JP4860702B2 - ポリペプチドのリコンビナント発現のための方法 - Google Patents
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Description
リコンビナントポリペプチドの産生のための発現システムは当該技術分野の状態で周知でありそして、例えばMarino, M.H., Biopharm. 2 (1989) 18-33; Goeddel, D.V., et al., Methods Enzymol. 185 (1990) 3-7; Wurm, F., and Bernard, A., Curr. Opin. Biotechnol. 10 (1999) 156-159により記載されている。医薬用途に使用するためのポリペプチドは、好ましくは、哺乳動物細胞、例えばCHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、COS細胞、HEK細胞、BHK細胞等において産生される。発現プラスミドの必須のエレメントは、複製起点および選択マーカーを含む例えばE.coliのための原核生物プラスミド増殖単位、真核生物選択マーカー、ならびに各々プロモーター、構造遺伝子、およびポリアデニル化シグナルを含む転写ターミネーターを含む関心のある構造遺伝子(1つまたは複数)の発現用の1つ以上の発現カセットである。哺乳動物細胞における一過性発現のために、哺乳動物複製起点、例えば、SV40 OriまたはOriPが含まれうる。プロモーターとして、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを選ぶことができる。最適化された転写のために、Kozak配列が、5’非翻訳領域に含まれうる。mRNAプロセッシング、特にmRNAスプライシングおよび転写終結のために、構造遺伝子の構成(エキソン/イントロン構成)に依存して、mRNAスプライシングシグナルならびにポリアデニル化シグナルが含まれうる。
本発明は、発現プラスミドを含む真核ホスト細胞における異種ポリペプチドのリコンビナント産生のための方法であって、該発現プラスミドが、5’から3’方向に、a)プロモーター、b)第1ポリペプチドをコードする核酸であって、該第1ポリペプチドのアミノ酸配列が第2ポリペプチドの最初の2つのアミノ酸に依存して表1から選ばれる、核酸、c)前記異種ポリペプチドをコードする核酸、リンカーをコードする核酸、および免疫グロブリンフラグメントをコードする核酸を含む、第2ポリペプチドをコードする核酸、ならびにd)ポリアデニル化シグナルを含む3’非翻訳領域、を含む上記の方法を含む。この方法は、更に、真核ホスト細胞に発現プラスミドを導入し、該真核ホスト細胞を第2ポリペプチドの発現のために適当な条件下に培養し、そして第2ポリペプチドを培養培地から回収することを含む。
本発明は、適当なプロモーター、転写ターミネーター、選択マーカー、ポリペプチドをコードする核酸配列およびシグナル配列をコードする核酸配列を含有する発現ベクターを含む真核ホスト細胞における関心のある異種ポリペプチドのリコンビナント発現のための方法であって、シグナル配列をコードする核酸配列が、続くポリペプチドの最初の2つのアミノ酸に依存して表1から選ばれる、方法を含む。異種ポリペプチドをコードする核酸配列は、シグナル配列をコードする核酸配列の末端の後の15ヌクレオチド内で始まる。異種ポリペプチドをコードする核酸配列は、免疫グロブリンのFR1領域内に、免疫グロブリンのVL領域内にまたは免疫グロブリンの第1定常ドメイン内に挿入されることができ、またはそれは免疫グロブリンのFR1領域、免疫グロブリンのVL領域または免疫グロブリンの第1定常ドメインのすべてもしくは一部を置換することができる。
材料および方法
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的情報が、Kabat,E.A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, fifth ed.,NIH Publication No 91-3242に示されている。
標準方法を使用して、Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A Laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているとおりにDNAを操作した。分子生物学試薬は製造者の指示に従って使用した。
タンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を使用して、280nmでの光学濃度(OD)を決定することにより決定した。
DNA配列は、MediGenomix GmbH(Martinsried, Germany)で行われた二本鎖配列決定により決定した。
配列作成、マッピング、分析、アノテーションおよび図示のために、GCG(Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin)のソフトウエアパッケージバージョン10.2およびInfomaxのVector NTI Advanceスイートバージョン8.0を使用した。
所望の遺伝子セグメントは、化学的合成により作られたオリゴヌクレオチドからMedigenomix GmbH(Martinsried, Germany)により調製された。単一制限エンドヌクレアーゼ開裂部位により隣接されている100〜600bp長の遺伝子セグメントをPCR増幅を含むオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションにより組立て、次いでpCR2.1−TOPO−TAクローニングベクター(Invitrogen Corp., USA)にAオーバーハングを介してクローニングした。サブクローニングされた遺伝子フラグメントのDNA配列はDNA配列決定により確認した。
発現されそして分泌された免疫グロブリンコンジュゲートを、公知の方法に従って、Protein A−Sepharose(商標)CL−4B(GE Healthcare 旧Amersham Bioscience, Sweden)を使用するアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。簡単にいえば、遠心(10,000gで10分間)および0.45μmフィルターを通すろ過の後、免疫グロブリンコンジュゲートを含有する澄明化した培養上清をPBSバッファー(10mM Na2HPO4、1mM KH2PO4、137mM NaClおよび2.7mM KCl、pH7.4)で平衡化されたProtein A−Sepharose(商標)CL−4Bカラムに適用した。結合しなかったタンパク質をPBS平衡化バッファーおよび0.1Mクエン酸バッファー、pH5.5で洗出した。免疫グロブリンコンジュゲートを0.1M クエン酸バッファー、pH3.0で溶出し、そして免疫グロブリンコンジュゲート含有画分を1M トリスベースで中和した。次いで免疫グロブリンコンジュゲートを4℃でPBSバッファーに対して十分に透析し、Biomax−SK膜(Millipore Corp., USA)を備えたウルトラフリー遠心フィルターデバイスで濃縮しそして0℃の氷水浴中に保存した。
発現プラスミドの作製
抗インスリン様増殖因子Iレセプター(IGF−1R)抗体軽鎖可変ドメイン(領域)(VL)およびヒトκ軽鎖定常ドメイン(領域)(CL)をコードする遺伝子セグメントを、抗IGF−1R重鎖可変ドメイン(領域)(VH)およびヒトγ1重鎖定常領域(CH1−ヒンジ−CH2−CH3)のための遺伝子セグメントと同様に連結した。
ベクター4818は、HEK293EBNA細胞における抗IGF−1R抗体(以下において抗IGF−1Rとしても示される)重鎖の一過性発現のための発現プラスミド(ゲノム的に構成された発現カセット;エキソン−イントロン構成)である(配列についてはUS2005/0008642参照)。それは、下記の機能的エレメントを含む:
抗IGF−1Rγ1重鎖発現カセットのほかに、このベクターは、
−選択マーカーとしてのハイグロマイシン耐性遺伝子、
−エプスタインバールウイルス(EBV)の複製起点、oriP、
−E.coliにおけるこのプラスミドの複製を可能とするベクターpUC18からの複製起点、および
−E.coliにおけるアンピシリン耐性を与えるβラクタマーゼ遺伝子、を含有する。
−ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)からの前初期エンハンサーおよびプロモーター、
− 合成5’非翻訳領域(UT)、
−シグナル配列イントロン(シグナル配列1、イントロン、シグナル配列2[L1−イントロン−L2])を含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−5’末端(L2シグナル配列)におけるユニークBsmI制限部位および3’末端におけるスプライスドナー部位およびユニークNotI制限部位を配置されたクローニングされた抗IGF−1R可変重鎖コードセグメント、
−マウス重鎖エンハンサーエレメント(部分JH3、JH4)を含むマウス/ヒト重鎖ハイブリッドイントロン2(Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378)、
−ゲノムヒトγ1重遺伝子定常領域、
−ヒトγ1免疫グロブリンポリアデニル化(「ポリA」)シグナル配列、および
−それぞれ5’末端および3’末端におけるユニーク制限部位AscIおよびSgrAI、から構成される。
ベクター4802は、HEK293EBNA細胞における抗IGF−1R抗体軽鎖(cDNA)の一過性発現のための発現プラスミドである。それは、下記の機能的エレメントを含む。
−選択マーカーとしてのハイグロマイシン耐性遺伝子、
−エプスタインバールウイルス(EBV)の複製起点、oriP
−E.coliにおけるこのプラスミドの複製を可能とするベクターpUC18からの複製起点、および
−E.coliにおけるアンピシリン耐性を与えるβラクタマーゼ遺伝子、
を含有する。
−ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)からの前初期エンハンサーおよびプロモーター、
−以下を含むクローニングされた抗IGF−1R可変軽鎖cDNA
−ネイティブ5’UTおよび
−5’末端におけるユニークBglII制限部位を配置されたヒト免疫グロブリン生殖系列遺伝子のネイティブ軽鎖シグナル配列、
−ヒトκ軽鎖遺伝子定常領域、
−ヒト免疫グロブリンκポリアデニル化(「ポリA」)シグナル配列、および
−それぞれ5’末端および3’末端におけるユニーク制限部位AscIおよびFseI、
から構成される。
ベクター4962は、発現プラスミド4965、4966および4967の組立てのための基本構造として用いた。これらのプラスミドは、HEK293EBNA細胞における改変された抗体重鎖(可変ドメインなしのN末端コンジュゲーション、cDNA構成)の一過性発現を可能とした。プラスミド4962は、下記の機能的エレメントを含む。
−選択マーカーとしてのハイグロマイシン耐性遺伝子、
−エプスタインバールウイルス(EBV)の複製起点、oriP、
−E.coliにおけるこのプラスミド複製を可能とするベクターpUC18からの複製起点、および
−E.coliにおけるアンピシリン耐性を与えるβラクタマーゼ遺伝子、
を含有する。
−ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)からの前初期エンハンサーおよびプロモーター、
−5’末端における単一BglII制限部位および3’末端における単一NheI制限部位(CH1N末端内のNheI部位)を含む合成リンカー(配列番号01)
−ヒトγ1重鎖遺伝子定常ドメイン(領域)(CH1−ヒンジ−CH2−CH3、cDNA構成)、
−ヒトγ1免疫グロブリンポリアデニル化(「ポリA」)シグナル配列、および
−それぞれ、5’末端および3’末端におけるユニーク制限部位AscIおよびFseI、から構成される。
ベクター4964は、発現プラスミド4976および4977の組立てのための基本構造として用いた。これらのプラスミドは、HEK293EBNA細胞における改変された抗IGF−1R抗体軽鎖(N末端コンジュゲーション)の一過性発現を可能とした。
ネイティブ軽鎖シグナル配列を、VL−IGF−1R可変ドメイン(領域)に直接連結された、5’末端におけるユニークBglII制限部位および3’末端におけるユニークNhel制限部位を配置された合成リンカーで置換する(配列番号03)。
発現プラスミド4969は、抗IGF−1R抗体軽鎖のための発現プラスミドであるプラスミド4802に由来する。プラスミドは、改変された抗体軽鎖フラグメント(可変ドメインなしのN末端コンジュゲーション;ポリペプチド−リンカー−κ鎖の定常領域)をコードする。
このプラスミドは、HEK293EBNA細胞における抗IGF−1R抗体軽鎖の一過性発現を可能とした。
−ヒトκ軽鎖定常遺伝子領域を、C−κ−Ig−κ−pA連結領域で僅かに改変した(ユニークHindIIIおよびKasI制限部位の挿入、配列番号558)。
最終発現プラスミドの作製
免疫グロブリン遺伝子セグメント、リンカー遺伝子セグメントおよびポリペプチド遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン融合遺伝子(重鎖および軽鎖)を、適合する遺伝子セグメント(核酸)の連結により公知のリコンビナント方法および技術により組立てた。
HEK293EBNA細胞における免疫グロブリン変異体の一過性発現
10%超低IgG FCS(ウシ胎仔血清、Gibco, Invitrogen Corp., USA)、2mM グルタミン(Gibco, Invitrogen Corp., USA)、1%容量/容量(v/v)非必須アミノ酸(Gibco, Invitrogen Corp., USA)および250μg/ml G418(Roche Molecular Biochemicals, Roche Diagnostics GmbH, Germany)を補充したDMEM(ダルベッコ改変イーグル培地、Gibco,Invitrogen Corp., USA)中で培養された付着性の成長中のHEK−293EBNA細胞(エプスタインバールウイルス核抗原を発現するヒト胚腎臓細胞系293;アメリカンタイプカルチャーコレクション寄託番号ATCC#CRL−10852)の一過性トランスフェクションにより、リコンビナント免疫グロブリン変異体を生成させた。トランスフェクションのために、Fugene(商標)6トランスフェクション試薬(Roche Molecular Biochemicals, Roche Diagnostics GmbH, Germany)を、3:1〜6:1の範囲の試薬(μl)対DNA(μg)の割合で使用した。免疫グロブリンポリペプチド軽鎖および重鎖を、1:2〜2:1の軽鎖コードプラスミド対重鎖コードプラスミドのモル比を使用して2つの異なるプラスミドから発現させた。免疫グロブリン変異体を含有する細胞培養上清をトランスフェクションの4〜11日後に回収した。上清を精製まで氷水浴中に0℃で保存した。
SDS−PAGE、ウエスタンブロットトランスファーおよび免疫グロブリン特異的抗体コンジュゲートによる検出を使用する発現分析
発現されそして分泌されたポリペプチドを、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)により処理し、そして分離されたポリペプチドをゲルから膜に移し、次いで免疫学的方法により検出した。
LDSサンプルバッフアー、4倍濃縮物(4×):4gグリセロール、0.682gトリスベース、0.666gトリス塩酸、0.8g LDS(ドデシル硫酸リチウム)、0.006g EDTA(エチレンジアミン四酸)、Serva BlueG250の1重量%(w/v)水溶液0.75ml、フェノールレッドの1重量%(w/v)溶液0.75ml、水を加えて10mlの全容積とする。
トランスファーバッファー:39mM グリシン、48mM トリス塩酸、0.04重量%(w/v)SDSおよび20容量%メタノール(v/v)。
TBSバッファー:pH7.5に調節された、50mM トリス塩酸、150mM NaCl
ブロッキング溶液:TBSバッファー中の1%(w/v)ウエスタンブロッキング試薬(Roche Molecular Biochemicals, Roche Diagnostics GmbH, Germany)、
TBSTバッファー:0.05容量%(v/v)Tween−20を有する1×TBSバッファー
重鎖:重鎖または重鎖フラグメント含有ポリペプチドの検出のために、ペルオキシダーゼにコンジュゲーションされた精製ウサギ抗ヒトIgG抗体を使用した(コード番号P2014、DAKO, Denmark)。
検出のために使用した二次ペルオキシダーゼ標識抗体コンジュゲートを、100mM β−メルカプトエタノールおよび20%(w/v)SDSを含有する1M トリス塩酸バッファー(pH6.7)において70℃で1時間膜をインキュベーションすることにより染色されたブロットから除去することができる。この処理の後に、ブロットを異なる二次抗体で2回目の染色をすることができる。2回目の検出の前に、ブロットをTBSバッファー中で振とうしながら室温で3回各々10分間洗浄する。
組立てられた免疫グロブリンポリペプチドの検出
Protein A Sepharose(商標)CL−4Bへのアフィニティー結合による免疫グロブリンポリペプチドの精製および濃縮
1つ以上のプラスミドを含有するHEK293EBNA細胞を、プラスミド(1つまたは複数)上に位置したポリペプチド遺伝子(1つまたは複数)の一過性発現のために適当な条件下に6〜10日間培養した。1.8ml Eppendorfカップ中の澄明化した培養上清1mlに、Protein A Sepharose(商標)CL−4B(GE Healthcare 旧Amersham Bioscience, Sweden)懸濁液(PBSバッファー(10mM Na2HPO4、1mM KH2PO4、137mM NaClおよび2.7mM KCl、pH7.4)中のProtein A Sepharoseの1:1(v/v)懸濁液)0.1mlを加えた。この懸濁液を、振とうしながら室温で1〜6時間インキュベーションした。その後、Sepharoseビーズを、遠心(30秒、5000rpm)により沈降させ、そして上清をすてた。Sepharoseペレットを、次いで各々1.6ml PBSバッファー、1.6ml 0.1M クエン酸バッファーpH5.0および1.6ml蒸留水で洗浄した。プロテインAが結合した免疫グロブリンをSepharoseビーズから0.1ml 1×LDS−PAGEサンプルバッファーを用いて70℃で5〜10分間抽出した。実施例4に記載のとおりのSDS−PAGE分離およびクーマシーブリリアントブルーによる染色により分析を行った。
一過性発現後の重鎖および/または軽鎖フラグメント含有ポリペプチドの発現/分泌分析:
図7a−c:アフィニティー精製されたポリペプチドのクーマシーブルー染色されたSDS−PAGEゲル;表6に従うサンプル配置
図8a−c:HEK293EBNA細胞における一過性発現の後の細胞培養上清中の軽鎖フラグメント含有ポリペプチドの免疫検出。
ヒトIgG ELISAによる発現された重鎖含有ポリペプチドの定量
細胞培養上清中の免疫グロブリン重鎖フラグメント含有ポリペプチド濃度を、サンドイッチELISAにより決定した。このサンドイッチELISAは、捕獲試薬としてビオチン化抗ヒトIgG F(ab’)2フラグメントを使用し、そして検出のためにペルオキシダーゼコンジュゲーション化抗ヒトIgG F(ab’)2抗体フラグメントを使用した。
Claims (10)
- 発現プラスミドを含む真核ホスト細胞における異種ポリペプチドのリコンビナント産生のための方法であって、
a)該発現プラスミドが、5’から3’方向に、
aa)プロモーター、
ab)シグナル配列である第1ポリペプチドをコードする核酸であって、該第1ポリペプチドのアミノ酸配列が第2ポリペプチドの最初の2つのアミノ酸に依存して表1から選ばれ、該第2ポリペプチドの最初の2つのアミノ酸が、天然において続く免疫グロブリンFR1領域のアミノ酸配列の最初の2つのアミノ酸と同一であるように選ばれる、核酸、
ac)i)前記異種ポリペプチドをコードする核酸、
ii)リンカーをコードする核酸、
iii)少なくとも免疫グロブリン鎖の定常ドメインを含む免疫グロブリンフラグメントをコードする核酸、
を含む第2ポリペプチドをコードする核酸、
ad)ポリアデニル化シグナルを含む3’非翻訳領域、
を含み、
b)該発現プラスミドを真核ホスト細胞に導入し、
c)該ホスト細胞を第2ポリペプチドの発現のために適当な条件下に培養し、
d)第2ポリペプチドを培養培地から回収する、
ことを特徴とする方法。 - 前記第2ポリペプチドが異種ポリペプチドの後にリンカーを含み、そしてリンカーの後に第2ポリペプチドのカルボキシ末端部分として前記免疫グロブリンフラグメントが続くことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 第2ポリペプチドが、前記異種ポリペプチドをコードする核酸に対して5’側の位置に、単一アミノ酸またはジペプチドまたはペプチドQIWNN(配列番号472)または少なくともジペプチドQIを含むそのフラグメントをコードする追加の核酸を含有することを特徴とする、請求項1または2のいずれか1項に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンフラグメントがIgGまたはIgEから得られることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 真核細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 哺乳動物細胞が、CHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、COS細胞、K562細胞、BHK細胞、PER.C6細胞またはHEK細胞であることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- リンカーが、配列番号06、07、08、09、10、139、140、554、555、556および557からなる群より選ばれるペプチドまたはポリペプチドであることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 免疫グロブリンフラグメントが定常ドメインのみを含むことを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 5’から3’方向に、
a)プロモーター、
b)シグナル配列である第1ポリペプチドをコードする核酸であって、該第1ポリペプチドのアミノ酸配列が第2ポリペプチドの最初の2つのアミノ酸に依存して表1から選ばれ、該第2ポリペプチドの最初の2つのアミノ酸が、天然において続く免疫グロブリンFR1領域のアミノ酸配列の最初の2つのアミノ酸と同一であるように選ばれる、核酸;
c)i)異種ポリペプチドをコードする核酸、
ii)リンカーをコードする核酸、
iii)少なくとも免疫グロブリン鎖の定常ドメインを含む免疫グロブリンフラグメントをコードする核酸、
を含む、第2ポリペプチドをコードする核酸;
d)ポリアデニル化シグナルを含む3’非翻訳領域;
を含むプラスミド。 - 5’から3’方向に、
a)プロモーター、
b)シグナル配列である第1ポリペプチドをコードする核酸であって、該第1ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号36、37、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328および329からなる群より選ばれる、核酸、
c)i)ペプチドQIWNN(配列番号472)または少なくともジペプチドQIを含むそのN末端部分をコードする核酸、
ii)少なくとも1つの制限開裂部位を含むクローニング部位、
iii)配列番号06、07、08、09、10、139、140、554、555、556および557からなる群より選ばれるリンカーをコードする核酸、
iv)少なくとも免疫グロブリン鎖の定常ドメインを含む免疫グロブリンフラグメントをコードする核酸、
を含む第2ポリペプチドをコードする核酸;
d)ポリアデニル化シグナルを含む3’非翻訳領域、
を含むプラスミドを含む、真核細胞において異種ポリペプチドを発現するためのプラスミドを調製するためのキット。
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