素-2(IL2)、IL7、IL12、IL15、IL21、TNF、以及能够与免疫细胞上的受体结合和/或能够增强T细胞功能或记忆形成的细胞因子和蛋白质的白介素家族的其他成员。在一个特定的实施例中，第一异源细胞因子是IL12(鼠或人)。编码muIL12a和muIL12b的核酸序列分别在SEQ ID NO:11和13中列出。编码huIL12a和huIL12b的核酸序列分别在SEQ ID NO:3和5中列出。muIL12a和muIL12b的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:12和14中列出。huIL12a和huIlL2b的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:4和6中列出。
天然形式的IL12是包含IL12A(p35亚基)和IL12B(p40亚基)的异二聚体细胞因子，其中每个亚基由单独的基因编码。因此，在一些实施例中，本发明的溶瘤病毒包含两个异源核酸：一个编码IL12 p35亚基，另一个编码IL12 p40亚基。在其他实施例中，本发明的溶瘤病毒包含单链IL12变体。在这样的单链IL12变体中，p35和p40亚基可以彼此直接融合(即，没有接头)，或者可以经由(合成的或基于肽的)接头彼此连接。合适的接头的实例包括：基于弹性蛋白的接头(VPGVGVPGVGGS；SEQ ID NO:22所示的核酸序列；SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列)、G4S、2x(G4S)、3x(G4S)、4x(G4S)、5x(G4S)、6x(G4S)、7x(G4S)、8x(G4S)、9x(G4S)和10x(G4S)。在一些实施例中，接头是VPGVGVPGVGGS、G4S、2x(G4S)或3x(G4S)。在一个特定的实施例中，接头是G4S。
IL12变体可以包含或可以排除天然IL12蛋白中存在的信号肽(每个亚基一个)。在一些实施例中，IL12变体包含零个、一个或两个信号肽。在一个具体的实施例中，IL12变体包含单个信号肽，例如[IL12(p40-GGGGS-No SP-p35)](SEQ ID NO:7中存在的核酸序列；SEQ ID NO:8中存在的氨基酸序列)，其中保留了p40信号肽，并去除了p35信号肽。参见图3。
异源树突细胞生长因子的实例包括细胞因子、C型凝集素和CD40L。在一些实施例中，异源树突细胞生长因子是选自包括以下的列表的细胞因子(即，第二细胞因子)：Fms相关酪氨酸激酶3配体(FLT3L)、GMCSF、TNFα、IL36γ和IFN。在一个特定的实施例中，异源树突细胞生长因子是FLT3L。编码muFLT3L的核酸序列在SEQ ID NO:9中列出。编码huFLT3L的核酸序列在SEQ ID NO:1中列出。muFLT3L的氨基酸序列在SEQ ID NO:10中列出。huFLT3L的氨基酸序列在SEQ ID NO:2中列出。
在一些实施例中，溶瘤病毒包含编码FLT3L和IL12的核酸。在其他实施例中，溶瘤病毒是HSV-1，其中编码ICP34.5的病毒基因和编码ICP47的病毒基因缺失，并且溶瘤病毒包含编码FLT3L和IL12的核酸。
外源核酸可以在相同启动子或不同启动子的控制下。在一个特定的实施例中，编码异源树突细胞生长因子的核酸和编码第一异源细胞因子的核酸在同一启动子的控制下。使用单个启动子(例如CMV启动子)具有能够在同一感染细胞中以相同的速率并同时产生异源树突细胞生长因子和第一异源细胞因子的益处。
合适的启动子的实例包括：巨细胞病毒(CMV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、人延伸因子1α启动子(EF1a)、猿猴病毒40早期启动子(SV40)、磷酸甘油酸激酶1启动子(PGK)、泛素C启动子(UBC)和鼠干细胞病毒(MSCV)。在一个特定的实施例中，启动子是CMV(SEQ ID NO:24中所示的核酸序列)。
当在同一启动子的控制下，编码有效载荷的核酸可以通过另外的核酸连接，所述核酸例如允许多顺反子翻译(多顺反子接头元件)。合适的多顺反子接头元件的实例包括：核糖体进入位点(例如，内部核糖体进入位点(IRES)(SEQ ID NO:19))、2A序列(例如，猪捷申病毒2a(GSG-P2A；SEQ ID NO:17中所述的核酸序列；SEQ ID NO:18中所述的氨基酸序列)、明脉扁刺蛾病毒2A(T2A)、口蹄疫病毒2A(F2A)和马鼻炎A病毒(E2A))。此类序列可用于以任何取向连接两个核酸。例如，病毒基因组中的核酸可以这样定向：[异源树突细胞生长因子]-[P2A]-[第一异源细胞因子]或[第一异源细胞因子]-[P2A]-[异源树突细胞生长因子]。
已经观察到，使用IRES导致构建体中IRES的第二核酸3'的产生减少。例如，[IL12]-[IRES]-[FLT3L]构建体中FLT3L的产生减少，同时[FLT3L]-[IRES]-[IL12]中IL12的产生减少。参见实例4。因此，在一个实施例中，多顺反子连接元件为2A。在一个具体的实施例中，多顺反子连接元件是P2A。
本发明的溶瘤病毒还可包含增强外源核酸翻译(例如哺乳动物翻译)的序列。例如，已知KOZAK序列增强哺乳动物翻译。因此，在一些实施例中，溶瘤病毒包含Kozak序列。在一个实施例中，Kozak序列是共有Kozak序列(SEQ ID NO:20)。
本发明的溶瘤病毒还可包含增强病毒表达的mRNA的稳定性的序列。这样的序列的实例包括牛生长激素聚腺苷酸化信号序列(BGHpA)和兔β珠蛋白(RBGpA)、SV40 polyA和hGHpolyA。在一个具体的实施例中，该序列是BGHpA(SEQ ID NO:21)。
可如本文所述进行修饰的其他溶瘤病毒包括RP1(HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/GM-CSF/GALV-GP R(-))；RP2(HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/GM-CSF/GALV-GP R(-)/抗CTLA-4结合物)；和RP3(HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/GM-CSF/GALV-GP R(-)/抗CTLA-4结合物/共刺激配体(例如，CD40L、4-1BBL、GITRL、OX40L、ICOSL))。在此类溶瘤病毒中，GALV(长臂猿白血病病毒)已被R肽的特定缺失修饰，得到GALV-GP R(-)。此类溶瘤病毒在WO 2017118864、WO2017118865、WO 2017118866、WO 2017118867、和WO 2018127713A1中进行了讨论，各自通过引用以其全文并入。可如本文所述进行修饰的溶瘤病毒的其他实例包括NSC-733972、HF-10、BV-2711、JX-594、Myb34.5、AE-618、BrainwelTM、和HeapwelTM、
Figure BDA0003210744360000121
(柯萨基病毒(coxsackievirus)、CVA21)、HF-10、
Figure BDA0003210744360000122
enadenotucirev、ONCR-177、以及在USP 10,105,404、WO 2018006005、WO 2018026872 A1、和WO 2017181420中描述的那些，其每一篇均通过引用以其全文并入。
可如本文所述进行修饰的溶瘤病毒的其他实例包括：
G207是源自野生型HSV-1毒株F的溶瘤HSV-1，其在HSV神经毒性的主要决定簇、ICP34.5基因二者拷贝中具有缺失，并且在UL39中失活插入编码感染的细胞蛋白6(ICP6)的大肠杆菌lacZ基因，参见Mineta等人(1995)Nat Med.[自然医学]1:938-943。
OrienX010是一种单纯疱疹病毒，其具有γ34.5和ICP47两种基因拷贝的缺失以及ICP6基因的中断和人GM-CSF基因的插入，参见Liu等人,(2013)World Journal ofGastroenterology[世界胃肠病学杂志]19(31):5138-5143。
NV1020是一种长(L)和短(S)区域的联合区域缺失的单纯疱疹病毒，其包括ICP34.5、UL24和UL56.34,35的一个拷贝。缺失区域被HSV-2US DNA的片段(US2、US3(PK)、gJ和gG)替换，参见Todo,等人(2001)Proc Natl Acad Sci USA.[美国国家科学院院刊]98:6396-6401。
M032是一种单纯疱疹病毒，其具有ICP34.5基因二者拷贝的缺失和白细胞介素12的插入，参见Cassady和Ness Parker,(2010)The Open Virology Journal[开放病毒学杂志]4:103-108。
ImmunoVEX HSV-2是一种单纯疱疹病毒(HSV2)，其具有编码vhs、ICP47、ICP34.5、UL43和US5的基因的功能性缺失。
OncoVEXGALV/CD也衍生自HSV-1毒株JS1，其中编码ICP34.5和ICP47的基因功能性缺失，并且编码胞嘧啶脱氨酶和长臂猿白血病病毒融膜糖蛋白的基因插入病毒基因组中以替代ICP34.5基因。
在一个特定的实施例中，本发明的溶瘤病毒是HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12。在另一个实施例中，本发明的溶瘤病毒是HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12，其中所述病毒衍生自保藏于欧洲细胞培养物保藏中心(ECAAC)的HSV-1毒株JS1，保藏号为01010209。
与其他药剂的组合
本发明的溶瘤病毒可以用作治疗癌症等疾病的单一药剂。通常已经发现溶瘤病毒是安全的，并且具有良好的安全性。因此，本发明的溶瘤病毒可以与其他药剂组合使用而对安全性没有明显的负面影响。
本发明的溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)可与免疫检查点抑制剂、免疫细胞因子、共刺激分子激动剂、靶向疗法、以及标准护理疗法组合使用。例如，本发明的溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)可以与靶向癌症疗法(例如，MEK抑制剂如考比替尼、曲美替尼和贝美替尼)和/或细胞因子(例如，聚乙二醇化IL2(例如，bempegaldesleukin)或聚乙二醇化IL10(例如，pegilodecakin))组合使用。
检查点抑制剂
免疫检查点是调节某些类型的免疫系统细胞(如T细胞(其在细胞介导的免疫中起核心作用))的蛋白质。虽然免疫检查点有助于在检查中控制免疫应答，但它们也可以防止T细胞杀死癌细胞。免疫检查点抑制剂(或简称“检查点抑制剂”)可以阻断免疫检查点蛋白活性，从而释放免疫系统上的“制动器”，并允许T细胞更好地杀死癌细胞。
如本文所用，术语“免疫检查点抑制剂”或“检查点抑制剂”是指完全或部分地减少、抑制、干扰或调节一种或多种检查点蛋白的分子。检查点蛋白调节T细胞激活或功能。许多检查点蛋白是已知的，例如CTLA-4及其配体CD80和CD86；以及PD-1及其配体PD-L1和PD-L2(Pardoll,Nature Reviews Cancer[自然癌症综述]12:252-264,2012)。这些蛋白质负责T细胞应答的共刺激或抑制相互作用。免疫检查点蛋白调节和维持自身耐受性以及生理免疫应答的持续时间和幅度。免疫检查点抑制剂包括抗体或可以衍生自抗体。
检查点抑制剂可以包括小分子抑制剂，或者可以包括结合并阻断或抑制免疫检查点受体的抗体或其抗原结合片段，或结合并阻断或抑制免疫检查点受体配体的抗体。可以被靶向以便阻断或抑制的示例性检查点分子包括但不限于CTLA-4、PD-L1、PD-L2、PD-1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、GAL9、LAG3、TIM3、VISTA、KIR、2B4(属于CD2分子家族并且在所有NK、γδ和记忆CD8+(αβ)T细胞上表达)、CD160(也称为BY55)、CGEN-15049、CHK 1和CHK2激酶、A2aR和各种B-7家族配体。B7家族配体包括但不限于B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6和B7-H7。检查点抑制剂包括抗体或其抗原结合片段、其他结合蛋白、生物治疗剂或小分子，这些检查点抑制剂结合并阻断或抑制CTLA-4、PD-L1、PD-L2、PD-1、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD 160和CGEN-15049中一种或多种的活性。
细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)是一种免疫检查点分子，其下调T细胞激活的途径。CTLA-4是T细胞激活的负调节物。已显示CTLA-4的阻断增强了T细胞激活和增殖。单纯疱疹病毒和抗CTLA-4抗体的组合旨在通过两种不同机制增强T细胞激活，从而增强对肿瘤中病毒裂解性复制后释放的肿瘤抗原的抗肿瘤免疫应答。因此，单纯疱疹病毒和抗CTLA-4抗体的组合可以增强经注射和未注射/远端肿瘤的破坏，改善总体肿瘤应答以及延长总存活期，特别是总存活期与单独使用抗CTLA-4抗体所获得的总存活期相比延长。
程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)是在T细胞和pro-B细胞上表达的288个氨基酸细胞表面蛋白分子，并且在它们的命运/分化中起作用。PD-1的两个配体PD-L1和PD-L2是B7家族的成员。当对感染有炎性应答时PD-1限制周围组织中T细胞的活性，并且在体外限制自身免疫PD-1阻断增强了T细胞增殖和细胞因子产生，以应答于混合的淋巴细胞应答中特异性抗原靶标或同种异体细胞的攻击。PD-1表达与应答之间的强相关性显示为PD-1的阻断(Pardoll,Nature Reviews Cancer[自然癌症综述],12:252-264,2012)。PD-1阻断可以通过多种机制实现，包括结合PD-1或PD-L1的抗体。
程序性死亡配体1(PD-L1)也称为分化簇274(CD274)或B7同源物1(B7-H1)，该程序性死亡配体1是由CD274基因编码的蛋白质。参见，Entrez Gene:CD274 CD274分子。PD-L1是一种在抑制免疫系统中起作用的40kDa 1型跨膜蛋白，其与激活的T细胞、B细胞和骨髓细胞上的受体(PD-1)结合以调节细胞激活或抑制。参见Chemnitz等人,Journal of Immunology[免疫学杂志],173(2):945-54(2004)。
其他免疫检查点抑制剂包括淋巴细胞激活基因-3(LAG-3)抑制剂，如IMP321即可溶性Ig融合蛋白(Brignone等人,2007,J.Immunol.[免疫学杂志]179:4202-4211)。还包括B7抑制剂，如B7-H3和B7-H4抑制剂(例如，抗B7-H3抗体MGA271(Loo等人,2012,Clin.CancerRes.[临床癌症研究]7月15日(18)3834))。另一个检查点抑制剂是TIM3(T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3)(Fourcade等人,2010,J.Exp.Med.[实验医学杂志]207:2175-86和Sakuishi等人,2010,J.Exp.Med.[实验医学杂志]207:2187-94)。
如本文进一步所述，在一个方面，本发明涉及溶瘤病毒和检查点抑制剂的组合用于治疗癌症的用途。在另一方面，本发明涉及包含溶瘤病毒和检查点抑制剂的组合的药物组合物。
因此，在本发明的一个方面，检查点抑制剂是CTLA-4、PD-1、PD-L1或PD-L2的阻断剂或抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是CTLA-4的阻断剂或抑制剂，例如替西木单抗、伊匹单抗(也称为10D1、MDX-D010)、BMS-986249、AGEN-1884和抗CTLA-4抗体，如美国专利号：5,811,097；5,811,097；5,855,887；6,051,227；6,207,157；6,682,736；6,984,720；和7,605,238中所述，其每一篇均通过引用并入本文。在一些实施例中，检查点抑制剂是PD-L1或PD-1的阻断剂或抑制剂(例如，抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2抑制剂相互作用的分子)，例如包括派姆单抗(抗PD-1抗体)、纳武单抗(抗PD-1抗体)、CT-011(抗PD-1抗体)、CX-072(抗PD-L1抗体)、IO-103(抗PD-L1)、BGB-A333(抗PD-L1)、WBP-3155(抗PD-L1)、MDX-1105(抗PD-L1)、LY-3300054(抗PD-L1)、KN-035(抗PD-L1)、FAZ-053(抗PD-L1)、CK-301(抗PD-L1)、AK-106(抗PD-L1)、M-7824(抗PD-L1)、CA-170(抗PD-L1)、CS-1001(抗PD-L1抗体)；SHR-1316(抗PD-L1抗体)；BMS 936558(抗PD-1抗体)、BMS-936559(抗PD-1抗体)、阿特珠单抗(抗PD-L1抗体)、AMP 224(PD-L2的细胞外结构域和设计成阻断PD-L2/PD-1相互作用的IgGl抗体的融合蛋白)、MEDI4736(度伐单抗；抗PD-L1抗体)、MSB0010718C(抗PD-L1抗体)，以及美国专利号7,488,802、7,943,743、8,008,449、8,168,757、8,217,149和PCT公开专利申请号：W003042402、WO 2008156712、W0 2010089411、W0 2010036959、WO 2011066342、WO2011159877、WO 2011082400和WO 2011161699中所述的那些，其中每一篇均通过引用并入本文。另外的抗PD-1抗体包括PDR-001、SHR-1210、BGB-A317、BCD-100、JNJ-63723283、PF-06801591、BI-754091、JS-001、AGEN-2034、MGD-013、LZM-009、GLS-010、MGA-012、AK-103、杰诺单抗(genolimzumab)、dostarlimab、cemiplimab、IBI-308、坎利珠单抗、AMP-514、TSR-042、Sym-021、HX-008和ABBV-368。
BMS 936558是靶向PD-1的完全人IgG4单克隆抗体。在I期试验中，BMS-936558的两周一次向患有治疗难治性晚期恶性肿瘤的受试者施用显示出持久的部分或完全消退。在患有黑色素瘤(28％)和肾细胞癌(27％)的受试者中观察到最显著的应答率，但在患有非小细胞肺癌(NSCLC)的受试者中也观察到显著的临床活性，并且一些应答持续超过一年。
BMS 936559是靶向PD-1配体PD-L1的完全人IgG4单克隆抗体。I期结果显示此药物的两周一次施用导致持久的应答，尤其是在患有黑色素瘤的受试者中这样。根据患有晚期NSCLC、黑色素瘤、RCC或卵巢癌的受试者中的癌症类型，客观应答率的范围为6％至17％，其中一些受试者经历持续一年或更长时间的应答。
AMP 224是第二PD-1配体、PD-L2和IgGl的细胞外结构域的融合蛋白，其具有阻断PD-L2/PD-1相互作用的潜力。AMP-224目前作为单一疗法在患有晚期癌症的受试者中正在进行I期测试。
MEDI4736是一种抗PD-L1抗体，其在此剂量递增研究中已证明具有可接受的安全性特性和持久的临床活性。作为单一疗法和以组合的形式在多种癌症中的扩展和MEDI4736的开发正在进行中。
治疗疾病或障碍的方法
本发明还涉及用溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)治疗疾病或病症例如癌症的方法。本发明的溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)可用于治疗任何可注射的癌症(即，在有或没有指导的情况下(例如视觉或超声指导)，可以用例如针头注射的任何肿瘤)。在一些实施例中，癌症是B细胞淋巴瘤(例如，弥漫性大B细胞淋巴瘤)、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、基底细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、结肠直肠癌、黑色素瘤(例如，葡萄膜黑色素瘤)、头颈鳞状癌、肝细胞癌、胃癌、肉瘤(例如软组织肉瘤、尤文肉瘤、骨肉瘤或横纹肌肉瘤)、胃食管癌、肾细胞癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、皮肤T细胞淋巴瘤、默克尔细胞癌或多发性骨髓瘤。
术语“转移性癌症”是指已经从其开始的身体部位(即主要部位)扩散到身体的其他部位的癌症。当癌症扩散到新的区域(即转移)时，它仍以开始时的身体部位来命名。例如，已经扩散到胰腺的结肠癌被称为“胰腺的转移性结肠癌”，而不是胰腺癌。治疗也基于癌症起源的地方。如果结肠癌扩散到骨骼，它仍然是结肠癌，并且相关医生将推荐已被证明可对抗转移性结肠癌的治疗。
本发明还涉及溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)和其他药剂(例如，检查点抑制剂)的组合用于治疗诸如上述那些的癌症的用途。
本发明还涉及一种通过施用以下治疗疾病或障碍(如癌症)的方法：(i)治疗有效量的溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)；和(ii)治疗有效量的另一种药剂(例如，检查点抑制剂)。
在特定的实施例中，本发明涉及溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)和抗PD-1抗体的组合、溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)和抗PD-L1抗体的组合、或溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)和抗CTLA-4抗体的组合。在具体的实施例中，溶瘤病毒是HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12。
在许多情况下，癌症作为原发性肿瘤(即在肿瘤进展开始的解剖部位生长的肿瘤并且继续产生癌性肿块)和作为继发性肿瘤或转移瘤(即，肿瘤从其原发部位扩散到身体的其他部位)两种形式存在于患者中。本发明的溶瘤病毒可以经由裂解作用和全身免疫作用有效地治疗肿瘤。例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12物理地裂解肿瘤细胞，导致原发性肿瘤细胞死亡并释放肿瘤来源的抗原，这些抗原然后被免疫系统识别。此外，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12的复制会导致FLT3L和IL12的产生，这有助于(局部和全身)增加和维持抗肿瘤免疫应答，从而使免疫系统可以识别和攻击原发性和继发性肿瘤/转移。因此，本发明预期单独或与第二药剂(例如检查点抑制剂)组合使用溶瘤病毒(例如HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)治疗原发性肿瘤、转移瘤(即继发性肿瘤)或两者。
在一些实施例中，本文所述的治疗方法或用途包括与靶向癌症疗法例如MEK抑制剂如考比替尼、曲美替尼和贝美替尼的组合治疗。在其他实施例中，本文所述的治疗方法或用途包括用细胞因子例如聚乙二醇化IL2(例如，bempegaldesleukin)或聚乙二醇化IL10(例如，pegilodecakin)治疗。在又另一个实施例中，本文所述的治疗方法或用途包括用靶向疗法和免疫调节剂的组合进行治疗。
本发明的方法可以用于治疗几种不同分期的癌症。大多数分期系统包括与以下有关的信息：癌症是否已扩散到附近淋巴结、肿瘤在体内的位置、细胞类型(例如，鳞状细胞癌)、癌症是否已扩散到身体的不同部位、肿瘤的大小和肿瘤的等级(即，细胞异常的程度、肿瘤生长和扩散的可能性)。例如，0期是指存在尚未扩散到附近组织的异常细胞-即可能成为癌症的细胞。I期、II期和III期癌症是指癌症的存在。分期越高，癌症肿瘤越大，并且其扩散到附近组织中的越多。IV期癌症是已经扩散到身体远端部位的癌症。在一些实施例中，本发明的方法可以用于治疗转移性癌症。
药物组合物
本发明还涉及药物组合物，其包含溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)，或包含溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)和检查点抑制剂、靶向癌症疗法和/或其他免疫调节剂的组合。该药物组合物可以含有用于修饰、维持、或保持组合物的例如pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的配制品材料。药学活性剂可以通过各种途径给予至患者，包括例如口服或肠胃外，分别例如静脉内、肌肉内、皮下、眼内、囊内、腹膜内、直肠内、脑池内、瘤内、血管内、皮内或通过使用皮肤贴剂或透皮离子电渗疗法穿过皮肤的被动或促进式吸收。在一个实施例中，将溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)注射到肿瘤中(即，通过瘤内注射)。在另一个实施例中，将检查点抑制剂(例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或抗CTLA-4抗体)全身(例如静脉内)施用。在另一个实施例中，靶向疗法(例如MEK小分子激酶抑制剂，例如考比替尼、曲美替尼或贝美替尼)通过口服途径全身施用。在又另一个实施例中，将细胞因子例如聚乙二醇化IL2(例如，bempegaldesleukin)或聚乙二醇化IL10(例如，pegilodecakin)全身施用。
本领域普通技术人员将能够根据本披露的任何方面确定治疗的剂量和持续时间。例如，技术人员可以监测患者以确定是否应该开始、继续、中断或恢复治疗。对于特定患者的有效量可以根据因素(如正在治疗的病症、患者的总体健康状况以及施用的方法、途径和剂量)而变化。临床医生使用本领域已知的参数确定适当的剂量。治疗上待使用的药物组合物的有效量将取决于例如治疗背景和目的。本领域技术人员将理解，治疗的适当剂量水平将因此部分地根据递送的分子、使用结合剂分子的适应症、施用途径以及患者的体型(体重、体表面积或器官大小)和状况(年龄和一般健康状况)而变化。因此，临床医师可滴定剂量并修改施用途径以获得最佳治疗效应。
临床研究已表明，可以将溶瘤病毒直接注射至皮肤、皮下或淋巴结病变中，这些病变是可见的、可触知的；或者可以用超声引导进行注射。因此，在一方面，包含HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12的药物组合物通过病变内注射施用。在一些实施例中，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12以固定给药浓度以1mL单次使用小瓶提供：用于初始给药的106pfu/mL和用于后续给药的108pfu/mL。注射的体积可以根据肿瘤类型而变化。例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12可通过瘤内注射在第1周的第1天以高达4.0mL 106空斑形成单位/mL(PFU/mL)的剂量，接着在第4周的第1天以高达4.0mL 108PFU/mL的剂量，并且此后每2周(±3天)施用至可注射的皮肤、皮下和结节肿瘤中。在另一个实施例中，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12可通过瘤内注射在第1周的第1天以高达4.0mL 106空斑形成单位/mL(PFU/mL)的剂量，接着在第4周的第1天以4.0mL 107PFU/mL的剂量，并且此后每2周(±3天)施用至可注射的皮肤、皮下和结节肿瘤中。
本发明的组合物可以包含一种或多种另外的组分，包括生理学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。例如，组合物可以包含缓冲液、抗氧化剂(如抗坏血酸)、低分子量多肽(例如，具有少于10个氨基酸)、蛋白质、氨基酸、碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖或糊精)、螯合剂(如EDTA)、谷胱甘肽、稳定剂和赋形剂中的一种或多种。可接受的稀释剂包括例如中性缓冲盐水或与特定血清白蛋白混合的盐水。还可以添加防腐剂如苯甲醇。可以使用合适的赋形剂溶液(例如，蔗糖)作为稀释剂将该组合物配制成冻干物。
在某些实施例中，将检查点抑制剂以0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.5mg/kg、0.7mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg或其任何组合剂量施用。在某些实施例中，将检查点抑制剂每周一次、每周两次、每周三次、每两周一次或每月一次施用。在某些实施例中，检查点抑制剂以单个剂量、两个剂量、三个剂量、四个剂量、五个剂量或6个或更多个剂量施用。
在某些实施例中，将抗PD-1抗体通过注射(例如，皮下或静脉内)以约1至30mg/kg，例如约5至25mg/kg、约10至20mg/kg、约1至5mg/kg或约3mg/kg的剂量施用。给药方案可以在例如每周一次与每2、3或4周一次之间变化。在一个实施例中，将抗PD-1抗体以约10至20mg/kg的剂量每隔一周施用。
在一个实施例中，将抗PD-1抗体分子(例如，纳武单抗)以约1mg/kg至3mg/kg(例如约1mg/kg、2mg/kg或3mg/kg)的剂量每两周静脉内施用。在一个实施例中，将抗PD-1抗体分子(例如，纳武单抗)以约2mg/kg的剂量按3周间隔静脉内施用。在一个实施例中，将纳武单抗以约1mg/kg至5mg/kg(例如，3mg/kg)的量约每周一次至每2、3或4周一次施用，并且可以在60分钟的时间段内施用。
在一个实施例中，将抗PD-1抗体分子(例如，派姆单抗)以约1mg/kg至3mg/kg(例如约1mg/kg、2mg/kg或3mg/kg)的剂量每三周静脉内施用。在一个实施例中，将抗PD-1抗体分子(例如，派姆单抗)以约2mg/kg的剂量按3周间隔静脉内施用。在另一个实施例中，将抗PD-1抗体分子(例如，派姆单抗)以约100mg/kg至300mg/kg(例如约100mg/kg、200mg/kg或300mg/kg)的剂量每三周静脉内施用。在一个实施例中，将抗PD-1抗体分子(例如，派姆单抗)以约200mg/kg的剂量按3周间隔静脉内施用。
在某些实施例中，将抗CTLA-4抗体(例如，伊匹单抗)通过注射(例如，皮下或静脉内)以如下剂量施用：约3mg/kg IV Q3W，最大4个剂量；约3mg/kg IV Q6W，最大4个剂量；约3mg/kg IV Q12W，最大4个剂量；约10mg/kg IV Q3W，最大4个剂量；或约10mg/kg IV Q12W，最大4个剂量。在某些实施例中，将抗CTLA-4抗体(例如，替西木单抗)通过注射(例如，皮下或静脉内)以约10mg/kg Q4W；或约15mg/kg每3周的剂量施用。
在某些实施例中，将抗PD-L1抗体(例如，阿特珠单抗)通过注射(例如，皮下或静脉内)以约1200mg IV Q3W的剂量施用，直至疾病进展或不可接受的毒性。
因此，在一个实施例中，本发明涉及一种用于治疗任何可注射的癌症的方法的药物组合物。在一些实施例中，癌症是B细胞淋巴瘤(例如，弥漫性大B细胞淋巴瘤)、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、基底细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、结肠直肠癌、黑色素瘤(例如，葡萄膜黑色素瘤)、头颈鳞状癌、肝细胞癌、胃癌、肉瘤(例如软组织肉瘤、尤文肉瘤、骨肉瘤或横纹肌肉瘤)、胃食管癌、肾细胞癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、皮肤T细胞淋巴瘤、默克尔细胞癌或多发性骨髓瘤，其中药物组合物包含溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)、或溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)和第二药剂(例如，检查点抑制剂)。
在其他实施例中，本发明涉及治疗有效量的溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)，其用于治疗B细胞淋巴瘤(例如，弥漫性大B细胞淋巴瘤)、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、基底细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、结肠直肠癌、黑色素瘤(例如，葡萄膜黑色素瘤)、头颈鳞状癌、肝细胞癌、胃癌、肉瘤(例如软组织肉瘤、尤文肉瘤、骨肉瘤或横纹肌肉瘤)、胃食管癌、肾细胞癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、皮肤T细胞淋巴瘤、默克尔细胞癌或多发性骨髓瘤。在又其他实施例中，本发明涉及治疗有效量的溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)和第二药剂(例如，检查点抑制剂)，其用于治疗B细胞淋巴瘤(例如，弥漫性大B细胞淋巴瘤)、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、基底细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、结肠直肠癌、黑色素瘤(例如，葡萄膜黑色素瘤)、头颈鳞状癌、肝细胞癌、胃癌、肉瘤(例如软组织肉瘤、尤文肉瘤、骨肉瘤或横纹肌肉瘤)、胃食管癌、肾细胞癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、皮肤T细胞淋巴瘤、默克尔细胞癌或多发性骨髓瘤。
试剂盒
在另一方面，本发明涉及试剂盒，其包含[1]溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)，该溶瘤病毒任选地与第二药剂(例如，检查点抑制剂)组合；和[2]向患者施用的说明书。例如，本发明的试剂盒可以包含溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)以及用于治疗患有癌症的患者的说明书(例如，在包装插页或标签中)。在一些实施例中，该癌症是转移性癌症。在另一个实施例中，本发明的试剂盒可以包含溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)、检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或抗CTLA-4抗体)和用于治疗患有癌症的患者的说明书(例如，在包装插页或标签中)。
在一些实施例中，第二药剂是靶向癌症疗法(例如，MEK抑制剂如考比替尼、曲美替尼和贝美替尼)或细胞因子(例如，聚乙二醇化IL2(例如，bempegaldesleukin)或聚乙二醇化IL10(例如，pegilodecakin))。
在一些实施例中，包含HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12的试剂盒包含通过瘤内注射在第1周的第1天以高达4.0ml的106PFU/mL的剂量，接着在第4周的第1天以高达4.0ml的108PFU/mL的剂量，并且此后每2周施用(例如，直至完全应答)的说明书(例如，在包装插页或标签中)。在一些实施例中，包含HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12的试剂盒包含通过瘤内注射在第1周的第1天以高达4.0ml的106PFU/mL的剂量，接着在第4周的第1天以高达4.0ml的107PFU/mL的剂量，并且此后每2周施用(例如，直至完全应答)的说明书(例如，在包装插页或标签中)。
在试剂盒包含抗PD-1抗体的实施例中，该试剂盒包含以本文所述剂量进行静脉内施用的说明书(例如，在包装插页或标签中)。抗PD-1抗体的实例包括派姆单抗和纳武单抗。
在试剂盒包含抗PD-L1抗体的实施例中，该试剂盒包含以本文所述剂量进行静脉内施用的说明书(例如，在包装插页或标签中)。抗PD-L1抗体的实例包括阿特珠单抗。
在试剂盒包含抗CTLA-4抗体的实施例中，该试剂盒包含以本文所述剂量进行静脉内施用的说明书(例如，在包装插页或标签中)。抗CTLA-4抗体的实例包括伊匹单抗。
在另一个实施例中提供了制造本发明的试剂盒的方法。
实例
提供以下实例是为了说明本发明的具体实施例或特征，而不是为了限制其范围。
实例1：以5'位置具有p40亚基和3'位置具有p35亚基并通过单个G4S接头连接的单链蛋白生产的白介素-12(IL12)在体外和体内均具有活性
利用特定工程化标准的工程化单链IL12分子可导致细胞因子的最佳表达和活性。
通过分析IL12(PDB ID 3HMX)的晶体结构来评估IL12的p40和p35亚基的最佳构型。由于亚基接近组件，因此单链蛋白预期具有更高程度的异源二聚化效率。由于C和N末端连接点的接近性，因此p40-p35取向(图1A；虚线)在结构上优于p35-p40取向。这将导致跨越约36埃缺口的接头(将p40的羧基末端连接到p35的氨基起始末端)。相比之下，p35-p40肽的产生导致约60埃的缺口，这需要更长的接头并不太有利。
为了建模p40与p35亚基之间的接头，使用在RosettaScripts中具有
Figure BDA0003210744360000231
坐标约束的FastRelax制备IL12(PDB 3HMX)的晶体结构的p40和p35亚基(S.J.Fleishman,A.Leaver-Fay,J.E.Corn,E.-M.Strauch,S.D.Khare,N.Koga,J.Ashworth,P.Murphy,F.Richter,G.Lemmon,J.Meiler和D.Baker.RosettaScripts:A Scripting LanguageInterface to the Rosetta Macromolecular Modeling Suite.[RosettaScripts：Rosetta大分子建模套件的脚本语言界面]PLoS ONE.[公共科学图书馆·综合]2011,6,6,e20161)。将生成的PDB文件连接到具有取向p40-p35的单链中，然后使用Rosetta Remodel在两个结构域之间建模以下接头：先前已描述的基于弹性蛋白的接头(VPGVGVPGVGGS)、G4S(图1B)、2x(G4S)(图1C)、3x(G4S)和无接头。未解析的p40的C末端残基(S340)和成熟p35的前11个残基(RNLPVATPDPG)包含在Remodel运行中。还运行了缺少未解析残基的对照。预期需要接头，因为当并入了接头时，使用Rosetta回路建模仿真计算出的环闭合率将显著提高。对于每个接头，使用来自环片段的片段插入进行采样并使用基于CCD的逆运动学进行环闭合来运行2880次Remodel轨迹。使用Remodel权重集对模型评分，并将具有成功环闭合(链断裂评分<0.07)的模型作为PDB文件输出。通过评估满足环闭合标准的轨迹百分比来确定环闭合率。对于每个接头，通过在RosettaScripts中使用RMSD Mover在不叠加下将每个模型的RMSD绘制到最低评分模型以测量构象收敛性。通过每个残基的Rosetta能量单位(REU)以及通过接头残基的主链评分项，评估了每个接头的前十个模型(表1)。在MOE中确定了具有Ramachandran异常值的模型(化学计算集团(Chemical Computing Group,Inc.))。
在没有接头的情况下或在截短的未解析的p40和p35末端下的Remodel运行的环闭合率<10％，这表明需要接头来将p40和p35亚基连接成单链。相比之下，具有接头的Remodel运行对于所有四个接头序列均具有成功的环闭合率。在没有主链应变或Ramachandran异常值的情况下，对于所有四个接头的最高得分模型的得分都很高。更长的弹性蛋白和3x(G4S)接头可能比G4S和2x(G4S)接头更具构象柔性，因为前者的模型与后者的模型相比，RMSD与得分最高模型的差异更大。Rosetta Remodel用于识别p40-接头-p35有效载荷的接头。G4S连接的和2xG4S连接的构建体的最高评分模型表明，两个接头都是合适的，基于弹性蛋白的接头也是合适的(图2)。
环闭合率总结在下表1中。
表1：针对IL12p35和IL12p40链的融合评估的接头的环闭合率。
Figure BDA0003210744360000241
为了通过计算机建模证实单链IL12的功能，将各种形式的单链IL12构建体克隆到pΔ34.5(XS)载体中(参见构建体图示，图3A)，pΔ34.5(XS)载体是在CMV启动子与BGH poly(A)尾部之间插入构建体的基于pcDNA3.1的载体。HSV-1反向重复序列位于CMV启动子和BGHpoly(A)尾部侧翼，促进单链IL12构建体、CMV和BGH poly(A)尾部重组到HSV-1病毒中。pΔ34.5(XS)载体通过限制性酶Hind III和Xho I线性化，这两种酶分别位于CMV启动子之后和BGH poly(A)尾部之前。对编码单链IL12构建体的重叠DNA片段进行排序，并使用吉布森组装法将其克隆到线性化pΔ34.5(XS)载体中。通过DNA测序证实了单链IL12构建体的真实性。这些构建体用于体外转染HEK 293细胞并比较IL12蛋白产生。在Optimem培养基中，用含8μl lipofectamine 2000的4μg DNA转染细胞，并在5％CO2下于37℃孵育48小时。除去上清液，并使用Biolegend公司人IL12p70 ELISA测定法定量IL12表达。肽链的位置显著改变了表达。含有p35-弹性蛋白-p40的构建体未产生可检测水平的IL12，而含有p40-弹性蛋白-p35的构建体产生了IL12(图3B)。
在天然形式中，IL12产生为两条独立链，两者均包含蛋白质分泌所需的信号肽。在修饰版本中，评估了第二信号肽的必要性。将包含位于融合物的5'端的单个信号肽的构建体[IL12(p40-弹性蛋白-No SP-p35)]与编码p35和p40亚基中信号肽的构建体[IL12(p40-弹性蛋白-p35)]进行了比较。第二信号肽的去除增加了由于转染产生的IL12的总产量(图3B)。最后，将具有弹性蛋白接头的IL12表达与单个G4S接头进行了比较(图3B)。基于这些观察，选择掺入了具有从p35亚基中去除的信号肽的p40-G4S接头-p35的单链IL12盒，以包含在工程化病毒中。
实例2：通过添加P2A接头同时表达生物活性FLT3L和IL12。
这些实验涉及使用猪捷申2A序列在单一启动子的控制下以双顺反子形式生产生物活性FLT3L和IL12的工程化技术。
从病毒表达多种合理选择的蛋白应增强病毒引发抗肿瘤应答的免疫刺激能力。选择FLT3L和IL12作为免疫刺激细胞因子。单个启动子(CMV启动子)用于产生两种细胞因子。这种方法的好处是可以在同一感染细胞中以相同的速率并同时产生两种细胞因子。我们选择了两种方法从单个启动子表达多种蛋白质：内部核糖体进入位点(IRES)和2A序列。设计并入FLT3L-IRES-IL12、IL12-IRES-FLT3L或FLT3L-P2A-IL12的DNA构建体。如前所述，在体外测试了DNA构建体(图4A)。将DNA构建体转染到293T细胞中，并通过ELISA测试上清液(Biolegend IL12p70测定用于IL12和Thermo FLT3L测定用于FLT3L)。
在任一取向上(FLT3L作为第一基因，IL12作为第二基因，或IL12作为第一基因，FLT3L作为第二基因)，使用IRES时，第二基因的产生降低(图4B和4C)。因此，选择P2A序列作为功能性单元，以从单个启动子产生两种蛋白质。
在使用备用有效载荷(GMCSF)的单独实验中，评估了共有KOZAK序列的效果。已知KOZAK序列可增强哺乳动物翻译，并预期改善完整盒的翻译。与此相一致，通过在翻译起始位点上游并入KOZAK序列显著增加5'蛋白(GMCSF)的表达，而与P2A或IRES使用无关(图5；(在KOZAK存在下的平均ng/ML＝660.9)；在KOZAK不存在下的平均ng/mL＝102.5))。
添加P2A位点的潜在结果是，其会将几个氨基酸附加到FLT3L蛋白的末端。P2A是导致在大多数哺乳动物细胞中产生两条不同的多肽链的序列，但是产生的第一肽包括添加氨基酸序列GSGATNFSLLKQAGDVEENPG。进行了计算机建模，以确定在FLT3L的羧基末端添加氨基酸是否会影响与其受体FLT3的相互作用。使用PyMOL v.1.8.6.0以评估Flt3L/Flt3复合物的结构，以在双有效载荷载体有效载荷1-P2A-有效载荷2盒中选择构建体取向。P2A产生与有效载荷1的C末端融合的18个氨基酸的肽。Flt3L/Flt3的结构揭示了Flt3L的C末端被暴露出并位于受体结合位点和Flt3L二聚化界面的远端。因此，Flt3L可能会容忍P2A标签，因此被选作P2A序列上游的有效载荷(图6)。然而，对FLT3L和IL12的生物活性加以证明以验证活性。
对于IL12，将先前描述并用于ELISA测定以定量总IL12表达的上清液用于IL12细胞报告基因测定中。使用HEK-Blue IL12细胞(Invivogen#hkb-il12)测量IL12的生物活性。具有生物活性的IL12通过HEK-Blue IL12细胞系诱导分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的剂量依赖性产生，并且可以使用显色剂QUANTI-Blue(Invivogen#rep-qb1)评估SEAP的水平。将DNA转染的293T细胞的上清液以三倍系列稀释的方式一式两份与HEK-Blue IL12细胞一起直接添加到96孔平板中，并在5％CO2中于37℃孵育过夜。第二天，根据制造商的说明新鲜制备QUANTI-Blue试剂，预热至37℃，持续15分钟，并且与20μL过夜细胞培养上清液在37℃孵育1小时。通过使用BioTek Synergy Neo2酶标仪(BioTek；Gen5软件v3.04)测量620-630nm处的吸光度来检测SEAP水平。上清液在IL12报告基因测定中显示出的活性与从商业供应商处购买的重组人IL12蛋白相当(R&D#219-IL-005；图7)。
对于FLT3L，还在BaF3细胞增殖测定中测试了上清液，该测定已在文献中描述为FLT3L敏感细胞系。将BaF3细胞以30,000个细胞/孔在24孔板中在RPMI+10％FBS+遗传霉素中于37℃接种过夜。将用含有工程化有效载荷或重组人FLT3L的DNA构建体转染的细胞的上清液添加到细胞中，将所有孔的总体积调整为500uL，然后在5％CO2中于37℃孵育14天。在第14天，通过移液将BaF3细胞轻轻重悬，并从每个孔中取出样品以使用Vi-CELL XR细胞活力分析仪(Beckman Coulter)进行细胞计数。从由Vi-CELL XR提供的活细胞浓度计算孔中的活细胞总数。包含人重组FLT3L作为对照，来自转染的293T细胞的上清液显示出对细胞增殖的相当的作用(图8)。
基于这些观察，通过上述工程化技术，将待重组到HSV1基因组中的最终构建体选择为人FLT3L-P2A-huIL12(p40-G4S-p35)。
实例3：HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12病毒的生成
HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12如下生成。
病毒基因组的描述：
HSV-1源自保藏于欧洲细胞培养物保藏中心(ECAAC)，保藏号为01010209的毒株JS1。在HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12中，如前所述，编码ICP34.5和ICP47的HSV-1病毒基因已功能性缺失。参见，Liu等人,Gene Ther.[基因疗法],10:292-303,2003；美国专利号7,223,593以及美国专利号7,537,924。在HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12中，ICP34.5和ICP47编码基因的功能性缺失与US11的早期表达相结合，可改善肿瘤复制，同时维持安全性。将人FLT3L和IL12的编码序列在HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12的ICP34.5基因的两个前位点处插入病毒基因组中(图9)。人FLT3L和IL12表达盒几乎替代了所有ICP34.5基因，从而确保HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12与野生型病毒之间的任何潜在重组事件只会导致有缺陷的非致病性病毒，不会导致携带人FLT3L和IL12基因的野生型病毒的产生。HSV胸苷激酶(TK)基因在HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12中保持完整，这使病毒对诸如阿昔洛韦的抗病毒剂敏感。因此，如有必要，阿昔洛韦可用于阻断HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12复制。
pΔ34.5转移质粒的创建：
如前所述，包含人FLT3L和IL12表达盒的转移质粒由修饰的SP72载体(普洛麦格公司(Promega))创建(参见Liu等人,Gene Ther.[基因疗法],10:292-303,2003；美国专利号7,223,593和美国专利号7,537,924)。该质粒包含HSV-1 17syn+的修饰的Sau3AI片段(核苷酸123462-126790，其去除了编码大部分ICP34.5(核苷酸124948-125713)的NotI片段)。将含有CMV-KOZAK-FLT3L-P2A-IL12-BGHPolyA的表达盒在原始Not1位点附近插入质粒中。该插入导致表达盒侧翼为被Sau3AI片段切除的HSV-1 17syn+区域(图9)。
将治疗基因插入HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12：
通过同源重组过程将基因插入病毒基因组。用pΔ34.5转移质粒转染Vero细胞。然后将转染细胞用HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/GFP(JS1毒株)感染。该病毒在插入CMV-FLT3L-P2A-IL12-BGHPolyA表达盒的基因组的ICP34.5编码区域中包含GFP。继续进行转染-感染反应，直至观察到完全的CPE(细胞病变效应)。将来自转染-感染反应的细胞和上清液稀释，并用于感染96孔板中的Vero细胞。2天后，通过ELISA评估上清液以鉴定含有表达IL12和FLT3L的病毒粒子的孔。收集来自IL12和FLT3L阳性孔的细胞和上清液，并在菌斑测定中与Vero细胞一起接种。2天后，通过GFP标记基因的损失鉴定重组病毒。GFP标记基因的损失表明ICP34.5位点处的GFP被[CMV]-[Kozak]-[Flt3L]-[P2A]-[IL12]-[BGHpA]表达盒替换(图9)。在荧光显微镜下鉴定非GFP菌斑，并使用无菌移液管尖端将其转移至装有新鲜生长培养基的微量离心管中。通过冻融将病毒从细胞中释放出，并将病毒接种到新细胞上。每2到3天重复一次此过程，直到获得同质群体(即，没有菌斑呈现绿色)。通过PCR和测序验证了CMV-FLT3L-P2A-IL12-BGHPolyA表达盒的插入。
实例4：HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12病毒能够在体外感染，在其中复制并杀死肿瘤细胞系并产生具有生物活性的FLT3L和IL12。
评价了重组病毒维持细胞感染、复制和裂解同时产生具有生物活性的FLT3L和IL12的能力。
为了证实工程化病毒能够在人细胞内复制，感染了两种人细胞系，并定量感染后病毒的总量。将100万个A375或VERO细胞接种在6孔培养皿中，并在37℃下在5％CO2中在含5％FBS的DMEM中孵育过夜。用HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12病毒以0.1的MOI一式三份感染细胞，然后返回到培养箱。感染后48小时，收集细胞和上清液，并通过在Vero细胞上进行菌斑测定来评估病毒滴度。评估了工程化HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12病毒和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/GMCSF病毒(图10)。
为了证实引入病毒的修饰不影响病毒感染和裂解细胞的能力，进行了体外杀伤试验。将小鼠(CT26)和人(HT-29、SK-MEL-5、FADU和BxPC3)来源的多种细胞系与多种感染复数(MOI)的病毒颗粒一起培养(图11A-E)。结果在下面讨论。
小鼠结肠直肠癌(CT26)
将CT26细胞以每孔6,000个细胞接种在96孔板中，并在37℃下孵育过夜。从100MOI开始将HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/GMCSF进行系列稀释(4倍，10孔)。孵育72小时后，使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定(普洛麦格公司，麦迪逊，威斯康星州(Promega,Madison,WI))对每个孔中剩余的细胞数量进行定量。
人癌细胞系(HT-29、SK-MEL-5、FADU和BxPC-3)
将各种人实体瘤细胞系(结直肠癌、黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌和胰腺癌)以每孔7,000-10,000个细胞接种在96孔板中，并在37℃下孵育过夜。从100MOI开始将HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/GMCSF进行系列稀释(4倍，10孔)。孵育72小时后，在SpectraMax M5酶标仪(分子设备有限公司(Molecular DevicesCorporation))上使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定(普洛麦格公司#G7571，麦迪逊，威斯康星州)对每个孔中剩余的细胞数量进行定量。
HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12对于所有测试的癌细胞系均是有效的。所有测试的细胞系的MOI IC50值均低于1。图11显示了通过增加五个细胞系中每一个的HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12的浓度达到的细胞生长抑制程度，以及MOI IC50值。这些结果表明，用HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12治疗结直肠癌、黑色素瘤、头颈癌和胰腺癌细胞系会强烈抑制肿瘤细胞生长，其MOI IC50值与HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/GMCSF类似。
评估了由于HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12感染而导致具有生物活性的FLT3L和IL12的体外产生。使用来自病毒感染细胞的上清液重复ELISA表达、IL12报告基因测定和FLT3L细胞增殖测定。如先前所述，筛选来自用于确认复制的A375和VERO细胞的上清液。IL12p70 ELISA证实了所有测试细胞系(VERO、A375和SK-MEL-5)的IL12的表达(图12A)。另外，FLT3L ELISA证明了所有测试细胞系的FLT3L的表达(图12B)。使用先前描述的IL12报告基因测定和BaF3细胞系增殖测定证明了IL12的生物活性。病毒感染的细胞上清液在SK-MEL-5(图13A)和A375细胞(图13B)中均表现出呈剂量依赖性方式的活性IL12。使用用来自SK-MEL-5(图14A)或A375(图14B)细胞系的上清液刺激的BaF3细胞系证明了FLT3L生物活性。
在所有检测的情况下，来自病毒感染细胞的上清液均含有具有生物活性的IL12和FLT3L，如基于工程化规格所预期的。
实例5：HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12病毒在治疗携带B细胞淋巴瘤的动物(A20细胞系)时能够在体内产生具有生物活性的FLT3L和IL12
评估了由HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12编码的双细胞因子有效载荷在小鼠A20肿瘤模型中的表达。
在第0天，将A20肿瘤细胞(2x106个细胞)皮下注射到雌性Balb/c小鼠的右侧腹中。使用电子卡尺每周两次(Q2W)测量肿瘤体积(mm3)。一旦肿瘤达到平均约230mm3，将动物随机分成5组(每组4只小鼠)，使得在治疗施用开始时平均肿瘤体积和肿瘤体积的可变性在治疗组之间是一致的。小鼠接受HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12、HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF、HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L或HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mIL12的单次瘤内注射(每种以1x 106PFU/剂量)，然后在16小时后收集肿瘤和血浆。使用MSD测定(mGM-CSF和mIL12(SEQ ID NO:15中显示的mIL-12核酸；SEQ ID NO:16中显示的mIL-12氨基酸))或R&D Quantikine ELISA(mFLT3L)测量每个治疗组的肿瘤裂解物和血浆中的mGM-CSF、mFLT3L和mIL12水平。
结果(图15)表明，在16小时时，单次瘤内剂量的HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12导致mFLT3L和mIL12均在A20肿瘤裂解物和血浆中的表达。
实例6：HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12病毒在治疗携带黑色素瘤的动物(B16F10细胞系)时在体内产生具有生物活性的FLT3L和IL12
评估了由HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12编码的双细胞因子有效载荷在小鼠B16F10-mNectin1肿瘤模型中的表达。
在第0天，将B16F10-mNectin1肿瘤细胞(3x105个细胞)皮下注射到雌性C57Bl/6小鼠的右侧腹中。使用电子卡尺每周两次(Q2W)测量肿瘤体积(mm3)。一旦肿瘤达到平均约210mm3，将动物随机分成5组(每组4只小鼠)，使得在治疗施用开始时平均肿瘤体积和肿瘤体积的可变性在治疗组之间是一致的。小鼠接受HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12、HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF、HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L或HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mIL12的单次瘤内注射(每种以5x106PFU/剂量)，然后在16小时后收集肿瘤和血浆。使用MSD测定(mGM-CSF和mIL12)或R&D Quantikine ELISA(mFLT3L)测量每个治疗组的肿瘤裂解物和血浆中的mGM-CSF、mFLT3L和mIL12水平。
结果(图16)表明，在16小时时，单次瘤内剂量的HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12导致mFLT3L和mIL12均在A20肿瘤裂解物和血浆中的表达。
实例7：HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12病毒在体内瘤内注射后引起全身性抗肿瘤免疫应答
评估了通过用HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12进行治疗引起的全身性抗肿瘤T细胞应答。
在第0天，将A20肿瘤细胞(2x106个细胞)皮下注射到雌性Balb/c小鼠的右侧腹和左侧腹中。使用电子卡尺每周两次(Q2W)测量肿瘤体积(mm3)。一旦肿瘤达到平均约100mm3(第11天)，将动物随机分成3组(每组12只小鼠)，使得在治疗施用开始时平均肿瘤体积(在两侧腹中)和肿瘤体积的可变性在治疗组之间是一致的。在研究的第11、14和17天，将HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF(3x104PFU/剂量)或配制品缓冲液对照通过瘤内施用(在动物的右侧)。对侧肿瘤(在动物的左侧)未接受注射。该研究在第21天终止，并收集脾脏。从单个脾脏中分离脾细胞，并将其用于全细胞ELISpot测定(CTL，谢克海茨，俄亥俄州)中，以测量与A20肿瘤细胞混合时分泌mIFN-γ的T细胞的数量。简而言之，将7.5×104个脾细胞与1.5×104个A20肿瘤细胞混合，并在37℃下孵育20小时。使用CTLS6荧光斑点分析仪(CTL，谢克海茨，俄亥俄州)读取测定值并列举IFN-γ+斑点。
结果(图17A)表明，与HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF治疗相比，用HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12治疗导致全身性抗A20肿瘤活性明显提高(分别为后者每7.5x104个脾细胞427个斑点，相对于前者的152个斑点；p＝0.0008)。除了整个肿瘤细胞外，使用与A20细胞系相关的鉴定的病毒抗原AH1(图17B)和在A20细胞系中鉴定的新抗原突变UV Rag(图17C)进行EliSpot。
实例8：HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12在同系小鼠B细胞淋巴瘤肿瘤模型(A20细胞)中引发抗肿瘤功效
该研究旨在评估HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF在对侧小鼠A20肿瘤模型中的耐受性和抗肿瘤活性。
在第0天，将A20肿瘤细胞(2x106个细胞)皮下注射到雌性Balb/c小鼠的右侧腹和左侧腹中。使用电子卡尺每周两次(Q2W)测量肿瘤体积(mm3)。一旦肿瘤体积达到平均约100mm3，将动物随机分成6组(每组10只小鼠)，使得在治疗施用开始时平均肿瘤体积(在两侧腹中)和肿瘤体积的可变性在治疗组之间是一致的。将HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF(3x104PFU/剂量)或配制品缓冲液对照通过瘤内施用(在动物的右侧)，每三天一次，总共三次注射。对侧肿瘤(在动物的左侧)未接受注射。每周2次测量临床体征、体重变化和存活期(当肿瘤达到800mm3时从研究中移除小鼠)直至研究终止。
所有动物在实验中均存活，并且未显示出与处理相关的不良健康影响的证据，如体重所证明的，并且在日常健康监测检查中未发现值得注意的不良临床体征。
在HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF处理组中，在处理(右侧)和未处理(左侧)肿瘤中均观察到以剂量依赖性形式的肿瘤生长抑制(图18)。但是，与用HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF处理的那些相比，在HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12处理的动物中，在处理的肿瘤(10/10对7/10)和对侧肿瘤(5/10对2/10)中的完全应答率增加。与HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF相比，HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12处理组的中位存活期显著增加(分别为32天和53天；p＝0.048)。
这些数据表明，HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12治疗可提高对侧肿瘤清除率并改善总体存活期。
实例9：评估HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF在小鼠神经母细胞瘤(Neuro2A)肿瘤模型中的功效的研究
该研究旨在评估HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF在对侧小鼠Neuro2A肿瘤模型中的耐受性和抗肿瘤活性
在第0天，将Neuro2A肿瘤细胞(1x106个细胞)皮下注射到雌性Balb/c小鼠的右侧腹和左侧腹中。使用电子卡尺每周两次(Q2W)测量肿瘤体积(mm3)。一旦肿瘤体积达到平均约100mm3，将动物随机分组(每组10只小鼠)，使得在治疗施用开始时平均肿瘤体积(在两侧腹中)和肿瘤体积的可变性在治疗组之间是一致的。将HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF(5x105或5x104PFU/剂量)或配制品缓冲液对照通过瘤内施用(在动物的右侧)，每三天一次，总共三次注射。未注射的肿瘤(对侧；在动物的左侧)未接受注射。每周2次测量临床体征、体重变化和存活期(当肿瘤达到800mm3时从研究中移除小鼠)直至研究终止。
所有动物在实验中均存活，并且未显示出与处理相关的不良健康影响的证据，如体重所证明的，并且在日常健康监测检查中未发现值得注意的不良临床体征。
在5e5 PFU/剂量下，与对照处理动物相比，HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12处理组和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF处理组具有统计学显著性。在5e4 PFU/剂量下，与HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF相比，HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12处理组的总体存活期增加(虽然两组的中位存活期均为20天；p＝0.0056)。
这些数据表明，HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12治疗可提高对侧肿瘤清除率并改善总体存活期。
实例10：评估HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF在小鼠神经母细胞瘤(CT26)肿瘤模型中的功效的研究
该研究旨在评估HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF在对侧小鼠CT26(也称为结肠26)肿瘤模型中的耐受性和抗肿瘤活性。
在第0天，将CT26肿瘤细胞(3x105个细胞)皮下注射到雌性Balb/c小鼠的右侧腹和左侧腹中。使用电子卡尺每周两次(Q2W)测量肿瘤体积(mm3)。一旦肿瘤体积达到平均约100mm3，将动物随机分组(每组10只小鼠)，使得在治疗施用开始时平均肿瘤体积(在两侧腹中)和肿瘤体积的可变性在治疗组之间是一致的。将HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12、HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF(5x106PFU/剂量)或配制品缓冲液对照通过瘤内施用(在动物的右侧)，每三天一次，总共三次注射。未注射的肿瘤(对侧；在动物的左侧)未接受注射。每周2次测量临床体征、体重变化和存活期(当肿瘤达到800mm3时从研究中移除小鼠)直至研究终止。
所有动物在实验中均存活，并且未显示出与处理相关的不良健康影响的证据，如体重所证明的，并且在日常健康监测检查中未发现值得注意的不良临床体征。
在5x106PFU/剂量下，与对照处理动物相比，HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12处理组和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF处理组的存活期明显增加(对照相对于HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF；p＝0.0017以及对照相对于HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12；p＝0.0008)。此外，与HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF相比，HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12处理组的总体存活期增加(HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12的中位存活期未定义，相比于HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF为27天；p＝0.0059)。参见图20。
这些数据表明，与对照治疗或HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF治疗相比，HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12治疗可提高对侧肿瘤清除率并改善总体存活期。
实例11：评估HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12结合检查点阻断(抗PD1mAb)在小鼠结直肠(MC38)肿瘤模型中的功效的研究
该研究旨在评估单独或结合抗程序性细胞死亡蛋白1(PD1)单克隆抗体(mAb)的HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12在对侧小鼠MC38肿瘤模型中的耐受性和抗肿瘤活性。
在第0天，将MC38肿瘤细胞(3x105个细胞)皮下注射到雌性C57BL/6小鼠的右侧腹和左侧腹中。使用电子卡尺每周两次(Q2W)测量肿瘤体积(mm3)。一旦肿瘤体积达到平均约100mm3，将动物随机分组(每组10只小鼠)，使得在治疗施用开始时平均肿瘤体积(在两侧腹中)和肿瘤体积的可变性在治疗组之间是一致的。将HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12(5x106PFU/剂量)或配制品缓冲液对照通过瘤内施用(在动物的右侧)，每三天一次，总共三次注射。未注射的肿瘤(对侧；在动物的左侧)未接受注射。将抗PD1单克隆抗体(200μg/剂量)通过腹膜内注射按相同的时间表施用(每三天一次，总共三次注射)。每周2次测量临床体征、体重变化和存活期(当肿瘤达到800mm3时从研究中移除小鼠)直至研究终止。
所有动物在实验中均存活，并且未显示出与处理相关的不良健康影响的证据，如体重所证明的，并且在日常健康监测检查中未发现值得注意的不良临床体征。
与对照处理的动物相比，两种单一处理(单独的抗PD1 mAb和单独5x106PFU HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12)表现出存活期显著增加(每次比较分别p<0.0001)。与单独的5x106 PFU HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12相比，单独的抗PD1 mAb处理的动物的存活期不具有统计学显著性(p＝0.246)。与所有其他治疗组相比，两种治疗的组合(抗PD1 mAb加5x106PFU HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12)显示出存活期明显增加(与单独的5x106PFU HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12相比，p＝0.0016，与单独的抗PD1mAb相比，p<0.0001，以及与对照治疗相比，p<0.0001)。参见图21。
这些数据表明，虽然与对照治疗相比，单独的HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12或抗PD1 mAb治疗显著改善总体存活期，但与任一单独的治疗相比，两种治疗的组合显著改善总体存活期。
实例12：评估HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12的细胞因子表达在小鼠结直肠(CT26)肿瘤模型中的动力学的研究
该研究旨在评估当注射到小鼠CT26肿瘤模型中时，HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12的细胞因子表达的动力学。
在第0天，将CT26肿瘤细胞(3x105个细胞)皮下注射到雌性BALB/c小鼠的右侧腹中。使用电子卡尺每周两次(Q2W)测量肿瘤体积(mm3)。一旦肿瘤体积达到平均约100mm3，将动物随机分组(对于对照，每组5只小鼠，对于HSV-1/ICP34.5-/ICP47-，每组25只小鼠，以及对于HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12，每组25只小鼠)。在治疗施用开始时平均肿瘤体积和肿瘤体积的可变性在治疗组之间是一致的。将HSV-1/ICP34.5-/ICP47-(5x106PFU/剂量的病毒；病毒不含细胞因子有效载荷)、HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12(5x106PFU/剂量的病毒)和配制品缓冲液对照各自通过瘤内施用，每三天一次，总共三次注射。每周2次测量临床体征和体重变化，直至研究终止。在施用病毒后4、24、72、168和240小时时，将每个病毒处理组中5只小鼠安乐死。在配制品缓冲液对照注射后立即取出对照处理组中5只小鼠。分离血液并制备成血清，从动物中切除肿瘤并制备成蛋白裂解物。
所有动物在实验中均存活，并且未显示出与处理相关的不良健康影响的证据，如体重所证明的，并且在日常健康监测检查中未发现值得注意的不良临床体征。
分析了血清和肿瘤蛋白裂解物中小鼠FLT3L和IL-12的存在，它们是由病毒HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12编码的两种细胞因子。使用不含细胞因子的病毒(HSV-1/ICP34.5-/ICP47-)来控制内源性细胞因子表达。
在肿瘤裂解物中，注射了HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12的所有动物在注射后第7天(168小时)均在肿瘤裂解物中显示出IL-12表达。5只动物中有2只在注射后第10天(240小时)显示出IL-12表达(图22A)。注射了对照或HSV-1/ICP34.5-/ICP47-病毒的所有动物的IL-12水平均低于检测下限(LLOD)。在血浆中，在注射了HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12的所有5只动物中在注射后4小时时均检测到IL-12。在注射后24小时时，注射了HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12的5只动物中有4只具有可检测的IL-12。24小时后采样的所有时间点均低于LLOD(图22B)。
在肿瘤裂解物中，注射了HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12的所有动物在注射后第3天(72小时)在肿瘤裂解物中FLT3L的表达显示出统计学上显著的增加(4小时HSV-1/ICP34.5-/ICP47-相对于HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12，p＝0.0197；24小时HSV-1/ICP34.5-/ICP47-相对于HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12，p＝0.0043，72小时HSV-1/ICP34.5-/ICP47-相对于HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12，p＝0.0012；168小时HSV-1/ICP34.5-/ICP47-相对于HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12，p＝0.2281；240小时HSV-1/ICP34.5-/ICP47-相对于HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12，p＝0.4890；图22C)。在血浆中，所有组中所有小鼠的所有样品中均可检测到FLT3L。在任何时间点，任何组之间都没有统计学上的显著差异(图22D)。
在肿瘤裂解物中，与注射后4小时时的对照相比，仅注射了HSV-1/ICP34.5-/ICP47-和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12的动物在肿瘤裂解物中的IFN-γ的表达显示出显著的增加(p＝0.0057)。注射后24、72、168和240小时，在对照处理的肿瘤中没有可检测到的IFN-γ。注射后24小时，与HSV-1/ICP34.5-/ICP47-相比，接受HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12的动物表现出明显升高的IFN-γ水平(p＝0.0253)。在注射后72、168和240小时，HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12中的IFN-γ水平趋于高于HSV-1/ICP34.5-/ICP47-，但未能达到统计学显著性(分别为p＝0.2306、0.1155和p＝0.0693；图22E)。注射后24小时持续产生IFN-γ与IL-12产生一致，并应引发增强的抗肿瘤免疫应答。在血浆中，在用对照注射处理的动物中未检测到IFN-γ。在用HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-处理的动物中，注射后4小时的血浆IFN-γ不具有统计学显著差异(p＝0.4803)，在注射后24小时显著增加(p＝0.0140)，并且在72小时时在HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12中检测到IFN-γ。所有其他时间点和条件均低于测定的检测下限(LLOD)(图22F)。
实例13：评估HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12产生抗肿瘤T细胞应答的能力的研究
该研究评估了通过在对侧小鼠MC38肿瘤模型中注射HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12产生的抗肿瘤免疫应答。
在第0天，将MC38肿瘤细胞(3x105个细胞)皮下注射到雌性C57BL/6小鼠的右侧腹和左侧腹中。使用电子卡尺每周两次(Q2W)测量肿瘤体积(mm3)。一旦肿瘤体积达到平均约100mm3，将动物随机分组(每组12只小鼠)，使得在治疗施用开始时平均肿瘤体积(在两侧腹中)和肿瘤体积的可变性在治疗组之间是一致的。将HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12(5x106PFU/剂量)或配制品缓冲液对照通过瘤内施用(在动物的右侧)，每三天一次，总共三次注射。未注射的肿瘤(对侧；在动物的左侧)未接受注射。将抗PD1单克隆抗体(200μg/剂量)通过腹膜内注射按相同的时间表施用(每三天一次，总共三次注射)。每周2次测量临床体征、体重变化和肿瘤体积，直至在第21天研究终止。
所有动物在实验中均存活，并且未显示出与处理相关的不良健康影响的证据，如体重所证明的，并且在日常健康监测检查中未发现值得注意的不良临床体征。
在第21天将小鼠安乐死，切除脾脏，并对脾细胞的单细胞悬液进行IFN-γELISpot测定(肽再刺激和全细胞)。对于肽再刺激测定，将5x105个脾细胞接种并用最终浓度为1μM的单个9-mer肽(代表MC38新抗原或病毒衍生的肿瘤抗原)刺激过夜。通过将1.25x105个脾细胞与1.25x104个MC38细胞一起接种来建立全细胞测定。在每个测定中，斑点的计数指示表达IFN-γ的免疫细胞的总数。
在肽再刺激测定中，单独用HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12进行处理显著提高对MC38肿瘤细胞的免疫反应性；在全细胞测定中，与对照和抗PD1处理的动物相比，用HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12进行处理显著提高抗MC38活性(两者均p<0.0001；图23A)。与对照动物相比，在HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12处理动物中，对病毒衍生的肿瘤抗原P15E的免疫反应性也显著提高(p＝0.0008；图23B)。
MC38包含导致新抗原的几种基因组突变。定量了对这些肿瘤特异性突变的免疫反应性。在HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12处理的动物中，与对照处理的小鼠相比，对Adpgk(图23C)、2410127L17Rik(图23D)、和Aatf(图23E)的反应性显著提高(分别为p＝0.003，p＝0.0416和p＝0.0035)。此外，与单独HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12处理相比，HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12和抗PD1阻断的组合显著提高对Adpgk(p＝0.002)、Aatf(p＝0.040)、Cpne1(p＝0.030)和P15E(p＝0.0008)的反应性。这些数据表明，HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12处理可以增加MC38肿瘤模型中的抗肿瘤免疫应答。可以通过添加抗PD1进一步增强这种增加。如本文的功效研究中所证明的，全身性抗肿瘤应答的产生及其通过检查点阻断的增强应有助于针对注射和未注射的病变的抗肿瘤免疫性。
实例14：评估HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12和4-1BB激动剂mAb组合在小鼠结直肠(MC38)肿瘤模型中的功效的研究
该研究评估了单独或与激动性抗体靶向4-1BB(又名CD137)组合的HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12在对侧小鼠MC38肿瘤模型中的耐受性和抗肿瘤活性。
在第0天，将MC38肿瘤细胞(3x105个细胞)皮下注射到雌性C57BL/6小鼠的右侧腹和左侧腹中。使用电子卡尺每周两次(Q2W)测量肿瘤体积(mm3)。一旦肿瘤体积达到平均约100mm3，将动物随机分组(每组10只小鼠)，使得在治疗施用开始时平均肿瘤体积(在两侧腹中)和肿瘤体积的可变性在治疗组之间是一致的。将HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12(5x106PFU/剂量)或配制品缓冲液对照通过瘤内施用(在动物的右侧)，每三天一次，总共三次注射。未注射的肿瘤(对侧；在动物的左侧)未接受注射。将抗4-1BB单克隆抗体(150μg/剂量)通过腹膜内注射按相同的时间表施用(每三天一次，总共三次注射)。每周2次测量临床体征、体重变化和存活期(当肿瘤达到800mm3时从研究中移除小鼠)直至研究终止。
所有动物在实验中均存活，并且未显示出与处理相关的不良健康影响的证据，如体重所证明的，并且在日常健康监测检查中未发现值得注意的不良临床体征。
与对照处理的动物相比，两种单一处理(单独的抗4-1BB mAb和单独5x106PFUHSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12)表现出存活期显著增加(每次比较分别p＝0.0048和p<0.0001)。与单独的抗4-1BB mAb相比，5x106PFU HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12处理的动物的存活期具有统计学显著性(p＝0.0175)。与所有其他治疗组相比，两种治疗的组合(抗4-1BB mAb加5x106PFU HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12)显示出存活期明显增加(与单独的5x106PFU HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12相比，p＝0.0246，与单独的抗4-1BB mAb相比，p＝0.0004，以及与对照治疗相比，p<0.0001)。参见图24。
这些数据表明，虽然与对照治疗相比，单独的HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12或抗4-1BB mAb治疗显著改善总体存活期，但与任一单独的治疗相比，两种治疗的组合显著改善总体存活期。
实例15：评估HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12和双特异性T细胞衔接子
Figure BDA0003210744360000401
分子组合在小鼠结直肠(MC38)肿瘤模型中的功效的研究
该研究评估了单独或与双特异性T细胞衔接子
Figure BDA0003210744360000402
分子组合的HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12在过度表达人上皮细胞粘附分子(EpCAM)的对侧小鼠MC38肿瘤模型中的耐受性和抗肿瘤活性。
在第0天，将工程化以表达人EpCAM的MC38肿瘤细胞(3x105个细胞)皮下注射到雌性C57BL/6小鼠的右侧腹和左侧腹中，这些小鼠被工程化以从内源性小鼠CD3座位表达人CD3。使用电子卡尺每周两次(Q2W)测量肿瘤体积(mm3)。一旦肿瘤体积达到平均约100mm3，将动物随机分组(每组10只小鼠)，使得在治疗施用开始时平均肿瘤体积(在两侧腹中)和肿瘤体积的可变性在治疗组之间是一致的。将HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12(5x106PFU/剂量)或配制品缓冲液对照通过瘤内施用(在动物的右侧)，每三天一次，总共三次注射。未注射的肿瘤(对侧；在动物的左侧)未接受注射。将含有抗人CD3和抗人EpCAM结合结构域的
Figure BDA0003210744360000403
分子(150μg/kg)通过静脉内注射施用，每周一次，总共两次注射。每周2次测量临床体征、体重变化和存活期(当肿瘤达到800mm3时从研究中去除小鼠)直至研究终止。
序列表
<110> 安进公司
<120> 溶瘤病毒用于治疗癌症的用途
<130> A-2353-US-PSP
<140> 62/813,961
<141> 2019-03-05
<160> 24
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huFLT3L
<400> 1
atgacagtgc tggcgccagc ctggagccca acaacctatc tcctcctgct gctgctgctg 60
agctcgggac tcagtgggac ccaggactgc tccttccaac acagccccat ctcctccgac 120
ttcgctgtca aaatccgtga gctgtctgac tacctgcttc aagattaccc agtcaccgtg 180
gcctccaacc tgcaggacga ggagctctgc ggtggcctct ggcggctggt cctggcacag 240
cgctggatgg agcggctcaa gactgtcgct gggtccaaga tgcaaggctt gctggagcgc 300
gtgaacacgg agatacactt tgtcaccaaa tgtgcctttc agccacctcc cagctgtctt 360
cgcttcgtcc agaccaacat ctcccgcctc ctgcaggaga cctccgagca gctggtggcg 420
ctgaagccct ggatcactcg ccagaacttc tcccggtgcc tggagctgca gtgtcaacct 480
gactcctcaa ctctgccacc tccatggagt ccacggcctc tggaggcaac agcgccgaca 540
gctccgcagc cccctctgtt actcctactg ctgctgcccg tgggcctcct actgctggca 600
gctgcctggt gcctgcactg gcagaggacg cggcggagga caccccgacc tggggagcag 660
gtgccccccg tccccagtcc ccaggacctg ctgcttgtgg agcac 705
<210> 2
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huFLT3L
<400> 2
Met Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Thr Thr Tyr Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Ser Ser Gly Leu Ser Gly Thr Gln Asp Cys Ser Phe
20 25 30
Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu
35 40 45
Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu
50 55 60
Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln
65 70 75 80
Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly
85 90 95
Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala
100 105 110
Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser
115 120 125
Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp
130 135 140
Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro
145 150 155 160
Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala
165 170 175
Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
180 185 190
Pro Val Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Trp Cys Leu His Trp Gln
195 200 205
Arg Thr Arg Arg Arg Thr Pro Arg Pro Gly Glu Gln Val Pro Pro Val
210 215 220
Pro Ser Pro Gln Asp Leu Leu Leu Val Glu His
225 230 235
<210> 3
<211> 594
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huIL12A
<400> 3
agaaacctcc ccgtggccac tccagaccca ggaatgttcc catgccttca ccactcccaa 60
aacctgctga gggccgtcag caacatgctc cagaaggcca gacaaactct agaattttac 120
ccttgcactt ctgaagagat tgatcatgaa gatatcacaa aagataaaac cagcacagtg 180
gaggcctgtt taccattgga attaaccaag aatgagagtt gcctaaattc cagagagacc 240
tctttcataa ctaatgggag ttgcctggcc tccagaaaga cctcttttat gatggccctg 300
tgccttagta gtatttatga agacttgaag atgtaccagg tggagttcaa gaccatgaat 360
gcaaagcttc tgatggatcc taagaggcag atctttctag atcaaaacat gctggcagtt 420
attgatgagc tgatgcaggc cctgaatttc aacagtgaga ctgtgccaca aaaatcctcc 480
cttgaagaac cggattttta taaaactaaa atcaagctct gcatacttct tcatgctttc 540
agaattcggg cagtgactat tgatagagtg atgagctatc tgaatgcttc ctag 594
<210> 4
<211> 197
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huIL12A
<400> 4
Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu
1 5 10 15
His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys
20 25 30
Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp
35 40 45
His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu
50 55 60
Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr
65 70 75 80
Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe
85 90 95
Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr
100 105 110
Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys
115 120 125
Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu
130 135 140
Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser
145 150 155 160
Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu
165 170 175
Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser
180 185 190
Tyr Leu Asn Ala Ser
195
<210> 5
<211> 984
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> huIL12B
<400> 5
atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60
gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120
gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180
accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240
gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300
ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360
aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420
acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480
ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540
agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600
gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660
gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720
ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780
acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840
agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900
cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960
gaatgggcat ctgtgccctg cagt 984
<210> 6
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huIL12B
<400> 6
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser
325
<210> 7
<211> 1590
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人单链 IL-12 (huIL12B-GGGGS-huIL12A)
<400> 7
atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60
gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120
gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180
accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240
gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300
ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360
aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420
acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480
ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540
agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600
gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660
gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720
ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780
acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840
agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900
cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960
gaatgggcat ctgtgccctg cagtggcggt ggagggtcca gaaacctccc cgtggccact 1020
ccagacccag gaatgttccc atgccttcac cactcccaaa acctgctgag ggccgtcagc 1080
aacatgctcc agaaggccag acaaactcta gaattttacc cttgcacttc tgaagagatt 1140
gatcatgaag atatcacaaa agataaaacc agcacagtgg aggcctgttt accattggaa 1200
ttaaccaaga atgagagttg cctaaattcc agagagacct ctttcataac taatgggagt 1260
tgcctggcct ccagaaagac ctcttttatg atggccctgt gccttagtag tatttatgaa 1320
gacttgaaga tgtaccaggt ggagttcaag accatgaatg caaagcttct gatggatcct 1380
aagaggcaga tctttctaga tcaaaacatg ctggcagtta ttgatgagct gatgcaggcc 1440
ctgaatttca acagtgagac tgtgccacaa aaatcctccc ttgaagaacc ggatttttat 1500
aaaactaaaa tcaagctctg catacttctt catgctttca gaattcgggc agtgactatt 1560
gatagagtga tgagctatct gaatgcttcc 1590
<210> 8
<211> 530
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人单链 IL-12 (huIL12B-GGGGS-huIL12A)
<400> 8
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Asn Leu
325 330 335
Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser
340 345 350
Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln
355 360 365
Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp
370 375 380
Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu
385 390 395 400
Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile
405 410 415
Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala
420 425 430
Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu
435 440 445
Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile
450 455 460
Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala
465 470 475 480
Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu
485 490 495
Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala
500 505 510
Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn
515 520 525
Ala Ser
530
<210> 9
<211> 696
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> muFl3l
<400> 9
atgacagtgc tggcgccagc ctggagccca aattcctccc tgttgctgct gttgctgctg 60
ctgagtcctt gcctgcgggg gacacctgac tgttacttca gccacagtcc catctcctcc 120
aacttcaaag tgaagtttag agagttgact gaccacctgc ttaaagatta cccagtcact 180
gtggccgtca atcttcagga cgagaagcac tgcaaggcct tgtggagcct cttcctagcc 240
cagcgctgga tagagcaact gaagactgtg gcagggtcta agatgcaaac gcttctggag 300
gacgtcaaca ccgagataca ttttgtcacc tcatgtacct tccagcccct accagaatgt 360
ctgcgattcg tccagaccaa catctcccac ctcctgaagg acacctgcac acagctgctt 420
gctctgaagc cctgtatcgg gaaggcctgc cagaatttct ctcggtgcct ggaggtgcag 480
tgccagccgg actcctccac cctgctgccc ccaaggagtc ccatagccct agaagccacg 540
gagctcccag agcctcggcc caggcagctt ttgctcctgc tactgctgtt gctacctctc 600
acactggtgc tgctggcagc cgcctggggc cttcgctggc aaagggcaag aaggaggggg 660
gagctccacc ctggggtgcc cctcccctcc catccc 696
<210> 10
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> muFl3l
<400> 10
Met Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Asn Ser Ser Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Ser Pro Cys Leu Arg Gly Thr Pro Asp Cys Tyr
20 25 30
Phe Ser His Ser Pro Ile Ser Ser Asn Phe Lys Val Lys Phe Arg Glu
35 40 45
Leu Thr Asp His Leu Leu Lys Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Val Asn
50 55 60
Leu Gln Asp Glu Lys His Cys Lys Ala Leu Trp Ser Leu Phe Leu Ala
65 70 75 80
Gln Arg Trp Ile Glu Gln Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln
85 90 95
Thr Leu Leu Glu Asp Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Ser Cys
100 105 110
Thr Phe Gln Pro Leu Pro Glu Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile
115 120 125
Ser His Leu Leu Lys Asp Thr Cys Thr Gln Leu Leu Ala Leu Lys Pro
130 135 140
Cys Ile Gly Lys Ala Cys Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Val Gln
145 150 155 160
Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Leu Pro Pro Arg Ser Pro Ile Ala
165 170 175
Leu Glu Ala Thr Glu Leu Pro Glu Pro Arg Pro Arg Gln Leu Leu Leu
180 185 190
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Thr Leu Val Leu Leu Ala Ala Ala
195 200 205
Trp Gly Leu Arg Trp Gln Arg Ala Arg Arg Arg Gly Glu Leu His Pro
210 215 220
Gly Val Pro Leu Pro Ser His Pro
225 230
<210> 11
<211> 579
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> muIl12a
<400> 11
agggtcattc cagtctctgg acctgccagg tgtcttagcc agtcccgaaa cctgctgaag 60
accacagatg acatggtgaa gacggccaga gaaaaactga aacattattc ctgcactgct 120
gaagacatcg atcatgaaga catcacacgg gaccaaacca gcacattgaa gacctgttta 180
ccactggaac tacacaagaa cgagagttgc ctggctacta gagagacttc ttccacaaca 240
agagggagct gcctgccccc acagaagacg tctttgatga tgaccctgtg ccttggtagc 300
atctatgagg acttgaagat gtaccagaca gagttccagg ccatcaacgc agcacttcag 360
aatcacaacc atcagcagat cattctagac aagggcatgc tggtggccat cgatgagctg 420
atgcagtctc tgaatcataa tggcgagact ctgcgccaga aacctcctgt gggagaagca 480
gacccttaca gagtgaaaat gaagctctgc atcctgcttc acgccttcag cacccgcgtc 540
gtgaccatca acagggtgat gggctatctg agctccgcc 579
<210> 12
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> muIl12a
<400> 12
Arg Val Ile Pro Val Ser Gly Pro Ala Arg Cys Leu Ser Gln Ser Arg
1 5 10 15
Asn Leu Leu Lys Thr Thr Asp Asp Met Val Lys Thr Ala Arg Glu Lys
20 25 30
Leu Lys His Tyr Ser Cys Thr Ala Glu Asp Ile Asp His Glu Asp Ile
35 40 45
Thr Arg Asp Gln Thr Ser Thr Leu Lys Thr Cys Leu Pro Leu Glu Leu
50 55 60
His Lys Asn Glu Ser Cys Leu Ala Thr Arg Glu Thr Ser Ser Thr Thr
65 70 75 80
Arg Gly Ser Cys Leu Pro Pro Gln Lys Thr Ser Leu Met Met Thr Leu
85 90 95
Cys Leu Gly Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Thr Glu Phe
100 105 110
Gln Ala Ile Asn Ala Ala Leu Gln Asn His Asn His Gln Gln Ile Ile
115 120 125
Leu Asp Lys Gly Met Leu Val Ala Ile Asp Glu Leu Met Gln Ser Leu
130 135 140
Asn His Asn Gly Glu Thr Leu Arg Gln Lys Pro Pro Val Gly Glu Ala
145 150 155 160
Asp Pro Tyr Arg Val Lys Met Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe
165 170 175
Ser Thr Arg Val Val Thr Ile Asn Arg Val Met Gly Tyr Leu Ser Ser
180 185 190
Ala
<210> 13
<211> 1005
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> muIl12b
<400> 13
atgtgtcctc agaagctaac catctcctgg tttgccatcg ttttgctggt gtctccactc 60
atggccatgt gggagctgga gaaagacgtt tatgttgtag aggtggactg gactcccgat 120
gcccctggag aaacagtgaa cctcacctgt gacacgcctg aagaagatga catcacctgg 180
acctcagacc agagacatgg agtcataggc tctggaaaga ccctgaccat cactgtcaaa 240
gagtttctag atgctggcca gtacacctgc cacaaaggag gcgagactct gagccactca 300
catctgctgc tccacaagaa ggaaaatgga atttggtcca ctgaaatttt aaaaaatttc 360
aaaaacaaga ctttcctgaa gtgtgaagca ccaaattact ccggacggtt cacgtgctca 420
tggctggtgc aaagaaacat ggacttgaag ttcaacatca agagcagtag cagttcccct 480
gactctcggg cagtgacatg tggaatggcg tctctgtctg cagagaaggt cacactggac 540
caaagggact atgagaagta ttcagtgtcc tgccaggagg atgtcacctg cccaactgcc 600
gaggagaccc tgcccattga actggcgttg gaagcacggc agcagaataa atatgagaac 660
tacagcacca gcttcttcat cagggacatc atcaaaccag acccgcccaa gaacttgcag 720
atgaagcctt tgaagaactc acaggtggag gtcagctggg agtaccctga ctcctggagc 780
actccccatt cctacttctc cctcaagttc tttgttcgaa tccagcgcaa gaaagaaaag 840
atgaaggaga cagaggaggg gtgtaaccag aaaggtgcgt tcctcgtaga gaagacatct 900
accgaagtcc aatgcaaagg cgggaatgtc tgcgtgcaag ctcaggatcg ctattacaat 960
tcctcatgca gcaagtgggc atgtgttccc tgcagggtcc gatcc 1005
<210> 14
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> muIl12b
<400> 14
Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln
50 55 60
Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr
85 90 95
Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys
115 120 125
Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln
130 135 140
Arg Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro
145 150 155 160
Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys
165 170 175
Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln
180 185 190
Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu
195 200 205
Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser
210 215 220
Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln
225 230 235 240
Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro
245 250 255
Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val
260 265 270
Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys
275 280 285
Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln
290 295 300
Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser
325 330 335
<210> 15
<211> 1599
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠单链 IL12 (muIl12b-GGGGS-muIl12a)
<400> 15
atgtgtcctc agaagctaac catctcctgg tttgccatcg ttttgctggt gtctccactc 60
atggccatgt gggagctgga gaaagacgtt tatgttgtag aggtggactg gactcccgat 120
gcccctggag aaacagtgaa cctcacctgt gacacgcctg aagaagatga catcacctgg 180
acctcagacc agagacatgg agtcataggc tctggaaaga ccctgaccat cactgtcaaa 240
gagtttctag atgctggcca gtacacctgc cacaaaggag gcgagactct gagccactca 300
catctgctgc tccacaagaa ggaaaatgga atttggtcca ctgaaatttt aaaaaatttc 360
aaaaacaaga ctttcctgaa gtgtgaagca ccaaattact ccggacggtt cacgtgctca 420
tggctggtgc aaagaaacat ggacttgaag ttcaacatca agagcagtag cagttcccct 480
gactctcggg cagtgacatg tggaatggcg tctctgtctg cagagaaggt cacactggac 540
caaagggact atgagaagta ttcagtgtcc tgccaggagg atgtcacctg cccaactgcc 600
gaggagaccc tgcccattga actggcgttg gaagcacggc agcagaataa atatgagaac 660
tacagcacca gcttcttcat cagggacatc atcaaaccag acccgcccaa gaacttgcag 720
atgaagcctt tgaagaactc acaggtggag gtcagctggg agtaccctga ctcctggagc 780
actccccatt cctacttctc cctcaagttc tttgttcgaa tccagcgcaa gaaagaaaag 840
atgaaggaga cagaggaggg gtgtaaccag aaaggtgcgt tcctcgtaga gaagacatct 900
accgaagtcc aatgcaaagg cgggaatgtc tgcgtgcaag ctcaggatcg ctattacaat 960
tcctcatgca gcaagtgggc atgtgttccc tgcagggtcc gatccggcgg tggagggtcc 1020
agggtcattc cagtctctgg acctgccagg tgtcttagcc agtcccgaaa cctgctgaag 1080
accacagatg acatggtgaa gacggccaga gaaaaactga aacattattc ctgcactgct 1140
gaagacatcg atcatgaaga catcacacgg gaccaaacca gcacattgaa gacctgttta 1200
ccactggaac tacacaagaa cgagagttgc ctggctacta gagagacttc ttccacaaca 1260
agagggagct gcctgccccc acagaagacg tctttgatga tgaccctgtg ccttggtagc 1320
atctatgagg acttgaagat gtaccagaca gagttccagg ccatcaacgc agcacttcag 1380
aatcacaacc atcagcagat cattctagac aagggcatgc tggtggccat cgatgagctg 1440
atgcagtctc tgaatcataa tggcgagact ctgcgccaga aacctcctgt gggagaagca 1500
gacccttaca gagtgaaaat gaagctctgc atcctgcttc acgccttcag cacccgcgtc 1560
gtgaccatca acagggtgat gggctatctg agctccgcc 1599
<210> 16
<211> 533
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠单链 IL12 (muIl12b-GGGGS-muIl12a)
<400> 16
Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln
50 55 60
Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr
85 90 95
Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys
115 120 125
Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln
130 135 140
Arg Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro
145 150 155 160
Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys
165 170 175
Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln
180 185 190
Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu
195 200 205
Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser
210 215 220
Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln
225 230 235 240
Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro
245 250 255
Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val
260 265 270
Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys
275 280 285
Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln
290 295 300
Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser Gly
325 330 335
Gly Gly Gly Ser Arg Val Ile Pro Val Ser Gly Pro Ala Arg Cys Leu
340 345 350
Ser Gln Ser Arg Asn Leu Leu Lys Thr Thr Asp Asp Met Val Lys Thr
355 360 365
Ala Arg Glu Lys Leu Lys His Tyr Ser Cys Thr Ala Glu Asp Ile Asp
370 375 380
His Glu Asp Ile Thr Arg Asp Gln Thr Ser Thr Leu Lys Thr Cys Leu
385 390 395 400
Pro Leu Glu Leu His Lys Asn Glu Ser Cys Leu Ala Thr Arg Glu Thr
405 410 415
Ser Ser Thr Thr Arg Gly Ser Cys Leu Pro Pro Gln Lys Thr Ser Leu
420 425 430
Met Met Thr Leu Cys Leu Gly Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr
435 440 445
Gln Thr Glu Phe Gln Ala Ile Asn Ala Ala Leu Gln Asn His Asn His
450 455 460
Gln Gln Ile Ile Leu Asp Lys Gly Met Leu Val Ala Ile Asp Glu Leu
465 470 475 480
Met Gln Ser Leu Asn His Asn Gly Glu Thr Leu Arg Gln Lys Pro Pro
485 490 495
Val Gly Glu Ala Asp Pro Tyr Arg Val Lys Met Lys Leu Cys Ile Leu
500 505 510
Leu His Ala Phe Ser Thr Arg Val Val Thr Ile Asn Arg Val Met Gly
515 520 525
Tyr Leu Ser Ser Ala
530
<210> 17
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GSG-P2A
<400> 17
ggatccggtg ccacaaactt ctctttgcta aagcaagcag gagatgttga ggaaaaccct 60
gggccc 66
<210> 18
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GSG-P2A
<400> 18
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 19
<211> 587
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IRES序列
<400> 19
cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 60
tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 120
gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 180
aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 240
aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 300
ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 360
cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa 420
ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggta 480
cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 540
ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataatatggc cacaacc 587
<210> 20
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Kozak序列
<400> 20
ctaggccacc 10
<210> 21
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BGHpA序列
<400> 21
ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60
tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120
tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180
gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225
<210> 22
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 弹性蛋白序列
<400> 22
gttcctggag taggggtacc tggagtgggc ggatct 36
<210> 23
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弹性蛋白序列
<400> 23
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 24
<211> 588
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CMV序列
<400> 24
gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggact atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420
agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480
tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540
aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctc 588

Claims (34)

1.一种溶瘤病毒，其包含：
编码异源树突细胞生长因子的核酸序列；以及
编码第一异源细胞因子的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的溶瘤病毒，其中所述编码异源树突细胞生长因子的核酸序列和所述编码第一异源细胞因子的核酸序列通过编码接头元件的核酸序列连接。
3.根据权利要求2所述的溶瘤病毒，其中所述接头元件是猪捷申病毒2a(P2A)或内部核糖体进入位点(IRES)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒是单纯疱疹病毒。
5.根据权利要求4所述的溶瘤病毒，其中所述单纯疱疹病毒是单纯疱疹1型病毒。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒进一步：
缺乏编码ICP 34.5的功能性基因；以及
缺乏编码ICP 47的功能性基因。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒进一步包含启动子，以及所述编码树突细胞生长因子的核酸序列和所述编码第一细胞因子的核酸序列均在所述启动子的控制下。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒进一步包含：
第一启动子，其中所述编码树突细胞生长因子的核酸序列在所述第一启动子的控制下；以及
第二启动子，其中所述编码第一细胞因子的核酸序列在所述第二启动子的控制下。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的溶瘤病毒，其中所述第一异源细胞因子是白介素。
10.根据权利要求9所述的溶瘤病毒，其中所述白介素是白介素-12(IL12)。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的溶瘤病毒，其中所述异源树突细胞生长因子是第二细胞因子。
12.根据权利要求11所述的溶瘤病毒，其中所述第二细胞因子是Fms相关酪氨酸激酶3配体(FLT3L)。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒是单纯疱疹病毒1型(HSV-1)病毒，
其中：
所述HSV-1：
缺乏编码ICP34.5的功能性基因，以及
缺乏编码ICP47的功能性基因；
所述异源树突细胞生长因子为FLT3L；以及
所述异源第一细胞因子为IL12。
14.根据权利要求13所述的溶瘤病毒，其中所述编码IL12的核酸和所述编码FLT3L的核酸存在于编码ICP34.5的基因的前位点中。
15.根据权利要求14所述的溶瘤病毒，其中所述编码IL12的核酸和所述编码FLT3L的核酸通过P2A连接。
16.根据权利要求15所述的溶瘤病毒，其中所述编码IL12、FLT3L和P2A的核酸以以下存在：[Flt3L]-[P2A]-[IL12]。
17.根据权利要求16所述的溶瘤病毒，其中所述[Flt3L]-[P2A]-[IL12]在单个启动子控制下。
18.根据权利要求17所述的溶瘤病毒，其中所述启动子选自包含以下的列表：巨细胞病毒(CMV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、人延伸因子1α启动子(EF1α)、猿猴病毒40早期启动子(SV40)、磷酸甘油酸激酶1启动子(PGK)、泛素C启动子(UBC)和鼠干细胞病毒(MSCV)。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒进一步包含牛生长激素聚腺苷酸化信号序列(BGHpA)。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒进一步包含增强哺乳动物翻译的核酸。
21.根据权利要求20所述的溶瘤病毒，其中所述增强哺乳动物翻译的核酸是Kozak序列或共有Kozak序列。
22.根据权利要求21所述的Kozak序列，其中所述共有Kozak序列在SEQ ID NO:20中列出。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒包含一种或多种编码[CMV]-[Kozak]-[Flt3L]-[P2A]-[IL12]-[BGHpA]的核酸。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的溶瘤病毒，其中所述IL12以[P40亚基]-[GGGGS]-[P35亚基]存在。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的溶瘤病毒，其中IL12 P35亚基中的信号肽是不存在的。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒衍生自毒株JS1。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒包含：
含有SEQ ID NO:1的FLT3L序列；以及
含有SEQ ID NO:7的IL12序列。
28.根据权利要求27所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒是HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12。
29.根据权利要求28所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒包含：
含有SEQ ID NO:24的CMV启动子；
含有SEQ ID NO:20的Kozak序列；
含有SEQ ID NO:1的FLT3L序列；
含有SEQ ID NO:17的P2A序列；
含有SEQ ID NO:7的IL12序列；以及
含有SEQ ID NO:21的BGHpA序列。
30.一种使用根据权利要求1-29中任一项所述的溶瘤病毒治疗癌症的方法。
31.一种治疗有效量的根据权利要求1-29中任一项所述的溶瘤病毒，用于在治疗癌症中使用。
32.一种用于在治疗癌症的方法中使用的药物组合物，其中所述药物组合物包含根据权利要求1-29中任一项所述的溶瘤病毒。
33.根据权利要求32所述的药物组合物，其中所述组合物进一步包含检查点抑制剂。
34.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-29中任一项所述的溶瘤病毒。
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