KR20210135532A - 암 치료를 위한 종양 용해 바이러스의 용도 - Google Patents

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제이슨 제임스 드보스
월터 한스 메이센
크리스틴 일레인 틴버그
키간 쿠크
아킴 클라우스 모에스타
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암젠 인크
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Abstract

본 발명은 다양한 유형의 암 치료를 위한 종양 용해 바이러스(예를 들어, 변형된 HSV-1 바이러스)의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 종양 용해 바이러스의 이러한 용도에 관한 조성물 및 키트에 관한 것이다.

Description

암 치료를 위한 종양 용해 바이러스의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 3월 5일자로 출원된 미국 가출원 제62/813,961호에 대한 우선권 및 유익을 주장하며, 이는 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
서열목록에 대한 언급
본 출원은 컴퓨터-판독 가능한 형태로 서열목록을 포함한다. 서열목록은 2020년 1월 10일자로 생성된 파일명 A-2353-WO-PCT_SeqListing_ST25.txt의 텍스트 파일로서 제공되며, 이는 용량이 37,667 바이트이다. 전자 형식 서열 목록의 정보 전체는 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
다양한 형태의 암 치료에서 최근의 진보는 가장 흔한 유형의 암, 예컨대, 폐암, 결장암, 유방암 및 전립선암에 대한 남성과 여성 둘 다의 생존율을 크게 개선시켰다. 환자 면역계가 특정 형태의 암을 공격하도록 지시하는 데 성공한 관문 저해제의 출현은 특정 암에 대한 환자 생존을 크게 개선시켰다. 예를 들어, 관문 저해제, 예컨대, 이필리무맙(항-CTLA-4 항체), 펨브롤리주맙 및 니볼루맙(항-PD-1 항체) 및 아테졸리주맙(항-PD-L1 항체)은 다양한 종양 유형에서 효능이 입증되었다. 문헌[Grosso et al., Cancer Immun., 13:5 (2013); Pardoll, Nat Rev Cancer, 12:252-264 (2012)]; 및 문헌[Chen et al., Immunity, 39:1-10 (2013)] 참조.
종양 용해 바이러스(oncolytic virus)는 또한 특정 형태의 암의 치료에서의 임상 효능이 입증되었다. 종양 용해 바이러스는 전형적으로 (건강한 세포 이상으로) 암세포에서 우선적으로 복제하도록 그리고 항종양 반응을 향상시키기 위해 사용될 수 있는 "페이로드(payload)"를 포함하도록 유전자 조작된다. 이러한 유전자 조작은 처음에 비-종양 세포에 대한 바이러스-유도 손상을 방지하기 위해 복제-부적격 바이러스의 사용에 중점을 두었다. 보다 최근에, 종양 용해 바이러스의 유전자 조작은 전신 감염을 피하는 한편 바이러스가 다른 종양 세포로 확산되게 하는 "복제-조건부" 바이러스의 생성에 중점을 두었다.
현재, 미국 및 유럽에서 승인된 유일한 종양 용해 바이러스-기반 약물은 탈리모겐 라허파렙벡(talimogene laherparepvec)(IMLYGIC®)이다. 탈리모겐 라허파렙벡은 임상 균주 JS1(유럽 세포 배양 컬렉션(European collection of cell cultures: ECAAC)에서 수탁번호 01010209 하에 기탁됨)로부터 유래된 HSV-1이다. 탈리모겐 라허파렙벡에서, ICP34.5 및 ICP47을 암호화하는 HSV-1 바이러스 유전자는 기능성이 결실된다. ICP47의 기능성 결실은 종양 선택성을 감소시키지 않으면서 종양 세포에서 바이러스 성장을 촉진시키는 유전자인 US11의 조기 발현을 야기한다. 또한, 인간 GM-CSF에 대한 암호화 서열은 앞의 ICP34.5 유전자 부위에서 바이러스 게놈에 삽입되었다. 문헌[Liu et al., Gene Ther., 10:292-303, 2003] 참조.
종양 용해 바이러스와 관문 저해제의 치료적 조합이 탐구되었다. 예를 들어, 탈리모겐 라허파렙벡과 면역요법(예를 들어, 이필리무맙 및 펨브롤리주맙)의 조합은 현재 흑색종(NCT01740297 및 NCT02263508) 및 두경부의 편평세포암종(NCT02626000)의 임상시험에서 연구 중에 있다.
종양 용해 바이러스는 암 치료에서의 큰 장래성이 입증되었지만, 암세포에 대한 복제 및 용해성 손상을 제한할 뿐만 아니라, 강한 전신 항-종양 면역 반응의 장착 및 유지에 도움을 주는 종양 용해 바이러스를 개발할 필요가 남아있다.
본 발명은 이들 및 다른 필요를 처리한다.
본 발명은 이종성 수지상 세포 성장 인자를 암호화하는 핵산 및 제1 이종성 사이토카인을 암호화하는 핵산을 포함하는 종양 용해 바이러스에 관한 것이다. 이종성 수지상 세포 성장 인자 및 제1 이종성 사이토카인은 다시스트론성 링커 요소에 의해 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 다시스트론성 링커 요소는 돼지 테스코 바이러스 2a(porcine tescho virus 2a: P2A) 또는 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosomal entry site: IRES)이다. 종양 용해 바이러스는 단순 포진 바이러스, 예컨대, 단순 포진 바이러스-1일 수 있다. 특정 실시형태에서, 종양 용해 바이러스는 HSV-1 균주 JS1로부터 유래된다.
종양 용해 바이러스는 기능성 ICP 34.5 유전자를 결여하고 기능성 ICP 47 유전자를 결여하도록 추가로 변형될 수 있다.
또한, 종양 용해 바이러스는 프로모터를 더 포함할 수 있되, 수지상 세포 성장 인자 및 제1 사이토카인을 암호화하는 핵산 서열은 둘 다 동일한 프로모터의 제어 하에 있다. 다른 실시형태에서, 종양 용해 바이러스는 제1 프로모터를 포함할 수 있되, 수지상 세포 성장 인자를 암호화하는 핵산 서열은 제1 프로모터, 및 제2 프로모터의 제어 하에 있고, 제1 사이토카인을 암호화하는 핵산 서열은 제2 프로모터의 제어 하에 있다.
제1 이종성 사이토카인은 인터류킨, 예컨대, 인터류킨-12(IL12)일 수 있다. 이종성 수지상 세포 성장 인자는 제2 사이토카인, 예컨대, Fms-관련 티로신 키나제 3 리간드(FLT3L)일 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 종양 용해 바이러스는 기능성 ICP34.5 암호화 유전자를 결여하고 기능성 ICP47 암호화 유전자를 결여하는 HSV-1을 포함하고, FLT3L을 암호화하는 핵산을 포함하고, IL12를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, IL12를 암호화하는 핵산 및 FLT3L을 암호화하는 핵산은 ICP34.5 암호화 유전자의 앞 부위에 존재한다. 일 실시형태에서, IL12를 암호화하는 핵산 및 FLT3L을 암호화하는 핵산은 P2A를 통해 연결된다.
IL12, FLT3L 및 P2A를 암호화하는 핵산은 [Flt3L]-[P2A]-[IL12]로서 제공될 수 있되, [Flt3L]-[P2A]-[IL12] 작제물은 단일 프로모터의 제어 하에 있고, 작제물은 ICP34.5 암호화 유전자의 앞 부위에 존재한다. 적합한 프로모터는 거대세포바이러스(CMV), 라우스 육종 바이러스(RSV), 인간 연장인자 1α 프로모터(EF1a), 유인원 바이러스 40 초기 프로모터(SV40), 포스포글리세린산 키나제 1 프로모터(PGK), 유비퀴틴 C 프로모터(UBC) 및 뮤린 줄기 세포 바이러스(MSCV)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 프로모터는 CMV이다.
본 발명의 종양 용해 바이러스는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 서열(BGHpA)을 포함할 수 있다. 본 발명의 종양 용해 바이러스는 또한 포유류 번역을 향상시키는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 포유류 번역을 향상시키는 핵산은 Kozak 서열 또는 공통 Kozak 서열이다. 특정 실시형태에서, 공통 Kozak 서열은 서열번호 20에 열거된다.
일 실시형태에서, 종양 용해 바이러스는 [CMV]-[Kozak]-[Flt3L]-[P2A]-[IL12]-[BGHpA]를 암호화하는 핵산 또는 핵산들(또한 작제물 또는 발현 카세트로서 지칭됨)을 포함한다. 다른 실시형태에서, IL12는 [P40 서브유닛]-[GGGGS]-[P35 서브유닛]으로서 제공된다. 다른 실시형태에서, IL12 P35 서브유닛의 신호 펩티드는 존재하지 않는다. 다른 실시형태에서, 종양 용해 바이러스는 [CMV]-[Kozak]-[Flt3L]-[P2A]-[IL12(p40-GGGGS-No SP-p35)]-[BGHpA]를 암호화하는 핵산 또는 핵산들을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 작제물은 ICP34.5 암호화 유전자의 앞 부위에 존재한다. HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12를 생성하는 데 사용되는 ICP34.5 암호화 유전자의 앞 부위 내의 작제물의 배향은 도 9에 나타내지만, ICP34.5 암호화 유전자의 앞 부위 내에서 발현 카세트의 다중 배향이 생성/이용될 수 있었다.
일부 실시형태에서, 종양 용해 바이러스는 서열번호 1을 포함하는 FLT3L 서열 및 서열번호 7을 포함하는 IL12 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 종양 용해 바이러스는 서열번호 24를 포함하는 CMV 프로모터, 서열번호 20을 포함하는 Kozak 서열, 서열번호 1을 포함하는 FLT3L 서열, P2A 서열(GSG-P2A) 서열번호 17, 서열번호 7을 포함하는 IL12 서열, 및 서열번호 21을 포함하는 BGHpA 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 종양 용해 바이러스를 이용하여 암을 치료하는 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 암을 치료하는 데 사용하기 위한 치료적 유효량의 종양 용해 바이러스를 포함한다.
본 발명은 또한 암을 치료하는 데 사용하기 위한 약제학적 조성물을 포함한다. 약제학적 조성물은 관문 저해제를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 종양 용해 바이러스를 포함하는 키트를 포함한다.
도 1. 도 1은 단일 쇄 사이토카인 산물을 생성하는 IL12p35 및 IL12p40 쇄의 융합에 대해 평가되는 링커의 인실리코(in-silico) 모델링을 나타낸다.
도 2. 도 2는 IL12p35 및 IL12p40 쇄의 융합에 대해 평가되는 링커에 대한 에너지 형태 모델링을 나타낸다.
도 3. 도 3은 쇄의 배향, 신호 펩티드의 위치 및 사용되는 링커의 평가를 포함하는, 발현을 최적화하는 IL12 융합 단백질의 조작을 나타낸다.
도 4. 도 4는 돼지 2A 바이러스(P2A) 서열 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열과 함께 발현될 때 FLT3L 및 단일 쇄 IL12의 발현을 나타낸다.
도 5. 도 5는 생성된 사이토카인 산물 수준에 대한 DNA 작제물의 KOZAK 서열 혼입 효과를 나타낸다.
도 6. 도 6은 동족 수용체인 FLT3에 대한 FLT3L의 활성 및 수용체 결합에 대한 P2A 아미노산 첨가의 구조적 영향을 나타낸다.
도 7. 도 7은 시험관내 수용체 분석에서 재조합 인간 IL12의 활성(a) 및 FLT3L-P2A-IL12 작제물에 의해 생성된 단일 쇄 IL12(b)를 나타낸다.
도 8. 도 8은 시험관내 세포 증식 분석에서 재조합 인간 FLT3L(a) 및 FLT3L-P2A-IL12 작제물에 의해 생성된 FLT3L(b)의 활성을 나타낸다.
도 9. 도 9는 HSV1 게놈의 2개의 34.5 좌위에 삽입된 FLT3-IL12 서열을 포함하는 조작된 바이러스를 생성하기 위한 상동성 재조합 접근을 나타낸다.
도 10. 도 10은 VERO(a) 및 A375(b) 세포주에서의 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12 바이러스의 시험관내 복제 능력을 나타낸다.
도 11. 도 11은 마우스 CT26 세포(a) 및 인간 HT-29(b), SK-MEL-5(c), FADU(d) 및 BxPC-3 세포주(e)에서의 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12 바이러스의 시험관내 감염 및 용해 능력을 나타낸다.
도 12. 도 12는 감염된 인간 VERO, SK-MEL-5 및 A375 세포에서의 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12 바이러스로부터의 FLT3L 및 IL12의 발현을 나타낸다.
도 13. 도 13은 시험관내에서 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12 바이러스로 감염된 인간 SK-MEL-5(a) 또는 A375(b) 세포에 의해 발현될 때, IL12의 활성을 나타낸다.
도 14. 도 14는 시험관내에서 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12 바이러스로 감염된 인간 SK-MEL-5(a) 또는 VERO(b) 세포에 의해 발현될 때, FLT3L의 활성을 나타낸다.
도 15. 도 15는 BALB/c 동물에 이식되고 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12의 1e6 PFU/동물로 종양내로 주사된 A20 종양 세포로부터의 마우스 FLT3L 및 IL12의 생체내 발현을 나타낸다.
도 16. 도 16은 C57BL6 동물에 이식되고 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12의 5e6 PFU/동물로 종양내로 주사된 B16F10 종양 세포로부터의 마우스 FLT3L 및 IL12의 생체내 발현을 나타낸다.
도 17. 도 17은 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF 또는 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 바이러스에 의한 주사 결과로서 생기는 항-종양 T 세포 반응을 나타낸다.
도 18. 도 18은 바이러스가 종양의 한쪽(우측 옆구리)에만 종양내로 전달되고, 다른 하나의 종양은 치료되지 않고 남아있는(좌측 옆구리) 양 옆구리 마우스 공통유전자 B 세포 림프종(A20 세포주) 종양 모델에서의 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF 및 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12의 항-종양 효능을 나타낸다.
도 19. 도 19는 바이러스가 종양의 한쪽(우측 옆구리)에만 종양내로 전달되고, 다른 하나의 종양은 치료되지 않고 남아있는(좌측 옆구리) 양 옆구리 마우스 공통유전자 신경아세포종(Neuro2A 세포주) 종양 모델에서의 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF 및 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12의 항-종양 효능을 나타낸다.
도 20. 도 20은 바이러스가 종양의 한쪽(우측 옆구리)에만 종양내로 전달되고, 다른 하나의 종양은 치료되지 않고 남아있는(좌측 옆구리) 양 옆구리 마우스 공통유전자 직장결장(CT26 세포주) 종양 모델에서의 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF 및 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12의 항-종양 효능을 나타낸다.
도 21. 도 21은 바이러스가 종양의 한쪽(우측 옆구리)에만 종양내로 전달되고, 다른 하나의 종양은 치료되지 않고 남아있는(좌측 옆구리) 양 옆구리 마우스 공통유전자 직장결장(MC38 세포주) 종양 모델에서 관문 차단(항-PD1 mAb)과 조합한 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12의 항-종양 효능을 나타낸다.
도 22. 도 22는 바이러스가 종양(우측 옆구리)에 종양내로 전달되는 단일 마우스 공통유전자 직장결장(CT26 세포주) 종양 모델에서의 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12의 사이토카인/페이로드 생성을 나타낸다.
도 23. 도 23은 양측 마우스 공통유전자 직장결장(MC38 세포주) 종양 모델에서 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 단독으로 또는 항-PD1 항체와 조합한 주사에 의해 생성된 항-종양 반응(ELISpot에 의해 측정)을 나타낸다. X-축 아래의 선은 선의 시작과 끝에서 나타내는 그룹 간의 통계학적 분석(양측 스튜던트 T 검정) 결과를 나타낸다. P 값을 다음과 같이 나타낸다: *는 p ≤ 0.05이고; **는 p ≤0.01이며, ***는 p ≤ 0.001이고, ****은 p ≤ 0.0001임
도 24. 도 24는 바이러스가 종양의 한쪽(우측 옆구리)에만 종양내로 전달되고, 다른 하나의 종양은 치료되지 않고 남아있는(좌측 옆구리) 양 옆구리 마우스 공통유전자 직장결장(MC38 세포주) 종양 모델에서 항-4-1BB 작용제 항체와 조합한 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12의 항-종양 효능을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 표제 부문은 단지 조직화 목적을 위한 것이며, 기재된 대상으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 명세서의 중심부에 열거되는 모든 참고문헌은 이들의 전문이 참조에 의해 명확히 포함된다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원과 관련하여 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가진다. 추가로, 문맥에서 달리 요구되지 않은 한, 단수 용어는 복수를 포함해야 하고, 복수 용어는 단수를 포함해야 한다.
일반적으로, 본 명세서에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용된 명명법 및 이들의 기법은 당해 분야에 널리 공지되고 흔히 사용되는 것이다. 본 출원의 방법 및 기법은 일반적으로 당업계에 잘 공지된 통상적인 방법에 따라 그리고 달리 표시되지 않는 한, 본 명세서 전체적으로 인용 및 논의되는 다양한 일반적이고 더 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함되는 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)], 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)], 및 문헌[Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)]을 참조한다. 효소적 반응 및 정제 기법은 당업계에서 통상적으로 수행되거나 또는 본 명세서에 기재된 바대로 제조업자의 명세서에 따라 수행된다. 본 명세서에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학 및 의학 및 약제 화학과 관련하여 사용되는 용어, 및 이의 실험 절차 및 기법은 당업계에 잘 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 화학 합성, 화학 분석, 약제학적 제제, 제형, 및 환자의 전달 및 치료에 대한 표준 기법이 사용될 수 있다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 방법, 프로토콜 및 시약 등으로 제한되지 않으며, 이들은 변할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 특정 실시형태만을 기재하는 목적을 위한 것이며, 청구범위에 의해서만 정해지는 개시된 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
작업 실시예 이외의 또는 달리 표시된 경우에, 본 명세서에서 사용되는 성분 또는 반응 조건의 양을 표현하는 모든 숫자는 용어 "약"에 의해 모든 예에서 변형되는 바와 같이 이해되어야 한다. 백분율과 관련하여 사용될 때 용어 "약"은 ±1%를 의미한다.
본 명세서의 구체적 단락에서 정의되는 변형보다 임의의 방법에서의 범주가 더 좁은 모든 실시형태는 본 개시내용애 포함되는 것으로 간주하여야 한다. 예를 들어, 특정 양상은 속(genus)으로서 기재되며, 속의 모든 구성원이 개개로 실시형태일 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 속으로서 기재되거나 속의 구성원을 선택하는 양상은 속의 둘 이상의 구성원의 조합을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 또한 본 명세서에의 다양한 실시형태는 다양한 상황 하에서 "포함하는"이라는 언어를 사용하여 제시되지만, "이루어진" 또는 "본질적으로 이루어진"이라는 언어를 사용하여 관련된 실시형태가 또한 기재될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
정의
유전자를 지칭할 때 용어 "기능성이 결실된"은 기능성 단백질이 더 이상 해당 유전자로부터 발현될 수 없도록 유전자가 (예를 들어, 유전자를 부분적으로 또는 완전히 결실, 대체, 재배열 또는 달리 변경함으로써) 변형됨을 의미한다. 단순 포진 바이러스(예컨대, 종양 용해 바이러스)와 관련하여, 기능성 바이러스 단백질이 단순 포진 바이러스에 의해 해당 유전자로부터 더 이상 발현될 수 없도록 바이러스 유전자가 단순 포진 게놈에서 변형될 때, 유전자는 "기능성이 결실된다".
용어 "이종성"은 바이러스 게놈에 존재하는 핵산(또는 핵산에 의해 암호화된 단백질)을 지칭할 때 바이러스에 자연적으로 존재하지 않는 핵산(또는 바이러스에 의해 자연적으로 생성되지 않은 단백질)을 지칭한다. 예를 들어, 인간 IL12를 암호화하는 핵산 또는 인간 FLT3L을 암호화하는 핵산은 HSV-1에 대해 "이종성"일 것이다.
용어 "종양 용해 바이러스"는 자연적으로 또는 변형의 결과로서, 비암세포에 비해 암세포를 우선적으로 감염시키고 사멸시키는 바이러스를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "환자" 또는 "대상체"는 상호 호환적으로 사용되고, 인간 또는 비인간 포유류, 예컨대 소과, 말과, 개과, 양과 또는 고양이과를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 포유류를 의미한다. 바람직하게는, 환자는 인간이다.
용어 "HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12"는 균주 JS1로부터 유래된 변형된 HSV-1을 지칭하되, HSV-1은 기능성 ICP34.5 암호화 유전자를 결여하고, 기능성 ICP47 암호화 유전자를 결여하며, ICP34.5 유전자의 앞 부위에 삽입된 다음의 것을 포함한다: [CMV]-[Kozak]-[Flt3L]-[P2A]-[IL12(p40-GGGGS-No SP-p35)]-[BGHpA].
종양 용해 바이러스
본 발명의 종양 용해 바이러스를 생성하기 위해 임의의 바이러스가 사용될 수 있다. 일반적으로, 바이러스는, 예를 들어, 숙주 면역계에 의해 검출될 능력인 이의 복제를 조절하기 위해(예를 들어, 건강한 세포에 비해 종양 세포에서 우선적으로 복제하기 위해), 그리고 외인성 핵산을 포함하기 위해 변형될 수 있다.
일부 실시형태에서, 종양 용해 바이러스는 단순 포진 바이러스(HSV)이다. 다른 실시형태에서, 종양 용해 바이러스는 단순 포진 바이러스-1(HSV-1)이다. 또 다른 실시형태에서, 종양 용해 바이러스는 JS1(HSV-1)로부터 유래된다. 수탁번호 01010209 하에 유럽 세포 배양 컬렉션(ECAAC)에 기탁된 바와 같은 JS1.
일부 실시형태에서, 종양 용해 바이러스는 HSV-1이되, ICP34.5를 암호화하는 바이러스 유전자는 기능이 결실된다. HSV 감염 동안 병독성 인자로서 작용하는 ICP34.5의 기능성 결실은 비분열 세포에서 복제를 제한하고, 바이러스가 비병원성이 되게 한다. ICP34.5-기능 결실 HSV의 안전성은 다수의 임상 연구에 나타났다(MacKie et al, Lancet 357: 525-526, 2001; Markert et al, Gene Ther 7: 867-874, 2000; Rampling et al, Gene Ther 7:859-866, 2000; Sundaresan et al, J. Virol 74: 3822-3841, 2000; Hunter et al, J Virol Aug; 73(8): 6319-6326, 1999).
다른 실시형태에서, 종양 용해 바이러스는 HSV-1이되, ICP47(주요 조직 적합 유전자 복합체 클래스 I 및 II 분자에 대한 바이러스 항원 제시를 차단함)을 암호화하는 바이러스 유전자는 기능이 결실된다. ICP47의 기능성 결실은 또한 종양 선택성을 감소시키지 않으면서 종양 세포에서 바이러스 성장을 촉진시키는 유전자인 US11의 조기 발현을 야기한다.
일부 실시형태에서, ICP34.5를 암호화하는 바이러스 유전자는 결실된다. 일부 실시형태에서, ICP47을 암호화하는 바이러스 유전자는 결실된다. 일부 실시형태에서, ICP34.5를 암호화하는 바이러스 유전자와 ICP47을 암호화하는 바이러스 유전자는 둘 다 결실된다. 일부 실시형태에서, ICP34.5를 암호화하는 바이러스 유전자와 ICP47을 암호화하는 바이러스 유전자는 둘 다 결실되며, ICP47의 결실은 US11의 더 조기의 발현을 야기한다.
포진 바이러스 균주 및 이러한 균주의 생성 방법은 미국 특허 제5824318호; 미국 특허 제6764675호; 미국 특허 제6,770,274호; 미국 특허 제7,063,835호; 미국 특허 제7,223,593호; 미국 특허 제7749745호; 미국 특허 제7744899호; 미국 특허 제8273568호; 미국 특허 제8420071호; 미국 특허 제8470577호; WIPO 공개 번호: WO199600007; WO199639841; WO199907394; WO200054795; WO2006002394; WO201306795; 중국 특허 제128303호, 중국 특허 제10230334호 및 중국 특허 제10230335호; 문헌[Varghese and Rabkin, (2002) Cancer Gene Therapy 9:967-97] 및 문헌[Cassady and Ness Parker, (2010) The Open Virology Journal 4:103-108]에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
본 발명의 종양 용해 바이러스는 또한 이들이 단백질을 암호화하는 외인성 핵산(들)을 포함하도록 변형된다. 이러한 단백질은 바이러스의 면역자극 능력을 향상시키도록 합리적으로 선택되었다. 면역자극 능력의 증가는 종양 용해 바이러스가 더 강한 항-종양 반응을 유발하게 한다. 따라서, 일 양상에서, 종양 용해 바이러스는 이종성 수지상 세포 성장 인자를 암호화하는 핵산, 제1 이종성 사이토카인을 암호화하는 핵산 또는 둘 다를 포함한다. FLT3L은 T 세포에 대한 종양 항원의 교차 제시에 중요한 수지상 세포, 특히 cDC1 서브세트의 증식 및 생존을 향상시킨다. 또한, IL12는 1형 T 헬퍼(Th1) 및 세포독성 T 림프구(CTL) 기능을 증가시켜, 최대 종양 사멸 활성을 초래한다. 이론에 의해 구속되는 일 없이, 이들 두 세트의 속성의 조합은 놀랍게도, 예를 들어, 암세포에 대해 전신 면역 반응을 유도할 수 있는 종양 용해 바이러스를 수득하는 것으로 생각된다.
특정 실시형태에서, 종양 용해 바이러스는 이종성 수지상 세포 성장 인자를 암호화하는 핵산 및 제1 이종성 사이토카인을 암호화하는 핵산(때때로 "페이로드"로서 지칭됨)을 포함한다. 제1 이종성 사이토카인의 예는 인터류킨-2(IL2), IL7, IL12, IL15, IL21, TNF, 및 사이토카인의 인터류킨 패밀리의 다른 구성원 및 면역 세포 상의 수용체에 결합할 수 있고/있거나 T 세포 기능 또는 기억 형성을 증가시킬 수 있는 단백질을 포함한다. 특정 실시형태에서, 제1 이종성 사이토카인은 IL12(뮤린 또는 인간)이다. muIL12a 및 muIL12b를 암호화하는 핵산 서열은 각각 서열번호 11 및 13에 열거된다. huIL12a 및 huIL12b를 암호화하는 핵산 서열은 각각 서열번호 3 및 5에 열거된다. muIL12a 및 muIL12b의 아미노산 서열은 각각 서열번호 12 및 14에 열거된다. huIL12a 및 huIlL2b의 아미노산 서열은 각각 서열번호 4 및 6에 열거된다.
천연 형태에서, IL12는 IL12A(p35 서브유닛) 및 IL12B(p40 서브유닛)를 포함하는 이형이량체 사이토카인이되, 각 서브유닛은 별개의 유전자에 의해 암호화된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 종양 용해 바이러스는 2가지의 이종성 핵산을 포함하며: 하나는 IL12 p35 서브유닛을 암호화하고, 다른 하나는 IL12 p40 서브유닛을 암호화한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 종양 용해 바이러스는 단일 쇄 IL12 변이체를 포함한다. 이러한 단일 쇄 IL12 변이체에서, p35 및 p40 서브유닛은 서로 직접(즉, 링커 없이) 융합될 수 있거나, 또는 링커(합성 또는 펩티드-기반)를 통해 서로 결합될 수 있다. 적합한 링커의 예는 엘리스틴-기반 링커(VPGVGVPGVGGS; 서열번호 22에 나타낸 핵산 서열; 서열번호 23에 나타낸 아미노산 서열), G4S, 2x(G4S), 3x(G4S), 4x(G4S), 5x(G4S), 6x(G4S), 7x(G4S), 8x(G4S), 9x(G4S) 및 10x(G4S)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 VPGVGVPGVGGS, G4S, 2x(G4S) 또는 3x(G4S)이다. 특정 실시형태에서, 링커는 G4S이다.
IL12 변이체는 천연 IL12 단백질에 존재하는 신호 펩티드(각 서브유닛에 대해 하나)를 포함할 수도 있거나 제외할 수도 있다. 일부 실시형태에서, IL12 변이체는 신호 펩티드 중 어느 것도 포함하지 않거나, 이 중 하나, 또는 둘 다를 포함한다. 구체적 실시형태에서, IL12 변이체는 단일 신호 펩티드 - 예를 들어, [IL12(p40-GGGGS-No SP-p35)](서열번호 7에 제시된 핵산 서열; 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열)를 포함하며, 여기서, p40 신호 펩티드는 유지되고, p35 신호 펩티드는 제거된다. 도 3을 참조한다.
이종성 수지상 세포 성장 인자의 예는 사이토카인, C-형 렉틴 및 CD40L을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이종성 수지상 세포 성장 인자는 하기를 포함하는 목록으로부터 선택된 사이토카인(즉, 제2 사이토카인)이다: Fms-관련 티로신 키나제 3 리간드(FLT3L), GMCSF, TNFα, IL36γ 및 IFN. 특정 실시형태에서, 이종성 수지상 세포 성장 인자는 FLT3L이다. muFLT3L을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 9에 열거된다. huFLT3L을 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 1에 열거된다. muFLT3L의 아미노산 서열은 서열번호 10에 열거된다. huFLT3L의 아미노산 서열은 서열번호 2에 열거된다.
일부 실시형태에서, 종양 용해 바이러스는 FLT3L 및 IL12를 암호화하는 핵산(들)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 종양 용해 바이러스는 HSV-1이되, ICP34.5를 암호화하는 바이러스 유전자 및 ICP47을 암호화하는 바이러스 유전자는 결실되고, 종양 용해 바이러스는 암호화 FLT3L 및 IL12를 암호화하는 핵산(들)을 포함한다.
외인성 핵산은 동일한 프로모터 또는 상이한 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 특정 실시형태에서, 이종성 수지상 세포 성장 인자를 암호화하는 핵산 및 제1 이종성 사이토카인을 암호화하는 핵산은 동일한 프로모터의 제어 하에 있다. 단일 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)를 이용하는 것은 동일한 속도 및 동일한 시간에 동일한 감염 세포에서 이종성 수지상 세포 성장 인자와 제1 이종성 사이토카인을 둘 다 생산하는 이점을 갖는다.
적합한 프로모터의 예는 거대세포바이러스(CMV), 라우스 육종 바이러스(RSV), 인간 연장인자 1α 프로모터(EF1a), 유인원 바이러스 40 초기 프로모터(SV40), 포스포글리세린산 키나제 1 프로모터(PGK), 유비퀴틴 C 프로모터(UBC) 및 뮤린 줄기 세포 바이러스(MSCV)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 프로모터는 CMV(서열번호 24에 나타낸 핵산 서열)이다.
동일한 프로모터의 제어 하에 있을 때, 페이로드를 암호화하는 핵산은, 예를 들어, 다시스트론성 번역을 가능하게 하는 추가적인 핵산(다시스트론성 링커 요소)에 의해 연결될 수 있다. 적합한 다시스트론성 링커 요소의 예는 리보솜 진입 부위(예를 들어, 내부 리보솜 진입 부위(IRES)(서열번호 19)), 2A 서열(예를 들어, 돼지 테스코 바이러스 2a(GSG-P2A; 서열번호 17에 열거된 핵산 서열; 서열번호 18에 열거된 아미노산 서열), 토세아 아시그나 바이러스 2A(thosea asigna virus 2A: T2A), 구제역 바이러스 2A(F2A) 및 말 비염 A 바이러스(E2A))를 포함한다. 이러한 서열은 임의의 배향에서 두 핵산을 연결하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 게놈에서 핵산은 [이종성 수지상 세포 성장 인자]-[P2A]-[제1 이종성 사이토카인] 또는 [제1 이종성 사이토카인]-[P2A]-[이종성 수지상 세포 성장 인자]로 배향될 수 있다.
IRES의 사용은 작제물에서 IRES의 제2 핵산 3'의 감소된 생성을 야기한다는 것이 관찰되었다. 예를 들어, [IL12]-[IRES]-[FLT3L] 작제물에서 FLT3L의 생성이 감소된 한편, [FLT3L]-[IRES]-[IL12]에서 IL12의 생성은 감소되었다. 실시예 4를 참조한다. 따라서, 일 실시형태에서, 다시스트론성 링커 요소는 2A이다. 구체적 실시형태에서, 다시스트론성 링커 요소는 P2A이다.
본 발명의 종양 용해 바이러스는 또한 외인성 핵산의 번역(예를 들어, 포유류 번역)을 향상시키는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, KOZAK 서열은 포유류 번역을 향상시키는 것으로 알려져 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 종양 용해 바이러스는 Kozak 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, KOZAK 서열은 공통 Kozak 서열(서열번호 20)이다.
본 발명의 종양 용해 바이러스는 또한 바이러스 발현된 mRNA의 안정성을 향상시키는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열의 예는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 서열(BGHpA) 및 토끼 베타 글로빈(RBGpA), SV40 폴리A(polyA) 및 hGH 폴리A를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 서열은 BGHpA(서열번호 21)이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 변형될 수 있는 다른 종양 용해 바이러스는 RP1(HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/GM-CSF/GALV-GP R(-); RP2(HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/GM-CSF/GALV-GP R(-)/항-CTLA-4 결합제; 및 RP3(HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/GM-CSF/GALV-GP R(-)/항-CTLA-4 결합제/공자극 리간드(예를 들어, CD40L, 4-1BBL, GITRL, OX40L, ICOSL))를 포함한다. 이러한 종양 용해 바이러스에서, GALV(긴팔원숭이 백혈병 바이러스)는 R-펩티드의 특이적 결실에 의해 변형되어, GALV-GP R(-)을 초래한다. 이러한 종양 용해 바이러스는 WO2017118864, WO2017118865, WO2017118866, WO2017118867 및 WO2018127713A1에서 논의되며, 이들 각각은 이들의 전문이 참조에 의해 포함된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형될 수 있는 종양 용해 바이러스의 추가적인 예는 NSC-733972, HF-10, BV-2711, JX-594, Myb34.5, AE-618, Brainwel™ 및 Heapwel™, Cavatak®(콕사키바이러스, CVA21), HF-10, Seprehvir®, Reolysin®, 에나데노툭시레브, ONCR-177, 및 USP 10,105,404, WO2018006005, WO2018026872A1 및 WO2017181420에 기재되어 있는 것을 포함하며, 이들 각각은 이들의 전문이 참조에 의해 포함된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 변형될 수 있는 종양 용해 바이러스의 추가적인 예는 하기를 포함한다:
ICP 34.5 유전자인 HSV 신경병독성의 주요 결정인자의 복제물 둘 다의 결실, 및 감염-세포 단백질 6(ICP6)을 암호화하는 UL39에서의 이콜라이(E. coli) lacZ 유전자의 비활성화 삽입을 갖는, 야생형 HSV-1 균주로부터 유래된 종양 용해 HSV-1인 G207, 문헌[Mineta et al. (1995) Nat Med. 1:938-943]을 참조한다.
γ34.5 및 ICP47 유전자의 복제물 둘 다의 결실, 및 ICP6 유전자의 차단 및 인간 GM-CSF 유전자의 삽입을 갖는 단순 포진 바이러스인 OrienX010, 문헌[Liu et al., (2013) World Journal of Gastroenterology 19(31):5138-5143]을 참조한다.
ICP34.5, UL24 및 UL56.34,35의 하나의 복제물을 포함하는, 긴(L) 및 짧은(S) 영역의 연결 영역을 갖는 단순 포진 바이러스인 NV1020은 결실된다. 결실된 영역은 HSV-2 US DNA의 단편(US2, US3(PK), gJ 및 gG)에 의해 대체되고, 문헌[Todo, et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA. 98:6396-6401]을 참조한다.
ICP34.5 유전자의 복제물 둘 다의 결실 및 인터류킨 12의 삽입을 갖는 단순 포진 바이러스인 M032, 문헌[Cassady and Ness Parker, (2010) The Open Virology Journal 4:103-108]을 참조한다.
ImmunoVEX HSV2는 vhs, ICP47, ICP34.5, UL43 및 US5를 암호화하는 유전자의 기능성 결실을 갖는 단순 포진 바이러스(HSV-2)이다.
OncoVEXGALV/CD는 기능성으로 결실된 ICP34.5 및 ICP47을 암호화하는 유전자 및 ICP34.5 유전자 대신에 바이러스 게놈으로 삽입된 긴팔원숭이 백혈병 융합생성 당단백질 및 사이토신 데아미나제를 암호화하는 유전자를 가지는 HSV-1 균주 JS1로부터 또한 유래된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 종양 용해 바이러스는 HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12이다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 종양 용해 바이러스는 HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12이되, 상기 바이러스는 수탁번호 01010209 하에 유럽 세포 배양 컬렉션(ECAAC)에 기탁된 HSV-1 균주 JS1로부터 유래된다.
다른 제제와의 병용
본 발명의 종양 용해 바이러스는 암과 같은 질환의 치료를 위한 단일 제제로서 사용될 수 있다. 종양 용해 바이러스는 일반적으로 바람직한 안전성 프로파일에 의해 안전한 것으로 발견되었다. 따라서, 본 발명의 종양 용해 바이러스는 안전성 프로파일에 대한 유의미한 부정적 기여 없이 다른 제제와 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 종양 용해 바이러스(예를 들어, HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)는 면역 관문 저해제, 면역 사이토카인, 공자극 분자의 작용제, 표적화된 요법뿐만 아니라 표준 치료 요법과 병용하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 종양 용해 바이러스(예를 들어, HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)는 표적화된 암 요법(예를 들어, MEK 저해제, 예컨대, 콤비메티닙, 트라메티닙 및 비니메티닙) 및/또는 사이토카인(예를 들어, 페길화된 IL2(예를 들어, 벰페갈데슬루킨(bempegaldesleukin)) 또는 페길화된 IL10(예를 들어, 페길로데카킨(pegilodecakin)))과 병용하여 사용될 수 있다.
관문 저해제
면역 관문은 일부 유형의 면역계 세포, 예컨대, T 세포(세포-매개 면역에서 중요한 역할을 함)를 조절하는 단백질이다. 면역 관문이 확인 시 면역 반응을 유지하는 데 도움을 주지만, 이들은 또한 T 세포가 암세포를 사멸시키는 것을 유지할 수 있다. 면역 관문 저해제(또는 간단하게 "관문 저해제")는 면역 관문 단백질 활성을 차단하여, 면역계에서 "제동(brake)"을 풀고, T 세포가 암세포를 더 양호하게 사멸시키는 것을 가능하게 할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "면역 관문 저해제" 또는 "관문 저해제"는 하나 이상의 관문 단백질을 완전히 또는 부분적으로 감소시키거나 저해하거나 방해하거나 조절하는 분자를 의미한다. 관문 단백질은 T 세포 활성화 또는 기능을 조절한다. 수많은 관문 단백질, 예컨대, CTLA-4 및 이의 리간드 CD80 및 CD86; 및 PD-1과 이의 리간드 PD-L1 및 PD-L2는 공지되어 있다(Pardoll, Nature Reviews Cancer 12: 252-264, 2012). 이 단백질은 T 세포 반응의 동시자극 또는 저해 상호작용을 담당한다. 면역 관문 단백질은 생리학적 면역 반응의 자가 관용 및 기간 및 폭을 조절하고 유지시킨다. 면역 관문 저해제는 항체를 포함하거나 항체로부터 유래할 수 있다.
관문 저해제는 소분자 저해제를 포함할 수 있거나, 면역 관문 수용체에 결합하고 이를 차단 또는 저해하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 면역 관문 수용체 리간드에 결합하고 이를 차단 또는 저해하는 항체를 포함할 수 있다. 차단 또는 저해를 위해 표적화될 수 있는 예시적인 관문 분자는 CTLA-4, PD-L1, PD-L2, PD-1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, GAL9, LAG3, TIM3, VISTA, KIR, 2B4(분자의 CD2 패밀리에 속하고, 모든 NK, γδ, 및 기억 CD8+(αβ) T 세포 상에서 발현됨), CD160(또한 BY55로서 지칭됨), CGEN-15049, CHK 1 및 CHK2 키나제, A2aR 및 다양한 B-7 패밀리 리간드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. B7 패밀리 리간드는 B7-1, B7-2, B7-DC, B7-H1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H5, B7-H6 및 B7-H7을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 관문 저해제는 CTLA-4, PD-L1, PD-L2, PD-1, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD 160 및 CGEN-15049 중 하나 이상에 결합하고, 이의 활성을 차단 또는 저해하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 다른 결합 단백질, 생물학적 치료제 또는 소분자를 포함한다.
세포독성 T-림프구-결합 단백질 4(CTLA-4)는 T-세포 활성화의 경로를 하향조절하는 면역관문 분자이다. CTLA-4는 T-세포 활성화의 음성 조절제이다. CTLA-4의 차단은 T-세포 활성화 및 증식을 증가시키는 것으로 나타났다. 단순 포진 바이러스와 항-CTLA-4 항체의 조합은 종양 내 바이러스의 용해 복제 후에 방출된 종양 항원에 대한 항-종양 면역 반응을 증가시키기 위해 두 상이한 메커니즘을 통해 T-세포 활성화를 향상시키는 것으로 의도된다. 따라서, 단순 포진 바이러스와 항-CTLA-4 항체의 조합은 주사 및 비주사/원위 종양의 파괴를 향상시키고, 전반적 종양 반응을 개선시키며, 전반적 생존을 연장시킬 수 있으며, 특히, 전반적 생존의 연장은 항-CTLA-4 항체 단독을 이용하여 얻은 것과 비교된다.
세포 예정사 단백질 1(PD-1)은 T 세포 및 프로-B 세포 상에서 발현되는 288개의 아미노산 세포 표면 단백질 분자이며, 이들의 운명/분화에서 어떤 역할을 한다. PD-1의 두 리간드, 즉, PD-L1 및 PD-L2는 B7 패밀리의 구성원이다. PD-1은 감염에 대한 염증 반응 시 말초 조직에서 T 세포 활성을 제한하며, 시험관내 자가면역 PD-1 차단을 제한하는 것은 특정 항원 표적에 의한 공격에 반응하여 또는 혼합 림프구 반응에서 동종이계 세포에 의해 T-세포 증식 및 사이토카인 생성을 향상시킨다. PD-1 발현과 반응 사이의 강한 상관관계는 PD-1의 차단에 의해 나타났다(Pardoll, Nature Reviews Cancer, 12: 252-264, 2012). PD-1 차단은 PD-1 또는 PD-L1에 결합하는 항체를 포함하는 다양한 메커니즘에 의해 달성될 수 있다.
분화 274(CD274) 또는 B7 상동체 1(B7-H1)의 클러스터로도 지칭되는 예정사-리간드 1(PD-L1)은 또한 CD274 유전자에 의해 암호화된 단백질이다. 문헌[Entrez Gene: CD274 CD274 molecule] 참조. 면역계를 억제하는 데 어떤 역할을 하는 40 kDa의 1형 막관통 단백질인 PD-L1은 활성화된 T 세포, B 세포 및 골수성 세포 상에서 발견된 이의 수용체(PD-1)에 결합하여, 세포 활성화 또는 저해를 조절한다. 문헌[Chemnitz et al., Journal of Immunology, 173 (2):945-54 (2004)] 참조.
다른 면역-관문 저해제는 림프구 활성화 유전자-3(LAG-3) 저해제, 예컨대, IMP321, 가용성 Ig 융합 단백질을 포함한다(Brignone et al., 2007, J. Immunol. 179:4202-4211). 또한 B7 저해제, 예컨대, B7-H3 및 B7-H4 저해제(예를 들어, 항-B7-H3 항체 MGA271이 포함된다(Loo et al., 2012, Clin. Cancer Res. July 15 (18) 3834). 다른 관문 저해제는 TIM3(T-세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3)이다(문헌[Fourcade et al., 2010, J. Exp. Med. 207:2175-86] 및 문헌[Sakuishi et al., 2010, J. Exp. Med. 207:2187-94]).
본 명세서에서 추가로 기재되는 바와 같이, 일 양상에서, 본 발명은 암 치료를 위한 종양 용해 바이러스와 관문 저해제의 조합물의 용도에 관한 것이다. 다른 양상에서, 본 발명은 종양 용해 바이러스와 관문 저해제의 조합물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 일 양상에서, 관문 저해제는 CTLA-4, PD-1, PD-L1 또는 PD-L2의 차단제 또는 저해제이다. 일부 실시형태에서, 관문 저해제는 CTLA-4의 차단제 또는 저해제, 예컨대, 트레멜리무맙, 이필리무맙(10D1, MDX-D010으로도 알려짐), BMS-986249, AGEN-1884, 및 미국 특허 제5,811,097호; 제5,811,097호; 제5,855,887호; 제6,051,227호; 제6,207,157호; 제6,682,736호; 제6,984,720호; 및 제7,605,238호에 기재되어 있는 항-CTLA-4 항체이며, 이들 각각은 본 명세서에 참조에 의해 포함된다. 일부 실시형태에서, 관문 저해제는 PD-L1 또는 PD-1의 차단제 또는 저해제(예를 들어, PD-L1 및/또는 PD-L2 저해제와의 PD-1 상호작용을 저해하는 분자)이며, 예컨대, 펨브롤리주맙(항-PD-1 항체), 니볼루맙(항-PD-1 항체), CT-011(항-PD-1 항체), CX-072(항-PD-L1 항체), IO-103(항-PD-L1), BGB-A333(항-PD-L1), WBP-3155(항-PD-L1), MDX-1105(항-PD-L1), LY-3300054(항-PD-L1), KN-035(항-PD-L1), FAZ-053(항-PD-L1), CK-301(항-PD-L1), AK-106(항-PD-L1), M-7824(항-PD-L1), CA-170(항-PD-L1), CS-1001(항-PD-L1 항체); SHR-1316(항-PD-L1 항체); BMS 936558(항-PD-1 항체), BMS- 936559(항-PD-1 항체), 아테졸리주맙(항-PD-L1 항체), AMP 224(PD-L2/PD-1 상호작용을 차단하도록 설계된 PD-L2의 세포외 도메인과 IgGl 항체의 융합 단백질), MEDI4736(두발루맙; 항 PD-L1 항체), MSB0010718C(항-PD-L1 항체), 및 미국 특허 제7,488,802호; 제7,943,743호; 제8,008,449호; 제8,168,757호; 제8,217,149호 및 PCT 공개 특허 출원 번호 W003042402, WO2008156712, W02010089411, W02010036959, WO2011066342, WO2011159877, WO2011082400 및 WO2011161699에 기재되어 있는 것을 포함하며, 이들 각각은 본 명세서에 참조에 의해 포함된다. 추가적인 항-PD-1 항체는 PDR-001; SHR-1210; BGB-A317; BCD-100; JNJ-63723283; PF-06801591; BI-754091; JS-001; AGEN-2034; MGD-013; LZM-009; GLS-010; MGA-012; AK-103; 게놀림주맙(genolimzumab); 도스탈리맙(dostarlimab); 세미플리맙(cemiplimab); IBI-308; 캄렐리주맙(camrelizumab); AMP-514; TSR-042; Sym-021; HX-008; 및 ABBV-368을 포함한다.
BMS 936558은 PD-1을 표적화하는 완전 인간 IgG4 단클론성 항체이다. I상 시험에서, 진행된, 치료-난치성 악성종양을 갖는 대상체에서의 BMS-936558의 2주마다의 투여는 지속 가능한 부분적 또는 완전한 퇴행을 나타내었다. 흑색종(28%) 및 신세포 암종(27%)을 갖는 대상체에서 가장 유의미한 반응률이 관찰되었지만, 비-소세포 폐암(NSCLC)을 갖는 대상체에서 실질적인 임상 활성이 또한 관찰되었고, 일부 반응은 1년 초과 동안 지속되었다.
BMS 936559는 PD-1 리간드 PD-L1을 표적화하는 완전 인간 IgG4 단클론성 항체이다. I상 결과는 2주마다 이 약물의 투여가 특히 흑색종을 갖는 대상체에서 지속 가능한 반응을 야기한다는 것을 나타내었다. 객관적 반응률은 진행된 병기의 NSCLC, 흑색종, RCC, 또는 난소암을 갖는 대상체에서의 암 유형에 따라 6% 내지 17%의 범위였고, 일부 대상체는 1년 이상 지속되는 반응을 경험하였다.
AMP 224는 제2 PD-1 리간드, PD-L2 및 IgGl의 세포외 도메인의 융합 단백질이며, 이는 PD-L2/PD-1 상호작용을 차단하는 잠재력을 가진다. AMP-224는 현재 진행된 암을 갖는 대상체에서 단일요법으로서 I상 시험을 받고 있다.
MEDI4736은 이런 용량-상승 연구에서 허용 가능한 안전성 프로파일 및 지속 가능한 임상 활성이 입증된 항-PD-L1 항체이다. 단일요법으로서 그리고 병용에서 MEDI4736의 다중 암에서의 확장 및 개발이 진행 중에 있다.
질환 또는 장애를 치료하는 방법
본 발명은 또한 종양 용해 바이러스(예를 들어, HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)를 이용하는 질환 또는 장애, 예컨대, 암의 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 종양 용해 바이러스(예를 들어, HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)는 임의의 주사 가능한 암(즉, 유도(guidance)(예를 들어, 시각적 또는 초음파 유도)에 따라 또는 유도 없이, 예를 들어, 바늘로 주사될 수 있는 임의의 종양)을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 B-세포 림프종(예를 들어, 미만성 거대 B-세포 림프종), 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 기저세포 암종, 피부 편평세포암종, 직장결장암, 흑색종(예를 들어, 포도막 흑색종), 두경부 편평암, 간세포암, 위암, 육종(예를 들어, 연조직 육종, 유잉 육종, 골육종 또는 횡문근육종), 위식도암, 신세포 암종, 교모세포종, 췌장암, 방광암, 전립선암, 유방암(예를 들어, 삼중 음성 유방 암종), 피부 T-세포 림프종, 머켈세포 암종 또는 다발성 골수종이다.
용어 "전이성 암"은 암이 시작된 신체의 부분(즉, 원발 부위)에서 신체의 다른 부분으로 확산된 암을 지칭한다. 암이 새로운 영역으로 확산되었을 때(즉, 전이되었을 때), 이것이 시작된 신체 부분 명칭을 따서 명명되었다. 예를 들어, 췌장으로 확산된 결장암은 췌장암과 반대로 "췌장까지의 전이성 결장암"으로서 지칭된다. 치료는 또한 암이 유래된 곳에 기반한다. 결장암이 뼈로 확산된다면, 이는 여전히 결장암이며, 관련 의사는 전이성 결장암과 싸우는 것으로 나타난 치료를 권장할 것이다.
본 발명은 또한 상기 논의한 것과 같은 암 치료를 위한 종양 용해 바이러스(예를 들어, HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)와 기타 제제(예를 들어, 관문 저해제)의 조합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한: (i) 치료적 유효량의 종양 용해 바이러스(예를 들어, HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12); 및 (ii) 치료적 유효량의 다른 제제(예를 들어, 관문 저해제)를 투여함으로써 질환 또는 장애, 예컨대, 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 종양 용해 바이러스(예를 들어, HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)와 항-PD-1 항체, 종양 용해 바이러스(예를 들어, HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)와 항-PD-L1 항체, 또는 종양 용해 바이러스(예를 들어, HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)와 항-CTLA-4 항체의 조합물에 관한 것이다. 구체적 실시형태에서, 종양 용해 바이러스는 HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12이다.
다른 예에서, 암은 환자에서 원발성 종양(즉, 종양 진행이 시작되고 진행되어 암 덩어리를 수득하는 해부학적 부위에서 성장하는 종양)과 2차 종양 또는 전이(즉, 원발성 부위로부터 신체의 다른 부분까지의 종양의 확산) 둘 다로서 존재한다. 본 발명의 종양 용해 바이러스는 용해 효과 및 전신 면역 효과를 통해 종양을 치료하는 데 효능이 있을 수 있다. 예를 들어, HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12는 종양 세포를 물리적으로 용해시켜 원발성 종양 세포사 및 종양-유래 항원의 방출을 야기하고, 이는 이어서, 면역계에 의해 인식된다. 또한, HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12의 복제는 면역계가 원발성 및 2차 종양/전이를 (국소와 전신 둘 다로) 둘 다 인식하고 공격할 수 있도록 항-종양 면역 반응의 장착 및 유지에 도움을 주는 FLT3L 및 IL12의 생성을 초래한다. 따라서, 본 발명은 원발성 종양, 전이(즉, 2차 종양)의 치료, 또는 단독으로 또는 제2 제제(예를 들어, 관문 저해제)와 병용한 종양 용해 바이러스(예를 들어, HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)에 의한 치료를 상정한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 치료 방법 또는 용도는 표적화된 암 요법, 예를 들어, MEK 저해제, 예컨대, 콤비메티닙, 트라메티닙, 및 비니메티닙과의 병용 치료를 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 치료 방법 또는 용도는 사이토카인, 예컨대, 페길화된 IL2(예를 들어, 벰페갈데슬루킨) 또는 페길화된 IL10(예를 들어, 페길로데카킨)에 의한 치료를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 치료 방법 또는 용도는 표적화된 요법 및 면역 조절제와 병용한 치료를 포함한다.
본 발명의 방법은 몇몇 상이한 병기의 암을 치료하는 데 사용될 수 있다. 대부분의 병기 시스템은 암이 근처의 림프절까지 확산되었는지의 여부에 관한 정보를 포함하며, 신체에서 종양이 위치된 곳, 세포 유형(예를 들어, 편평세포암종), 암이 신체의 상이한 부분으로 확산되었는지의 여부, 종양의 크기, 및 종양의 등급(즉, 종양이 성장하고 확산될 가능성의 세포 이상 수준)을 포함한다. 예를 들어, 0기는 근처 조직까지 확산되지 않는 비정상 세포 - 즉, 암이 될 수 있는 세포의 존재를 지칭한다. I기, II기 및 III기 암은 암의 존재를 지칭한다. 병기가 높을수록, 종양의 크기는 크며, 근처 조직까지 더 많이 확산된다. IV기 암은 신체의 원위 부분까지 확산된 암이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 전이성 암을 치료하는 데 사용될 수 있다.
약제학적 조성물
본 발명은 또한 종양 용해 바이러스(예를 들어, HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)를 포함하거나, 종양 용해 바이러스(예를 들어, HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)와 관문 저해제, 표적화된 암 요법 및/또는 다른 면역 조절제의 조합물을 포함하는, 약제학적 조성물에 관한 것이다. 약제학적 조성물은 예를 들어 조성물의 pH, 삼투도, 점도, 선명도, 색상, 등장성, 냄새, 무균성, 안정성, 용해 속도 또는 방출 속도, 흡착 또는 침투를 변형, 유지 또는 보존하기 위한 제형 물질을 함유할 수 있다. 약제학적 활성제는, 예를 들어, 경구 또는 비경구로, 예컨대, 정맥내, 근육내, 피하, 안와내, 피막내, 복강내, 직장내, 수조내, 종양내, 혈관내, 진피내를 포함하는 다양한 경로에 의해, 또는 수동으로 환자에게 투여될 수 있거나, 또는, 예를 들어, 피부 패치 또는 경피 이온도입법을 각각 이용하여 피부를 통해 흡수가 용이하게 될 수 있다. 일 실시형태에서, 종양 용해 바이러스(예를 들어, HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)는 종양내로(즉, 종양내 주사를 통해) 주사된다. 다른 실시형태에서, 관문 저해제(예를 들어, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 또는 항-CTLA-4 항체)는 전신으로(예를 들어, 정맥내로) 투여된다. 다른 실시형태에서, 표적화된 요법(예를 들어, MEK 소분자 키나제 저해제, 예컨대, 콤비메티닙, 트라메티닙 또는 비니메티닙)은 경구 경로를 통해 전신으로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 사이토카인, 예컨대, 페길화된 IL2(예를 들어, 벰페갈데슬루킨) 또는 페길화된 IL10(예를 들어, 페길로데카킨)은 전신으로 투여된다.
당업자는 본 개시내용의 임의의 양상에 따른 치료의 투약량 및 지속기간을 결정할 수 있을 것이다. 예를 들어, 당업자는 치료가 시작되거나, 계속되거나, 중단되거나 재개되는지의 여부를 결정하기 위해 환자를 모니터링할 수 있다. 특정 환자에 대한 유효량은 치료 중인 병태, 환자의 전반적 건강 및 투여 방법, 경로 및 용량과 같은 인자에 따라 다를 수 있다. 당업계에 공지된 파라미터를 이용하여 임상의는 적절한 용량을 결정한다. 치료적으로 사용될 유효량의 약제학적 조성물은, 예를 들어, 치료 내용 및 목적에 따를 것이다. 따라서 당업자는 치료를 위한 적절한 투약량 수준이, 부분적으로, 전달되는 분자, 결합제 분자가 사용되고 있는 적응증, 투여 경로, 및 환자의 크기(체중, 체표면 또는 기관 크기) 및/또는 병태(연령 및 일반적 건강상태)에 따라 다를 것임을 인식할 것이다. 따라서, 임상의는 투약량을 적정할 수 있고, 최적의 치료 효과를 얻기 위해 투여 경로를 변경시킬 수 있다.
임상 연구는 종양 용해 바이러스가 눈에 보이고, 만질 수 있거나, 초음파-유도에 의해 주사될 수 있는 피부, 피하 또는 결절 병변에 직접 주사될 수 있다는 것을 입증하였다. 따라서, 일 양상에서, HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12를 포함하는 약제학적 조성물은 병변내 주사를 통해 투여된다. 일부 실시형태에서, HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12는 고정된 투약 농도로 1 ㎖ 일회용 바이알에 제공된다: 초회 투약을 위해 106 pfu/㎖ 그리고 후속 투약을 위해 108 pfu/㎖. 주사되는 용적은 종양 유형에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12는 1주 중 1일에 106 플라크 형성 단위/㎖(PFU/㎖)의 4.0 ㎖ 이하의 용량, 이어서 4주 중 1일에 108 PFU/㎖의 4.0 ㎖ 이하의 용량에서, 및 이후 2주(±3일)마다 주사용 피부, 경피 및 결절 종양으로 종양내 주사에 의해 투여된다. 다른 실시형태에서, HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12은 1주 중 1일에 106개의 플라크 형성 단위/㎖(PFU/㎖)의 4.0 ㎖ 이하의 용량, 이어서 4주 중 1일에 107 PFU/㎖의 4.0 ㎖ 이하의 용량에서, 및 이후 2주(±3일)마다 주사용 피부, 경피 및 결절 종양으로 종양내 주사에 의해 투여된다.
본 발명의 조성물은 생리적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 1가지 이상의 추가적인 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 완충제, 항산화제, 예컨대, 아스코르브산, 저분자량 폴리펩티드(예를 들어, 10개 미만의 아미노산을 가짐), 단백질, 아미노산, 탄수화물, 예컨대, 글루코스, 수크로스 또는 덱스트린, 킬레이트제, 예컨대, EDTA, 글루타티온, 안정제 및 부형제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 허용 가능한 희석제는, 예를 들어, 중성 완충 식염수 또는 특정 혈청 알부민과 혼합된 식염수를 포함한다. 보존제, 예컨대, 벤질 알코올이 또한 첨가될 수 있다. 조성물은 희석제로서 적절한 부형제 용액(예를 들어, 수크로스)을 이용하여 동결건조물로서 제형화될 수 있다.
특정 실시형태에서, 관문 저해제는 0.01 ㎎/㎏, 0.05 ㎎/㎏, 0.1 ㎎/㎏, 0.2 ㎎/㎏, 0.3 ㎎/㎏, 0.5 ㎎/㎏, 0.7 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏, 2 ㎎/㎏, 3 ㎎/㎏, 4 ㎎/㎏, 5 ㎎/㎏, 6 ㎎/㎏, 7 ㎎/㎏, 8 ㎎/㎏, 9 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏, 또는 이들의 임의의 조합 용량으로 투여된다. 특정 실시형태에서, 관문 저해제는 1주 1회, 1주 2회, 1주 3회, 2주마다 1회, 또는 1개월마다 1회 투여된다. 특정 실시형태에서, 관문 저해제는 단일 용량으로서, 2회 용량으로, 3회 용량으로, 4회 용량으로, 5회 용량으로, 또는 6회 이상의 용량으로 투여된다.
특정 실시형태에서, 항-PD-1 항체는 약 1 내지 30 ㎎/㎏, 예를 들어, 약 5 내지 25 ㎎/㎏, 약 10 내지 20 ㎎/㎏, 약 1 내지 5 ㎎/㎏, 또는 약 3 ㎎/㎏의 용량으로 주사에 의해(예를 들어, 피하로 또는 정맥내로) 투여된다. 투약 스케줄은, 예를 들어, 1주 1회 내지 2, 3 또는 4주마다 1회로 다를 수 있다. 일 실시형태에서, 항-PD-1 항체는 격주마다 약 10 내지 20 ㎎/㎏의 용량으로 투여된다.
일 실시형태에서, 항-PD-1 항체 분자, 예를 들어, 니볼루맙은 2주마다 약 1 ㎎/㎏ 내지 3 ㎎/㎏, 예를 들어, 약 1 ㎎/㎏, 2 ㎎/㎏ 또는 3 ㎎/㎏의 용량으로 정맥내로 투여된다. 일 실시형태에서, 항-PD-1 항체 분자, 예를 들어, 니볼루맙은 3주 간격으로 약 2 ㎎/㎏의 용량으로 정맥내로 투여된다. 일 실시형태에서, 니볼루맙은 약 1 ㎎/㎏ 내지 5 ㎎/㎏, 예를 들어, 3 ㎎/㎏의 양으로 투여되고, 60분의 기간에 걸쳐, 1주에 약 1회 내지 2, 3 또는 4주마다 1회로 투여될 수 있다.
일 실시형태에서, 항-PD-1 항체 분자, 예를 들어, 펨브롤리주맙은 3주마다 약 1 ㎎/㎏ 내지 3 ㎎/㎏, 예를 들어, 약 1 ㎎/㎏, 2 ㎎/㎏ 또는 3 ㎎/㎏의 용량으로 정맥내로 투여된다. 일 실시형태에서, 항-PD-1 항체 분자, 예를 들어, 펨브롤리주맙은 3주 간격으로 약 2 ㎎/㎏의 용량으로 정맥내로 투여된다. 다른 실시형태에서, 항-PD-1 항체 분자, 예를 들어, 펨브롤리주맙은 3주마다 약 100 ㎎/㎏ 내지 300 ㎎/㎏, 예를 들어, 약 100 ㎎/㎏, 200 ㎎/㎏ 또는 300 ㎎/㎏의 용량으로 정맥내로 투여된다. 일 실시형태에서, 항-PD-1 항체 분자, 예를 들어, 펨브롤리주맙은 3주 간격으로 약 200 ㎎/㎏의 용량으로 정맥내로 투여된다.
특정 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체(예를 들어, 이필리무맙)는 최대 4회 용량 동안 약 3 ㎎/㎏ IV Q3W; 최대 4회 용량 동안 약 3 ㎎/㎏ IV Q6W; 최대 4회 용량 동안 약 3 ㎎/㎏ IV Q12W; 최대 4회 용량 동안 약 10 ㎎/㎏ IV Q3W; 또는 최대 4회 용량 동안 약 10 ㎎/㎏ IV Q12W의 용량으로 주사에 의해(예를 들어, 피하로 또는 정맥내로) 투여된다. 특정 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체(예를 들어, 트레멜리무맙)는 3개월마다 약 10 ㎎/㎏ Q4W; 또는 약 15 ㎎/㎏의 용량으로 주사에 의해(예를 들어, 피하로 또는 정맥내로) 투여된다.
특정 실시형태에서, 항-PD-L1 항체(예를 들어, 아테졸리주맙)는 질환 진행 또는 허용 가능하지 않은 독성까지 약 1200 ㎎ IV Q3W의 용량으로 주사에 의해 (예를 들어, 피하로 또는 정맥내로) 투여된다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 임의의 주사 가능한 암 치료 방법에서 사용하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 암은 B-세포 림프종(예를 들어, 미만성 거대 B-세포 림프종), 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 기저세포 암종, 피부 편평세포암종, 직장결장암, 흑색종(예를 들어, 포도막 흑색종), 두경부 편평암, 간세포암, 위암, 육종(예를 들어, 연조직 육종, 유잉 육종, 골육종 또는 횡문근육종), 위식도암, 신세포 암종, 교모세포종, 췌장암, 방광암, 전립선암, 유방암(예를 들어, 삼중 음성 유방 암종), 피부 T-세포 림프종, 머켈세포 암종 또는 다발성 골수종이되, 약제학적 조성물은 종양 용해 바이러스(예를 들어, HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12), 또는 종양 용해 바이러스(예를 들어, HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12) 및 제2 제제(예를 들어, 관문 저해제)를 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 B-세포 림프종(예를 들어, 미만성 거대 B-세포 림프종), 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 기저세포 암종, 피부 편평세포암종, 직장결장암, 흑색종(예를 들어, 포도막 흑색종), 두경부 편평암, 간세포암, 위암, 육종(예를 들어, 연조직 육종, 유잉 육종, 골육종 또는 횡문근육종), 위식도암, 신세포 암종, 교모세포종, 췌장암, 방광암, 전립선암, 유방암(예를 들어, 삼중 음성 유방 암종), 피부 T-세포 림프종, 머켈세포 암종 또는 다발성 골수종을 치료하는 데 사용하기 위한 치료적 유효량의 종양 용해 바이러스(예를 들어, HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)에 관한 것이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 B-세포 림프종(예를 들어, 미만성 거대 B-세포 림프종), 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 기저세포 암종, 피부 편평세포암종, 직장결장암, 흑색종(예를 들어, 포도막 흑색종), 두경부 편평암, 간세포암, 위암, 육종(예를 들어, 연조직 육종, 유잉 육종, 골육종, 또는 횡문근육종), 위식도암, 신세포 암종, 교모세포종, 췌장암, 방광암, 전립선암, 유방암(예를 들어, 삼중 음성 유방 암종), 피부 T-세포 림프종, 머켈세포 암종 또는 다발성 골수종을 치료하는 데 사용하기 위한 치료적 유효량의 종양 용해 바이러스(예를 들어, HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12) 및 제2 제제(예를 들어, 관문 저해제)에 관한 것이다.
키트
다른 양상에서, 본 발명은 [1] 선택적으로 제2 제제(예를 들어, 관문 저해제)와 조합된 종양 용해 바이러스(예를 들어, HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12); 및 [2] 환자에 대한 투여를 위한 지침을 포함하는, 키트에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명의 키트는 암을 갖는 환자를 치료하기 위해 종양 용해 바이러스(예를 들어, HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12) 및 지침(예를 들어, 포장 삽입물 또는 라벨 내)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 전이성 암이다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 키트는 암을 갖는 환자를 치료하기 위해 종양 용해 바이러스(예를 들어, HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12), 관문 저해제(예를 들어, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 또는 항-CTLA-4 항체), 및 지침(예를 들어, 포장 삽입물 또는 라벨 내)을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제2 제제는 표적화된 암 요법(예를 들어, MEK 저해제, 예컨대, 콤비메티닙, 트라메티닙 및 비니메티닙) 또는 사이토카인(예를 들어, 페길화된 IL2(예를 들어, 벰페갈데슬루킨) 또는 페길화된 IL10(예를 들어, 페길로데카킨))이다.
일부 실시형태에서, HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12를 포함하는 키트는 제1주의 제1일에 최대 4.0 ㎖의 106 PFU/㎖의 용량, 다음에, 제4주의 제1일에 최대 4.0 ㎖의 108 PFU/㎖의 용량, 및 이후에 2주마다(예를 들어, 완전한 반응까지) 종양내 주사에 의해 투여를 위한 지침(예를 들어, 포장 삽입물 또는 라벨 내)을 포함한다. 일부 실시형태에서, HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12를 포함하는 키트는 제1주의 제1일에 최대 4.0 ㎖의 106 PFU/㎖의 용량, 다음에, 제4주의 제1일에 최대 4.0 ㎖의 107 PFU/㎖의 용량, 및 이후에 2주마다(예를 들어, 완전한 반응까지) 종양내 주사에 의해 투여를 위한 지침(예를 들어, 포장 삽입물 또는 라벨 내)을 포함한다.
키트가 항-PD-1 항체를 포함하는 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 기재된 용량에서의 정맥내 투여를 위한 지침(예를 들어, 포장 삽입물 또는 라벨 내)을 포함한다. 항-PD-1 항체의 예는, 펨브롤리주맙 및 니볼루맙을 포함한다.
키트가 항-PD-L1 항체를 포함하는 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 기재된 용량에서의 정맥내 투여를 위한 지침(예를 들어, 포장 삽입물 또는 라벨 내)을 포함한다. 항-PD-L1 항체의 예는, 아테졸리주맙을 포함한다.
키트가 항-CTLA-4 항체를 포함하는 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 기재된 용량에서의 정맥내 투여를 위한 지침(예를 들어, 포장 삽입물 또는 라벨 내)을 포함한다. 항-CTLA-4 항체의 예는, 이필리무맙을 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 키트의 제조 방법이 제공된다.
실시예
다음의 실시예는 본 발명의 구체적 실시형태 또는 특징을 예시하는 목적을 위해 제공하며, 이의 범주를 제한하는 것으로 보지 않는다.
실시예 1: 5' 위치에서 p40 서브유닛 및 3' 위치에서 p35 서브유닛을 갖는 단일 쇄 단백질로서 생성되고 단일 G4S 링커를 통해 연결된 인터류킨-12(IL12)는 시험관내 및 생체내에서 활성이다
특정 조작 기준을 이용하여 조작된 단일 쇄 IL12 분자는 사이토카인의 최적의 발현 및 활성을 초래한다.
IL12의 결정 구조(PDB ID 3HMX)를 분석함으로써 p40 및 p35 서브유닛의 최적의 IL12의 입체배치를 평가하였다. 서브유닛이 조립체에 대해 근위이기 때문에 단일 쇄 단백질은 보다 높은 정도의 이형이량체화 효율을 갖는 것으로 예상된다. p40-p35 배향(도 1A; 파선)은 C- 및 N-말단의 연결 지점에 근접하기 때문에 p35-p40 배향 이상으로 구조적으로 바람직하다. 이는 대략 36 옹스트롬 갭에 걸쳐 있는 링커(p40의 카복시 말단 단부를 p35의 아미노산 개시 단부와 연결)를 야기한다. 대조적으로, p35-p40 펩티드의 생성은 보다 긴 링커가 필요하고 더 바람직한 대략 60 옹스트롬 갭을 초래한다.
p40과 p35 서브유닛 사이의 링커를 모델링하기 위해, IL12의 결정 구조(PDB 3HMX)의 p40 및 p35 서브유닛은 RosettaScripts에서 0.5 Å 좌표 제약을 갖는 FastRelax를 이용하여 준비하였다(S. J. Fleishman, A. Leaver-Fay, J. E. Corn, E.-M. Strauch, S. D. Khare, N. Koga, J. Ashworth, P. Murphy, F. Richter, G. Lemmon, J. Meiler and D. Baker. RosettaScripts: A Scripting Language Interface to the Rosetta Macromolecular Modeling Suite. PLoS ONE. 2011, 6, 6, e20161). 얻어진 PDB 파일을 배향 p40-p35를 갖는 단일 쇄에 연관시키고, 이어서, Rosetta Remodel을 사용하여 두 도메인 사이에 다음의 링커를 모델링하였다: 앞서 기재한 엘리스틴-기반 링커(VPGVGVPGVGGS), G4S(도 1B), 2x(G4S)(도 1C), 3x(G4S), 및 링커 없음. 해결되지 않은 p40의 C-말단 잔기(S340) 및 성숙 p35의 처음 11개의 잔기(RNLPVATPDPG)를 Remodel 실행에 포함시켰다. 해결되지 않은 잔기를 결여하는 대조군을 또한 실행하였다. 루프 모델링 시뮬레이션을 이용하여 계산한 루프 폐쇄율이 링커가 혼입되었을 때 유의미하게 개선되었기 때문에 링커가 필요할 것으로 예상하였다. 각 링커에 대해, 샘플링을 위해 루프 단편으로부터의 단편 삽입 및 루프 폐쇄를 위해 CCD-기반 역운동학(inverse kinematics)을 이용하여 2880 Remodel 경로를 실행하였다. Remodel 가중치 설명을 이용하여 모델을 스코어링하고, 성공적인 루프 폐쇄를 갖는 모델(체인 브레이크 스코어 < 0.07)을 PDB 파일로서 출력하였다. 루프 폐쇄 기준을 충족하는 백분율을 평가함으로써 루프 폐쇄율을 결정하였다. 각 링커에 대해, 각 모델의 RMSD를 중첩 없이 RosettaScripts에서 RMSD Mover를 이용하는 최저 점수화 모델에 플롯팅함으로써 입체형태 수렴을 측정하였다. 각 링커에 대한 상위 10개 모델을 잔기당 로제타 에너지 단위(Rosetta Energy Unit: REU)에 의해 그리고 링커 잔기에 대해 골격 스코어에 의해 평가하였다(표 1). 라마찬드란 이상값(Ramachandran outlier)을 갖는 모델을 MOE(Chemical Computing Group, Inc.)에서 확인하였다.
링커 없이 또는 절단된 미해결 p40 및 p35 말단을 갖는 Remodel 실행은 루프 폐쇄율이 10% 미만이었고, 이는 링커가 p40 및 p35 서브유닛을 단일 쇄로서 연결하는 데 필수적이라는 것을 시사한다. 대조적으로, 링커에 의한 Remodel 실행은 모두 4개의 링커 서열에 대해 성공적인 루프 폐쇄를 가졌다. 모두 4개의 링커에 대한 상위 스코어링 모델을 골격 균주 또는 라마찬드란 이상값 없이 제대로 스코어링하였다. 보다 긴 엘라스틴 및 3x(G4S) 링커는 G4S 및 2x(G4S) 링커보다 더 입체형태가 가요성이 될 가능성이 있는데, 전자로부터의 모델이 후자로부터의 모델보다 상위-스코어링 모델로부터 더 큰 RMSD 분기를 나타내었기 때문이다. Rosetta Remodel을 사용하여 p40-링커-p35 페이로드에 대한 링커를 확인하였다. G4S-연결 및 2xG4S-연결된 작제물의 상위 스코어링 모델은 엘리스틴-기반 링커이기 때문에 링커가 둘 다 적합하였다는 것을 시사한다(도 2).
루프 폐쇄율을 이하의 표 1에 요약한다.
Figure pct00001
인실리코 모델링으로부터 단일 쇄 IL12의 기능을 확인하기 위해, 다양한 형식에서 단일쇄 IL12 작제물을 작제물이 CMV 프로모터와 BGH 폴리(A) 꼬리 사이에 삽입된 pcDNA3.1 기반 벡터인 pΔ34.5(XS) 벡터(작제물 도시, 도 3a 참조)에 클로닝하였다. CMV 프로모터 및 BGH 폴리(A) 꼬리에 측접하는 HSV-1 역위 반복부는 단일 쇄 IL12 작제물, CMV 및 BGH 폴리(A) 꼬리의 HSV-1 바이러스에의 재조합을 용이하게 한다. pΔ34.5(XS) 벡터는 각각 CMV 프로모터 뒤에 그리고 BGH 폴리(A) 꼬리 앞에 위치되는 제한효소 Hind III 및 Xho I에 의해 선형화되었다. 단일쇄 IL12 작제물을 암호화하는 중복 DNA 단편을 정돈하고, Gibson 조립체 방법을 이용하여 선형화된 pΔ34.5(XS) 벡터에 클로닝하였다. 단일쇄 IL12 작제물의 진본성(authenticity)을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 시험관내 HEK 293 세포를 형질감염하고, IL12 단백질 생성을 비교하기 위해 이들 작제물을 사용하였다. 세포를 Optimem 배지에서 8 ㎕의 리포펙타민 2000과 함께 4 ㎍ DNA로 형질감염시키고, 48시간 동안 37℃에서 5% CO2와 함께 인큐베이션시켰다. 상청액을 제거하고, Biolegend 인간 IL12p70 ELISA 분석을 이용하여 IL12 발현을 정량화하였다. 펩티드 쇄의 위치는 발현을 유의미하게 변경시켰다. p35-엘라스틴-p40을 포함하는 작제물은 검출 가능한 수준의 IL12를 생성하지 않은 반면, p40-엘라스틴-p35를 포함하는 작제물은 IL12를 생성하였다(도 3b).
천연 형태에서, IL12는 2개의 독립적 쇄로서 생성되며, 이들 둘 다 단백질 분비에 필요한 신호 펩티드를 포함한다. 변형된 형태에서, 제2 신호 펩티드의 필요성을 평가하였다. 융합물의 5' 단부에 위치된 단일 신호 펩티드를 포함하는 작제물[IL12(p40-엘라스틴-No SP-p35)]을 p35와 p40 서브유닛 둘 다에서 신호 펩티드를 암호화하는 작제물[IL12(p40-엘라스틴-p35)]과 비교하였다. 제2 신호 펩티드의 제거는 형질감염의 결과로서 생성된 IL12의 전체 수율을 증가시켰다(도 3b). 최종적으로, 엘라스틴 링커에 의한 IL12의 발현을 단일 G4S 링커와 비교하였다(도 3b). 이들 관찰에 기반하여, 조작된 바이러스에 포함을 위해 p35 서브유닛으로부터 신호 펩티드가 제거된 p40-G4S 링커-p35를 혼입하는 단일 쇄 IL12 카세트를 선택하였다.
실시예 2: 생활성 FLT3L 및 IL12를 P2A 링커의 첨가를 통해 동시에 발현시킨다.
이들 실험은 돼지 테스코 2A 서열을 이용하여 단일 프로모터의 제어 하에 2시스트론성 형식으로 생활성 FLT3L 및 IL12를 생성하도록 수행한 조작에 관한 것이다.
바이러스로부터의 다중의, 합리적으로 선택된 단백질의 발현은 바이러스가 항-종양 반응을 유발하는 면역자극 능력을 향상시켜야 한다. FLT3L 및 IL12를 면역자극 사이토카인으로서 선택하였다. 사이토카인을 둘 다 생성하기 위해 단일 프로모터(CMV 프로모터)를 사용하였다. 이 접근은 동일한 비율 및 동일한 시간에 동일한 감염 세포에서 사이토카인 둘 다를 생성하는 이점을 가졌다. 본 발명자들은 단일 프로모터로부터 다중 단백질을 발현시키기 위해 2가지 수단, 즉, 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 및 2A 서열을 선택하였다. FLT3L-IRES-IL12, IL12-IRES-FLT3L 또는 FLT3L-P2A-IL12를 혼입시키는 DNA 작제물을 설계하였다. 앞서 기재한 바와 같이 시험관내에서 DNA 작제물을 시험하였다(도 4a). DNA 작제물을 293T 세포에서 형질감염시키고, 상청액을 ELISA(IL12에 대해 Biolegend IL12p70 분석 및 FLT3L에 대해 Thermo FLT3L 분석)에 의해 시험하였다.
배향 중 하나(제1 유전자로서 FLT3L 및 제2 유전자로서 IL12, 또는 제1 유전자로서 IL12 및 제2 유전자로서 FLT3L)에서, IRES를 이용할 때 제2 유전자의 생성이 감소되었다(도 4b 및 도 4c). 이런 이유로, 단일 프로모터로부터 두 단백질의 생성을 제공하기 위해 기능성 단위로서 P2A 서열을 선택하였다.
교번의 페이로드(GMCSF)를 이용하는 별개의 실험에서, 공통 KOZAK 서열의 효과를 평가하였다. KOZAK 서열은 포유류 번역을 향상시키는 것으로 알려져 있고, 완전한 카세트의 번역을 개선시키는 것으로 예상되었다. 이와 일치되게, 5' 단백질(GMCSF)의 발현은 P2A 또는 IRES 용법과 독립적으로 번역 개시 부위 상류에서 KOZAK 서열의 혼입에 의해 유의미하게 증가되었다(도 5; (KOZAK이 있는 평균 ng/ML= 660.9; KOZAK이 없는 평균 ng/㎖ = 102.5)).
P2A 부위 첨가의 잠재적 결과는 이것이 FLT3L 단백질 단부에 몇 개의 아미노산을 현수한다는 것이다. P2A는 대다수의 포유류 세포에서 2개의 별개의 폴리펩티드 쇄의 생성을 초래하는 서열이지만, 생성된 제1 펩티드는 아미노산 서열 GSGATNFSLLKQAGDVEENPG의 첨가를 포함한다. FLT3L의 카복시 말단 단부에 대한 아미노산의 첨가가 이의 수용체인 FLT3과의 상호작용에 영향을 미치는지의 여부를 결정하기 위해 인실리코 모델링을 수행하였다. 이중 페이로드 벡터 페이로드1-P2A-페이로드2 카세트에서의 작제물 배향을 선택하기 위해 Flt3L/Flt3 복합체 구조를 평가하는 데 PyMOL v. 1.8.6.0을 사용하였다. P2A는 페이로드1의 C-말단에 융합된 18개의 아미노산 펩티드를 생성하였다. Flt3L/Flt3의 구조는 노출될 Flt3L의 C-말단 및 수용체 결합 부위 및 Flt3L 이량체화 계면에 대한 원위를 나타낸다. 따라서 Flt3L은 P2A 태그를 용인할 가능성이 있으며, P2A 서열 상류에서 페이로드로서 선택하였다(도 6). 그러나, FLT3L과 IL12 둘 다의 생활성을 입증하는 것으로 활성 입증을 수행하였다.
IL12에 대해, 발현된 총 IL12를 정량화하기 위해 앞서 기재하고 ELISA 분석에서 사용한 상청액을 IL12 세포 리포터 분석에서 사용하였다. HEK-Blue IL12 세포(Invivogen #hkb-il12)를 이용하여 IL12의 생활성을 측정하였다. 생활성 IL12는 HEK-Blue IL12 세포주에 의한 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP)의 용량-의존적 생성을 유도하고, 색소생산성 시약인 QUANTI-Blue(Invivogen #rep-qb1)를 이용하여 SEAP 수준을 평가할 수 있다. DNA-형질감염 293T 세포로부터의 상청액을 HEK-Blue IL12 세포를 이용하여 2회 3배 연속 희석으로 96웰 편평 바닥 플레이트에 직접 첨가하고, 37℃에서 밤새 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 다음 날, 제조업자의 지침에 따라 QUANTI-Blue 시약을 새로 준비하고, 37℃까지 15분 동안 사전 가온시키고, 20 ㎕의 밤새 배양시킨 세포 배양물 상청액을 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. BioTek Synergy Neo2 마이크로플레이트 판독기(BioTek; Gen5 소프트웨어 v3.04)를 이용하여 620 내지 630 ㎚에서 흡광도를 측정함으로써 SEAP 수준을 검출하였다. 상청액은 상업적 공급업자(R&D #219-IL-005; 도 7)로부터 구입한 재조합 인간 IL12 단백질과 비슷한 IL12 수용체 분석에서의 활성을 입증하였다.
FLT3L에 대해, 상청액을 또한 FLT3L 민감 세포주에 대해 문헌에 기재한 BaF3 세포 증식 분석에서 시험하였다. BaF3 세포를 RPMI + 10% FBS + 게네티신으로 24웰 플레이트에서 밤새 37℃에서 웰당 30,000개의 세포로 플레이팅하였다. 조작된 페이로드 또는 재조합 인간 FLT3L을 포함하는 DNA 작제물로 형질감염시킨 세포로부터의 상청액을 세포에 첨가하고, 총 용적을 모든 웰에 대해 500 ㎕까지 조절한 후에 37℃에서 14일 동안 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 제14일에, BaF3 세포를 피펫팅에 의해 부드럽게 재현탁시키고, Vi-CELL XR 세포 생존력 분석기(Beckman Coulter)를 이용하여 세포 계수를 위해 각 웰로부터 샘플을 제거하였다. 웰에서 생존 가능한 세포의 총 수를 Vi-CELL XR에 의해 제공된 생존 가능한 세포 농도로부터 계산하였다. 인간 재조합 FLT3L을 대조군으로서 포함시켰고, 형질감염 293T 세포로부터의 상청액은 세포 증식에 대해 비슷한 효과를 나타내었다(도 8).
이들 관찰에 기반하여, HSV1 게놈에 재조합될 최종 작제물을 상기 기재한 조작에 의해 인간 FLT3L-P2A-huIL12(p40-G4S-p35)로서 선택하였다.
실시예 3: HSV1/ICP34.5 - /ICP47 - /FLT3L/IL12 바이러스의 생성
HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12를 다음과 같이 생성하였다.
바이러스 게놈의 설명:
HSV-1은 수탁번호 01010209 하에 유럽 세포 배양 컬렉션(ECAAC)에 기탁된 바와 같은 균주 JS1로부터 유래되었다. HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12에서, ICP34.5 및 ICP47을 암호화하는 HSV-1 바이러스 유전자는 앞서 기재한 바와 같이 기능적으로 결실되었다. 문헌[Liu et al., Gene Ther., 10:292-303, 2003]; 미국 특허 제7,223,593호 및 미국 특허 제7,537,924호 참조. HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12에서, US11의 조기 발현과 조합된 ICP34.5 및 ICP47 암호화 유전자의 기능성 결실은 종양 복제를 개선시키는 한편 안전성을 유지한다. 인간 FLT3L 및 IL12에 대한 암호화 서열을 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12의 ICP34.5 유전자의 2개의 앞 부분에서 바이러스 게놈에 삽입하였다(도 9). 인간 FLT3L 및 IL12 발현 카세트는 ICP34.5 유전자 모두를 근처에서 대체하여, HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12와 야생형 바이러스 사이의 임의의 잠재적 재조합 사건이 무력화된, 비병원성 바이러스만을 생성할 수 있고, 인간 FLT3L 및 IL12에 대한 유전자를 운반하는 야생형 바이러스의 생성을 초래할 수 없었다는 것을 보장한다. HSV 티미딘 키나제(TK) 유전자는 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12에서 무손상으로 남아있으며, 이는 아시클로버(acyclovir)와 같은 항바이러스제에 민감한 바이러스를 제공한다. 따라서, 아시클로버는 필요하다면 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12 복제를 차단하는 데 사용될 수 있다.
pΔ34.5 전달 플라스미드의 생성:
인간 FLT3L 및 IL12 발현 카세트를 포함하는 전달 플라스미드를 앞서 기재한 바와 같이 변형된 SP72 벡터(Promega)로부터 생성하였다(문헌[Liu et al., Gene Ther., 10:292-303, 2003]; 미국 특허 제7,223,593호 및 미국 특허 제7,537,924호 참조). 플라스미드는 HSV-1 17syn+의 변형된 Sau3AI 단편(뉴클레오티드 123462 내지 126790)을 포함하며, 대다수의 ICP34.5를 암호화하는 NotI 단편(뉴클레오티드 124948-125713)은 제거된다. CMV-KOZAK-FLT3L-P2A-IL12-BGHPolyA를 포함하는 발현 카세트를 본래의 Not1 부위 근처의 플라스미드에 삽입하였다. 삽입은 Sau3AI 단편에 의해 절단된 HSV-1 17syn+ 영역에 측접되는 발현 카세트를 생성한다(도 9).
HSV-1/ICP34.5 - /ICP47 - /FLT3L/IL12에 치료적 유전자의 삽입:
상동성 재조합 과정에 의해 유전자를 바이러스 게놈에 삽입하였다. pΔ34.5 전달 플라스미드에 의해 Vero 세포를 형질감염시켰다. 이어서, 형질감염 세포를 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/GFP(JS1 균주)로 감염시켰다. 이 바이러스는 CMV-FLT3L-P2A-IL12-BGHPolyA 발현 카세트가 삽입된 게놈 영역을 암호화하는 ICP34.5에서 GFP를 포함하였다. 완전한 CPE(세포 변성 효과)가 관찰될 때까지 형질감염-감염 반응이 계속되게 하였다. 형질감염-감염 반응으로부터의 세포 및 상청액을 희석시키고, 96 웰 플레이트에서 Vero 세포를 감염시키는 데 사용하였다. 2일 후에, IL12 및 FLT3L을 발현시키는 비리온을 포함하는 웰을 확인하기 위해 상청액을 ELISA에 의해 평가하였다. IL12 및 FLT3L 양성 웰로부터의 세포 및 상청액을 수집하고, Vero 세포로 플라크 분석에서 플레이팅하였다. 2일 후에, GFP 마커 유전자의 상실에 의해 재조합 바이러스를 확인하였다. GFP 마커 유전자의 상실은 ICP34.5 부위에서 GFP가 [CMV]-[Kozak]-[Flt3L]-[P2A]-[IL12]-[BGHpA] 발현 카세트에 의해 대체되었다는 것을 시사하였다(도 9). 비-GFP 플라크를 형광 현미경 하에 확인하였고, 이들을 멸균 피펫 팁을 이용하여 신선한 성장 배지를 포함하는 에펜도르프 관에 옮겼다. 바이러스는 냉동-해동에 의해 세포로부터 방출되었고, 바이러스를 새로운 세포 상에 플레이팅하였다. 균질한 집단이 달성될 때까지(즉, 플라크 중 어느 것도 녹색이 아님), 2 내지 3일마다 이 과정을 반복하였다. PCR 및 서열분석에 의해 CMV-FLT3L -P2A-IL12-BGHPolyA 발현 카세트의 삽입을 입증하였다.
실시예 4: HSV-1/ICP34.5 - /ICP47 - /FLT3L/IL12 바이러스는 종양 세포주 내에서 감염, 복제하고, 종양 세포주를 사멸시킬 수 있으며, 시험관내에서 생활성 FLT3L 및 IL12를 생성할 수 있다.
재조합 바이러스가 세포 감염, 복제 및 용해를 유지하는 한편, 생활성 FLT3L 및 IL12를 생성하는 능력을 평가하였다.
조작된 바이러스가 인간 세포 내에서 복제할 수 있다는 것을 확인하기 위해, 2개의 인간 세포주를 감염시키고, 감염 후 바이러스의 총량을 정량화하였다. 1백만개의 A375 또는 VERO 세포를 6웰 접시에 플레이팅하고, 5% FBS를 포함하는 DMEM에서 밤새 37℃에서 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 세포를 3회 중복하여 0.1의 MOI에서 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12 바이러스로 감염시켰고, 인큐베이터에 되돌렸다. 감염 후 48시간에, 세포 및 상청액을 수집하고, Vero 세포 상의 플라크 분석에 의해 바이러스 역가를 평가하였다. 조작된 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12 바이러스 및 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/GMCSF 바이러스를 평가하였다(도 10).
바이러스에 도입된 변형이 바이러스가 세포를 감염 및 용해시키는 능력에 영향을 미치지 않았다는 것을 확인하기 위해, 시험관내 사멸 분석을 수행하였다. 마우스(CT26)와 인간(HT-29, SK-MEL-5, FADU, 및 BxPC3) 유래 둘 다의 다양한 세포주를 다양한 감염 다중도(multiplicities of infection: MOI)의 바이러스 입자와 함께 배양시켰다(도 11a 내지 도 11e). 결과를 이하에서 논의한다.
마우스 직장결장암(CT26)
CT26 세포를 웰당 6,000개의 세포로 96-웰 플레이트에서 플레이팅하고, 밤새 37℃에서 인큐베이션시켰다. 100 MOI에서 시작 시 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12 및 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/GMCSF를 연속 희석시켰다(4-배, 10웰). 72시간의 인큐베이션 후에, 각 웰에 남아있는 세포의 수를 CellTiter-Glo Luminescent 세포 생존도 분석(Promega, 위스콘신주 메디슨에 소재)을 이용하여 정량화하였다.
인간암 세포주(HT-29, SK-MEL-5, FADU 및 BxPC-3)
다양한 인간 고형 종양 세포주(직장결장, 흑색종, 두경부 편평 암종 및 췌장)를 웰당 7,000 내지 10,000개의 세포로 96웰 플레이트에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 100 MOI에서 시작 시 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12 및 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/GMCSF를 연속 희석시켰다(4-배, 10웰). 72시간의 인큐베이션 후에, 각 웰에 남아있는 세포의 수를 SpectraMax M5 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices Corporation) 상의 CellTiter-Glo Luminescent 세포 생존도 분석(Promega #G7571, 위스콘신주 메디슨에 소재)을 이용하여 정량화하였다.
HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12는 시험한 모든 암 세포주에 대해 효능이 있었다. 시험한 모든 세포주는 MOI IC50 값이 1 미만이었다. 도 11은 5가지 세포주 각각에서 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12 농도를 증가시킴으로 달성된 세포 성장 저해도를 MOI IC50 값과 함께 나타낸다. 이들 결과는 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12를 이용하는 직장결장, 흑색종, 두경부 및 췌장암 세포주의 치료가 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/GMCSF와 유사한 MOI IC50 값을 갖는 종양 세포 성장의 강한 저해를 초래한다는 것을 입증한다.
HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12 감염 결과로서 시험관내 생활성 FLT3L 및 IL12의 생성을 평가하였다. 바이러스 감염 세포로부터의 상청액을 이용하여 ELISA 발현, IL12 리포터 분석 및 FLT3L 세포 증식 분석을 반복하였다. 복제를 확인하기 위해 사용한 A375 및 VERO 세포로부터의 상청액을 앞서 기재한 바와 같이 선별하였다. IL12p70 ELISA는 시험한 모든 세포주(VERO, A375 및 SK-MEL-5)로부터의 IL12 발현을 확인하였다(도 12a). 또한, FLT3L ELISA는 시험한 모든 세포주로부터의 FLT3L의 발현을 입증하였다(도 12b). 앞서 기재한 IL12 리포터 분석 및 BaF3 세포주 증식 분석을 이용하여 IL12 생활성 증거를 확립하였다. 바이러스 감염 세포 상청액은 SK-MEL-5(도 13a)와 A375 세포(도 13b) 둘 다에서 용량 의존적 방식으로 활성 IL12를 나타내었다. FLT3L 생활성 증거를 SK-MEL-5(도 14a) 또는 A375(도 14b) 세포주 중 하나로부터의 상청액으로 자극한 BaF3 세포주를 이용하여 입증하였다.
시험한 모든 경우에, 바이러스 감염 세포로부터의 상청액은 조작 세부항목에 기반하여 예상되는 바와 같이 생활성 IL12 및 FLT3L을 함유하였다.
실시예 5: HSV-1/ICP34.5 - /ICP47 - /mFLT3L/mIL12 바이러스는 B 세포 림프종 종양 보유 동물(A20 세포주)의 치료 시 생체내에서 생활성 FLT3L 및 IL12를 생성할 수 있다
마우스 A20 종양 모델에서 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12에 의해 암호화된 이중 사이토카인 페이로드의 발현을 평가하였다.
A20 종양 세포(2×106개의 세포)를 제0일에 암컷 Balb/c 마우스의 우측 옆구리에 피하로 주사하였다. 주당 2회(Q2W) 전자 캘리퍼를 이용하여 종양 용적(㎣)을 측정하였다. 일단 종양이 대략 평균 230 ㎣에 도달되면, 평균 종양 용적 및 치료 투여의 시작 시 종양 용적의 가변성이 처리군에 걸쳐 균일하게 되도록, 동물을 5개 그룹(그룹당 4마리 마우스)에 무작위화시켰다. 마우스는 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12, HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF, HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L 또는 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mIL12(각각 1×106 PFU/용량으로)의 단일 종양내 주사를 받았고, 이어서, 16시간 후에 종양 및 혈장을 수집하였다. MSD 분석(mGM-CSF 및 mIL12(서열번호 15에 나타낸 mIL-12 핵산; 서열번호 16에 나타낸 mIL-12 아미노산)) 또는 R&D Quantikine ELISA(mFLT3L)를 이용하여 각 처리군으로부터의 종양 용해물 및 혈장에서 mGM-CSF, mFLT3L 및 mIL12를 측정하였다.
결과(도 15)는 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12의 단일 종양내 용량이 16시간에 A20 종양 용해물 및 혈장에서 mFLT3L과 mIL12 둘 다의 발현을 야기한다는 것을 나타낸다.
실시예 6: HSV-1/ICP34.5 - /ICP47 - /mFLT3L/mIL12 바이러스는 흑색종 종양 보유 동물(B16F10 세포주)의 치료 시 생체내에서 생활성 FLT3L 및 IL12를 생성한다
마우스 B16F10-mNectin1 종양 모델에서 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12에 의해 암호화된 이중 사이토카인 페이로드의 발현을 평가하였다.
B16F10-mNectin1 종양 세포(3×105개의 세포)를 제0일에 암컷 C57Bl/6 마우스의 우측 옆구리에 피하로 주사하였다. 주당 2회(Q2W) 전자 캘리퍼를 이용하여 종양 용적(㎣)을 측정하였다. 일단 종양이 대략 평균 210 ㎣에 도달되면, 평균 종양 용적 및 치료 투여의 시작 시 종양 용적의 가변성이 처리군에 걸쳐 균일하게 되도록, 동물을 5개 그룹(그룹당 4마리 마우스)에 무작위화시켰다. 마우스는 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12, HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF, HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L 또는 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mIL12(각각 5×106 PFU/용량으로)의 단일 종양내 주사를 받았고, 이어서, 16시간 후에 종양 및 혈장을 수집하였다. MSD 분석(mGM-CSF 및 mIL12) 또는 R&D Quantikine ELISA(mFLT3L)을 이용하여 각 처리군으로부터의 종양 용해물 및 혈장에서 mGM-CSF, mFLT3L 및 mIL12 수준을 측정하였다.
결과(도 16)는 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12의 단일 종양내 용량이 16시간에 A20 종양 용해물 및 혈장에서 mFLT3L과 mIL12 둘 다의 발현을 야기한다는 것을 나타낸다.
실시예 7: HSV-1/ICP34.5 - /ICP47 - /mFLT3L/mIL12 바이러스는 생체내 종양내 주사 후에 전신 항-종양 면역 반응을 유발한다
HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12에 의한 치료에 의해 유발되는 전신 항-종양 T-세포 반응을 평가하였다.
A20 종양 세포(2×106개의 세포)를 제0일에 암컷 Balb/c 마우스의 우측 및 좌측 옆구리에 피하로 주사하였다. 주당 2회(Q2W) 전자 캘리퍼를 이용하여 종양 용적(㎣)을 측정하였다. 일단 종양이 대략 평균 100 ㎣(제11일)에 도달되면, 평균 종양 용적(양 옆구리에서) 및 치료 투여의 시작 시 종양 용적의 가변성이 처리군에 걸쳐 균일하게 되도록, 동물을 3개 그룹(그룹당 12마리 마우스)에 무작위화시켰다. HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 및 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF(3×104 PFU/용량) 또는 제형 완충제 대조군을 연구의 제11일, 제14일 및 제17일에 종양내로(동물의 우측에) 투여하였다. 대측성 종양(동물의 좌측)은 주사를 받지 않았다. 제21일에 연구를 종결하였고, 비장을 수집하였다. 비장세포를 개개 비장으로부터 단리시키고, 전세포 ELISpot 분석(CTL, 오하이오주 셰이커 하이츠에 소재)에서 사용하여 A20 종양 세포와 혼합하였을 때의 T-세포 분비 mIFN-γ의 수를 측정하였다. 간략하게, 7.5×104개의 비장세포를 1.5×104개의 A20 종양 세포와 혼합하고, 20시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. CTLS6 Fluorospot 분석기(CTL, 오하이오주 셰이커 하이츠에 소재)를 사용하여 분석을 판독하고, IFN-γ+ 스폿을 세었다.
결과(도 17a)는 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12에 의한 처리가 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF 처리에 비해 유의미하게 증가된 전신 항-A20 종양 활성을 야기하였다는 것을 나타낸다(각각 152개의 스폿에 비해 7.5×104개의 비장세포당 427개의 스폿; p=0.0008). 전체 종양 세포에 추가로, A20 세포주인 AH1과 연관된 확인된 바이러스 항원(도 17b) 및 A20 세포주인 UV Rag에서 확인된 네오-항원 돌연변이(도 17c)를 이용하여 EliSpot을 수행하였다.
실시예 8: HSV-1/ICP34.5 - /ICP47 - /mFLT3L/mIL12는 공통유전자 마우스 B 세포 림프종 종양 모델(A20 세포)에서 항-종양 효능을 유발한다
대측성 마우스 A20 종양 모델에서 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 및 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF의 내약성 및 항-종양 활성을 평가하기 위해 본 연구를 설계하였다.
A20 종양 세포(2×106개의 세포)를 제0일에 암컷 Balb/c 마우스의 우측 및 좌측 옆구리에 피하로 주사하였다. 주당 2회(Q2W) 전자 캘리퍼를 이용하여 종양 용적(㎣)을 측정하였다. 일단 종양이 대략 100 ㎣의 평균 용적에 도달되면, 평균 종양 용적(양 옆구리에서) 및 치료 투여의 시작 시 종양 용적의 가변성이 처리군에 걸쳐 균일하게 되도록, 동물을 6개 그룹(그룹당 10마리 마우스)에 무작위화시켰다. HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 및 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF (3×104 PFU/용량) 또는 제형 완충제 대조군을 총 3회의 주사를 위해 3일마다 종양내로(동물의 우측에) 투여하였다. 대측성 종양(동물의 좌측)은 주사를 받지 않았다. 임상 징후, 체중 변화 및 생존을 연구 종결까지 매주 2회 측정하였다(종양이 800 ㎣에 도달되었을 때 마우스를 연구로부터 제거함).
모든 동물은 실험 내내 생존하였고, 체중에 의해 입증된 처리와 관련된 유해 건강 효과의 증거를 나타내지 않았고, 매일의 건강 모니터링 시험에 대해 확인된 유해 임상 징후는 나타나지 않았다.
용량 의존적 방식으로 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12와 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF 처리군 둘 다의 종양 성장 저해가 처리(우측) 및 비처리(좌측) 종양 둘 다에서 관찰되었다(도 18). 그러나, HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF로 처리한 동물에 비해 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 처리 동물의 처리 종양 및 대측성 종양(5/10 대 2/10)에서 완전한 반응(10/10 대 7/10)의 증가가 있었다. HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF에 비해 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 처리군에서 중위 생존은 유의미하게 증가되었다(각각 53일 대 32일; p= 0.048).
이들 데이터는 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 처리가 개선된 대측성 종양 클리어런스 및 개선된 전반적 생존을 야기하였다는 것을 나타낸다.
실시예 9: 마우스 신경아세포종(Neuro2A) 종양 모델에서 HSV-1/ICP34.5 - /ICP47 - /mFLT3L/mIL12 및 HSV-1/ICP34.5 - /ICP47 - /mGMCSF 효능을 평가하는 연구
대측성 마우스 Neuro2A 종양 모델에서 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 및 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF의 내약성 및 항-종양 활성을 평가하기 위해 본 연구를 설계하였다.
Neuro2A 종양 세포(1×106개의 세포)를 제0일에 암컷 Balb/c 마우스의 우측 및 좌측 옆구리에 피하로 주사하였다. 주당 2회(Q2W) 전자 캘리퍼를 이용하여 종양 용적(㎣)을 측정하였다. 일단 종양이 대략 100 ㎣의 평균 용적에 도달되면, 평균 종양 용적(양 옆구리에서) 및 치료 투여의 시작 시 종양 용적의 가변성이 처리군에 걸쳐 균일하게 되도록, 동물을 그룹(그룹당 10마리 마우스)에 무작위화시켰다. HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 및 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF(5×105 또는 5×104 PFU/용량) 또는 제형 완충제 대조군을 총 3회의 주사를 위해 3일마다 종양내로(동물의 우측에) 투여하였다. 비주사 종양(대측성; 동물의 좌측)은 주사를 받지 않았다. 임상 징후, 체중 변화 및 생존을 연구 종결까지 매주 2회 측정하였다(종양이 800 ㎣에 도달되었을 때 마우스를 연구로부터 제거함).
모든 동물은 실험 내내 생존하였고, 체중에 의해 입증된 처리와 관련된 유해 건강 효과의 증거를 나타내지 않았고, 매일의 건강 모니터링 시험에 대해 확인된 유해 임상 징후는 나타나지 않았다.
용량당 5e5 PFU에서, HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 처리군과 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF 처리군은 둘 다 대조군 처리 동물에 비해 통계적으로 유의미하였다. 용량당 5e4 PFU에서, HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF에 비해 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 처리군의 전반적 생존은 증가되었다(그럼에도 불구하고 그룹 둘 다에 대한 중위 생존은 20일임; p= 0.0056).
이들 데이터는 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 처리가 개선된 대측성 종양 클리어런스 및 개선된 전반적 생존을 야기하였다는 것을 나타낸다.
실시예 10: 마우스 신경아세포종(CT26) 종양 모델에서 HSV-1/ICP34.5 - /ICP47 - /mFLT3L/mIL12 및 HSV-1/ICP34.5 - /ICP47 - /mGMCSF 효능을 평가하는 연구
대측성 마우스 CT26(colon26으로도 알려짐) 종양 모델에서 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 및 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF의 내약성 및 항-종양 활성을 평가하기 위해 본 연구를 설계하였다.
CT26 종양 세포(3×105개의 세포)를 제0일에 암컷 Balb/c 마우스의 우측 및 좌측 옆구리에 피하로 주사하였다. 주당 2회(Q2W) 전자 캘리퍼를 이용하여 종양 용적(㎣)을 측정하였다. 일단 종양이 대략 100 ㎣의 평균 용적에 도달되면, 평균 종양 용적(양 옆구리에서) 및 치료 투여의 시작 시 종양 용적의 가변성이 처리군에 걸쳐 균일하게 되도록, 동물을 그룹(그룹당 10마리 마우스)에 무작위화시켰다. HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12, HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF(5×106 PFU/용량) 또는 제형 완충제 대조군을 총 3회의 주사를 위해 3일마다 종양내로(동물의 우측에) 투여하였다. 비주사 종양(대측성; 동물의 좌측)은 주사를 받지 않았다. 임상 징후, 체중 변화 및 생존을 연구 종결까지 매주 2회 측정하였다(종양이 800 ㎣에 도달되었을 때 마우스를 연구로부터 제거함).
모든 동물은 실험 내내 생존하였고, 체중에 의해 입증된 처리와 관련된 유해 건강 효과의 증거를 나타내지 않았고, 매일의 건강 모니터링 시험에 대해 확인된 유해 임상 징후는 나타나지 않았다.
용량당 5×106 PFU에서, HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 처리군과 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF 처리군 둘 다의 생존은 대조군 처리 동물에 비해 통계적으로 유의미하게 증가되었다(대조군 대 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF; p = 0.0017 및 대조군 대 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12; p = 0.0008). 추가적으로, HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF에 비해 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 처리군의 전반적 생존은 증가되었다(HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF에 대해 27일에 비해 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12에 대해 나타나지 않은 중위 생존; p=0.0059). 도 20 참조.
이들 데이터는 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 처리가 대조군 처리 또는 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF 처리에 비해 개선된 대측성 종양 클리어런스 및 개선된 전반적 생존을 야기하였다는 것을 나타낸다.
실시예 11: 마우스 직장결장(MC38) 종양 모델에서의 관문 차단(항-PD1 mAb) 효능과 조합한 HSV-1/ICP34.5 - /ICP47 - /mFLT3L/mIL12를 평가하는 연구
대측성 마우스 MC38 종양 모델에서 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 단독으로 또는 항-세포 예정사단백질 1(PD1) 단클론성 항체(mAb)와 조합하여 내약성 및 항-종양 활성을 평가하기 위해 본 연구를 설계하였다.
MC38 종양 세포(3×105개의 세포)를 제0일에 암컷 C57BL/6 마우스의 우측 및 좌측 옆구리에 피하로 주사하였다. 주당 2회(Q2W) 전자 캘리퍼를 이용하여 종양 용적(㎣)을 측정하였다. 일단 종양이 대략 100 ㎣의 평균 용적에 도달되면, 평균 종양 용적(양 옆구리에서) 및 치료 투여의 시작 시 종양 용적의 가변성이 처리군에 걸쳐 균일하게 되도록, 동물을 그룹(그룹당 10마리 마우스)에 무작위화시켰다. HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12(5×106 PFU/용량) 또는 제형 완충제 대조군을 총 3회의 주사를 위해 3일마다 종양내로(동물의 우측에) 투여하였다. 비주사 종양(대측성; 동물의 좌측)은 주사를 받지 않았다. 항-PD1 단클론성 항체(200 ㎍/용량)을 동일한 스케줄로 (총 3회의 주사에 대해 3일마다) 복강내 주사에 의해 투여하였다. 임상 징후, 체중 변화 및 생존을 연구 종결까지 매주 2회 측정하였다(종양이 800 ㎣에 도달되었을 때 마우스를 연구로부터 제거함).
모든 동물은 실험 내내 생존하였고, 체중에 의해 입증된 처리와 관련된 유해 건강 효과의 증거를 나타내지 않았고, 매일의 건강 모니터링 시험에 대해 확인된 유해 임상 징후는 나타나지 않았다.
단일 치료 둘 다, 즉, 항-PD1 mAb 단독 및 5×106 PFU HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 단독은 대조군 처리 동물에 비해 유의미하게 증가된 생존을 입증하였다(각 비교를 위해 각각 p<0.0001). 항-PD1 mAb 단독 처리 동물의 생존은 5×106 PFU HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 단독에 비해 통계적으로 유의미하지 않았다(p=0.246). 처리 둘 다의 조합, 즉, 항-PD1 mAb와 5×106 PFU HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12를 더한 것은 모든 다른 처리군과 비교할 때 유의미하게 증가된 생존을 입증하였다(5×106 PFU HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 단독과 비교할 때 p=0.0016, 항-PD1 mAb 단독과 비교할 때 p<0.0001, 및 대조군 처리와 비교할 때 p<0.0001). 도 21 참조.
이들 데이터는 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 또는 항-PD1 mAb 처리 단독이 대조군 처리에 비해 전반적 생존의 유의미한 개선을 야기하였지만, 처리 둘 다의 조합은 처리 단독과 비교할 때 유의미하게 개선된 전반적 생존을 초래하였다는 것을 나타낸다.
실시예 12: 마우스 직장결장(CT26) 종양 모델에서 HSV-1/ICP34.5 - /ICP47 - /mFLT3L/mIL12에 의한 사이토카인 발현의 동력학을 평가하는 연구
마우스 CT26 종양 모델에서 주사하였을 때 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12에 의한 사이토카인 발현의 동력학을 평가하기 위해 본 연구를 설계하였다.
CT26 종양 세포(3×105개의 세포)를 제0일에 암컷 BALB/c 마우스의 우측 옆구리에 피하로 주사하였다. 주당 2회(Q2W) 전자 캘리퍼를 이용하여 종양 용적(㎣)을 측정하였다. 일단 종양이 대략 100 ㎣의 평균 용적에 도달되면, 동물을 그룹(대조군에 대해 그룹당 5마리 마우스, HSV-1/ICP34.5-/ICP47-에 대해 그룹당 25마리 마우스 및 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12에 대해 그룹당 25마리 마우스)에 무작위화시켰다. 평균 종양 용적 및 처리 투여의 시작 시 종양 용적의 가변성은 처리군에 따라 균일하였다. HSV-1/ICP34.5-/ICP47-(5×106 PFU/용량의 바이러스; 사이토카인 페이로드를 포함하지 않는 바이러스), HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12(5×106 PFU/용량의 바이러스) 및 제형 완충제 대조군을 각각 총 3회의 주사 동안 3일마다 종양내로 투여하였다. 임상 징후 및 체중 변화를 연구 종결까지 매주 2회 측정하였다. 각 바이러스 처리군당 5마리의 마우스를 바이러스 투여 후 4, 24, 72, 168 및 240시간에 안락사시켰다. 대조군 처리군에서 5마리의 마우스를 제형 완충제 대조군 주사 직후에 죽였다. 혈액을 단리시키고, 혈청으로서 준비하고, 동물로부터 종양을 절개하고, 단백질 용해물로서 준비하였다.
모든 동물은 실험 내내 생존하였고, 체중에 의해 입증된 처리와 관련된 유해 건강 효과의 증거를 나타내지 않았고, 매일의 건강 모니터링 시험에 대해 확인된 유해 임상 징후는 나타나지 않았다.
바이러스 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12에 의해 암호화된 2종의 사이토카인인 마우스 FLT3L 및 IL-12의 존재에 대해 혈청 및 종양 단백질 용해물을 분석하였다. 내인성 사이토카인 발현에 대해 제어하기 위해 사이토카인이 없는 바이러스(HSV-1/ICP34.5-/ICP47-)를 사용하였다.
종양 용해물에서, HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12를 주사한 모든 동물은 주사 후 제7일(168시간)까지 종양 용해물에서 IL-12의 발현을 나타내었다. 5마리의 동물 중 2마리는 주사 후 제10일(240시간)에 IL-12의 발현을 나타내었다(도 22a). 대조군 또는 HSV-1/ICP34.5-/ICP47- 바이러스 중 하나를 주사한 모든 동물은 IL-12 수준이 검출하한(LLOD) 미만이었다. 혈장에서, 주사 4시간 후에 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12를 주사한 5마리의 동물 모두에서 IL-12가 검출되었다. 주사 24시간 후에, HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12를 주사한 5마리의 동물 중 4마리는 검출 가능한 IL-12를 가졌다. 24시간 후에 샘플링한 모든 시점은 LLOD 미만이었다(도 22b).
종양 용해물에서, HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12를 주사한 모든 동물은 주사 3일(72시간) 후까지 종양 용해물에서 FLT3L의 발현의 통계적으로 유의미한 증가를 나타내었다(4시간 HSV-1/ICP34.5-/ICP47- 대 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12, p = 0.0197; 24시간 HSV-1/ICP34.5-/ICP47- 대 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12, p = 0.0043, 72시간 HSV-1/ICP34.5-/ICP47- 대 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12, p = 0.0012; 168시간 HSV-1/ICP34.5-/ICP47- 대 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12, p = 0.2281; 240시간 HSV-1/ICP34.5-/ICP47- 대 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12, p = 0.4890; 도 22c). 혈장에서, FLT3L은 모든 그룹에서 모든 마우스로부터 모든 샘플에서 검출 가능하였다. 임의의 시점에 임의의 그룹 간에 통계적으로 유의미한 차이는 없었다(도 22d).
종양 용해물에서, HSV-1/ICP34.5-/ICP47- 및 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12를 주사한 동물만이 주사 4시간 후에 대조군과 비교할 때 종양 용해물의 IFN-γ를 유의미하게 증가된 발현을 나타내었다(p = 0.0057). 주사 후 24, 72, 168 및 240시간에, 대조군 처리 종양에서 검출 가능한 IFN-γ가 없었다. 주사 24시간 후에, HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12를 받은 동물은 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-과 비교할 때 유의미하게 상승된 IFN-γ 수준을 나타내었다(p = 0.0253). 주사 후 72, 168 및 240시간에, HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12에서 IFN-γ의 수준은 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-보다 더 높은 경향이 있지만, 통계학적 유의도를 달성하지 못하였다(각각 p = 0.2306, 0.1155 및 p = 0.0693; 도 22e). 주사 24시간 후에 지속된 IFN-γ 생성은 IL-12의 생성과 일치되고, 향상된 항-종양 면역 반응을 촉진시켜야 한다. 혈장에서, 대조군 주사로 처리한 동물에서 IFN-γ는 검출되지 않았다. HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 및 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-로 처리한 동물에서, 주사 4시간 후에 혈장 IFN-γ에서 통계적으로 유의미한 차이가 없고(p = 0.4803), 주사 24시간 후에 유의미한 증가는 없었고(p = 0.0140), 72시간에 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12에서 IFN-γ가 검출되었다. 모든 다른 시점 및 병태는 분석에 대해 검출하한(LLOD) 미만이었다(도 22f).
실시예 13: HSV-1/ICP34.5 - /ICP47 - /mFLT3L/mIL12가 항-종양 T 세포 반응을 생성하는 능력을 평가하는 연구
본 연구는 대측성 마우스 MC38 종양 모델에서 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12의 주사에 의해 생성된 항-종양 면역 반응을 평가하였다.
MC38 종양 세포(3×105개의 세포)를 제0일에 암컷 C57BL/6 마우스의 우측 및 좌측 옆구리에 피하로 주사하였다. 주당 2회(Q2W) 전자 캘리퍼를 이용하여 종양 용적(㎣)을 측정하였다. 일단 종양이 대략 100 ㎣의 평균 용적에 도달되면, 평균 종양 용적(양 옆구리에서) 및 치료 투여의 시작 시 종양 용적의 가변성이 처리군에 걸쳐 균일하게 되도록, 동물을 그룹(그룹당 12마리 마우스)에 무작위화시켰다. HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12(5×106 PFU/용량) 또는 제형 완충제 대조군을 총 3회의 주사를 위해 3일마다 종양내로(동물의 우측에) 투여하였다. 비주사 종양(대측성; 동물의 좌측)은 주사를 받지 않았다. 항-PD1 단클론성 항체(200 ㎍/용량)을 동일한 스케줄로 (총 3회의 주사에 대해 3일마다) 복강내 주사에 의해 투여하였다. 제21일에 임상 징후, 체중 변화 및 종양 용적을 연구 종결까지 매주 2회 측정하였다.
모든 동물은 실험 내내 생존하였고, 체중에 의해 입증된 처리와 관련된 유해 건강 효과의 증거를 나타내지 않았고, 매일의 건강 모니터링 시험에 대해 확인된 유해 임상 징후는 나타나지 않았다.
마우스를 제21일에 안락사시키고, 비장을 절개하고, IFN-γ ELISpot 분석(펩티드 재자극 및 전세포)를 비장세포의 단세포 현탁액에서 수행하였다. 펩티드 재자극 분석을 위해, 5×105개의 비장세포를 플레이팅하고, 1μM의 최종 농도로 밤새 단일 9량체 펩티드로 자극하였다(MC38 네오항원 또는 바이러스-유래 종양 항원 중 하나로 나타냄). 1.25×105개의 비장세포를 1.25×104개의 MC38 세포와 함께 플레이팅함으로써 전세포 분석을 셋업하였다. 각 분석에서, 스폿의 열거는 IFN-γ 발현 면역 세포의 총 수를 나타낸다.
펩티드 재자극 분석에서, HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 단독에 의한 처리는 MC38 종양 세포에 대한 면역 반응성의 유의미한 증가를 야기하였고; 전세포 분석에서, HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12에 의한 처리는 대조군 및 항-PD1 처리 동물과 비교할 때 항-MC38 활성의 유의미한 증가를 야기하였다(둘 다에 대해 p < 0.0001; 도 23a). 바이러스-유래 종양 항원 P15E에 대한 면역 반응성은 또한 대조군 동물과 비교할 때 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 처리에서 유의미하게 증가되었다(p = 0.0008; 도 23b).
MC38은 네오항원을 초래하는 몇 개의 게놈 돌연변이를 포함한다. 이들 종양 특이적 돌연변이에 대한 면역 반응성을 정량화하였다. HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 처리 동물에서, Adpgk(도 23c), 2410127L17Rik(도 23d), 및 Aatf(도 23e)에 대한 반응성은 대조군 처리 마우스와 비교할 때 유의미하게 증가되었다(각각 p = 0.003, p =0.0416 및 p = 0.0035). 또한, HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 및 항-PD1 차단의 조합은 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 처리 단독과 비교할 때 Adpgk(p = 0.002), Aatf(p = 0.040), Cpne1(p = 0.030) 및 P15E(p = 0.0008)에 대한 면역 반응성의 유의미한 증가를 야기하였다. 이들 데이터는 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 처리가 MC38 종양 모델에서 항-종양 면역 반응을 증가시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 이 증가는 항-PD1의 첨가에 의해 추가로 향상될 수 있다. 관문 차단에 의한 전신 항-종양 반응 및 이의 향상의 생성은 본 명세서의 효능 연구에서 입증된 바와 같이, 주사 병변과 비주사 병변 둘 다에 대해 항-종양 면역에 기여하여야 한다.
실시예 14: 마우스 직장결장(MC38) 종양 모델에서 4-1BB 작용제 mAb 효능과 조합한 HSV-1/ICP34.5 - /ICP47 - /mFLT3L/mIL12를 평가하는 연구
본 연구는 대측성 마우스 MC38 종양 모델에서 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 단독 또는 작용제 항체 표적화된 4-1BB(CD137이라고도 함)와 조합한 내약성 및 항-종양 활성을 평가하였다.
MC38 종양 세포(3×105개의 세포)를 제0일에 암컷 C57BL/6 마우스의 우측 및 좌측 옆구리에 피하로 주사하였다. 주당 2회(Q2W) 전자 캘리퍼를 이용하여 종양 용적(㎣)을 측정하였다. 일단 종양이 대략 100 ㎣의 평균 용적에 도달되면, 평균 종양 용적(양 옆구리에서) 및 치료 투여의 시작 시 종양 용적의 가변성이 처리군에 걸쳐 균일하게 되도록, 동물을 그룹(그룹당 10마리 마우스)에 무작위화시켰다. HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12(5×106 PFU/용량) 또는 제형 완충제 대조군을 총 3회의 주사를 위해 3일마다 종양내로(동물의 우측에) 투여하였다. 비주사 종양(대측성; 동물의 좌측)은 주사를 받지 않았다. 항-4-1BB 단클론성 항체(150 ㎍/용량)를 동일한 스케줄로 (총 3회의 주사에 대해 3일마다) 복강내 주사에 의해 투여하였다. 임상 징후, 체중 변화 및 생존을 연구 종결까지 매주 2회 측정하였다(종양이 800 ㎣에 도달되었을 때 마우스를 연구로부터 제거함).
모든 동물은 실험 내내 생존하였고, 체중에 의해 입증된 처리와 관련된 유해 건강 효과의 증거를 나타내지 않았고, 매일의 건강 모니터링 시험에 대해 확인된 유해 임상 징후는 나타나지 않았다.
단일 치료 둘 다, 항-4-1BB mAb 단독 및 5×106 PFU HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 단독은 대조군 처리 동물에 비해 유의미하게 증가된 생존을 입증하였다(각 비교를 위해 각각 p= 0.0048 및 p<0.0001). 5×106 PFU HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 처리 동물의 생존은 항-4-1BB mAb 단독과 비교할 때 통계적으로 유의미하였다(p=0.0175). 처리 둘 다의 조합, 즉, 항-4-1BB mAb와 5×106 PFU HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12를 더한 것은 모든 다른 처리군과 비교할 때 유의미하게 증가된 생존을 입증하였다(5×106 PFU HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 단독과 비교할 때 p=0.0246, 항-4-1BB 단독과 비교할 때 p=0.0004, 및 대조군 처리와 비교할 때 p<0.0001). 도 24 참조.
이들 데이터는 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12 또는 항-4-1BB mAb 처리 단독이 대조군 처리에 비해 전반적 생존의 유의미한 개선을 야기하였지만, 처리 둘 다의 조합은 처리 단독과 비교할 때 유의미하게 개선된 전반적 생존을 초래하였다는 것을 나타낸다.
실시예 15: 마우스 직장결장(MC38) 종양 모델에서 이중특이성 T 세포 관여자(BiTE ®) 분자와 조합한 HSV-1/ICP34.5 - /ICP47 - /mFLT3L/mIL12의 효능을 평가하는 연구
본 연구는 인간 상피세포 접착 분자(EpCAM)를 과발현시키는 대측성 마우스 MC38 종양 모델에서 HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12를 단독으로 또는 이중특이성 T 세포 관여자(BITE®) 분자와 조합한 내약성 및 항-종양 활성을 평가한다.
제0일에 내인성 마우스 CD3 좌위로부터 인간 CD3을 발현시키도록 조작한 암컷 C57BL/6 마우스의 우측 및 좌측 옆구리에 인간 EpCAM을 발현시키도록 조작된 MC38 종양 세포(3×105개의 세포)를 피하로 주사한다. 주당 2회(Q2W) 전자 캘리퍼를 이용하여 종양 용적(㎣)을 측정한다. 일단 종양이 대략 100 ㎣의 평균 용적에 도달되면, 평균 종양 용적(양 옆구리에서) 및 치료 투여의 시작 시 종양 용적의 가변성이 처리군에 걸쳐 균일하게 되도록, 동물을 그룹(그룹당 10마리 마우스)에 무작위화시킨다. HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12(5×106 PFU/용량) 또는 제형 완충제 대조군을 총 3회의 주사를 위해 3일마다 종양내로(동물의 우측에) 투여한다. 비주사 종양(대측성; 동물의 좌측)은 주사를 받지 않는다. 항-인간 CD3 및 항-인간 EpCAM 결합 도메인(150 ㎍/kg)을 함유하는 BiTE® 분자를 총 2회의 주사에 대해 1주 1회 정맥내 주사에 의해 투여한다. 임상 징후, 체중 변화 및 생존을 연구 종결까지 매주 2회 측정한다(종양이 800 ㎣에 도달되었을 때 마우스를 연구로부터 제거함).
SEQUENCE LISTING <110> AMGEN INC. <120> USE OF ONCOLYTIC VIRUSES FOR THE TREATMENT OF CANCER <130> A-2353-US-PSP <140> 62/813,961 <141> 2019-03-05 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> huFLT3L <400> 1 atgacagtgc tggcgccagc ctggagccca acaacctatc tcctcctgct gctgctgctg 60 agctcgggac tcagtgggac ccaggactgc tccttccaac acagccccat ctcctccgac 120 ttcgctgtca aaatccgtga gctgtctgac tacctgcttc aagattaccc agtcaccgtg 180 gcctccaacc tgcaggacga ggagctctgc ggtggcctct ggcggctggt cctggcacag 240 cgctggatgg agcggctcaa gactgtcgct gggtccaaga tgcaaggctt gctggagcgc 300 gtgaacacgg agatacactt tgtcaccaaa tgtgcctttc agccacctcc cagctgtctt 360 cgcttcgtcc agaccaacat ctcccgcctc ctgcaggaga cctccgagca gctggtggcg 420 ctgaagccct ggatcactcg ccagaacttc tcccggtgcc tggagctgca gtgtcaacct 480 gactcctcaa ctctgccacc tccatggagt ccacggcctc tggaggcaac agcgccgaca 540 gctccgcagc cccctctgtt actcctactg ctgctgcccg tgggcctcct actgctggca 600 gctgcctggt gcctgcactg gcagaggacg 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tggctggtgc aaagaaacat ggacttgaag ttcaacatca agagcagtag cagttcccct 480 gactctcggg cagtgacatg tggaatggcg tctctgtctg cagagaaggt cacactggac 540 caaagggact atgagaagta ttcagtgtcc tgccaggagg atgtcacctg cccaactgcc 600 gaggagaccc tgcccattga actggcgttg gaagcacggc agcagaataa atatgagaac 660 tacagcacca gcttcttcat cagggacatc atcaaaccag acccgcccaa gaacttgcag 720 atgaagcctt tgaagaactc acaggtggag gtcagctggg agtaccctga ctcctggagc 780 actccccatt cctacttctc cctcaagttc tttgttcgaa tccagcgcaa gaaagaaaag 840 atgaaggaga cagaggaggg gtgtaaccag aaaggtgcgt tcctcgtaga gaagacatct 900 accgaagtcc aatgcaaagg cgggaatgtc tgcgtgcaag ctcaggatcg ctattacaat 960 tcctcatgca gcaagtgggc atgtgttccc tgcagggtcc gatcc 1005 <210> 14 <211> 335 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> muIl12b <400> 14 Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val 20 25 30 Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu 35 40 45 Thr Cys Asp 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Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val 260 265 270 Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys 275 280 285 Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln 290 295 300 Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn 305 310 315 320 Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser 325 330 335 <210> 15 <211> 1599 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> murine single-chain IL12 (muIl12b-GGGGS-muIl12a) <400> 15 atgtgtcctc agaagctaac catctcctgg tttgccatcg ttttgctggt gtctccactc 60 atggccatgt gggagctgga gaaagacgtt tatgttgtag aggtggactg gactcccgat 120 gcccctggag aaacagtgaa cctcacctgt gacacgcctg aagaagatga catcacctgg 180 acctcagacc agagacatgg agtcataggc tctggaaaga ccctgaccat cactgtcaaa 240 gagtttctag atgctggcca gtacacctgc cacaaaggag gcgagactct gagccactca 300 catctgctgc tccacaagaa ggaaaatgga atttggtcca ctgaaatttt aaaaaatttc 360 aaaaacaaga ctttcctgaa gtgtgaagca ccaaattact ccggacggtt cacgtgctca 420 tggctggtgc aaagaaacat ggacttgaag ttcaacatca agagcagtag cagttcccct 480 gactctcggg cagtgacatg tggaatggcg tctctgtctg cagagaaggt cacactggac 540 caaagggact atgagaagta ttcagtgtcc tgccaggagg atgtcacctg cccaactgcc 600 gaggagaccc tgcccattga actggcgttg gaagcacggc agcagaataa atatgagaac 660 tacagcacca gcttcttcat cagggacatc atcaaaccag acccgcccaa gaacttgcag 720 atgaagcctt tgaagaactc acaggtggag gtcagctggg agtaccctga ctcctggagc 780 actccccatt cctacttctc cctcaagttc tttgttcgaa tccagcgcaa gaaagaaaag 840 atgaaggaga cagaggaggg gtgtaaccag aaaggtgcgt tcctcgtaga gaagacatct 900 accgaagtcc aatgcaaagg cgggaatgtc tgcgtgcaag ctcaggatcg ctattacaat 960 tcctcatgca gcaagtgggc atgtgttccc tgcagggtcc gatccggcgg tggagggtcc 1020 agggtcattc cagtctctgg acctgccagg tgtcttagcc agtcccgaaa cctgctgaag 1080 accacagatg acatggtgaa gacggccaga gaaaaactga aacattattc ctgcactgct 1140 gaagacatcg atcatgaaga catcacacgg gaccaaacca gcacattgaa gacctgttta 1200 ccactggaac tacacaagaa cgagagttgc ctggctacta gagagacttc ttccacaaca 1260 agagggagct gcctgccccc acagaagacg tctttgatga tgaccctgtg ccttggtagc 1320 atctatgagg acttgaagat gtaccagaca gagttccagg ccatcaacgc agcacttcag 1380 aatcacaacc atcagcagat cattctagac aagggcatgc tggtggccat cgatgagctg 1440 atgcagtctc tgaatcataa tggcgagact ctgcgccaga aacctcctgt gggagaagca 1500 gacccttaca gagtgaaaat gaagctctgc atcctgcttc acgccttcag cacccgcgtc 1560 gtgaccatca acagggtgat gggctatctg agctccgcc 1599 <210> 16 <211> 533 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> murine single-chain IL12 (muIl12b-GGGGS-muIl12a) <400> 16 Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val 20 25 30 Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu 35 40 45 Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln 50 55 60 Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys 65 70 75 80 Glu Phe Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr 85 90 95 Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp 100 105 110 Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys 115 120 125 Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln 130 135 140 Arg Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro 145 150 155 160 Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys 165 170 175 Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln 180 185 190 Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu 195 200 205 Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser 210 215 220 Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln 225 230 235 240 Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro 245 250 255 Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val 260 265 270 Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys 275 280 285 Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln 290 295 300 Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn 305 310 315 320 Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser Gly 325 330 335 Gly Gly Gly Ser Arg Val Ile Pro Val Ser Gly Pro Ala Arg Cys Leu 340 345 350 Ser Gln Ser Arg Asn Leu Leu Lys Thr Thr Asp Asp Met Val Lys Thr 355 360 365 Ala Arg Glu Lys Leu Lys His Tyr Ser Cys Thr Ala Glu Asp Ile Asp 370 375 380 His Glu Asp Ile Thr Arg Asp Gln Thr Ser Thr Leu Lys Thr Cys Leu 385 390 395 400 Pro Leu Glu Leu His Lys Asn Glu Ser Cys Leu Ala Thr Arg Glu Thr 405 410 415 Ser Ser Thr Thr Arg Gly Ser Cys Leu Pro Pro Gln Lys Thr Ser Leu 420 425 430 Met Met Thr Leu Cys Leu Gly Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr 435 440 445 Gln Thr Glu Phe Gln Ala Ile Asn Ala Ala Leu Gln Asn His Asn His 450 455 460 Gln Gln Ile Ile Leu Asp Lys Gly Met Leu Val Ala Ile Asp Glu Leu 465 470 475 480 Met Gln Ser Leu Asn His Asn Gly Glu Thr Leu Arg Gln Lys Pro Pro 485 490 495 Val Gly Glu Ala Asp Pro Tyr Arg Val Lys Met Lys Leu Cys Ile Leu 500 505 510 Leu His Ala Phe Ser Thr Arg Val Val Thr Ile Asn Arg Val Met Gly 515 520 525 Tyr Leu Ser Ser Ala 530 <210> 17 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GSG-P2A <400> 17 ggatccggtg ccacaaactt ctctttgcta aagcaagcag gagatgttga ggaaaaccct 60 gggccc 66 <210> 18 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GSG-P2A <400> 18 Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 19 <211> 587 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRES sequence <400> 19 cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 60 tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 120 gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 180 aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 240 aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 300 ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 360 cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa 420 ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggta 480 cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 540 ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataatatggc cacaacc 587 <210> 20 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak sequence <400> 20 ctaggccacc 10 <210> 21 <211> 225 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BGHpA sequence <400> 21 ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60 tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120 tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180 gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225 <210> 22 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Elastin sequence <400> 22 gttcctggag taggggtacc tggagtgggc ggatct 36 <210> 23 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Elastin sequence <400> 23 Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 24 <211> 588 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV sequence <400> 24 gttgacattg 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Claims (34)

  1. 종양 용해 바이러스(oncolytic virus)로서,
    이종성 수지상 세포 성장 인자를 암호화하는 핵산 서열; 및
    제1 이종성 사이토카인을 암호화하는 핵산 서열
    을 포함하는, 종양 용해 바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 이종성 수지상 세포 성장 인자를 암호화하는 상기 핵산 서열 및 제1 이종성 사이토카인을 암호화하는 상기 핵산 서열은 링커 요소를 암호화하는 핵산 서열에 의해 연결된, 종양 용해 바이러스.
  3. 제2항에 있어서, 상기 링커 요소는 돼지 테스코 바이러스 2a(porcine tescho virus 2a: P2A) 또는 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosomal entry site: IRES)인, 종양 용해 바이러스.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 용해 바이러스는 단순 포진 바이러스인, 종양 용해 바이러스.
  5. 제4항에 있어서, 상기 단순 포진 바이러스는 단순 포진 바이러스-1(herpes simplex-1 virus)인, 종양 용해 바이러스.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 용해 바이러스는 추가로:
    ICP 34.5를 암호화하는 기능성 유전자를 결여하고;
    ICP 47을 암호화하는 기능성 유전자를 결여하는,
    종양 용해 바이러스.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 용해 바이러스는 프로모터를 더 포함하고, 상기 수지상 세포 성장 인자를 암호화하는 상기 핵산 서열 및 상기 제1 사이토카인을 암호화하는 상기 핵산 서열은 둘 다 상기 프로모터의 제어 하에 있는, 종양 용해 바이러스.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 용해 바이러스는 제1 프로모터 및 제2 프로모터를 더 포함하되,
    상기 수지상 세포 성장 인자를 암호화하는 상기 핵산 서열이 상기 제1 프로모터의 제어 하에 있고;
    상기 제1 사이토카인을 암호화하는 상기 핵산 서열이 상기 제2 프로모터의 제어 하에 있는, 종양 용해 바이러스.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 이종성 사이토카인은 인터류킨인, 종양 용해 바이러스.
  10. 제9항에 있어서, 상기 인터류킨은 인터류킨-12(IL12)인, 종양 용해 바이러스.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 수지상 세포 성장 인자는 제2 사이토카인인, 종양 용해 바이러스.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제2 사이토카인은 Fms-관련 티로신 키나제 3 리간드(FLT3L)인, 종양 용해 바이러스.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 용해 바이러스는 단순 포진 바이러스 1(HSV-1)이되,
    상기 HSV-1은:
    ICP34.5를 암호화하는 기능성 유전자를 결여하고,
    ICP47을 암호화하는 기능성 유전자를 결여하며;
    상기 이종성 수지상 세포 성장 인자는 FLT3L이고;
    상기 이종성 제1 사이토카인은 IL12인, 종양 용해 바이러스.
  14. 제13항에 있어서, IL12를 암호화하는 상기 핵산 및 FLT3L을 암호화하는 상기 핵산은 ICP34.5를 암호화하는 유전자의 앞 부위에 존재하는, 종양 용해 바이러스.
  15. 제14항에 있어서, IL12를 암호화하는 상기 핵산 및 FLT3L을 암호화하는 상기 핵산은 P2A를 통해 연결되는, 종양 용해 바이러스.
  16. 제15항에 있어서, IL12, FLT3L 및 P2A를 암호화하는 상기 핵산은 [Flt3L]-[P2A]-[IL12]로서 제시되는, 종양 용해 바이러스.
  17. 제16항에 있어서, 상기 [Flt3L]-[P2A]-[IL12]는 단일 프로모터의 제어 하에 있는, 종양 용해 바이러스.
  18. 제17항에 있어서, 상기 프로모터는 거대세포바이러스(CMV), 라우스 육종 바이러스(RSV), 인간 연장인자 1α 프로모터(EF1α), 유인원 바이러스 40 초기 프로모터(SV40), 포스포글리세린산 키나제 1 프로모터(PGK), 유비퀴틴 C 프로모터(UBC) 및 뮤린 줄기 세포 바이러스(MSCV)를 포함하는 목록으로부터 선택된, 종양 용해 바이러스.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 용해 바이러스는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 서열(BGHpA)을 더 포함하는, 종양 용해 바이러스.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 용해 바이러스는 포유류 번역을 향상시키는 핵산을 더 포함하는, 종양 용해 바이러스.
  21. 제20항에 있어서, 포유류 번역을 향상시키는 상기 핵산은 Kozak 서열 또는 공통 Kozak 서열인, 종양 용해 바이러스.
  22. 제21항에 있어서, 상기 공통 Kozak 서열은 서열번호 20에 열거된, Kozak 서열.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 용해 바이러스는 [CMV]-[Kozak]-[Flt3L]-[P2A]-[IL12]-[BGHpA]를 암호화하는 핵산 또는 핵산들을 포함하는, 종양 용해 바이러스.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL12는 [P40 서브유닛]-[GGGGS]-[P35 서브유닛]으로서 제시되는, 종양 용해 바이러스.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL12 P35 서브유닛에서 상기 신호 펩티드가 존재하지 않는, 종양 용해 바이러스.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 용해 바이러스는 균주 JS1로부터 유래된, 종양 용해 바이러스.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 용해 바이러스는:
    서열번호 1을 포함하는 FLT3L 서열; 및
    서열번호 7을 포함하는 IL12 서열
    을 포함하는, 종양 용해 바이러스.
  28. 제27항에 있어서, 상기 종양 용해 바이러스는 HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12인, 종양 용해 바이러스.
  29. 제28항에 있어서, 상기 종양 용해 바이러스는:
    서열번호 24를 포함하는 CMV 프로모터;
    서열번호 20을 포함하는 Kozak 서열;
    서열번호 1을 포함하는 FLT3L 서열;
    P2A 서열 서열번호 17;
    서열번호 7을 포함하는 IL12 서열; 및
    서열번호 21을 포함하는 BGHpA 서열
    을 포함하는, 종양 용해 바이러스.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 종양 용해 바이러스를 이용하는 암 치료 방법.
  31. 암 치료에서 사용하기 위한 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 치료적 유효량의 종양 용해 바이러스.
  32. 암 치료 방법에서 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 종양 용해 바이러스를 포함하는, 약제학적 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 상기 조성물은 관문 저해제를 더 포함하는, 약제학적 조성물.
  34. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 종양 용해 바이러스를 포함하는 키트.
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