KR102370150B1 - 전사 조절 인자 및 이의 외래 단백질 발현 증강에 있어서의 응용 - Google Patents

전사 조절 인자 및 이의 외래 단백질 발현 증강에 있어서의 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질 발현 시스템에서 단백질 발현 수준을 높이기 위한 WXRE 전사 조절 인자(transcriptional regulatory element)로 사용할 수 있는 폴리뉴클레오티드, 및 전술한 WXRE 전사 조절 인자를 포함하는 단백질 발현 벡터 또는 단백질 발현 시스템 및 이들의 사용에 관한 것이다. 본 발명에 따른 전사 조절 인자 WXRE를 사용함으로써 외래 단백질의 발현 수준을 대폭 향상시킴과 아울러 그 자체의 생화학적 활성을 유지할 수 있다.

Description

전사 조절 인자 및 이의 외래 단백질 발현 증강에 있어서의 응용
본 발명은 분자 생물학 및 생물 공학 분야에 관한 것이다. 특히 본 발명은 포유동물 세포를 사용해서 외래 단백질을 발현함에 있어서 신규 전사 조절 인자에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 진핵 세포주에서 외래 단백질을 제조하고 그 발현 수준을 증강하기 위해 사용되는 전사 조절 인자인 WXRE(WuXi Regulatory Element), 및 WXRE를 함유하는 외래 단백질 발현 시스템, 그리고 외래 단백질 생산에 있어서 상기 발현 시스템의 응용에 관한 것이다.
생물학적 연구에서 단백질 연구가 점점 주목을 받고 있다. 단백질 연구에서 가장 중요한 것은 단백질 발현 시스템을 선택하는 것이다. 단백질 발현 시스템이란, 세균, 효모, 식물 세포 또는 동물 세포 등의 모델 생물을 이용해서 외래 단백질을 발현하는 분자 생물학적 기술이다. 단백질 발현 시스템은 원핵 생물 발현 시스템과 진핵 생물 발현 시스템으로 대략 구별된다.
여기서 원핵 생물 발현 시스템은 원핵 생물을 통해 외래 단백질을 취득하는 시스템이며, 주로 대장균 발현 시스템, 고초균 발현 시스템, 스트렙토미세스 발현 시스템 등이 포함된다. 이 중, 대장균 시스템이 가장 널리 사용되고 있다. 원핵 생물 발현 시스템은 숙주 세균의 급속한 증식, 간단한 배양, 편리한 조작, 저렴한 가격, 명확한 유전적 배경, 안전한 유전자, 단백질의 높은 발현 수준과 같은 특징이 있다. 그러나 원핵 생물 발현 시스템은 발현 시간 및 발현 수준을 제어할 수 없다. 또한 원핵 생물 발현 시스템은 발현 산물이 봉입체로 존재할 가능성이 있기 때문에 생물적 활성이 낮고 번역 후 프로세싱 및 수식 시스템이 불완전하다(예를 들면 글리코실화 수식이 불가능).
한편, 진핵 생물 발현 시스템에는 주로 포유동물 세포, 효모 세포 및 곤충 세포 발현 시스템이 포함된다. 이것은 최근 일반적으로 외래 단백질 발현에 사용되는 수단 중 하나이며, 원핵 생물 발현 시스템에 결여된 몇 가지 기능을 보완한다. 구체적으로 예를 들면 진핵 생물 발현 시스템으로 발현했을 경우에는 안정된 이황화 결합을 형성할 수 있고, 단백질이 번역된 후 단백질을 올바르게 수식함으로써 발현된 단백질이 분해되거나 봉입체를 형성하지 않고 보다 천연 활성을 가질 수 있다. 그 중 포유동물 발현 시스템은 고효율 발현의 유도, 발현 단백질의 올바른 폴딩, 복잡한 글리코실화 수식을 정확하게 수행할 수 있고, 천연 단백질에 가까운 단백질 활성을 가지면서 내독소(endotoxin)를 제거할 필요가 없다는 점 등의 특징이 있다. 그리고 포유동물 발현 시스템은 복잡한 단백질을 발현할 수 있는 유일한 시스템이며 항체, 예를 들면 인간화 단클론 항체 생산에 있어 대량 생산 가능하고 인간화 특성이 양호한 점 등의 특징이 있다. 포유동물 발현 시스템에 일반적으로 사용되는 숙주 세포에는 CHO, COS, BHK 등의 세포가 포함된다.
아달리무맙(adalimumab, 상품명: HUMIRA)은 류마티스 관절염과 강직성 척추염 치료에 대한 응용이 NMPA(National Medical Products Administration)에 승인된 항인간 종양괴사인자(TNF)의 인간화 단클론 항체이다. 그리고 양호한 치료 효과를 갖는다.
과립구 대식 세포 집락 자극인자(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)는 다기능성 조혈 세포 성장인자이며, 과립구류 및 대식 세포의 발달과 성숙에 조절적 역할을 수행한다. GM-CSF는 활막 조직 단구의 염증성 수상 세포로의 분화에도 중요한 역할을 하고, 급성 관절염의 발생과 증상 유발 및 유지에 관여한다. 그리고 류마티스 관절염 환자의 혈청 및 활막 검사에서 GM-CSF 인자 수치가 현저하게 증가하여 질병 활성과 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었다. 이것은 주로 뼈 침식의 악화, 활막 내층 세포 및 그 하층 세포에 다수의 대식 세포 침윤에 반영된다.
PD-1은 활성화된 T 세포와 B 세포에 의해 발현되는 중요한 면역 체크포인트 수용체이며 면역 억제를 중개할 수 있다. PD-1은 CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1 및 BTLA를 포함하는 CD28 수용체 패밀리 중 하나이다. PD-1에 대해, 세포 표면 당단백질 리간드인 프로그램된 세포사멸 리간드-1(PD-L1)와 프로그램된 세포사멸 리간드-2(PD-L2)가 이미 식별되어 있다. 이들은 항원 제시 세포와 많은 인간 암에서 발현되며, PD-1에 결합하면 T 세포의 활성화와 세포 인자의 분비를 하향 조절(down regulation)하는 것으로 나타났다.
PD-L1은 CD274 또는 B7-H1이라고도 불린다. 이것은 다양한 종양 세포에서 발현이 상향 조절(up regulation)되고 T 세포상의 PD-1과 결합하면 T 세포의 증식과 활성화를 억제하여 T 세포를 불활성화 상태로 하고 최종적으로는 면역 도피를 유도한다. PD-L1 억제제는 PD-1과 PD-L1의 결합을 블록킹할 수 있으며, T 세포의 성장과 증식을 상향 조절하고, 종양 세포에 대한 T 세포의 인식을 높여 T 세포의 공격과 살해능을 활성화하고 인간 자신의 면역 기능을 동원함으로써 항종양 효과를 발휘한다.
아달리무맙 등의 단클론 항체, PD-1에 대한 단클론 항체 및 PD-L1에 대한 단클론 항체는 모두 포유동물 발현 시스템을 통해 생산될 수 있는 반면, 포유동물 발현 시스템은 외래 단백질의 발현 수준이 낮다는 문제가 있다. 따라서 선행기술로 알려져 있는 포유동물 발현 시스템을 개선하여 현저히 높은 수준의 외래 단백질 발현을 달성할 수 있는 시스템을 제공하는 것이 절박한 상황이다. 그리고 인간화 단클론 항체를 제작하려면 상기 시스템이 필요하다.
본 발명은 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포에서 유래한 외래 단백질 발현 증강에 사용할 수 있는 DNA 서열이며, 포유동물 발현 시스템에서 외래 단백질 발현 수준을 증강할 수 있는 DNA 서열을 제공한다.
본 발명에 따른 기술 구성은 다음과 같다.
(1) (i) 내지 (iv)에서 선택되는 어느 하나의 폴리뉴클레오티드:
(i) SEQ ID NO: 3-9 중 어느 하나로 표시되는 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열;
(ii) SEQ ID NO: 3-9 중 어느 하나로 표시되는 서열의 역상보 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열;
(iii) 고 엄격성 혼성화(high stringency hybridization) 조건 또는 보다 고 엄격성 혼성화 조건에서 (i) 또는 (ii)로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 혼성화 가능한 서열의 역상보 서열;
(iv) (i) 또는 (ii)로 표시되는 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%, 나아가 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 97%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열.
(2) (v) 내지 (viii)에서 선택되는 어느 하나를 더 포함하는, (1)에 기재된 폴리뉴클레오티드:
(v) SEQ ID NO: 13으로 표시되는 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열;
(vi) SEQ ID NO: 13으로 표시되는 서열의 역상보 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열;
(vii) 고 엄격성 혼성화 조건 또는 보다 고 엄격성 혼성화 조건에서 (v) 또는 (vi)로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 혼성화 가능한 서열의 역상보 서열;
(viii) (v) 또는 (vi)로 표시되는 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%, 나아가 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 97%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열.
(3) 단백질 발현 시스템에서 단백질 발현 수준을 높일 수 있는, (1) 또는 (2)에 기재된 폴리뉴클레오티드. 임의로 단백질 발현 시스템이 진핵 세포 단백질 발현 시스템에서 선택된다. 바람직하게는, 상기 진핵 세포 단백질 발현 시스템이 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포의 단백질 발현 시스템이다.
(4) 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 4로 표시되는 서열을 포함하는 서열, 또는 SEQ ID NO: 4로 표시되는 서열의 역상보 서열을 포함하는 서열에서 선택되는, (1) 또는 (2)에 기재된 폴리뉴클레오티드. 임의로 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 4로 표시되는 서열과 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID NO: 4로 표시되는 서열의 역상보 서열과 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 서열의 역상보 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에서 선택된다.
(5) 단백질 발현 시스템이 항체, 융합 단백질 또는 재조합 단백질을 발현하는 것인, (3)에 기재된 폴리뉴클레오티드. 임의로 상기 항체는 단클론 항체에서 선택되고, 상기 융합 단백질이 프로그램된 세포사멸 수용체-1(Programmed Death-1, PD-1)에 대한 항체, 또는 프로그램된 세포사멸 수용체 리간드-1(Programmed Death-Ligand 1, PD-L1)에 대한 항체이다. 바람직하게는, 상기 단클론 항체는 아달리무맙이고, 상기 PD-1에 대한 항체는 펨브롤리주맙(pembrolizumab)이다.
(6) (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는, 단백질 발현 시스템의 단백질 발현 수준을 증강하기 위한 WXRE 전사 조절 인자.
(7) (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 (6)에 기재된 WXRE 전사 조절 인자를 함유하는 단백질 발현 벡터 또는 단백질 발현 시스템. 임의로 상기 단백질 발현 벡터 또는 단백질 발현 시스템은 적어도 1개의 프로모터와 적어도 1개의 제한 효소 사이트를 더 포함한다. 바람직하게는, 상기 단백질 발현 벡터 또는 단백질 발현 시스템은 포유동물 세포 단백질 발현 벡터 또는 포유동물 세포 단백질 발현 시스템에서 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 포유동물 세포는 CHO 세포이다.
(8) (7)에 기재된 단백질 발현 벡터 또는 단백질 발현 시스템을 함유하는 세포주.
(9) (7)에 기재된 단백질 발현 벡터 또는 단백질 발현 시스템, 또는 (8)에 기재된 세포주를 함유하는 키트.
(10) (7)에 기재된 단백질 발현 벡터 또는 단백질 발현 시스템, 또는 (8)에 기재된 세포주의, 비정상적인 단백질 발현에 의한 동물 질환을 검출하기 위한 시약 또는 키트 제조에서의 사용.
(11) 상기 동물 질환이 상기 동물체에서 표적 단백질의 비정상적인 발현을 야기하고, 또한 상기 단백질 발현 벡터 또는 단백질 발현 시스템 또는 세포주가 상기 표적 단백질에 대한 항체를 분비할 수 있는, (10)에 기재된 사용. 임의로 상기 동물은 포유동물에서 선택된다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 인간이다.
본 발명의 일 측면에서 류마티스 관절염은 GM-CSF 인자의 발현 수준이 현저히 증강되어 질병 활성과 밀접한 관련이 있음을 선행 기술로부터 알 수 있다. 이것은 주로 뼈 침식의 발전, 활막 내층 세포 및 그 하층에 다수의 대식 세포 침윤에 반영된다. 따라서, 본 발명에 따른 단백질 발현 벡터 또는 단백질 발현 시스템을 통해 항GM-CSF 항체를 제조할 수 있다. 여기서, GM-CSF 항체의 서열은 선행 기술에서 알려진 바와 같다. 예시적으로 항GM-CSF 항체의 서열은 WO2018050111A1에 개시된 서열에서 선택할 수 있다. 항GM-CSF 항체가 얻어진 후 GM-CSF의 발현 수준을 검출함으로써 류마티스 관절염 진단에 사용할 수 있다.
(12) (7)에 기재된 단백질 발현 벡터 또는 단백질 발현 시스템, 또는 (8)에 기재된 세포주에서 발현된 단백질의, 동물 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약품 제조에 대한 사용. 임의로 상기 동물 질환은 종양 또는 자가 면역 질환에서 선택된다.
(13) 상기 종양은 암에서 선택되고, 및/또는 상기 자가 면역 질환은 류마티스 관절염 또는 강직성 척추염에서 선택되는, (12)에 기재된 사용.
(14) (7)에 기재된 단백질 발현 벡터 또는 단백질 발현 시스템, 또는 (8)에 기재된 세포주를 선택해서 상기 단백질을 분비하는, 단백질을 제조하는 방법. 임의로 상기 단백질은 항체, 융합 단백질 또는 재조합 단백질에서 선택된다. 바람직하게는, 상기 항체는 단클론 항체에서 선택된다. 상기 융합 단백질은 프로그램된 세포사멸 수용체-1(Programmed Death-1, PD-1)에 대한 항체, 또는 프로그램된 세포사멸 수용체 리간드-1(Programmed Death-Ligand 1, PD-L1)에 대한 항체이다; 보다 바람직하게는, 상기 단클론 항체는 아달리무맙이고, 상기 PD-1에 대한 항체는 펨브롤리주맙이다.
(15) 표적 단백질을 고발현하는 안정된 세포주의 스크리닝 방법으로서, (7)에 기재된 단백질 발현 벡터 또는 단백질 발현 시스템을 이용해서 상기 표적 단백질을 코딩하는 표적 유전자를 상기 세포에 트랜스펙션하여 표적 단백질을 고발현하는 안정된 세포주를 스크리닝해서 취득하는 방법. 임의로 상기 단백질 발현 벡터 또는 단백질 발현 시스템은 포유동물 세포의 단백질 발현 벡터 또는 포유동물 세포의 단백질 발현 시스템에서 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 포유동물 세포는 CHO 세포이다.
(16) (15)에 기재된 스크리닝 방법으로서, 상기 스크리닝 방법은 선택 마커인 항생물질에 의한 스크리닝, 또는 증폭된 마커 유전자에 대한 시약 스트레스에 의한 스크리닝이 포함되는, 방법.
(17) (15) 또는 (16)에 기재된 스크리닝 방법을 이용해서 얻어진 세포주.
(18) (7)에 기재된 단백질 발현 벡터 또는 단백질 발현 시스템, 또는 (8)에 기재된 세포주에서 분비된 단백질을 이용해서 상기 동물이 병에 걸렸는지 여부를 검출하기 위한 방법으로서, 상기 동물의 질환은 상기 동물체에서 표적 단백질의 비정상적인 발현을 야기할 수 있는, 동물의 질환을 검출하는 방법.
(i) 상기 분비된 단백질이 상기 검출 표적 단백질과 상호작용 가능한 경우, 상기 동물이 질환을 갖고 있다는 것을 나타낸다;
(ii) 상기 분비된 단백질이 상기 검출 표적 단백질과 상호작용 불가능한 경우, 상기 동물이 질환을 갖고 있지 않다는 것을 나타낸다.
(19) 상기 단백질 발현 벡터 또는 단백질 발현 시스템, 또는 세포주가 상기 검출 목적으로 하는 단백질에 대한 항체를 분비할 수 있는, (18)에 기재된 방법. 임의로 상기 동물은 포유동물에서 선택된다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 인간이다.
(20) (7)에 기재된 단백질 발현 벡터 또는 단백질 발현 시스템, 또는 (8)에 기재된 세포주에서 분비된 단백질을 상기 동물에게 투여하는, 동물의 질환을 치료 또는 예방하는 방법. 임의로 상기 동물의 질환은 종양 또는 자가 면역 질환에서 선택된다.
(21) 상기 종양은 암에서 선택되는, 및/또는 상기 자가 면역 질환은 류마티스 관절염 또는 강직성 척추염에서 선택되는, (20)에 기재된 방법.
(22) 표적 항체를 제조하는 방법으로서, 다음 단계를 포함하는 방법:
(i) (14)에 기재된 단백질을 제조하는 방법에 따라 상기 단백질을 제조해서 얻는 단계;
(ii) 단계 (i)에서 얻어진 상기 단백질을 동물에 면역시켜서, 대응하는 상기 표적 항체를 얻는 단계.
(23) (1) 또는 (2)에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 적어도 어느 하나를 포함하는 벡터.
(24) CMV 프로모터를 더 포함하는, (23)에 기재된 벡터. 임의로 상기 CMV 프로모터가 SEQ ID NO: 16으로 표시되는 서열을 포함하거나, 또는 상기 CMV 프로모터가 상기 SEQ ID NO: 16으로 표시되는 서열과 적어도 90%, 나아가 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 97%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
(25) 1종류 또는 여러 종류의 표적 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함하는, (23) 또는 (24)에 기재된 벡터.
(26) 상기 표적 단백질은 항체, 융합 단백질, 효소, 가용성 단백질, 막 단백질, 구조 단백질, 리보솜 단백질, 자이모겐(zymogen), 세포 표면 수용체 단백질, 전사 조절 단백질, 번역 조절 단백질, 염색질 단백질, 호르몬, 세포주기 조절 단백질, G 단백질, 신경 활성화 펩티드(neuroactive peptide), 면역 조절 단백질, 혈액 성분 단백질, 이온 채널 단백질, 열 충격 단백질(heat shock protein), 디히드로 엽산환원효소(dihydrofolate reductase), 항생물질 내성 단백질, 어느 하나의 상기 단백질의 기능적 단편(fragment), 어느 하나의 상기 단백질의 에피토프(epitope) 단편, 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, (25)에 기재된 벡터.
(27) (23) 내지 (26) 중 어느 하나에 기재된 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 숙주 세포.
(28) (23) 내지 (26) 중 어느 하나에 기재된 벡터를 이용해서 원래의 숙주 세포를 형질 전환하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 단백질을 안정적으로 발현하는 숙주 세포를 제조하는 방법.
(29) 상기 숙주 세포가 중국 햄스터 난소 세포인, (27)에 기재된 숙주 세포 또는 (28)에 기재된 방법.
(30) (27)에 기재된 숙주 세포를 사용하거나, (28) 또는 (29)에 기재된 방법을 이용함으로써 상기 표적 단백질을 제조하는 것을 포함하는, 표적 단백질을 제조하는 방법.
임의로 본 발명은 다음 실시형태를 제공한다.
(31) SEQ ID NO: 3-9로 이루어진 군에서 선택되는 제어 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 프로모터; 및 폴리펩티드를 코딩하는 외래 서열;을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 제어 서열, 상기 프로모터, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 외래 서열이 작동 가능하게 연결되어 있는 폴리뉴클레오티드.
(32) EF1αI 유전자의 인트론을 더 포함하는, (31)에 기재된 폴리뉴클레오티드.
(33) 상기 EF1αI 유전자의 인트론은 SEQ ID NO: 13과 적어도 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, (32)에 기재된 폴리뉴클레오티드.
(34) 상기 SEQ ID NO: 3-9로 이루어진 군에서 선택되는 제어 서열은 정방향(forward direction)인, (33)에 기재된 폴리뉴클레오티드.
(35) 상기 SEQ ID NO: 3-9로 이루어진 군에서 선택되는 제어 서열은 역방향(reverse direction)인, (34)에 기재된 폴리뉴클레오티드.
(36) 다음 서열을 포함하는, 항체의 발현을 증강하기 위한 숙주 세포:
SEQ ID NO: 3-9 중 어느 하나의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 서열 또는 SEQ ID NO: 3-9 중 어느 하나의 서열의 역상보 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는, 항체 중쇄 또는 그 단편을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및
SEQ ID NO: 3-9 중 어느 하나의 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 서열 또는 SEQ ID NO: 3-9 중 어느 하나의 서열의 역상보 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는, 항체 경쇄 또는 그 단편을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드.
(37) 상기 제1 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 4와 적어도 85% 동일성을 갖는 서열에 작동 가능하게 연결되어 있으면서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 4와 적어도 85% 동일성을 갖는 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는, (36)에 기재된 숙주 세포.
(38) 상기 제1 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 4와 적어도 85% 동일성을 갖는 서열에 작동 가능하게 연결되어 있으면서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 9와 적어도 85% 동일성을 갖는 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는, (36)에 기재된 숙주 세포.
(39) 상기 제1 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 9와 적어도 85% 동일성을 갖는 서열에 작동 가능하게 연결되어 있으면서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 9와 적어도 85% 동일성을 갖는 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는, (36)에 기재된 숙주 세포.
(40) 상기 제1 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 4와 적어도 85% 동일성을 갖는 서열에 작동 가능하게 연결되어 있으면서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 17과 적어도 85% 동일성을 갖는 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는, (36)에 기재된 숙주 세포.
(41) 상기 제1 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 9와 적어도 85% 동일성을 갖는 서열에 작동 가능하게 연결되어 있으면서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO: 17과 적어도 85% 동일성을 갖는 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는, (36)에 기재된 숙주 세포.
(42) 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터로서, 상기 발현 카세트는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터, 및 SEQ ID NO: 3-9로 이루어진 군에서 선택되는 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 제어 서열이 포함되며, 상기 제어 서열은 상기 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있는 발현 벡터.
(43) 센스 가닥과 안티센스 가닥을 가지며, 상기 센스 가닥은 SEQ ID NO: 3-9로 이루어진 군에서 선택되는 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 서열(5'에서 3'으로)을 포함하는, (42)에 기재된 발현 벡터.
(44) 센스 가닥과 안티센스 가닥을 가지며, 상기 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 3-9로 이루어진 군에서 선택되는 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 서열(5'에서 3'으로)을 포함하는, (42)에 기재된 발현 벡터.
본 발명의 일 측면에서, 본 발명에 의한 전사 조절 인자(transcriptional regulatory element) WXRE를 사용함으로써 외래 단백질 발현 수준을 대폭 향상시켜 포유동물 단백질 생산에 크게 기여한다.
일부 실시형태에서, 외래 단백질 발현 수준은 약 또는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 증가한다. 일부 실시형태에서 외래 단백질의 발현 수준은 80% 증가한다.
다른 실시형태에서, 본 발명에 의한 전사 조절 인자 WXRE를 사용함으로써 외래 단백질 발현 수준을 대폭 향상시키는 동시에 그 자체의 생화학적 활성을 유지할 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명에 의한 전사 조절 인자 WXRE는 다른 전사 조절 인자와 함께 일체적으로 사용할 수 있으며, 외래 단백질 발현 수준을 대폭 향상시키는 동시에 그 자체의 생화학적 활성을 유지할 수 있다.
도 1은 WXRE가 삽입되지 않은 GFP 발현 벡터의 모식도를 나타낸다.
도 2는 WXRE가 삽입된 GFP 발현 벡터의 모식도를 나타낸다.
도 3은 전사 조절 인자(transcriptional regulatory element) A~G의 첨가가 융합 단백질의 발현 수준에 미치는 영향을 나타낸다. 여기서 A1 및 A2는 각각 전사 조절 인자 A의 정방향 및 역방향을 나타낸다. 이하 동일.
도 4는 전사 조절 인자 A~G의 첨가가 융합 단백질 발현의 비생산율(比生産率, specific production rate)에 미치는 영향을 나타낸다. 여기서 A1 및 A2는 각각 전사 조절 인자 A의 정방향 및 역방향을 나타낸다. 이하 동일.
도 5는 WXRE를 삽입한 아달리무맙 중쇄 발현 벡터의 모식도를 나타낸다. 여기서 HC는 중쇄를 의미한다.
도 6은 WXRE를 삽입한 아달리무맙 경쇄 발현 벡터의 모식도를 나타낸다. 여기서 LC는 경쇄를 의미한다.
도 7은 전사 조절 인자의 상이한 조합 조건하에 14일째에 아달리무맙의 발현 수준을 비교한 것이다. 샘플 1-샘플 6에서 중쇄 상류에 있는 전사 조절 인자의 구성과 경쇄 상류에 있는 전사 조절 인자의 구성을 표 6에 나타낸다.
도 8은 WXRE와 EF1αI 인트론(즉 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 서열)이 삽입된 항체 중쇄 발현 벡터의 모식도를 나타낸다. 여기서 HC는 중쇄를 의미한다.
도 9는 WXRE와 EF1αI 인트론(즉 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 서열)이 삽입된 항체 경쇄 발현 벡터의 모식도를 나타낸다. 여기서 LC는 경쇄를 의미한다.
도 10은 항체 중쇄 발현 벡터의 모식도를 나타낸다.
도 11은 항체 경쇄 발현 벡터의 모식도를 나타낸다.
정의
본 발명의 특허청구범위 및/또는 명세서에서 "하나(a)", "하나(an)" 또는 "하나(the)"라는 단어는 "1개"를 가리키는 경우가 있으나, "1개 또는 복수", "적어도 1개" 및 "1개 또는 1개 초과"를 가리킬 수 있다.
특허청구범위 및 명세서에서 사용되는 "가지다", "포함하다" 또는 "함유하다"라는 용어는 포괄적 또는 개방 형식을 의미하며, 기재되지 않은 요소 또는 방법·단계를 배제하지 않는다. 그리고 "가지다", "포함하다" 또는 "함유하다"는 폐쇄 형식을 의미하는 경우도 있으며, 기재되지 않은 요소 또는 방법·단계를 배제한다.
본 출원 전체에서 "약"이라는 용어는 어느 값이 그 값을 결정하기 위해 사용되는 장치 또는 방법의 오차를 포함하는 표준 편차를 의미한다.
공개된 내용에서 "또는"이라는 용어는 "및/또는"과 대체물로만 정의되어 있으나, 대체물인 것 또는 대체물들이 상호 배타적이라는 것이 명확하게 표시되지 않는 한, 특허청구범위에서 "또는"이라는 용어는 "및/또는"을 의미한다.
본 발명에서 "전사 조절 인자"(Transcriptional Regulatory Element)란, 유전자 전사의 제어에 관여하는 일부 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 임의로 상기 폴리뉴클레오티드는 주로 프로모터, 인핸서(enhancer), 인슐레이터(insulator) 등을 포함하는 DNA에서 선택될 수 있다. 본 발명에서 전사 조절 인자는 WXRE(WuXi Regulatory Element)라고도 불린다. 예시적으로, 본 발명의 WXRE는 전사 조절 인자 A, 전사 조절 인자 B, 전사 조절 인자 C, 전사 조절 인자 D, 전사 조절 인자 E, 전사 조절 인자 F, 전사 조절 인자 G를 포함한다.
본 발명에서 "역상보 서열"(Reverse Complementary Sequence)이란, 원래 폴리뉴클레오티드의 서열방향과 반대이면서 원래 폴리뉴클레오티드의 서열과 상보적인 서열을 의미한다. 예시적으로 원래의 폴리뉴클레오티드 서열이 ACTGAAC일 경우, 그 역상보 서열은 GTTCAGT이다.
본 발명에서 "내부 리보솜 침입 부위"(IRES)는 번역 제어 서열에 속하며, 일반적으로 캡(cap)에 의존하지 않고 RNA를 번역 가능하도록, 주목하는 유전자의 5' 말단에 위치한다. 전사된 IRES는 리보솜 서브유닛에 직접 결합할 수 있고, 그 결과 mRNA의 개시 코돈은 리보솜에 대해 적절하게 배향되어 번역을 시작한다. IRES 서열은 일반적으로 mRNA의 5' UTR(개시 코돈의 상류 직전)에 있다. IRES는 기능적으로 진핵 생물의 번역 메커니즘에서 상호작용하는 다양한 단백질 인자의 요구를 충족한다.
본 발명에서 "벡터"는 폴리뉴클레오티드의 전달 비히클을 가리킨다. 일부 실시형태에 있어서, 유전자 공학 재조합 기술에서 벡터는 작동 가능하게 삽입된 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이 단백질의 발현을 가능하게 한다. 벡터는 숙주 세포를 형질 전환(transformation), 형질 도입(transduction) 또는 트랜스펙션(transfection)하기 위해 사용되며, 벡터에 의해 운반되는 유전 물질 요소가 숙주 세포에서 발현되는 것이 가능하다. 본 발명에서 "벡터"는 염색체, 비염색체와 합성 핵산 벡터(적절한 일련의 발현 제어 인자를 포함하는 핵산 서열)를 포함한 임의의 적절한 벡터일 수 있다. 예시적으로 상기 벡터는 재조합 플라스미드 벡터, 재조합 진핵 생물 바이러스 벡터, 재조합 박테리오파지 벡터, 재조합 효모 미니 염색체 벡터, 재조합 세균 인공 염색체 벡터 또는 재조합 효모 플라스미드 벡터여도 된다.
예시적으로 본 발명의 벡터는 SV40의 유도체, 세균 플라스미드, 박테리오파지 DNA, 바큘로바이러스, 효모 플라스미드, 플라스미드와 박테리오파지 DNA의 조합에서 유래한 벡터, 및 바이러스 핵산(RNA 또는 DNA) 벡터를 포함한다. 일부 실시형태에서 벡터는 아데노 수반 바이러스(AAV) 벡터이다.
구체적인 일 실시형태에 있어서, 본 발명에 따른 벡터는 도 1-2, 5-6, 8-9에 도시된 것이다. 상기 벡터 모식도에서 CMV는 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터(Human cytomegalovirus promoter, 예를 들면 PubMed PMID: 2985280을 참조)를 의미한다. TK pA는 티미딘키나아제 폴리아데닐화 시그널(Thymidine kinase polyadenylation signal, 예를 들면 PubMed PMID: 3018551을 참조)을 의미한다. SV40은 SV40 초기 프로모터(SV40 early promoter, 예를 들면 PubMed PMID: 6286831을 참조)를 의미한다. BSR은 블라스티사이딘 내성 유전자 선택 마커(Blasticidin resistance gene: selection marker, 예를 들면 PubMed PMID: 7948022를 참조)를 의미한다. SV pA는 SV40 폴리아데닐화 시그널(SV40 polyadenylation signal, 예를 들면 PubMed PMID: 6113054를 참조)을 의미한다. pUC ori는 pUC 플라스미드의 복제 기점(예를 들면 PubMed PMID: 2985470을 참조)을 의미한다. Amp는 암피실린 내성 유전자(Ampicillin resistance gene, 예를 들면 PubMed PMID: 2985470을 참조)를 의미한다. EMCV IRES는 뇌 심근염 바이러스의 내부 리보솜 침입 부위(예를 들면 PubMed PMID: 8954121을 참조)를 의미한다. Zeocin은 제오신 내성 유전자 선택 마커(Zeocin resistance gene: selection marker, 예를 들면 PubMed PMID: 2450783을 참조)를 의미한다. EF1αI는 인간 신장 인자 1α(human elongation factor 1 alpha, 예를 들면 PubMed PMID: 2210382) 유전자의 첫 번째 인트론을 의미한다.
일부 실시형태에서 본 발명의 CMV 프로모터는 SEQ ID NO: 16과 적어도 또는 약 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 갖는 서열을 포함해도 된다. 본 명세서에서 프로모터란, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 전사 개시를 일으키는 DNA 영역을 의미한다. 프로모터는 코딩 서열의 전사 개시 부위 근처이면서 DNA의 상류(코딩 서열의 센스 가닥의 5' 영역을 향해)에 위치한다. 일부 실시형태에서는 다른 프로모터를 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서 프로모터는 SV40 프로모터, hCMV 프로모터, mCMV 프로모터, 레티노스키신(retinoschisin) 프로모터, 로돕신(rhodopsin) 프로모터, 로돕신 키나아제(rhodopsin kinase) 프로모터, CRX 프로모터, 또는 광수용체간 레티노이드 결합 단백질(interphotoreceptor retinoid binding protein, IRBP) 프로모터이다. 코딩된 단백질의 조직 특이적 발현을 가능하게 하는 어떠한 프로모터도 사용 가능하다.
본 발명에서 "숙주 세포"는 외래 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터가 도입된 세포이다. 상기 숙주 세포는 진핵 숙주 세포 또는 원핵 숙주 세포이다. 이 중, 상기 진핵 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포, 곤충 숙주 세포, 식물 숙주 세포, 진균 숙주 세포, 진핵 조류 숙주 세포, 선충 숙주 세포, 원생동물 숙주 세포 및 어류 숙주 세포일 수 있다. 예시적으로 본 발명의 숙주 세포는 진핵 숙주 세포이고, 상기 진핵 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포이다. 그 중에서도 상기 포유동물 숙주 세포는 중국 햄스터 난소 세포(CHO 세포), COS 세포, Vero 세포, SP2/0 세포, NS/O 골수종 세포, 인간 태아성 신장 세포, 미성숙 햄스터 신장 세포, HeLa 세포, 인간 B 세포, cv-1/EBNA 세포, L 세포, 3T3 세포, HEPG2 세포, PerC6 세포, 293 세포 및 MDCK 세포에서 선택된다. 예시적으로 본 발명의 포유동물 숙주 세포는 CHO 세포이다.
본 발명에서 "단백질 발현 시스템"은 숙주 및 외래 유전자를 포함하는 벡터를 포함하면서, 숙주에서 외래 유전자의 발현 목적을 달성할 수 있는 시스템이다. 단백질 발현 시스템은 일반적으로 다음 요소를 포함한다: (1) 숙주, 즉 세균, 효모, 식물 세포와 동물 세포 등에서 선택될 수 있는 단백질을 발현하는 생명체; (2) 숙주와 대응하는 벡터. 상이한 숙주에 따라 벡터는 원핵(세균) 발현 벡터, 효모 발현 벡터, 식물 발현 벡터, 포유동물 발현 벡터 및 곤충 발현 벡터 등으로 나뉜다. 벡터는 외래 유전자의 단편을 포함한다. 외래 유전자는 벡터의 매개를 통해 숙주에서 발현시킬 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 발현된 단백질 산물은 분비된다. 일부 실시형태에 있어서, 벡터는 숙주 세포의 DNA에 편입된다.
단백질 발현에서 중요한 단계는 목적 단백질을 코딩하는 외래 유전자를 포함하는 벡터로 성공적으로 트랜스펙션된 재조합 숙주 세포를 스크리닝하는 것이다. 가장 일반적으로는 선택 마커가 벡터에 포함되어 있다. 선택 마커는 마커를 포함하는 재조합 숙주 세포와, 그것을 포함하지 않는 재조합 숙주 세포를 구별 가능하게 하는 유전자 또는 DNA 서열일 수 있다. 선택 마커와 선택 배지의 조합으로 인해 벡터로 트랜스펙션된 재조합 숙주 세포의 증식이 가능함과 아울러, 트랜스펙션에 성공하지 못한 숙주 세포의 증식이 억제된다.
항생물질 내성 유전자는 재조합 숙주 세포의 스크리닝에 가장 일반적으로 사용되는 마커이다. 선택 마커로서의 항생물질 내성 유전자와 항생물질을 함유하는 선택 배지를 조합해서 사용함으로써 스크리닝을 달성할 수 있다. 예시적인 항생물질 선택 마커로는 암피실린 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 폴리믹신 B 내성 유전자, 에리스로마이신 내성 유전자, 카르베니실린 내성 유전자, 스트렙토마이신 내성 유전자, 스펙티노마이신 내성 유전자, 블라스티사이딘 내성 유전자, 프라디오마이신 내성 유전자, 퓨로마이신 내성 유전자, 제오신 내성 유전자, 및 하이그로마이신 B 내성 유전자가 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 따라서, 선택 항생물질에는 암피실린, 클로람페니콜, 카나마이신, 테트라사이클린, 폴리믹신 B, 에리스로마이신, 카르베니실린, 스트렙토마이신, 스펙티노마이신, 블라스티사이딘, 프라디오마이신, 퓨로마이신, 제오신 및 하이그로마이신 B가 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용되는 선택 마커는 블라스티사이딘 내성 유전자이다. 일부 실시형태에서, 본 발명에서 사용되는 선택 마커는 제오신 내성 유전자이다.
일부 측면에서 본 발명은 헤테로 다량체(예를 들면 항체)의 발현을 신속하게 평가하기 위해 설계된 방법을 제공한다. 예를 들면 항체를 효율적으로 발현시키기 위해서는 항체 중쇄와 항체 경쇄를 약 1:1 비율로 발현시킬 필요가 있다. 선택용 항생물질의 농도가 지나치게 낮으면 세포 내 기능적인 벡터의 양이 너무 적을 수 있다. 선택용 항생물질의 농도가 지나치게 높으면 세포 배양에 적합하지 않은 상태가 될 수 있다. 또한 2개 벡터의 비율을 적절히 조정할 필요가 있다. 다양한 조건에서 실시한 시험에 기초해서 본 명세서에서 제공되는 방법은 고효율로 항체를 발현할 수 있으면서, 비교적 짧은 시간에 헤테로 다량체 발현을 확실하게 평가하는 데 사용할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 제공되는 방법은 높은 발현 수준으로 항체를 발현할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 제1 폴리펩티드를 코딩하는 외래 유전자를 보유한 벡터, 및 제2 폴리펩티드를 코딩하는 외래 유전자를 보유한 벡터라는, 쌍을 이루는 2개의 벡터로 세포를 트랜스펙션하는 것에 관한 것이다. 그리고 2개의 선택 마커가 사용된다. 선택 마커 중 하나는 블라스티사이딘 내성 유전자이고, 다른 하나는 제오신 내성 유전자이다. 일부 실시형태에서 블라스티사이딘이 1-15㎍/mL의 양으로 선택 배지에 존재하고, 제오신이 50-1500㎍/mL의 양으로 존재한다. 바람직하게는 블라스티사이딘이 2-12㎍/mL의 양으로 존재하고, 제오신이 100-1000㎍/mL의 양으로 존재한다. 보다 바람직하게는 블라스티사이딘이 3-10㎍/mL의 양으로 존재하고, 제오신이 150-800㎍/mL의 양으로 존재한다. 보다 바람직하게는 블라스티사이딘이 4-9㎍/mL의 양으로 존재하고, 제오신이 200-400㎍/mL의 양으로 존재한다. 가장 바람직하게는 블라스티사이딘이 9㎍/mL의 양으로 존재하고, 제오신이 400㎍/mL의 양으로 존재한다. 임의로 블라스티사이딘이 4㎍/mL의 양으로 존재하고, 제오신이 200㎍/mL의 양으로 존재한다. 일부 실시형태에서, 제오신 농도에 대한 블라스티사이딘 농도의 비는 1:50~1:40(예를 들면 약 9:400)이다. 일부 실시형태에서, 배지중 블라스티사이딘의 최저 농도는 5, 6, 7, 8 또는 9㎍/mL이다. 일부 실시형태에서, 배지중 블라스티사이딘의 최고 농도는 15 또는 20㎍/mL이다.
일부 실시형태에서, 선택 배지는 혈청, 다당(예를 들면 글루코오스 및/또는 덱스트로오스), 피루브산 나트륨, 글루타티온, 에탄올아민, 아미노산(예를 들면 글리신, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파라긴산, 시스테인, 글루타민산, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 글루타민, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및/또는 발린) 또는 그 염, 비타민(예를 들면 아스코르빈산 인산염(ascorbic acid phosphate), 염화 콜린, D-판토텐산 칼슘, 엽산, 나이아신 아미드, 피리독신 염산염, 리보플라빈, 티아민 염산염 및/또는 이소이노시톨(i-inositol)), 무기염(예를 들면 염화 칼슘, 질산 제2철, 황산 마그네슘, 염화 칼륨, 중탄산 나트륨, 염화 나트륨 및/또는 인산 수소 2 나트륨), 단백질(예를 들면 인간 트랜스페린 및/또는 재조합 인슐린) 및/또는 미량 원소(예를 들면 메타바나듐산 암모늄, 황산 구리, 염화 망간 및/또는 아셀렌산 나트륨)를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포는 트랜스펙션하고 나서 약 18~30시간(예를 들면 약 24시간) 후 블라스티사이딘(예를 들면 9㎍/mL)과 제오신(예를 들면 400㎍/mL)을 함유하는 적당한 세포 배지에서 배양된다. 그 후 2~4일마다 세포를 블라스티사이딘과 제오신을 함유하는 새로운 배지에 계대하였다. 세포 생존율이 90% 이상으로 회복되었을 경우, 헤테로 다량체의 발현 수준을 유가 배양으로 평가할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유가 배양물(fed-batch cultures)은 본 명세서에 기재된 임의의 배지일 수 있다. 일부 실시형태에서, 유가 배양물은 블라스티사이딘과 제오신을 함유한다.
일부 실시형태에서, 본 방법의 "단백질 발현 시스템"은 항체 중쇄를 코딩하는 외래 유전자를 보유한 벡터, 및 항체 경쇄를 코딩하는 외래 유전자를 보유한 벡터라는, 쌍을 이루는 2개의 벡터에 관한 것이다. 2개 벡터의 선택 마커가 달라도 된다. 일 실시형태에서, 한쪽 벡터의 선택 마커는 블라스티사이딘이고, 다른 쪽 벡터의 선택 마커는 제오신이다. 블라스티사이딘과 제오신의 농도는 본 명세서에 기재된 임의의 농도여도 된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 항체 중쇄를 코딩하는 외래 유전자와, 항체 경쇄를 코딩하는 외래 유전자를 포함하는 1개의 벡터에 관여할 수도 있다.
WXRE 서열은 2개의 벡터에 삽입할 수 있다. 그들은 동일 또는 달라도 되고, 정방향 또는 역방향을 가질 수 있다. 표 1에 2개 벡터의 WXRE 조합예를 기재하였다.
WXRE의 조합
# 한쪽 벡터의 WXRE 다른 쪽 벡터의 WXRE # 한쪽 벡터의 WXRE 다른 쪽 벡터의 WXRE
1 SEQ ID NO 3 SEQ ID NO 3 54 SEQ ID NO 7 SEQ ID NO 17
2 SEQ ID NO 3 SEQ ID NO 4 55 SEQ ID NO 7 SEQ ID NO 18
3 SEQ ID NO 3 SEQ ID NO 5 56 SEQ ID NO 7 SEQ ID NO 19
4 SEQ ID NO 3 SEQ ID NO 6 57 SEQ ID NO 7 SEQ ID NO 20
5 SEQ ID NO 3 SEQ ID NO 7 58 SEQ ID NO 7 SEQ ID NO 21
6 SEQ ID NO 3 SEQ ID NO 8 59 SEQ ID NO 7 SEQ ID NO 22
7 SEQ ID NO 3 SEQ ID NO 9 60 SEQ ID NO 7 SEQ ID NO 23
8 SEQ ID NO 3 SEQ ID NO 17 61 SEQ ID NO 8 SEQ ID NO 8
9 SEQ ID NO 3 SEQ ID NO 18 62 SEQ ID NO 8 SEQ ID NO 9
10 SEQ ID NO 3 SEQ ID NO 19 63 SEQ ID NO 8 SEQ ID NO 17
11 SEQ ID NO 3 SEQ ID NO 20 64 SEQ ID NO 8 SEQ ID NO 18
12 SEQ ID NO 3 SEQ ID NO 21 65 SEQ ID NO 8 SEQ ID NO 19
13 SEQ ID NO 3 SEQ ID NO 22 66 SEQ ID NO 8 SEQ ID NO 20
14 SEQ ID NO 3 SEQ ID NO 23 67 SEQ ID NO 8 SEQ ID NO 21
15 SEQ ID NO 4 SEQ ID NO 4 68 SEQ ID NO 8 SEQ ID NO 22
16 SEQ ID NO 4 SEQ ID NO 5 69 SEQ ID NO 8 SEQ ID NO 23
17 SEQ ID NO 4 SEQ ID NO 6 70 SEQ ID NO 9 SEQ ID NO 9
18 SEQ ID NO 4 SEQ ID NO 7 71 SEQ ID NO 9 SEQ ID NO 17
19 SEQ ID NO 4 SEQ ID NO 8 72 SEQ ID NO 9 SEQ ID NO 18
20 SEQ ID NO 4 SEQ ID NO 9 73 SEQ ID NO 9 SEQ ID NO 19
21 SEQ ID NO 4 SEQ ID NO 17 74 SEQ ID NO 9 SEQ ID NO 20
22 SEQ ID NO 4 SEQ ID NO 18 75 SEQ ID NO 9 SEQ ID NO 21
23 SEQ ID NO 4 SEQ ID NO 19 76 SEQ ID NO 9 SEQ ID NO 22
24 SEQ ID NO 4 SEQ ID NO 20 77 SEQ ID NO 9 SEQ ID NO 23
25 SEQ ID NO 4 SEQ ID NO 21 78 SEQ ID NO 17 SEQ ID NO 17
26 SEQ ID NO 4 SEQ ID NO 22 79 SEQ ID NO 17 SEQ ID NO 18
27 SEQ ID NO 4 SEQ ID NO 23 80 SEQ ID NO 17 SEQ ID NO 19
28 SEQ ID NO 5 SEQ ID NO 5 81 SEQ ID NO 17 SEQ ID NO 20
29 SEQ ID NO 5 SEQ ID NO 6 82 SEQ ID NO 17 SEQ ID NO 21
30 SEQ ID NO 5 SEQ ID NO 7 83 SEQ ID NO 17 SEQ ID NO 22
31 SEQ ID NO 5 SEQ ID NO 8 84 SEQ ID NO 17 SEQ ID NO 23
32 SEQ ID NO 5 SEQ ID NO 9 85 SEQ ID NO 18 SEQ ID NO 18
33 SEQ ID NO 5 SEQ ID NO 17 86 SEQ ID NO 18 SEQ ID NO 19
34 SEQ ID NO 5 SEQ ID NO 18 87 SEQ ID NO 18 SEQ ID NO 20
35 SEQ ID NO 5 SEQ ID NO 19 88 SEQ ID NO 18 SEQ ID NO 21
36 SEQ ID NO 5 SEQ ID NO 20 89 SEQ ID NO 18 SEQ ID NO 22
37 SEQ ID NO 5 SEQ ID NO 21 90 SEQ ID NO 18 SEQ ID NO 23
38 SEQ ID NO 5 SEQ ID NO 22 91 SEQ ID NO 19 SEQ ID NO 19
39 SEQ ID NO 5 SEQ ID NO 23 92 SEQ ID NO 19 SEQ ID NO 20
40 SEQ ID NO 6 SEQ ID NO 6 93 SEQ ID NO 19 SEQ ID NO 21
41 SEQ ID NO 6 SEQ ID NO 7 94 SEQ ID NO 19 SEQ ID NO 22
42 SEQ ID NO 6 SEQ ID NO 8 95 SEQ ID NO 19 SEQ ID NO 23
43 SEQ ID NO 6 SEQ ID NO 9 96 SEQ ID NO 20 SEQ ID NO 20
44 SEQ ID NO 6 SEQ ID NO 17 97 SEQ ID NO 20 SEQ ID NO 21
45 SEQ ID NO 6 SEQ ID NO 18 98 SEQ ID NO 20 SEQ ID NO 22
46 SEQ ID NO 6 SEQ ID NO 19 99 SEQ ID NO 20 SEQ ID NO 23
47 SEQ ID NO 6 SEQ ID NO 20 100 SEQ ID NO 21 SEQ ID NO 21
48 SEQ ID NO 6 SEQ ID NO 21 101 SEQ ID NO 21 SEQ ID NO 22
49 SEQ ID NO 6 SEQ ID NO 22 102 SEQ ID NO 21 SEQ ID NO 23
50 SEQ ID NO 6 SEQ ID NO 23 103 SEQ ID NO 22 SEQ ID NO 22
51 SEQ ID NO 7 SEQ ID NO 7 104 SEQ ID NO 22 SEQ ID NO 23
52 SEQ ID NO 7 SEQ ID NO 8 105 SEQ ID NO 23 SEQ ID NO 23
53 SEQ ID NO 7 SEQ ID NO 9
본 발명에서 "서열 동일성"과 "동일성 퍼센트"는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 사이에서 같은(즉 동일한) 뉴클레오티드 또는 아미노산의 퍼센트를 말한다. 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 사이의 서열 동일성은 다음 방법으로 측정할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 정렬시키고, 정렬된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 중 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 포함하는 위치 수를 스코어링하고, 그것과 정렬된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 중 다른 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 포함하는 위치 수와 비교한다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들면 다른 뉴클레오티드(즉, 치환 또는 변이)를 포함하는 것, 또는 뉴클레오티드의 결실(즉, 폴리뉴클레오티드 중 1개 또는 2개의 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실)로 인해 한 군데에서 다를 수 있다. 폴리펩티드는 예를 들면 아미노산(즉, 치환 또는 변이)을 포함하는 것, 또는 아미노산의 결실(즉, 1개 또는 2개의 폴리펩티드 중 아미노산의 삽입 또는 아미노산의 결실)로 인해 한 군데에서 다를 수 있다. 서열 동일성은 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 포함하는 위치 수를, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 중 아미노산 잔기 총수로 나누어서 산출할 수 있다. 예를 들면, 퍼센트 동일성은 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 포함하는 위치 수를, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 중 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 총수로 나누고 100을 곱해서 산출할 수 있다.
본 발명에서 "동물체 내 표적 단백질의 비정상적인 발현"이란, 정상적인 조건의 동물체 내 표적 단백질 발현 수준과 비교해서 검체 동물체 내 표적 단백질의 발현 수준이 상승 또는 감소하거나; 또는 정상적인 조건에서 발현되지 않아야 할 단백질이 발현되거나; 또는 발현되어야 할 단백질이 발현되지 않는 것이다. 본 발명의 일 측면에서 상기 동물은 포유동물을 가리킨다. 다른 실시형태에서 상기 포유동물은 인간이다.
본 발명에서 "항체"라는 용어는 면역 글로불린 또는 그 단편 또는 그들의 유도체를 가리키며, 인비트로 또는 인비보 중 어디에서 생산되는지에 관계없이 항원 결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 이 용어는 다클론 항체, 단클론 항체, 단일 특이성 항체, 이중 특이성 항체, 삼중 특이성 항체, 다중 특이성 항체, 비특이성 항체, 인간화 항체, 완전 인간 항체, 키메라 항체, 단일 도메인 항체, 단일 가닥 항체, 합성 항체, 재조합 항체, 헤테로 접합 항체, 변이 항체, 그래프트 항체(grafted antibody)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. "항체"라는 용어는 또한 예를 들면 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb 등의 항체 단편 및 항원 결합 기능을 보유한 다른 항체 단편을 포함한다. 일반적으로 이러한 단편은 항원 결합 단편을 포함한다.
본 발명에서 "융합 단백질"은 2개 이상의 단백질 또는 그 단편을 각각의 펩티드의 주쇄를 공유 결합으로 연결하여 함유한 분자를 말한다. 융합 단백질은 그들 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자의 유전 발현에 의해 생성되는 것이 보다 바람직하다. 바람직한 실시형태에 있어서, 융합 단백질은 면역 글로불린 도메인을 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 융합 단백질은 Fc-융합 단백질이다.
예시적으로, 본 발명에서 사용 가능한 항체에는 아달리무맙(Adalimumab), 베즐로톡수맙(Bezlotoxumab), 아벨루맙(Avelumab), 듀필루맙(Dupilumab), 더발루맙(Durvalumab), 오크렐리주맙(Ocrelizumab), 브로달루맙(Brodalumab), 레슬리주맙(Reslizumab), 올라라투맙(Olaratumab), 다라투무맙(Daratumumab), 엘로투주맙(Elotuzumab), 넥시투무맙(Necitumumab), 인플릭시맙(Infliximab), 오빌톡삭시맙(Obiltoxaximab), 아테졸리주맙(Atezolizumab), 세쿠키누맙(Secukinumab), 메폴리주맙(Mepolizumab), 니볼루맙(Nivolumab), 알리로쿠맙(Alirocumab), 에볼로쿠맙(Evolocumab), 디누툭시맙(Dinutuximab), 베바시주맙(Bevacizumab), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 라무시루맙(Ramucirumab), 베돌리주맙(Vedolizumab), 실툭시맙(Siltuximab), 알렘투주맙(Alemtuzumab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 페르투주맙(Pertuzumab), 오비누투주맙(Obinutuzumab), 브렌툭시맙(Brentuximab), 락시바쿠맙(Raxibacumab), 벨리무맙(Belimumab), 이필리무맙(Ipilimumab), 데노수맙(Denosumab), 오파투무맙(Ofatumumab), 베실레소맙(Besilesomab), 토실리주맙(Tocilizumab), 카나키누맙(Canakinumab), 골리무맙(Golimumab), 우스테키누맙(Ustekinumab), 서톨리주맙(Certolizumab), 카투막소맙(Catumaxomab), 에쿨리주맙(Eculizumab), 라니비주맙(Ranibizumab), 파니투무맙(Panitumumab), 나탈리주맙(Natalizumab), 오말리주맙(Omalizumab), 세툭시맙(Cetuximab), 에팔리주맙(Efalizumab), 이브리투모맙(Ibritumomab), 파놀레소맙(Fanolesomab), 토시투모맙(Tositumomab), 젬투주맙(Gemtuzumab), 팔리비주맙(Palivizumab), 네시투무맙(Necitumumab), 바실릭시맙(Basiliximab), 리툭시맙(Rituximab), 카프로맙(Capromab), 사투모맙(Satumomab) 및 무로모납(Muromonab)이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
예시적으로, 본 발명을 사용할 수 있는 융합 단백질에는 에타너셉트(Etanercept), 알레파셉트(Alefacept), 아바타셉트(Abatacept), 릴로나셉트(Rilonacept), 로미플로스팀(Romiplostim), 벨라타셉트(Belatacept), 아플리버셉트(Aflibercept)가 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
일 실시형태에서, 본 발명은 2개의 폴리뉴클레오티드의 상보성 정도를 한정하기 위해 사용되는 혼성화 조건의 엄격성(stringency)에 관한 것이다. 임의로 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA에서 선택될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 "엄격성"은 혼성화 중 온도와 이온 강도 조건, 및 어떠한 유기 용매의 존재 여부를 가리킨다. 엄격성이 높을수록 표적 뉴클레오티드 서열과 표지된 폴리뉴클레오티드 서열간 상보성 정도가 높아진다. "엄격성 조건"이라 함은 단순히 상보 빈도가 높은 염기를 갖는 뉴클레오티드 서열만이 혼성화 가능한 온도 및 이온 강도 조건을 가리킨다. 본 명세서에서 사용되는 "고 엄격성 또는 보다 고 엄격성 조건에서 혼성화"이라는 용어는 혼성화 및 세척에 이용되는 조건을 말한다. 혼성화 반응을 실시하기 위한 지침은 "Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y(1989), 6.3.1-6.3.6"을 참조할 수 있다. 본 발명에 언급된 구체적인 혼성화 조건은 다음과 같다: 1) 고 엄격성 혼성화 조건: 약 45℃의 6X 염화 나트륨/구연산 나트륨(SSC)으로, 이어서 65℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS로 1회 또는 2회 이상 세척한다; 2) 보다 고 엄격성 혼성화 조건: 65℃에서 0.5M 인산 나트륨, 7% SDS, 이어서 65℃에서 0.2X SSC, 1% SDS에서 1회 또는 2회 이상 세척한다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 WXRE 서열은 SEQ ID NO: 3-9 중 어느 하나의 서열과 비교해서 적어도 또는 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 동일성(이 숫자들 사이의 모든 범위와 퍼센트를 포함)을 갖는다. 일부 실시형태에서, WXRE 서열상은 SEQ ID NO: 3-9 어느 중 하나의 서열과 비교해서 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 또는 10개의 보존적 변이를 갖는다. 일부 실시형태에서, WXRE 서열은 SEQ ID NO: 3-9의 서열과 비교해서 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오티드가 다르다. WXRE 서열은 정방향 또는 역방향을 가질 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 경우, 센스 가닥(5'에서 3'으로)이 대상 서열과 동일한 서열을 갖는 경우, 대상의 서열은 정방향이다. 센스 가닥이 대상 서열에 역상보적인 서열을 갖는 경우, 대상 서열은 역방향이다. SEQ ID NO: 3-9와 역상보인 서열은 각각 SEQ ID NO: 17-23으로 표시된다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 17-23에서 선택되는 서열의 적어도 또는 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(이 숫자들 사이의 모든 범위와 퍼센트를 포함)인 서열을 제공한다.
일부 실시형태에 있어서, WXRE 서열은 외래 단백질의 발현 수준을 (예를 들면, WXRE 서열이 없는 제어 서열과 비교해서) 약 또는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 전사 조절 인자는 또한 WXRE 서열과 다른 진핵 세포주의 단백질 발현 수준을 증가시킬 수 있는 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에서 선택된다. 예시적으로, 본 발명의 전사 조절 인자는 WXRE 서열과 SEQ ID: 13(인간 EF1αI의 제1 인트론)으로 표시되는 서열과 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열이다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 SEQ ID: 13으로 표시되는 서열과 서열 동일성을 갖는 서열은 SEQ ID: 13(인간 EF1αI의 제1 인트론)으로 표시되는 서열과 비교해서 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 동일성(이 숫자들 사이의 모든 범위와 퍼센트를 포함)을 갖는다. 일부 실시형태에서, 상기 서열은 외래 단백질의 발현 수준을 (예를 들면, 그러한 서열이 없는 제어 서열과 비교해서) 약 또는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 증가시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, WXRE 서열, 프로모터 및 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결되어 있다. 일부 실시형태에서, WXRE 서열, 프로모터, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 1개 이상의 추가적인 조절 인자가 작동 가능하게 연결되어 있다. 일부 실시형태에서, 1개 이상의 추가적인 조절 인자는 EF1αI의 인트론(예를 들면 인간 EF1αI의 제1 인트론)이다. 작동 가능하게 연결되어 있는 WXRE 서열, 프로모터 및 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 다양한 순서를 가질 수 있다. 예를 들면 WXRE 서열은 프로모터의 앞(예를 들면 코딩 서열의 센스 가닥의 5'에서 3') 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 뒤(예를 들면 코딩 서열의 센스 가닥의 5'에서 3')에 위치할 수 있다. 일부 실시형태에서, WXRE 서열과 프로모터 사이, 또는 WXRE 서열과 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 적어도 또는 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1K, 2K, 3K, 4K 또는 5K개의 뉴클레오티드가 존재한다. 일부 실시형태에서, WXRE 서열과 프로모터 사이, 또는 WXRE 서열과 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1K, 2K, 3K, 4K 또는 5K개 이하의 뉴클레오티드가 존재한다. 일부 실시형태에서, 1개 이상의 추가적인 조절 인자는 프로모터와 폴리펩티드를 코딩하는 서열 사이에 위치한다.
본 발명은 또한 재조합 단백질 또는 폴리펩티드의 발현을 증강하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 1개 이상의 본 명세서에 기재된 벡터를 세포에(예를 들면 형질 전환 또는 트랜스펙션을 통해) 삽입하여 배지에서 세포를 배양하고, 그렇게 발현된 재조합 단백질 또는 폴리펩티드를 회수하는 것에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 분자생물학적 방법은 모두 "Current Protocols in Molecular Biology"(Wiley 발행), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"(Cold Spring Harbor Laboratory 발행) 등의 출판물에 기재된 방법을 참조할 수 있다.
실시예
본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은 다음 상세한 설명으로 명백해질 것이다. 그러나 상세한 설명 및 구체적인 실시예(본 발명의 구체적인 실시형태를 나타냄)는 당업자가 그 구체적인 내용을 읽은 후 본 발명의 사상 및 범위 내에서 이루어진 다양한 변경 및 수정이 명백해질 것이므로 예시 목적으로만 제공됨을 이해해야 한다.
실시예에서 사용된 모든 시약은 특별히 언급되지 않는 한, 상업적 공급원을 통해 구입 및 입수할 수 있다.
실시예 1: 벡터 라이브러리 구축 및 녹색 형광 단백질(green fluorescence protein, GFP)을 발현하는 안정된 세포 집단의 구축
1.1 중국 햄스터 난소 세포(Chinese hamster ovary cell, CHO cell) 게놈 단편을 포함하는 벡터 라이브러리의 제조
1.1.1 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease) BamHI를 포함하는 효소 소화 키트(NEB) 중 BamHI를 이용해서 GFP 발현 벡터(즉 도 1에 도시된 벡터) 1㎍을 효소 소화하여 선형화하고 37℃에서 하룻밤 보존하였다(효소 소화 반응의 시약 조성 및 함유량을 표 2에 기재). 여기서 BamHI는 임의로 GFP에 대응하는 프로모터 상류에 존재하는 특이적인 효소 소화 부위에 대응하는 다른 엔도뉴클레아제로 대체될 수 있다.
GFP 발현 벡터의 모식도는 도 1에 도시하였다.
효소 소화 반응의 시약 조성 및 함유량
반응 성분 부피
NEB CutSmart Buffer (Cat# B7204S) 5㎕
BamHI 5㎕
GFP 발현 벡터 1㎍
초순수(ultrapure water) 총 부피를 50㎕로 함
1.1.2 약 500만개의 CHO 숙주 세포를 취해 DNeasy Blood & Tissue Kit(QIAGEN)를 사용해서 CHO 숙주 세포의 게놈 DNA를 추출하고, 상기 게놈 DNA를 상기 키트의 용출 버퍼 100㎕에 용해하였다.
1.1.3 100U의 제한 엔도뉴클레아제 BglII(NEB) 또는 DpnII(NEB)에서 게놈 DNA 5㎍을 효소 소화하였다(효소 소화 반응의 시약 조성 및 함유량을 표 3에 기재). 단계 1.1.1에서 선형화된 벡터의 엔도뉴클레아제 점착 말단과 합치되는 한, 다른 제한 엔도뉴클레아제도 사용 가능하다.
효소 소화 반응의 시약 조성 및 함유량
반응 성분 부피
NEB CutSmart Buffer(Cat# B7204S) 5㎕
BamHI 5㎕
CHO 게놈 DNA 1㎍
초순수(ultrapure water) 총 부피를 50㎕로 함
1.1.4 1.1.1에서 선형화된 벡터를 2U의 송아지 장내 알칼리 포스파타아제(NEB)로 37℃, 30분 정도 처리하였다. 다른 타입의 알칼리 포스파타아제도 사용 가능하다.
1.1.5 1.1.4에서 선형화된 GFP 발현 벡터와 1.1.3에서 효소 소화된 CHO 게놈 DNA는 각각 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 분리되었다. 겔을 절단하여 GFP 발현 벡터 단편과 효소 소화된 게놈 1-4kb의 단편을 회수하고 QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)를 이용해서 전기 영동한 후 아가로오스 겔로부터 DNA를 추출하였다.
1.1.6 1.1.5에서 회수해서 얻어진 GFP 발현 벡터 단편과 게놈 단편을 DNA Ligation Kit(Takara, Cat#6022)를 이용해서 16℃ 조건에서 45분간 라이게이션(ligation) 반응(라이게이션 반응의 시약 조성 및 함유량을 표 4에 기재)을 실시하여 라이게이션하였다.
라이게이션 반응의 시약 조성 및 함유량
반응 성분 부피
회수한 후 CHO 게놈 DNA 4㎕
회수한 후 벡터 6㎕
Solution I 20㎍
초순수(ultrapure water) 10㎕
1.1.7 1.1.6에서 얻어진 라이게이션 산물 10㎕를 취하여 100㎕ 컴피턴트 세포에 첨가하고, 빙욕(氷浴)에 30분간 넣고 42℃에서 1분간 열 충격을 주었다. 그 후 얼음 위에서 1분간 두고 항생물질을 포함하지 않는 신선한 LB 배지 500㎕를 각 튜브의 세포에 첨가하고 37℃ 온도에서 45분간 회복시켰다. 플레이팅 단계를 건너뛰고 암피실린을 100mg/L 함유하는 배지 500mL를 직접 첨가하고 Plasmid Maxi Kit(QIAGEN)를 이용해서 벡터를 추출하였다. 추출한 DNA를 벡터 라이브러리로 하였다.
1.1.8 1.1.7에서 얻어진 벡터 라이브러리는 예를 들면 PvuI(NEB) 등의 소화 효소 부위가 벡터 백본의 원핵 영역(prokaryotic region)에만 있는 제한 엔도뉴클레아제를 이용해서 선형화되고 1.1.1과 동일한 반응 조건으로 37℃ 조건에서 하룻밤 보존하였다. 다음날 페놀-클로로포름법으로 DNA를 회수하여 트랜스펙션에 사용하였다.
1.2 녹색 형광 단백질을 발현하는 안정된 세포 집단의 구축
1.2.1 약 500만개의 CHO 숙주 세포를 원심 분리하고 상청을 폐기하였다. 그리고 Amaxa SF Cell Line 4D-Nucleofector Kit L(Lonza, Cat#VCA-1005)에 포함되는 90㎕ SF Cell Line Solution 및 20㎕ Supplement I와, 0.3~0.6㎍ 단계 1.1.8에서 얻어진 선형화된 벡터 라이브러리를 균일하게 혼합하였다. 이 혼합 용액으로 세포를 재현탁하고 일렉트로포레이션(electroporation)용 큐벳에 옮겼다. 4D-NucleofectorTM 시스템 일렉트로포레이션 장치로 각각의 숙주 세포에 대응하는 프로그램을 이용해서 세포를 트랜스펙션하였다. 일렉트로포레이션 후 세포를 항생물질을 포함하지 않는 배지 5mL에 현탁하고 37℃의 쉐이커에 넣어서 배양하였다.
1.2.2 트랜스펙션하고 나서 24시간 후 벡터의 내성 유전자에 대응하는 항생물질을 포함하는 선택 배지를 등량으로 세포 배지에 첨가하였다(이 실험에서 항생물질은 800㎍/mL의 제오신이었다.).
1.2.3 세포는 2~4일마다 카운팅되었다. 세포 증식 상황에 따라 계대를 실시하고, 벡터중의 내성 유전자에 대응하는 항생물질을 포함하는 선택 배지를 이용해서 스크리닝을 실시하였다(이 실험에서 항생물질은 400㎍/mL의 제오신이었다.). 세포 생존율이 90% 이상으로 회복되었을 때 클론 스크리닝을 준비하였다.
실시예 2: 녹색 형광 단백질을 고도로 발현하는 클론의 스크리닝
2.1 단세포 소팅(sorting) 및 증폭
2.1.1 실시예 1의 단계 1.2.3에서 회복한 후 세포 집단에 GFP 발현 수준이 비교적 높은(발현 수준의 상위 0.5%) 세포를 FACS AriaII 유세포 측정기(flow cytometer) 소팅에 의해 96 웰 플레이트에 넣고 배양하였다.
2.1.2 회수한 세포가 육안으로 보일 때까지 플레이트 내 배지의 75%를 2~4일마다 교체하였다.
2.2 GFP를 고도로 발현하는 클론의 스크리닝
2.1.2에서 회복된 세포는 각각 새로운 96 웰 플레이트에 순차적으로 옮겨져 총 약 300클론이 되었다(각 웰의 모든 세포는 1개 세포에서 유래하며, 본 명세서에서는 클론이라고 함). FACS AriaII 유세포 측정기로 GFP 발현 수준을 측정하고 검출 강도가 상위 10%인 클론을 24 웰 플레이트에 옮겨서 증식시켰다.
실시예 3: 전사 조절 인자의 스크리닝, 식별 및 검증
3.1 전사 조절 인자 후보 서열의 식별
3.1.1 2.2에서 24 웰 플레이트에 증식한 세포가 플레이트 바닥을 실질적으로 덮었을 때 DNeasy Blood & Tissue Kit(QIAGEN)를 사용해서 각 클론의 게놈을 추출하였다.
3.1.2 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 각각 벡터의 BamHI 효소 소화 부위에서 상류와 하류 약 200bp 정도 떨어진 곳에 설계하고 3.1.1에서 추출한 게놈을 PCR 증폭하였다. 여기서 PCR 반응의 정방향 프라이머의 서열은: GCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGG(SEQ ID NO: 1)이고, PCR 반응의 역방향 프라이머의 서열은: CATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTA(SEQ ID NO: 2)였다.
상기 PCR 반응의 반응계는 표 5와 같다:
PCR 반응의 반응계
반응 성분 부피
5X Q5 Reaction Buffer 5㎕
10mM dNTPs 0.5㎕
10μM 정방향 프라이머 1.25㎕
10μM 역방향 프라이머 1.25㎕
게놈 1㎕
Q5 DNA Polymerase(Cat# M0491S) 0.25㎕
초순수(ultrapure water) 15.75㎕
상기 PCR 반응의 반응 단계는 표 6과 같다.
PCR 반응의 반응 단계
온도 시간 사이클 수
98℃ 1min 1
98℃ 30s 35
61℃ 30s
68℃ 5min
68℃ 10min 1
3.1.3 PCR 산물을 아가로오스 겔 전기 영동으로 분리하고 겔을 절단하여 1kb 이상의 특정 밴드를 회수하고 QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)를 이용해서 DNA를 추출하였다.
3.1.4 회수된 밴드는 시퀀싱하여 전사 조절 인자의 후보 서열 A~G가 식별되었다.
3.1.5 시퀀싱과 식별을 통해 얻어진 전사 조절 인자의 서열 A~G는 다음과 같다. 여기서,
전사 조절 인자 A의 서열은 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 서열(SEQ ID NO: 3의 역상보 서열은 SEQ ID NO: 17)이었다;
전사 조절 인자 B의 서열은 SEQ ID NO: 4로 표시되는 서열(SEQ ID NO: 4의 역상보 서열은 SEQ ID NO: 18)이었다;
전사 조절 인자 C의 서열은 SEQ ID NO: 5로 표시되는 서열(SEQ ID NO: 5의 역상보 서열은 SEQ ID NO: 19)이었다;
전사 조절 인자 D의 서열은 SEQ ID NO: 6으로 표시되는 서열(SEQ ID NO: 6의 역상보 서열은 SEQ ID NO: 20)이었다;
전사 조절 인자 E의 서열은 SEQ ID NO: 7로 표시되는 서열(SEQ ID NO: 7의 역상보 서열은 SEQ ID NO: 21)이었다;
전사 조절 인자 F의 서열은 SEQ ID NO: 8로 표시되는 서열(SEQ ID NO: 8의 역방향 상보 서열은 SEQ ID NO: 22)이었다;
전사 조절 인자 G의 서열은 SEQ ID NO: 9로 표시되는 서열(SEQ ID NO: 9의 역상보 서열은 SEQ ID NO: 23)이었다.
3.2 전사 조절 인자의 검증
3.2.1 In-Fusion Cloning Kit(Takara)를 이용해서 3.1.5에서 시퀀싱 및 식별을 통해 얻어진 전사 조절 인자 A~G를 각각 GFP 유전자를 함유하는 벡터의 대응하는 프로모터 상류의 BamHI 소화 효소 부위에 삽입하였다. 도 2에 도시된 바와 같이 전사 조절 인자가 삽입된 벡터(여기서 WXRE는 전사 조절 인자 A~G 중 1개를 나타냄)가 얻어졌다. 상기 벡터는 예를 들면 PvuI(NEB) 등의 소화 효소 부위가 벡터 백본의 원핵 영역에만 있는 제한 엔도뉴클레아제를 사용해서 선형화되고 37℃에서 하룻밤 보존되었다. 다음날 페놀-클로로포름법으로 DNA를 회수하여 트랜스펙션에 사용하였다.　
3.2.2 약 500만개의 CHO 숙주 세포를 원심 분리하고 상청을 폐기하였다. 그리고 Amaxa SF Cell Line 4D-Nucleofector Kit L(Lonza, Cat#VCA-1005)에 포함되는 90㎕ SF Cell Line Solution 및 20㎕ Supplement I와, 발현해야 할 단백질 정보를 포함하는 선형화된 벡터(3.2.1에서 얻어짐) 30㎍을 균일하게 혼합하였다. 이 혼합 용액으로 세포를 재현탁하고 일렉트로포레이션용 큐벳에 옮겼다. 4D-NucleofectorTM 시스템 일렉트로포레이션 장치로 각각의 숙주 세포에 대응하는 프로그램을 이용해서 세포를 트랜스펙션하였다. 일렉트로포레이션 후 세포를 항생물질을 포함하지 않는 배지 5mL에 현탁하고 37℃의 쉐이커에 넣어서 배양하였다. 각 샘플은 1종류의 전사 조절 인자를 포함하거나, 또는 대조군으로서 전사 조절 인자를 포함하지 않는 샘플이다.
3.2.3 트랜스펙션하고 나서 24시간 후 벡터의 내성 유전자에 대응하는 항생물질을 포함하는 선택 배지를 등량으로 세포 배지에 첨가하였다. 항생물질을 포함하는 배지를 이용해서 2~4일마다 세포를 계대하였다.
3.2.4 세포 생존율이 90% 이상으로 회복된 후 단백질 발현 수준에 대한 전사 조절 인자 A~G의 영향을 유가 배양을 통해 평가하였다.
실시예 4: 외래 단백질을 발현하는 단백질 발현 시스템의 발현 수준에 대한 전사 조절 인자의 영향
4.1.1 전사 조절 인자 A~G는 정방향 및 역방향으로 융합 단백질(상기 융합 단백질이 PD-L1의 A 사슬이고, 그 서열이 SEQ ID NO: 10으로 표시되는 서열이다) 프로모터의 상류 BamHI 위치에 구축되었다. 도 2에 도시된 바와 같이, 전사 조절 인자가 삽입된 벡터(여기서 WXRE는 전사 조절 인자 A~G 중 하나임)가 얻어졌다. 이 중에서 인자의 이름(A~G) 뒤 숫자는 WXRE 조절 인자의 방향을 나타낸다. 전사 조절 인자의 이름 뒤 숫자 1은 정방향을 나타내고, 숫자 2는 역방향을 나타낸다. 예를 들면 전사 조절 인자 A1은 코딩 서열의 센스 가닥에서 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 서열의 정방향(즉 5'에서 3') 서열을 나타낸다. 전사 조절 인자 A2는 단백질 코딩 서열의 센스 가닥에서 SEQ ID NO: 17로 표시되는 서열의 역상보 서열을 나타낸다.
상기 벡터는 예를 들면 PvuI(NEB) 등의 소화 효소 부위가 벡터 백본(backbone)의 원핵 영역에만 있는 제한 엔도뉴클레아제를 사용해서 선형화되고 37℃ 조건에서 하룻밤 보존되었다. 다음날 페놀-클로로포름법으로 DNA를 회수하여 트랜스펙션에 사용하였다.
4.1.2 약 500만개의 CHO 숙주 세포를 원심 분리하고 상청을 폐기하였다. 그리고 Amaxa SF Cell Line 4D-Nucleofector Kit L(Lonza, Cat#VCA-1005)에 포함되는 90㎕ SF Cell Line Solution 및 20㎕ Supplement I와, 발현되어야 할 융합 단백질 정보를 포함하는 선형화된 벡터(4.1.1에서 얻어짐) 30㎍을 균일하게 혼합하였다. 이 혼합 용액으로 세포를 재현탁하고 일렉트로포레이션용 큐벳에 옮겼다. 4D-NucleofectorTM 시스템 일렉트로포레이션 장치로 각각의 숙주 세포에 대응하는 프로그램을 이용해서 세포를 트랜스펙션하였다. 일렉트로포레이션 후 세포를 항생물질을 포함하지 않는 배지 5mL에 현탁하고 37℃의 쉐이커에 넣어서 배양하였다. 각 그룹의 샘플은 특정 방향(즉, 정방향 또는 역방향)인 전사 조절 인자 1개만 포함한다. 전사 조절 인자를 포함하지 않는 샘플을 대조군으로 채용하였다.
4.1.3 트랜스펙션하고 나서 24시간 후 800㎍/mL의 제오신을 포함하는 배지를 등량으로 트랜스펙션된 세포에 첨가하였다.
4.1.4 2~4일마다 400㎍/mL의 제오신을 포함하는 배지를 사용해서 세포를 계대하였다.
4.1.5 세포 생존율이 90% 이상으로 회복된 후 융합 단백질 PD-L1의 발현 수준을 유가 배양을 통해 평가하였다.
4.1.6 발현을 통해 얻어진 PD-L1의 서열이 서열 번호 10에 나타내는 서열과 동일한지 여부를 검증하였다.
4.2 실험 결과
도 3에 도시된 바와 같이, 전사 조절 인자를 갖지 않는 대조군에 비해, 융합 단백질 프로모터 상류에 전사 조절 인자를 삽입하면 표적 단백질의 발현량이 약 10~25% 정도 증가하였다(도 3의 A2, B1, B2, D2, E2, F2, G1을 참조). 단백질 발현에 대한 한쪽 방향의 상기 서열의 촉진 효과는 다른 방향의 촉진 효과보다 우수하며, 이것은 프로모터의 방향성과 관련 있을 수 있다.
도 4에 도시된 바와 같이 발현량에 대응하여 상기 전사 조절 인자의 정방향 또는 역방향은 비생산율(specific production rate)을 약 10% 증가시킬 수 있다(도 4의 A2, B1, B2, D2, E2, F2를 참조).
한편, 검증 결과, 발현에 의해 얻어진 PD-L1의 서열은 SEQ ID NO: 10으로 표시되는 서열과 동일했다.
실시예 5: 아달리무맙 발현에 사용되는 단백질 발현 시스템의 발현 수준에 대한 전사 조절 인자의 영향
5.1.1 전사 조절 인자 A의 역방향 서열(A2), 전사 조절 인자 B의 정방향 서열(B1), 및 전사 조절 인자 G의 정방향 서열(G1)은 각각 Takara의 In-Fusion Cloning 키트에 의해 아달리무맙을 발현하는 프로모터 상류(구체적인 조건을 표 7에 기재함)에 구축되었다. 도 5 및 도 6에 도시된 바와 같이 전사 조절 인자가 삽입된 벡터(여기서 WXRE는 전사 조절 인자 A~G 중 하나임)가 각각 얻어졌다. 여기서, "중쇄 상류에 있는 전사 조절 인자"가 도 5에 도시된 것과 같은 벡터에 클로닝되고, "경쇄 상류에 있는 전사 조절 인자"가 도 6에 도시된 것과 같은 벡터에 클로닝되었다. 여기서 도 5의 아달리무맙의 중쇄(HC)의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 11에 표시한 바와 같고, 도 6의 아달리무맙의 경쇄(LC)의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 12에 표시한 바와 같았다.
상기 벡터는 예를 들면 PvuI(NEB) 등의 소화 효소 부위가 벡터 백본의 원핵 영역에만 있는 제한 엔도뉴클레아제를 사용해서 선형화되고 37℃에서 하룻밤 보존되었다. 다음날 페놀-클로로포름법으로 DNA를 회수하여 트랜스펙션에 사용하였다.
상이한 조건에서의 대응하는 전사 조절 인자
샘플 ID 중쇄 상류에 있는
전사 조절 인자		 경쇄 상류에 있는
전사 조절 인자
1 B1 B1
2 B1 G1
3 G1 G1
4 B1 A2
5 G1 A2
6 (대조군) N/A N/A
5.1.2 약 500만개의 CHO 숙주 세포를 원심 분리하고 상청을 폐기하였다. 그리고 Amaxa SF Cell Line 4D-Nucleofector Kit L(Lonza, Cat#VCA-1005)에 포함되는 90㎕ SF Cell Line Solution 및 20㎕ Supplement I와, 아달리무맙 서열 정보를 포함하는 선형화된 벡터(5.1.1에서 얻어짐) 30㎍을 균일하게 혼합하였다. 이 혼합 용액으로 세포를 재현탁하고 일렉트로포레이션용 큐벳에 옮겼다. 4D-NucleofectorTM 시스템 일렉트로포레이션 장치로 각각의 숙주 세포에 대응하는 프로그램을 이용해서 세포를 트랜스펙션하였다. 일렉트로포레이션 후 세포를 항생물질을 포함하지 않는 배지 5mL에 현탁하고 37℃의 쉐이커에 넣어서 배양하였다. 각 그룹의 샘플은 특정 방향(즉, 정방향 또는 역방향)인 전사 조절 인자 1개만 포함하고, 전사 조절 인자를 포함하지 않는 샘플을 대조군으로 채용하였다.
5.1.3 항체 발현을 신속하게 평가하기 위해 설계된 방법이 사용되었다. 이러한 방법은 항체의 중쇄와 경쇄가 거의 1:1 비율로 발현되도록 보장할 수 있으며, 비교적 짧은 시간에 항체 발현을 확실하게 평가할 수 있다. 트랜스펙션하고 나서 24시간 후, 18㎍/mL의 블라스티사이딘과 800㎍/mL의 제오신을 포함하는 배지를 등량으로 트랜스펙션한 세포에 첨가하였다.
5.1.4 2~4일마다 9㎍/mL의 블라스티사이딘과 400㎍/mL의 제오신을 포함하는 배지를 사용해서 세포를 계대하였다.
5.1.5 세포 생존율이 90% 이상으로 회복된 후 아달리무맙의 발현 수준을 유가 배양을 통해 평가하였다. 아달리무맙의 중쇄 발현 벡터와 경쇄 발현 벡터 모두를 동일한 숙주 세포에 트랜스펙션할 수 있어 아달리무맙의 중쇄와 경쇄를 동시에 발현시킬 수 있었다. 상기 중쇄 및 경쇄는 숙주 세포 내에서 자기 조립할 수 있기 때문에 완전한 아달리무맙을 얻을 수 있었다.
5.1.6 얻어진 아달리무맙의 생물적 활성을 측정하였다.
5.2 실험 결과
대조군에 비해 전사 조절 인자 B를 포함하는 정방향 서열의 일부(샘플 1, 2 및 4 참조)에서 아달리무맙의 발현 수준이 10%에서 20% 증가하였다(도 7에 도시).
외래 단백질 발현 벡터를 통해 발현되는 아달리무맙의 생물학적 활성을 측정함으로써, 그 생물학적 활성이 이미 알려진 시판되는 아달리무맙의 생물학적 활성과 동일함을 알 수 있었다.
실시예 6: 아달리무맙 발현에 사용되는 단백질 발현 시스템의 발현 수준에 대한 전사 조절 인자 조합의 영향
6.1.1 도 8 및 도 9에 도시한 바와 같이 각각 2개의 벡터를 구축하였다. 여기서 WXRE는 전사 조절 인자 B의 정방향 서열(B1)이고, EF1αI은 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 인간 EF1αI 유전자의 제1 인트론의 서열이고, HC는 아달리무맙의 중쇄를 코딩하는 핵산 서열이고, 그 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 11로 표시되며, LC는 아달리무맙의 경쇄(LC)를 코딩하는 핵산 아미노산 서열(nucleic amino acid sequence)이고, 그 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 12로 표시된다. 상기 벡터 구축이 완료된 후, MN 키트를 사용해서 플라스미드를 추출하고 얻어진 플라스미드를 세포 트랜스펙션에 사용하였다.
6.1.2 약 500만개의 CHO 숙주 세포를 원심 분리하고 상청을 폐기하였다. 그리고 Amaxa SF Cell Line 4D-Nucleofector Kit L(Lonza, Cat#VCA-1005)에 포함되는 90㎕ SF Cell Line Solution 및 20㎕ Supplement I와, 아달리무맙 서열을 포함하는 벡터(6.1.1에서 얻어짐) 30㎍을 균일하게 혼합하였다. 이 혼합 용액으로 세포를 재현탁하고 일렉트로포레이션용 큐벳에 옮겼다. 4D-NucleofectorTM 시스템 일렉트로포레이션 장치로 각각의 숙주 세포에 대응하는 프로그램을 이용해서 세포를 트랜스펙션하였다. 일렉트로포레이션 후 세포를 항생물질을 포함하지 않는 배지 5mL에 현탁하고 37℃의 쉐이커에 넣어서 배양하였다. 한쪽 샘플은 1개의 전사 조절 인자, 즉 EF1αI 인트론을 포함하고, 다른 쪽 샘플은 2개의 인자, 즉 B1 및 EF1αI 인트론을 포함하고, 전사 조절 인자를 포함하지 않는 샘플을 대조군으로 채용하였다.
6.1.3 트랜스펙션하고 나서 24시간 후 8㎍/mL의 블라스티사이딘과 400㎍/mL의 제오신을 포함하는 배지를 등량으로 트랜스펙션한 세포에 첨가하였다.
6.1.4 2~4일마다 4㎍/mL의 블라스티사이딘과 200㎍/mL의 제오신을 포함하는 배지를 사용해서 세포를 계대하였다.
6.1.5 세포 생존율이 90% 이상으로 회복된 후 아달리무맙의 발현 수준을 유가 배양을 통해 평가하였다. 아달리무맙의 중쇄 발현 벡터와 경쇄 발현 벡터 모두를 동일한 숙주 세포에 트랜스펙션할 수 있어 아달리무맙의 중쇄와 경쇄를 동시에 발현시킬 수 있었다. 상기 중쇄 및 경쇄는 숙주 세포 내에서 자기 조립할 수 있기 때문에 완전한 아달리무맙을 얻을 수 있었다.
6.1.6 얻어진 아달리무맙의 생물적 활성을 측정하였다.
6.2 실험 결과
실시예 6의 실험 결과는 표 8과 같다.
전사 조절 인자의 상이한 조합 조건하에 14일째에 아달리무맙의 상대적 발현 수준을 비교한 결과
번호 벡터 상대적 발현 수준
(Day 14)		 발현량 변화
1 CMV(대조군) 1
2 CMV-EF1αI 1.18 18% 상승
3 WXRE-CMV-EF1αI 1.42 42% 상승
표 8에서 알 수 있듯이, WXRE와 EF1αI 인트론을 포함하는 조합은 아달리무맙의 발현 수준을 유의하게 증가시켰다.
외래 단백질 발현 벡터에 의해 발현되는 아달리무맙의 생물학적 활성을 측정함으로써 그 생물학적 활성이 이미 알려진 시판되는 아달리무맙의 생물학적 활성과 동일함을 알 수 있었다. 따라서, 이 벡터에 의해 발현된 단백질은 올바르게 폴딩되었다.
실시예 7: 펨브롤리주맙을 발현하기 위해 사용되는 단백질 발현 시스템의 발현 수준에 대한 전사 조절 인자 조합의 영향
7.1.1 도 8 및 도 9에 도시한 바와 같이 각각 2개의 벡터를 구축하였다. 여기서 WXRE는 전사 조절 인자 B의 정방향 서열(B1)이고, EF1αI은 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 인간 EF1αI 유전자의 제1 인트론의 서열이고, HC는 펨브롤리주맙의 중쇄를 코딩하는 핵산 서열이고, 그 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 14로 표시되며, LC는 펨브롤리주맙의 경쇄(LC)를 코딩하는 핵산 아미노산 서열이고, 그 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 15로 표시된다.
상기 벡터 구축이 완료된 후, MN 키트를 사용해서 플라스미드를 추출하고, 얻어진 플라스미드를 세포 트랜스펙션에 사용하였다.
7.1.2 아래의 실험 단계는 본 발명의 실시예 6.1.2에서 6.1.6에 기재된 실험 단계와 동일하였다.
7.2 실험 결과
실시예 7의 실험 결과는 표 9와 같다.
전사 조절 인자의 상이한 조합 조건하에 14일째에 펨브롤리주맙의 상대적 발현 수준을 비교한 결과
번호 벡터 상대적 발현 수준
(Day 14)		 발현량 변화
1 CMV(대조군) 1
2 WXRE-CMV-EF1αI 1.16 16% 상승
표 9에서 알 수 있듯이, WXRE 및 EF1αI 인트론을 포함하는 조합은 펨브롤리주맙의 발현 수준을 유의하게 증가시켰다.
외래 단백질 발현 벡터에 의해 발현되는 펨브롤리주맙의 생물학적 활성을 측정함으로써 그 생물학적 활성이 이미 알려진 시판되는 펨브롤리주맙의 생물학적 활성과 동일함을 알 수 있었다.
실시예 8: 단백질 발현 시스템의 발현 수준에 대한 상이한 항생물질 농도의 영향
8.1.1 도 10 및 도 11에 도시한 바와 같이 각각 두 그룹의 벡터를 구축하였다. 1개 그룹은 아달리무맙에 사용하고, 다른 1개 그룹은 펨브롤리주맙에 사용하였다. 벡터 구축이 완료된 후 MN 키트를 사용해서 플라스미드를 추출하고 얻어진 플라스미드를 세포 트랜스펙션에 사용하였다.
8.1.2 약 500만개의 CHO 숙주 세포를 원심 분리하고 상청을 폐기하였다. 그리고 Amaxa SF Cell Line 4D-Nucleofector Kit L(Lonza, Cat#VCA-1005)에 포함되는 90㎕ SF Cell Line Solution 및 20㎕ 서플리먼트 I와, 아달리무맙 또는 펨브롤리주맙의 서열을 포함하는 벡터 30㎍을 균일하게 혼합하였다. 세포를 이 혼합 용액으로 재현탁하고 일렉트로포레이션용 큐벳에 옮겼다. 4D-NucleofectorTM 시스템 일렉트로포레이션 장치로 각각의 숙주 세포에 대응하는 프로그램을 사용하여 세포를 트랜스펙션하였다. 일렉트로포레이션 후 세포를 항생물질을 포함하지 않는 배지 5mL에 재현탁하고 37℃의 쉐이커에 넣어서 배양하였다.
8.1.3 트랜스펙션하고 나서 24시간 후 2~4일마다 상이한 농도의 블라스티사이딘 및/또는 제오신을 포함하는 선택 배지를 사용해서 세포를 계대하였다. 블라스티사이딘 및/또는 제오신의 구체적인 농도를 표 10에 기재하였다.
8.1.4 세포 생존율이 90% 이상으로 회복된 후, 항체 발현 수준을 유가 배양을 통해 평가하였다. 중쇄 발현 벡터 및 경쇄 발현 벡터 모두를 동일한 숙주 세포에 트랜스펙션할 수 있어 항체의 중쇄와 경쇄는 동시에 발현할 수 있었다. 중쇄와 경쇄는 숙주 세포 내에서 자기 조립(self-organization)할 수 있기 때문에 완전한 항체가 얻어졌다.
8.1.5 얻어진 항체의 생물학적 활성을 측정하였다.
8.2 실험 결과
실시예 8의 실험 결과는 표 10과 같다.
상이한 항생물질 농도하에서 14일째에 아달리무맙과 펨브롤리주맙의 발현 수준을 비교한 결과
블라스티사이딘 농도(㎍/mL) 제오신 농도(㎍/mL) titer(g/L)
아달리무맙 1 9 0 0.66
2 0 400 1.14
3 9 400 1.35
4 4 200 1.24
펨브롤리주맙 1 9 0 0.69
2 0 400 1.99
3 9 400 2.27
4 4 200 2.15
표 10에서 알 수 있듯이, 블라스티사이딘과 제오신을 포함하는 조합은 블라스티사이딘 또는 제오신 단독 사용에 비해 발현 수준이 유의하게 증가한 결과가 얻어졌다.
외래 단백질 발현 벡터에 의해 발현되는 아달리무맙 또는 펨브롤리주맙의 생물학적 활성을 측정함으로써 그 생물학적 활성이 이미 알려진 시판되는 아달리무맙 또는 펨브롤리주맙의 생물학적 활성과 동일함을 알 수 있었다. 따라서, 이 벡터에 의해 발현된 단백질은 올바르게 폴딩되었다.
본 발명의 상기 예는 본 발명을 명확하게 설명하기 위해 제공된 예시일 뿐이며, 본 발명의 실시형태를 한정하는 것은 아니다. 당업자는 상기 명세서에 기초해서 다른 형태의 다른 변경 또는 변형을 가할 수도 있다. 본 명세서의 모든 실시형태를 망라할 필요는 없으며 방법도 없다. 본 발명의 사상 및 원칙 범위 내에서 이루어진 수정, 동등한 대체, 개선 등은 모두 본 발명의 청구항의 보호범위 내에 포함되어야 한다.
<110> WuXi Biologics Ireland Limited <120> TRANSCRIPTIONAL REGULATORY ELEMENT AND ITS USE IN ENHANCING THE EXPRESSION OF EXOGENOUS PROTEIN <130> 19IP06001CN <150> PCT/CN 2018/100467 <151> 2018-08-14 <160> 23 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gcaaaaaagg gaataagggc gacacgg 27 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 catagcccat atatggagtt ccgcgtta 28 <210> 3 <211> 3619 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 3 gatctgcctg cctctgcccc gtgagtgctg ggattaaagg ccagcaccgc catgcctggc 60 ctcctttaag tgcaggtgta gcacgccaga aataccctgc tggtgacagt gtgagccaca 120 tgcgtgagac tgctgcagag gtcccagctt aggttgtgcc cttctttctt gagaaatgtc 180 ttacttggtg attttgagtg gaaacatgta tttagctgac atatgagcct agtcttttat 240 gtataaatgt gtgttatatt tctagataca aaaatattaa aaattagaaa tcttcagggc 300 tggagagggg ttcattggtt aagagctcat tggttaaggg ctgctcctgt ataggacccg 360 ggttacctgt cagcaccgta tgacggctct caaccatctg cagctcccgt tccagaggac 420 ccagtgtctt cttctggcct ctacagacat acatatagac aaaacaccca tacacaaaaa 480 tttaattaga aatcttaatt tttttctttc aattttctag attgactggg gataactttt 540 ttgttaactt tactgtcttg aggataacgt tcagtatgag ttgtatttct agagtttgtc 600 tttattttta ggcaaaaata acctttatta ccattttggg gggtgactgt tttacaactt 660 ttccaacttt ctgcttcatc tcttgtgtcc tatataggcc cctatttact gtcattatta 720 gagataggac ttgatgtcat gtcaactcca tctttgttat aaatctcaag aagagctaat 780 ttcttttgtg ttattacaac caaaaataaa caaggtagct tataaacagt gacttatttt 840 tatagttcta gatatgggaa gatcatggtg acagtagatt caatgtctag ttggaagttg 900 actcttcttc atagatggaa tccttgctat aatataatct caggatggaa gggatgagct 960 aagccctctg ggatctctta ttaatctgtt cattcattta cttattgcat agtgctctaa 1020 ttctgttcat ggagactctg ttcttacaca ttaggtggtt agggagggac atgatcaatc 1080 aggacatagg agcaacaata atttttatta tatttcccaa aatacatggc agttcctgac 1140 cttgctttat tactgcaaac atacagcttg tggccattgg acttagccat atgagaaatg 1200 taagaattta ttttatattg tagctgcaaa tggtaggttc atcaaattgt gccttaagtt 1260 cacatcttaa tttgctacaa aaaaaaaaga ggagtagtgt aagttacatt taattttcaa 1320 ttacttagta acagtttgta agtgctactt gatcctgttt tatatctagc attgagtata 1380 gatcaacaag tgtttcaatt cttgtttgga catgctgttc tctccttcat cacaagttac 1440 ttctggctaa acaaggcaca aatttcgcat gaccaccaat ccaaggacag ggcgacaatt 1500 ttaatgagtt tcattgagag ctggccaact gagcatctgt tccttttgtt ttcctgtacg 1560 tggtaagcca gtgtttctac actccttagc cttgttgctg tgtgtatagt gtggggtgga 1620 tttgtttttg ctgttctttt ttcttttttc taccctctac ttcagtggtg cacggttaga 1680 aatcttgtgg cgtctggcac ggtggtataa ttccttccat gctcttgggt gaggaaataa 1740 gtttgctcat tgctgctcat cagtctgttt cacttgctcc cagatggtga ccttctcgtc 1800 ccattcttgc ttgttttaac attattctga cacctatttt ctttcattgt ccccttaacc 1860 actctaattg aataatgatt tctgtaattt ccatttggaa cacaaccagc ttcctggttc 1920 cttttattgg cccacatcct gtcttctagt tcattgcttc agatttgagc caaatcatca 1980 aataaaaata cgtaactgaa aaaaatgttt attgcagtgg cctcctctag catggcaaca 2040 atgagagttt tcctttctta ttgctaaaca tgttatatct gtctcatgat ttcatactgt 2100 ctctcctggc ctcatttact gcttgacctt taaaagaaat gactcaaaga tatttttgta 2160 gttctgtaag catttctcta gttcttgttc ttcaccttta gttcttaaca gtagttttgt 2220 ctgctacact gacgtggctg tgaggacttt ccttcagaaa ctggcgtctg atactgattc 2280 aaactggtct ccattgtggc ctacatgtcc agctgtctcc atgtaacgcc actgaaatac 2340 agtgaagcca gccttttttt cccccttatg gttcaaagca actgaatttc agtcagagta 2400 attttggttt gggtatcaat actaattgta gtcttagacc ttttaattat tacttgtttg 2460 cattttacag aagacattgg tccttctcaa aagcagagat gaaacctgta gtattttgtg 2520 tgtagttttc ctctgctggt tgccctgtaa ctattcagtt cctgtaagga agcacagctg 2580 cttcataagc taccttaggc tgacagcagt ctcctgaaag aaagagttca agaaagaaac 2640 atttaaaaat aaaaatgggg aggggtccaa gtagtatttg aagccatgaa atatcttgaa 2700 tatagtttgc ttttttgttt tgttttgtct gtctgtctgt ccgatgtagc tttggccata 2760 tcaaccaggc tgtccttgaa ctcacagaaa tccacctgcc tccgcctccc aagtgctgga 2820 tgcaccacca tgccagctag tttgcttttt agagcatctc atctgctgct cacagccctg 2880 gtgctttatg ggatttgttt ggggaacatg atgagctcta tatttattgt agctttaaat 2940 ggacagcggt tattgactgt cagcttagtc tttaaaatct ataatcacat tgtacctaat 3000 tgtcaacctt catgtttttt aattatgaaa aaaactgaga acattaattt ttatgttatc 3060 ttgttattga ctttattgaa atactacaga aaattttggt ttgaggcttt tccataattt 3120 acccttacac ctcacacccc ttccataaac atgtgcagtt aaaattgaat tgttcgggca 3180 cttctacctt gatacctggc ctacagtggg aaaggtctgt ctttctttgg aataagccca 3240 tcagtggcct tgtgtacatt ctgtattttt gttgtttgtt attactgttt tttacttggg 3300 actaataatc tgtttgaaac tgactgagat agaaagatgt gatgttcctt cccactcact 3360 ccggattttg atagaagact tgttttattt atttccaaaa ttatatccgc aggaaacaag 3420 ctgtttaaat tcagattatg ctgaagcaaa atggtcctgg tatgagaagc aacgtgctgt 3480 tttacgagca cagagtccct tttctcataa ctgattgata gtaaatattt tcctgaagaa 3540 ttattgccaa ccatgaacag tgcaactgtt tcactttttt tccgtgctac ttgctgtacc 3600 agccattgtc ggtaattaa 3619 <210> 4 <211> 1114 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 4 gatctgaagt ttggatctgc agaacccaca caaaggccta cgggcttagt agtgtacctg 60 caatttcagc acttggaagg ctgagaaagg atcccaaggg cagctggcta 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tttctgtatt 660 tttaattctt ctgtttgcag ttgtaggaga ataaccctgc agcatctgag agaccaagct 720 aattacaaga atgactagaa atcctttgca tttttaaaac aattttatac atatgtcact 780 ttgtctttct aaaaaataaa aataaaaaaa atacctaaga gccgagtttg tgttaaaggc 840 taatgattgt attgtacaat tagtaagaat taaggacaaa ggtctcttta cctgaagttt 900 cctgggtgct tttattcatt cattcattca ttcattcatt cattcattca tttagtcaaa 960 ttagttcatt tctgatgcaa tgactgactg attactcccc agaccaatgc tccttcctgt 1020 tttaggttca cagatagcat ttcctacctt ctcttgtcct tccttttgtc caaaattttg 1080 agttctagac aaccacagaa ttgcctagaa atgctggaca gaattcatgc atctgattcc 1140 tggtaagacc gtcgatgcac tataaacttg cagaagctga cagcagactg ttcttcactt 1200 caactcattt atccctttcc tttgggttct gtccaaatca catcaccaga tcacaagaac 1260 ctaacatcag attgagacgt aaatagatga tatcacattg gatttccacc attgagccac 1320 accaccagcc acctgcctga taactttcac agtcccagaa gatattatac aagttactag 1380 ggcaaaaaga gatcaaagtc tgaatcagct gtgaacccta tgaatggcaa tacctactta 1440 tcaggcaata caagcccacc cgtgtgatag tggaataaca gtaatatggg caatcactgg 1500 attgagtcct ggccccactg cagagaatcc atgccaagca ctgtaaatcc aggaagaaaa 1560 aaaaaaacct atcactgaag aagacataaa ccctagaaag gaacttacta ctcttactta 1620 actgagtgag caaagcaaca agttatcttc taagtactta tgctggtgct catacacaaa 1680 attatccatc attcttaatt agagaattct ctctagtgaa tggttgtgga ttcaaagact 1740 cataaatacc aagggtgcta agaatgagcg acaattaaga actcagccct aaacaagatt 1800 tttatacctc atcttctaag gctcagaaac attgtggaag aaggtgtcaa aagaatgtaa 1860 gagtgaaaag agtgagaagg gctgccaata tcatctttgc tatcatgaac tcacaaaagc 1920 tgcagttgtt agtgccagga ctgtgtgaca ttgtcactac caacactcag ccttgggtgg 1980 ggaggagggc ataatgtcat actcttcatc attgagccat tggttactaa cagattctag 2040 gagaatcact ctctcttgtt atgtatccat ccatgaatct acaaggctcc attgggcagt 2100 tccaaactgg aggtcagaaa aatttcactg atgaaactca ctgggacaca atcaaaaata 2160 tgaaagagct ttgtagccat ctttttttct gacaagggtg ggagaggcat aacaaggaag 2220 gtaaataatt gattgcatta tatacacata tgaaactgtc aaagaacgca atttaaaaag 2280 tacatagtaa gtggttttcc atacaattta atttattatc acacagttgt tctttacagt 2340 atgtcttgat tatctctatc cctgactccc atgtcacccc cacaaacacc ctcaatatat 2400 ctccctccac cttatcaccc cttaatttct ttcattttac tattttatag ataatccact 2460 gaattcaatt agtgctgtct gttggaaagc cgaaggagac cgatatgttg gcttgatttg 2520 acacaggtct tctgcaggtg accaagatga agtgacttga atgtgatagc catgctatga 2580 aaaagagggc ttcatgtatt gtatcaaaag ggagcgtttc tcagctcctc tctccagcct 2640 ctgtctcata ttctttctgc tccgtcttcc tctgtaacat agtaaatttg tacagaacgg 2700 tcacaagtca caaatttggt agactacatg atgaaatttg caatgacttt ggagtactta 2760 acatggattt gaatgtccat ttggcatcgt tctagaagat aagtccaaag taagtgtgct 2820 atcttaccat cttccttcct tgtaggagtc ggccacgttt cccactctag accttagctc 2880 ctctagttag ctgcttcaaa gcatcaagtg gagtccgcat aatcactttg tactaattca 2940 taagctcata aatccagaca aagtgaaagt caaatctcaa gtcctgggcc acttatttgt 3000 tttctgtgca tcggacttag gattatttgc cctcttcctg ttccactgca tcagttctgt 3060 cagtgggggg ggggggggtt gggagtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 3120 gtgtgtgtgt tgcttacaaa gctgtcataa tgatgaaaca gagtatcagt cacatggtaa 3180 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ataaaaaata gcgcattgac 660 tctaactttt actacacctt actggttata tatgtatgtg tatgccatgg tacatgtgca 720 gagaacaaag gacaactttc cgggagtcat ttctatcctt ccactatgca tgtggtttct 780 gggatagaac tcaggtcatt agccttggca gcaagcctct taaccctctg aaccatctcc 840 ctggcctggc attttaaaat aatctttgat gcttctatca gtatcttggc cactgataat 900 ctataattat ttctctaaga ctatttgttt tccacaaaca aaatgctata agctgggaga 960 tttataaaga agagatacat ttggctcaca gctctggaaa ctgggaagtc caaaagcatg 1020 acaccagcag ctgtcaaatg cctttctgca gtatcataag aaatcagagg acagcacatg 1080 acaagaatgt tacaaaagga caggacaagt gttccaggct tggtctatgg ttttcatcat 1140 ttaaggccgc caattccatc acaagtgttc tcttccctat gatttcatgt aattctaaag 1200 acattctaaa accccacacc caaatactat tagcacaaga cattggagat tttagtttca 1260 atcttagctt taggggagag acactcagtt cataacagta tccccaagat ttccagtatc 1320 cagtgctgtc tcaatgcaat actactcaga ag 1352 <210> 9 <211> 1246 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 9 gatctttcca ttttctggta tcttctttaa tttctttctt ttaagactca aagttcttgc 60 tagacaggtc tttcacttgt 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gagttactag aatgtatttt atattatttg aagctattgt gattgctgct 120 gcttctttta tttcattctc aagctgtttg ccatttttac ataggagggc taatggttgt 180 tttagttact cttgtatccc gtcactttgc tgaaagtttt aatcacctgt acttccattg 240 atgaattttt agtgtcactt aggtggtacc actatatcat caacaagtaa caacacttct 300 acttcttcct ttccttgttg tcctttagct gtttaatggg tctatctaga acttcaagta 360 ctgtattgag tagatataga cttcacaaac ttgtcaagtt acagatttta taggaattcc 420 tttgtttttt ctctccattg tatttgatgt tgtctatagg tttgctgtaa atgtccttca 480 ttatgtgtgt gtatgtaaat tgtatccata atatctccaa gacttttatg atgtttgttt 540 cttgtcaatg actatttatt tatttattta tttattggtt tttcaagaca gggtttctcc 600 gtgcagcttt gaagcctatc ctggcactcg ctctggagat caggctggcc ttgaactcac 660 agtgatccac ctgcctctgc ctcccaagta ctgggattaa aggcatgcac ccccaatacc 720 tggcttatca atgactttgt aagcatgtaa agggataata aaaaagtgtt ttttaaagtt 780 tatttttatg gtggattaca gttactgatt tttgtatgtt gaaccatcac tgcgtatctg 840 agatgaagcc tactggatca gtttgtatga caaagttact ctgtggcttt tggtcctggg 900 actccctctg tagaccaggc tggcctcaaa ctcacataga tgcaactgcc tgtgtctccc 960 aagtgctggt gttaatgcca tgtgccacca ctgcccggct ctttattcct ttttataact 1020 caaatatttt gtaagtaact acagaaataa taggacacag aaaatgtagt actgcctagt 1080 aataattgtt gataacctgg attctccctc tccctaggtt ctgtgcgacc tggccctgat 1140 ccagctgcca atttctctcc tcccaccctg gtgttttctc ttgatctcca catgtcactc 1200 cacatcagca ctctcctggg cctgttgctt ccttagagat cctttcctgg cctagtggcc 1260 tctctaacac ttggattccc tccctgctct gggatccatc ttctcttctc ttttccaggt 1320 gacctgccct tgccctggga tctgtttttc acaggtgatt gttccttgct gacatctcaa 1380 agactgtcaa agtttgcatg gctgtgtggt gcatgtgtta attgactgaa ttaggattct 1440 gcatacagag accatgtaaa tcttggccaa aggcagttca gtgactatgg tttcaaaggc 1500 cccaactact gagcctcatt cttaactgtt tcctttccct ttataagcaa gtgcctccca 1560 tctgttttct ctctttccat ttctgctccc tattggttaa cacctacccc tccctttatt 1620 cccttttcca ataaactcca tgtggatttg ttgagtgtgt tggatcatgt tttatcaccc 1680 aaatgcacag taaaagacaa caacaacagt atctttaaaa taactgtgaa tagtgtatct 1740 attgagctag aaccataact caggttaaga gcacttcttg ttctatcata gtactacagt 1800 tctatttctc tctcccaacc ctggtggctt tcacccacca gtaactacag ctcttagaga 1860 acacaatttc tcctgatctc catgggctct tgcatatgca tgtacattta tacatataat 1920 ttaaaataac taacacgcac acactcactc acatatatat aatttttgag acagtttttc 1980 tctttgtaac cctggctatc tttctgctca gagatacttt tgcctatatc tacagggtgt 2040 tgagattaaa tacttgaacc agtgctgcct gcgtaaattc ttttttaagt ttatttgatt 2100 tcctgttgat taaaaagaaa tcccccaaaa tacatatcta aagacaagat ccagagtgca 2160 atggtcaagt gtctttggct agactggagt tcactgctac agttcctctt ggacacctag 2220 aataaaaact tggtatcagc agggactgtt agctcaagat taaactgcct gtaaatgcaa 2280 gactatggag gctaaagctg ggagatattc agagtttgag cctagtctgg gcaacttagt 2340 aagactcttt ctaaaataac caacaaaatg agaggcacag tgtcacacac ttgtcactca 2400 gcacttagga attagcggct ggataatcaa gcctgcaagg tcctcttgtg ctatgtagag 2460 agctcaagat gagtgtgcac tacatgaaat ctgtgtaaag aagaaagtag ccaacaaaaa 2520 ctacacacca aaacagaacc aatgaaaact gtattgtctt tgatatctac ccatagtcac 2580 tagagcttag gaagcaataa cctaaaagat tttaaaaaga gccaggcatt agtggtgcac 2640 gcctttaatc ccagcactcg ggaggcagag gcatttgcat ctctgtgagt tagaggccag 2700 cctgggcagc tttgaacagc atcaattgta gatgcaagat aaatgccatt aatacacagg 2760 gaaaatctct aaaatgttgg gaagaaatca attcctagcc ctaacaagta ggtaacaatc 2820 atcatccttt cattacaaat tcactttaaa attgggtagt gagttacctg tcaccatgat 2880 ccagcaatcc cagctacccc agaggcttag acagtaaaat aggctacagt atacccagga 2940 gctccagacc agccatgaca tcttcacaag aactaaaaaa aaattaaaaa ctaggggagc 3000 tgttaggata tcagtcaggc aaatagatga accactacat cctcccttta ctcacaattg 3060 ccttttgacg aatgcaatgg atgagagaat cacattgcac tgctagttcc cataaagacg 3120 gctggactcc atcttggctc aagggcagag agttcataac tgtccttagg aaatcataaa 3180 acctaaaggt caaaggtgtg gctacagtag gatattgcat catggcatgg ggtgtcttat 3240 gctaaataaa aacagacttg gtctgagatg tgctgacacc tgtccctaaa gaacaggtaa 3300 ctagaatttg aatctaaggt atggttacca aattggtgaa aaattcagca agaaaagagt 3360 gtttgctttg tatgaaggaa ctcatgttca ccttttggtt aaggtatatg agagtggtga 3420 gaaataaact tgtggtgttc agtattaact ggatctgccc tcctgatttt attctgtgtc 3480 tttctaggct tcctttagtc cacactctcc ctttcaagaa caaacctcag gctgcttggt 3540 tggctgccac tgcagctcca aaaagtcagc ttctcacatt gcacaagcat gtgaacttca 3600 taaatctgct tgatagctta gcttccaatg tttaaatcca gtgaggtcta cttgattatt 3660 tacaggctga taatccattg cattcagaat aatgaaaact agtgatggat cttcctgagg 3720 tgcaaataat cccaaagcaa atgccaaagt gcctgcaagg taggaatgaa ctttatttcc 3780 aaactgacag cagcagctgc tgtggtggaa gctggtgcac acactgtata acttgagagg 3840 cagtcagctg gatctcctgt tgctaacagt gcgactgatg agagctgaca cccatcaatg 3900 gagttagggc ctcactccga gatcaagtgt tgtggcagct acacagatc 3949 <210> 21 <211> 1128 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 21 atggtcagac ccaggtgctc tggcagacag gtttcagtcc ctcccatgag gtgtcccatg 60 tatgctcagt gagatgtcct tcacctctga cacctcagat acctcaccgg gttctctttg 120 cagcagaaaa tagatgctaa caaattctgt tgatgaatcc atctgggcaa taagactcaa 180 gggagccact tgcctacaca cctgaataga tgaagcaagc cctaccctac cctccaggta 240 tctaaaacca ggattccaat aataaaatcc ttacaattca caggggagcc tgaatgtttt 300 gatttacaat gtggcattga ttgtgttgga gaatatgggg ggaacaacta gtgcaccttg 360 aaacatcact gctcaattgc agcattgcca aaatacccca gcagaacgca ttaggacaga 420 gtgtctgtgg gacaggtcca tagtgcacat acatgacctc ccgactgaac tccctaggag 480 catgtgacag tgaaggacag agaggcccag tgtatgctgc tgatgataaa gcttctgcac 540 aacaaaatct gtcctttctg ccccctgcac gggacaaggg ccagttgtag agagtgcttg 600 tgtcacaggg ctcctctagg cctctgtgtc ctggccacag atgggtgtgg accgcagcct 660 cagggttctc atgacatgac ttctttcgtt attacatttg tttctctgtc tctgtctctg 720 tctctgtctc tgtctctgtc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctg 780 tgtttatgtg tgtttgtaga ggttaaaagg tgctctgtag catttcttca aattggttta 840 aatagtaaaa acgctgagtg agatgtcaga taattgggta aatgttgaga cataagagaa 900 ttaaaggagc caactctata gggacttctt acctgtacca aatgttcaga tggaagtgct 960 ggggaggtcc tgtctttaca aatcctctat atgaataagc ctaaatactg cctcctccag 1020 ccttatactc ctgtctccac ctgaggtgcg agccacacgc acccagctct tatatctatc 1080 agactggttg aatttcgtgt acctcagtgt ggccttgaac tcctgatc 1128 <210> 22 <211> 1352 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 22 cttctgagta gtattgcatt gagacagcac tggatactgg aaatcttggg gatactgtta 60 tgaactgagt gtctctcccc taaagctaag attgaaacta aaatctccaa tgtcttgtgc 120 taatagtatt tgggtgtggg gttttagaat gtctttagaa ttacatgaaa tcatagggaa 180 gagaacactt gtgatggaat tggcggcctt aaatgatgaa aaccatagac caagcctgga 240 acacttgtcc tgtccttttg taacattctt gtcatgtgct gtcctctgat ttcttatgat 300 actgcagaaa ggcatttgac agctgctggt gtcatgcttt tggacttccc agtttccaga 360 gctgtgagcc aaatgtatct cttctttata aatctcccag cttatagcat tttgtttgtg 420 gaaaacaaat agtcttagag aaataattat agattatcag tggccaagat actgatagaa 480 gcatcaaaga ttattttaaa atgccaggcc agggagatgg ttcagagggt taagaggctt 540 gctgccaagg ctaatgacct gagttctatc ccagaaacca catgcatagt ggaaggatag 600 aaatgactcc cggaaagttg tcctttgttc tctgcacatg taccatggca tacacataca 660 tatataacca gtaaggtgta gtaaaagtta gagtcaatgc gctatttttt atataaataa 720 acataaggac acagcacacg cgcgagcaca catacacaca cacacacaca cacacacaaa 780 aaaaaaaaaa aaaaatgaaa gtagaagagg gcctgctgag gaagagggtc ccagctggtt 840 aggaaggagg atgacaatgg tattaaaggg tgaaaaatga cccaaattca ctatatactt 900 acatgaatct gtcaaatcat ttaaaaagcc atgtattact gtattagttt cttgtctatt 960 gttgtgataa aatgccatga actaaagcaa ctttaaaaag tttattttgg ttttcagttc 1020 cagaggttcc tgagggggca ttcataatgg tgggagaggc atgtcagctg gtagccaaag 1080 caggaagctg agggcctaga gagatggctc actagttaag agcactgact cctcttccag 1140 aggactcaag ttcagttccc agccccacat ggcagctcac acctgtctgt agctccagtt 1200 tcaggggacg caacacccat ggcaaaacat tgattaacat aaatataaaa tgaaaacctc 1260 cagtttcagg gtatccgaca cccacgacaa aaaacatcaa tgggtataaa aataaaataa 1320 aatactttta aaaagcagga agctgagaga tc 1352 <210> 23 <211> 1246 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 23 ctggtacctt cttttcccag agtctataca agttaggaaa aacaggaaat gtgggaaaac 60 aggagacagc tgaagctcag catctggcaa gacccaacag ggtccctctg ctaatgatgt 120 tccctgagat ttgattctaa aacctcagat tctttaagtc atgaggtgac atcctcacct 180 cagacttcta aatcacctgt gttctccttt ctacaaatgg gacaaacatc catccaacat 240 tcaagtccaa aacctgagag tcatccttaa tttctctttt cctttttagc tccctaccga 300 ttctttttca aaaatccacc ctttctctca atcttcacgt catcagtttt tagaaatagg 360 tcatttctct ccctgagctt atcatctgcc tacatgaatc tgaactctca ttttaaaaat 420 cacatgtaga gcttggcccc tgccttgagc ccgacttctg cctgtccact ctgggaactc 480 ctgtcctggg gactgcaggc aaatcaactt gccccctgag gaccaagcaa cctcaagtct 540 gatgacatca ctgtgctagt ccagttccca cccccaccta gagagggagt gccccagacc 600 cgcctgaacc caccataaga cccatcagag tatcagaccc tcttgcatcc accaaagaga 660 accttggacc catacacacc aggagaggaa gagacggcac ctgaacccac tggaagaaga 720 gatgggaaga caacaatata aaaacgcatt caataacaga aaaaacaata tgacaccact 780 agaatctagg gactctacgc cagcaagacc tgaacatccc aacacagatg aagcagaaga 840 gaatgacttc tgcttgtact tgaagttcta tctggggcaa tatgacaaca aaaaggagaa 900 caaggggata caaattggaa aggaagaagt caaattttta ctgtttgcag atgatatgat 960 agttacataa gtaacccaaa aaactctacc agggaactac tacagctgat aaacaccttc 1020 agctaagtgg aaggatacaa gattaactca aaaaatcact agccctatta tacacaggag 1080 ataaatgggc tgagaaataa atcagagaaa catcatcctt tacaatagcc aaacaacata 1140 aaatatcttg gggtaatgat aaccaaacaa gtgaaagacc tgtctagcaa gaactttgag 1200 tcttaaaaga aagaaattaa agaagatacc agaaaatgga aagatc 1246

Claims (20)

  1. (i) 또는 (ii)로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자로서:
    (i) SEQ ID NO: 3-9 중 어느 하나의 서열;
    (ii) SEQ ID NO: 3-9 중 어느 하나의 서열의 역상보 서열;
    단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  2. 청구항 1에 기재된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 벡터.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 벡터가 재조합 발현 벡터인 벡터.
  4. 청구항 2에 있어서,
    (iii) 내지 (v)로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 벡터:
    (iii) SEQ ID NO: 13의 서열;
    (iv) SEQ ID NO: 13의 서열의 역상보 서열; 및
    (v) 고 엄격성 혼성화 조건 또는 보다 고 엄격성 혼성화 조건에서 (iii) 또는 (iv)의 서열과 혼성화 가능한 서열의 역상보 서열.
  5. 청구항 2에 있어서,
    CMV 프로모터를 더 포함하고, 상기 CMV 프로모터는 SEQ ID NO: 16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
  6. 삭제
  7. 청구항 2에 있어서,
    한 종류 또는 여러 종류의 단백질을 코딩하는 1개 이상의 유전자를 더 포함하는 벡터.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 단백질은 항체, 융합 단백질, 효소, 가용성 단백질, 막 단백질, 구조 단백질, 리보솜 단백질, 자이모겐(zymogen), 세포 표면 수용체 단백질, 전사 조절 단백질, 번역 조절 단백질, 염색질 단백질, 호르몬, 세포주기 조절 단백질, G 단백질, 신경 활성화 펩티드, 면역 조절 단백질, 혈액 성분 단백질, 이온 채널 단백질, 열 충격 단백질(heat shock protein), 디히드로 엽산환원효소(dihydrofolate reductase), 항생물질 내성 단백질, 어느 하나의 상기 단백질의 기능적 단편, 어느 하나의 상기 단백질의 에피토프 단편, 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 벡터.
  9. 청구항 2 내지 5, 7 및 8 중 어느 한 항에 기재된 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  10. 단백질을 안정적으로 발현하는 재조합 숙주 세포를 제조하는 방법으로서, 청구항 2 내지 5, 7 및 8 중 어느 한 항에 기재된 벡터를 숙주 세포에 삽입하는 단계를 포함하는 방법.
  11. 상기 숙주 세포가 중국 햄스터 난소(CHO) 세포인, 청구항 9에 기재된 재조합 숙주 세포.
  12. 단백질을 제조하는 방법으로서, 단백질 생산을 가능하게 하는 조건하에 청구항 9에 기재된 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  13. 청구항 9에 기재된 재조합 숙주 세포를 포함하는 키트.
  14. 청구항 9의 재조합 숙주 세포를 포함하는 비정상적인 단백질 발현에 의한 질 환을 검출하기 위한 시약 또는 키트의 제조용 조성물.
  15. 청구항 9의 재조합 숙주 세포를 포함하는 종양(tumors) 또는 자가면역 질환 (autoimmune diseases) 중에서 선택된 질환의 치료 또는 예방용 의약 조성물.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
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