CN104968791B - 优化的高产率表达多肽的表达盒 - Google Patents

Abstract

本发明是基于以下发现：在表达目标多肽的表达盒内的特定5’UTR多核苷酸序列(参见SEQ ID NO 1)与hCD33分泌性前导序列的组合使得目标多肽的表达水平意外优于现有技术的表达盒。基于此发现，本发明尤其提供以高产率生成目标多肽的新型表达盒、表达载体和方法。

Description

优化的高产率表达多肽的表达盒

技术领域

本发明尤其涉及适于表达目标多肽的表达盒，其中所述表达盒包括特定的5’UTR和hCD33分泌性前导序列的组合。发现此遗传元件的特定组合意外地引起目标多肽表达水平显著优于其它5’UTR与其它分泌性前导序列的组合。因此，使用此表达盒有利于高产率生成目标多肽。

背景技术

大量克隆和表达目标多肽的能力变得越来越重要。生成和纯化高水平蛋白的能力对于人用药物和生物技术领域，例如合成蛋白药物以及基础研究例如结晶蛋白以能测定其三维结构尤其重要。其他情况下难以获得一定量的蛋白能在宿主细胞中过表达且随后被分离和纯化。

选择生成重组蛋白的表达系统取决于多种因素，包括目标蛋白的细胞生长特性、表达水平、胞内和胞外表达、翻译后修饰和生物活性以及产生治疗性蛋白的调节问题和经济考虑。哺乳动物细胞相比其它表达系统如细菌或酵母的关键优势是完成合适蛋白折叠、复杂N-连接糖基化和真O-连接糖基化的能力以及广谱的其它翻译后修饰。由于所述优势，真核且特别是哺乳动物细胞是目前用于生成复合治疗性蛋白如单克隆抗体的表达系统的选择。

获得高表达宿主细胞(也称为高生产子)的最常见方法以产生合适表达载体以表达目标产物作为第一步。所述表达载体驱动编码目标产物的多核苷酸在宿主细胞内表达且通常包括至少一个选择标记以产生重组细胞系。除了编码目标蛋白的多核苷酸，用于在宿主细胞内表达多肽的表达载体通常还包括适于驱动转录的转录控制元件作为表达盒元件，如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、转录暂停或终止信号。此外，一般包括适当翻译控制元件且操作性连接待表达的多核苷酸，如合适的5’UTR和3’UTR。

为增加所述表达系统的效率，优化不同元件，尤其是有助于转录和翻译效率、蛋白合成、ER内正确折叠和蛋白分泌的DNA序列。没有经优化翻译和分泌组件的高产率表达系统可能导致mRNA不稳定、蛋白质分泌不足、错折叠(失活)蛋白积聚于细胞质或膜中。因此，对能稳定和持续翻译并分泌正确折叠蛋白进入细胞培养基的表达系统尤其感兴趣。这种分泌系统提供以下优势：稳定和有效的mRNA翻译；正确的蛋白折叠和有效分泌，简单且快速的产物纯化过程，以及相较胞质系统产率提高。然而，多数可用分泌系统的产物产率尚未充分优化。为提高生产率和分泌效率，一个目标是优化分泌信号(本文也称为信号肽或分泌性前导序列)以及其与不同5’UTR序列的组合，从而获得产生所需高水平表达的遗传元件组合。

来自原核或真核生物的大部分分泌和膜结合蛋白具有氨基末端前导肽(也称为分泌性前导序列或信号肽)，其在生物合成期间从新生前体多肽中切割。分泌性前导序列通常长度为5-60个氨基酸。此序列对于分泌而言是必须且充足的。分析大量这类分泌性前导序列显示在没有显著氨基酸序列同源性的情况下出现的共同结构基序[Von Heijne,1981；Perlman等,1983]。一般，分泌性前导序列由带正电荷的氨基末端(n)、疏水核(h)和极性更高的定义信号肽酶切割位点的羧基末端(c)组成。分泌性前导序列的“n”区长度为约5-8个氨基酸且特征为存在碱性残基。“h”区包含8-12个非极性氨基酸，其平均构成为37％亮氨酸、15％丙氨酸、10％缬氨酸、10％苯丙氨酸、7％异亮氨酸和21％疏水氨基酸如甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或色氨酸。此区域形成α-螺旋的倾向高，所述构象可促进与脂双层内部的相互作用。对分泌性前导肽结构特征的研究主要基于细菌蛋白，表明“h”区对信号序列功能关键[Gierasch,1990]。通过缺失或者疏水残基被亲水或带电氨基酸取代来破坏h区可导致信号功能损失，而改变“n”区的影响不大[Bird等,1990]。羧基末端或切割区通常长度为约6个氨基酸。该区域参与信号肽酶识别和切割，一般需要其来实现蛋白的最终折叠和分泌。

5’UTR(5’非翻译区)是转录成mRNA而非蛋白的DNA序列部分。其通常始于转录起始，终止于起始密码子前的一个核苷酸。5’UTR可包含调节翻译效率或mRNA稳定性、蛋白结合位点、调控元件的序列，以及促进翻译起始的序列。5’UTR序列的长度可变且能包括几十个核苷酸到多至数百或甚至数千个核苷酸。真核生物中，5’UTR的中值长度是约100-200nt。5’UTR和其元件的特定作用尚未充分阐明，部分也是因为所述序列不被翻译为功能蛋白。然而，已知特定5’UTR和特定分泌性前导序列的组合能大幅提高生产系统的翻译和分泌效率，因此可增加表达产率。然而，由于有过多的5’UTR和分泌性前导序列可用，获得能确实提高表达的有效组合是一个挑战。因此，尽管有很多的可用表达盒和表达载体，在真核细胞中获得高产率的稳健多肽/蛋白生成仍是挑战。

因此，本发明的目的是提供表达盒，当所述表达盒引入宿主细胞时其能以高产率分泌目标多肽。此外，本发明的一个目的是提供能以高产率表达目标多肽的表达载体。此外，本发明的一个目的是提供适于高产率表达目标多肽的方法。

发明内容

本发明是基于以下发现：在一个表达盒内组合特定5’UTR多核苷酸序列(参见SEQID NO 1，其也包含于SEQ ID NO 2、3和4以及5、6和7中)与人CD33分泌性前导序列使得所述表达盒所编码目标多肽的表达高得惊人。在一些示例中，显示本发明所述表达盒优于现有技术已知的表达盒，因为表达产率增加可多至4倍。本发明所述表达盒的优越性能在许多实验中得到确认，其中不同目标多肽从所述表达盒中表达。因此，本发明所述表达盒对于高产率生成目标多肽特别有利。另外，发现前导序列的正确加工可被改善。因此，本发明为本领域作出有价值的贡献，因为此新型表达盒设计显著提高目标多肽的表达。

根据第一方面，本发明提供表达目标多肽的表达盒，所述表达盒包括：

a)启动子

b)5’UTR多核苷酸序列，其中所述5’UTR多核苷酸序列选自下组

i)包括以下序列的5’UTR多核苷酸序列

agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgca(SEQ IDNO 1)；

ii)包括以下序列的5’UTR多核苷酸序列

agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcg(SEQ ID NO 2)；

iii)包括以下序列的5’UTR多核苷酸序列

agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgaaaacgcgtccacc(SEQ ID NO 3)；

iv)包括以下序列的5’UTR多核苷酸序列

agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgcgattgaattccccggggatcctctagggtgaccgtttggtgccgccacc(SEQ ID NO 4)；

v)包括以下序列的5’UTR多核苷酸序列

agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgaaaacgcgcctctagagccgccacc(SEQ ID NO 5)；

vi)包括以下序列的5’UTR多核苷酸序列

agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgaaaaacgcgtgccgccacc(SEQ ID NO 6)；

vii)包括以下序列的5’UTR多核苷酸序列

agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgaaaacgcgtgccgccacc(SEQ ID NO 7)；

viii)包括与SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4或SEQ IDNO 5、SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 7所示序列至少85％，优选至少90％同一的序列的5’UTR多核苷酸序列；

c)编码hCD33分泌性前导序列的多核苷酸；和

d)编码目标多肽的多核苷酸或用于插入编码目标多肽的多核苷酸的插入位点。

根据第二方面，本发明提供表达目标多肽的表达载体，所述载体包括至少一个如本发明第一方面所述的表达盒。

根据第三方面，本发明提供真核宿主细胞，所述细胞包括至少一个如本发明第一方面所述的表达盒和/或至少一个如本发明第二方面所述的表达载体。

根据第四方面，本发明提供生成如本发明第三方面所述的宿主细胞的方法，其中如本发明第二方面所述的表达载体被引入真核宿主细胞。

根据第五方面，本发明提供生成目标多肽的方法，所述方法包括在允许所述目标多肽表达的条件下，以细胞培养方式，培养如本发明第三方面所述的宿主细胞。

根据第六方面，本发明涉及处于表达盒中的5’UTR序列与hCD33分泌性前导序列的组合在由所述表达盒高产率表达目标多肽中的应用，其中所述5’UTR多核苷酸序列选自下组

i)包括以下序列的5’UTR多核苷酸序列

agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgca(SEQ IDNO 1)；

ii)包括以下序列的5’UTR多核苷酸序列

agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcg(SEQ ID NO 2)；

iii)包括以下序列的5’UTR多核苷酸序列

agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgaaaacgcgtccacc(SEQ ID NO 3)；

iv)包括以下序列的5’UTR多核苷酸序列

agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgcgattgaattccccggggatcctctagggtgaccgtttggtgccgccacc(SEQ ID NO 4)；

v)包括以下序列的5’UTR多核苷酸序列

agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgaaaacgcgcctctagagccgccacc(SEQ ID NO 5)；

vi)包括以下序列的5’UTR多核苷酸序列

agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgaaaaacgcgtgccgccacc(SEQ ID NO 6)；

vii)包括以下序列的5’UTR多核苷酸序列

agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgaaaacgcgtgccgccacc(SEQ ID NO 7)；

viii)包含与SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4或SEQ IDNO 5、SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 7所示序列至少85％，优选至少90％同一的序列的5’UTR多核苷酸序列。

本申请的其它目的、特征、优势和方面通过以下说明书和所附权利要求书对本领域技术人员是显而易见的。然而，应理解以下说明书和所附权利要求书以及具体实施例尽管描述本申请的优选实施方式，其仅以说明方式给出。本领域技术人员通过阅读以下内容可清楚了解本发明精神和范围内的多种变化和修改。

具体实施方式

本发明提供表达目标多肽的表达盒，所述表达盒包括遗传元件即特定5’UTR多核苷酸序列和hCD33分泌性前导序列的新型组合。该遗传元件的特定组合引起编码的目标多肽表达效率显著增加。此外，发现所述前导序列的加工可加以改善，从而能减少由于前导序列误加工引起的不需的序列扩展或截断(也称为“截短”(clipping))。

根据第一方面，提供表达目标多肽的表达盒，所述表达盒包括：

a)启动子

b)5’UTR多核苷酸序列，其中所述5’UTR多核苷酸序列选自下组

i)包括以下序列的5’UTR多核苷酸序列

agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgca(SEQ IDNO 1)；

ii)包括以下序列的5’UTR多核苷酸序列

agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcg(SEQ ID NO 2)；

iii)包括以下序列的5’UTR多核苷酸序列

agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgaaaacgcgtccacc(SEQ ID NO 3)；

iv)包括以下序列的5’UTR多核苷酸序列

agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgcgattgaattccccggggatcctctagggtgaccgtttggtgccgccacc(SEQ ID NO 4)；

v)包括以下序列的5’UTR多核苷酸序列

agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgaaaacgcgcctctagagccgccacc(SEQ ID NO 5)；

vi)包括以下序列的5’UTR多核苷酸序列

agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgaaaaacgcgtgccgccacc(SEQ ID NO 6)；

vii)包括以下序列的5’UTR多核苷酸序列

agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgaaaacgcgtgccgccacc(SEQ ID NO 7)；

viii)包含与SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4或SEQ IDNO 5、SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 7所示序列至少85％，优选至少90％同一的序列的5’UTR多核苷酸序列；

c)编码hCD33分泌性前导序列的多核苷酸；和

d)编码目标多肽的多核苷酸或用于插入编码目标多肽的多核苷酸的插入位点。

本文所用的术语“表达盒”特别指DNA区段，所述区段在合适设置下能驱动所述表达盒中所结合的编码目标多肽的多核苷酸表达。引入宿主细胞时，表达盒尤其能指导细胞机制将所结合的编码目标多肽的多核苷酸转录成RNA，其随后通常被进一步加工并最终翻译成目标多肽。如下进一步详述，所述表达盒能包括在表达载体中。本发明所述表达盒的各元件在之后详细说明。

本发明所述表达盒包括启动子作为元件a)。本文所用的术语“启动子”特别指DNA元件，所述元件促进与该启动子操作性连接的多核苷酸的转录。所述启动子也可形成部分启动子/增强子元件。尽管元件“启动子”和“增强子”之间的物理边界不总是很清晰，但术语“启动子”常指核酸分子上结合RNA聚合酶和/或任何相关因子且转录起始的位点。增强子从时间和空间上提高启动子活性。本领域已知许多在广泛细胞类型中有转录活性的启动子。启动子能分成2类，在功能上为组成型的那些和通过诱导或去抑制来调节的那些。2种类型都适合蛋白表达。用于在真核且特别是哺乳动物细胞中高水平生成多肽的启动子应该是强启动子，优选应在广泛细胞类型中有活性。能在许多细胞类型中驱动表达的组成型强启动子为本领域熟知，因此不需在此详述。优选地，巨细胞病毒(CMV)启动子根据本发明教导使用。获自人巨细胞病毒(hCMV)极早(IE)区的启动子或启动子/增强子特别适合作为本发明所述表达盒中的启动子。人巨细胞病毒(hCMV)极早(IE)区和获自其的功能性表达启动片段和/或功能性表达增强片段描述于例如EP 0 173 177和EP 0 323 997，且也为本领域熟知。因此，hCMV极早(IE)区的一些片段能用作启动子和/或启动子/增强子。根据一个实施方式，人CMV启动子用于本发明所述表达盒。本文所用的术语“人CMV启动子”特别指获自hCMV极早(IE)区的启动子。

根据一个实施方式，使用选自下组的人CMV启动子

a)包括以下序列的启动子

或其担任启动子的功能片段；

b)包含与SEQ ID NO 8所示序列或其担任启动子的功能片段至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更加优选至少97％，最优选至少99％同一的序列的启动子。

％同一性可根据参考序列全长计算。

发现如本发明所教导，各启动子与选自上组的特定5’UTR多核苷酸序列和hCD33信号序列的组合表现特别好。

本发明所述表达盒还包括特定5’UTR(5’端非翻译区)多核苷酸序列作为元件b)。本文所用的术语“5’UTR多核苷酸序列”特别指DNA序列，所述序列转录成mRNA，但随后不翻译成多肽。5’UTR多核苷酸序列通常始于转录起始位点且终止于实际编码区的起始密码子前。在本发明所述表达盒中，5’UTR多核苷酸序列在编码hCD33分泌性前导序列的多核苷酸序列开始前结束。

用于本发明所述表达盒的5’UTR多核苷酸序列优选包括SEQ ID NO 1所示序列。各5’UTR多核苷酸序列描述于WO 2009/080720。

根据一个实施方式，5’UTR多核苷酸序列包括选自序列SEQ ID NO 1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4的序列或包括选自序列SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6或SEQ IDNO 7的序列。SEQ ID NO 1所示5’UTR序列是SEQ ID NO 2、3和4所示5’UTR序列以及SEQ IDNO 5、6和7所示5’UTR序列中同样包括的共有序列。优选地，包括SEQ ID NO 3或由其组成的5’UTR序列用于表达抗体或其功能片段的轻链，包括SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 4或者由其组成的5’UTR序列用于表达抗体或其功能片段的重链。根据一个实施方式，包括SEQ ID NO:5或由其组成的5’UTR序列用于表达抗体或其功能片段的轻链。例如作为示范性实施方式，SEQ ID NO 5还可用于表达纳米抗体。根据一个实施方式，包括SEQ ID NO:6或由其组成的5’UTR序列用于表达抗体或其功能片段的重链。根据一个实施方式，包括SEQ ID NO:7或由其组成的5’UTR序列用于表达抗体或其功能片段的重链。其还在实施例中测试。

发现根据本发明使用的5’UTR由数种元件构成且包括内含子侧翼区5’序列、内含子和内含子侧翼区3’序列。所述5’UTR中包括的内含子和内含子侧翼区源自小鼠IgG重链(参见例如Eaton等.,1986,Biochemistry 25,8343-8347,Neuberger等.,1983,EMBO J.2(8),1373-1378；其能获自pRK-5载体(BD PharMingen))。下表阐明可根据本发明使用的5’UTR所含所述元件的推定边界：

此外，能使用5’UTR多核苷酸序列，其包括与SEQ ID NO 1、2、3或4所示序列或者SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 7所示序列至少85％，优选至少90％，优选至少95％，更优选至少98％，最优选至少99％同一的序列。同一性可根据参考5’UTR序列全长计算。

在许多实验中，发明人发现所述特定5’UTR多核苷酸序列与上述hCD33信号序列组合时对表达产率产生有利效果，其相较现有技术的表达盒显著增加。

本发明所述表达盒还包括编码hCD33分泌性前导序列的多核苷酸作为元件c)。人CD33是唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素抑制受体的一员。CD33是67-kDa跨膜糖蛋白且在髓系上特异性表达。本文所用的术语“编码hCD33分泌性前导序列的多核苷酸”特别指编码含hCD33分泌性前导序列的分泌性前导序列的多核苷酸。因此，在转录和随后的翻译时，获得分泌性前导序列，所述序列包括hCD33分泌性前导序列并优选由其组成。所述分泌性前导序列具有如下效果：与其融合的目标多肽从宿主细胞中有效分泌。所述分泌性前导序列在生物合成中切割。如上所述，发明人意外发现上述5’UTR多核苷酸序列与hCD33分泌性前导序列的特定组合引起多肽表达显著增加。因此，本发明所述组合优于其它使用相同5’UTR与其它分泌性前导序列的组合，所述其它分泌性前导序列不包括hCD33分泌性前导序列，而包括例如免疫球蛋白分泌性前导序列，如WO2009/080720所述。根据一个实施方式，用于本发明所述表达盒的hCD33分泌性前导序列包括以下氨基酸序列：

MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO 12)

关于hCD33分泌性前导序列的文献描述了不同氨基酸序列。大部分文献描述hCD33分泌性前导序列由以下氨基酸序列组成

MPLLLLLPLLWAGALAMD(SEQ ID NO 13)

显然SEQ ID NO 13相较SEQ ID NO 12，在3’末端包括2个额外氨基酸。根据一个实施方式，编码hCD33分泌性前导序列的多核苷酸编码由SEQ ID NO12或SEQ ID NO 13所示氨基酸序列组成的分泌性前导序列。然而，优选使用SEQ ID NO 12所示的较短hCD33分泌性前导序列。假定所述略短的信号序列提高正确肽酶切割的可能性，能正确加工并从而确保产物质量。使用SEQ ID NO 13所示的较长CD33分泌性前导序列可能引发以下风险：目标多肽在分泌性前导序列切除后在其N末端携带额外氨基酸，这无法接受，尤其是当表达药物多肽时。使用SEQ ID NO 12所示hCD33分泌性前导序列时可避免此风险。此外，由于电荷分布更好，较短序列显然对分泌更有效，尤其是与本发明所述5’UTR多核苷酸序列联用时。因此，所述多核苷酸编码由SEQ ID NO 12所示氨基酸序列组成的hCD33分泌性前导序列。

在表达盒中，启动子(元件a))排列在5’UTR多核苷酸序列(元件b))的5’，后者进而排列在编码hCD33分泌性前导序列的多核苷酸(元件c))的5’。所述元件在表达盒中操作性连接，从而如果编码各目标多肽的多核苷酸插入所述表达盒，能有效表达目标多肽。

本发明所述表达盒“适于表达目标多肽”。此术语特别描述如果编码多肽的多核苷酸插入所述表达盒，所述多肽由所述表达盒表达。因此，根据一个实施方式，本发明所述表达盒包括编码目标多肽的多核苷酸作为元件d)。因而所述多核苷酸包括目标多肽的编码区。优选地，所述多核苷酸是cDNA或源自cDNA。优选地，所述多核苷酸不包括额外分泌性前导序列。所述编码目标多肽的多核苷酸位于编码hCD33分泌性前导序列的多核苷酸的3’，从而在表达时获得融合多肽，所述融合多肽包括hCD33分泌性前导序列和目标多肽。5’UTR和用于本发明所述表达盒的分泌性前导序列与编码目标多肽的多核苷酸是异源的，即其与所述多核苷酸不天然相连。编码目标多肽的多核苷酸的表达处于所述5’UTR和所述分泌性前导序列的转录后调控下，所述序列包括hCD33前导序列且优选由其组成。

根据另一个实施方式，所述表达盒包括插入位点以插入编码目标多肽的多核苷酸，然而，不包括编码目标多肽的多核苷酸。所述插入位点位于编码hCD33分泌性前导序列的多核苷酸的3’。出于此目的，所述表达盒可包括例如多克隆位点(MCS)，其能例如用于所有阅读框。含插入位点的各“空”表达盒能用于插入编码所需目标多肽的多核苷酸。这具有以下优势：客户可将编码所需多肽的多核苷酸插入所述插入位点，从而完成表达盒。表达后，融合本发明所述分泌性前导序列的所需多肽由所述完整的表达盒表达并分泌。因此，各“空”表达盒提供一种表达不同目标多肽的有用工具，因为所述表达盒可仅通过将编码所需目标多肽的多核苷酸插入插入位点而易于适应希望的用途。

此外，所述表达盒可包括合适的转录终止位点。转录终止位点在现有技术中已得到良好表征，其纳入表达盒已显示对基因表达产生多种有益效果。如下进一步详述，本发明所述表达盒特别用于在真核宿主细胞中表达目标多肽。大部分真核新生mRNA在其3’末端具有多聚A尾，其在涉及初级转录物切割和偶联聚腺苷酸化反应的复杂过程中加入。所述多聚A尾尤其有利于mRNA稳定。因此，所述表达盒优选分别包括适于转录终止和聚腺苷酸化的聚腺苷酸化位点。有数种有效polyA信号，能用于旨在真核细胞中表达的表达盒，包括获自牛生长激素(bgh)、小鼠β球蛋白、SV40早期转录单元和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的那些。然而，也已知合成的聚腺苷酸化位点(参见例如普洛麦格(Promega)pCI-neo表达载体，基于Levitt等,1989,Genes Dev.3,(7):1019-1025)。因此，用于本发明所述表达盒的聚腺苷酸化位点可选自SV40polyA位点如SV40晚期和早期poly-A位点(参见例如质粒pSV2-DHFR，如Subramani等，1981，Mol.Cell.Biol.854-864所述)、合成polyA位点(参见例如普洛麦格pCI-neo表达载体，这是基于Levitt等，1989，Genes Dev.3，(7)：1019-1025)和bgh polyA位点(牛生长激素)。所述转录终止位点在表达盒中可与编码目标多肽的多核苷酸一起提供或作为单独元件提供。

因此，根据一个实施方式，所述表达盒还包括3’UTR序列作为元件e)。3’端非翻译区(3’UTR)在编码区之后且包括调控元件。所述3’UTR可包含的元件包括但不限于诱导RNAi如miRNA的蛋白和/或分子的结合位点。根据一个实施方式，使用含以下序列的3’UTR：

gggcggccgcttccctttagtgagggttaatgcttcgag(SEQ ID NO 14)。

此外，所述表达盒可包括聚腺苷酸化信号作为元件f)。合适的聚腺苷酸化位点如上所述。根据一个实施方式，使用含以下序列的多聚A位点：

cagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggagatgtgggaggttttttaaagcaagtaaaacctctacaaatgtggta(SEQ ID NO 15).

根据一个优选的实施方式，所述表达盒包括下列元件：

a)启动子，优选人CMV启动子或源自人CMV启动子的启动子；

b)选自下组的5’UTR多核苷酸序列：含SEQ ID NO 1的5’UTR多核苷酸序列，含SEQID NO 2的5’UTR多核苷酸序列，含SEQ ID NO 3的5’UTR多核苷酸序列，含SEQ ID NO 4的5’UTR多核苷酸序列，含SEQ ID NO 5的5’UTR多核苷酸序列，含SEQ ID NO 6的5’UTR多核苷酸序列，含SEQ ID NO 7的5’UTR多核苷酸序列，以及包含与SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 7所示序列至少85％，优选至少90％同一的序列的5’UTR多核苷酸序列；

c)编码hCD33分泌性前导序列的多核苷酸；

d)编码目标多肽的多核苷酸或用于插入编码目标多肽的多核苷酸的插入位点；

e)3’UTR多核苷酸序列；和

f)多聚A位点。

如所述，％同一性可根据参考序列全长计算。如上所述和实施例所示，本发明所述表达盒引起目标多肽的表达增加。“多肽”指含由肽键连接在一起的氨基酸聚合物的分子。多肽包括任何长度的多肽，包括蛋白(例如具有大于50个氨基酸)和肽(例如具有2-49个氨基酸)。多肽包括具有任何活性或生物活性的蛋白和/或肽。待生成的多肽可以是药物或治疗活性化合物，或待用于试验的研究工具等。因此，多肽不限于任何特定多肽或多肽组，相反可以是任何尺寸、功能或来源的多肽，其需要通过本文所述方法选择和/或表达。因而，数种不同的目标多肽可由本发明所述表达盒和/或本发明所述宿主细胞表达。如上所概括，术语多肽包括具有任何活性或生物活性的蛋白和/或肽，包括例如生物活性多肽如酶蛋白或肽(例如蛋白酶、激酶、磷酸酶)、受体蛋白或肽、转运蛋白或肽、细菌和/或内毒素结合蛋白、结构蛋白或肽、免疫多肽、免疫球蛋白、毒素、抗生素、激素、生长因子、疫苗等。所述多肽可选自肽激素、白介素、组织纤溶酶原激活物、细胞因子、免疫球蛋白，特别是抗体或其功能片段或衍生物和单域抗体，也称为纳米抗体。根据一个实施方式，目标多肽被糖基化。由本发明所述表达盒表达的目标多肽还可以是上述多肽之一的亚基或结构域，如抗体或者其功能片段或衍生物的重链或轻链。在一个优选的实施方式中，目标多肽是免疫球蛋白分子，更优选抗体或其亚基或结构域，如抗体或者单域抗体的重链或轻链。还包括上述的功能片段或衍生物或者上述的亚基或结构域，如抗体或者其功能片段或衍生物的重链或轻链。根据一个实施方式，目标多肽不是hCD33。

本文所用的术语“抗体”特别指含至少2条重链和2条轻链的蛋白，所述链由二硫键相连。术语“抗体”包括天然存在的抗体以及所有重组形式的抗体，如人源化抗体、全人抗体和嵌合抗体。各重链通常由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。各轻链通常由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。重链恒定区包括3个或-在IgM型或IgE型抗体情况中-4个重链恒定区(CH1、CH2、CH3和CH4)，其中第一恒定区CH1毗邻可变区且可通过铰链区连接第二恒定区CH2。轻链恒定区仅由一个恒定区组成。可变区能进一步细分成超变区，称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的区域，称为框架区(FR)，其中各可变区包括3个CDR和4个FR。重链和轻链可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子结合，包括不同免疫系统细胞(如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。然而，根据本发明，术语“抗体”还包括抗体的其它类型和变体，如重链抗体，即仅由一条或多条，特别是2条重链组成的抗体，以及纳米抗体，即仅由单个单体可变域组成的抗体。这种纳米抗体还可连接形成多价结构。优选地，所述抗体在合适宿主细胞中表达时被糖基化。如上所述，编码目标多肽的多核苷酸还可编码抗体的一个或多个亚基或结构域，例如重链或轻链或者功能片段或衍生物，作为目标多肽。

单域抗体也称为纳米抗体，是仅由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。如同全抗体，其能选择性结合特定抗原。分子量仅为12–15kDa的单域抗体比由2条重链和2条轻链组成的普通抗体(150–160kDa)小很多，且甚至小于Fab片段和单链可变片段。第一个单域抗体改造自骆驼中发现的重链抗体；这些称为VHH片段。重链抗体也在其它物种中发现。一种替代性方法是将人或小鼠共同免疫球蛋白G(IgG)中的二聚可变域分裂成单体。尽管大部分关于单域抗体的研究目前是基于重链可变域，源自轻链的纳米抗体也显示特异性结合靶表位。获自骆驼和单峰骆驼科(双峰驼(Camelus bactrianus)和单峰驼(Camelusdromaderius))成员的抗体蛋白已就尺寸、结构复杂性和对人类对象抗原性方面进行鉴定，所述成员包括新大陆成员如美洲驼种(羊驼(Lama paccos)、大羊驼(Lama glama)和小羊驼(Lama vicugna))。来自此哺乳动物科的某些IgG抗体如自然所见缺乏轻链，并因而在结构上不同于来自其他动物的抗体的具有2条重链和2条轻链的典型4链四级结构(参见WO94/04678)。骆驼抗体区域是鉴定为VHH的较小单一可变域，可如下获得：通过遗传工程改造产生对靶标有高亲和性的小蛋白，得到称为“骆驼纳米抗体”的低分子量抗体衍生蛋白(参见US5,759,808；Stijlemans,B.等.,2004J Biol Chem 279:1256-1261；Dumoulin,M.等.,2003Nature 424:783-788；Pleschberger,M.等.2003Bioconjugate Chem 14:440-448；Cortez-Retamozo,V.等.2002Int J Cancer 89:456-62；和Lauwereys,M.等.1998EMBO J17:3512-3520)。骆驼抗体和抗体片段的改造文库市售可得。正如其它非人来源的抗体，骆驼抗体的氨基酸序列能重组改变以获得更密切地类似人序列的序列，即所述纳米抗体能被“人源化”。各单域抗体也能用本发明教导的内容表达。此外，如所述，单域抗体还可连接形成多价结构。各多聚纳米抗体也可用本发明教导的内容表达。根据一个实施方式，多聚纳米抗体由单一表达盒表达。

抗体的“功能片段或衍生物”特别指蛋白或糖蛋白，其源自抗体且能与该抗体结合同一抗原，特别是同一表位。经适当变动后，这也同样适用于免疫球蛋白分子片段或衍生物，重链或轻链。已显示抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段或其衍生物来执行。抗体片段或衍生物示例包括(i)Fab片段，由可变区和各重链和轻链第一恒定区组成的单价片段；(ii)F(ab)2片段，包括在铰链区由二硫键相连的2个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由可变区和重链第一恒定区CH1组成；(iv)Fv片段，由抗体单臂的重链和轻链可变区组成；(v)scFv片段，由单一多肽链组成的Fv片段；(vi)(Fv)2片段，由共价连接的2个Fv片段组成；(vii)重链可变区；和(viii)由重链可变区和轻链可变区组成的多抗体，所述区共价连接的方式使得该重链和轻链可变区相联仅能在分子间而不是分子内发生。这些抗体片段和衍生物能用本领域技术人员已知的常规技术获得。

从可根据本发明教导来表达的上述多肽示例显然可见，待由宿主细胞生成和分泌的最终多肽也可以是二聚或多聚蛋白。各蛋白的优选示例是免疫球蛋白分子，特别是包括例如重链和轻链的抗体。有数种选择可生成各二聚或多聚蛋白。

根据一个实施方式，所述二聚或多聚蛋白的2个或更多亚基或结构域由本发明所述的一个表达盒表达。在此实施方式中，从各表达盒获得一个长转录物，所述表达盒包括二聚或多聚蛋白中各亚基或结构域的编码区。根据一个实施方式，至少一个IRES元件(内部核糖体进入位点)功能性定位于各亚基或结构域的编码区之间且各编码区之前是上述的hCD33分泌性前导序列。因此，确保单独的翻译产物获自所述转录物且终二聚或多聚蛋白能正确组装和分泌。此外，多聚纳米抗体也能由单一表达盒表达。

然而，这也在本发明范围内且对于一些实施方式，甚至优选由不同表达盒表达二聚或多聚蛋白的各亚基或结构域。根据一个实施方式，本发明所述表达盒是单顺反子表达盒。在此实施方式中，各表达盒包括编码二聚或多聚蛋白中一个亚基或结构域作为目标多肽的多核苷酸。根据一个实施方式，所有这些表达盒根据本发明教导进行设计。然而，针对不同表达盒使用不同设计也在本发明范围内。由各表达盒表达各亚基/结构域后，终二聚或多聚蛋白进行组装并从宿主细胞中分泌。此实施方式将结合本发明所述表达载体进一步详述。

根据一个优选的实施方式，编码目标多肽的多核苷酸编码抗体分子或者其功能片段或衍生物的重链或轻链作为目标多肽。

根据一个实施方式，本发明所述表达盒包括编码至少部分免疫球蛋白分子恒定区的多核苷酸。然后，编码免疫球蛋白分子对应可变部分的多核苷酸能被使用者/客户通过使用合适克隆策略插入表达盒，以使表达盒完整。

所述表达盒可包括能用于缓解和/或改善高表达宿主细胞选择的额外元件。一种已确立的选择高产率表达目标多肽的宿主细胞的本领域已知选择方法是基于使用流式细胞术，特别是荧光激活细胞分选术(FACS)。采用流式细胞术的选择方法具有能快速筛选大量细胞的优势。在一种特别用于鉴定高产细胞克隆的选择方法中，部分目标产物如抗体表达为膜结合融合多肽。因此，部分产物展示为细胞表面的融合多肽。由于所生成融合多肽的量与总体表达率相关联，宿主细胞能通过流式细胞术根据细胞表面展示的融合多肽量来选择。这能快速选择高产宿主细胞。本发明所述表达盒能有利地适应，从而其可用于基于流式细胞术使用的各选择方法。为了能使用流式细胞术(优选FACS)进行有效选择，可使用特殊表达盒以表达目标多肽。因此，根据一个实施方式，设计表达盒以表达编码目标多肽的多核苷酸，从而一部分所表达的目标多肽，优选小于10％，更优选小于5％或甚至小于2.5％，包括跨膜锚。有数种选择可实现该结果。

根据一个实施方式，所述表达盒包括在编码目标多肽的多核苷酸下游的额外的至少一个终止密码子，以及在终止密码子下游的编码膜锚和/或膜锚信号的另一多核苷酸。各元件操作性连接。此表达盒设计具有如下效果：通过翻译通读过程(终止密码子“渗漏”)，部分目标多肽生成为含膜锚的融合多肽。结果，此融合多肽在细胞表面展示且展示高水平膜锚定融合多肽的细胞能通过流式细胞术(优选FACS)加以选择。因此，选择具有高表达率的宿主细胞。基于此终止密码子的技术的细节和优选实施方式描述于WO2005/073375和WO2010/022961。参考公开内容。

根据另一个实施方式，所述表达盒在编码目标多肽的多核苷酸下游包括至少一个含5’剪接供体位点和3’剪接受体位点且包含框内翻译终止密码子和多腺苷酸化信号的内含子以及在所述内含子下游的编码膜锚和/或膜锚信号的多核苷酸。各元件操作性连接。此表达盒设计具有如下效果：通过转录和转录物加工，从表达盒获得至少2种不同的成熟mRNA(mRNA-POI)和(mRNA-POI-ANCHOR)。翻译mRNA-POI产生目标产物。翻译mRNA-POI-ANCHOR产生含目标产物和膜锚的融合多肽。结果，此融合多肽再次在细胞表面展示且展示高水平膜锚定融合多肽的细胞能通过流式细胞术(优选FACS)加以选择。因此，选择有高表达率的宿主细胞。基于此内含子的技术的细节和优选实施方式描述于WO2007/131774。参考公开内容。

根据一个特别用于表达抗体作为目标产物的优选实施方式，所述膜锚是免疫球蛋白跨膜锚。其它合适的膜锚和免疫球蛋白跨膜锚的优选实施方式描述于WO2007/131774、WO2005/073375和WO2010/022961。参考各公开内容。

根据第二方面，本发明提供表达目标多肽的表达载体，包括至少一个本发明第一方面所述的表达盒。所述表达盒如上详述，因此参考上述公开。

本发明所述“表达载体”特别指能携带至少一个外来核酸片段的多核苷酸。载体的功能类似分子载体，分别递送核酸片段、多核苷酸进入宿主细胞。其包括至少一个本发明第一方面所述的表达盒，包括必要调控序列以适当表达纳入其中的编码目标多肽的多核苷酸。

根据一个实施方式，所述表达载体额外包括至少一个表达盒，所述表达盒包含编码选择标记的多核苷酸。所述表达盒包括必要调控序列以适当表达纳入其中的编码选择标记的多核苷酸。选择标记包括为真核宿主细胞提供抗性抵御毒剂或毒性药物如抗生素特别是氨基糖苷类抗生素的选择标记，例如新霉素选择标记。选择标记还包括但不限于真核选择标记如二氢叶酸还原酶(DHFR)和谷氨酰胺合成酶(GS)。其它合适选择标记如叶酸受体描述于WO2009/080759和WO 2010/097240。优选地，所述表达载体包括至少一个表达盒，所述表达盒包含编码可扩增选择标记的多核苷酸。可扩增选择标记能选择含载体的真核宿主细胞以及基因扩增。可扩增选择性哺乳动物标记基因的一个非限制性示例是二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。目前使用的其它系统是谷氨酰胺合成酶(gs)系统(Bebbington等.,1992)和组氨醇驱动选择系统(Hartmann和Mulligan,1988)等。这些可扩增标记也是选择标记并因而能用于选择获得载体的那些细胞。DHFR和谷氨酰胺合成酶提供良好结果。两种情况中，选择通常在没有合适代谢物(DHFR情况下是次黄嘌呤和胸苷，GS情况下是谷氨酰胺)的情况下发生，从而防止未转化细胞生长。使用可扩增系统如DHFR系统，通过使细胞暴露于某些基因扩增促进剂如DHFR系统中的抗叶酸剂(如氨甲蝶呤(MTX))能增加重组蛋白的表达。促进基因扩增的GS的合适抑制剂是甲硫氨酸砜亚胺(MSX)。暴露于MSX也导致基因扩增。根据一个优选的实施方式，所述表达载体包括表达盒，所述表达盒包含编码二氢叶酸还原酶(DHFR)作为选择标记的多核苷酸。

此外，所述表达载体还可包括表达盒，所述表达盒包含编码原核选择标记的多核苷酸。“原核选择标记”是在合适选择条件下能在原核宿主细胞中选择的选择标记。各原核选择标记的示例是提供针对抗生素，如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素和/或氯霉素抗性的标记。在表达载体中包括原核选择标记具有以下优势：所述表达载体在原核宿主细胞中易于增殖。

优选地，所述表达载体包括至少一个本发明第一方面所述的表达盒，含编码真核选择标记的多核苷酸的表达盒，以及含编码可扩增选择标记优选DHFR的多核苷酸的表达盒，所述真核选择标记提供抗性抵御氨基糖苷类抗生素，优选新霉素选择标记。

本发明所述表达载体可包括多于一个表达盒以表达目标多肽。因此，根据一个实施方式，表达相同或不同的目标多肽的数个表达盒排列于本发明所述表达载体上。因而，本发明还提供含多于一个表达盒的表达载体，其中各表达盒编码例如二聚或高级多聚蛋白的亚基或结构域。编码多聚蛋白不同亚基的表达盒能放置成例如彼此相邻，所述亚基各自纳入不同表达盒。对于由至少2个不同基因编码的多聚蛋白(例如，抗体或其功能片段或衍生物的轻链和重链)，编码所需亚基或结构域的多核苷酸作为目标多肽被插入不同表达盒。使用至少2个不同表达盒以表达二聚或多聚蛋白的各亚基或结构域作为目标多肽的各实施方式对于表达免疫球蛋白分子例如抗体特别有利。在宿主细胞中，所述二聚或多聚蛋白如抗体进行组装并分泌。根据一个实施方式，本公开所述表达盒设计用于表达抗体重链。在实施方式中，轻链的表达盒可具有不同设计，例如可包括不同分泌性前导序列如Ig前导序列。根据一个实施方式，2种表达盒都根据本公开的教导设计。

因此，根据一个实施方式，所述表达载体包括至少两个本发明第一方面所述的表达盒。所述表达盒之一所含的多核苷酸编码免疫球蛋白分子或其功能片段或衍生物的重链作为目标多肽，另一表达盒所含的多核苷酸编码免疫球蛋白分子或其功能片段或衍生物的轻链作为目标多肽。在宿主细胞中由所述表达盒表达轻链和重链时，所述功能免疫球蛋白分子(优选抗体)进行组装并从宿主细胞中分泌。根据一个实施方式，轻链或其功能片段或衍生物的5’UTR包括SEQ ID NO 3或由其组成。根据一个实施方式，重链或其功能片段或衍生物的5’UTR包括SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 4或由其组成。根据一个实施方式，轻链或其功能片段或衍生物的5’UTR包括SEQ ID NO 5或由其组成。根据一个实施方式，重链或其功能片段或衍生物的5’UTR包括SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 7或由其组成。

能与本发明联用的合适表达载体描述于WO 2009/080720，然而其中，在本发明教导内容中，WO 2009/080720所述免疫球蛋白分泌性前导序列在表达盒内被hCD33分泌性前导序列取代，所述表达盒包括编码目标多肽的多核苷酸。如所述，在表达载体存在多于一个表达盒的情况中，一个表达盒按照本文所述的设计是足够的。

根据第三方面，提供真核宿主细胞，包括至少一个本发明第一方面所述的表达盒和/或至少一个本发明第二方面所述的表达载体。本发明所述表达盒和表达载体如上详述，参考在此同样适用的上述公开。优选地，所述表达盒包括编码目标多肽的多核苷酸。优选包括在表达载体中的各表达盒能经转染引入宿主细胞。

根据一个实施方式，所述真核宿主细胞包括至少两个本发明所述的表达盒。根据一个实施方式，各所述表达盒包括编码二聚或多聚蛋白中至少一个亚基或结构域作为目标多肽的多核苷酸。此实施方式特别适于表达免疫球蛋白分子。根据一个优选的实施方式，所述宿主细胞包括本发明第一方面所述的第一表达盒和本发明第一方面所述的第二表达盒，第一表达盒包括编码免疫球蛋白分子或其功能片段或衍生物的重链作为目标多肽的多核苷酸，第二表达盒包括编码免疫球蛋白分子或其功能片段或衍生物的轻链作为目标多肽的多核苷酸。如上所述，优选地，表达轻链的表达盒所用的5’UTR包括SEQ ID NO 3或由其组成，且表达重链的表达盒所用的5’UTR包括SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 4或由其组成。根据一个实施方式，表达轻链的表达盒所用的5’UTR包括SEQ ID NO 5或由其组成，且表达重链的表达盒所用的5’UTR包括SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 7或由其组成。所述表达盒能通过使用上述一种或多种合适表达载体来引入宿主细胞。根据一个实施方式，第一表达盒通过一种表达载体引入且第二表达盒通过第二表达载体引入。然而，优选2种表达盒都通过使用携带2种表达盒的一个表达载体来引入。

根据一个实施方式，所述真核宿主细胞包括至少一个根据第一方面的表达盒以表达抗体重链。如所述，例如，包括SEQ ID NO 1、4、6或7或由其组成的5’UTR可用于此目的。

基本上，任何真核宿主细胞可与本发明联用，只要其能从本发明所述表达盒中有效表达多肽。优选地，所述真核宿主细胞是哺乳动物细胞。所述哺乳动物细胞优选选自啮齿动物细胞、人细胞和猴细胞。尤其优选使用啮齿动物细胞，优选选自CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、小鼠3T3成纤维细胞和SP2/0细胞。尤其优选使用CHO细胞作为宿主细胞。人细胞可例如选自HEK293细胞、MCF-7细胞、PerC6细胞和HeLa细胞。猴细胞可选自例如COS细胞和Vero细胞。本发明所述表达载体特别适于在啮齿动物细胞中生成多肽，如CHO细胞，包括DHFR-CHO细胞或DHFR+CHO细胞。优选地，所述宿主细胞是CHO细胞。

根据第四方面，提供生成本发明第三方面所述宿主细胞的方法，其中本发明第二方面所述表达载体被引入真核宿主细胞，优选哺乳动物宿主细胞。因此，将第一方面所述的表达盒引入宿主细胞，所述表达盒优选包括表达目标多肽的多核苷酸。

引入可通过例如转染本发明第二方面所述的表达载体来完成。根据一个实施方式，所述表达载体整合入宿主细胞基因组(稳定转染)。能将本发明第一方面所述表达盒引入宿主细胞的合适表达载体结合本发明所述第二方面如上详述。如果所引入的表达盒未插入基因组(瞬时转染)，其可能在后面阶段如细胞经历有丝分裂时失去。合适的表达载体还可在宿主细胞中维持而不整合入基因组，例如通过附加型复制。现有技术已知有数种合适方法将表达载体引入真核宿主细胞，包括哺乳动物宿主细胞，特别是通过转染。各方法包括但不限于磷酸钙转染、电穿孔、脂转染、基因枪-和聚合物-介导的基因转移。除了基于随机整合的传统方法，还能使用重组介导方法。这种重组方法可包括使用位点特异性重组酶如Cre、Flp或ΦC31(参见例如Oumard等,Cytotechnology(2006)50:93-108)，所述酶能介导转基因定向插入。或者，同源重组机制可用于插入本发明所述表达盒(综述参见Sorrell等,Biotechnology Advances 23(2005)431-469)。基于重组的基因插入能使待引入宿主细胞的表达载体所包含的元件数最小。本发明所述合适表达载体或表达载体组合以及合适宿主细胞的实施方式如上详述；参考上述公开。如上所述并结合实施方式，如果至少2个表达载体的组合用于转染宿主细胞，含编码免疫球蛋白分子或其功能片段或衍生物重链和轻链的多核苷酸的表达盒可位于相同或不同的表达载体上。

根据第五方面，提供生成目标多肽的方法，所述方法包括在允许所述目标多肽表达的条件下，以细胞培养方式，培养本发明第三方面所述的宿主细胞。有2种主要的宿主细胞培养模式，即贴壁细胞培养和悬浮培养。优选使用悬浮培养。根据一个实施方式，所述宿主细胞在无血清条件下培养。

目标多肽由本发明所述表达盒表达并从宿主细胞中分泌，例如进入培养基，所分泌多肽能从中获得。如果宿主细胞中存在多于一个表达盒，例如当二聚或多聚蛋白表达时(见上)，所述二聚或多聚蛋白在细胞中组装且随后从宿主细胞中分泌。由于使用本发明所述新型5’UTR/分泌性前导序列组合实现了惊人表达，多肽能以高产率表达和分泌。所分泌多肽还可接受更多加工步骤，例如纯化和/或修饰步骤。因此，生成目标多肽的方法可包括以下至少一个步骤：

-从所述细胞培养基中分离目标多肽；和/或

-加工所分离的目标多肽。

因此，根据本发明生成的多肽可回收且任选进一步加工，例如通过本领域已知方法进一步纯化、分离和/或修饰。例如，所述多肽可通过常规过程从营养培养基中回收，所述过程包括但不限于离心、过滤、超滤、萃取或沉淀。纯化可通过本领域已知多种过程进行，包括但不限于色谱(如离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦、和尺寸排阻)、电泳过程(如制备式等电子聚焦)、差别溶解法(如硫酸铵沉淀)或萃取。

如上所述，目标多肽优选是免疫球蛋白分子或其功能片段或衍生物，更优选抗体或其功能片段或衍生物。

根据第六方面，本发明涉及处于表达盒内的5’UTR序列与hCD33分泌性前导序列的组合在由所述表达盒高产率表达目标多肽的应用，其中所述5’UTR多核苷酸序列选自下组：含SEQ ID NO 1的5’UTR多核苷酸序列，含SEQ ID NO 2的5’UTR多核苷酸序列，含SEQ ID NO3的5’UTR多核苷酸序列，含SEQ ID NO 4的5’UTR多核苷酸序列，和包含与SEQ ID NO 1、SEQID NO 2、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4所示序列至少85％，优选至少90％同一的序列的5’UTR多核苷酸序列，或其中所述5’UTR多核苷酸序列选自下组：含SEQ ID NO 5的5’UTR多核苷酸序列，含SEQ ID NO 6的5’UTR多核苷酸序列，含SEQ ID NO 7的5’UTR多核苷酸序列，和包含与SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 7所示序列至少85％，优选至少90％同一的序列的5’UTR多核苷酸序列。同一性可根据参考序列全长计算。

各组合的优势、5’UTR多核苷酸序列和hCD33分泌性前导序列的合适且优选的实施方式，以及表达盒和编码目标多肽的多核苷酸的合适且优选实施方式如上详述。参考在此同样适用的上述公开。

优选地，所述表达盒具有以上结合本发明第一方面所述的表达盒设计。参考上述公开。根据一个实施方式，所述表达盒具有一个或多个以下特征：

a)其包括启动子；

b)其包括上述5’UTR多核苷酸序列；

c)其包括hCD33分泌性前导序列，所述序列包括序列MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ IDNO 12)且优选由其组成；

d)其包括编码目标多肽的多核苷酸或用于插入编码目标多肽的多核苷酸的插入位点；

e)其包括3’UTR序列和/或

f)其包括多聚A位点

如上结合本发明第一方面描述关于各元件和优选实施方式及组合的细节。参考上述公开。

根据一个实施方式，编码目标多肽的多核苷酸编码二聚或多聚蛋白的2个或更多亚基或结构域作为目标多肽，其中至少一个IRES元件位于各亚基或结构域的编码区之间且各编码区之前是hCD33分泌性前导序列。然而，在本发明背景下优选使用单顺反子表达盒。

根据另一个实施方式，编码目标多肽的多核苷酸编码二聚或多聚蛋白的亚基或结构域作为目标多肽。优选地，编码目标多肽的多核苷酸编码抗体分子或者其功能片段或衍生物的重链或轻链作为目标多肽。根据一个实施方式，本公开所述表达盒设计用于表达抗体重链。这时，表达轻链的表达盒可具有不同设计，且可以例如包括不同前导序列如Ig前导序列，或也可根据本发明教导设计。根据一个实施方式，本公开所述表达盒设计用于表达抗体轻链。这时，表达重链的表达盒可具有不同设计，且可以例如包括不同前导序列如Ig前导序列，或也可根据本发明教导设计。

根据一个实施方式，含某些元件的本文所述主题也指由各元件组成的主题。特别地，如本文所述的含某些序列的5’UTR还可由各序列组成。

优选选择并组合本文所述的优选实施方式，产生于优选实施方式中各组合的特定主题也属于本公开范围。

本文所提及文本和文献的全部内容通过引用纳入本文，并从而构成本公开的一部分。

下列实施例用于阐明本发明，但不以任何方式限制其范围。所述实施例特别涉及本发明的优选实施方式。

实施例

根据以下操作进行实施例：

实施例A

I.材料和方法

宿主细胞

使用源自CHO-K1细胞的CHO(中国仓鼠卵巢)细胞作为宿主细胞。

表达载体

作为标准对照，使用设计如WO 2009/080720(具体参见实施例6)所述的表达载体，所述载体在表达盒中采用Ig分泌性前导序列以表达抗体轻链和重链。CMV启动子包括SEQID NO 8。SEQ ID NO 3用作表达轻链的5’UTR且SEQ ID NO 4用作表达重链的5’UTR。根据本发明教导的表达载体通过以下获自所述对照载体：用下列hCD33分泌性前导序列取代现有的轻链和重链免疫球蛋白分泌性前导序列：

MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO 12)

所述表达载体用于表达抗体分子。对应载体设计还用于表达作为目标多肽的纳米抗体，然而其中，使用根据SEQ ID NO 5的5’UTR。这时，然而，仅需要一个表达盒。对照载体具有相同设计，然而，再次使用Ig前导序列。

细胞培养、转染和选择

细胞用具有专利权的内部细胞培养基培养，每周常规传代2-3次以在整个研究中维持对数生长期。用标准核转染方法转染细胞。离心5E6细胞/核转染脉冲并重悬于转染缓冲液。加入3ug用于编码目标多肽的载体DNA，进行核转染。将转染细胞移至125ml摇瓶，并在振荡条件下培养24-48小时。

用G-418的第一选择步骤如前面WO 2009/080720所述进行。进一步选择用2个额外氨甲蝶呤(MTX)选择步骤，即500nM MTX和1000nM MTX进行。含抗性且大部分是高产细胞的选定库以0.5-1细胞/孔的密度通过有限稀释或使用FACS系统进行克隆。对于所得克隆，克隆产率和生长以不同筛选模式分析。

II.结果

根据现有技术的表达载体(对照表达载体，含Ig分泌性前导序列)和本发明所述表达载体(含hCD33分泌性前导序列)所得的实验数据证明产生的抗体效价在使用本发明所述特定5’UTR和hCD33分泌性前导序列的新型组合时显著增加。作为目标蛋白的IgG抗体被表达。使用本发明所述表达载体时，观察到的库水平产率增长平均为2.88倍。所述结果可在克隆水平上进一步提高，其中用本发明所述表达载体时能获得4.1倍的产率增长(当比较用对照表达载体获得的最佳对照克隆与用本发明所述表达载体获得的最佳克隆时)。

表达作为目标蛋白的纳米抗体时，最佳克隆的对比显示用本发明所述表达载体时产率增长为1.1倍，且比较6个最佳克隆时，产率增长平均为1.6倍。这由下表阐明：

表2：用IgG抗体的新组合评估：用本发明所述表达载体在库水平上实现2.88倍产率增长。

表3：用IgG抗体的新组合评估：比较现有技术已知表达载体与本发明所述表达载体的最佳克隆，有4.1倍产率增长，且在6个最佳克隆的均值中：4倍产率增长

表4：用纳米抗体的新组合评估：比较现有技术已知表达载体与本发明所述表达载体的最佳克隆，有1.1倍产率增长，且在平均6个最佳克隆中：1.6倍产率增长。

	hCD33SP前6位克隆	对照前6位克隆
			效价(g/L)	0.92	0.75
	0.92	0.58
				0.90	0.57

	0.88	0.57
				0.88	0.57
	0.87	0.57

实施例B

表达载体

作为标准对照，使用基本设计如WO 2009/080720(具体参见实施例6)所述的表达载体，所述载体采用表达盒中的Ig分泌性前导序列以表达抗体轻链和重链。用于重链的表达盒用WO2010/022961所述的渗漏终止密码子技术改良以促进FACS选择。CMV启动子包括SEQ ID NO 8。SEQ ID NO 5用作表达轻链的5’UTR，且SEQ ID NO 7用作表达重链的5’UTR。根据本发明教导的表达载体通过以下获自所述对照载体：用下列hCD33分泌性前导序列取代现有的重链免疫球蛋白分泌性前导序列：

MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO 12)

所述表达载体用于表达不同抗体分子。

进行评价以处理3个不同抗体的IgG表达和重链盒的正确信号肽(前导序列)加工。前导序列的正确加工即通过信号肽酶切割前导序列对于在其N末端获得目标多肽的预期序列及因而获得有预期品质的功能分子是必须的。先前注意到，在使用现有技术设计的一些情况中，信号肽加工不正确，产生例如在N末端有一个或多个额外氨基酸的重或轻链。根据在N末端不正确保留的一个或多个氨基酸，由保留的一个或多个前导序列氨基酸引起的该氨基酸序列的延伸可例如增加分子聚合倾向或诱导二硫键形成。因此，其可对产物品质产生严重影响。此外，发现不正确信号肽加工带来如下风险：目标多肽如抗体产物被蛋白酶在N末端预期切割位点下游切割(也称为截短(clipping))。这生成了截断产物，也可能对分子质量产生严重影响。

表5描述相较对照，用本公开技术所得的信号肽(前导序列)加工的结果。可以看出，用本发明技术显著减少不需要的信号肽加工并因此提高质量。

表5：评价重链盒上的不同信号肽显示在表达3个不同模型抗体时改善且正确的细胞系加工

Claims (12)

1.一种稳定转染有至少一种表达盒和/或至少一种表达载体的CHO宿主细胞，其中所述至少一种表达盒和/或至少一种表达载体整合入所述宿主细胞的基因组，且其中：

a) 所述表达盒是一种表达目标多肽的表达盒，所述表达盒包括：

aa) 启动子；

ab) 由如下序列组成的5’UTR多核苷酸序列：

ac) 编码hCD33分泌性前导序列的多核苷酸，其中，所述hCD33分泌性前导序列由序列MPLLLLLPLLWAGALA (SEQ ID NO 12)组成；和

ad) 编码目标多肽的多核苷酸或用于插入编码目标多肽的多核苷酸的插入位点；且

b) 所述表达载体是一种表达目标多肽的表达载体，包括至少一种如a)的表达盒。

2.如权利要求1所述的CHO宿主细胞，其特征在于，所述表达盒还包括：

ae) 3’UTR序列和/或

af) 多聚A信号。

3.如权利要求1或2所述的CHO宿主细胞，其特征在于，所述表达盒具有一个或多个以下特征：

i) 所述编码目标多肽的多核苷酸编码二聚或多聚蛋白的2个或更多亚基或结构域作为目标多肽，其中至少一个IRES元件位于各亚基或结构域的编码区之间且各编码区之前是hCD33分泌性前导序列；

ii) 所述编码目标多肽的多核苷酸编码二聚或多聚蛋白的亚基或结构域作为目标多肽；

iii) 所述编码目标多肽的多核苷酸编码抗体分子或者其功能片段或衍生物的重链或轻链作为目标多肽；

iv) 所述5’UTR多核苷酸序列由SEQ ID NO 5组成且所述编码目标多肽的多核苷酸编码抗体分子或其功能片段或衍生物的轻链作为目标多肽；

v) 所述表达盒是单顺反子表达盒；

vi) 所述表达盒中包含的启动子是人CMV启动子，其选自下组：

vi a) 包括以下序列的启动子

或其担任启动子的功能片段；

vi b) 包含与SEQ ID NO 8所示序列或其担任启动子的功能片段至少80%同一的序列的启动子。

4.如权利要求2或3的CHO宿主细胞，其中所述表达盒包括以下元件：

aa) 人CMV启动子；

ab) 由SEQ ID NO: 5组成的5’UTR多核苷酸序列；

ac) 编码hCD33分泌性前导序列的多核苷酸，其中所述hCD33分泌性前导序列由序列MPLLLLLPLLWAGALA (SEQ ID NO 12)组成；

ad) 编码目标多肽的多核苷酸；

ae) 3’UTR多核苷酸序列；和

af) 多聚A位点。

5.如权利要求1-4中任一项所述的CHO宿主细胞，其中所述表达目标多肽的表达载体包括至少一种如权利要求1-4中一项或多项所述的表达盒。

6.如权利要求5所述的CHO宿主细胞，其特征在于，所述表达载体还包括一个或多个以下元件：

a) 至少一种表达盒，所述表达盒包括编码选择标记的多核苷酸；

b) 至少一种表达目标多肽的第二表达盒。

7.如权利要求6所述的CHO宿主细胞，其特征在于，所述表达载体包括至少2个表达盒，其中各表达盒包括编码目标多肽的多核苷酸，其中一个表达盒所含多核苷酸编码免疫球蛋白分子或其功能片段或衍生物的重链，且另一表达盒所含多核苷酸编码免疫球蛋白分子或其功能片段或衍生物的轻链。

8.一种生成如权利要求1-7中的一项或多项所述宿主细胞的方法，其中权利要求5-7中一项或多项所定义的表达载体被引入CHO宿主细胞。

9.一种生成目标多肽的方法，所述方法包括在允许所述目标多肽表达的条件下，以细胞培养方式，培养如权利要求1-7中一项或多项所述的宿主细胞。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述目标多肽分泌入细胞培养基并从细胞培养基中分离，所分离多肽任选进一步加工。

11.如权利要求9或10所述的方法，其特征在于，所述多肽是免疫球蛋白分子或其片段。

12.处于表达盒内或含所述表达盒的表达载体内的5’UTR序列与hCD33分泌性前导序列的组合用于在CHO宿主细胞中由所述表达盒高产率表达目标多肽的应用，其中所述宿主细胞稳定转染有所述表达盒或含所述表达盒的表达载体，其中所述hCD33分泌性前导序列由序列MPLLLLLPLLWAGALA (SEQ ID NO 12)组成，且其中所述至少一种表达盒和/或至少一种表达载体整合入所述宿主细胞的基因组，

所述5’UTR多核苷酸序列由如下序列组成：