BR112015011061B1

BR112015011061B1 - Cassete de expressão adequado para expressão de um polipeptídeo de interesse, vetor de expressão, métodos para produzir uma célula hospedeira eucariótica e um polipeptídeo de interesse, e uso de uma sequência 5'utr em combinação com uma sequência líder de secreção de hcd33 em um cassete de expressão

Info

Publication number: BR112015011061B1
Application number: BR112015011061-4A
Authority: BR
Inventors: Zorica DRAGIC; Rita SCHMITZ; Burkhard Wilms; Sabine Geisse
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2012-11-20
Filing date: 2013-11-18
Publication date: 2022-09-27
Also published as: BR112015011061A2; US20170356006A1; PT2922962T; RU2015124041A; CN104968791B; LT2922962T; MX2015006376A; MX359950B; RU2682884C2; US9663797B2; EP2922962B1; CN113981002A; AU2013349844B2; US11230718B2; AU2013349844A1; CA2891388C; IL238703A0; PL2922962T3; ES2620325T3; JP6388592B2

Abstract

CASSETE DE EXPRESSÃO OTIMIZADO PARA EXPRESSÃO DE UM POLIPEPTÍDEO COM RENDIMENTO ELEVADO. A presente invenção refere-se à descoberta de que a combinação de uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR específica (vide SEQ ID NO: 1) e a sequência líder de secreção de hCD33 em um cassete de expressão para expressão de um polipeptídeo de interesse resulta em um nível de expressão surpreendentemente melhor do polipeptídeo de interesse comparado com os cassetes de expressão do estado da técnica. Com base nesta descoberta, a presente invenção proporciona, inter alia, novos cassetes de expressão, vetores de expressão e métodos para produção de um polipeptídeo de interesse com um rendimento elevado.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere, inter alia, a um cassete de expressão adequado para expressão de um polipeptídeo de interesse, em que o dito cassete de expressão compreende uma combinação específica de uma 5'UTR e a sequência líder de secreção de hCD33. Descobriu-se que esta combinação específica de elementos genéticos resulta, surpreendentemente, em um melhor nível significativo de expressão do polipeptídeo de interesse em relação a outras combinações de 5'UTRs com outras sequências líder secretoras. Portanto, uso deste cassete de expressão é vantajoso para produção de um polipep- tídeo de interesse com um rendimento elevado.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A capacidade de clonar e expressar um polipeptídeo de in teresse em grandes quantidades se tornou cada vez mais importante. A capacidade de produzir e purificar níveis elevados de proteínas é importante, em particular, no campo farmacêutico e de biotecnologia humana, por exemplo, para produção de produtos farmacêuticos de proteína, bem como no ambiente de pesquisa básica, por exemplo, para cristalização de proteínas para permitir determinação de sua estrutura tridimensional. Proteínas que são, de outro modo, difíceis de obter em quantidade, podem ser expressas em excesso em uma célula hospedeira e subsequentemente isoladas e purificadas.

[003] A escolha de um sistema de expressão para a produção de proteínas recombinantes depende de muitos fatores, incluindo as características de crescimento celular, níveis de expressão, expressão intracelular e extracelular, modificações pós-traducionais e atividade biológica da proteína de interesse, bem como questões de regulamentação e considerações econômicas na produção de proteínas terapêuticas. As principais vantagens de células de mamífero em relação a outros sistemas de expressão, tais como bactérias ou leveduras, são a capacidade de realizar o enrolamento correto da proteína, glicosilação N-ligada complexa e glicosilação O-ligada autêntica, bem como um amplo espectro de outras modificações pós-traducionais. Em virtude das vantagens descritas, células eucariotas e, em particular, células de mamíferos, são atualmente o sistema de expressão de escolha para produção de proteínas terapêuticas complexas, tais como anticorpos monoclonais.

[004] A abordagem mais comum para obter células hospedeiras de alta expressão (também denominadas produtores de alto rendimento) é gerar um vetor de expressão adequado para expressão do produto de interesse como uma primeira etapa. O vetor de expressão dirige a expressão do polinucleotídeo que codifica o produto de interesse na célula hospedeira e, normalmente, compreende pelo menos um marcador de seleção para gerar a linhagem de células recombinante. Vetores de expressão usados para expressar um polipeptídeo em uma célula hospedeira usualmente compreendem, além do polinucleotídeo que codifica a proteína de interesse, elementos de controle de transcrição adequados para dirigir a transcrição tais como, por exemplo, promotores, intensificadores, sinais de poliadenilação, sinais de término ou interrupção de transcrição como elementos de um cassete de expressão. Além disso, elementos de controle de tradução adequados são normalmente incluídos e operativamente ligados aos polinucleotí- deos a serem expressos, por exemplo, tal como 5'UTRs e 3'UTRs adequadas.

[005] Para aumentar a eficiência de tal sistema de expressão, diferentes elementos são otimizados, especialmente as sequências de DNA as quais contribuem para a eficiência de transcrição e tradução, síntese de proteínas, enrolamento correto no ER e secreção de proteína. Sistemas de expressão de alto rendimento sem componentes de tradução e secreção otimizados podem levar potencialmente à instabilidade do mRNA, secreção insuficiente de proteína e ao acúmulo de proteína erroneamente enrolada (inativa) no citoplasma ou membrana celular. Portanto, sistemas de expressão que permitem a tradução estável e consistente e secreção de proteínas corretamente enroladas no meio de cultura de células são de interesse particular. Tais sistemas de secreção oferecem as vantagens de uma tradução estável e eficiente de mRNA; enrolamento correto e secreção eficiente da proteína, procedimentos de purificação de produto simples e rápidos, bem como um maior rendimento comparado com sistemas citosólicos. No entanto, os rendimentos de produto da maioria dos sistemas de secreção disponíveis ainda não são totalmente otimizados. Para melhorar a produtividade e eficiência de secreção, um objetivo é otimizar os sinais de secreção (também ditos aqui como peptídeo sinalizador ou sequência líder de secreção), bem como sua combinação com diferentes sequências 5'UTR, a fim de obter uma combinação de elementos genéticos que resulta na expressão de alto nível desejada.

[006] A maioria de proteínas secretadas e ligadas à membrana de organismos procariotas ou eucariotas possui um peptídeo líder amino terminal (também dito como sequência líder de secreção ou peptídeo sinalizador) que é clivado do polipeptídeo precursor nascente durante biossíntese. Peptídeos líderes de secreção têm, em geral, 5 a 60 aminoácidos de comprimento. Esta sequência é necessária e suficiente para secreção. Análise de um grande número destes peptídeos líderes de secreção revelou um motivo estrutural em comum que ocorre na ausência de homologia de sequência de aminoácidos significativa [Von Heijne, 1981; Perlman et al., 1983]. Em geral, uma sequência líder de secreção consiste em um amino término positivamente carregado (n), um núcleo hidrofóbico (h) e um carbóxi término mais polar (C) que define o sítio de clivagem da peptidase sinalizadora. A região "n" do peptídeo líder de secreção tem cerca de 5 a 8 aminoácidos de comprimento e é caracterizada pela presença de resíduos básicos. A região "h" contém 8 a 12 aminoácidos não polares que são compostos, em média, de 37% de leucina, 15% de alanina, 10% de valina, 10% de fenilalanina, 7% de isoleucina e 21% de aminoácidos hidrofóbicos, tais como glicina, metionina, prolina ou triptofano. Esta região tem uma propensão elevada para a formação de alfa hélices em uma conformação que pode facilitar a interação com o interior da bicamada lipídica. Estudos sobre as características estruturais de peptídeos líderes de secreção, principalmente com base em proteínas bacterianas, sugeriram que a região "h" é crítica para sinalizar a função de sequência [Gi- erasch, 1990]. Ruptura da região h por eliminação ou por substituição de resíduos hidrofóbicos por aminoácidos hidrofílicos ou aminoácidos carregados leva à perda de função sinalizadora, enquanto que alterações na região "n" têm pouco efeito [Bird et al., 1990]. O carbóxi término, ou região de clivagem tem, tipicamente, cerca de 6 aminoácidos de comprimento. Esta região está envolvida no reconhecimento e clivagem de peptidase sinalizadora, a qual geralmente é necessária para obter enrolamento final e secreção da proteína.

[007] A 5'UTR (região não traduzida 5') é uma parte de uma se quência de DNA que é transcrita em mRNA, mas não em proteína. Ge-ralmente, ela começa no início de transcrição e termina um nucleotí- deo antes do códon inicial. A 5'UTR pode conter sequências que regulam a eficiência de tradução ou estabilidade do mRNA, sítios de liga- ção para proteínas, elementos reguladores e sequências que promovem o início de tradução. Sequências 5'UTR podem variar quanto ao seu comprimento e podem compreender alguns décimos de nucleotí- deos até algumas centenas ou mesmo milhares de nucleotídeos. Em eucariotas, o comprimento médio da 5'UTR é de aproximadamente 100 a 200 nt. O papel específico da 5'UTR e seus elementos ainda não foi totalmente elucidado, em parte também porque a sequência não é traduzida em proteína funcional. No entanto, sabe-se que a combinação específica de uma 5'UTR e uma sequência líder de secreção específica pode melhorar grandemente a eficiência de secreção e tradução do sistema de produção e, assim, pode aumentar o rendimento de expressão. No entanto, como uma pletora de 5'UTRs e sequências líderes de secreção estão disponíveis, é um desafio obter uma combinação eficiente que melhore de fato a expressão. Assim, apesar do grande número de cassetes de expressão e vetores de expressão disponíveis, obtenção de uma produção robusta de polipeptí- deo/proteína com um rendimento elevado em células eucariotas ainda é difícil.

[008] Portanto, é o objetivo da presente invenção proporcionar um cassete de expressão que permita a secreção de um polipeptídeo de interesse com um rendimento elevado quando o dito cassete de expressão é introduzido em uma célula hospedeira. Além disso, é um objetivo da presente invenção proporcionar um vetor de expressão que permita a expressão de um polipeptídeo de interesse com um rendimento elevado. Além disso, é um objetivo da presente invenção proporcionar um método adequado para expressão de um polipeptídeo de interesse com um rendimento elevado.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009] A presente invenção se baseia na descoberta de que a combinação de uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR específica (vide SEQ ID NO: 1, a qual também está contida em SEQ ID NO: 2, 3 e 4 e também 5, 6 e 7) e a sequência líder de secreção de CD33 humana em um cassete de expressão resulta em uma expressão surpreendentemente elevada do polipeptídeo de interesse que é codificado pelo dito cassete de expressão. Em vários exemplos, foi mostrado que o cassete de expressão de acordo com a presente invenção é superior aos cassetes de expressão conhecidos no estado da técnica porque o rendimento de expressão pode ser aumentado em até 4 vezes. O desempenho superior do cassete de expressão de acordo com a presente invenção foi confirmado em vários experimentos onde diferentes polipeptídeos de interesse foram expressos a partir do dito cassete de expressão. Portanto, o cassete de expressão de acordo com a presente invenção é particularmente vantajoso para a produção de um poli- peptídeo de interesse com um rendimento elevado. Além disso, descobriu-se que o processamento correto da sequência líder pode ser melhorado. Assim, a presente invenção fornece uma contribuição valiosa para a técnica porque este conceito inovador do cassete de expressão melhora consideravelmente a expressão do polipeptídeo de interesse.

[0010] De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção proporciona um cassete de expressão para expressar um polipeptídeo de interesse que compreende:

[0011] a) um promotor

[0012] b) uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR, em que a dita sequência de polinucleotídeos 5'UTR é selecionada do grupo que consiste em

[0013] i) uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR compreen dendo a seguinte sequência agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccag cctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtac cgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataac cttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacag gtgtccactcccaggtccaactgca (SEQ ID NO: 1);

[0014] ii) uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR compreen dendo a seguinte sequência agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccag cctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtac cgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataac cttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctcca aggtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcg (SEQ ID NO: 2);

[0015] iii) uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR compreen dendo a seguinte sequência agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccag cctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtac cgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataac cttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacag gtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgaaaacgcgtccacc (SEQ ID NO: 3);

[0016] iv) uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR compreen dendo a seguinte sequência agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccag cctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtac cgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataac cttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacag gtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgcgattgaattccccggggatcctctagg gtgaccgtttggtgccgccacc (SEQ ID NO: 4);

[0017] v) uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR compreen dendo a seguinte sequência agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccag cctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtac cgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataac cttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacag gtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgaaaacgcgcctctagagccgccacc (SEQ ID NO: 5);

[0018] vi) uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR compreen dendo a seguinte sequência agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccag cctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtac cgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataac cttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacag gtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgaaaaacgcgtgccgccacc (SEQ ID NO: 6);

[0019] vii) uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR compreen dendo a seguinte sequência agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccag cctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtac cgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataac cttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacag gtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgaaaacgcgtgccgccacc (SEQ ID NO: 7);

[0020] viii) uma sequência de polinucleotídeos compreendendo uma sequência 5 'UTR a qual é pelo menos 85%, de preferência pelo menos 90% idêntica a uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7;

[0021] c) um polinucleotídeo que codifica uma sequência líder de secreção de hCD33; e

[0022] d) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de in teresse ou um sítio de inserção para inserção de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse.

[0023] De acordo com um segundo aspecto, a presente invenção proporciona um vetor de expressão para expressar um polipeptídeo de interesse compreendendo pelo menos um cassete de expressão de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção.

[0024] De acordo com um terceiro aspecto, a presente invenção proporciona uma célula hospedeira eucariota que compreende pelo menos um cassete de expressão de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção e/ou pelo menos um vetor de expressão de acordo com o segundo aspecto da presente invenção.

[0025] De acordo com um quarto aspecto, a presente invenção proporciona um método para produzir a célula hospedeira de acordo com o terceiro aspecto da presente invenção, em que um vetor de expressão de acordo com o segundo aspecto da presente invenção é introduzido em uma célula hospedeira eucariota.

[0026] De acordo com um quinto aspecto, a presente invenção proporciona um método para produzir um polipeptídeo de interesse, o dito método compreendendo cultura de células hospedeiras de acordo com o terceiro aspecto da presente invenção em uma cultura de células sob condições que permitam a expressão do dito polipeptídeo de interesse.

[0027] De acordo com um sexto aspecto, a presente invenção se refere ao uso de uma sequência 5 'UTR em combinação com uma sequência líder de secreção de hCD33 em um cassete de expressão para expressar um polipeptídeo de interesse com um rendimento elevado a partir do dito cassete de expressão, em que a dita sequência de po- linucleotídeos 5'UTR é selecionada do grupo que consiste em

[0028] i) uma sequência de polinucleotídeos que compreende a sequência 5 'UTR agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccag cctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtac cgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataac cttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacag gtgtccactcccaggtccaactgca (SEQ ID NO: 1);

[0029] ii) uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR compreen dendo a seguinte sequência agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccag cctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtac cgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataac cttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacag gtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcg (SEQ ID NO: 2);

[0030] iii) uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR compreen dendo a seguinte sequência agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccag cctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtac cgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataac cttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacag gtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgaaaacgcgtccacc (SEQ ID NO: 3);

[0031] iv) uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR compreen dendo a seguinte sequência agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccag cctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtac cgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataac cttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacag gtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgcgattgaattccccggggatcctctagg gtgaccgtttggtgccgccacc (SEQ ID NO: 4);

[0032] v) uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR compreen dendo a seguinte sequência agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccag cctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtac cgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataac cttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacag gtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgaaaacgcgcctctagagccgccacc (SEQ ID NO: 5);

[0033] vi) uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR compreen dendo a seguinte sequência agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccag cctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtac cgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataac cttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacag gtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgaaaaacgcgtgccgccacc (SEQ ID NO: 6);

[0034] vii) uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR compreen dendo a seguinte sequência agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccag cctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtac cgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataac cttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacag gtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgaaaacgcgtgccgccacc (SEQ ID NO: 7);

[0035] viii) uma sequência de polinucleotídeos compreendendo uma sequência 5 'UTR, que é pelo menos 85%, de preferência pelo menos 90% idêntica a uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7.

[0036] Outros objetivos, características, vantagens e aspectos do presente pedido se tornarão evidentes para aqueles versados na técnica a partir da descrição a seguir e reivindicações anexas. Deverá ser entendido, no entanto, que a descrição a seguir, reivindicações anexas e exemplos específicos, embora indicando modalidades preferidas do pedido, são fornecidos apenas a título de ilustração. Várias alterações e modificações dentro do espírito e âmbito da invenção descrita serão facilmente evidentes para aqueles versados na técnica a partir da leitura a seguir.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0037] A presente invenção proporciona um cassete de expressão para expressão de um polipeptídeo de interesse que compreende uma nova combinação de elementos genéticos, ou seja, uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR específica e a sequência líder de secreção de hCD33. Esta combinação específica de elementos genéticos resulta em um aumento significativo na eficiência de expressão do polipeptí- deo codificado de interesse.

[0038] Além disso, descobriu-se que o processamento da sequên cia líder pode ser melhorado, de modo que extensões ou truncamentos de sequência indesejados (também conhecidos como "corte") em virtude de processamento errôneo da sequência líder podem ser reduzidos.

[0039] De acordo com um primeiro aspecto, é fornecido um casse te de expressão para expressão de um polipeptídeo de interesse que compreende:

[0040] a) um promotor

[0041] b) uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR, em que a dita sequência de polinucleotídeos 5'UTR é selecionada do grupo que consiste em

[0042] i) uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR compreen dendo a seguinte sequência agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccag cctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtac cgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataac cttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacag gtgtccactcccaggtccaactgca (SEQ ID NO: 1);

[0043] ii) uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR compreen dendo a seguinte sequência agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccag cctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtac cgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataac cttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacag gtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcg (SEQ ID NO: 2);

[0044] iii) uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR compreen dendo a seguinte sequência agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccag cctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtac cgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataac cttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacag gtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgaaaacgcgtccacc (SEQ ID NO: 3);

[0045] iv) uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR compreen dendo a seguinte sequência agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccag cctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtac cgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaagcggctacaattaatacataacct tatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacaggt gtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgcgattgaattccccggggatcctctagggt gaccgtttggtgccgccacc (SEQ ID NO: 4);

[0046] v) uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR compreen dendo a seguinte sequência agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccag cctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtac cgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataac cttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacag gtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgaaaacgcgcctctagagccgccacc (SEQ ID NO: 5);

[0047] vi) uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR compreen dendo a seguinte sequência agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccag cctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtac cgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataac cttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacag gtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgaaaaacgcgtgccgccacc (SEQ ID NO: 6);

[0048] vii) uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR compreen dendo a seguinte sequência agatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccag cctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtac cgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcgttagaacgcggctacaattaatacataac cttatgtatcatacacatacgatttaggtgacactatagaataacatccactttgcctttctctccacag gtgtccactcccaggtccaactgcacctcggttctatcgaaaacgcgtgccgccacc (SEQ ID NO: 7);

[0049] viii) uma sequência de polinucleotídeos compreendendo uma sequência 5 'UTR que é pelo menos 85%, de preferência pelo menos 90% idêntica a uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7;

[0050] c) um polinucleotídeo que codifica uma sequência líder de secreção de hCD33; e

[0051] d) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de in teresse ou um sítio de inserção para inserção de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse.

[0052] O termo "cassete de expressão", conforme usado aqui se refere, em particular, a um segmento de DNA que é capaz, em uma configuração apropriada, de dirigir a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse que é incorporado no dito cassete de expressão. Quando introduzido em uma célula hospedeira, um cassete de expressão é, inter alia, capaz de dirigir a maquinaria da célula para transcrever um polinucleotídeo que codifica um polipeptí- deo de interesse incorporado em RNA o qual é, então, ainda processado normalmente e finalmente traduzido para o polipeptídeo de interesse. O cassete de expressão pode estar compreendido em um vetor de expressão, conforme será descrito em maiores detalhes abaixo. Os elementos individuais do cassete de expressão de acordo com a presente invenção são subsequentemente explicados em detalhes.

[0053] O cassete de expressão de acordo com a presente inven ção compreende, como elemento a) um promotor. O termo "promotor", conforme usado aqui se refere, em particular, a um elemento de DNA que facilita a transcrição de um polinucleotídeo ao qual o promotor está operativamente ligado. O promotor também pode fazer parte de um elemento promotor/intensificador. Embora os limites físicos entre os elementos "promotor" e "intensificador" nem sempre sejam claros, o termo "promotor" se refere, em geral, a um local na molécula de ácido nucleico ao qual uma RNA polimerase e/ou quaisquer fatores associados se ligam e no qual a transcrição é iniciada. Intensificadores potencializam a atividade do promotor, tanto temporal quanto espacialmente. Muitos promotores são conhecidos no estado da técnica os quais são transcricionalmente ativos em uma ampla variedade de tipos de células. Os promotores podem ser divididos em duas classes, aqueles que funcionam de forma constitutiva e aqueles que são regulados por indução ou desrepressão. Ambas as classes são adequadas para expressão de proteínas. Os promotores que são usados para produção de alto nível de polipeptídeos em células eucariotas e, em particular, células de mamíferos deverão ser fortes e, de preferência, deverão ser ativos em uma ampla variedade de tipos de células. Promotores constitutivos fortes que são capazes de dirigir a expressão em diversos tipos de células são bem conhecidos no estado da técnica e, portanto, não requerem descrição detalhada aqui. De preferência, um promotor de citomegalovírus (CytoMegaloVirus - CMV) é usado de acordo com os ensinamentos da presente invenção. Um promotor ou promo- tor/intensificador derivado da região imediata precoce (Immediate Early - IE) do citomegalovírus humano (hCMV) é particularmente apropriado como promotor no cassete de expressão de acordo com a presente invenção. A região imediata precoce (IE) do citomegalovírus humano (hCMV) e fragmentos promotores de expressão funcionais e/ou fragmentos de intensificação de expressão funcionais derivados do mesmo são, por exemplo, descritos nos documentos EP 0 173 177 e EP 0 323 997 e são também bem conhecidos no estado da técnica. Assim, vários fragmentos da região imediata precoce (IE) de hCMV podem ser usados como promotor e/ou promotor/intensificador. De acordo com uma modalidade, um promotor de CMV humano é usado no cassete de expressão de acordo com a presente invenção. O termo "um promotor de CMV humano", conforme usado aqui se refere, em particular, a um promotor que é derivado da região imediata precoce (IE) de hCMV.

[0054] De acordo com uma modalidade, um promotor de CMV humano o qual é usado é selecionado do grupo que consiste em:

[0055] a) um promotor compreendendo a seguinte sequência tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc tcgtttagtg aaccgtc (SEQ ID NO: 8);

[0056] ou um fragmento funcional do mesmo que funciona como promotor;

[0057] b) um promotor que compreende uma sequência que é pelo menos 80%, de preferência pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 97%, mais preferivelmente pelo menos 99% idêntica à sequência mostrada em SEQ ID NO: 8 ou um fragmento funcional da mesma que funciona como promotor.

[0058] A identidade % pode ser calculada ao longo de todo o com primento da sequência de referência.

[0059] Descobriu-se que um respectivo promotor funciona particu larmente bem em combinação com a sequência de polinucleotídeos 5'UTR específica selecionada do grupo acima e a sequência sinalizadora de hCD33, conforme é ensinado pela presente invenção.

[0060] O cassete de expressão de acordo com a presente inven ção compreende ainda, como elemento b), uma sequência de polinu- cleotídeos 5'UTR (região não traduzida cinco linha) específica. O termo "uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR", conforme usado aqui se refere, em particular, a uma sequência de DNA que é transcrita em mRNA, mas não é subsequentemente traduzida em um polipeptídeo. Uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR geralmente começa no sítio de início de transcrição e termina antes do códon inicial da região de codificação real. No cassete de expressão de acordo com a presente invenção, a sequência de polinucleotídeos 5'UTR termina antes que o polinucleotídeo de codificação da sequência líder de secreção de hCD33 seja iniciado.

[0061] A sequência de polinucleotídeos 5'UTR usada no cassete de expressão de acordo com a presente invenção compreende, de preferência, a sequência apresentada em SEQ ID NO: 1. Uma respectiva sequência de polinucleotídeos 5'UTR é descrita no documento WO 2009/080720.

[0062] De acordo com uma modalidade, a sequência de polinucle- otídeos 5'UTR compreende uma sequência selecionada dentre as sequências SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 ou compreende uma sequência selecionada dentre as sequências SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7. A sequência 5 'UTR que é mostrada em SEQ ID NO: 1 é uma sequência de consenso que também está compreendida nas sequências 5'UTR mostradas como SEQ ID NO: 2, 3 e 4, bem como nas sequências 5'UTR mostradas como SEQ ID NO: 5, 6 e 7. De preferência, a sequência 5'UTR que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 3 é usada para expressar a cadeia leve de um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo e a sequência 5'UTR que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 4 é usada para expressar a cadeia pesada de um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo. A sequência 5'UTR que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 5 é, de acordo com uma modalidade, usada para expressão da cadeia leve de um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo. SEQ ID NO: 5 também pode ser usada, por exemplo, para expressão de uma nanocorpo como modalidade exemplificativa. A sequência 5 'UT que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 6 é, de acordo com uma modalidade, usada para expressar a cadeia pesada de um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo. A sequência 5'UTR que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 7 é, de acordo com uma modalidade, usada para expressão da cadeia pesada de um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo. Ela também foi testada nos exemplos.

[0063] Descobriu-se que a 5'UTR que é usada de acordo com a presente invenção é composta de vários elementos e compreende um íntron que flanqueia a sequência da região 5', um íntron e um íntron que flanqueia a sequência da região 3'. O íntron e regiões de flanque- amento intrônicas compreendidos na dita 5'UTR se originam da cadeia pesada de IgG de camundongo (vide, por exemplo, Eaton et al., 1986, Biochemistry 25, 8343-8347, Neuberger et al., 1983, EMBO J. 2 (8), 1373-1378; ela pode ser obtida a partir do vetor pRK-5 (BD PharMin- gen)). A tabela a seguir ilustra as fronteiras putativas dos ditos elementos que estão compreendidos na 5'UTR que pode ser usada de acordo com a presente invenção:

[0064] Além disso, pode ser usada uma sequência de polinucleotí- deos 5'UTR que compreende uma sequência que é pelo menos 85%, de preferência pelo menos 90%, de preferência pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 98%, mais preferivelmente pelo menos 99% idêntica à sequência mostrada em SEQ ID NOs 1, 2, 3 ou 4 ou à sequência mostrada em SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7. A identidade pode ser calculada ao longo de todo o comprimento da sequência 5'UTR de referência.

[0065] Em numerosos experimentos, os inventores descobriram que as ditas sequências de polinucleotídeos 5'UTR em particular têm, em combinação com a sequência sinalizadora de hCD33, os efeitos vantajosos descritos acima sobre o rendimento de expressão, o qual é substancialmente aumentado comparado com os cassetes de expressão do estado da técnica.

[0066] O cassete de expressão de acordo com a presente inven ção compreende ainda, como elemento c), um polinucleotídeo que codifica uma sequência líder de secreção de hCD33. CD33 humana é um membro de receptores inibidores de lectina de tipo imunoglobulina de ligação ao ácido siálico. CD33 é uma glicoproteína transmembrana de 67 kDa e é expressa especificamente na linhagem mieloide. O termo "um polinucleotídeo que codifica uma sequência líder de secreção de hCD33", conforme usado aqui se refere, em particular, a um polinu- cleotídeo que codifica uma sequência líder de secreção compreendendo a sequência líder de secreção de hCD33. Assim, quando de transcrição e subsequente tradução, uma sequência líder de secreção é obtida, a qual compreende e, de preferência, consiste em uma se-quência líder de secreção de hCD33. A dita sequência líder de secreção tem o efeito de que um polipeptídeo de interesse fundido à mesma é eficientemente secretado a partir da célula hospedeira. A sequência líder de secreção é clivada durante biossíntese. Conforme discutido acima, surpreendentemente, os inventores descobriram que a combinação específica da sequência de polinucleotídeos 5'UTR descrita acima com uma sequência líder de secreção de hCD33 resulta em um aumento notável de expressão do polipeptídeo. Assim, a combinação de acordo com a presente invenção é superior a outras combinações que usam a mesma 5'UTR em conjunto com outras sequências líderes de secreção as quais não compreendem uma sequência líder de se-creção de hCD33 mas, por exemplo, uma sequência líder de secreção de imunoglobulina, conforme é descrito no documento WO2009/080720. De acordo com uma modalidade, a sequência líder de secreção de hCD33 usada no cassete de expressão de acordo com a presente invenção compreende a seguinte sequência de aminoáci- dos: MPLLLLLPLLWAGALA (SEQ ID NO: 12)

[0067] Diferentes sequências de aminoácidos são descritas na lite ratura para a sequência líder de secreção de hCD33. A maioria dos documentos descrevem a sequência líder de secreção de hCD33 como consistindo na seguinte sequência de aminoácidos: MPLLLLLPLLWAGALAMD (SEQ ID NO: 13).

[0068] Conforme se torna evidente, SEQ ID NO: 13 compreende dois aminoácidos adicionais na extremidade 3' em relação à SEQ ID NO: 12. De acordo com uma modalidade, o polinucleotídeo que codifica uma sequência líder de secreção de hCD33 codifica uma sequência líder de secreção que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13. No entanto, é preferido usar a sequência líder de secreção de hCD33 mais curta mostrada em SEQ ID NO: 12. Acredita-se que a sequência sinalizadora ligeiramente mais curta aumente a probabilidade de clivagem correta por peptidases, permita processamento correto e, deste modo, assegure a qualidade do produto. Uso da sequência líder de secreção de CD33 mais longa mostrada em SEQ ID NO: 13 poderia apresentar o risco de que o poli- peptídeo de interesse traga aminoácidos adicionais em seu N-término após a sequência líder de secreção ser clivada, o que é inaceitável, em particular quando de expressão de polipeptídeos farmacêuticos. Este risco é evitado quando se usa a sequência líder de secreção de hCD33 mostrada em SEQ ID NO: 12. Além disso, a sequência mais curta é aparentemente mais eficiente para secreção em virtude de uma melhor distribuição de carga, em particular quando usada em combinação com a sequência de polinucleotídeos 5'UTR de acordo com a presente invenção. Assim, de preferência, o polinucleotídeo codifica uma sequência líder de secreção de hCD33 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 12.

[0069] No cassete de expressão, o promotor (elemento a)) está localizado 5' da sequência de polinucleotídeos 5'UTR (elemento b) a qual, por sua vez, está localizada 5' do polinucleotídeo que codifica a sequência líder de secreção de hCD33 (elemento c)). Os ditos elementos estão operativamente ligados no cassete de expressão a fim de permitir uma expressão eficiente de um polipeptídeo de interesse se um polinucleotídeo que codifica um respectivo polipeptídeo de interesse é inserido no dito inserido no dito cassete de expressão.

[0070] O cassete de expressão de acordo com a presente inven ção é "adequado para expressão de um polipeptídeo de interesse". Este termo descreve, em particular, um polipeptídeo que é expresso a partir do dito cassete de expressão se um polinucleotídeo que codifica o dito polipeptídeo é inserido no dito cassete de expressão. Assim, de acordo com uma modalidade, o cassete de expressão de acordo com a presente invenção compreende, como elemento d), um polinucleotí- deo que codifica um polipeptídeo de interesse. Assim, o dito polinucle- otídeo compreende a região codificadora do polipeptídeo de interesse. De preferência, o dito polinucleotídeo é ou é derivado de um cDNA. De preferência, o dito polinucleotídeo não compreende uma sequência líder de secreção adicional. O dito polinucleotídeo que codifica o poli- peptídeo de interesse está localizado 3' do polinucleotídeo que codifica a sequência líder de secreção de hCD33 de modo que, quando de expressão, um polipeptídeo de fusão é obtido, o qual compreende a sequência líder de secreção de hCD33 e o polipeptídeo de interesse. A 5'UTR e a sequência líder de secreção que são usadas no cassete de expressão de acordo com a presente invenção são heterólogas ao po- linucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse, isto é, elas não estão naturalmente associadas ao dito polinucleotídeo. A expressão do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse está sob o controle pós-transcricional da dita 5'UTR e da dita sequência líder de secreção que compreende e, de preferência, consiste na sequência líder de hCD33.

[0071] De acordo com uma modalidade alternativa, o cassete de expressão compreende um sítio de inserção para inserção de um poli- nucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse, no entanto, ainda não compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptí- deo de interesse. O dito sítio de inserção está localizado 3' do polinu- cleotídeo que codifica a sequência líder de secreção de hCD33. Para esta finalidade, o cassete de expressão pode, por exemplo, compreender um sítio de clonagem múltipla (Multiple Cloning Site - MCS) o qual pode, por exemplo, ser usado em todos os quadros de leitura. Um respectivo cassete de expressão "vazio" que compreende um sítio de inserção pode ser usado para inserção de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse desejado. Isto tem a vantagem de que um cliente pode inserir um polinucleotídeo que codifica um poli- peptídeo desejado no dito sítio de inserção, deste modo, concluindo o cassete de expressão. Quando de expressão, o polipeptídeo desejado fundido à sequência líder de secreção de acordo com a presente invenção é expresso a partir do dito cassete de expressão concluído e secretado. Assim, um respectivo cassete de expressão "vazio" constitui uma ferramenta útil para expressão de diferentes polipeptídeos de interesse, uma vez que o cassete de expressão pode ser facilmente adaptado ao uso pretendido simplesmente através da inserção do po- linucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse desejado no sítio de inserção.

[0072] Além disso, o cassete de expressão pode compreender um sítio de término de transcrição adequado. Sítios de término de trans- crição são bem caracterizados no estado da técnica e foi mostrado que sua incorporação em cassetes de expressão tem múltiplos efeitos benéficos sobre a expressão do gene. Conforme será descrito abaixo em maiores detalhes, o cassete de expressão de acordo com a presente invenção se destina, em particular, à expressão de um polipeptí- deo de interesse em uma célula hospedeira eucariota. A maioria dos mRNAs eucariotas nascentes possuem uma cauda poli A em sua ex-tremidade 3', a qual é adicionada durante um processo complexo que envolve clivagem do transcrito primário e uma reação de poliadenila- ção acoplada. A cauda poli A é, inter alia, vantajosa para estabilidade do mRNA. Consequentemente, o cassete de expressão compreende, de preferência fornece respectivamente, um sítio de poliadenilação adequado para término de transcrição e poliadenilação. Há vários sinais poliA eficientes que podem ser usados em cassetes de expressão que são destinados à expressão em células eucariotas, incluindo aqueles derivados de hormônio de crescimento bovino (bovine growth hormone - bhg), beta-globina de camundongo, a unidade de transcrição precoce de SV40 e o gene de quinase de timidina do vírus Herpes simplex. No entanto, também os sítios de poliadenilação sintéticos são conhecidos (vide, por exemplo, o vetor de expressão pCI-neo da Pro- mega que se baseia em Levitt et al., 1989, Genes Dev. 3, (7): 10191025). Assim, o sítio de poliadenilação que é usado no cassete de expressão de acordo com a presente invenção pode ser selecionado do grupo que consiste no sítio poli A de SV40, tal como o sítio poli A tardio e precoce de SV40 (vide, por exemplo, o plasmídeo pSV2-DHFR, conforme descrito em Subramani et al., 1981, Mol. Cell Biol. 854-864), um sítio poliA sintético (vide, por exemplo, o vetor de expressão pCI- neo da Promega que se baseia em Levitt et al., 1989, Genes Dev. 3, (7): 1019-1025) e um sítio poli A de bgh (hormônio de crescimento bovino). O sítio de término de transcrição pode ser fornecido junto com o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse ou pode ser fornecido como elemento separado no cassete de expressão.

[0073] Assim, de acordo com uma modalidade, o cassete de ex pressão compreende ainda uma sequência 3'UTR como elemento e). A região não traduzida três linha (3'UTR) segue a região codificadora e compreende elementos reguladores. Os elementos que podem ser compreendidos na dita 3'UTR incluem, porém sem limitações, sítios de ligação para proteínas e/ou moléculas que induzem a RNAi, tais como miRNAs. De acordo com uma modalidade, uma 3'UTR compreendendo a sequência a seguir é usada: gggcggccgcttccctttagtgagggttaatgcttcgag (SEQ ID NO: 14).

[0074] Além disso, o cassete de expressão pode compreender um sinal de poliadenilação como elemento f). Sítios de poliadenilação adequados são descritos acima. De acordo com uma modalidade, é usado um sítio poli A que compreende a seguinte sequência: cagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatg ctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaa caacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggagatgtgggaggttttttaaagcaagtaaaa cctctacaaatgtggta (SEQ ID NO: 15).

[0075] De acordo com uma de preferência um promotor de CMV humano ou um promotor derivado do promotor de CMV humano;

[0076] a) um promotor, preferivelmente um promotor CMV humano ou um promotor derivado a partir do promotor CMV humano;

[0077] b) uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR selecionada do grupo que consiste de uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR compreendendo SEQ ID NO: 1, uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR que compreende SEQ ID NO: 2, uma sequência de polinucleo- tídeos 5'UTR que compreende SEQ ID NO: 3, uma sequência de poli- nucleotídeos 5'UTR que compreende SEQ ID NO: 4, uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR que compreende SEQ ID NO: 5, uma se- quência de polinucleotídeos 5'UTR que compreende SEQ ID NO: 6, uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR que compreende SEQ ID NO: 7 e uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR que compreende uma sequência que é pelo menos 85%, de preferência pelo menos 90% idêntica à sequência mostrada em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7;

[0078] c) um polinucleotídeo que codifica uma sequência líder de secreção de hCD33;

[0079] d) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de in teresse ou um sítio de inserção para inserção de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse;

[0080] e) uma sequência de polinucleotídeos 3'UTR; e

[0081] f) um sítio poli A.

[0082] Conforme descrito, a identidade % pode ser calculada ao longo de todo o comprimento da sequência de referência. Conforme discutido acima e conforme é mostrado nos exemplos, o cassete de expressão de acordo com a presente invenção resulta em um aumento da expressão do polipeptídeo de interesse. Um "polipeptídeo" se refere a uma molécula compreendendo um polímero de aminoácidos ligados entre si por uma ligação(ões) peptídica(s). Os polipeptídeos incluem polipeptídeos de qualquer comprimento, incluindo proteínas (por exemplo, tendo mais de 50 aminoácidos) e peptídeos (por exemplo, tendo 2-49 aminoácidos). Os polipeptídeos incluem proteínas e/ou peptídeos de qualquer atividade ou bioatividade. O polipeptídeo que está sendo produzido pode ser um composto farmacêutica ou terapeu- ticamente ativo ou uma ferramenta de pesquisa a ser usada em ensaios e assim por diante. Um polipeptídeo, consequentemente, não está limitado a qualquer polipeptídeo ou grupo de polipeptídeos em particular, mas pode, pelo contrário, ser qualquer polipeptídeo, de qualquer tamanho, função ou origem, que se deseja selecionar e/ou expressar por meio dos métodos descritos aqui. Portanto, vários polipeptídeos de interesse diferentes podem ser expressos a partir do cassete de expressão de acordo com a presente invenção e/ou as células hospedeiras de acordo com a presente invenção. Conforme descrito acima, o termo polipeptídeo inclui proteínas e/ou peptídeos de qualquer atividade ou bioatividade, por exemplo, incluindo polipeptídeos bioativos, tais como peptídeos ou proteínas enzimáticas (por exemplo, proteases, quinases, fosfatases), proteínas ou peptídeos de receptor, proteínas ou peptídeos transportadores, proteínas bactericidas e/ou de ligação à endotoxina, proteínas ou peptídeos estruturais, polipeptídeos imunes, imunoglobulinas, toxinas, antibióticos, hormônios, fatores de crescimento, vacinas ou similar. O dito polipeptídeo pode ser selecionado do grupo que consiste em hormônios peptídicos, interleucinas, ativadores de plasminogênio tecidual, citocinas, imunoglobulinas, em particular anticorpos ou fragmentos funcionais ou derivados dos mesmos e anticorpos com um único domínio, também ditos como nanocorpos. De acordo com uma modalidade, o polipeptídeo de interesse é glicosilado. O polipeptídeo de interesse que é expresso a partir do cassete de expressão de acordo com a presente invenção pode também ser uma subunidade ou domínio de um dos polipeptídeos precedentes tal como, por exemplo, uma cadeia pesada ou uma cadeia leve de um anticorpo ou um fragmento funcional ou derivado do mesmo. Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo de interesse é uma molécula de imunoglobulina, mais preferivelmente um anticorpo ou uma subunida- de ou domínio do mesmo tal como, por exemplo, a cadeia pesada ou leve de um anticorpo ou um anticorpo com um único domínio. Também estão incluídos fragmentos ou derivados funcionais dos precedentes ou uma subunidade ou domínio dos precedentes tal como, por exemplo, uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo ou um fragmento fun- cional ou derivado do mesmo. De acordo com uma modalidade, o poli- peptídeo de interesse não é hCD33.

[0083] O termo "anticorpo", conforme usado aqui, se refere parti cularmente a uma proteína que compreende pelo menos duas cadeias pesadas e duas cadeias leves ligadas por ligações de dissulfureto. O termo "anticorpo" inclui anticorpos que ocorrem naturalmente, bem como todas as formas recombinantes de anticorpos, por exemplo, anticorpos humanizados, anticorpos totalmente humanos e anticorpos quiméricos. Cada cadeia pesada é, em geral, compreendida de uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região constante de cadeia pesada (CH). Cada cadeia leve é, em geral, compreendida de uma região variável de cadeia leve (VL) e uma região constante de cadeia leve (CL). A região constante de cadeia pesada compreende três ou - no caso de anticorpos de tipo IgE ou IgM - quatro domínios constantes de cadeia pesada (CH1, CH2, CH3 e CH4), em que o pri-meiro domínio constante CH1 é adjacente à região variável e pode estar ligado ao segundo domínio constante CH2 por uma região de dobradiça. A região constante de cadeia leve consiste apenas em um domínio constante. As regiões variáveis podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, designadas regiões determinantes de complementaridade (Complementarity Determining Region - CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de "framework" (FR), em que cada região variável compreende três CDRs e quatro FRs. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imu- noglobulina a tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetuadoras) e o primeiro componente (C1q) do sistema de complemento clássico. O termo "anticorpo", de acordo com a invenção, no entanto, também inclui outros tipos e variantes de anticorpos, tais como anticorpos de cadeia pesada, isto é, anticorpos compostas apenas de uma ou mais, em particular duas cadeias pesadas e, nanocorpos, isto é, anticorpos compostos apenas de um único domínio variável monomérico. Tais nanocorpos também podem ser ligados para formar estruturas multivalentes. De preferência, o anticorpo é, quando de expressão na célula hospedeira apropriada, glicosilado. Conforme discutido acima, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse podem também codificar uma ou mais subunidades ou domínios de um anticorpo, por exemplo, uma cadeia leve ou uma pesada ou um fragmento ou derivado funcional, como polipeptídeo de interesse.

[0084] Um anticorpo com um único domínio, também dito como nanocorpo, é um fragmento de anticorpo que consiste em um único domínio variável de anticorpo monomérico. Assim como um anticorpo inteiro, ele é capaz de se ligar seletivamente a um antígeno específico. Com um peso molecular de apenas 12-15 kDa, anticorpos com um único domínio são muito menores do que anticorpos comuns (150-160 kDa), os quais são compostos de duas cadeias pesadas e duas cadeias leves de proteína, e ainda menores do que fragmentos Fab e fragmentos variáveis com uma única cadeia. Os primeiros anticorpos com um único domínio foram manipulados a partir de anticorpos de cadeias pesadas encontrados em camelídeos; estes são denominados fragmentos VHH. Anticorpos de cadeia pesada também são encontrados em outras espécies. Uma abordagem alternativa é dividir os domínios variáveis diméricos de imunoglobulina comum G (IgG) de seres hu-manos ou camundongos em monômeros. Embora a maioria das pesquisas em anticorpos com um único domínio se baseiem atualmente em domínios variáveis de cadeia pesada, também foi mostrado que nanocorpos derivados de cadeias leves se ligam especificamente a epítopos alvo. Proteínas de anticorpos obtidos de membros da família dos camelos e dromedários (Camelus bactrianus e Camelus dromade- rius), incluindo membros do novo mundo, tal como espécies de lhama (Lama paccos, Lama glama e Lama vicugna) foram caracterizados quanto ao tamanho, complexidade estrutural e antigenicidade para seres humano. Determinados anticorpos de IgG desta família de mamíferos, conforme encontrado na natureza, possuem cadeias leves e são, assim, estruturalmente distintos da estrutura quaternária de quatro cadeias típica tendo duas pesadas e duas cadeias leves para anticorpos de outros animais (vide documento WO94/04678). A região do anticorpo de camelídeo a qual é o pequeno domínio variável único identificada como VHH pode ser obtida por engenharia genética para proporcionar uma pequena proteína que tem alta afinidade por um alvo, resultando em uma proteína derivada de anticorpo de baixo peso molecular conhecida como um "nanocorpo de camelídeo" (vide documento US 5.759.808; Stijlemans, B. et al., 2004 J. Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. et al. 2003, Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. et al. 2002, Int J Cancer 89: 456-62; e Lauwereys, M. et al. 1998, EMBO J. 17: 3512-3520). Bibliotecas manipuladas de anticorpos e fragmentos de anticorpos de camelídeo estão comercialmente disponíveis. Tal como acontece com outros anticorpos de origem não humana, uma sequência de aminoácidos de um anticorpo de camelídeo pode ser recombinantemente alterada para se obter uma sequência que se assemelha mais a uma sequência humana, ou seja, o nanocorpo pode ser "humanizado". Os respectivos anticorpos com um único domínio podem também ser expressos usando os ensinamentos da presente invenção. Além disso, conforme descrito, anticorpos com um único domínio também podem ser ligados para formar estruturas multivalentes. Os respectivos nanocorpos multiméricos também podem ser expressos usando os ensinamentos da presente invenção. De acordo com uma modalidade, um nanocorpo multimérico é expresso a partir de um único cassete de expressão.

[0085] Um "fragmento funcional ou derivado" de um anticorpo se refere, em particular, a uma proteína ou glicoproteína que é derivada de um anticorpo e que é capaz de se ligar ao mesmo antígeno, em particular ao mesmo epítopo que o anticorpo. O mesmo se aplica, mu- tatis mutandis, a um fragmento ou derivado de uma molécula de imu- noglobulina, uma cadeia pesada ou uma cadeia leve. Foi mostrado que a função de ligação a antígeno de um anticorpo pode ser desempenha por fragmentos de um anticorpo de comprimento total ou derivados do mesmo. Exemplos de fragmentos ou derivados de um anticorpo incluem (i) fragmentos Fab, fragmentos monovalentes que consistem na região variável e no primeiro domínio constante de cada uma da cadeia pesada e da cadeia leve; (ii) fragmentos F(ab)2, fragmentos bivalentes que compreendem dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfureto na região de dobradiça; (iii) fragmentos Fd, fragmentos os quais consistem na região variável e no primeiro domínio constante CH1 de cadeia pesada; (iv) fragmentos Fv, os quais consistem nas regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve de um único braço de um anticorpo; (v) fragmentos de scFv, fragmentos Fv os quais consistem em uma única cadeia polipeptídica; (vi) fragmentos (Fv)2, os quais consistem em dois fragmentos Fv covalentemente ligados entre si; (vii) um domínio variável de cadeia pesada; e (viii) multi- corpos, os quais consistem em uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve covalentemente ligadas juntas, de modo que a associação das regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve pode ocorrer apenas intramolecularmente, mas não in- tramolecularmente. Estes fragmentos de anticorpo e derivados podem ser obtidos usando métodos convencionais conhecidos por aqueles versados na técnica.

[0086] Como se torna evidente a partir dos exemplos descritos acima de polipeptídeos que podem ser expressos de acordo com os ensinamentos da presente invenção, o polipeptídeo final que está sendo produzido e secretado pela célula hospedeira pode também ser uma proteína dimérica ou multimérica. Um exemplo preferido de uma respectiva proteína é uma molécula de imunoglobulina, em particular um anticorpo que compreende, por exemplo, cadeias pesadas e leves. Há várias opções para produzir uma respectiva proteína dimérica ou multimérica.

[0087] De acordo com uma modalidade, duas ou mais subunida- des ou domínios da dita proteína dimérica ou multimérica são expressos a partir de um cassete de expressão de acordo com a presente invenção. Nesta modalidade, um transcrito longo é obtido a partir do respectivo cassete de expressão que compreende as regiões de codificação das subunidades ou domínios individuais da proteína dimérica ou multimérica. De acordo com uma modalidade, pelo menos um elemento IRES (Internal Ribosome Entry Site - sítio de entrada ribossômi- ca interno) está funcionalmente localizado entre as regiões de codificação das subunidades ou domínios individuais e cada região de codificação é precedida por uma sequência líder de secreção de hCD33, conforme descrito acima. Deste modo, é assegurado que produtos de tradução separados são obtidos a partir da dita transcrição e que a proteína dimérica ou multimérica final pode ser montada e secretada corretamente. Além disso, também nanocorpos multiméricos podem ser expressos a partir de um único cassete de expressão.

[0088] No entanto, também está dentro do âmbito da presente in venção e, para algumas modalidades, é ainda preferido, expressar as subunidades ou domínios individuais de uma proteína dimérica ou mul- timérica a partir de diferentes cassetes de expressão. De acordo com uma modalidade, o cassete de expressão de acordo com a presente invenção é um cassete de expressão monocistrônico. Nesta modalidade, cada cassete de expressão compreende um polinucleotídeo que codifica uma subunidade ou domínio da proteína dimérica ou multimé- rica como polipeptídeo de interesse. De acordo com uma modalidade, todos estes cassetes de expressão são concebidos de acordo com os ensinamentos da presente invenção. No entanto, está também dentro do âmbito da presente invenção o uso de diferentes modelos para diferentes cassetes de expressão. Após expressão das subunida- des/domínios individuais a partir dos cassetes de expressão individuais, a proteína dimérica ou multimérica final é montada e secretada pela célula hospedeira. Esta modalidade será explicada maiores detalhes em conjunto com o vetor de expressão de acordo com a presente invenção.

[0089] De acordo com uma modalidade preferida, o polinucleotí- deo que codifica o polipeptídeo de interesse codifica o polipeptídeo de interesse como cadeia a pesada ou leve de uma molécula de anticorpo ou um fragmento funcional ou derivado do mesmo.

[0090] De acordo com uma modalidade, o cassete de expressão de acordo com a presente invenção já compreende um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma parte de uma região constante de uma molécula de imunoglobulina. O polinucleotídeo que codifica uma parte variável correspondente da molécula de imunoglobulina pode, então, ser inserido pelo usuário/cliente no cassete de expressão por meio de estratégias de clonagem apropriadas, a fim de concluir o cassete de expressão.

[0091] O cassete de expressão pode compreender elementos adi cionais que podem ser usados para aliviar e/ou melhorar a seleção de células hospedeiras de alta expressão. Um método de seleção estabelecido conhecido no estado da técnica para seleção de células hospedeiras que expressam o polipeptídeo de interesse com um rendimento elevado se baseia no uso de citometria de fluxo, em particular de seleção de células ativada por fluorescência (Fluorescence Activated Cell Sorting - FACS). Métodos de seleção que empregam citometria de fluxo têm a vantagem de que um grande número de células podem ser rastreadas rapidamente. Em um método de seleção que é particularmente útil para identificar clones de células produtores de elevado rendimento, uma porção do produto de interesse, por exemplo, um anticorpo, é expressa como polipeptídeo de fusão ligado à membrana. Deste modo, uma porção do produto é exibida como polipeptídeo de fusão sobre a superfície celular. Uma vez que a quantidade de poli- peptídeo de fusão produzido se correlaciona com a taxa de expressão, em geral, as células hospedeiras podem ser selecionadas por meio de citometria de fluxo com base na quantidade de polipeptídeo de fusão exibido sobre a superfície celular. Isto permite seleção rápida de células hospedeiras produtoras de elevado rendimento. O cassete de expressão de acordo com a presente invenção pode, vantajosamente, ser adaptado de modo que ele possa ser usado em um respectivo método de seleção que se baseia no uso de citometria de fluxo. Para permitir seleção eficiente usando citometria de fluxo, de preferência FACS, um cassete de expressão especial pode ser usado para expressar o polipeptídeo de interesse. Assim, de acordo com uma modalidade, o cassete de expressão para expressão do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse é concebido de modo que uma porção do polipeptídeo de interesse expresso, de preferência menos de 10%, mais preferivelmente menos de 5% ou, ainda mais preferivelmente, menos de 2,5%, compreenda uma âncora transmembrana. Há várias opções para alcançar este resultado.

[0092] De acordo com uma modalidade, o dito cassete de expres são compreende, adicionalmente, pelo menos um códon terminal a jusante do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse e um outro polinucleotídeo a jusante do códon terminal que codifica uma âncora na membrana e/ou um sinal para uma âncora na membrana. Os respectivos elementos estão operativamente ligados. Está concepção do cassete de expressão tem o efeito de que, através de processos de tradução "read-through" (o códon terminal é "permeável"), uma porção do polipeptídeo de interesse é produzida como um polipeptídeo de fusão que compreende uma âncora na membrana. Como um resultado, este polipeptídeo de fusão é exibido sobre a superfície celular e células que exibem níveis elevados de peptídeo de fusão ancorado à membrana podem ser selecionadas por meio de citometria de fluxo, de preferência por FACS. Deste modo, são selecionadas células hospedeiras que têm uma alta taxa de expressão. Detalhes e modalidades preferidas da presente tecnologia com base em códon terminal são descritos nos documentos WO2005/073375 e WO2010/022961. Eles fazem referência à presente descrição.

[0093] De acordo com uma modalidade alternativa, o dito cassete de expressão compreende, a jusante do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse, pelo menos um íntron que compreende um sítio doador de splicing 5' e um sítio aceitador de splicing 3' e compreende um códon de término de tradução "in-frame" e um sinal de polia- denilação e um polinucleotídeo a jusante do dito íntron que codifica uma âncora na membrana e/ou um sinal para uma âncora na membrana. Os respectivos elementos estão operativamente ligados. Esta concepção do cassete de expressão tem o efeito de que, através de transcrição e processamento de transcrição, pelo menos dois mRNAs maduros diferentes (mRNA-POI) e (mRNA-POI-ANCHOR) são obtidos a partir do cassete de expressão. Tradução do mRNA-POI resulta no produto de interesse. Tradução do mRNA-POI-ANCHOR resulta em um polipeptídeo de fusão compreendendo o produto de interesse e uma âncora na membrana. Como um resultado, este polipeptídeo de fusão é novamente exibido sobre a superfície celular e células que exibem níveis elevados de polipeptídeo de fusão ancorado à membrana podem ser selecionadas por meio de citometria de fluxo, de preferência por FACS. Deste modo, são selecionadas células hospedeiras que têm uma elevada taxa de expressão. Detalhes e modalidades preferidas da presente tecnologia com base em íntrons são descritos no documento WO2007/131774. Ele faz referência à presente descrição.

[0094] De acordo com uma modalidade preferida a qual é, em parti cular, útil para expressão de anticorpos como produto de interesse, a âncora na membrana é uma âncora transmembrana de imunoglobulina. Outras âncoras na membrana adequadas e modalidades preferidas de uma âncora transmembrana de imunoglobulina são descritas nos documentos WO2007/131774, WO2005/073375 e WO2010/022961. Eles fazem referência à presente descrição.

[0095] De acordo com um segundo aspecto, a presente invenção proporciona um vetor de expressão para expressar um polipeptídeo de interesse compreendendo pelo menos um cassete de expressão de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção. O dito cassete de expressão foi descrito em detalhes acima; assim, ele faz referência à descrição acima.

[0096] Um "vetor de expressão" de acordo com a presente inven ção se refere, em particular, a um polinucleotídeo capaz de trazer pelo menos um fragmento de ácido nucleico estranho. Um vetor funciona como um veículo molecular, distribuindo fragmentos de ácidos nuclei- cos, respectivamente, polinucleotídeos, em uma célula hospedeira. Ele compreende pelo menos um cassete de expressão de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção, o qual compreende as sequências reguladoras necessárias para expressão adequada de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse incorporado no mesmo.

[0097] De acordo com uma modalidade, o vetor de expressão compreende, adicionalmente, pelo menos um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um marcador seleci- onável. O dito cassete de expressão compreende as sequências reguladoras necessárias para expressão adequada do polinucleotídeo que codifica o marcador selecionável incorporado no mesmo. Marcadores selecionáveis incluem marcadores selecionáveis que conferem às células hospedeiras eucariotas uma resistência contra agentes tóxicos ou fármacos, tais como antibióticos, em particular antibióticos de ami- noglicosídeo, por exemplo, um marcador de seleção de neomicina. Marcadores selecionáveis incluem, porém sem limitações, marcadores de seleção eucariotas, tais como di-hidrofolato redutase (DHFR) e glu- tamina sintetase (GS). Outros marcadores de seleção apropriados, tal como o receptor de ácido fólico, são descritos nos documentos WO 2009/080759 e WO 2010/097240. De preferência, o vetor de expressão compreende pelo menos um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um marcador selecionável amplifi- cável. Um marcador selecionável amplificável permite a seleção de células hospedeiras eucariotas contendo o vetor, bem como amplificação do gene. Um exemplo não limitativo de um gene marcador seleci- onável amplificável de mamífero é o gene de di-hidrofolato redutase (DHFR). Outros sistemas atualmente em uso são, dentre outros, o sistema de glutamina sintetase (GS) (Bebbington et al., 1992) e o sistema de seleção comandada por histidinol (Hartmann e Mulligan, 1988). Estes marcadores amplificáveis são também marcadores de seleção e, assim, podem ser usados para selecionar aquelas células que obtiveram o vetor. DHFR e glutamina sintetase conferem bons resultados. Em ambos os casos, a seleção normalmente ocorre na ausência do metabólito adequado (hipoxantina e timidina no caso de DHFR, gluta- mina no caso de GS), deste modo, impedindo o crescimento de célu- las não transformadas. Com sistemas amplificáveis, tal como o sistema de DHFR, expressão de uma proteína recombinante pode ser aumentada ao expor as células a determinados agentes que promovem a amplificação do gene, tais como antifolatos (por exemplo, metotrexato (MTX)) no caso do sistema de DHFR. Um inibidor adequado para promover a amplificação do gene de GS é sulfoximina de metionina (MSX). Exposição à MSX também resulta em amplificação do gene. De acordo com uma modalidade preferida, o vetor de expressão compreende um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma enzima di-hidrofolato redutase (DHFR) como marcador selecionável.

[0098] Além disso, o vetor de expressão também pode compreen der um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um marcador selecionável procariota. Um "marcador selecio- nável procariota" é um marcador selecionável que permite seleção em células hospedeiras procariotas sob condições de seleção apropriadas. Exemplos de respectivos marcadores selecionáveis procariotas são marcadores que conferem uma resistência a antibióticos tais como, por exemplo, ampicilina, canamicina, tetraciclina e/ou cloranfeni- col. Inclusão de um marcador selecionável procariota no vetor de expressão tem a vantagem de que o vetor de expressão pode ser facilmente proliferado em células hospedeiras procariotas.

[0099] De preferência, o vetor de expressão compreende pelo me nos um cassete de expressão de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção, um cassete de expressão compreendendo um po- linucleotídeo que codifica um marcador de seleção eucariota que confere resistência contra antibióticos de aminoglicosídeo, de preferência um marcador selecionável neo, e um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica um marcador selecionável amplificável, de preferência DHFR.

[00100] O vetor de expressão de acordo com a presente invenção pode compreender mais de um cassete de expressão para expressar um polipeptídeo de interesse. Portanto, de acordo com uma modalidade, vários cassetes de expressão para expressar os mesmos ou diferentes polipeptídeos de interesse estão localizados no vetor de expressão de acordo com a presente invenção. Assim, a presente invenção também proporciona um vetor de expressão que compreende mais de um cassete de expressão, em que cada cassete de expressão codifica, por exemplo, uma subunidade ou domínio de uma proteína dimérica ou multimérica de ordem superior. Cassetes de expressão que codificam diferentes subunidades de uma proteína multimérica, cada uma incorporado em um cassete de expressão diferente, por exemplo, podem ser colocados adjacentes uns aos outros. Para proteínas multiméricas codificadas por pelo menos dois genes distintos (por exemplo, as cadeias leves e pesadas de um anticorpo ou fragmentos funcionais ou derivados dos mesmos), os polinucleotídeos que codificam as subunidades ou domínios desejados são inseridos como poli- peptídeos de interesse em diferentes cassetes de expressão. Uma respectiva modalidade que usa pelo menos dois cassetes de expressão diferentes para expressão de subunidades ou domínios individuais de uma proteína dimérica ou multimérica como polipeptídeo de inte-resse é particularmente vantajoso para expressão de moléculas de imunoglobulina tais como, por exemplo, anticorpos. Na célula hospedeira, a proteína dimérica ou multimérica, por exemplo, o anticorpo, é montado e secretado. De acordo com uma modalidade, a concepção de cassetes de expressão de acordo com a presente descrição é usada para expressar a cadeia pesada de um anticorpo. O cassete de expressão de cadeia leve pode ter, em modalidades, uma concepção diferente, por exemplo, pode compreender uma sequência líder de secreção diferente tal como, por exemplo, uma sequência líder de Ig. De acordo com uma modalidade, ambos os cassetes de expressão são concebidos de acordo com os ensinamentos da presente descrição.

[00101] Assim, de acordo com uma modalidade, o vetor de expressão compreende pelo menos dois cassetes de expressão de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção. O polinucleotídeo compreendido em um dos ditos cassetes de expressão codifica a cadeia pesada de uma molécula de imunoglobulina ou um fragmento funcional ou derivado da mesma como polipeptídeo de interesse e o polinucleotí- deo compreendido no outro cassete de expressão codifica a cadeia leve de uma molécula de imunoglobulina ou um fragmento funcional ou derivado da mesma como polipeptídeo de interesse. Após expressão da cadeia leve e da cadeia pesada a partir dos ditos cassetes de expressão na célula hospedeira, a molécula de imunoglobulina funcional a qual é, de preferência, um anticorpo, é montada e secretada a partir da célula hospedeira. De acordo com uma modalidade, a 5'UTR para a cadeia leve ou um fragmento funcional ou derivado da mesma compreende ou consiste em SEQ ID N 3. De acordo com uma modalidade, a 5'UTR para a cadeia pesada ou um fragmento funcional ou derivado da mesma compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 4. De acordo com uma modalidade, a 5'UTR para a cadeia leve ou um fragmento funcional ou derivado da mesma compreende ou consiste em SEQ ID NO: 5. De acordo com uma modalidade, a 5'UTR para a cadeia pesada ou um fragmento funcional ou derivado da mesma compreende ou consiste em SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7.

[00102] Vetores de expressão adequados que podem ser usados em conjunto com a presente invenção são descritos no documento WO 2009/080720 em que, no entanto, nos ensinamentos da presente invenção, a sequência líder de secreção de imunoglobulina ensinada pelo documento WO 2009/080720 é substituída pela sequência líder de secreção de hCD33 no(s) cassete(s) de expressão que compreen- de o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse. Conforme descrito, no caso onde mais de um cassete de expressão estão presentes no vetor de expressão, basta que um cassete de expressão seja concebido conforme descrito aqui.

[00103] De acordo com um terceiro aspecto, uma célula hospedeira eucariota é fornecida a qual compreende pelo menos um cassete de expressão de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção e/ou que compreende pelo menos um vetor de expressão de acordo com o segundo aspecto da presente invenção. O cassete de expressão e o vetor de expressão de acordo com a presente invenção foram descritos em detalhes acima; referência é feita à descrição precedentes, a qual também se aplica aqui. De preferência, o cassete de expressão compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse. De preferência, um respectivo cassete de expressão compreendido em um vetor de expressão pode ser introduzido na célula hospedeira por meio de transfecção.

[00104] De acordo com uma modalidade, a célula hospedeira euca- riota compreende pelo menos dois cassetes de expressão de acordo com a presente invenção. De acordo com uma modalidade, cada um dos ditos cassetes de expressão compreende um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma subunidade ou domínio de uma proteína di- mérica ou multimérica como polipeptídeo de interesse. Esta modalidade é particularmente adequada para expressão de moléculas de imu- noglobulina. De acordo com uma modalidade preferida, a célula hospedeira compreende um primeiro cassete de expressão de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção que compreende um po- linucleotídeo que codifica a cadeia pesada de uma molécula de imu- noglobulina ou um fragmento funcional ou derivado da mesma como polipeptídeo de interesse e um segundo cassete de expressão de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção que compreende um polinucleotídeo que codifica a cadeia leve de uma molécula de imunoglobulina ou um fragmento funcional ou derivado da mesma como polipeptídeo de interesse. Conforme discutido acima, de preferência, a 5 'UTR que é usada no cassete de expressão para expressar a cadeia leve compreende ou consiste em SEQ ID NO: 3 e a 5' UTR que é usada no cassete de expressão para expressar a cadeia pesada compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 4. De acordo com uma modalidade, a 5'UTR que é usada no cassete de expressão para expressar a cadeia leve compreende ou consiste em SEQ ID NO: 5 e a 5'UTR que é usada no cassete de expressão para expressar a cadeia pesada compreende ou consiste em SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7. Os ditos cassetes de expressão podem ser introduzidos nas células hospedeiras usando um ou mais vetores de expres-são apropriados, conforme descrito acima. De acordo com uma modalidade, o primeiro cassete de expressão foi introduzido por um vetor de expressão e o segundo cassete de expressão foi introduzido por um segundo vetor de expressão. No entanto, é preferido que ambos os cassetes de expressão sejam introduzidos usando um vetor de expressão que traz ambos os cassetes de expressão.

[00105] De acordo com uma modalidade, a célula hospedeira euca- riota compreende pelo menos um cassete de expressão de acordo com o primeiro aspecto para expressão da cadeia pesada de um anticorpo. Conforme descrito, por exemplo, uma 5'UTR que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1, 4, 6 ou 7 pode ser usada para esta finalidade.

[00106] Basicamente, quaisquer células hospedeiras eucariotas podem ser usadas em conjunto com a presente invenção, contanto que elas permitam a expressão eficiente de um polipeptídeo a partir do cassete de expressão de acordo com a presente invenção. De preferência, a célula hospedeira eucariota é uma célula de mamífero. A dita célula de mamífero é, de preferência, selecionada do grupo que consiste em células de roedores, células humanas e células de macaco. Particularmente preferido é o uso de células de roedores, de preferência selecionadas do grupo que consiste em células CHO, células BHK, células NS0, célula de fibroblasto 3T3 de camundongo e células SP2/0. Particularmente preferido é o uso de células CHO como células hospedeiras. As células humanas podem ser, por exemplo, selecionadas do grupo que consiste em células HEK293, células MCF-7, células PerC6 e células HeLa. Células de macaco podem ser selecionadas, por exemplo, de células COS e células Vero. O vetor de expressão de acordo com a presente invenção é particularmente adequado para produção de polipeptídeos em células de roedores, tais como células CHO, incluindo células CHO DHFR- ou células CHO DHFR+. De preferência, a célula hospedeira é uma célula CHO.

[00107] De acordo com um quarto aspecto, é proporcionado um método para produzir a célula hospedeira de acordo com o terceiro aspecto da presente invenção, em que o vetor de expressão de acordo com o segundo aspecto da presente invenção é introduzido na célula hospedeira eucariota a qual é, de preferência, uma célula hospedeira de mamífero. Deste modo, o cassete de expressão de acordo com o primeiro aspecto que compreende, de preferência, um polinucleotídeo para expressão de um polipeptídeo de interesse, é introduzido na célula hospedeira.

[00108] Introdução pode ser obtida, por exemplo, por meio de trans- fecção do vetor de expressão de acordo com o segundo aspecto da presente invenção. De acordo com uma modalidade, o vetor de expressão se integra no genoma da célula hospedeira (transfecção estável). Vetores de expressão adequados que permitem a introdução do cassete de expressão de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção dentro da célula hospedeira são descritos em detalhes acima em conjunto com o segundo aspecto de acordo com a presente invenção. Se o cassete de expressão introduzido não é inserido no genoma (transfecção transitória), ele pode ser perdido no estágio posterior, por exemplo, quando as células sofrem mitose. Vetores de expressão adequados também podem ser mantidos na célula hospedeira sem integração no genoma, por exemplo, através de replicação epissomal. Há vários métodos apropriados conhecidos no estado da técnica para introdução de um vetor de expressão em uma célula hospedeira euca- riota, incluindo células hospedeiras de mamífero, em particular por meio de transfecção. Respectivos métodos incluem, porém sem limitações, transfecção com fosfato de cálcio, eletroporação, lipofecção, transferência de genes mediada por polímero e biolística. Além de métodos com base em integração aleatória tradicional, também abordagens mediadas por recombinação podem ser usadas. Tais métodos de recombinação podem incluir o uso de recombinases sítio específicas, tais como Cre, Flp ou ΦC31 (vide, por exemplo, Oumard et al., Cyto- technology (2006) 50: 93-108), as quais podem mediar a inserção dirigida de transgenes. Alternativamente, o mecanismo de recombinação homóloga pode ser usado para inserir o cassete de expressão de acordo com a presente invenção (revisto em Sorrell et al., Biotechnology Advances 23 (2005) 431-469). Inserção do gene com base em recombinação permite minimizar o número de elementos a serem incluídos no vetor de expressão que é introduzido na célula hospedeira. Modalidades de um vetor de expressão ou combinações de vetores de expressão adequados de acordo com a presente invenção, bem como células hospedeiras adequadas, são descritas em detalhes acima; referência é feita à descrição acima. Conforme discutido acima em conjunto com a modalidade, os cassetes de expressão que compreendem os polinucleotídeos que codificam a cadeia pesada e a cadeia leve de uma molécula de imunoglobulina ou um fragmento funcional ou deri- vado da mesma podem estar localizados nos mesmos ou em diferentes vetores de expressão no caso onde uma combinação de pelo menos dois vetores de expressão é usada para transfectar as células hospedeiras.

[00109] De acordo com um quinto aspecto, é proporcionado um método para produzir um polipeptídeo de interesse, o dito método compreendendo cultura das células hospedeiras de acordo com o terceiro aspecto da presente invenção em uma cultura de células sob condições que permitam a expressão do dito polipeptídeo de interesse. Há dois formatos principais de culturas de células hospedeiras, a saber, culturas de células aderentes e culturas em suspensão. É preferido usar culturas em suspensão. De acordo com uma modalidade, as ditas células hospedeiras são cultivadas sob condições isentas de soro.

[00110] O polipeptídeo de interesse é expresso a partir do cassete de expressão de acordo com a presente invenção e é secretado da célula hospedeira, por exemplo, para o meio de cultura, e o polipeptí- deo secretado pode ser obtido a partir do mesmo. Se mais de um cassete de expressão está presente na célula hospedeira, por exemplo, quando a proteína dimérica ou multimérica é expressa (vide acima), a proteína dimérica ou multimérica é montada na célula e, então, é se- cretada a partir da célula hospedeira. Em virtude da extraordinária expressão que é obtida usando a nova combinação de 5'UTR/sequência líder de secreção de acordo com a presente invenção, os polipeptí- deos podem ser expressos e secretados com elevado rendimento. O polipeptídeo secretado também pode ser submetida a novas etapas de processamento tais como, por exemplo, etapas de purificação e/ou modificação. Consequentemente, o método para produzir o polipeptí- deo de interesse pode compreender pelo menos uma das etapas a seguir:

[00111] - isolamento do polipeptídeo de interesse do dito meio de cultura de células; e/ou

[00112] - processamento do polipeptídeo de interesse isolado.

[00113] Assim, o polipeptídeo produzido de acordo com a invenção pode ser recuperado e, opcionalmente, ainda processado, por exemplo, adicionalmente purificado, isolado e/ou modificado por meio de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado do meio nutriente através de procedimentos convencionais incluindo, porém sem limitações, centrifugação, filtração, ultrafiltração, precipitação ou extração. Purificação pode ser realizada através de uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, porém sem limitações, cromatografia (por exemplo, de permuta iônica, de afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem e exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação com sulfato de amônio) ou extração.

[00114] Conforme discutido acima, o polipeptídeo de interesse é, de preferência, uma molécula de imunoglobulina ou um fragmento funcional ou derivado da mesma, mais preferivelmente um anticorpo ou um fragmento funcional ou derivado do mesmo.

[00115] De acordo com um sexto aspecto, a presente invenção se refere ao uso de uma sequência 5'UTR em combinação com uma sequência líder de secreção de hCD33 em um cassete de expressão para expressar um polipeptídeo de interesse com um rendimento elevado a partir do dito cassete de expressão, em que a dita sequência de po- linucleotídeos 5'UTR é selecionada do grupo que consiste em uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR que compreende SEQ ID NO: 1, uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR que compreende SEQ ID NO: 2, uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR que compreende SEQ ID NO: 3, uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR que compreende SEQ ID NO: 4 e uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR a qual é pelo menos 85%, de preferência pelo menos 90% idêntica à sequência mostrada em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou em que a dita sequência de polinucleotídeos 5'UTR é selecionada do grupo que consiste em uma sequência de polinucleo- tídeos 5'UTR que compreende SEQ ID NO: 5, uma sequência de poli- nucleotídeos 5'UTR que compreende SEQ ID NO: 6, uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR que compreende SEQ ID NO: 7 e uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR a qual é pelo menos 85%, de preferência pelo menos 90% idêntica à sequência mostrada em SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7. A identidade pode ser calculada ao longo de todo o comprimento da sequência de referência.

[00116] As vantagens de uma respectiva combinação, modalidades adequadas e preferidas da sequência de polinucleotídeos 5'UTR e da sequência líder de secreção de hCD33, bem como modalidades adequadas e preferidas do cassete de expressão e do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse são descritas em detalhes acima. Referência é feita à descrição acima, a qual também se aplica aqui.

[00117] De preferência, o cassete de expressão tem a concepção do cassete de expressão que é descrita acima em conjunto com o primeiro aspecto da presente invenção. Referência é feita à descrição acima. De acordo com uma modalidade, o cassete de expressão tem uma ou mais das seguintes características:

[00118] a) ele compreende um promotor;

[00119] b) ele compreende uma sequência de polinucleotídeos 5'UTR conforme descrito acima;

[00120] c) ele compreende uma sequência líder de secreção de hCD33 que compreende e, de preferência, consiste na sequência MPLLLLLPLLWAGALA (SEQ ID NO: 12);

[00121] d) ele compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse ou um sítio de inserção para inserção de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse;

[00122] e) ele compreende uma sequência 3'UTR; e/ou

[00123] f) ele compreende um sítio poli A.

[00124] Detalhes em relação aos elementos individuais e combinações de modalidades preferidas são descritos acima em conjunto com o primeiro aspecto da presente invenção. Referência é feita à descrição acima.

[00125] De acordo com uma modalidade, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse codifica o polipeptídeo de interesse como duas ou mais subunidades ou domínios de uma proteína diméri- ca ou multimérica, em que pelo menos um elemento IRES está localizado entre as regiões de codificação das subunidades ou domínios individuais e cada região de codificação é precedida por uma sequência líder de secreção de hCD33. No entanto, o uso de cassetes de expressão monocistrônicos é preferido no contexto da presente invenção.

[00126] De acordo com uma modalidade alternativa, o polinucleotí- deo que codifica o polipeptídeo de interesse codifica polipeptídeo de interesse como uma subunidade ou domínio de uma proteína dimérica ou multimérica. De preferência, o polinucleotídeo que codifica o poli- peptídeo de interesse codifica polipeptídeo de interesse como as cadeias pesada ou leve de uma molécula de anticorpo ou um fragmento funcional ou derivado do mesmo. De acordo com uma modalidade, uma concepção de cassete de expressão de acordo com a presente invenção é usada para expressar a cadeia pesada de um anticorpo. Aqui, o cassete de expressão para expressar a cadeia leve pode ter uma concepção diferente e pode, por exemplo, compreender uma se-quência líder diferente, por exemplo, uma sequência líder de Ig, ou pode também ser concebido de acordo com os ensinamentos da presente invenção. De acordo com uma modalidade, uma concepção de cassete de expressão de acordo com a presente invenção é usada para expressão da cadeia leve de um anticorpo. Aqui, o cassete de expressão para expressar a cadeia pesada pode ter uma concepção diferente e pode, por exemplo, compreender uma sequência líder diferente, por exemplo, uma sequência líder de Ig, ou pode também ser concebido de acordo com os ensinamentos da presente invenção.

[00127] De acordo com uma modalidade, o assunto descrito aqui como compreendendo determinados elementos também se refere ao assunto que consiste nos respectivos elementos. Em particular, as 5'UTRs descritas aqui como compreendendo determinadas sequências podem também consistir nas respectivas sequências.

[00128] É preferido selecionar e combinar modalidades preferidas descritas aqui e o assunto específico proveniente de uma respectiva combinação de modalidades preferidas também pertence à presente descrição.

[00129] O conteúdo integral dos documentos e texto, conforme mencionado aqui, é incorporado por referência e, assim, forma parte da presente descrição.

[00130] Os exemplos que seguem servem para ilustrar a presente invenção sem limitar de qualquer forma seu âmbito. Em particular, os exemplos se referem a modalidades preferidas da presente invenção. EXEMPLOS

[00131] Os exemplos foram realizados de acordo com o protocolo a seguir: EXEMPLO A I. Material e métodos Células Hospedeiras

[00132] Como células hospedeiras, células CHO (Ovário de Hâms- ter Chinês) derivadas de células CHO-K1 são usadas. Vetores de Expressão

[00133] Como controle padrão, um vetor de expressão que tem uma concepção conforme descrito no documento WO 2009/080720 (vide, em particular, Exemplo 6) é usado, o qual utiliza uma sequência líder de secreção de Ig nos cassetes de expressão para expressar as cadeias pesada e leve do anticorpo. O promotor de CMV compreende SEQ ID NO: 8. SEQ ID NO: 3 é usada como 5 'UTR para expressar a cadeia leve e SEQ ID NO: 4 foi usada como 5'UTR para expressar a cadeia pesada. Um vetor de expressão de acordo com os ensinamentos da presente invenção é obtido a partir do dito vetor de controle ao substituir a sequência líder de secreção de cadeias pesada e leve de imunoglobulina existente pela sequência líder de secreção de hCD33 a seguir: MPLLLLLPLLWAGALA (SEQ ID NO: 12)

[00134] Os ditos vetores de expressão são usados para expressar moléculas de anticorpo. Uma concepção de vetor correspondente também é usada a fim de expressar um nanocorpo como polipeptídeo de interesse em que, no entanto, a 5'UTR de acordo com SEQ ID NO: 5 foi usada. Aqui, no entanto, é necessário apenas um cassete de expressão. O vetor de controle tinha a mesma concepção, no entanto, mais uma vez, uma sequência líder de Ig foi usada. Cultura de Células, Transfecção e Seleção

[00135] As células são cultivadas usando meio de cultura de células in-house e passadas regularmente 2-3 vezes por semana para manter na fase de crescimento logarítmica durante todo o estudo. As células são transfectadas usando o método de nucleofecção convencional. 5E6 células/pulso de nucleofecção são centrifugadas e ressuspensas em tampão de transfecção. 3 μg de DNA de vetor que codifica o poli- peptídeo de interesse são adicionados e nucleofecção é realizada. As células transfectadas são transferidas para um frasco de agitação de 125 mL e são cultivadas sob condições de agitação durante 24-48 ho ras. Uma primeira etapa de seleção com G-418 é realizada, conforme previamente descrito no documento WO 2009/080720. Além disso, seleção é realizada com duas etapas de seleção adicionais com meto- trexato (MTX), a saber, MTX a 500 nM e MTX a 1000 nM. Reservatórios selecionados, compreendendo células resistentes, principalmente boas produtoras, são clonados em uma densidade de 0,5-1 célu- la/cavidade ou através de diluição limitativa ou usando o sistema de FACS. Para clones obtidos, a produtividade e o crescimento clonal são analisados em diferentes formatos de rastreio. II. Resultados

[00136] Os dados experimentais obtidos com o vetor de expressão de acordo com o estado da técnica (vetor de controle de expressão) compreendendo a sequência líder de secreção de Ig e o vetor de expressão de acordo com a presente invenção compreendendo a sequência líder de secreção de hCD33 demonstram que a titulação de anticorpo produzido é notavelmente aumentada quando se usa a nova combinação da 5'UTR específico e da sequência líder de secreção de hCD33 de acordo com a presente invenção. Como proteína de interesse, um anticorpo de IgG foi expresso. O aumento da produtividade observado ao nível do reservatório foi, em média, de 2,88 vezes quando se usa o vetor de expressão de acordo com a presente invenção. Os resultados podem ainda ser melhorados ao nível de clone, em que um aumento na produtividade de 4,1 vezes pode ser obtido quando se usa o vetor de expressão de acordo com a presente invenção (quando se compara o melhor clone de controle obtido com o vetor de expressão de controle e o melhor clone obtido com o vetor de expressão de acordo com a presente invenção).

[00137] Quando se expressa um nanocorpo como proteína de interesse, comparação dos melhores clones mostra um aumento na produtividade de 1,1 vez quando se usa o vetor de expressão de acordo com a presente invenção e, quando de comparação dos 6 melhores clones, um aumento na produtividade de 1,6 vezes, em média, foi obtido. Isto é ilustrado pelas tabelas a seguir: Tabela 2: Avaliação da nova combinação com anticorpo de IgG: um aumento na produtividade de 2,88 vezes é obtido ao nível do reservatório com o vetor de expressão de acordo com a presente invenção.

Tabela 3: Avaliação da nova combinação com anticorpo de IgG: um aumento na produtividade de 4,1 vezes comparando os melhores clones do vetor de expressão conhecido no estado da técnica e o vetor de expressão de acordo com a presente invenção e, em média, dos 6 melhores clones: aumento na produtividade de 4

Tabela 4: Avaliação da nova combinação com nanocorpos: aumento na produtividade de 1,1 vez comparando os melhores clones do vetor de expressão conhecido no estado da técnica e o vetor de expressão de acordo com a presente invenção e, em média, dos 6 melhores clones: aumento na produtividade de 1,6 vezes.

EXEMPLO B Vetores de Expressão

[00138] Como controle padrão, os vetores de expressão que têm a concepção básica conforme descrito no documento WO 2009/080720 (vide, em particular, Exemplo 6) foram usados, os quais utilizam sequências líderes de secreção de Ig nos cassetes de expressão para expressar as cadeias pesada e leve do anticorpo. O cassete de expressão para a cadeia pesada foi modificado usando a tecnologia "leaky stop codon" descrita no documento WO2010/022961 para facilitar a seleção por FACS. O promotor de CMV compreendia SEQ ID NO: 8. SEQ ID NO: 5 é usada como 5'UTR para expressar a cadeia leve e SEQ ID NO: 7 é usada como 5 'UTR para expressar a cadeia pesada. Um vetor de expressão de acordo com os ensinamentos da presente invenção é obtido a partir dos ditos vetores de controle ao substituira sequência líder de secreção de imunoglobulina de cadeia pesada existente pela sequência líder de secreção de hCD33 a seguir: MPLLLLLPLLWAGALA (SEQ ID NO: 12)

[00139] Os ditos vetores de expressão são usados para expressar diferentes moléculas de anticorpo.

[00140] A avaliação foi realizada para abordar a expressão de IgG e processamento do peptídeo sinalizador correto (sequência líder) no cassete de cadeia pesada para 3 anticorpos diferentes. O processamento correto da sequência líder, isto é, clivagem de sequência líder pela peptidase sinalizadora, é essencial para se obter a sequência esperada do polipeptídeo de interesse em seu N-término e, assim, uma molécula funcional com a qualidade pretendida. Foi observado anteriormente que, em alguns casos, usando concepções do estado da técnica, o processamento do peptídeo sinalizador era incorreto e, por exemplo, gerou uma cadeia pesada ou leve com um ou mais aminoá- cidos adicionais no N-término. Dependendo dos um ou mais aminoáci- dos que permaneceram incorretamente no N-término, esta extensão da sequência de aminoácidos pelos um ou mais aminoácidos restantes da sequência líder pode, por exemplo, aumentar a propensão para agregação da molécula ou induzir à formação de ligações de dissulfe- to. Assim, ele pode ter um grave impacto sobre a qualidade do produto. Além disso, descobriu-se que o processamento incorreto do peptí- deo sinalizador impõe o risco de que o polipeptídeo de interesse, tal como um produto de anticorpo, seja clivado pela protease a jusante do sítio de clivagem previsto no N-término (também dito como corte). Isso gera um produto truncado, o qual também pode ter um grave impacto sobre a qualidade da molécula.

[00141] A Tabela 5 ilustra os resultados de processamento de peptídeo sinalizador (sequência líder) obtidos com a tecnologia da presente invenção em comparação com os controles. Conforme pode ser observado, uso da tecnologia da invenção reduziu significativamente a transformação indesejada do peptídeo sinalizador e, assim, melhora a qualidade. Tabela 5: Avaliação de diferentes peptídeos sinalizadores sobre o cassete de cadeia pesada mostra processamento aprimorado e correto da linhagem de células quando de expressão de três diferentes anticorpos modelo

Claims

1. Cassete de expressão adequado para expressão de um polipeptídeo de interesse, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um promotor; (b) uma sequência de polinucleotídeo 5'UTR, em que a referida sequência de polinucleotídeo 5'UTR é selecionada do grupo que consiste em (i) uma sequência de polinucleotídeo 5'UTR compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 1; (ii) uma sequência de polinucleotídeo 5'UTR compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 2; (iii) uma sequência de polinucleotídeo 5'UTR compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 3; (iv) uma sequência de polinucleotídeo 5'UTR compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 4; (v) uma sequência de polinucleotídeo 5'UTR compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 5; (vi) uma sequência de polinucleotídeo 5'UTR compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 6; (vii) uma sequência de polinucleotídeo 5'UTR compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 7; (c) um polinucleotídeo que codifica uma sequência líder de secreção de hCD33 de SEQ ID NO: 12; e (d) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse ou um sítio de inserção para inserção de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse.

2. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido cassete de expressão compreende ainda (e) uma sequência 3'UTR e/ou (f) um sinal poli A.

3. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que tem uma ou mais das seguintes características: (i) o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse codifica como polipeptídeo de interesse duas ou mais subunidades ou domínios de uma proteína dimérica ou multimérica, em que pelo menos um elemento IRES está localizado entre as regiões de codificação das subunidades ou domínios individuais e cada região de codificação é precedida por uma sequência líder de secreção de hCD33; (ii) o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse codifica como polipeptídeo de interesse uma subunidade ou domínio de uma proteína dimérica ou multimérica; (iii) o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse codifica como polipeptídeo de interesse as cadeias pesada ou leve de uma molécula de anticorpo ou um fragmento funcional ou derivado da mesma; (iv) a sequência de polinucleotídeo 5'UTR compreende ou consiste em SEQ ID NO: 3 e o polinucleotídeo que codifica o polipep- tídeo de interesse codifica como polipeptídeo de interesse a cadeia leve de uma molécula de anticorpo ou um fragmento funcional ou seu derivado; (v) a sequência de polinucleotídeo 5'UTR compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 4 e o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse codifica como polipeptídeo de interesse a cadeia pesada de uma molécula de anticorpo ou um fragmento funcional ou derivado da mesma; (vi) a sequência de polinucleotídeo 5'UTR compreende ou consiste em SEQ ID NO: 5 e o polinucleotídeo que codifica o polipep- tídeo de interesse codifica como polipeptídeo de interesse como a ca- deia leve de uma molécula de anticorpo ou um fragmento funcional ou derivado da mesma; (vii) a sequência de polinucleotídeo 5'UTR compreende ou consiste em SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7 e o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse codifica como polipeptídeo de interesse a cadeia pesada de uma molécula de anticorpo ou um fragmento funcional ou derivado da mesma; (viii) o cassete de expressão é um cassete de expressão monocistrônico; (ix) o promotor contido no cassete de expressão é um promotor de CMV humano, o qual é selecionado do grupo que consiste em: (aa) um promotor que compreende a sequência de SEQ ID NO: 8; ou um fragmento funcional da mesma que funciona como promotor.

4. Cassete de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende os seguintes elementos: (a) um promotor de CMV humano; (b) uma sequência de polinucleotídeo 5’ UTR selecionada do grupo que consiste em uma sequência de polinucleotídeo 5'UTR compreendendo SEQ ID NO: 1, uma sequência de polinucleotídeo 5'UTR compreendendo SEQ ID NO: 2, uma sequência de polinucleotí- deo 5'UTR compreendendo SEQ ID NO: 3, uma sequência de polinu- cleotídeo 5'UTR compreendendo SEQ ID NO: 4, uma sequência de polinucleotídeo 5'UTR compreendendo SEQ ID NO: 5, uma sequência de polinucleotídeo 5'UTR compreendendo SEQ ID NO: 6, uma sequência de polinucleotídeo 5'UTR compreendendo SEQ ID NO: 7; (c) um polinucleotídeo que codifica uma sequência líder s de secreção de hCD33, em que a sequência líder de secreção de hCD33 consiste na sequência de SEQ ID NO 12; (d) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse; (e) uma sequência de polinucleotídeo 3'UTR; e (f) um sítio poli A.

5. Vetor de expressão para expressão de um polipeptídeo de interesse, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um cassete de expressão como definido em uma ou mais das reivindicações 1 a 4.

6. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 5, ca-racterizado pelo fato de que compreende ainda um ou mais dos seguintes elementos: (a) pelo menos um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um marcador selecionável; (b) pelo menos um segundo cassete de expressão para expressão de um polipeptídeo de interesse.

7. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 6, ca-racterizado pelo fato de que compreende pelo menos dois cassetes de expressão, em que cada cassete de expressão compreende um poli- nucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse, em que o poli- nucleotídeo compreendido em um cassete de expressão codifica a cadeia pesada de uma molécula de imunoglobulina ou um fragmento funcional ou derivado da mesma e o polinucleotídeo compreendido no outro cassete de expressão codifica a cadeia leve de uma molécula de imunoglobulina ou um fragmento funcional ou derivado da mesma.

8. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 7, ca-racterizado pelo fato de que a sequência de polinucleotídeo 5'UTR do cassete de expressão que codifica a cadeia pesada de uma molécula de imunoglobulina ou um fragmento funcional ou derivado da mesma compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 4 e em que a sequência de polinucleotídeo 5'UTR do cassete de expressão que codifica a cadeia leve de uma molécula de imunoglobulina ou um fragmento funcional ou derivado da mesma compreende ou consiste em SEQ ID NO: 3.

9. Método para produzir uma célula hospedeira eucariótica que compreende pelo menos um cassete de expressão, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e/ou pelo menos um vetor de expressão, como definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizado pelo fato de que um vetor de expressão, como definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 8, é introduzido em uma célula hospedeira eucariota.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a referida célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste em células de roedores, células de primatas e células humanas e em que a referida célula hospedeira é preferencialmente uma célula CHO.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que a referida célula hospedeira é transfectada de forma estável com pelo menos um cassete de expressão, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e/ou pelo menos um vetor de expressão, como definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 8, em que o pelo menos um cassete de expressão e/ou pelo menos um vector de expressão estão integrados no genoma da célula hospedeira, preferencialmente em que a referida célula hospedeira é uma célula CHO.

12. Método para produzir um polipeptídeo de interesse, ca-racterizado pelo fato de que compreende cultivar células hospedeiras que compreende, pelo menos um cassete de expressão, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e/ou pelo menos um vetor de expressão, como definido em qualquer uma das reivindica- ções 5 a 8, em uma cultura de células sob condições que permitam expressão do referido polipeptídeo de interesse.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as referidas células hospedeiras são selecionadas do grupo que consiste em células de roedores, células de primatas e células humanas e em que a referida célula hospedeira é preferencialmente uma célula CHO.

14. Método, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que as referidas células hospedeiras são trans- fectada de forma estável com pelo menos um cassete de expressão, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e/ou pelo menos um vetor de expressão, como definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 8, em que o pelo menos um cassete de expressão e/ou pelo menos um vector de expressão estão integrados no genoma da célula hospedeira, preferencialmente em que a referida célula hospedeira é uma célula CHO.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo de interesse é secretado no meio de cultura de células e é isolado do meio de cultura de células e o polipeptídeo isolado é opcionalmente ainda processado.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo é uma molécula de imunoglobulina ou um fragmento da mesma.

17. Uso de uma sequência 5'UTR em combinação com uma sequência líder de secreção de hCD33 de SEQ ID NO: 12 em um cassete de expressão para expressar um polipeptídeo de interesse com um rendimento elevado a partir do referido cassete de expressão, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de polinucleotídeo 5'UTR é selecionada do grupo que consiste em: (i) uma sequência de polinucleotídeo 5'UTR que compreende a sequência de SEQ ID NO: 1; (ii) uma sequência de polinucleotídeo 5'UTR que compreende a sequência de SEQ ID NO: 2; (iii) uma sequência de polinucleotídeo 5'UTR que compreende a sequência de SEQ ID NO: 3; (iv) uma sequência de polinucleotídeo 5'UTR que compreende a sequência de SEQ ID NO: 4; (v) uma sequência de polinucleotídeo 5'UTR que compreende a sequência de SEQ ID NO: 5; (vi) uma sequência de polinucleotídeo 5'UTR que compreende a sequência de SEQ ID NO: 6; (vii) uma sequência de polinucleotídeo 5'UTR que compreende a sequência de SEQ ID NO: 7.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por um ou mais dos seguintes: (i) o cassete de expressão é um cassete de expressão, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4; (ii) o cassete de expressão está compreendido em um vetor de expressão; (iii) o uso é em uma célula hospedeira compreendendo pelo menos um cassete de expressão, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e/ou pelo menos um vetor de expressão, como definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 8.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 18 (iii), caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste em células de roedores, células de primatas e células humanas e em que a referida célula hospedeira é preferencialmente uma célula CHO.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 18 (iii) ou 19, carac- terizado pelo fato de que a referida célula hospedeira é transfectada de forma estável com pelo menos um cassete de expressão, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e/ou pelo menos um vetor de expressão, como definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 8, em que o pelo menos um cassete de expressão e/ou pelo menos um vetor de expressão estão integrados no genoma da célula hospedeira, preferencialmente em que a referida célula hospedeira é uma célula CHO.

21. Uso, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão é um vetor de expressão, como definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 8.