KR20150085537A - 폴리펩티드를 고 수율로 발현하는 최적화 발현 카세트 - Google Patents

폴리펩티드를 고 수율로 발현하는 최적화 발현 카세트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 관심 폴리펩티드를 발현하는 발현 카세트에서 특정 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열 (서열 1 참조)과 hCD33 분비 리더 서열의 조합이 선행 기술 발현 카세트와 비교하여 관심 폴리펩티드의 놀랄만하게 더 양호한 발현 수준을 가져온다는 발견에 기초한다. 이러한 발견에 기초하여, 본 발명은 특히 관심 폴리펩티드를 고 수율로 생산하는 신규 발현 카세트, 발현 벡터 및 방법을 제공한다.

Description

폴리펩티드를 고 수율로 발현하는 최적화 발현 카세트 {OPTIMIZED EXPRESSION CASSETTE FOR EXPRESSING A POLYPEPTIDE WITH HIGH YIELD}
본 발명은 특히, 특정 5' UTR과 hCD33 분비 리더 서열의 조합을 포함하는, 관심 폴리펩티드의 발현에 적합한 발현 카세트에 관한 것이다. 유전 요소의 이러한 특정 조합이 놀랍게도 다른 5' UTR과 다른 분비 리더 서열의 조합과 비교하여 관심 폴리펩티드의 현저히 더 양호한 발현 수준을 가져오는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이러한 발현 카세트를 사용하는 것은 관심 폴리펩티드를 고 수율로 생산하는데 유리하다.
관심 폴리펩티드를 대량으로 클로닝하고 발현하는 능력이 점점 중요해지고 있다. 단백질의 고 수준 생산 및 정제 능력은 인간 제약 및 생물공학 분야에서, 예를 들어 단백질 약제 생산에 및 기초연구의 장에서, 예를 들어 단백질을 결정화하여 그들의 3차원 구조의 측정을 가능케 해주는 데에 특히 중요하다. 달리 다량으로 수득하기가 곤란한 단백질을 숙주 세포에서 과발현시키고 후속하여 단리 및 정제시킬 수 있다.
재조합 단백질의 생산을 위한 발현 시스템의 선택은 세포 성장 특징, 발현 수준, 세포내 및 세포외 발현, 번역후 변형과 관심 단백질의 생물학적 활성, 및 치료용 단백질의 생산에 있어서 규제문제와 경제적 고려사항을 포함하여 다수의 요인에 좌우된다. 포유동물 세포가 박테리아 또는 효모와 같은 다른 발현 시스템에 비해 우월한 핵심 이점은 적당한 단백질 폴딩, 복잡한 N-연결 글리코실화와 확실한 O-연결 글리코실화, 및 광범위의 다른 번역후 변형 수행능력이다. 전술한 이점에 기인하여, 진핵 및 특히 포유동물 세포는 현재 모노클로날 항체와 같은 복잡한 치료용 단백질의 생산을 위한 최적의 발현 시스템이다.
고 발현 숙주 세포 (또한 "고 생산자"로도 호칭)를 수득하기 위한 가장 일반적인 접근법은 제1 단계로서 관심 생성물을 발현하는 적당한 발현 벡터를 생성하는 것이다. 발현 벡터는 숙주 세포에서 관심 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 구동시키고, 보통은 재조합 세포주를 생성하기 위한 적어도 하나의 선택 마커를 포함한다. 숙주 세포에서 폴리펩티드를 발현하기 위하여 사용된 발현 벡터는 보통은 관심 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 외에도, 전사를 구동시키기에 적합한 전사 제어 요소, 예컨대 예를 들어 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 전사 중지 또는 종결 신호를 발현 카세트의 요소로서 포함한다. 또한, 예를 들어 적당한 5' UTR 및 3' UTR과 같은 적합한 번역 제어 요소가 보통은 포함되고 발현시킬 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다.
그러한 발현 시스템의 효율을 증가시키기 위하여, 상이한 요소, 특히 전사와 번역의 효율, 단백질 합성, ER에서의 정확한 폴딩 및 단백질 분비에 기여하는 DNA 서열을 최적화시킨다. 최적화된 번역 및 분비 성분이 없는 고 산출 발현 시스템은 잠재적으로는 mRNA 불안정성, 불충분한 단백질 분비, 및 세포질 또는 세포막내 미스-폴딩된 (비활성) 단백질 축적으로 인도할 수 있다. 따라서, 정확하게 폴딩된 단백질의 안정하고 일관된 번역과 세포 배양 배지 내로의 분비를 가능케 해주는 발현 시스템이 특히 관심을 끈다. 그러한 분비 시스템은 세포질 시스템과 비교하여 증가된 수율뿐만 아니라, 안정하고 효율적인 mRNA 번역; 정확한 단백질 폴딩과 효율적인 분비, 간편 신속한 생성물 정제 절차라는 이점을 제공한다. 그러나, 이용가능한 분비 시스템의 대다수의 생성물 수율은 아직 완전히 최적화되어 있지 않다. 생산성과 분비효율을 향상시키기 위하여, 하나의 목표는 분비 신호 (본원에서는 또한 "신호 펩티드" 또는 "분비 리더 서열"로도 호칭), 및 목적하는 고 수준 발현을 이끌어내는 유전 요소의 조합을 수득하도록 상이한 5' UTR 서열과의 그들의 조합을 최적화하는 것이다.
원핵생물 또는 진핵생물 어느 한 쪽으로부터의 분비된 및 막-결합된 단백질의 대다수는 생합성중에 초기 전구체 폴리펩티드로부터 절단되는 아미노-말단 리더 펩티드 (또한 "분비 리더 서열" 또는 "신호 펩티드"로도 호칭)를 소유한다. 분비 리더 펩티드는 보통 5 내지 60개 아미노산 길이이다. 당해 서열은 분비에 필요충분하다. 다수의 이들 분비 리더 펩티드의 분석은 유의한 아미노산 서열 상동성의 부재하에 발생하는 공통적인 구조 모티프를 밝혀주었다 [Von Heijne, 1981; Perlman et al, 1983]. 일반적으로, 분비 리더 서열은 양전하를 띤 아미노 말단 (n), 소수성 코어 (h) 및 신호 펩티다제 절단 부위를 규정하는 보다 극성을 띠는 카르복시 말단 (c)으로 이루어져 있다. 분비 리더 펩티드의 "n" 영역은 약 5 내지 8개 아미노산 길이이며 염기성 잔기의 존재를 특징으로 한다. "h" 영역은 평균적으로 37% 류신, 15% 알라닌, 10% 발린, 10% 페닐알라닌, 7% 이소류신과 21% 소수성 아미노산, 예컨대 글리신, 메티오닌, 프롤린 또는 트립토판으로 이루어지는 8 내지 12개 비-극성 아미노산을 함유한다. 당해 영역은 지질 이중층 내부와의 상호작용을 촉진할 수 있는 입체구조인 알파 나선 형성에 대한 높은 성향을 보유한다. 주로 박테리아 단백질에 기반한, 분비 리더 펩티드의 구조적 특징에 관한 연구는 "h" 영역이 신호 서열 기능에 중요함을 시사하였다 [Gierasch, 1990]. 결실에 의한 또는 소수성 잔기의 친수성 또는 하전 아미노산으로의 치환에 의한 h 영역의 붕괴는 신호 기능의 상실을 가져오고, 반면에 "n" 영역에의 변경은 거의 영향이 없다 [Bird et al., 1990]. 카르복시 말단, 즉 바꿔 말하면 절단 영역은 전형적으로 약 6개 아미노산 길이이다. 당해 영역은 보통 단백질의 최종 폴딩과 분비를 달성하는 데 요구되는 신호 펩티다제 인식과 절단에 관여된다.
5' UTR (5' 비-번역 영역)은 mRNA로 전사되지만 단백질로는 전사되지 않는 DNA 서열의 일부이다. 5' UTR은 보통은 전사 개시부에서 시작하여 출발 코돈의 1개 뉴클레오티드 앞에서 끝난다. 5' UTR은 번역 효율 또는 mRNA 안정성을 조절하는 서열, 단백질에 대한 결합 부위, 조절 요소, 및 번역의 개시를 촉진하는 서열을 함유할 수 있다. 5' UTR 서열은 그들의 길이에 있어서 다양할 수 있으며 수십개의 뉴클레오티드에서 수백개 또는 심지어 수천개까지의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 진핵생물에서, 5' UTR의 중앙값 길이는 대략 100 내지 200nt이다. 5' UTR 및 그의 요소의 구체적인 역할은 아직 완전히 규명되지를 않았는데, 부분적으로는 그 서열이 기능적 단백질로 번역되지 않기 때문이기도 하다. 그러나, 특정 5' UTR과 특정 분비 리더 서열의 조합이 생산 시스템의 번역 및 분비 효율을 강력하게 향상시킬 수 있고, 따라서 발현 수율을 증가시킬 수도 있다고 알려져 있다. 그러나, 과다의 5' UTR과 분비 리더 서열이 이용가능함에 따라, 발현을 실제로 향상시키는 효율적인 조합을 수득하는 것은 난제이다. 따라서, 과다의 이용가능한 발현 카세트와 발현 벡터에도 불구하고, 진핵 세포에서 고 수율로의 강건한 폴리펩티드/단백질 생산을 달성하는 것은 여전히 도전과제이다.
따라서, 본 발명의 목적은 발현 카세트를 숙주 세포 내로 도입시 고 수율로 관심 폴리펩티드의 분비를 가능케 해주는 발현 카세트를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 고 수율로 관심 폴리펩티드의 발현을 가능케 해주는 발현 벡터를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 관심 폴리펩티드를 고 수율로 발현하기에 적합한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 발현 카세트에 특정 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열 (또한 서열 2, 3 및 4에도 및 또한 5, 6 및 7에도 들어있는, 서열 1 참조)과 인간 CD33 분비 리더 서열을 조합하면 상기 발현 카세트에 의하여 코딩되는 관심 폴리펩티드의 놀랄 정도로 높은 발현이 도출된다는 발견에 기초한다. 몇몇 예에서, 본 발명에 따른 발현 카세트는 발현 수율이 4배까지 증가될 수 있었기 때문에 선행 기술에 알려져 있는 발현 카세트를 능가하여 보다 우수한 것으로 나타났다. 본 발명에 따른 발현 카세트의 보다 우수한 성능은 상기 발현 카세트로부터 상이한 관심 폴리펩티드를 발현시킨 다수의 실험에서 확인되었다. 따라서, 본 발명에 따른 발현 카세트는 관심 폴리펩티드를 고 수율로 생산하기에 특히 유리하다. 추가로, 리더 서열의 정확한 프로세싱을 향상시킬 수 있음이 밝혀졌다. 그러므로, 발현 카세트의 당해 신규 설계가 관심 폴리펩티드의 발현을 상당히 향상시키기 때문에 본 발명은 관련 기술분야에 귀중한 공헌을 제공한다.
제1 측면에 따라, 본 발명은
a) 프로모터;
b) i) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00001
(서열 1);
ii) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00002
(서열 2);
iii) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00003
(서열 3);
iv) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00004
(서열 4);
v) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00005
(서열 5);
vi) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00006
(서열 6);
vii) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00007
(서열 7);
viii) 서열 1, 서열 2, 서열 3 또는 서열 4 또는 서열 5, 서열 6 또는 서열 7에 나타낸 서열에 대해 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열;
c) hCD33 분비 리더 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
d) 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 위한 삽입 부위
를 포함하는, 관심 폴리펩티드를 발현하는 발현 카세트를 제공한다.
제2 측면에 따라, 본 발명은 본 발명의 제1 측면에 따른 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는, 관심 폴리펩티드를 발현하는 발현 벡터를 제공한다.
제3 측면에 따라, 본 발명은 본 발명의 제1 측면에 따른 적어도 하나의 발현 카세트 및/또는 본 발명의 제2 측면에 따른 적어도 하나의 발현 벡터를 포함하는 진핵 숙주 세포를 제공한다.
제4 측면에 따라, 본 발명은 본 발명의 제2 측면에 따른 발현 벡터를 진핵 숙주 세포 내로 도입시키는, 본 발명의 제3 측면에 따른 숙주 세포를 생산하는 방법을 제공한다.
제5 측면에 따라, 본 발명은 본 발명의 제3 측면에 따른 숙주 세포를 관심 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건하에서 세포 배양으로 배양하는 것을 포함하는, 상기 관심 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다.
제6 측면에 따라, 본 발명은 발현 카세트로부터 고 수율로 관심 폴리펩티드를 발현시키기 위한 상기 발현 카세트서의 hCD33 분비 리더 서열과 조합한 5' UTR 서열의 용도에 관한 것이며, 여기서 상기 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열은
i) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00008
(서열 1);
ii) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00009
(서열 2);
iii) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00010
(서열 3);
iv) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00011
(서열 4);
v) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00012
(서열 5);
vi) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00013
(서열 6);
vii) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00014
(서열 7);
viii) 서열 1, 서열 2, 서열 3 또는 서열 4 또는 서열 5, 서열 6 또는 서열 7에 나타낸 서열에 대해 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 출원의 다른 목적, 특징, 이점 및 측면은 하기 상세한 설명과 첨부 청구범위로부터 통상의 기술자에게 자명해질 것이다. 그러나, 하기 상세한 설명, 첨부 청구범위와 구체적 실시예는 본 출원의 바람직한 실시양태를 나타내지만 실례로서 주어지는 것일 뿐임을 이해하여야 한다. 개시 발명의 취지와 범위 안에 있는 다양한 변화와 변형이 이하를 정독함으로써 통상의 기술자에게 쉽사리 자명해질 것이다.
본 발명은 유전 요소, 즉 특정 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열과 hCD33 분비 리더 서열의 신규 조합을 포함하는, 관심 폴리펩티드를 발현하는 발현 카세트를 제공한다. 유전 요소의 이러한 특정 조합은 코딩된 관심 폴리펩티드의 발현 효율에 있어 현저한 증가를 가져온다. 또한, 리더 서열의 오류성 프로세싱에 기인한 바람직하지 못한 서열 연장 또는 말단절단 (또한 "클립핑"으로도 알려져 있음)이 감소될 수 있도록 리더 서열의 프로세싱을 향상시킬 수 있음이 밝혀졌다.
제1 측면에 따라,
a) 프로모터;
b) i) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00015
(서열 1);
ii) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00016
(서열 2);
iii) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00017
(서열 3);
iv) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00018
(서열 4);
v) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00019
(서열 5);
vi) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00020
(서열 6);
vii) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00021
(서열 7);
viii) 서열 1, 서열 2, 서열 3 또는 서열 4 또는 서열 5, 서열 6 또는 서열 7에 나타낸 서열에 대해 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열;
c) hCD33 분비 리더 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
d) 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 위한 삽입 부위
를 포함하는, 관심 폴리펩티드를 발현하는 발현 카세트가 제공된다.
본원에 사용되는 용어 "발현 카세트"는 특히, 상기 발현 카세트에 도입되는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 적당한 세팅에서 구동시킬 수 있는 DNA 절편을 언급한다. 숙주 세포 내로 도입시, 발현 카세트는 특히 세포 기구로 하여금 관심 폴리펩티드를 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드를 RNA로 전사하도록 지시할 수 있으며, RNA는 이어서 보통은 추가 프로세싱되고 최종적으로는 관심 폴리펩티드로 번역된다. 이하에서 보다 상세하게 기재되고 있듯이 발현 카세트는 발현 벡터 내에 포함되어 있을 수 있다. 본 발명에 따른 발현 카세트의 개별 요소는 뒤에 상세하게 설명된다.
본 발명에 따른 발현 카세트는 요소 a)로서 프로모터를 포함한다. 본원에 사용되는 용어 "프로모터"는 특히, 그 프로모터가 작동가능하게 연결되는 폴리뉴클레오티드의 전사를 촉진하는 DNA 요소를 언급한다. 프로모터는 프로모터/인핸서 요소의 일부를 또한 형성할 수 있다. 비록 요소 "프로모터"와 "인핸서"간의 물리적 경계가 반드시 분명한 것은 아니지만, 용어 "프로모터"는 보통은 RNA 중합체라제 및/또는 어떤 관련 인자가 결합하고 전사가 개시되는 핵산 분자상의 부위를 언급한다. 인핸서는 공간적으로 뿐만 아니라 시간적으로도 프로모터 활성을 강화한다. 광범위의 세포 유형에서 전사적으로 활성인 다수의 프로모터가 선행 기술에 알려져 있다. 프로모터는 두 부류, 즉 구성적으로 기능하는 것들과 유도 또는 탈억제에 의하여 조절되는 것들로 나누어질 수 있다. 두 부류 모두 단백질 발현에 적합하다. 진핵 및 특히 포유동물 세포에서 폴리펩티드의 고 수준 생산에 사용되는 프로모터는 강력하여야 하고, 바람직하게는 광범위의 세포 유형에서 활성이어야 한다. 다수의 세포 유형에서 발현을 구동할 수 있는 강력한 구성적 프로모터가 선행 기술에 주지이며, 따라서 여기서는 상세한 설명을 필요로 하지 않는다. 바람직하게는, 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터가 본 발명의 교시에 따라 사용된다. 인간 시토메갈로바이러스 (hCMV)의 극초기 (IE) 영역으로부터 유래한 프로모터 또는 프로모터/인핸서가 본 발명에 따른 발현 카세트에서의 프로모터로서 특히 적합하다. 인간 시토메갈로바이러스 (hCMV)의 극초기 (IE) 영역 및 그로부터 유래한 기능적 발현 촉진 단편 및/또는 기능적 발현 증진 단편이 예를 들어 EP 0 173 177 및 EP 0 323 997에 기재되어 있으며 또한 선행 기술에 주지이다. 따라서, hCMV의 극초기 (IE) 영역의 몇몇 단편이 프로모터 및/또는 프로모터/인핸서로서 사용될 수 있다. 하나의 실시양태에 따라, 인간 CMV 프로모터가 본 발명에 따른 발현 카세트에 사용된다. 본원에 사용되는 용어 "인간 CMV 프로모터"는 특히, hCMV의 극초기 (IE) 영역으로부터 유래되는 프로모터를 언급한다.
하나의 실시양태에 따라,
a) 하기 서열을 포함하는 프로모터
Figure pct00022
(서열 8); 또는 프로모터로서 기능하는 그의 기능적 단편; 및
b) 서열 8에 나타낸 서열에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 97%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 프로모터 또는 프로모터로서 기능하는 그의 기능적 단편
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 CMV 프로모터가 사용된다.
% 동일성은 참조 서열의 전체 길이에 걸쳐서 계산될 수 있다.
본 발명에 의하여 교시되고 있듯이 각각의 프로모터는 상기 군으로부터 선택된 특정 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열 및 hCD33 신호 서열과 조합하여 특히 잘 작동하는 것으로 밝혀졌다.
본 발명에 따른 발현 카세트는 요소 b)로서 특정 5' UTR (5' 비-번역 영역) 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 본원에 사용되는 용어 "5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열"은 특히, mRNA로 전사되지만 후속하여 폴리펩티드로 번역되지는 않는 DNA 서열을 언급한다. 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열은 보통은 전사 출발 부위에서 시작하여 실제 코딩 영역의 출발 코돈 앞에서 끝난다. 본 발명에 따른 발현 카세트에서, 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열은 hCD33 분비 리더 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 시작하기 전에 끝난다.
본 발명에 따른 발현 카세트에 사용된 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 서열 1에 나타낸 서열을 포함한다. 각각의 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열은 WO 2009/080720에 기재되어 있다.
하나의 실시양태에 따라, 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 1, 서열 2, 서열 3 및 서열 4의 서열로부터 선택된 서열을 포함하거나 또는 서열 5, 서열 6 또는 서열 7의 서열로부터 선택된 서열을 포함한다. 서열 1에서 보여지는 5' UTR 서열은 서열 2, 3 및 4로서 나타낸 5' UTR 서열 안에 및 서열 5, 6 및 7로서 나타낸 5' UTR 서열 안에 또한 포함되어 있는 컨센서스 서열이다. 바람직하게는, 서열 3을 포함하거나 또는 서열 3으로 이루어진 5' UTR 서열은 항체 또는 그의 기능적 단편의 경쇄 발현에 사용되고, 서열 1 또는 서열 4를 포함하거나 또는 서열 1 또는 서열 4로 이루어진 5' UTR 서열은 항체 또는 그의 기능적 단편의 중쇄 발현에 사용된다. 서열 5를 포함하거나 또는 서열 5로 이루어진 5' UTR 서열은 하나의 실시양태에 따라 항체 또는 그의 기능적 단편의 경쇄 발현에 사용된다. 서열 5는 예를 들어 예시적인 실시양태로서 나노바디의 발현에 또한 사용될 수 있다. 서열 6을 포함하거나 또는 서열 6으로 이루어진 5' UTR 서열은 하나의 실시양태에 따라 항체 또는 그의 기능적 단편의 중쇄 발현에 사용된다. 서열 7을 포함하거나 또는 서열 7로 이루어진 5' UTR 서열은 하나의 실시양태에 따라 항체 또는 그의 기능적 단편의 중쇄 발현에 사용된다. 그것은 또한 실시예에서 시험되었다.
본 발명에 따라 사용되는 5' UTR은 몇몇 요소로 이루어져 있으며, 인트론 플랭킹 영역 5' 서열, 인트론 및 인트론 플랭킹 영역 3' 서열을 포함하고 있는 것으로 밝혀졌다. 상기 5' UTR 내에 포함되어 있는 인트론 및 인트론 플랭킹 영역은 마우스 IgG 중쇄로부터 기원한다 (예를 들어 문헌 [Eaton et al., 1986, Biochemistry 25, 8343-8347, 및 Neuberger et al., 1983, EMBO J. 2(8), 1373-1378] 참조; 그것은 pRK-5 벡터 (비디 파밍젠(BD PharMingen))로부터 수득될 수 있다). 하기 표는 본 발명에 따라 사용될 수 있는 5' UTR 내에 포함되어 있는 상기 요소의 추정상의 경계를 예시한다:
Figure pct00023
또한, 서열 1, 2, 3 또는 4에 나타낸 서열 또는 서열 5, 서열 6 또는 서열 7에 나타낸 서열에 대해 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열이 사용될 수 있다. 동일성은 참조 5' UTR 서열의 전체 길이에 걸쳐서 계산될 수 있다.
다수의 실험에서, 본 발명자들은 상기 특정 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열이 hCD33 신호 서열과 조합하여, 선행 기술 발현 카세트와 비교하여 실질적으로 증가되는, 발현 수율에 대한 전술한 유리한 효과를 나타낸다는 것을 발견하였다.
본 발명에 따른 발현 카세트는 요소 c)로서 hCD33 분비 리더 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 인간 CD33은 시알산-결합 이뮤노글로불린-유사 렉틴 억제 수용체의 구성원이다. CD33은 67-kDa 막횡단 당단백질이며 골수계에서 특이적으로 발현된다. 본원에 사용되는 용어 "hCD33 분비 리더 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드"는 특히, hCD33 분비 리더 서열을 포함하는 분비 리더 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 언급한다. 따라서, 전사 및 후속 번역시, hCD33 분비 리더 서열을 포함하고 바람직하게는 그로 이루어지는 분비 리더 서열이 수득된다. 상기 분비 리더 서열은 거기에 융합된 관심 폴리펩티드가 숙주 세포로부터 효율적으로 분비되는 효과를 나타낸다. 분비 리더 서열은 생합성중에 절단된다. 전술한 바와 같이, 놀랍게도 본 발명자들에 의하면 전술한 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열과 hCD33 분비 리더 서열의 특정 조합이 폴리펩티드 발현의 현저한 증가를 가져옴이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에 따른 조합은 WO 2009/080720에 기재된 바와 같이 동일한 5' UTR을, hCD33 분비 리더 서열을 포함하지는 않지만 예를 들어 이뮤노글로불린 분비 리더 서열은 포함하는 다른 분비 리더 서열과 함께 사용하는 다른 조합보다 우수하다. 하나의 실시양태에 따라, 본 발명에 따른 발현 카세트에 사용된 hCD33 분비 리더 서열은 하기 아미노산 서열을 포함한다:
MPLLLLLPLLWAGALA (서열 12)
hCD33 분비 리더 서열에 대한 상이한 아미노산 서열이 문헌에 기재되어 있다. 대부분의 문서는 hCD33 분비 리더 서열이 하기 아미노산 서열로 이루어지는 것으로 기재하고 있다.
MPLLLLLPLLWAGALAMD (서열 13)
자명해지는 바와 같이, 서열 13은 서열 12와 비교하여 3' 말단에 2개의 추가의 아미노산을 포함한다. 하나의 실시양태에 따라, hCD33 분비 리더 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 12 또는 서열 13에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 분비 리더 서열을 코딩한다. 그러나, 서열 12에 나타낸 보다 짧은 hCD33 분비 리더 서열을 사용하는 것이 바람직하다.
약간 더 짧은 신호 서열은 정확한 펩티다제 절단의 확률을 증진시킬 것으로 여겨지고, 정확한 프로세싱을 가능케 해주며, 그리하여 생성물 품질을 보장해 준다. 서열 13에 나타낸 보다 긴 CD33 분비 리더 서열을 사용하면 관심 폴리펩티드가 분비 리더 서열이 절단되고 난 후 그들의 N-말단에 추가의 아미노산을 담지하는 위험성을 제기할 수 있으며, 이는 특히 의약용 폴리펩티드의 발현시 용납하기 어려운 것이다. 이러한 위험성은 서열 12에 나타낸 hCD33 분비 리더 서열을 사용할 때 회피된다. 또한, 특히 본 발명에 따른 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열과 조합하여 사용될 때, 보다 짧은 서열은 보다 양호한 전하 분포에 기인하여 분비에 명백히 더욱 효율적이다. 따라서, 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 서열 12에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 hCD33 분비 리더 서열을 코딩한다.
발현 카세트에서, 프로모터 (요소 a))는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열 (요소 b))로부터 5'에 배치되고, 이어서 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열은 hCD33 분비 리더 서열 (요소 c))을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 5'에 배치된다. 상기 요소는 각각의 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현 카세트 내로 삽입되는 경우 관심 폴리펩티드의 효율적인 발현을 허용하도록 발현 카세트에 작동가능하게 연결된다.
본 발명에 따른 발현 카세트는 "관심 폴리펩티드의 발현에 적합"하다. 이 용어는 특히, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 상기 발현 카세트 내로 삽입되는 경우 폴리펩티드가 상기 발현 카세트로부터 발현된다는 것을 기술한다. 따라서, 하나의 실시양태에 따라, 본 발명에 따른 발현 카세트는 요소 d)로서 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 상기 폴리뉴클레오티드는 관심 폴리펩티드의 코딩 영역을 포함한다. 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 cDNA이거나 또는 그로부터 유래된다. 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 추가의 분비 리더 서열을 포함하지 않는다. 관심 폴리펩티드를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 hCD33 분비 리더 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 3'에 위치하며, 그에 따라 발현시 hCD33 분비 리더 서열과 관심 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드가 수득된다. 본 발명에 따른 발현 카세트에 사용되는 5' UTR 및 분비 리더 서열은 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와는 이종이며, 즉 그들은 자연적으로는 상기 폴리뉴클레오티드와는 회합되지 않는다. 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현은 상기 5' UTR과 hCD33 리더 서열을 포함하고 바람직하게는 그로 이루어지는 상기 분비 리더 서열의 전사후 제어하에 있다.
대안적인 실시양태에 따라, 발현 카세트는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 위한 삽입 부위를 포함하되, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 아직 포함하지 않는다. 상기 삽입 부위는 hCD33 분비 리더 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 3'에 위치한다. 당해 목적을 위해, 발현 카세트는 예를 들어 모든 판독 프레임에 사용될 수 있는, 예를 들어 다중 클로닝 부위 (MCS)를 포함할 수 있다. 삽입 부위를 포함하는 각각의 "공(empty)" 발현 카세트는 목적하는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 삽입에 사용될 수 있다. 이는 주문자가 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 상기 삽입 부위 내로 삽입시킬 수 있고, 그리하여 발현 카세트를 완성하게 되는 이점이 있다. 발현시, 본 발명에 따른 분비 리더 서열에 융합된 목적하는 폴리펩티드는 상기 완성된 발현 카세트로부터 발현된 다음 분비된다. 따라서, 각각의 "공" 발현 카세트는 단순히 목적하는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입 부위 내로 삽입시킴으로써 발현 카세트를 의도하는 용도에 쉽사리 적응시킬 수 있기 때문에 상이한 관심 폴리펩티드를 발현시키기 위한 유용한 도구를 제공한다.
또한, 발현 카세트는 적당한 전사 종결 부위를 포함할 수 있다. 전사 종결 부위는 선행 기술에서 잘 특성화되어 있으며 발현 카세트 내 그들의 도입은 유전자 발현에 여러 유익한 영향을 미치는 것으로 나타났다. 이하에서 좀더 상세히 기재되는 바와 같이, 본 발명에 따른 발현 카세트는 특히 진핵 숙주 세포에서의 관심 폴리펩티드 발현용으로 의도된다. 대부분의 진핵생물 초기 mRNA는 그들의 3' 말단에, 1차 전사체의 절단 및 커플링된 폴리아데닐화 반응을 수반하는 복잡한 과정 동안에 첨가되는 폴리 A 테일을 소유한다. 폴리 A 테일은 mRNA 안정성에 특히 유리하다. 그러므로, 발현 카세트는 바람직하게는 전사 종결과 폴리아데닐화에 적합한 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 소 성장 호르몬 (bgh), 마우스 β-글로빈, SV40 초기 전사 유닛 및 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 유전자로부터 유래된 것들을 포함하여, 진핵 세포에서의 발현용으로 의도되는 발현 카세트에 사용될 수 있는 몇몇 효율적인 폴리 A 신호가 존재한다. 그러나, 또한 합성 폴리아데닐화 부위도 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Levitt el al., 1989, Genes Dev. 3, (7): 1019-1025]에 기반하는 프로메가(Promega)의 pCI-neo 발현 벡터 참조). 따라서, 본 발명에 따른 발현 카세트에 사용되는 폴리아데닐화 부위는 SV40 폴리 A 부위, 예컨대 SV40 후기 및 초기 폴리 A 부위 (예를 들어, 문헌 [Subramani et al., 1981, Mol.Cell. Biol. 854-864]에 기재된 바와 같은 플라스미드 pSV2-DHFR 참조), 합성 폴리 A 부위 (예를 들어, 문헌 [Levitt el al., 1989, Genes Dev. 3, (7): 1019-1025]에 기반하는 프로메가의 pCI-neo 발현 벡터 참조) 및 bgh 폴리 A 부위 (소 성장 호르몬)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 전사 종결 부위는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 함께 제공될 수 있거나 또는 발현 카세트에 별개 요소로서 제공될 수 있다.
따라서, 하나의 실시양태에 따라, 발현 카세트는 요소 e)로서 3' UTR 서열을 추가로 포함한다. 3' 비-번역 영역 (3' UTR)은 코딩 영역 다음에 오며 조절 요소를 포함한다. 상기 3' UTR의 내에 포함되어 있을 수 있는 요소는 RNAi, 예컨대 miRNA를 유도하는 단백질 및/또는 분자에 대한 결합 부위를 포함하며 이에 제한되지 않는다. 하나의 실시양태에 따라, 하기 서열을 포함하는 3' UTR이 사용된다:
Figure pct00024
(서열 14)
또한, 발현 카세트는 요소 f)로서 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 적합한 폴리아데닐화 부위는 전술하였다. 하나의 실시양태에 따라, 하기 서열을 포함하는 폴리 A 부위가 사용된다:
Figure pct00025
(서열 15)
바람직한 실시양태에 따라, 발현 카세트는 하기 요소를 포함한다:
a) 프로모터, 바람직하게는 인간 CMV 프로모터 또는 인간 CMV 프로모터로부터 유래한 프로모터;
b) 서열 1을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열, 서열 2를 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열, 서열 3을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열, 서열 4를 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열, 서열 5를 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열, 서열 6을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열, 서열 7을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열, 및 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6 또는 서열 7에 나타낸 서열에 대해 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열;
c) hCD33 분비 리더 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
d) 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 위한 삽입 부위;
e) 3' UTR 폴리뉴클레오티드 서열; 및
f) 폴리 A 부위.
기술하였듯이, % 동일성은 참조 서열의 전체 길이에 걸쳐서 계산될 수 있다. 전술한 바와 같이 및 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 발현 카세트는 관심 폴리펩티드의 증가된 발현을 가져온다. "폴리펩티드"는 펩티드 결합(들)에 의하여 함께 연결된 아미노산의 중합체를 포함하는 분자를 언급한다. 폴리펩티드는 단백질 (예를 들어, 50개보다 많은 아미노산을 가짐) 및 펩티드 (예를 들어, 2 내지 49개의 아미노산을 가짐)를 비롯하여 임의의 길이의 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드는 임의의 활성 또는 생물활성의 단백질 및/또는 펩티드를 포함한다. 생산하고자 하는 폴리펩티드는 제약 또는 치료 활성 화합물, 또는 검정 등에 이용될 연구 도구일 수 있다. 폴리펩티드는 따라서 어떤 특정 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 군에 한정되지 않으며, 그와 반대로 본원 기재의 방법에 의하여 선택 및/또는 발현하기를 소망하는 임의의 크기, 기능 또는 기원의 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 따라서, 몇몇 상이한 관심 폴리펩티드를 본 발명에 따른 발현 카세트 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포로부터 발현시킬 수 있다. 위에서 개요된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 예를 들어 생물활성 폴리펩티드, 예컨대 효소 단백질 또는 펩티드 (예를 들어, 프로테아제, 키나제, 포스파타제), 수용체 단백질 또는 펩티드, 수송체 단백질 또는 펩티드, 살박테리아성 및/또는 내독소-결합 단백질, 구조 단백질 또는 펩티드, 면역 폴리펩티드, 이뮤노글로불린, 독소, 항생제, 호르몬, 성장 인자, 백신 등을 비롯하여 임의의 활성 또는 생물활성의 단백질 및/또는 펩티드를 포함한다. 상기 폴리펩티드는 펩티드 호르몬, 인터류킨, 조직 플라스미노겐 활성화인자, 시토카인, 이뮤노글로불린, 특히 항체 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체 및 단일 도메인 항체 (또한 "나노바디"로도 호칭)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 하나의 실시양태에 따라, 관심 폴리펩티드는 글리코실화된다. 본 발명에 따른 발현 카세트로부터 발현되는 관심 폴리펩티드는 또한 상기 폴리펩티드 중 하나의 서브유닛 또는 도메인, 예컨대 예를 들어 항체 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 중쇄 또는 경쇄일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 관심 폴리펩티드는 이뮤노글로불린 분자, 보다 바람직하게는 항체, 또는 그의 서브유닛 또는 도메인, 예컨대 예를 들어 항체 또는 단일 도메인 항체의 중쇄 또는 경쇄이다. 상술한 것의 기능적 단편 또는 유도체 또는 상술한 것의 서브유닛 또는 도메인, 예컨대 예를 들어 항체 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 중쇄 또는 경쇄가 또한 포함된다. 하나의 실시양태에 따라, 관심 폴리펩티드는 hCD33이 아니다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 디술피드 결합에 의하여 연결된 적어도 두 중쇄 및 두 경쇄를 포함하는 단백질을 특히 언급한다. 용어 "항체"는 자연 발생 항체 및 항체의 모든 재조합 형태, 예를 들어 인간화 항체, 완전 인간 항체와 키메라 항체를 포함한다. 각 중쇄는 보통은 중쇄 가변 영역 (VH)과 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함하여 이루어져 있다. 각 경쇄는 보통은 경쇄 가변 영역 (VL)과 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함하여 이루어져 있다. 중쇄 불변 영역은 3개의 또는 - IgM 또는 IgE 유형 항체의 경우에는 - 4개의 중쇄 불변 도메인 (CH1, CH2, CH3 및 CH4)을 포함하며, 여기서 제1 불변 도메인 CH1은 가변 영역에 인접하며 힌지 영역에 의하여 제2 불변 도메인 CH2에 연결될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 1개의 불변 도메인만으로 이루어져 있다. 가변 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존되어 있는 영역에 산재한, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변성의 영역으로 보다 세분될 수 있으며, 여기서 각 가변 영역은 3개의 CDR과 4개의 FR을 포함한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)을 포함하여 숙주 조직 또는 인자에의 이뮤노글로불린 결합을 매개할 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 용어 "항체"는 항체의 다른 유형과 변이체, 예컨대 중쇄 항체, 즉 1개 이상의, 특히 2개의 중쇄만으로 이루어진 항체, 및 나노바디, 즉 단일 단량체 가변 도메인만으로 이루어진 항체를 또한 포함한다. 그러한 나노바디 역시도 연결시켜 다가 구조를 형성할 수 있다. 바람직하게는, 항체는 적당한 숙주 세포에서의 발현시 글리코실화된다. 전술한 바와 같이, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 관심 폴리펩티드로서 항체의 1개 이상의 서브유닛 또는 도메인, 예를 들어 중쇄 또는 경쇄 또는 기능적 단편 또는 유도체를 또한 코딩할 수 있다.
나노바디로도 호칭되는 단일 도메인 항체는 단일 단량체 가변 항체 도메인으로 이루어진 항체 단편이다. 전체 항체처럼, 단일 도메인 항체는 특정 항원에 선택적으로 결합할 수 있다. 불과 12 내지 15 kDa의 분자량으로 인해, 단일 도메인 항체는 두 중 단백질 쇄 및 두 경쇄로 이루어져 있는 일반 항체 (150 내지 160 kDa)보다 훨씬 작으며, 심지어는 Fab 단편 및 단일 쇄 가변 단편보다 더 작다. 최초의 단일 도메인 항체는 낙타과 동물에서 발견되는 중쇄 항체로부터 조작되었으며; 이들은 "VHH 단편"으로 호칭된다. 중쇄 항체는 다른 종에서도 또한 발견된다. 대안적인 접근법은 인간 또는 마우스로부터의 일반 이뮤노글로불린 G (IgG)로부터 이량체 가변 도메인을 단량체로 분할하는 것이다. 비록 단일 도메인 항체에 대한 대부분의 연구가 현재로서는 중쇄 가변 도메인에 기반하고 있지만, 경쇄로부터 유래한 나노바디 역시도 표적 에피토프에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다. 라마(llama) 종 (라마 파코스(Lama paccos), 라마 글라마(Lama glama) 및 라마 비쿠냐(Lama vicugna))과 같은 신세계 구성원을 포함한 낙타 및 단봉낙타 패밀리 (카멜루스 박트리아누스(Camelus bactrianus) 및 카멜루스 드로메다리우스(Camelus dromedarius))의 구성원으로부터 수득한 항체 단백질이 크기, 구조적 복잡성 및 인간 대상체에 대한 항원성에 관하여 특성화되었다. 자연에서 발견되는 이러한 패밀리의 포유동물로부터의 특정 IgG 항체는 경쇄가 결여되어 있으며, 따라서 다른 동물로부터의 항체에 대한 두 중쇄와 두 경쇄를 갖는 전형적인 4쇄 4차 구조와는 구조적으로 다르다 (WO 94/04678 참조).　 VHH로서 확인되는 소형 단일 가변 도메인인 낙타 항체의 영역은 표적에 대한 높은 친화도를 보유한 소형 단백질을 산출하도록 유전자 조작함으로써 수득될 수 있으며, 그에 따라 "낙타 나노바디"로서 알려진 저-분자량 항체-유래 단백질이 도출된다 (다음 참조: US 5,759,808; Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62; 및 Lauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520).　 낙타 항체 및 항체 단편의 조작된 라이브러리가 시판되고 있다.　 비-인간 기원의 다른 항체처럼, 낙타 항체의 아미노산 서열을 재조합적으로 변경시켜 인간 서열과 더욱 흡사한 서열을 수득할 수 있으며, 즉 나노바디를 "인간화"시킬 수 있다.　 각각의 단일 도메인 항체는 본 발명의 교시를 이용하여 또한 발현시킬 수 있다.　 또한, 기재하였듯이, 단일 도메인 항체를 또한 연결시켜 다가 구조를 형성할 수 있다. 각각의 다량체 나노바디는 본 발명의 교시를 이용하여 또한 발현시킬 수 있다. 하나의 실시양태에 따라, 다량체 나노바디는 단일 발현 카세트로부터 발현된다.
항체의 "기능적 단편 또는 유도체"는 특히, 항체로부터 유래되고 동일한 항원에, 특히 항체와 동일한 에피토프에 결합할 수 있는 단백질 또는 당단백질을 언급한다. 이는 이뮤노글로불린 분자의 단편 또는 유도체, 중쇄 또는 경쇄에 대해서도 준용해서 적용된다. 항체의 항원-결합 기능이 전장 항체 또는 그의 유도체의 단편에 의하여 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 단편 또는 유도체의 예는 (i) 각각 중쇄와 경쇄의 가변 영역과 제1 불변 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 브리지에 의하여 연결된 두 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; (iii) 중쇄의 가변 영역과 제1 불변 도메인 CH1으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로 이루어진 Fv 단편; (v) 단일 폴리펩티드 쇄로 이루어진 Fv 단편인 scFv 단편; (vi) 함께 공유적으로 연결된 두 Fv 단편으로 이루어진 (Fv)2 단편; (vii) 중쇄 가변 도메인; 및 (viii) 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 회합이 분자내에서가 아니라 분자간에서만 일어날 수 있도록 하는 방식으로 함께 공유적으로 연결된 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역으로 이루어진 멀티바디를 포함한다. 이들 항체 단편 및 유도체는 통상의 기술자에게 알려져 있는 통상적인 기술을 이용하여 수득될 수 있다.
본 발명의 교시에 따라 발현시킬 수 있는 폴리펩티드의 전술한 예로부터 자명해지듯이, 숙주 세포에 의하여 생산되고 분비될 최종 폴리펩티드는 또한 이량체 또는 다량체 단백질일 수 있다. 각 단백질의 바람직한 예는 이뮤노글로불린 분자, 특히 예를 들어 중쇄와 경쇄를 포함하는 항체이다. 각각의 이량체 또는 다량체 단백질을 생산하기 위한 몇가지 선택사항이 존재한다.
하나의 실시양태에 따라, 상기 이량체 또는 다량체 단백질의 2개 이상의 서브유닛 또는 도메인이 본 발명에 따른 하나의 발현 카세트로부터 발현된다. 당해 실시양태에서, 이량체 또는 다량체 단백질의 개별 서브유닛 또는 도메인의 코딩 영역을 포함하는 각각의 발현 카세트로부터 하나의 길이가 긴 전사체가 수득된다. 하나의 실시양태에 따라, 적어도 하나의 IRES 요소 (내부 리보솜 진입 부위)가 개별 서브유닛 또는 도메인의 코딩 영역 사이에 기능가능하게 위치하며, 각각의 코딩 영역 앞에 전술한 바와 같은 hCD33 분비 리더 서열이 선행된다. 그리하여, 별개 번역 생성물이 상기 전사체로부터 수득되는 것이 보장되고, 최종 이량체 또는 다량체 단백질이 정확하게 조립되고 분비될 수 있는 것이 보장된다. 또한, 다량체 나노바디 역시도 단일 발현 카세트로부터 발현될 수 있다.
그러나, 이량체 또는 다량체 단백질의 개별 서브유닛 또는 도메인을 상이한 발현 카세트로부터 발현시키는 것 또한 본 발명의 범위 안에 들어오며, 일부 실시양태의 경우 그렇게 하는 것이 한층 바람직하다. 하나의 실시양태에 따라, 본 발명에 따른 발현 카세트는 모노시스트론성 발현 카세트이다. 당해 실시양태에서, 각각의 발현 카세트는 관심 폴리펩티드로서 이량체 또는 다량체 단백질의 1개 서브유닛 또는 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 하나의 실시양태에 따라, 이들 발현 카세트의 전부는 본 발명의 교시에 따라 설계된다. 그러나, 상이한 발현 카세트에 대한 상이한 설계를 사용하는 것 또한 본 발명의 범위 안에 들어온다. 개별 발현 카세트로부터 개별 서브유닛/도메인의 발현 후, 최종 이량체 또는 다량체 단백질이 숙주 세포로부터 조립되고 분비된다. 당해 실시양태는 본 발명에 따른 발현 벡터에 관련하여 보다 상세하게 설명될 예정이다.
바람직한 실시양태에 따라, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 관심 폴리펩티드로서 항체 분자 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩한다.
하나의 실시양태에 따라, 본 발명에 따른 발현 카세트는 적어도 이뮤노글로불린 분자의 불변 영역의 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 이미 포함하고 있다. 이어서 이뮤노글로불린 분자의 상응하는 가변부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용자/주문자에 의하여 적당한 클로닝 전략을 사용하여 발현 카세트 내로 삽입시켜 발현 카세트를 완성할 수 있다.
발현 카세트는 고 발현 숙주 세포의 선택을 완화하고/하거나 향상시키는 데 사용될 수 있는 추가의 요소를 포함할 수 있다. 관심 폴리펩티드를 고 수율로 발현하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선행 기술에 알려져 있는 하나의 확립된 선택 방법은 유동 세포측정법, 특히 형광 활성화 세포 분류법 (FACS)의 이용에 기반한다. 유동 세포측정법을 채용하는 선택 방법은 다수의 세포를 신속하게 스크리닝할 수 있는 이점이 있다. 고 생산 세포 클론의 확인에 특히 유용한 하나의 선택 방법에서, 관심 생성물, 예를 들어 항체의 일부는 막-결합 융합 폴리펩티드로서 발현된다. 그리하여, 생성물의 일부는 융합 폴리펩티드로서 세포 표면상에 제시된다. 생산된 융합 폴리펩티드의 양은 전체 발현율과 상관관계가 있으므로, 숙주 세포는 세포 표면상에 제시된 융합 폴리펩티드의 양에 기초하여 유동 세포측정법을 통해 선택될 수 있다. 이는 고 생산 숙주 세포의 신속한 선택을 가능케 해준다. 본 발명에 따른 발현 카세트는 그것이 유동 세포측정법의 사용에 기반하는 각 선택 방법에 사용될 수 있도록 유리하게 적응시킬 수 있다. 유동 세포측정법, 바람직하게는 FACS를 사용하는 효율적인 선택을 가능케 하기 위해서는, 특수 발현 카세트가 관심 폴리펩티드의 발현에 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 실시양태에 따라, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 발현 카세트는 발현된 관심 폴리펩티드의 일부, 바람직하게는 10% 미만, 보다 바람직하게는 5% 미만 또는 심지어는 2.5% 미만이 막횡단 앵커를 포함하도록 설계된다. 그 결과를 달성하기 위해서는 몇가지 선택사항이 존재한다.
하나의 실시양태에 따라, 상기 발현 카세트는 추가로 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하류에 적어도 하나의 정지 코돈, 및 정지 코돈의 하류에 막 앵커 및/또는 막 앵커에 대한 신호를 코딩하는 추가 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 각각의 요소는 작동적으로 연결된다. 발현 카세트의 이러한 설계는 번역 완독 과정을 통해 (정지 코돈은 "리키(leaky)") 관심 폴리펩티드의 일부가 막 앵커를 포함하는 융합 폴리펩티드로서 생산되는 효과를 나타낸다. 그 결과로서, 당해 융합 폴리펩티드는 세포 표면상에 제시되고, 고 수준의 막-고정 융합 폴리펩티드를 제시하는 세포는 유동 세포측정법에 의하여, 바람직하게는 FACS에 의하여 선택될 수 있다. 그리하여, 높은 발현율을 보유하는 숙주 세포가 선택된다. 당해 정지 코돈 기반 기술의 세부사항과 바람직한 실시양태는 WO 2005/073375 및 WO 2010/022961에 기재되어 있다. 이 개시내용을 참조한다.
대안적인 실시양태에 따라, 상기 발현 카세트는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하류에 적어도 5' 스플라이스 공여자 부위와 3' 스플라이스 수용자 부위를 포함하고 인 프레임 번역 정지 코돈과 폴리아데닐화 신호를 포함하는 인트론 및 상기 인트론의 하류에 막 앵커 및/또는 막 앵커에 대한 신호를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 각각의 요소는 작동적으로 연결된다. 발현 카세트의 이러한 설계는 전사 및 전사체 프로세싱을 통해 적어도 2종의 상이한 성숙 mRNA (mRNA-POI) 및 (mRNA-POI-ANCHOR)가 발현 카세트로부터 수득되는 효과를 나타낸다. mRNA-POI의 번역은 관심 생성물을 가져온다. mRNA-POI-ANCHOR의 번역은 관심 생성물과 막 앵커를 포함하는 융합 폴리펩티드를 가져온다. 그 결과로서, 당해 융합 폴리펩티드 역시 세포 표면상에 제시되고, 고 수준의 막-고정된 융합 폴리펩티드를 제시하는 세포는 유동 세포측정법, 바람직하게는 FACS에 의하여 선택될 수 있다. 그리하여, 높은 발현율을 보유하는 숙주 세포가 선택된다. 당해 인트론 기반 기술의 세부사항 및 바람직한 실시양태는 WO 2007/131774에 기재되어 있다. 이 개시내용을 참조한다.
관심 생성물로서 항체의 발현에 특히 유용한 바람직한 실시양태에 따라, 막 앵커는 이뮤노글로불린 막횡단 앵커이다. 이뮤노글로불린 막횡단 앵커의 다른 적합한 막 앵커 및 바람직한 실시양태는 WO 2007/131774, WO 2005/073375 및 WO 2010/022961에 기재되어 있다. 각각의 개시내용을 참조한다.
제2 측면에 따라, 본 발명은 본 발명의 제1 측면에 따른 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는, 관심 폴리펩티드를 발현하는 발현 벡터를 제공한다. 상기 발현 카세트는 위에서 상세하게 기재하였으며, 따라서 상기 개시내용을 참조한다.
본 발명에 따른 "발현 벡터"는 특히 적어도 하나의 외래 핵산 단편을 운반할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 언급한다. 벡터는 분자 담체처럼 기능하여, 핵산의 단편인 각각의 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 전달하게 된다. 벡터는 그 안에 도입된 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적당하게 발현시키기 위한 필요한 조절 서열을 포함하는 본 발명의 제1 측면에 따른 적어도 하나의 발현 카세트를 포함한다.
하나의 실시양태에 따라, 발현 벡터는 선택 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트를 추가로 포함한다. 상기 발현 카세트는 그 안에 도입된 선택 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적당하게 발현시키기 위한 필요한 조절 서열을 포함한다. 선택 마커는 진핵 숙주 세포에 유독한 작용제 또는 약물, 예컨대 항생제, 특히 아미노글리코시드 항생제에 대한 내성을 제공하는 선택 마커, 예를 들어 네오마이신 선택 마커를 포함한다. 선택 마커는 또한 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 및 글루타민 신세타제 (GS)와 같은 진핵 선택 마커를 포함하며 이에 제한되지 않는다. 폴산 수용체와 같은 다른 적합한 선택 마커는 WO 2009/080759 및 WO 2010/097240에 기재되어 있다. 바람직하게는, 발현 벡터는 증폭가능한 선택 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트를 포함한다. 증폭가능한 선택 마커는 유전자 증폭뿐만 아니라 벡터-함유 진핵 숙주 세포의 선택도 가능케 해준다. 증폭가능하고 선택가능한 포유동물 마커 유전자에 대한 비-제한적인 예는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자이다. 현재 사용중에 있는 다른 시스템은 그 중에서도 특히 글루타민 신세타제 (GS) 시스템 (Bebbington et al., 1992) 및 히스티디놀-구동 선택 시스템 (Hartmann and Mulligan, 1988)이다. 이들 증폭가능한 마커는 또한 선택 마커이며 따라서 벡터를 획득한 세포의 선택에 사용될 수 있다. DHFR 및 글루타민 신세타제는 양호한 결과를 제공한다. 양쪽 경우 모두에서, 선택은 보통은 적당한 대사산물 (DHFR의 경우에는 히포크산틴과 티미딘, GS의 경우에는 글루타민)의 부재하에 일어나며, 그리하여 비-형질전환된 세포의 성장을 방지하게 된다. DHFR 시스템과 같은 증폭가능한 시스템으로는, 세포를 유전자 증폭을 촉진하는 특정 작용제, 예컨대 DHFR 시스템의 경우에 안티폴레이트 (예를 들어, 메토트렉세이트 (MTX))에 노출시킴으로써 재조합 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다. 유전자 증폭을 촉진하는 GS에 대한 적합한 억제제는 메티오닌 술폭시민 (MSX)이다. MSX에로의 노출 역시 유전자 증폭을 가져온다. 바람직한 실시양태에 따라, 발현 벡터는 선택 마커로서 디히드로폴레이트 리덕타제 효소 (DHFR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
또한, 발현 벡터는 원핵 선택 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 또한 포함할 수 있다. "원핵 선택 마커"는 적당한 선택 조건하에서 원핵 숙주 세포에서의 선택을 가능케 해주는 선택 마커이다. 각 원핵 선택 마커의 예는 항생제, 예컨대 예를 들어 암피실린, 카나마이신, 테트라시클린 및/또는 클로람페니콜에 대한 내성을 제공하는 마커이다. 발현 벡터에 원핵 선택 마커를 포함하는 것은 발현 벡터가 원핵 숙주 세포에서 용이하게 증식될 수 있는 이점이 있다.
바람직하게는, 발현 벡터는 본 발명의 제1 측면에 따른 적어도 하나의 발현 카세트, 아미노글리코시드 항생제에 대한 내성을 제공하는 진핵 선택 마커, 바람직하게는 neo 선택 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트, 및 증폭가능한 선택 마커, 바람직하게는 DHFR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
본 발명에 따른 발현 벡터는 관심 폴리펩티드를 발현하는 하나 초과의 발현 카세트를 포함할 수 있다. 따라서, 하나의 실시양태에 따라, 동일하거나 상이한 관심 폴리펩티드를 발현하는 몇종의 발현 카세트가 본 발명에 따른 발현 벡터상에 배열된다. 그러므로, 본 발명은 하나 초과의 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 또한 제공하며, 여기서 각각의 발현 카세트는 예를 들어 이량체 또는 고차 다량체 단백질의 서브유닛 또는 도메인을 코딩한다. 각각이 상이한 발현 카세트에 도입된 다량체 단백질의 상이한 서브유닛을 코딩하는 발현 카세트를 예를 들어 서로에 대하여 인접하여 배치시킬 수 있다. 적어도 두 별개 유전자에 의하여 코딩된 다량체 단백질 (예를 들어, 항체 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 경쇄 및 중쇄)을 위하여, 관심 폴리펩티드로서 목적하는 서브유닛 또는 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 상이한 발현 카세트 내로 삽입된다. 관심 폴리펩티드로서 이량체 또는 다량체 단백질의 개별 서브유닛 또는 도메인을 발현하는 적어도 두 별개 발현 카세트를 사용하는 각 실시양태는 예를 들어 항체와 같은 이뮤노글로불린 분자의 발현에 특히 유리하다. 숙주 세포에서, 이량체 또는 다량체 단백질, 예를 들어 항체는 조립되고 분비된다. 하나의 실시양태에 따라, 본원 개시내용에 따른 발현 카세트 설계는 항체의 중쇄 발현에 사용된다. 경쇄의 발현 카세트는 실시양태에서 상이한 설계를 가질 수 있으며, 예를 들어 그것은 상이한 분비 리더 서열, 예컨대 예를 들어 Ig 리더 서열을 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에 따라, 양쪽 발현 카세트 모두는 본원 개시내용의 교시에 따라 설계된다.
따라서, 하나의 실시양태에 따라, 발현 벡터는 본 발명의 제1 측면에 따른 적어도 두 발현 카세트를 포함한다. 상기 발현 카세트 중 하나 내에 포함되어 있는 폴리뉴클레오티드는 관심 폴리펩티드로서 이뮤노글로불린 분자 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 중쇄를 코딩하고, 다른 발현 카세트 내에 포함되어 있는 폴리뉴클레오티드는 관심 폴리펩티드로서 이뮤노글로불린 분자 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 경쇄를 코딩한다. 숙주 세포에서 상기 발현 카세트로부터 경쇄 및 중쇄의 발현시, 바람직하게는 항체인 기능적 이뮤노글로불린 분자는 숙주 세포로부터 조립되고 분비된다. 하나의 실시양태에 따라, 경쇄 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체에 대한 5' UTR은 서열 3을 포함하거나 또는 서열 3으로 이루어진다. 하나의 실시양태에 따라, 중쇄 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체에 대한 5' UTR은 서열 1 또는 서열 4를 포함하거나 또는 서열 1 또는 서열 4로 이루어진다. 하나의 실시양태에 따라, 경쇄 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체에 대한 5' UTR은 서열 5를 포함하거나 또는 서열 5로 이루어진다. 하나의 실시양태에 따라, 중쇄 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체에 대한 5' UTR은 서열 6 또는 서열 7을 포함하거나 또는 서열 6 또는 서열 7로 이루어진다.
본 발명에 관련하여 사용될 수 있는 적합한 발현 벡터는 WO 2009/080720에 기재되어 있으며, 그러나 본 발명의 교시에서는 WO 2009/080720에 의하여 교시된 이뮤노글로불린 분비 리더 서열이 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트(들)에서 hCD33 분비 리더 서열에 의하여 치환된다. 기재한 바와 같이, 하나 초과의 발현 카세트가 발현 벡터에 존재하는 경우에, 하나의 발현 카세트가 본원에 기재된 바와 같이 설계되는 것으로 충분하다.
제3 측면에 따라, 본 발명의 제1 측면에 따른 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하고/하거나 본 발명의 제2 측면에 따른 적어도 하나의 발현 벡터를 포함하는 진핵 숙주 세포가 제공된다. 본 발명에 따른 발현 카세트와 발현 벡터는 위에서 상세하게 기재하였으며, 또한 여기에도 적용되는 상기 개시내용을 참조한다. 바람직하게는, 발현 카세트는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는 발현 벡터 내에 포함되어 있는 각각의 발현 카세트는 형질감염에 의하여 숙주 세포 내로 도입시킬 수 있다.
하나의 실시양태에 따라, 진핵 숙주 세포는 본 발명에 따른 적어도 두 발현 카세트를 포함한다. 하나의 실시양태에 따라, 상기 발현 카세트의 각각은 관심 폴리펩티드로서 이량체 또는 다량체 단백질의 적어도 하나의 서브유닛 또는 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 당해 실시양태는 이뮤노글로불린 분자의 발현에 특히 적합하다. 바람직한 실시양태에 따라, 숙주 세포는 관심 폴리펩티드로서 이뮤노글로불린 분자 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 제1 측면에 따른 제1 발현 카세트 및 관심 폴리펩티드로서 이뮤노글로불린 분자 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 제1 측면에 따른 제2 발현 카세트를 포함한다. 전술한 바와 같이, 바람직하게는, 경쇄를 발현하는 발현 카세트에 사용되는 5' UTR은 서열 3을 포함하거나 또는 서열 3으로 이루어지고 중쇄를 발현하는 발현 카세트에 사용되는 5' UTR은 서열 1 또는 서열 4를 포함하거나 또는 서열 1 또는 서열 4로 이루어진다. 하나의 실시양태에 따라, 경쇄를 발현하는 발현 카세트에 사용되는 5' UTR은 서열 5를 포함하거나 또는 서열 5로 이루어지고 중쇄를 발현하는 발현 카세트에 사용되는 5' UTR은 서열 6 또는 서열 7을 포함하거나 또는 서열 6 또는 서열 7로 이루어진다. 상기 발현 카세트는 전술한 바와 같은 하나 이상의 적당한 발현 벡터(들)를 사용함으로써 숙주 세포 내로 도입시킬 수 있다. 하나의 실시양태에 따라, 제1 발현 카세트는 하나의 발현 벡터에 의하여 도입시켰고 제2 발현 카세트는 제2 발현 벡터에 의하여 도입시켰다. 그러나, 양쪽 발현 카세트 모두는 양쪽 발현 카세트 모두를 운반하는 하나의 발현 벡터를 사용하여 도입시킨 것이 바람직하다.
하나의 실시양태에 따라, 진핵 숙주 세포는 항체의 중쇄를 발현하는 제1 측면에 따른 적어도 하나의 발현 카세트를 포함한다. 기술한 바와 같이, 예를 들어 서열 1, 4, 6 또는 7을 포함하거나 또는 서열 1, 4, 6 또는 7로 이루어진 5' UTR이 당해 목적을 위해 사용될 수 있다.
기본적으로는 어떠한 진핵 숙주 세포라도 그들이 본 발명에 따른 발현 카세트로부터의 폴리펩티드의 효율적인 발현을 허용하는 한 본 발명에 관련하여 사용될 수 있다. 바람직하게는, 진핵 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 상기 포유동물 세포는 바람직하게는 설치류 세포, 인간 세포 및 원숭이 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는 CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, 마우스 3T3 섬유모세포 및 SP2/0 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 설치류 세포의 사용이 특히 바람직하다. 숙주 세포로서 CHO 세포의 사용이 특히 바람직하다. 인간 세포는 예를 들어 HEK293 세포, MCF-7 세포, PerC6 세포 및 HeLa 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 원숭이 세포는 예를 들어 COS 세포 및 Vero 세포로부터 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 발현 벡터는 설치류 세포, 예컨대 DHFR- CHO 세포 또는 DHFR+ CHO 세포를 포함한 CHO 세포에서 폴리펩티드의 생산에 특히 적합하다. 바람직하게는, 숙주 세포는 CHO 세포이다.
제4 측면에 따라, 본 발명의 제2 측면에 따른 발현 벡터를 바람직하게는 포유동물 숙주 세포인 진핵 숙주 세포 내로 도입시키는, 본 발명의 제3 측면에 따른 숙주 세포를 생산하는 방법이 제공된다. 그리하여, 관심 폴리펩티드를 발현하는 바람직하게는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 측면에 따른 발현 카세트가 숙주 세포 내로 도입된다.
도입은 예를 들어 본 발명의 제2 측면에 따른 발현 벡터를 형질감염시킴으로써 달성될 수 있다. 하나의 실시양태에 따라, 발현 벡터는 숙주 세포의 게놈 내로 통합된다 (안정한 형질감염). 숙주 세포 내로 본 발명의 제1 측면에 따른 발현 카세트의 도입을 가능케 해주는 적합한 발현 벡터는 본 발명에 따른 제2 측면에 관련하여 위에서 상세하게 기재하였다. 도입된 발현 카세트가 게놈 내로 삽입되지 않으면 (일시적 형질감염), 후기에, 예를 들어 세포가 유사분열을 겪을 때 도입된 발현 카세트가 소실될 수 있다. 적합한 발현 벡터는 예를 들어 에피솜 복제에 의하여 게놈 내로의 통합 없이 숙주 세포에서 또한 유지시킬 수 있다. 발현 벡터를 포유동물 숙주 세포를 포함한 진핵 숙주 세포 내로 특히 형질감염에 의하여 도입하는 선행 기술에 알려져 있는 몇몇 적당한 방법이 있다. 각각의 방법은 인산칼슘 형질감염, 전기천공, 리포펙션, 유전자총- 및 중합체-매개 유전자 전달을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 전통적인 무작위 통합 기반 방법 외에도 또한 재조합-매개 접근법이 사용될 수 있다. 그러한 재조합 방법은 트랜스진의 지향성 삽입을 매개할 수 있는 Cre, Flp 또는 ΦC31같은 부위-특이적 레콤비나제 (예를 들어, 문헌 [Oumard et al., Cytotechnology (2006) 50: 93 - 108] 참조)의 사용을 포함할 수 있다. 이와 달리, 상동 재조합의 메카니즘을 이용하여 본 발명에 따른 발현 카세트를 삽입시킬 수도 있다 (문헌 [Sorrell et al., Biotechnology Advances 23 (2005) 431 - 469]에 개관되어 있음). 재조합 기반 유전자 삽입은 숙주 세포에 도입되는 발현 벡터에 포함시키고자 하는 요소의 수를 최소화하도록 해준다. 적합한 숙주 세포뿐만 아니라 적합한 발현 벡터의 실시양태 또는 본 발명에 따른 발현 벡터의 조합은 위에서 상세하게 기재하였으며; 상기 개시내용을 참조한다. 실시양태에 관련하여 전술한 바와 같이, 적어도 두 발현 벡터의 조합이 숙주 세포의 형질감염에 사용되는 경우에 이뮤노글로불린 분자 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트는 동일한 발현 벡터에 또는 상이한 발현 벡터에 위치할 수 있다.
제5 측면에 따라, 본 발명의 제3 측면에 따른 숙주 세포를 관심 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건하에서 세포 배양으로 배양하는 것을 포함하는, 상기 관심 폴리펩티드를 생산하는 방법이 제공된다. 숙주 세포 배양의 두 주요 포맷, 즉 부착 세포의 배양과 현탁 배양이 존재한다. 현탁 배양의 사용이 바람직하다. 하나의 실시양태에 따라, 상기 숙주 세포는 무혈청 조건하에서 배양된다.
관심 폴리펩티드는 본 발명에 따른 발현 카세트로부터 발현되고 숙주 세포로부터 예를 들어 배양 배지 내로 분비되며, 그로부터 분비 폴리펩티드가 수득될 수 있다. 하나 초과의 카세트가 숙주 세포에 존재할 경우, 예를 들어 이량체 또는 다량체 단백질이 발현될 때 (상기 참조), 그 이량체 또는 다량체 단백질은 세포에서 조립되고 이어서 숙주 세포로부터 분비된다. 본 발명에 따른 신규 5' UTR/분비 리더 서열 조합을 사용함으로써 달성되는 비상한 발현에 기인하여, 폴리펩티드는 고 수율로 발현되고 분비될 수 있다. 분비 폴리펩티드는 또한 추가 프로세싱 단계, 예컨대 예를 들어 정제 및/또는 변형 단계에 투입될 수 있다. 따라서, 관심 폴리펩티드를 생산하는 방법은 하기 단계 중 적어도 하나를 포함할 수 있다:
- 상기 세포 배양 배지로부터 관심 폴리펩티드를 단리하는 단계; 및/또는
- 단리된 관심 폴리펩티드를 프로세싱하는 단계.
따라서, 본 발명에 따라 생산된 폴리펩티드는 관련 기술분야에 알려져 있는 방법에 의하여 회수되고 임의로는 추가 프로세싱, 예를 들어 추가 정제, 단리 및/또는 변형될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 원심분리, 여과, 한외여과, 추출 또는 침전을 포함한 (이에 제한되지 않음) 통상적인 절차에 의하여 영양 배지로부터 회수될 수 있다. 정제는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화도, 소수성, 크로마토포커싱 및 크기 배제), 전기영동 절차 (예를 들어, 정제용 등전 포커싱), 차등 용해도 (예를 들어, 황산암모늄 침전) 또는 추출을 포함하여 (이에 제한되지 않음) 관련 기술분야에 알려져 있는 다양한 절차에 의하여 수행될 수 있다.
전술한 바와 같이, 관심 폴리펩티드는 바람직하게는 이뮤노글로불린 분자 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체, 보다 바람직하게는 항체 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체이다.
제6 측면에 따라, 본 발명은 발현 카세트로부터 관심 폴리펩티드를 고 수율로 발현시키기 위한 상기 발현 카세트에서의 hCD33 분비 리더 서열과 조합한 5' UTR 서열의 용도에 관한 것이며, 여기서 상기 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 1을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열, 서열 2를 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열, 서열 3을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열, 서열 4를 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열, 및 서열 1, 서열 2, 서열 3 또는 서열 4에 나타낸 서열에 대해 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되거나 또는 여기서 상기 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 5를 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열, 서열 6을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열, 서열 7을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열, 및 서열 5, 서열 6 또는 서열 7에 나타낸 서열에 대해 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 동일성은 참조 서열의 전체 길이에 걸쳐서 계산될 수 있다.
각 조합의 이점, 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열과 hCD33 분비 리더 서열의 적합하고 바람직한 실시양태 및 발현 카세트와 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 적합하고 바람직한 실시양태는 위에서 상세하게 기재하였다. 또한 여기에도 적용되는 상기 개시내용을 참조한다.
바람직하게는, 발현 카세트는 본 발명의 제1 측면에 관련하여 전술한 발현 카세트의 설계를 갖는다. 상기 개시내용을 참조한다. 하나의 실시양태에 따라, 발현 카세트는 하기 특징 중 하나 이상을 갖는다:
a) 발현 카세트는 프로모터를 포함함;
b) 발현 카세트는 전술한 바와 같은 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열을 포함함;
c) 발현 카세트는 서열 MPLLLLLPLLWAGALA (서열 12)을 포함하고 바람직하게는 그로 이루어지는 hCD33 분비 리더 서열을 포함함;
d) 발현 카세트는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 위한 삽입 부위를 포함함;
e) 발현 카세트는 3' UTR 서열을 포함함; 및/또는
f) 발현 카세트는 폴리 A 부위를 포함함.
개별 요소 및 바람직한 실시양태와 조합에 관하여 세부사항은 본 발명의 제1 측면에 관련하여 전술하였다. 상기 개시내용을 참조한다.
하나의 실시양태에 따라, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 관심 폴리펩티드로서 이량체 또는 다량체 단백질의 2개 이상의 서브유닛 또는 도메인을 코딩하며, 여기서 적어도 하나의 IRES 요소는 개별 서브유닛 또는 도메인의 코딩 영역 사이에 위치하고, 각각의 코딩 영역 앞에 hCD33 분비 리더 서열이 선행된다. 그러나, 본 발명의 맥락에서는 모노시스트론성 발현 카세트의 사용이 바람직하다.
대안적인 실시양태에 따라, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 관심 폴리펩티드로서 이량체 또는 다량체 단백질의 서브유닛 또는 도메인을 코딩한다. 바람직하게는, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 관심 폴리펩티드로서 항체 분자 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩한다. 하나의 실시양태에 따라, 본원 개시내용에 따른 발현 카세트 설계는 항체의 중쇄 발현에 사용된다. 여기서 경쇄를 발현하는 발현 카세트는 상이한 설계를 가질 수 있으며, 예를 들어 상이한 리더 서열, 예를 들어 Ig 리더 서열을 포함할 수 있거나, 또는 본 발명의 교시에 따라 또한 설계될 수 있다. 하나의 실시양태에 따라, 본원 개시내용에 따른 발현 카세트 설계는 항체의 경쇄 발현에 사용된다. 여기서 중쇄를 발현하는 발현 카세트는 상이한 설계를 가질 수 있으며, 예를 들어 상이한 리더 서열, 예를 들어 Ig 리더 서열을 포함할 수 있거나, 또는 본 발명의 교시에 따라 또한 설계될 수 있다.
하나의 실시양태에 따라, 특정 요소를 포함하는 것으로서 본원에 기재된 주제는 각각의 요소로 이루어지는 주제를 또한 언급한다. 특히, 특정 서열을 포함하는 것으로서 본원에 기재된 5' UTR은 각각의 서열로 또한 이루어질 수 있다.
본원 기재의 바람직한 실시양태를 선택하고 조합하는 것이 바람직하며, 바람직한 실시양태의 각 조합으로부터 생기는 구체적 주제 또한 본원 개시내용에 속한다.
본원에서 언급되는 바와 같은 텍스트와 문서의 전 내용은 참조로 본원에 포함되고 따라서 본원 개시내용의 일부를 구성한다.
하기 실시예는 본 발명을 어떠한 식으로도 그의 범위를 제한함이 없이 실례를 들어 설명하는 역할을 한다. 특히, 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태에 관계한다.
실시예
실시예는 하기 프로토콜에 따라 수행하였다:
실시예 A
I. 재료 및 방법
숙주 세포
숙주 세포로서 CHO-K1 세포로부터 유래한 CHO (차이니즈 햄스터 난소) 세포를 사용하였다.
발현 벡터
표준 대조군으로서 항체 경쇄와 중쇄를 발현하는 발현 카세트에 Ig 분비 리더 서열을 이용하는 WO 2009/080720 (특히 실시예 6 참조)에 기재된 바와 같은 설계를 가진 발현 벡터를 사용하였다. CMV 프로모터는 서열 8을 포함하였다. 서열 3은 경쇄 발현을 위한 5' UTR로서 사용되었고 서열 4는 중쇄 발현을 위한 5' UTR로서 사용되었다. 본 발명의 교시에 따른 발현 벡터는 상기 대조군 벡터로부터 기존 경쇄 및 중쇄 이뮤노글로불린 분비 리더 서열을 하기 hCD33 분비 리더 서열로 치환시킴으로써 수득되었다:
MPLLLLLPLLWAGALA (서열 12)
상기 발현 벡터를 사용하여 항체 분자를 발현시켰다. 상응하는 벡터 설계를 또한 사용하여 관심 폴리펩티드로서 나노바디를 발현시켰으되, 여기서는 서열 5에 따른 5' UTR이 사용되었다. 여기서는 그러나 오직 하나의 발현 카세트만이 필요로 하였다. 대조군 벡터는 동일한 설계를 가졌지만, 그 대신 Ig 리더 서열이 사용되었다.
세포 배양, 형질감염 및 선택
세포를 독점 인-하우스(proprietary in-house) 세포 배양 배지를 사용하여 배양하였으며, 주 2 내지 3회 정기적으로 계대하여 연구내내 대수증식기로 유지시켰다. 세포를 표준 뉴클레오펙션 방법을 이용하여 형질감염시켰다. 5E6 세포/뉴클레오펙션 임펄스를 원심분리한 다음 형질감염 완충제에 재현탁시켰다. 관심 폴리펩티드를 코딩하는 벡터 DNA 3 ㎍을 첨가하고, 뉴클레오펙션을 수행하였다. 형질감염 세포를 125 ml 진탕 플라스크에 옮기고, 진탕 조건하에 24 내지 48시간 동안 배양하였다. G-418로의 제1 선택 단계를 WO 2009/080720에 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. 두 추가의 메토트렉세이트 (MTX) 선택 단계, 즉 500 nM MTX 및 1000 nM MTX로 추가 선택을 수행하였다. 내성을 띠는 대부분 양호하게 생산하는 세포를 포함하여 이루어지는 선택된 풀을 제한 희석에 의하여 또는 FACS 시스템을 사용하여 0.5 내지 1개 세포/웰의 밀도로 클로닝하였다. 수득된 클론에 대하여, 클론 생산성 및 성장을 상이한 스크리닝 포맷으로 분석하였다.
II. 결과
Ig 분비 리더 서열을 포함하는 선행 기술에 따른 발현 벡터 (대조군 발현 벡터)와 hCD33 분비 리더 서열을 포함하는 본 발명에 따른 발현 벡터로 수득한 실험 데이터는 본 발명에 따른 특정 5' UTR과 hCD33 분비 리더 서열의 신규 조합 사용시 생산된 항체 역가가 현저히 증가하였음을 증명해보여 주었다. 관심 단백질로서, IgG 항체가 발현되었다. 풀 수준에서의 관찰된 생산성 증가는 본 발명에 따른 발현 벡터의 사용시 평균적으로 2.88배이었다. 결과는 클론 수준에서 더욱 개선될 수 있었는데, 여기서 본 발명에 따른 발현 벡터의 사용시 (대조군 발현 벡터로 수득된 최상 대조군 클론과 본 발명에 따른 발현 벡터로 수득된 최상 클론의 비교시) 4.1배의 생산성 증가가 달성될 수 있었다.
관심 단백질로서 나노바디를 발현하는 경우, 최상 클론의 비교는 본 발명에 따른 발현 벡터의 사용시 1.1배의 생산성 증가를 보여주었고, 6개의 최상 클론을 비교시 평균적으로 1.6배의 생산성 증가가 달성되었다. 이는 하기 표에 의하여 예시되었다:
<표 2>
IgG 항체를 사용한 신규 조합 평가: 본 발명에 따른 발현 벡터로는 풀 수준에서 2.88배 생산성 증가가 달성되었다.
Figure pct00026
<표 3>
IgG 항체를 사용한 신규 조합 평가: 선행 기술에 알려져 있는 발현 벡터와 본 발명에 따른 발현 벡터의 최상 클론 비교시 4.1배 생산성 증가 및 6개 최상 클론의 평균으로: 4배 생산성 증가.
Figure pct00027
<표 4>
나노바디를 사용한 신규 조합 평가: 선행 기술에 알려져 있는 발현 벡터와 본 발명에 따른 발현 벡터의 최상 클론 비교시 1.1배 생산성 증가 및 6개 최상 클론의 평균으로: 1.6배 생산성 증가.
Figure pct00028
실시예 B
발현 벡터
표준 대조군으로서 항체 경쇄와 중쇄를 발현하는 발현 카세트에 Ig 분비 리더 서열을 이용하는 WO 2009/080720 (특히 실시예 6 참조)에 기재된 바와 같은 기본적 설계를 가지는 발현 벡터를 사용하였다. 중쇄에 대한 발현 카세트는 WO 2010/022961에 기재된 리키 정지 코돈 기술을 이용하여 변형시켜 FACS 선택을 촉진하였다. CMV 프로모터는 서열 8을 포함하였다. 서열 5는 경쇄 발현을 위한 5' UTR로서 사용되었고, 서열 7은 중쇄 발현을 위한 5' UTR로서 사용되었다. 본 발명의 교시에 따른 발현 벡터는 상기 대조군 벡터로부터 기존 중쇄 이뮤노글로불린 분비 리더 서열을 하기 hCD33 분비 리더 서열로 치환시킴으로써 수득되었다:
MPLLLLLPLLWAGALA (서열 12)
상기 발현 벡터를 사용하여 상이한 항체 분자를 발현시켰다.
3종의 상이한 항체에 대하여 중쇄 카세트에 대한 평가를 수행하여 IgG 발현 및 정확한 신호 펩티드 (리더 서열) 프로세싱을 어드레싱하였다. 리더 서열의 정확한 프로세싱, 즉 신호 펩티다제에 의한 리더 서열 절단은 그의 N-말단에서 관심 폴리펩티드의 예상된 서열, 및 따라서 예상된 품질을 갖는 기능적 분자를 수득하는 데에 필수이다. 선행 기술 설계를 사용하는 일부 경우에 있어서 신호 펩티드의 프로세싱이 부정확하였고, 예를 들어 N-말단에 1개 이상의 추가의 아미노산을 갖는 중쇄 또는 경쇄를 생성하였음이 이전에 주시되었다. N-말단에 올바르지 않게 남아있는 1개 이상의 아미노산에 따라, 리더 서열의 잔류하는 1개 이상의 아미노산에 의한 아미노산 서열의 이러한 연장은 예를 들어 분자의 응집 성향을 증가시키거나 또는 디술피드 결합 형성을 유도할 수 있다. 따라서, 그것은 생성물 품질에 격심한 영향을 미칠 수 있다. 또한, 부정확한 신호 펩티드 프로세싱은 관심 폴리펩티드, 예컨대 항체 생성물이 N-말단에서의 예측된 절단 부위로부터 하류에서 프로테아제에 의하여 절단되는 (또한 "클립핑"으로도 호칭) 위험을 제기하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 점은 말단절단 생성물을 생성하게 되며, 이는 또한 분자 품질에 격심한 영향을 미칠 수 있다.
표 5는 대조군과 비교하여 본원 개시내용의 기술로 수득한 신호 펩티드 (리더 서열) 프로세싱 결과를 예시한다. 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 기술 사용은 바람직하지 못한 신호 펩티드 프로세싱을 현저히 감소시켰고 따라서 품질을 향상시켰다.
<표 5>
중쇄 카세트에 대한 상이한 신호 펩티드의 평가는 3종의 상이한 모델 항체의 발현시 향상되고 정확한 세포주 프로세싱을 보여주었다.
Figure pct00029
SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG <120> Optimized expression cassette for expressing a polypeptide with high yield <130> PAT055302-WO-PCT <150> US 61/728,459 <151> 2012-11-20 <160> 15 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 288 <212> DNA <213> artificial <220> <223> 5' UTR <400> 1 agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat 60 ccagcctccg cggccgggaa cggtgcattg gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgacg 120 taagtaccgc ctatagagtc tataggccca cccccttggc ttcgttagaa cgcggctaca 180 attaatacat aaccttatgt atcatacaca tacgatttag gtgacactat agaataacat 240 ccactttgcc tttctctcca caggtgtcca ctcccaggtc caactgca 288 <210> 2 <211> 302 <212> DNA <213> artificial <220> <223> 5' UTR <400> 2 agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat 60 ccagcctccg cggccgggaa cggtgcattg gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgacg 120 taagtaccgc ctatagagtc tataggccca cccccttggc ttcgttagaa cgcggctaca 180 attaatacat aaccttatgt atcatacaca tacgatttag gtgacactat agaataacat 240 ccactttgcc tttctctcca caggtgtcca ctcccaggtc caactgcacc tcggttctat 300 cg 302 <210> 3 <211> 316 <212> DNA <213> artificial <220> <223> 5' UTR <400> 3 agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat 60 ccagcctccg cggccgggaa cggtgcattg gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgacg 120 taagtaccgc ctatagagtc tataggccca cccccttggc ttcgttagaa cgcggctaca 180 attaatacat aaccttatgt atcatacaca tacgatttag gtgacactat agaataacat 240 ccactttgcc tttctctcca caggtgtcca ctcccaggtc caactgcacc tcggttctat 300 cgaaaacgcg tccacc 316 <210> 4 <211> 352 <212> DNA <213> artificial <220> <223> 5' UTR <400> 4 agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat 60 ccagcctccg cggccgggaa cggtgcattg gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgacg 120 taagtaccgc ctatagagtc tataggccca cccccttggc ttcgttagaa cgcggctaca 180 attaatacat aaccttatgt atcatacaca tacgatttag gtgacactat agaataacat 240 ccactttgcc tttctctcca caggtgtcca ctcccaggtc caactgcacc tcggttctat 300 cgcgattgaa ttccccgggg atcctctagg gtgaccgttt ggtgccgcca cc 352 <210> 5 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 5'UTR <400> 5 agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat 60 ccagcctccg cggccgggaa cggtgcattg gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgacg 120 taagtaccgc ctatagagtc tataggccca cccccttggc ttcgttagaa cgcggctaca 180 attaatacat aaccttatgt atcatacaca tacgatttag gtgacactat agaataacat 240 ccactttgcc tttctctcca caggtgtcca ctcccaggtc caactgcacc tcggttctat 300 cgaaaacgcg cctctagagc cgccacc 327 <210> 6 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 5'UTR <400> 6 agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat 60 ccagcctccg cggccgggaa cggtgcattg gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgacg 120 taagtaccgc ctatagagtc tataggccca cccccttggc ttcgttagaa cgcggctaca 180 attaatacat aaccttatgt atcatacaca tacgatttag gtgacactat agaataacat 240 ccactttgcc tttctctcca caggtgtcca ctcccaggtc caactgcacc tcggttctat 300 cgaaaaacgc gtgccgccac c 321 <210> 7 <211> 320 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 5'UTR <400> 7 agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat 60 ccagcctccg cggccgggaa cggtgcattg gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgacg 120 taagtaccgc ctatagagtc tataggccca cccccttggc ttcgttagaa cgcggctaca 180 attaatacat aaccttatgt atcatacaca tacgatttag gtgacactat agaataacat 240 ccactttgcc tttctctcca caggtgtcca ctcccaggtc caactgcacc tcggttctat 300 cgaaaacgcg tgccgccacc 320 <210> 8 <211> 737 <212> DNA <213> hCMV <400> 8 tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60 ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120 aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180 gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga 420 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg 480 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat 540 caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600 caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc 660 cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720 tcgtttagtg aaccgtc 737 <210> 9 <211> 119 <212> DNA <213> mouse <400> 9 agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat 60 ccagcctccg cggccgggaa cggtgcattg gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgac 119 <210> 10 <211> 144 <212> DNA <213> mouse <400> 10 gtaagtaccg cctatagagt ctataggccc acccccttgg cttcgttaga acgcggctac 60 aattaataca taaccttatg tatcatacac atacgattta ggtgacacta tagaataaca 120 tccactttgc ctttctctcc acag 144 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> mouse <400> 11 gtgtccactc ccaggtccaa ctgca 25 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> human <400> 12 Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala 1 5 10 15 <210> 13 <211> 18 <212> PRT <213> human <400> 13 Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala 1 5 10 15 Met Asp <210> 14 <211> 39 <212> DNA <213> artificial <220> <223> 3' UTR <400> 14 gggcggccgc ttccctttag tgagggttaa tgcttcgag 39 <210> 15 <211> 222 <212> DNA <213> artificial <220> <223> poly A site <400> 15 cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa 60 aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca 120 ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggagatgt 180 gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg ta 222

Claims (15)

  1. a) 프로모터;
    b) i) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
    Figure pct00030

    (서열 1);
    ii) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
    Figure pct00031

    (서열 2);
    iii) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
    Figure pct00032

    (서열 3);
    iv) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
    Figure pct00033

    (서열 4);
    v) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
    Figure pct00034

    (서열 5);
    vi) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
    Figure pct00035

    (서열 6);
    vii) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
    Figure pct00036

    (서열 7);
    viii) 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6 또는 서열 7에 나타낸 서열에 대해 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열;
    c) hCD33 분비 리더 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
    d) 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 위한 삽입 부위
    를 포함하는, 관심 폴리펩티드의 발현에 적합한 발현 카세트.
  2. 제1항에 있어서, hCD33 분비 리더 서열이 서열 MPLLLLLPLLWAGALA (서열 12)로 이루어지는 것인 발현 카세트.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    e) 3' UTR 서열 및/또는
    f) 폴리 A 신호
    를 추가로 포함하는 발현 카세트.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 특징:
    i) 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 관심 폴리펩티드로서 이량체 또는 다량체 단백질의 2개 이상의 서브유닛 또는 도메인을 코딩하고, 여기서 적어도 하나의 IRES 요소는 개별 서브유닛 또는 도메인의 코딩 영역 사이에 위치하고, 각각의 코딩 영역 앞에 hCD33 분비 리더 서열이 선행됨;
    ii) 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 관심 폴리펩티드로서 이량체 또는 다량체 단백질의 서브유닛 또는 도메인을 코딩함;
    iii) 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 관심 폴리펩티드로서 항체 분자 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩함;
    iv) 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 3을 포함하거나 또는 서열 3으로 이루어지고, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 관심 폴리펩티드로서 항체 분자 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 경쇄를 코딩함;
    v) 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 1 또는 서열 4를 포함하거나 또는 서열 1 또는 서열 4로 이루어지고, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 관심 폴리펩티드로서 항체 분자 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 중쇄를 코딩함;
    vi) 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 5를 포함하거나 또는 서열 5로 이루어지고, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 관심 폴리펩티드로서 항체 분자 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 경쇄를 코딩함;
    vii) 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 6 또는 서열 7을 포함하거나 또는 서열 6 또는 서열 7로 이루어지고, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 관심 폴리펩티드로서 항체 분자 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 중쇄를 코딩함;
    viii) 발현 카세트는 모노시스트론성 발현 카세트임;
    ix) 발현 카세트 내에 포함되어 있는 프로모터는
    aa) 하기 서열을 포함하는 프로모터
    Figure pct00037

    (서열 8); 또는 프로모터로서 기능하는 그의 기능적 단편;
    bb) 서열 8에 나타낸 서열에 대해 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 프로모터 또는 프로모터로서 기능하는 그의 기능적 단편
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 CMV 프로모터임
    중 하나 이상을 갖는 발현 카세트.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는, 관심 폴리펩티드를 발현하는 발현 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 하기 요소:
    a) 선택 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트;
    b) 관심 폴리펩티드를 발현하는 적어도 하나의 제2 발현 카세트
    중 하나 이상을 추가로 포함하는 발현 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 적어도 두 발현 카세트를 포함하며, 여기서 각각의 발현 카세트는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 하나의 발현 카세트 내에 포함되어 있는 폴리뉴클레오티드는 이뮤노글로불린 분자 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 중쇄를 코딩하고, 다른 발현 카세트 내에 포함되어 있는 폴리뉴클레오티드는 이뮤노글로불린 분자 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 경쇄를 코딩하는 것인 발현 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 이뮤노글로불린 분자 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 중쇄를 코딩하는 발현 카세트의 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열이 서열 1 또는 서열 4를 포함하거나 또는 서열 1 또는 서열 4로 이루어지고, 이뮤노글로불린 분자 또는 그의 기능적 단편 또는 유도체의 경쇄를 코딩하는 발현 카세트의 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열이 서열 3을 포함하거나 또는 서열 3으로 이루어지는 것인 발현 벡터.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 발현 카세트 및/또는 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 발현 벡터를 포함하는 진핵 숙주 세포.
  10. 제9항에 있어서, 설치류 세포, 영장류 세포 및 인간 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 CHO 세포인 숙주 세포.
  11. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터를 진핵 숙주 세포 내로 도입시키는, 제9항 또는 제10항에 따른 숙주 세포를 생산하는 방법.
  12. 제9항 또는 제10항에 따른 숙주 세포를 관심 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건하에서 세포 배양으로 배양하는 것을 포함하는, 상기 관심 폴리펩티드를 생산하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 관심 폴리펩티드가 세포 배양 배지 내로 분비되고, 세포 배양 배지로부터 단리되며, 단리된 폴리펩티드는 임의로 추가 프로세싱되는 것인 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 이뮤노글로불린 분자 또는 그의 단편인 방법.
  15. 발현 카세트로부터 관심 폴리펩티드를 고 수율로 발현시키기 위한 상기 발현 카세트에서의 hCD33 분비 리더 서열과 조합한 5' UTR 서열의 용도이며,
    여기서 상기 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열은
    i) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
    Figure pct00038

    (서열 1);
    ii) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
    Figure pct00039

    (서열 2);
    iii) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
    Figure pct00040

    (서열 3);
    iv) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
    Figure pct00041

    (서열 4);
    v) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
    Figure pct00042

    (서열 5);
    vi) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
    Figure pct00043

    (서열 6);
    vii) 하기 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
    Figure pct00044

    (서열 7);
    viii) 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6 또는 서열 7에 나타낸 서열에 대해 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 5' UTR 폴리뉴클레오티드 서열
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
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