CN116555264A - 转录调节元件及其在增强异源蛋白表达中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及转录调节元件及其在增强异源蛋白表达中的应用。提供了一种多核苷酸,所述多核苷酸可用作用于提高蛋白质表达系统的蛋白质表达水平的WXRE转录调控元件。还提供了包含上述WXRE转录调控元件的蛋白质表达载体或蛋白质表达系统及其用途。使用WXRE转录调控元件可以在保持其生物活性不变的情况下大幅提高异源蛋白的表达水平。
Description
本申请是申请日为2019年8月14日、申请号为201980052283.5(国际申请号:PCT/CN2019/100549)的专利申请“转录调节元件及其在增强异源蛋白表达中的应用”的分案申请。
技术领域
本公开涉及分子生物学和生物工程领域。特别是,本公开涉及一种利用哺乳动物细胞表达异源蛋白的新型转录调节元件。具体来说,本公开涉及一种用于真核细胞系制备异源蛋白并提高前述蛋白表达水平的转录调节元件WXRE(WuXi Regulatory Element)和含有WXRE的异源蛋白表达系统,以及前述表达系统在生产异源蛋白的应用。
背景技术
在生物学研究中,蛋白质的研究越来越受到关注,而蛋白质研究最为重要的莫过于蛋白表达系统的选择。蛋白表达系统是指用模式生物如细菌、酵母、植物细胞或者动物细胞表达异源蛋白的一种分子生物学技术。常见的蛋白表达系统分为原核表达系统和真核表达系统。
其中,原核表达系统是通过原核生物来获得异源蛋白的体系,主要包括:大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统等,其中大肠杆菌系统应用最为广泛。原核表达系统的特点是宿主菌生长快,培养简单,操作方便;价格低廉;遗传背景清楚,基因安全;蛋白表达水平高。但是,原核表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控;与此同时,原核表达系统的表达产物可能会以包涵体的形式存在,生物活性较低,并且翻译后的加工修饰体系不完善(例如无法进行糖基化修饰)。
另一方面,真核表达系统主要包括哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞表达系统,是近年来常用的一种表达异源蛋白的手段,它补充了一些原核表达系统中所缺乏的功能,例如利用真核表达系统表达时能够形成稳定的二硫键,在蛋白经过翻译后可对蛋白进行正确修饰,使表达出来的蛋白更具天然活性而不是被降解或者是形成包涵体。其中,哺乳动物表达系统具有能诱导高效表达,对表达的蛋白进行正确折叠,并准确进行复杂糖基化修饰,蛋白活性接近于天然蛋白,且不需去除内毒素等特点。与此同时,哺乳动物表达系统是唯一可以表达复杂蛋白质的系统,其对于抗体,例如人源化单克隆抗体的生产,具有可大量生产和人源性好等特点。哺乳动物表达系统中常用的宿主细胞包括CHO,COS,BHK等细胞。
阿达木单抗(adalimumab,商品名:修美乐)是抗人肿瘤坏死因子(TNF)的人源化单克隆抗体,被NMPA(National Medical Products Administration)批准用于治疗类风湿关节炎和强直性脊柱炎,并且具有良好的治疗效果。
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulatingfactor,GM-CSF)是一种具有多效性的造血细胞生长因子,在粒细胞系与巨噬细胞的发育与成熟阶段起到调控作用。GM-CSF对滑膜组织中的单核细胞分化为炎症性树突细胞也具有关键作用,其参与诱导并维持急性关节炎的产生和发展。与此同时,对于类风湿性关节炎患者进行血清及滑膜检测,发现GM-CSF因子水平显著增高,并与疾病活动密切相关,主要反映在骨侵蚀恶化,滑膜衬里细胞及其下层浸润大量巨噬细胞。
PD-1是由活化的T和B细胞表达的关键的免疫检查点受体和介导免疫抑制。PD-1是CD28受体家族的成员,该家族包括CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1和BTLA。已鉴定了PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体,程序化死亡配体-1(PD-L1)和程序化死亡配体-2(PD-L2),它们在抗原呈递细胞以及许多人癌症上表达和已经显示在结合PD-1时下调T细胞活化和细胞因子分泌。
PD-L1又被称为CD274或者B7-H1,其在多种肿瘤细胞中均有上调表达,它与T细胞上的PD-1结合,抑制T细胞增殖和活化,使T细胞处于失活状态,最终诱导免疫逃逸。PD-L1的抑制剂可以阻断PD-1和PD-L1的结合,上调T细胞的生长和增殖,增强T细胞对肿瘤细胞的识别,激活其攻击和杀伤功能,通过调动人体自身的免疫功能实现抗肿瘤作用。
由于单克隆抗体,例如阿达木单抗、PD-1的单克隆抗体和PD-L1的单克隆抗体,均可以通过哺乳动物表达系统进行生产,而哺乳动物表达系统存在异源蛋白表达水平较低的问题,因此,迫切需要对现有技术已知的哺乳动物表达系统进行改进,提供一个能够达到显著更高水平的异源蛋白表达的系统。与此同时,需要通过上述系统,生产人源化单克隆抗体。
发明内容
发明要解决的问题
本公开提供了一种源于CHO(Chinese Hamster Ovary)细胞的,可以用于增强异源蛋白表达的DNA序列,所述DNA序列能够用于增强哺乳动物表达系统的异源蛋白表达水平。
用于解决问题的方案
本公开涉及的技术方案如下。
(1)一种多核苷酸,其中,所述多核苷酸选自(i)-(iv)中的任一项:
(i)包含如SEQ ID NO:3-9任一序列所示的序列的核苷酸序列;
(ii)包含如SEQ ID NO:3-9任一序列所示的序列的反向互补序列的核苷酸序列;
(iii)在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下,能够与(i)或(ii)所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列;
(iv)与(i)或(ii)所示的核苷酸序列具有至少90%,可选至少95%,优选至少97%,更优选至少98%,最优选至少99%的序列同一性的序列。
(2)根据(1)所述的多核苷酸,其中,所述多核苷酸还包含选自(v)-(viii)中的任一项:
(v)包含如SEQ ID NO:13所示的序列的核苷酸序列;
(vi)包含如SEQ ID NO:13所示的序列的反向互补序列的核苷酸序列;
(vii)在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下,能够与(v)或(vi)所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列;
(viii)与(v)或(vi)所示的核苷酸序列具有至少90%,可选至少95%,优选至少97%,更优选至少98%,最优选至少99%的序列同一性的序列。
(3)根据(1)或(2)所述的多核苷酸,其中,所述多核苷酸能够提高蛋白表达系统的蛋白表达水平;可选的,所述蛋白表达系统选自真核细胞蛋白表达系统;优选的,所述真核细胞蛋白表达系统为CHO(Chinese Hamster Ovary)细胞的蛋白表达系统。
(4)根据(1)或(2)所述的多核苷酸,其中,所述多核苷酸选自包含如SEQ ID NO:4所示的序列,或包含如SEQ ID NO:4所示的序列的反向互补序列的序列;可选的,所述多核苷酸选自包含如SEQ ID NO:4所示的序列和如SEQ ID NO:13所示的序列的核苷酸序列,或包含如SEQ ID NO:4所示的序列的反向互补序列的序列和如SEQ ID NO:13所示的序列的反向互补序列的核苷酸序列。
(5)根据(3)所述的多核苷酸,其中,所述蛋白表达系统用于表达抗体,融合蛋白或重组蛋白,可选的,所述抗体选自单克隆抗体,所述融合蛋白为细胞程序性死亡受体-1(Programmed Death-1,PD-1)的抗体或细胞程序性死亡受体配体-1(Programmed Death-Ligand 1,PD-L1)的抗体;优选的,所述单克隆抗体选自阿达木抗体,所述PD-1的抗体为pembrolizumab。
(6)一种用于提高蛋白表达系统的蛋白表达水平的WXRE转录调节元件,其中,其含有如(1)至(5)任一项所述的多核苷酸。
(7)一种蛋白表达载体或蛋白表达系统,其中,其含有如(1)至(5)任一项所述的多核苷酸或如(6)所述的WXRE转录调节元件;可选的,所述蛋白表达载体或蛋白表达系统还含有至少一个启动子和至少一个限制性酶切位点;优选的,所述蛋白表达载体或蛋白表达系统选自哺乳动物细胞蛋白表达载体或哺乳动物细胞蛋白表达系统;更优选的,所述哺乳动物细胞为CHO细胞。
(8)一种细胞系,其中,其含有如(7)所述的蛋白表达载体或蛋白表达系统。
(9)一种试剂盒,其中,其含有如(7)所述的蛋白表达载体或蛋白表达系统、或(8)所述的细胞系。
(10)如(7)所述的蛋白表达载体或蛋白表达系统、或如(8)所述的细胞系在制备用于检测蛋白表达异常导致的动物疾病的试剂或试剂盒中的应用。
(11)根据(10)所述的应用,其中,所述动物疾病能够导致所述动物体内的目标蛋白的表达异常,并且所述蛋白表达载体或蛋白表达系统、或细胞系能够分泌所述目标蛋白的抗体;可选的,所述动物选自哺乳动物;优选的,所述哺乳动物为人。
在一个技术方案中,可以通过现有技术中已知,对于类风湿性关节炎,发现GM-CSF因子水平显著增高,并与疾病活动密切相关,主要反映在骨侵蚀恶化,滑膜衬里细胞及其下层浸润大量巨噬细胞。因此,可以通过本公开涉及的蛋白表达载体或蛋白表达系统,制备得到GM-CSF的抗体。其中,GM-CSF的抗体的序列是现有技术中已知的。示例性的,GM-CSF抗体的序列可以选自如WO 2018050111 A1中所示的序列。得到GM-CSF的抗体后,进而通过检测GM-CSF的表达水平,用于诊断类风湿性关节炎。
(12)如(7)所述的蛋白表达载体或蛋白表达系统、或如(8)所述的细胞系表达的蛋白在制备用于治疗或预防动物疾病的药物的应用;可选的,所述动物疾病选自肿瘤或者自身免疫性疾病。
(13)根据(12)所述的用途,其中,所述肿瘤选自癌症,和/或所述自身免疫性疾病选自类风湿关节炎或强直性脊柱炎。
(14)一种制备蛋白的方法,其中,选择如(7)所述的蛋白表达载体或蛋白表达系统、或如(8)所述的细胞系分泌所述蛋白;可选的,所述蛋白选自抗体,融合蛋白或重组蛋白;优选的,所述抗体选自单克隆抗体,所述融合蛋白为细胞程序性死亡受体-1(Programmed Death-1,PD-1)的抗体或细胞程序性死亡受体配体-1(Programmed Death-Ligand 1,PD-L1)的抗体;更优选的,所述单克隆抗体为阿达木抗体,所述PD-1的抗体为pembrolizumab。
(15)一种高表达目标蛋白的稳定细胞系的筛选方法,其中,利用如(7)所述的蛋白表达载体或蛋白表达系统,将编码所述目标蛋白的目标基因转染到所述细胞,筛选获得高表达目标蛋白的稳定细胞系;可选的,所述蛋白表达载体或蛋白表达系统选自哺乳动物细胞蛋白表达载体或哺乳动物细胞蛋白表达系统;更优选的,所述哺乳动物细胞为CHO细胞。
(16)根据(15)所述的筛选方法,其中,所述筛选方法包括针对筛选标记的抗生素筛选或针对扩增的标记基因的药物加压筛选。
(17)利用(15)至(16)任一项所述的筛选方法获得的细胞系。
(18)一种检测动物疾病的方法,其中,采用如(7)所述的蛋白表达载体或蛋白表达系统、或如(8)所述的细胞系分泌的蛋白对所述动物是否患有疾病进行检测;其中,所述动物疾病能够导致所述动物体内的目标蛋白的表达异常;并且,
(i)如果所述分泌的蛋白能够和所述检测目标蛋白相互作用,表明所述动物患有疾病;
(ii)如果所述分泌的蛋白能够和所述检测目标蛋白不相互作用,表明所述动物未患有疾病。
(19)根据(18)所述的方法,其中,所述蛋白表达载体或蛋白表达系统、或细胞系能够分泌所述检测目标蛋白的抗体;可选的,所述动物选自哺乳动物;优选的,所述哺乳动物为人。
(20)一种治疗或预防动物疾病的方法,其中,将如(7)所述的蛋白表达载体或蛋白表达系统、或如(8)所述的细胞系分泌的蛋白给予所述动物;可选的,所述动物疾病选自肿瘤或者自身免疫性疾病。
(21)根据(20)所述的方法,其中,所述肿瘤选自癌症,和/或所述自身免疫性疾病选自类风湿关节炎或强直性脊柱炎。
(22)一种制备目标抗体的方法,其中,包括如下步骤:
(i)根据(14)所述的制备蛋白的方法,制备得到所述蛋白;
(ii)利用步骤(i)得到的所述蛋白免疫动物,得到相应所述目标抗体。
(23)一种载体,其中,所述载体包含根据(1)或(2)所述的多核苷酸中的至少任意一种。
(24)根据(23)所述的载体,其中,所述载体还包含CMV启动子;可选的,所述CMV启动子包含如SEQ ID NO:16所示的序列,或所述CMV启动子包含与所述如SEQ ID NO:16所示的序列具有至少90%,可选至少95%,优选至少97%,更优选至少98%,最优选至少99%的序列同一性的序列。
(25)根据(23)或(24)所述的载体,其中,所述载体包含一个或多个编码一种或多种目标蛋白的基因。
(26)根据(25)所述的载体,其特征在于,所述目标蛋白选自:抗体、融合蛋白、酶、可溶性蛋白、膜蛋白、结构蛋白、核糖体蛋白、酶原、细胞表面受体蛋白、转录调节蛋白、翻译调节蛋白、染色质蛋白、激素、细胞周期调节蛋白、G蛋白、神经活性肽、免疫调节蛋白、血液组分蛋白、离子门蛋白、热休克蛋白、二氢叶酸还原酶、抗生素抗性蛋白、任一所述目标蛋白的功能片段、任一所述目标蛋白的表位片段、及其任意组合所组成的组。
(27)一种分离的宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞包含如(23)至(26)任一项所述的载体。
(28)一种制备稳定表达目标蛋白的宿主细胞的方法,其特征在于,所述方法包含利用(23)至(26)任一项所述的载体,转化初始宿主细胞的步骤。
(29)根据(27)所述的宿主细胞或根据(28)所述的方法,其中,所述宿主细胞为中国仓鼠卵巢细胞。
(30)一种制备目标蛋白的方法,其中所述方法包含利用(27)所述的宿主细胞、或通过(28)或(29)所述的方法,制备所述目标蛋白。
可选地,本发明提供以下实施方案。
(31).一种多核苷酸,其包含与选自由SEQ ID NO:3-9组成的组中的调控序列具有至少85%同一性的核苷酸序列、启动子和编码多肽的异源序列,其中所述调控序列、所述启动子和所述编码多肽的异源序列可操作地连接在一起。
(32).根据(31)所述的多核苷酸,其中所述多核苷酸进一步包含EF1αI基因内含子。
(33).根据(32)所述的多核苷酸,其中所述EF1αI基因内含子包含与SEQ ID NO:13具有至少80%同一性的序列。
(34).根据(33)所述的多核苷酸,其中所述选自由SEQ ID NO:3-9组成的组中的调控序列具有正向。
(35).根据(34)所述的多核苷酸,其中所述选自由SEQ ID NO:3-9组成的组中的调控序列具有反向。
(36).一种用于增强抗体的表达的宿主细胞,所述细胞包含
编码抗体重链或其片段的第一多核苷酸,其中所述第一多核苷酸可操作地连接至与SEQ ID NO:3-9中任一项的序列具有至少85%同一性的序列或SEQ ID NO:3-9中任一项的序列的反向互补序列;和
编码抗体轻链或其片段的第二多核苷酸,其中所述第二多核苷酸可操作地连接至与SEQ ID NO:3-9中任一项的序列具有至少85%同一性的序列或SEQ ID NO:3-9中任一项的序列的反向互补序列。
(37).根据(36)所述的宿主细胞,其中所述第一多核苷酸可操作地连接至与SEQID NO:4具有至少85%同一性的序列并且所述第二多核苷酸可操作地连接至与SEQ ID NO:4具有至少85%同一性的序列。
(38).根据(36)所述的宿主细胞,其中所述第一多核苷酸可操作地连接至与SEQID NO:4具有至少85%同一性的序列并且所述第二多核苷酸可操作地连接至与SEQ ID NO:9具有至少85%同一性的序列。
(39).根据(36)所述的宿主细胞,其中所述第一多核苷酸可操作地连接至与SEQID NO:9具有至少85%同一性的序列并且所述第二多核苷酸可操作地连接至与SEQ ID NO:9具有至少85%同一性的序列。
(40).根据(36)所述的宿主细胞,其中所述第一多核苷酸可操作地连接至与SEQID NO:4具有至少85%同一性的序列并且所述第二多核苷酸可操作地连接至与SEQ ID NO:17具有至少85%同一性的序列。
(41).根据(36)所述的宿主细胞,其中所述第一多核苷酸可操作地连接至与SEQID NO:9具有至少85%同一性的序列并且所述第二多核苷酸可操作地连接至与SEQ ID NO:17具有至少85%同一性的序列。
(42).一种包含表达盒的表达载体,其中所述表达盒包含可操作地连接至编码多肽的核酸序列的启动子、和与选自由SEQ ID NO:3-9组成的组中的序列具有至少85%同一性的调控序列,其中所述调控序列可操作地连接至所述启动子。
(43).根据(42)所述的表达载体,其中所述表达载体具有有义链和反义链,并且所述有义链包含与选自由SEQ ID NO:3-9组成的组中的序列具有至少85%同一性的序列(从5’至3’)。
(44).根据(42)所述的表达载体,其中所述表达载体具有有义链和反义链,并且所述反义链包含与选自由SEQ ID NO:3-9组成的组中的序列具有至少85%同一性的序列(从5’至3’)。
发明的效果
在一个技术方案中,本公开中列出的转录调节元件WXRE的使用可以使异源蛋白的表达水平大幅提高,对于哺乳动物蛋白生产方面有巨大的帮助作用。
在一些技术方案中,异源蛋白的表达水平提高约或至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%。在一些技术方案中,异源蛋白的表达水平提高80%。
在另一个技术方案中,本公开中列出的转录调节元件WXRE的使用,可以使异源蛋白在表达水平大幅提高的同时,仍然维持自身的生化活性。
在另一个技术方案中,本公开中列出的转录调节元件WXRE能够和其它的转录调节元件作为整体一起使用,可以使异源蛋白在表达水平大幅提高的同时,仍然维持自身的生化活性。
附图说明
图1示出了未插入WXRE的表达GFP的载体的示意图。
图2示出了插入WXRE后的表达GFP的载体的示意图。
图3示出了加入转录调节元件A~G后对融合蛋白表达水平的影响。其中A1和A2分别示出转录调节元件A的正反两个方向,其他以此类推。
图4示出了加入转录调节元件A~G后对融合蛋白表达的单位生产率的影响。其中A1和A2分别示出转录调节元件A的正反两个方向,其他以此类推。
图5示出了插入WXRE的表达阿达木单抗重链的载体的示意图。其中,HC的含义是重链。
图6示出了插入WXRE的表达阿达木单抗轻链的载体的示意图。其中,LC的含义是轻链。
图7示出了在不同转录调节元件组合条件下阿达木单抗的第14天表达水平对比。其中,在样品1-样品6中,重链上游转录调节元件和轻链上游转录调节元件的组分参见表6。
图8示出了插入WXRE和EF1αI内含子(即如SEQ ID NO:13所示的序列)的表达抗体的重链的载体的示意图。其中,HC的含义是重链。
图9示出了插入WXRE和EF1αI内含子(即如SEQ ID NO:13所示的序列)的表达抗体的轻链的载体的示意图。其中,LC的含义是轻链。
图10示出了表达抗体重链的载体的示意图。
图11示出了表达抗体轻链的载体的示意图。
具体实施方式
定义
在本公开的权利要求和/或说明书中,词语“一(a)”或“一(an)”或“一(the)”可以指“一个”,但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的,词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的,并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。与此同时,“包含”、“具有”、“包括”或“含有”也可以表示封闭式的,排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中,术语“约”表示:一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”,但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外,权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
本公开中的“转录调节元件”(Transcriptional Regulatory Element)指的是参与基因转录调控的一些多核苷酸。可选的,前述多核苷酸可以选自DNA,主要包括启动子、增强子、绝缘子等。在本公开中,转录调节元件也被称为WXRE(WuXi Regulatory Element)。示例性的,本公开中的WXRE包括转录调节元件A,转录调节元件B,转录调节元件C,转录调节元件D,转录调节元件E,转录调节元件F,转录调节元件G。
本公开中的“反向互补序列”(Reverse Complementary Sequence)的含义为:和原始多核苷酸的序列的方向相反,并且与原始多核苷酸的序列也互补的序列。示例性的,如果原始多核苷酸序列为ACTGAAC,则其反向互补序列为GTTCAGT。
本公开中的“内部核糖体进入位点”(IRES)属于翻译控制序列,通常位于所关注基因的5’端,并使得以帽非依赖性方式翻译RNA。经转录的IRES可直接结合核糖体亚单位,以使得mRNA起始密码子在核糖体中适当地取向以进行翻译。IRES序列通常位于mRNA的5’UTR中(起始密码子的正上游)。IRES在功能上取代对各种与真核生物翻译机制相互作用的蛋白因子的需求。
本公开中的“载体”指多核苷酸的运载工具。在一些实施方案中,在基因工程重组技术中,载体包括可操作地插入其中的编码某蛋白的多核苷酸序列并使该蛋白获得表达。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞,使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。本公开中的“载体”可以是任何适合的载体,包括染色体、非染色体和合成的核酸载体(包括一组适合的表达控制元件的核酸序列)。示例性的,所述载体可以是重组质粒载体、重组真核病毒载体、重组噬菌体载体、重组酵母微型染色体载体、重组细菌人工染色体载体或重组酵母质粒载体。
示例性的,本公开中的载体可以包括SV40的衍生物、细菌质粒、嗜菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、衍生自质粒和嗜菌体DNA的组合的载体、以及病毒核酸(RNA或DNA)等载体。在一些实施方案中,载体为腺相关病毒(AAV)载体。
在一个具体的实施方式中,本公开中所涉及的载体如图1-2,5-6,8-9所示。在上述载体的示意图中,CMV的含义是人巨细胞病毒启动子(Human cytomegalovirus promoter,参见,例如,PubMed PMID:2985280),TK pA的含义是胸苷激酶多腺苷酸化信号(Thymidinekinase polyadenylation signal,参见,例如,PubMed PMID:3018551),SV40的含义是SV40早启动子(SV40early promoter,参见,例如,PubMed PMID:6286831),BSR的含义是杀稻瘟菌素抗性基因选择标记(Blasticidin resistance gene:selection marker,参见,例如,PubMed PMID:7948022),SV pA的含义是SV40多腺苷酸化信号(SV40polyadenylationsignal,参见,例如,PubMed PMID:6113054),pUC ori的含义是pUC质粒的复制起始元件(参见,例如,PubMed PMID:2985470),Amp的含义是氨苄青霉素抗性基因(Ampicillinresistance gene,参见,例如,PubMed PMID:2985470),EMCV IRES的含义是脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点(参见,例如,PubMed PMID:8954121),Zeocin的含义是博莱霉素抗性基因选择标记(Zeocin resistance gene:selection marker,参见,例如,PubMed PMID:2450783),EF1αI的含义是人延伸因子1α(human elongation factor 1alpha,参见,例如,PubMed PMID:2210382)基因的第一个内含子。
在一些实施方案中,本公开中的CMV启动子可以具有与SEQ ID NO:16具有至少或约80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列。如本文中所使用的,启动子是指导致编码多肽的多核苷酸的转录开始的DNA区域。启动子位于编码序列的转录起始位点附近、在DNA上游(朝向编码序列的有义链的5'区域)。在一些实施方案中,可以使用其它启动子。在一些实施方案中,启动子为SV40启动子、hCMV启动子、mCMV启动子、retinoschisin启动子、视紫红质启动子、视紫红质激酶启动子、CRX启动子、或光间受体视黄类物质结合蛋白(interphotoreceptor retinoidbinding protein,IRBP)启动子。还可以使用允许编码的蛋白的组织特异性表达的任何启动子。
本公开中的“宿主细胞”是指导入异源多核苷酸和/或载体的细胞。所述宿主细胞为真核宿主细胞或原核宿主细胞。其中所述真核宿主细胞可以是哺乳动物宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真菌宿主细胞、真核藻类宿主细胞、线虫宿主细胞、原生动物宿主细胞和鱼类宿主细胞。示例性,本公开中的宿主细胞为真核宿主细胞,所述真核宿主细胞为哺乳动物宿主细胞。其中所述哺乳动物宿主细胞选自:中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、COS细胞、Vero细胞、SP2/0细胞、NS/O骨髓瘤细胞、人类胚肾细胞、幼仓鼠肾细胞、HeLa细胞、人类B细胞、cv-1/EBNA细胞、L细胞、3T3细胞、HEPG2细胞、PerC6细胞、293细胞和MDCK细胞。示例性的,本公开中的哺乳动物宿主细胞为CHO细胞。
本公开中的“蛋白表达系统”是指包括宿主和包含异源基因的载体的系统,并且可以通过该系统来实现在宿主中表达异源基因的目的。蛋白表达系统通常包括以下部分:(1)宿主,即,表达蛋白的有机体,其可以选自细菌、酵母、植物细胞和动物细胞等;(2)载体。载体的种类与宿主匹配。根据不同的宿主,将载体分为原核(细菌)表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表达载体、和昆虫表达载体等。载体包含异源基因的片段。异源基因可以经由载体的介导在宿主中表达。在一些实施方案中,表达的蛋白产物被分泌。在一些实施方案中,将载体整合至宿主细胞DNA中。
蛋白表达中的关键步骤是已经被包含编码目的蛋白的异源基因的载体成功地转染的重组宿主细胞的筛选。最常见的是载体中包含选择标记。选择标记可以为使得包含标记的重组宿主细胞与不包含标记的那些相区分的基因或DNA序列。选择标记与选择培养基的组合在阻止尚未被成功转染的宿主细胞的生长的同时允许已经被载体转染的重组宿主细胞的生长。
抗生素抗性基因为用于重组宿主细胞筛选的最常用的标记。可以将作为选择标记的抗生素抗性基因与含有抗生素的选择培养基组合使用,从而实现筛选。示例性抗生素选择标记包括但不限于氨苄西林抗性基因、氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因、多粘菌素B抗性基因、红霉素抗性基因、羧苄西林抗性基因、链霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、新霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、博莱霉素抗性基因、和潮霉素B抗性基因。因此,选择抗生素包括但不限于氨苄西林、氯霉素、卡那霉素、四环素、多粘菌素B、红霉素、羧苄西林、链霉素、奇霉素、杀稻瘟菌素、新霉素、嘌呤霉素、博莱霉素和潮霉素B。在一些实施方案中,用于本发明的选择标记为杀稻瘟菌素抗性基因。在一些实施方案中,用于本发明的选择标记为博莱霉素抗性基因。
在一些方面,本公开提供设计用于快速评价异源多聚体(例如,抗体)表达的方法。例如,为了有效表达抗体,抗体重链和抗体轻链需要以大致1:1的比例表达。如果选择抗生素的浓度过低,则细胞中的功能性载体的量可能过少。如果选择抗生素的浓度过高,则可能造成对于培养细胞不利的条件。此外,需要适当地调整两种载体的比例。基于对很多不同条件的试验,已经确定了本文中提供的方法可以以高的效率表达抗体,并且可以用于在相当短的时间内可靠地评价异源多聚体表达。此外,本文中提供的方法可以以高的表达水平表达抗体。
在一些实施方案中,所述方法涉及用一对两个载体来转染细胞,一个载体携带编码第一多肽的异源基因并且另一个载体携带编码第二多肽的异源基因。使用两种选择标记。一种选择标记为杀稻瘟菌素抗性基因,并且另一种选择标记为博莱霉素抗性基因。在一些实施方案中,杀稻瘟菌素以1-15μg/mL的量存在于选择培养基中并且博莱霉素以50-1500μg/mL的量存在。优选地,杀稻瘟菌素以2-12μg/mL的量存在并且博莱霉素以100-1000μg/mL的量存在。更优选地,杀稻瘟菌素以3-10μg/mL的量存在并且博莱霉素以150-800μg/mL的量存在。更优选地,杀稻瘟菌素以4-9μg/mL的量存在并且博莱霉素以200-400μg/mL的量存在。最优选地,杀稻瘟菌素以9μg/mL的量存在并且博莱霉素以400μg/mL的量存在。可选地,杀稻瘟菌素以4μg/mL的量存在并且博莱霉素以200μg/mL的量存在。在一些实施方案中,杀稻瘟菌素浓度与博莱霉素浓度的比例为1:50~1:40(例如,约9:400)。在一些实施方案中,培养基中的杀稻瘟菌素的最低浓度为5、6、7、8或9μg/mL。在一些实施方案中,培养基中的杀稻瘟菌素的最高浓度为15或20μg/mL。
在一些实施方案中,选择培养基进一步包含血清、多糖(例如葡萄糖和/或右旋糖)、丙酮酸钠、谷胱甘肽、乙醇胺、氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、和/或缬氨酸)或其盐,维生素(例如抗坏血酸磷酸盐(ascorbic acid phosphate)、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素、和/或异肌醇),无机盐(例如氯化钙、硝酸铁、硫酸镁、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、和/或磷酸氢二钠),蛋白(例如人转铁蛋白和/或重组胰岛素),和/或微量元素(例如偏钒酸铵、硫酸铜、氯化锰和/或亚硒酸钠)。
在一些实施方案中,在转染约18~30小时(例如,约24小时)之后,在含有杀稻瘟菌素(例如,9μg/mL)和博莱霉素(例如,400μg/mL)的适当的细胞培养基中培养细胞。然后每2至4天将细胞传代至含有杀稻瘟菌素和博莱霉素的新培养基。当细胞活率恢复至90%以上时,异源多聚体的表达水平可以通过分批补料培养来评价。在一些实施方案中,分批补料培养物(fed-batch cultures)可以为如本文中所述的任意培养基。在一些实施方案中,分批补料培养物含有杀稻瘟菌素和博莱霉素。
在一些实施方案中,本方法中的“蛋白表达系统”涉及一对两个载体,一个载体携带编码抗体重链的异源基因并且另一个载体携带编码抗体轻链的异源基因。两个载体中的选择标记可以不同。在一个实施方案中,第一载体中的选择标记为杀稻瘟菌素而第二载体中的选择标记为博莱霉素。杀稻瘟菌素和博莱霉素的浓度可以为如本文中所述的任意浓度。在一些实施方案中,所述方法还可以涉及包含编码抗体重链的异源基因和编码抗体轻链的异源基因的一个载体。
可以将WXRE序列插入两个载体。它们可以相同或不同,并且可以具有正向或反向。表1列出两个载体中WXRE的示例性组合。
表1WXRE的组合
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本公开中的“序列同一性”和“同一性百分比”指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即同一)的核苷酸或氨基酸的百分比。两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定:将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且对经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分,且将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸(即取代或突变)或缺失核苷酸(即一个或两个多核苷酸中的核苷酸插入或核苷酸缺失)而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸(即取代或突变)或缺失氨基酸(即一个或两个多肽中的氨基酸插入或氨基酸缺失)而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言,可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以100来计算同一性百分比。
本公开中的“动物体内的目标蛋白的表达异常”指的是,相较于动物正常情况下体内的目标蛋白表达水平,待测动物体内的目标蛋白表达水平出现上升或下降;或者正常情况下不应表达的蛋白出现表达,或者应当表达的蛋白不表达。在一个技术方案中,所述动物指的是哺乳动物。在另一个技术方案中,所述哺乳动物为人。
本公开中的术语“抗体”,指免疫球蛋白或其片段或它们的衍生物,并且包括其包含的抗原结合位点的任何多肽,而不管其是否是在体外或体内产生。该术语包括,但不限于,多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、双特异性抗体、三特异性抗体、多特异性抗体、非特异性抗体、人源化抗体、全人抗体、嵌合抗体、单结构域抗体、单链抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变抗体、嫁接抗体。术语“抗体”还包括抗体片段例如Fab、Fab’、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb和其它保留抗原结合功能的抗体片段。通常情况下,这样的片段将包括抗原结合片段。
本公开中的“融合蛋白”,是指包含通过其各自肽主链由共价键连接的两种或多种蛋白质或其片段的分子,更优选地通过编码这些蛋白质的多核苷酸分子的遗传表达来产生。在优选实施方案中,融合蛋白包括免疫球蛋白结构域。在优选实施方案中,融合蛋白为Fc-融合蛋白。
示例性的,可以用于本公开的抗体包括但不限于:阿达木单抗,贝洛托舒单抗,阿维鲁单抗,度匹鲁单抗,度伐鲁单抗,奥瑞利珠单抗,布洛鲁单抗,瑞司利珠单抗,奥拉妥单抗,达雷妥木单抗,依洛妥珠单抗,奈西妥木单抗,英夫利昔单抗,奥托萨昔单抗,阿特利珠单抗,瑟库吉努单抗,美珀利珠单抗,尼沃鲁单抗,阿利苏单抗,依沃苏单抗,地努妥昔单抗,贝伐赛珠单抗,兰洛利珠单抗,雷姆赛卢单抗,维多利珠单抗,司妥昔单抗,阿仑妥珠单抗,曲妥珠单抗,珀妥珠单抗,奥比妥珠单抗,布仑妥昔单抗,雷昔巴库单抗,贝利木单抗,艾匹利木单抗,迪诺舒单抗,奥法妥木单抗,贝西来索单抗,托西利珠单抗,卡那吉努单抗,戈利木单抗,优特吉努单抗,瑟托利珠单抗,卡妥玛索单抗,依库利珠单抗,雷尼比珠单抗,帕尼妥木单抗,那他利珠单抗,奥玛利珠单抗,塞妥昔单抗,依法利珠单抗,艾瑞妥莫单抗,Fanolesomab,托司妥莫单抗,津妥珠单抗,帕利韦珠单抗,奈西妥木单抗,巴司利昔单抗,瑞妥昔单抗,卡普罗单抗,萨妥莫单抗,莫罗单抗。
示例性的,可以用于本公开的融合蛋白包括但不限于:依那西普,阿来西普,阿他西普,利那西普,洛米洛司亭,贝他西普,阿柏西普。
在一个实施方案中,本公开涉及用于限定两个多核苷酸互补程度的杂交条件严格性。可选的,前述多核苷酸可以选自DNA。本公开使用的“严格性”指杂交期间的温度和离子强度条件以及是否存在某些有机溶剂。严格性越高,靶核苷酸序列与经标记的多核苷酸序列之间的互补程度越高。“严格条件”指仅具有高频率互补碱基的核苷酸序列将杂交的温度和离子条件。本文使用的术语“在高严格性或非常高的严格性条件下杂交”描述了用于杂交和洗涤的条件。用于进行杂交反应的指导可见于Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley和Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中。本公开提及的具体杂交条件如下:1)高严格性杂交条件:在约45℃的6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中,然后于65℃下用0.2XSSC、0.1%SDS洗涤一次或更多次;2)非常高严格性杂交条件:65℃的0.5M磷酸钠,7%SDS,然后于65℃下用0.2X SSC、1%SDS洗涤一次或更多次。
在本公开的一个技术方案中,所述WXRE序列和SEQ ID NO:3-9任一项的序列相比,具有至少或约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的序列同一性(包括这些数值之间所有范围和百分数)。在一些实施方案中,WXRE序列相对于SEQ ID NO:3-9中任一项的序列具有至少或约1、2、3、4、5、6、7、9或10个保守突变。在一些实施方案中,WXRE序列与选自SEQ ID NO:3-9的序列存在至少或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸差异。WXRE序列可以具有正向或反向。如本文中所使用的,当有义链(从5’至3’)具有与目的序列相同的序列时,目的序列具有正向。当有义链具有与目的序列反向互补的序列时,目的序列具有反向。与SEQ ID NO:3-9反向互补的序列分别如SEQ ID NO:17-23所示。在一些实施方案中,本公开提供为选自SEQID NO:17-23的序列的至少或约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%(包括这些数值之间所有范围和百分数)的序列。
在一些实施方案中,WXRE序列可以使异源蛋白的表达水平增加约或至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%(例如,与没有WXRE序列的控制序列相比)。
在本公开的一个技术方案中,所述转录调节元件还可以选自含有WXRE序列和其它可提高真核细胞系的蛋白表达水平的序列的核苷酸序列。示例性的,本公开中的转录调节元件为含有WXRE序列和如SEQ ID:13(人EF1αI的第一内含子)所示的序列具有序列同一性的序列的核苷酸序列。
在本公开的一个技术方案中,所述与如SEQ ID:13所示的序列具有序列同一性的序列和如SEQ ID:13(人EF1αI的第一内含子)所示的序列相比,具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的序列同一性(包括这些数值之间所有范围和百分数)。在一些实施方案中,所述序列可以使异源蛋白的表达水平增加约或至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%(例如,与没有此类序列的控制序列相比)。
在一些实施方案中,WXRE序列、启动子和编码多肽的多核苷酸可操作地连接在一起。在一些实施方案中,WXRE序列、启动子、编码多肽的多核苷酸和一个或多个额外的调节元件可操作地连接在一起。在一些实施方案中,一个额外的调节元件为EF1αI的内含子(例如,人EF1αI的第一内含子)。可操作地连接在一起的WXRE序列、启动子和编码多肽的多核苷酸可以具有各种顺序。例如,WXRE序列可以位于启动子之前(例如,在编码序列的有义链上从5’至3’)或在编码多肽的多核苷酸之后(例如,在编码序列的有义链上从5’至3’)。在一些实施方案中,在WXRE序列和启动子之间或在WXRE序列和编码多肽的多核苷酸之间存在至少或约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1K、2K、3K、4K或5K个核苷酸。在一些实施方案中,在WXRE序列和启动子之间或在WXRE序列和编码多肽的多核苷酸之间存在不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1K、2K、3K、4K或5K个核苷酸。在一些实施方案中,一个或多个额外的调节元件位于启动子和编码多肽的序列之间。
本公开还提供增强重组蛋白或多肽的表达的方法。所述方法涉及将一个或多个如本文中所述的载体插入至细胞中(例如,通过转化或转染)、在培养基中培养细胞、并且回收如此表达的重组蛋白或多肽。
本公开中采用的分子生物学方法,均可以参见“最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology,Wiley出版)”,“分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,冷泉港实验室出版)”等公开出版物中记载的相应方法。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是,应当理解的是,详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出,因为在阅读该详细说明后,在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰,对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
实施例中采用的所有试剂,除非另有强调,否则均可以通过商业途径购买获得。
实施例1:载体库构建和表达绿色荧光蛋白的稳定细胞群的构建
1.1含有中国仓鼠卵巢细胞基因组片段的载体库的制备
1.1.1用含有限制性内切酶BamHI的酶切试剂盒(NEB)中的BamHI对1μg表达GFP的载体(即如图1所示的载体)进行酶切从而线性化,在37℃下过夜(酶切反应中试剂的组成和含量如表2所示)。其中BamHI可以替换为任何其他存在于与GFP对应的启动子上游的与特异性酶切位点对应的内切酶。
表达GFP的载体示意图如图1所示。
表2酶切反应中试剂的组成和含量
反应组分 | 体积 |
NEB CutSmart Buffer(Cat#B7204S) | 5μL |
BamHI | 5μL |
表达GFP的载体 | 1μg |
超纯水 | 补足总体积至50μL |
1.1.2取大约五百万个CHO宿主细胞,使用DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN)提取CHO宿主细胞的基因组DNA,上述基因组DNA溶解在100μL与前述试剂盒的洗脱缓冲液中。
1.1.3用100units限制性内切酶BglII(NEB)或DpnII(NEB)对5μg基因组DNA进行酶切(酶切反应中试剂的组成和含量如表3所示)。其它限制性内切酶也可使用,只需要与步骤1.1.1中线性化载体的内切酶粘性末端匹配即可。
表3酶切反应中试剂的组成和含量
反应组分 | 体积 |
NEB CutSmart Buffer(Cat#B7204S) | 5μL |
BamHI | 5μL |
CHO基因组DNA | 1μg |
超纯水 | 补足总体积至50μL |
1.1.4用2units小牛肠碱性磷酸酶(NEB)处理1.1.1线性化后的载体,37℃30分钟左右。其它类型的碱性磷酸酶也可以使用。
1.1.5将1.1.4中线性化的GFP表达载体和1.1.3中酶切后的CHO基因组DNA分别通过琼脂糖凝胶电泳进行分离。切胶回收GFP表达载体片段和酶切后基因组1-4kb的片段,使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)从电泳后的琼脂糖凝胶中提取DNA。
1.1.6将1.1.5回收得到的GFP表达载体片段和基因组片段,用DNA Ligation Kit(Takara,Cat#6022)进行连接,在16℃条件下进行连接反应45分钟(连接反应中试剂的组成和含量如表4所示)。
表4连接反应中试剂的组成和含量
反应组分 | 体积 |
回收后的CHO基因组DNA | 4μL |
回收后的的载体 | 6μL |
Solution I | 20μg |
超纯水 | 10μL |
1.1.7取10μL通过1.1.6得到的连接产物,加入100μL感受态细胞,冰浴30分钟,42℃热激1分钟后至于冰上1分钟,每管细胞中加入500μl无抗生素新鲜LB培养基,于37℃的温度下进行45分钟的复苏。跳过涂板步骤,直接加入500mL含有100mg/L氨苄青霉素的培养基,使用Plasmid Maxi Kit(QIAGEN)进行载体抽提。抽提得到的DNA作为载体库。
1.1.8利用酶切位点仅处在载体骨架原核区的限制性内切酶,例如PvuI(NEB),将1.1.7得到的载体库的线性化,在和1.1.1相同的反应条件,37℃条件下过夜。第二天用酚-氯仿法回收DNA用于转染。
1.2表达绿色荧光蛋白的稳定细胞群的构建
1.2.1将约五百万个CHO宿主细胞离心,弃去上清。同时将Amaxa SF Cell Line4D-Nucleofector Kit L(Lonza,Cat#VCA-1005)中的90μL SF Cell Line Solution,20μLSupplement I和0.3~0.6μg通过步骤1.1.8得到的线性化的载体库混合均匀,并用此混合溶液重悬细胞,转移入电穿孔试管中。用4D-NucleofectorTM System电穿孔仪中与相应的宿主细胞对应的程序进行转染,用5mL不含抗生素的培养基将电穿孔后的细胞进行重悬,置于37℃摇床培养。
1.2.2转染后24小时后,在细胞培养基中加入等体积的与载体中抗性基因对应的抗生素的选择培养基进行筛选(此次试验中,抗生素为800μg/mL博莱霉素)。
1.2.3每隔2-4天对细胞进行计数,根据细胞的生长情况进行细胞传代,使用与载体中抗性基因对应的抗生素的选择培养基进行筛选(此次试验为400μg/mL博莱霉素)。待细胞活率恢复到90%以上后,准备进行单克隆筛选。
实施例2:高表达绿色荧光蛋白的克隆筛选
2.1单细胞分选和扩增
2.1.1将实施例1的步骤1.2.3中恢复后的细胞群中GFP表达水平较高(如表达水平前0.5%)的细胞,通过FACS AriaII流式细胞仪分选进入96孔板进行培养。
2.1.2每隔2-4天更换孔板中75%培养基,直至恢复的细胞肉眼可见。
2.2筛选高表达GFP克隆
将2.1.2中恢复的细胞分别依次转移到新的96孔板中,共计约300个克隆(每个孔中的所有细胞来源于一个细胞,在此称为一个克隆)。通过FACS AriaII流式细胞仪检测GFP表达水平,将检测强度前10%的克隆转移至24孔板进行扩增。
实施例3:转录调节元件的筛选、鉴定和验证
3.1转录调节元件候选序列的鉴定
3.1.1待2.2中扩增进24孔板的细胞基本铺满板底时,使用DNeasy Blood&TissueKit(QIAGEN)提取每个克隆的基因组。
3.1.2在载体中相对于BamHI的酶切位点的上下游约200bp左右分别设计正向引物和反向引物,对3.1.1中提取出的基因组依次进行PCR扩增。其中,PCR反应的正向引物的序列为:GCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGG(SEQ ID NO:1),PCR反应的反向引物的序列为:CATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTA(SEQ ID NO:2)。
上述PCR反应的反应体系如表5所示:
表5 PCR反应的反应体系
上述PCR反应的反应步骤如表6所示:
表6PCR反应的反应步骤
3.1.3将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离,切胶回收1kb以上特异性条带,使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)提取DNA。
3.1.4将回收后的条带送测序,鉴定出候选转录调节元件的序列A~G。
3.1.5通过测序鉴定,得到的转录调节元件的序列A~G如下。其中,
转录调节元件A的序列为如SEQ ID NO:3所示的序列(SEQ ID NO:3的反向互补序列为SEQ ID NO:17);
转录调节元件B的序列为如SEQ ID NO:4所示的序列(SEQ ID NO:4的反向互补序列为SEQ ID NO:18);
转录调节元件C的序列为如SEQ ID NO:5所示的序列(SEQ ID NO:5的反向互补序列为SEQ ID NO:19);
转录调节元件D的序列为如SEQ ID NO:6所示的序列(SEQ ID NO:6的反向互补序列为SEQ ID NO:20);
转录调节元件E的序列为如SEQ ID NO:7所示的序列(SEQ ID NO:7的反向互补序列为SEQ ID NO:21);
转录调节元件F的序列为如SEQ ID NO:8所示的序列(SEQ ID NO:8的反向互补序列为SEQ ID NO:22);
转录调节元件G的序列为如SEQ ID NO:9所示的序列(SEQ ID NO:9的反向互补序列为SEQ ID NO:23)。
3.2转录调节元件的验证
3.2.1使用In-Fusion Cloning Kit(Takara)将3.1.5中通过测序鉴定得到的转录调节元件A~G分别插入含有GFP基因的载体中的相应启动子的上游的BamHI酶切位点,得到如图2所示的插入转录调节元件后的载体(其中,WXRE所示的是转录调节元件A~G中的一种)。利用酶切位点仅处在载体骨架原核区的限制性内切酶,例如PvuI(NEB),将前述载体线性化,37℃下过夜。第二天用酚-氯仿回收DNA用于转染。
3.2.2将约五百万个CHO宿主细胞离心,弃去上清。同时将Amaxa SF Cell Line4D-Nucleofector Kit L(Lonza,Cat#VCA-1005)中的90μL SF Cell Line Solution,20μLSupplement I和30μg含有待表达蛋白线性化后的载体(通过3.2.1得到)混合均匀,并用此混合溶液重悬细胞,转移入电穿孔试管中。用4D-NucleofectorTM System电穿孔仪中相应的宿主细胞对应程序进行转染,用5mL不含抗生素的培养基重悬电穿孔后的细胞,置于37℃摇床培养。每个样品中含有一种转录调节元件或者为没有任何转录调节元件的对照。
3.2.3转染24小时后,在细胞培养基中加入等体积的与载体中抗性基因对应的抗生素的选择培养基进行筛选。每隔2~4天使用含有抗生素的培养基对细胞进行传代。
3.2.4待细胞活率恢复至90%以上后,通过批次补料(Fed-Batch)培养的方式评估转录调节元件A~G对蛋白表达水平的影响。
实施例4:转录调节元件对蛋白表达系统用于表达异源蛋白的表达水平的影响
4.1.1将转录调节元件A~G以正反两个方向构建进入融合蛋白(前述融合蛋白为PD-L1的A链,其序列为如SEQ ID NO:10所示的序列)的启动子的上游BamHI位置,得到如图2所示的插入转录调节元件后的载体(其中WXRE所示的是转录调节元件A~G中的一种)。其中元件名称(A~G)后的数字表示WXRE调节元件的方向。转录调节元件的名称后的数字1表示正向,并且数字2表示反向。例如,转录调节元件A1所示的是编码序列的有义链中如SEQ IDNO:3所示的序列的正向(即5’至3’)序列;转录调节元件A2所示的是蛋白编码序列的有义链中如SEQ ID NO:17所示的序列的反向互补序列。
利用酶切位点仅处在载体骨架原核区的限制性内切酶,例如PvuI(NEB),将前述载体线性化,37℃条件下过夜。第二天用酚-氯仿回收DNA用于转染。
4.1.2将约五百万个CHO宿主细胞离心,弃去上清。同时将Amaxa SF Cell Line4D-Nucleofector Kit L(Lonza,Cat#VCA-1005)中的90μL SF Cell Line Solution,20μLSupplement I和30μg含融合蛋白线性化后的载体(通过4.1.1得到)混合均匀,并用此混合溶液重悬细胞,转移入电穿孔试管中。用4D-NucleofectorTM System电穿孔仪中相应的宿主细胞对应程序进行转染,用5mL不含抗生素的培养基重悬电穿孔后的细胞,置于37℃摇床培养。每组样品只含有某一个方向(即正向或反向)的一个转录调节元件,以不包含任何转录调节元件的样品作为对照。
4.1.3转染24小时后,将等体积含有800μg/mL博莱霉素的培养基加入转染后的细胞中。
4.1.4每隔2~4天使用含有400μg/mL博莱霉素的培养基对细胞进行传代。
4.1.5待细胞活率恢复到90%以上通过批次补料,对融合蛋白PD-L1的表达水平进行评估。
4.1.6验证表达得到的PD-L1的序列是否和SEQ ID NO:10所示的序列相同。
4.2实验结果
如图3所示,和没有转录原件的对照组相比,在融合蛋白启动子上游插入转录调节元件,可以提高目标蛋白表达水平10~25%左右(参见图3中的A2、B1、B2、D2、E2、F2和G1)。前述序列在某一个方向上对蛋白表达的促进作用优于另外一个方向,这可能和启动子的方向性有关。
如图4所示,和表达水平相对应,前述转录调节元件的正向或者反向能使单位生产率有10%左右的提高(参见图4中的A2、B1、B2、D2、E2和F2)。
与此同时,通过验证,表达得到的PD-L1的序列和SEQ ID NO:10所示的序列相同。
实施例5:转录调节元件对蛋白表达系统用于表达阿达木单抗的表达水平的影响
5.1.1将转录调节元件A的反向序列(A2),转录调节元件B的正向序列(B1)和转录调节元件G的正向序列(G1)分别通过Takara的In-Fusion Cloning试剂盒构建进入表达阿达木单抗的启动子的上游(具体条件如表7所示),分别得到如图5和图6所示的插入转录调节元件后的载体(其中WXRE所示的是转录调节元件A~G中的一种)。其中,将“重链上游转录调节元件”克隆至如图5所示的载体中,将“轻链上游转录调节元件”克隆至如图6所示的载体中。其中,图5中阿达木单抗的重链(HC)的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示;图6中阿达木单抗的轻链(LC)的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
利用酶切位点仅处在载体骨架原核区的限制性内切酶,例如PvuI(NEB),将前述载体线性化,37℃下过夜。第二天用酚-氯仿回收DNA用于转染。
表7不同条件对应的转录调节元件
样品ID | 重链上游转录调节元件 | 轻链上游转录调节元件 |
1 | B1 | B1 |
2 | B1 | G1 |
3 | G1 | G1 |
4 | B1 | A2 |
5 | G1 | A2 |
6(对照) | N/A | N/A |
5.1.2将约五百万个CHO宿主细胞离心,弃去上清。同时将Amaxa SF Cell Line4D-Nucleofector Kit L(Lonza,Cat#VCA-1005)中的90μL SF Cell Line Solution,20μLSupplement I和30μg含阿达木单抗序列线性化后的载体(通过5.1.1得到)混合均匀,并用此混合溶液重悬细胞,转移入电穿孔试管中。用4D-NucleofectorTM System电穿孔仪中相应的宿主细胞对应程序进行转染,用5mL不含抗生素的培养基重悬电穿孔后的细胞,置于37℃摇床培养。每组样品只含有某一个方向(即正向或反向)的一个转录调节元件,以不包含任何转录调节元件的样品作为对照。
5.1.3使用设计用于快速评价抗体表达的方法。该方法可以确保抗体重链和轻链大致以1:1的比例表达,并且可以在相当短的时间内可靠地评价抗体表达。转染24小时后,将等体积的含有18μg/mL杀稻瘟菌素和800μg/mL博莱霉素的培养基加入转染后的细胞中。
5.1.4每隔2~4天使用含有9μg/mL杀稻瘟菌素和400μg/mL博莱霉素的培养基对细胞进行传代。
5.1.5待细胞活率恢复到90%以上通过批次补料培养,对阿达木单抗的表达水平进行评估。由于阿达木单抗的重链表达载体和轻链表达载体均可以被转染至同一宿主细胞中,因此,阿达木单抗的重链和轻链能够同时表达。由于前述重轻链能够在宿主细胞内自组装,得到完整的阿达木抗体。
5.1.6对得到的阿达木单抗的生物活性进行检测。
5.2实验结果
和对照组相比,部分含有转录调节元件B的正向序列中(参见样品1、2、4),阿达木单抗的表达水平有10%~20%的提升(如图7所示)。
通过对异源蛋白表达载体表达的阿达木单抗的生物活性进行检测,发现其生物活性和已知的商业化阿达木单抗的生物活性相同。
实施例6:转录调节元件的组合对蛋白表达系统用于表达阿达木单抗的表达水平
的影响
6.1.1分别如图8和图9中所示构建两种载体,其中WXRE为转录调节元件B的正向序列(B1),EF1αI为如SEQ ID NO:13所示的人EF1αI基因的第一内含子的序列,HC为编码阿达木单抗的重链的核酸序列,其氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示,并且LC为编码阿达木单抗的轻链(LC)的核酸氨基酸序列(nucleic amino acid sequence),其氨基酸序列如SEQ IDNO:12所示。上述载体构建完成后使用MN试剂盒进行质粒抽提,获得的质粒用于细胞转染。
6.1.2将约五百万个CHO宿主细胞离心,弃去上清。同时将Amaxa SF Cell Line4D-Nucleofector Kit L(Lonza,Cat#VCA-1005)中的90μL SF Cell Line Solution,20μLSupplement I和30μg含阿达木单抗序列的载体(通过6.1.1得到)混合均匀,并用此混合溶液重悬细胞,转移入电穿孔试管中。用4D-NucleofectorTM System电穿孔仪中相应的宿主细胞对应程序进行转染,用5mL不含抗生素的培养基重悬电穿孔后的细胞,置于37℃摇床培养。一组样品含有EF1αI内含子一个转录调节元件,另一组样品含有B1和EF1αI内含子两个元件,以不包含任何转录调节元件的样品作为对照。
6.1.3转染24小时后,将等体积的含有8μg/mL杀稻瘟菌素和400μg/mL博莱霉素的培养基加入转染后的细胞中。
6.1.4每隔2~4天使用含有4μg/mL杀稻瘟菌素和200μg/mL博莱霉素的培养基对细胞进行传代。
6.1.5待细胞活率恢复到90%以上通过批次补料培养,对阿达木单抗的表达水平进行评估。由于阿达木单抗的重链表达载体和轻链表达载体均可以被转染至同一宿主细胞中,因此,阿达木单抗的重链和轻链能够同时表达。由于前述重轻链能够在宿主细胞内自组装,得到完整的阿达木抗体。
6.1.6对得到的阿达木单抗的生物活性进行检测。
6.2实验结果
实施例6的实验结果如表8所示。
表8不同转录调节元件组合条件下阿达木单抗的第14天的相对表达水平对比
从表8来看,对于含有WXRE和EF1αI内含子的组合,阿达木单抗的表达水平有明显的提升。
通过对异源蛋白表达载体表达的阿达木单抗的生物活性进行检测,发现其生物活性和已知的商业化阿达木单抗的生物活性相同。因此,由该载体表达的蛋白被正确地折叠。
实施例7:转录调节元件的组合对蛋白表达系统用于表达Pembrolizumab单抗的表
达水平的影响
7.1.1分别如图8和图9中所示构建两种载体,其中WXRE为转录调节元件B的正向序列(B1),EF1αI为如SEQ ID NO:13所示的人EF1αI基因的第一内含子的序列,HC为编码Pembrolizumab的重链的核酸序列,其氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示,并且LC为编码Pembrolizumab的轻链(LC)的核酸氨基酸序列,其氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。
上述载体构建完成后,使用MN试剂盒进行质粒抽提,获得的质粒用于细胞转染。
7.1.2后续的实验步骤和本公开实施例6.1.2至6.1.6所记载的实验步骤相同。
7.2实验结果
实施例7的实验结果如表9所示。
表9不同转录调节元件组合条件下pembrolizumab单抗的第14天的相对表达水平对比
从表9来看,对于含有WXRE和EF1αI内含子的组合,Pembrolizumab单抗的表达水平有明显的提升。
通过对异源蛋白表达载体表达的Pembrolizumab单抗的生物活性进行检测,发现其生物活性和已知的商业化Pembrolizumab单抗的生物活性相同。
实施例8:不同抗生素浓度对蛋白表达系统的表达水平的影响
8.1.1分别如图10和图11中所示构建两组载体。一组用于阿达木单抗并且另一组用于Pembrolizumab。在完成载体构建之后,使用MN试剂盒来进行质粒提取,并且将获得的质粒用于细胞转染。
8.1.2将约五百万个CHO宿主细胞离心,并且弃去上清液。同时,将Amaxa SF CellLine 4D-Nucleofector Kit L(Lonza,Cat#VCA-1005)中的90μLSF Cell Line Solution和20μL补充剂I以及30μg包含阿达木单抗或Pembrolizumab的序列的载体均匀地混合,并且将细胞用该混合溶液重悬并且转移至电转杯。在4D-NucleofectorTM系统电穿孔仪中使用对应于各宿主细胞的程序对细胞进行转染。将电穿孔后的细胞用5mL不含抗生素的培养基重悬并且置于37℃的摇床中进行培养。
8.1.3转染后24小时,每2至4天使用含有不同浓度的杀稻瘟菌素和/或博莱霉素的选择培养基来将细胞传代。杀稻瘟菌素和/或博莱霉素的具体浓度在表10中列出。
8.1.4当细胞活率恢复至90%以上时,通过分批补料培养对抗体表达水平进行评价。由于可以将重链表达载体和轻链表达载体二者均转染至相同的宿主细胞中,因此抗体重链和轻链能够同时被表达。由于重链和轻链能够在宿主细胞中自组装,因此获得完整的抗体。
8.1.5测定获得的抗体的生物学活性。
8.2实验结果
实施例8的实验结果在表10中示出。
表10在不同抗生素浓度下、在第14天阿达木单抗和Pembrolizumab的表达水平的比较
从表10可以看出,与单独使用杀稻瘟菌素或博莱霉素相比,包含杀稻瘟菌素和博莱霉素的组合取得显著提高的表达水平。
通过测定由异源蛋白表达载体表达的阿达木单抗或Pembrolizumab的生物学活性,发现其生物学活性与已知的商业化阿达木单抗或Pembrolizumab的生物学活性相同。因此,由该载体表达的蛋白被正确地折叠。
本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例,而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。
Claims (15)
1.一种分离的多核苷酸分子,其包含选自由(i)-(iv)组成的组中的核苷酸序列:
(i)SEQ ID NO:5-9中任一项的序列;
(ii)SEQ ID NO:5-9中任一项的序列的反向互补序列。
2.一种载体,其包含根据权利要求1所述的多核苷酸分子。
3.根据权利要求2所述的载体,其中所述载体为重组表达载体。
4.根据权利要求2或3所述的载体,其进一步包含选自由(iii)-(vi)组成的组中的核苷酸序列:
(iii)SEQ ID NO:13的序列;
(iv)SEQ ID NO:13的序列的反向互补序列;
(v)在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下,能够与(iii)或(iv)的序列杂交的序列的反向互补序列;和
(vi)与(iii)或(iv)的序列具有至少80%,或至少90%,可选至少95%,优选至少97%,更优选至少98%,最优选至少99%的序列同一性的序列。
5.根据权利要求2-4任一项所述的载体,其进一步包含CMV启动子;优选地,所述CMV启动子包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列,或所述CMV启动子包含与所述SEQ ID NO:16的序列具有至少80%,或至少90%,可选至少95%,优选至少97%,更优选至少98%,最优选至少99%的序列同一性的序列。
6.根据权利要求5所述的载体,其包含以下的组合:(1)SEQ ID NO:4的序列、(2)SEQ IDNO:13的序列或与该序列具有90%同一性的序列、和(3)SEQ ID NO:16的序列或与该序列具有90%同一性的序列。
7.根据权利要求2-6任一项所述的载体,其进一步包含编码一种或多种蛋白的一个或多个基因。
8.根据权利要求7所述的载体,其中,所述蛋白选自:抗体、融合蛋白、酶、可溶性蛋白、膜蛋白、结构蛋白、核糖体蛋白、酶原、细胞表面受体蛋白、转录调节蛋白、翻译调节蛋白、染色质蛋白、激素、细胞周期调节蛋白、G蛋白、神经活性肽、免疫调节蛋白、血液组分蛋白、离子门蛋白、热休克蛋白、二氢叶酸还原酶、抗生素抗性蛋白、任一所述蛋白的功能片段、任一所述蛋白的表位片段、及其任意组合所组成的组。
9.一种重组宿主细胞,其包含根据权利要求2-8任一项所述的载体。
10.一种制备稳定表达蛋白的重组宿主细胞的方法,其包括将根据权利要求2-8任一项所述的载体插入至宿主细胞的步骤。
11.根据权利要求9所述的重组宿主细胞或根据权利要求10所述的方法,其中,所述宿主细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
12.一种制备蛋白的方法,所述方法包括在允许蛋白生产的条件下培养根据权利要求9或11所述的重组宿主细胞的步骤。
13.一种试剂盒,其包含根据权利要求9或11所述的重组宿主细胞。
14.根据权利要求9或11所述的重组宿主细胞在制备用于检测蛋白表达异常导致的疾病的试剂或试剂盒中的用途。
15.根据权利要求9或11所述的重组宿主细胞在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途。
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