ES2361188T3 - Método para la expresión recombinante de un polipéptido. - Google Patents
Método para la expresión recombinante de un polipéptido. Download PDFInfo
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Abstract
Método para la producción recombinante de un polipéptido heterólogo en una célula huésped eucariótica que comprende un plásmido de expresión, caracterizado porque: a) el plásmido de expresión comprende, en dirección 5' a 3', aa) un promotor, ab) un ácido nucleico codificante de un primer polipéptido que es una secuencia de señal, la secuencia de aminoácidos del cual se selecciona de la Tabla 1 dependiendo de los primeros dos aminoácidos del segundo polipéptido seleccionados de manera que los primeros dos aminoácidos del segundo polipéptido sean idénticos a los primeros dos aminoácidos de las secuencias de aminoácidos de la región FR1 de inmunoglobulina que sigue naturalmente, ac) un ácido nucleico codificante de un segundo polipéptido que comprende: i) un ácido nucleico codificante de dicho polipéptido heterólogo, ii) un ácido nucleico codificante de un conector, iii) un ácido nucleico codificante de un fragmento de inmunoglobulina que comprende por lo menos los dominios constantes de una cadena de una inmunoglobulina, ad) una región 3' no traducida que comprende una señal de poliadenialción, b) el plásmido de expresión se introduce en una célula huésped eucariótica, c) la célula huésped se cultiva bajo condiciones adecuadas para la expresión del segundo polipéptido, d) el segundo polipéptido se recupera del medio de cultivo.
Description
La presente invención se refiere a un método para la expresión de un polipéptido en células eucarióticas.
Antecedentes de la invención
Los sistemas de expresión para la producción de polipéptidos recombinantes son bien conocidos del estado de la técnica y se describen en, por ejemplo, Marino M.H., Biopharm. 2:18-33, 1989; Goeddel D.V. et al., Methods Enzymol. 185:3-7, 1990; Wurm F. y Bernard A., Curr. Opin. Biotechnol. 10:156-159, 1999. Los polipéptidos para la utilización en aplicaciones farmacéuticas preferentemente se producen en células de mamífero tales como células CHO, células NS0, células Sp2/0, células COS, células HEK, células BHK y similares. Los elementos esenciales de un plásmido de expresión son una unidad de propagación plásmido procariótico, por ejemplo para E. coli, que comprende un origen de replicación y un marcador de selección, un marcaodr de selección eucariótico, y uno o más casetes de expresión para la expresión del gen o genes estructurales de interés, comprendiendo cada uno un promotor, un gen estructural y un terminador de transcripción, incluyendo una señal de poliadenilación. Para la expresión transitoria en células de mamífero, puede incluirse un origen de replicación de mamífero tal como Ori de SV40 ó OriP. Como promotor, puede seleccionarse un promotor constitutivo o inducible. Para la transcripción optimizada, puede incluirse una secuencia de Kozak en la región 5' no traducida. Para el procesamiento del ARNm, en particular el corte y empalme del ARNm y la terminación de la transcripción, pueden incluirse señales de corte y empalme del ARNm, dependiendo de la organización del gen estructural (organización exón/intrón), así como una señal de poliadenilación.
La expresión de un gen se lleva a cabo en forma de expresión transitoria o permanente. El polipéptido o polipéptidos de interés en general son polipéptidos secretados y por lo tanto contienen una extensión N-terminal (también conocida como secuencia de señal), que resulta necesaria para el transporte/secreción del polipéptido a través de la célula hacia el medio extracelular.
En general, la secuencia de señal puede derivarse de cualquier gen codificante de un polipéptido secretado. En el caso de que se utilice una secuencia de señal heteróloga, preferentemente es una secuencia que resulta reconocida y procesada (es decir, cortada por una peptidasa de señal) por la célula huésped. Para la secreción en levaduras, por ejemplo, la secuencia de señal nativa de un gen heterólogo que debe expresarse puede sustituirse por una secuencia de señal de levadura homóloga derivada de un gen secretado, tal como la secuencia de señal de invertasa de levadura, el líder de factor alfa (incluyendo los líderes de factor α de Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia y Hansenula, estando el segundo descrito en la patente US nº 5.010.182), la secuencia de señal de la fosfatasa ácida, o la secuencia de señal de la glucoamilasa de C. albicans (patente EP nº 0 362 179). En la expresión en células de mamífero, la secuencia de señal nativa de la proteína de interés resulta satisfactoria, aunque pueden resultar adecuadas otras secuencias de señal de mamífero tales como las secuencias de señal de polipéptidos secretados de la misma especie o de especies relacionadas, por ejemplo para inmunoglobulinas de origen humano o murino, así como secuencias de señal secretoria víricas, por ejemplo la secuencia de señal de la glucoproteína D del herpes simplex. El fragmento de ADN codificante de dicho presegmento se liga en el mismo marco de lectura al fragmento de ADN codificante de un polipéptido de interés.
En la patente WO nº 98/28427, se informa de una proteína de fusión preparada genética o químicamente que comprende la región Fc de inmunoglobulina, un derivado o análogo fusionado con la parte N-terminal de la proteína OB. Una molécula quimérica, es decir, una fusión de anticuerpo o una proteína de fusión, que comprende una secuencia importada de proteína carboxi-terminal y una región cargo amino-terminal se presenta en la patente WO nº 03/035892.
En la patente US nº 2003/0049227 se informa de un método para la inducción de una respuesta inmunológica citocida contra un tumor en un mamífero mediante la administración de una inmunocitoquina, que es una proteína de fusión que comprende una parte inmunoglobulina aminoterminal y una parte citoquina carboxi-terminal.
La patente WO nº 01/16437 informa de una proteína fusionada recombinante soluble que es estable en el sistema circulatorio de mamífero, que comprende un polipétido que contiene un sitio de reconocimiento para una molécula diana, tal como un sitio receptor del complemento, y que se encuentra unida en el extremo N-terminal de una cadena de inmunoglobulina. Se informa de una proteína de fusión constituida de un anticuerpo y un péptido que presenta una actividad biológica en la patente US nº 2003/0103984.
En la patente US nº 2004/0033511, se informa de una proteían de fusión de anticuerpo-citoquina y en la patente US nº 2004/0180035, de un inmunoconjugado de anticuerpo-citoquina. Se informa de una inmunotoxina que comrpende gelonina y un anticuerpo en la patente WO nº 94/26910. Perlman et al. (Perlman D., J. Mol. Biol. 167:391-409, 1983) informan de un sitio y secuencia de reconocimiento putativo de peptidasa de señal en péptidos de señal eucarióticos y procarióticos. Se informa del efecto de los cambios de péptido de señal sobre el procesamiento extracelular de la estreptoquinasa de Escherichia coli en Pratap J. y Dikshit K.L., Mol. Gen. Genet. 258:326-333, 1998.
Descripción resumida de la invención
La presente invención comprende un método para la producción recombinante de un polipéptido heterólogo en una célula huésped eurcariótica, que comrpende un plásmido de expresión, en el que el plásmido de expresión comprende, en una dirección 5' a 3', a) un promotor, b) un ácido nucleico codificante de un primer polipéptido que es una secuencia d señal, cuya secuencia de aminoácidos se selecciona de la Tabla 1 dependiendo de los primeros dos aminoácidos del segundo polipéptido, seleccionados de manera que los primeros dos aminoácidos del segundo polipéptido sean idénticos a los primeros dos aminoácidos de las secuencias de aminoácidos de la región FR1 de inmunoglobulina que sigue naturalmente, c) un ácido nucleico codificante de un segundo polipéptido que comprende un ácido nucleico codificante del polipéptido heterólogo, un ácido nucleico codificante de una molécula conectora, y un ácido nuclieco codificante de un fragmento de inmunoglobulina que comrpende por lo menos los dominios constantes de una cadena de una inmunoglobulina, y d) una región 3' no traducida que comprende una señal de poliadenilación. El método comrpende aemás la introducción del plásmido de expreión en una célula huésped eucariótica que se cultiva bajo condiciones adecuadas para la expresión del segundo polipéptido y se recupera el segundo polipéptido del medio de cultivo.
En una realización de la invención, el ácido nuclieco codificante del segundo polipéptido contiene en posición 5' respecto al ácido nucleico codificante del polipéptido heterólogo un ácido nucleico adicional codificante de un único aminoácido o un dipéptido, o el péptido de secuencia de aminoácidos QIWNN (SEC ID nº 472) o un fragmento del mismo.
En otra realización, el fragmento de inmunolgobulina se obtiene de una IgG o de una IgE.
En una realización adicional, la célula eucariótica es una célula de mamífero, especialmente una célula CHO, una célula NS0, una célula Sp2/0, una célula COS, una célula K562, una célula BHK, una célula PER.C6 o una célula HEK.
En todavía otra realización, la molécula conectora es un péptido o polipéptido seleccionado de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 06, 07, 08, 09, 10, 139, 140, 554, 555, 556 y 557.
En otra realización, el fragmento de inmunogloublina comprende el dominio constante carboxi-terminal de una cadena pesada o ligera de una inmunoglobulina natural o sintética, es decir, el dominio CH1, la región bisagra, el dominio CH2, el dominio CH3 de una cadena pesada, o el dominio CL de una cadena ligera. Además, el fragmento de inmunoglobulina comprende un fragmento de dominio variable.
En otra realización, el fragmento de domino variable es un dominio variable de una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina en la que uno a seis aminoácidos del dominio variable han sido delecionados.
En una realización adicional, entre una y seis regiones (FR1, FR2, FR3, CDR1, CDR2, CDR3) del dominio variable han sido delecionadas.
En una realización adicional, ha sido delecionado el dominio variable.
En otra realización, el fragmento de inmunoglobulina se deriva de una inmunoglobulina natural o variante de la misma.
En una realización adicional, el fragmento de inmunoglobulina se deriva de una inmunogloublina por lo menos parcialmente sintética.
En todavía otra realización de la invención, la secuencia de aminoácidos del polipéptido heterólogo presenta entre 5 y 500 residuos aminoácidos, más preferentemente entre 10 y 350 residuos aminoácidos, todavía más preferentemente entre 15 y 150 residuos aminoácidos.
La invención comprende además un plásmido que comprende, en una dirección 5' a 3', a) un promotor, b) un ácido nucleico codificante de un primer polipéptido que es una secuencia de señal, cuya secuencia de aminoácidos se selecciona de la Tabla 1 dependiendo de los primeros dos aminoácidos del segundo polipéptido seleccionado de manera que los primeros dos aminoácidos del segundo polipéptido sean idénticos a los primeros dos aminoácidos de las secuencias de aminoácidos de la región FR1 de la inmunoglobulina siguiente, c) un ácido nucleico codificante de un segundo polipéptido que comprende un ácido nucleico codificante de un polipéptido heterólogo, un ácido nucleico codificante de una molécula conectora, y un ácido nucleico codificante de un fragmento de inmunoglobulina, que comprende por lo menos los dominios constantes de una cadena de una inmunoglobulina, y d) una región 3' no traducida que comprende una señal de poliadenilación.
La invención todavía adicionalmente comprende un kit para la preparación de un plásmido para la expresión de un polipéptido heterólogo en una célula eucariótica que comprende un plásmido que comprende, en una dirección 5' a 3', a) un promotor, b) un ácido nucleico codificante de un primer polipéptido que es una secuencia de señal, cuya secuencia de aminoácidos se selecciona de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 36, 37, 31.9, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328 y 329, c) un ácido nucleico codificante de un segundo polipéptido que comprende: i) un ácido nucleico codificante de un péptido de secuencia de aminoácidos QIWNN (SEC ID nº 472) o una fracción N-terminal de la misma que comprende por lo menos el dipéptido QI, ii) un sitio de clonación que comprende por lo menos un sitio de corte de restricción adecuado para la inserción de un ácido nucleico codificante de un polipéptido heterólogo, iii) un ácido nucleico codificante de una molécula conectora seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 06, 07, 08, 09, 10, 139, 140, 554, 555, 556 y 557, e iv) un ácido nucleico codificante de un fragmento de inmunoglobulina, que comprende por lo menos los dominios constantes de una cadena de una inmunoglobulina, y d) una región 3' no traducida que comprende una señal de poliadenilación.
Descripción detallada de la invención
La presente invención comprende un método para la expresión recombinante de un polipéptido heterólogo de interés en una célula huésped eucariótica que comprende un plásmido de expresión que comprende una secuencia de ácidos nucleicos codificante de una secuencia de señal, en la que la secuencia de ácidos nucleicos codificante de la secuencia de señal se selecciona de la Tabla 1 dependiendo de los primeros dos aminoácidos del polipéptido siguiente. La secuencia de ácidos nucleicos codificante del polipéptido heterólogo se inicia dentro de los quince nucleótidos posteriores al final de la secuencia de ácidos nucleicos codificante de la secuencia de señal. La secuencia de ácidos nucleicos codificante del polipéptido heterólogo puede insertarse dentro de una región FR1 de una inmunoglobulina, dentro de una región VL de una inmunoglobulina o dentro del primer dominios constante de una inmunoglobulina, o puede sustituir la totalidad o una fracción de una región FR1 de una inmunoglobulina, una región VL de una inmunoglobulina o el primer dominio constante de una inmunoglobulina.
Dentro del alcance de la presente invención algunos de los términos utilizados se define de la manera siguiente:
La expresión "molécula de ácidos nucleicos" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un ácido nucleico natural, o parcial o totalmente no natural, codificante de un polipéptido que puede producirse recombinantemente. La molécula de ácidos nucleicos puede construirse a partir de fragmentos de ADN que se aíslan o se sintetizan por medios químicos. La molécula de ácidos nucleicos puede integrarse en otro ácido nucleico, por ejemplo en un plásmido de expresión o el genoma/cromosoma de una célula huésped eucariótica. El plásmido incluye vectores lanzadera y vectores de expresión. Típicamente el plásmido también comprende una unidad de propagación procariótica que comprende un origen de replicación (por ejemplo el origen ColE1 de replicación) y un marcador seleccionable (por ejemplo el gen de resistencia a la ampicilina o a la tetraciclina) para la replicación y la selección, respectivamente, del vector en bacterias.
La expresión "casete de expresión" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que contiene los elementos necesarios para la expresión y secreción de por lo menos el gen estructural contenido en una célula.
Una molécula de ácidos nucleicos, de manera similar, se caracteriza a partir de su secuencia de ácidos nucleicos, que consiste de nucleótidos individuales y/o de una secuencia de aminoácidos codificada por la molécula de ácidos nucleicos.
El término "gen" se refiere a un segmento, por ejemplo en un cromosoma o en un plásmido, que resulta necesario para la expresión de un péptido, polipéptido o proteína. Aparte de la región codificante, el gen comprende otros elementos funcionales, incluyendo un promotor, intrones y terminadores.
La expresión "gen estructural" se refiere a la región codificante de un gen sin una secuencia de señal.
La expresión "gen de resistencia" o "marcador seleccionable", que se utilizan intercambiablemente en la presente solicitud, es un gen que permite que las células que portan el gen resulten seleccionadas positiva o negativamente, en presencia de un agente de selección correspondiente. Un marcador seleccionable positivo que resulta útil es un gen de resistencia a antibiótico. Este marcador seleccionable permite que la célula huésped transformada con el gen resulte seleccionada positivamente en presencia del antibiótico correspondiente; una célula huésped no transformada no sería capaz de crecer o sobrevivir bajo las condiciones selectivas de cultivo. Los marcadores seleccionables pueden ser positivos, negativos o bifuncionales. Los marcadores seleccionables positivos permiten la selección de células que portan el marcador, mientras que los marcadores seleccionables negativos permiten eliminar selectivamente las células que portan el marcador. Típicamente, un marcador seleccionable proporcionará resistencia a un fármaco o compensará un defecto metabólico o catabólico en la célula huésped. Entre los genes de resistencia que resultan útiles al utilizar células eucarióticas se incluyen, por ejemplo, los genes de la aminoglucósido fosfotransferasa (APH), tales como la higromicina fosfotransferasa (hyg), y la neomicina APH y G418 APH, la dihidrofolato reductasa (DHFR), la timidina quinasa (tk), la glutamina sintetasa (GS), la asparagina sintetasa, la triptófano sintetasa (indol), la histidinol deshidrogenasa (histidinol D) y los genes codificantes de resistencia a puromicina, bleomicina, fleomicina, cloranfenicol, zeocina y ácido micofenólico. Se describen genes marcadores adicionales en las patentes WO nº 92/08796 y nº 94/28143.
La expresión "elementos reguladores" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a secuencias de nucleótidos presentes en cis, necesarias para la transcripción y/o traducción del gen que comprende la secuencia de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido de interés. Los elementos reguladores de la transcripción normalmente comprenden un promotor cadena arriba de la secuencia del gen estructural que debe expresarse, sitios de inicio y terminación de la transcripción, y una secuencia de señal de poliadenilación. La expresión "sitio de inicio de transcripción" se refiere a la base del ácido nucleico en el gen correspondiente al primer ácido nucleico incorporado en el transcrito primario, es decir, el precursor ARNm, el sitio de inicio de transcripción puede solaparse con la secuencia de promotor. La expresión "sitio de terminación de transcripción" se refiere a una secuencia de nucleótidos normalmente representada en el extremo 3' de un gen de interés que debe transcribirse, que causa que la ARN polimerasa termine la transcripción. La secuencia de señal de poliadenilación, o señal de adición de poli-A, proporciona la señal para el corte en un sitio específico en el extremo 3' del ARNm eucariótico y la adición post-transcripcional en el núcleo de una secuencia de aproximadamente 100 a 200 nucleótidos adenina (cola poli-A) al extremo 3' cortado. La secuencia de señal de poliadenilación puede incluir la secuencia de consenso AATAAA situada aproximadamente 10 a 30 nucleótidos cadena arriba del sitio de corte.
Para producir un polipéptido secretado, el gen estructural de interés incluye un segmento de ADN que codifica una secuencia de señal/péptido líder. La secuencia de señal dirige el polipéptido recién sintetizado hasta la membrana del ER y a través de la misma, en donde el polipéptido puede ser enviado para su secreción. La secuencia de señal resulta escindida por una peptidasa de señal durante los cruces de la proteína a través de la membrana del ER. Respecto a la función de la secuencia de señal, el reconocimiento por parte de la maquinaria de secreción de la célula huésped resulta esencial. Por lo tanto, la secuencia de señal utilizada debe ser reconocida por las proteínas de la célula huésped y los enzimas de la maquinaria de secreción.
Entre los elementos reguladores de la transcripción se incluyen codones de inicio (AUG) y parada (TAA, TAG o TGA) de la traducción. En algunos constructos puede incluirse un sitio interno de entrada ribosómica (IRES).
El término "promotor" se refiere a una secuencia polinucleótida que controla la transcripción de una secuencia de un gen/gen estructural o ácido nucleico a la que se encuentra operablemente ligada. Un promotor incluye señales para la unión de la ARN polimerasa y el inicio de la transcripción. Los promotores utilizados serán funcionales en el tipo celular de la célula huésped en la que se contempla la expresión de la secuencia seleccionada. Un gran número de promotores, incluyendo promotores constitutivos, inducibles y reprimibles procedentes de una diversidad de diferentes fuentes, son bien conocidos de la técnica (y se encuentran identificados en bases de datos tales como GenBank) y se encuentran disponibles en forma de polinucleótidos clonados o en el interior de los mismos (procedentes de, por ejemplo, depósitos tales como la ATCC, así como de otras fuentes comerciales o individuales). Un "promotor" comprende una secuencia de nucleótidos que dirige la transcripción de un gen estructural. Típicamente, un promotor se encuentra situado en la región 5' no codificante o no traducida de un gen, próximo al sitio de inicio de transcripción de un gen estructural. Los elementos de secuencia situados en el interior de promotores, que funcionan durante el inicio de la transcripción con frecuencia se caracterizan por secuencias de nucleótidos de consenso. Entre estos elementos promotores se incluyen sitios de unión de ARN polimerasa, secuencias TATA, secuencias CAAT, elementos específicos de la diferenciación (DSEs, McGehee
R.E. et al., Mol. Endocrinol. 7:551, 1993), elementos de respuesta a AMP cíclico (CREs), elementos de respuesta a suero (SREs, Treisman R., Seminars in Cancer Biol. 1:47, 1990), elementos de respuesta a glucocorticoides (GREs) y sitios de unión para otros factores de transcripción tales como CRE/ATF (O'Reilly M.A. et al., J. Biol. Chem. 267:19938, 1992), AP2 (Ye J. et al., J. Biol. Chem. 269:25728, 1994) y SP1, proteína de unión a elemento de respuesta a AMPc (CREB, Loeken M.R. Gene Expr. 3:253, 1993) y factores octámeros (ver, en general, Watson et al., editores, Molecular Biology of the Gene, 4a edición (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., 1987), y Lemaigre F.P. y Rousseau G.G., Biochem. J. 303:1-14, 1994). En el caso de que el promotor sea un promotor inducible, la tasa de transcripción se incrementa en respuesta a un agente inductor. En contraste, la tasa de transcripción no se encuentra regulada por un agente inductor en el caso de que el promotor sea un promotor constitutivo. También se conocen promotores reprimibles. Por ejemplo, el promotor c-fos se activa específicamente tras la unión de la hormona de crecimiento a su receptor sobre la superficie celular. La expresión regulada por la tetraciclina (tet) puede conseguirse con promotores híbridos artificiales que consisten de, por ejemplo un promotor de CMV seguido de dos sitios de operador Tet. El represor Tet se une a los dos sitios de operador Tet y bloquea la transcripción. Tras la inducción del inductor tetraciclina, el represor Tet resulta liberado de los sitios de operador Tet y se produce la transcripción (Gossen M. y Bujard H., PNAS 89:5547-5551, 1992). Para otros promotores inducibles, incluyendo la metalotioneina y los promotores de choque térmico ver, por ejemplo, Sambrook et al. (supra) y Gossen et al., Curr. Opin. Biotech. 5:516-520, 1994. Entre los promotores eucarióticos que han sido identificados como promotores fuertes para la expresión de nivel elevado se encuentran el promotor temprano de SV40, el promotor tardío mayor de adenovirus, el promotor de la metalotioneína-1 de ratón, la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous, el factor 1 alfa de alargamiento de hámster chino (CHEF-1, ver, por ejemplo, la patente US nº 5.888.809), el EF-1 alfa humano, la ubiquitina y el promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (CMV IE).
El "promotor" puede ser constitutivo o inducible. Un intensificador (es decir, un elemento de ADN de acción en cis que actúa sobre un promotor incrementando la transcripción) puede resultar necesario para funcionar conjuntamente con el promotor para incrementar el nivel de expresión obtenido con un promotor solo, y puede incluirse en forma de elemento regulador de la transcripción. Con frecuencia, el segmento polinucleótido que contiene el promotor también incluye secuencias de intensificador (por ejemplo CMV o SV40).
El término "intensificador" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una secuencia polinucleótida que incrementa la transcripción de un gen o secuencia codificante a la que se encuentra operablemente ligada. Al contrario que los promotores, los intensificadores son relativamente independientes de la orientación y de la posición y se han encontrado en orientación 5' ó 3' (Lusky M. et al., Mol. Cell Bio. 3:1108, 1983) respecto a la unidad de transcripción en el interior de un intrón (Banerji J. et al., Cell 33:729, 1983), así como en el interior de la secuencia codificante misma (Osborne T.F. et al., Mol. Cell Bio. 4:1293, 1984). Por lo tanto, pueden introducirse intensificadores cadena arriba o abajo del sitio de inicio de transcripción o a distancias considerables del promotor, aunque en la práctica los intensificadores pueden solaparse física y funcionalmente con los promotores. Son bien conocidos de la técnica (y se encuentran identificados en bases de datos tales como GenBank) un gran número de intensificadores procedentes de una diversidad de diferentes fuentes y se encuentran disponibles en forma de secuencias polinucleótidas clonadas o en el interior de las mismas (procedentes de, por ejemplo, depósitos tales como la ATCC, así como de otras fuentes comerciales o individuales). Varios polinucleótidos que comprenden secuencias de promotor (tales como el promotor de CMV utilizado comúnmente) también comprenden secuencias de intensificador. Por ejemplo, la totalidad de los promotores fuertes indicados anteriormente también pueden contener intensificadores fuertes (ver, por ejemplo, Bendig M.M., Genetic Engineering 7:91-127, 1988).
La expresión "sitio interno de entrada ribosómica" o "IRES" se refiere a una secuencia que promueve funcionalmente el inicio de la traducción independientemente del gen situado 5' respecto al IRES y permite la traducción de dos cistrones (marcos de lectura abierta) a partir de un único transcrito en una célula animal. El IRES proporciona un sitio de entrada ribosómico independiente para la traducción del marco de lectura abierta inmediatamente cadena abajo del mismo (en la presente memoria se utiliza cadena abajo intercambiablemente con "orientado 3' respecto a"). A l contrario que el ARNm bacteriano, que puede ser policistrónico, es decir, puede codificar varios polipéptidos diferentes que se traducen secuencialmente a partir de los ARNm, la mayor parte de los ARNm de las células animales son monocistrónicos y codifican la síntesis de únicamente una proteína. Con un transcrito policistrónico en una célula eucariótica, la traducción se iniciaría a partir de la mayoría de sitios de inicio 5' de la traducción, terminarían en el primer codón de parada y el transcrito resultaría liberado del ribosoma, resultando en la traducción de únicamente el primer polipéptido codificado en el ARNm. En una célula eucariótica, un transcrito policistrónico que presente un IRES operablemente ligado al segundo
o posterior marco de lectura abierta en el transcrito permite la traducción secuencial de dicho marco de lectura abierta cadena abajo para producir los dos o más polipéptidos codificados por el mismo transcrito. La utilización de elementos IRES en la construcción de un vector ha sido descrita anteriormente; ver, por ejemplo, Pelletier J. et al., Nature 334:320325, 1988; Jang S.K. et al., J. Virol. 63:1651-1660, 1989; Davies M.V. et al., J. Virol. 66:1924-1932, 1992; Adam M.A. et al., J. Virol. 65:4985-4990, 1991; Morgan R.A. et al., Nucl. Acids Res. 20:1293-1299, 1992; Sugimoto Y. et al., Biotechnology 12:694-698, 1994; Ramesh N. et al., Nucl. Acids Res. 24:2697-2700, 1996; y Mosser D.D. et al., Biotechniques 22:150-152, 1997).
La expresión "operablemente ligado" se refiere a una yuxtaposición de dos o más componentes, en la que los componentes descritos de esta manera se encuentran en una relación que les permite funcionar del modo deseado. Por ejemplo, un promotor y/o un intensificador se encuentran operablemente ligados a una secuencia codificante en el caso de que actúen en cis controlando o modulando la transcripción de la secuencia ligada. Generalmente, aunque no necesariamente, las secuencias de ADN que se encuentran "operablemente ligadas" son contiguas y, en el caso de que resulte necesario unir dos regiones codificantes de proteína, tales como una secuencia líder/de señal secretoria y un polipéptido, son contiguas y se encuentran en el mismo marco de lectura. Sin embargo, aunque un promotor operablemente ligado generalmente se encuentra situado cadena arriba de la secuencia codificante, no es necesariamente contiguo a la misma.
No es necesario que los intensificadores sean contiguos. Un intensificador se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que el intensificador incremente la transcripción de la secuencia codificante. Los intensificadores operablemente ligados pueden situarse cadena arriba, en el interior o cadena abajo de secuencias codificantes y a una distancia considerable del promotor. Un sitio de poliadenilación se encuentra operablemente ligado a una secuencia codifiante en el caso de que se encuentre situado en el extremo cadena abajo de la secuencia codificante de manera que la transcripción transcurra a lo largo de la secuencia codificante hasta el interior de la secuencia de poliadenilación. El ligamiento se consigue mediante métodos recombinantes conocidos de la técncia, por ejemplo utilizando metodología de PCR y/o mediante ligación en sitios de restricción convenientes. En el caso de que no existan sitios de restricción convenientes, se utilizan adaptadores oligonucleótidos sintéticos de acuerdo a la práctica convencional.
El término "expresión" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a que la transcripción y/o traducción se produce dentro de una célula huésped. El nivel de transcripción de un producto deseado en una célula huésped puede determinarse basándose en la cantidad de ARNm correspondiente que se encuentra presente en la célula. Por ejemplo, el ARNm transcrito a partir de una secuencia seleccionada puede cuantificarse mediante PCR o mediante hibridación northern (ver Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). La proteína codificada por una secuencia seleccionada puede cuantificarse mediante diversos métodos, por ejemplo mediante ELISA sometiendo a ensayo la actividad biológica de la proteína, o mediante la utilización de ensayos que sean independientes de dicha actividad, tales como la transferencia western o el radioinmunoensayo, utilizando anticuerpos que reconocen y se unen a la proteína (ver Sambrook et al., 1989, supra).
La expresión "célula huésped" se refiere a una célula en la que se introduce el gen codificante del polipéptido de la invención. Entre las células huésped se incluyen tanto células procarióticas utilizadas para la propagación de los plásmidos/vectores, como células eucarióticas para la expresión del gen estructural. Típicamente las células eucarióticas son células de mamífero.
Un "polipéptido" es un polímero de residuos aminoácidso unidos mediante enlaces peptídicos, producido natural o sintéticametne. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 20 residuos aminoácidos pueden denominarse "péptidos". Los polipéptidos que comprenden una o más cadenas de polipéptido o que comprenden una cadena de aminoácidos de una longitud de 100 aminoácidos o más pueden denominarse "proteínas".
Una "proteína" es una macromolécula que comprende una o más cadenas de polipéptido en las que por lo menos una cadena presenta una longitud de aminoácidos de 100 aminoácidos o superior. Una proteína también puede comprender componentes no peptídicos tales como grupos carbohidrato.
La célula en la que se produce una proteína puede añadir carbohidratos y otros sustituyentes no peptídicos a la misma, y pueden variar según el tipo de célula. Las proteínas se definen en la presente memoria en términos de sus estructuras de esqueleto de aminoácidos, las adiciones tales como grupos carbohidarto generalmente no se especifican, aunque, sin embargo, pueden encontrarse presentes.
La expresión "ADN heterólogo" o "polipéptido heterólogo" se refiere a una molécula de ADN o a un polipéptido, o a una población de moléculas de ADN o a una población de polipéptidos, que no existen naturalmente dentro de una célula huésped dada. Las moléculas de ADN heterólogas respecto a una célula huésped particular pueden contener ADN derivado de la especie de células huésped (es decir del ADN endógeno), con la condición de que el ADN huésped se combine con el ADN no del huésped (es decir, el ADN exógeno). Por ejemplo, una molécula de DAN que contenga un segmento de ADN no del huésped codificante de un polipéptido operablemente ligado a un segmento de ADN huésped que comprende un promotor se considera que es una molécula de ADN heteróloga. A la inversa, una molécula de ADN heteróloga puede comprender un gen estructural endógeno operablemente ligado a un promotor exógeno.
Un péptido o polipéptido codificado por una molécula de ADN no del huésped es un péptido o polipéptido "heterólogo".
Un "vector de cloanción" es una molécula de ácidos nucleicos, tal como un plásmido, cósmido, fagémido o cromosoma artificial bacteriano (BAC), que presenta la capacidad de replicarse autónomamente en una célula huésped. Los vectores de clonación típicamente contiene uno o un número reducido de sitios de reconocmiento de endonucleasa de restricción que permiten la inserción de una molécula de ácidos nucleicos de un modo determinable sin pérdida de una función biológica esencial del vector, así como de secuencias de nucleótidos codificantes de un gen de resistencia que resulte adecuado para la utilización en la identificación y selección de las células transformadas con el vector de clonación. Entre los genes de resistencia típicamente se incluyen genes que proporcionan resistencia a la tetraciclina o a la ampicilina.
Un "plásmido de expresión" es una molécula de ácidos nucleicos codificante de una proteína que debe expresarse en una célula huésped. Típicamente, un plásmido de expresión comprende una unidad de propagación de plásmido procariótico, por ejemplo para E. coli, que comprende un origen de replicación y un marcador de selección, un marcador de selección eucariótico, y uno o más casetes de expresión para la expresión del gen o genes estructurales de interés que comprende un promotor, un gen estructural y un terminador de transcripción que incluye una señal de poliadenilación. La expresión del gen habitualmente se somete al control de un promotor, y este gen estructural se dice de esta manera que se encuentra "operablemente ligado" al promotor. De manera similar, un elemento regulador y un promotor nuclear se encuentran operablemente ligados en el caso de que el elemento regulador module la actividad del promotor nuclear.
Una "unidad de transcripción policistrónica" es una unidad de transcripción en la que más de un gen estructural se encuentra bajo el control del mismo promotor.
Un "polipéptido aislado" es un polipéptido que se encuentra esencialmente libre de componentes celulares contaminantes, tales como carbohidratos, lípidos u otras impurezas proteicas asociadas al polipéptido en estado natural. Típicamente, una preparación de un polipéptido aislado contiene el polipéptido en una forma altamente purificada, es decir, en una pureza de por lo menos aproximadamente 80%, en una pureza de por lo menos aproximadamente 90%, en una pureza de por lo menos aproximadamente 95%, en una pureza superior a 95%, o superior a 99%. Un modo de mostrar que una preparación particular de proteína contiene un polipéptido aislado es a partir de la aparición de una única banda en la electroforesis en gel de dodecil-sulfato sódico (SDS)-poliacrilamida de la preparación de proteína y la tinción con azul brillante de Coomassie del gel. Sin embargo, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipétido en formas físicas alternativas, tales como dímeros o formas alternativamente glucosiladas o derivatizadas.
El término "inmunoglobulina" se refiere a una proteína que consiste de uno o más polipéptidos sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los diferentes genes de dominio (región) constante, así como la miríada de genes de región variable de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas pueden existir en una diversidad de formatos, incluyendo, por ejemplo, Fv, Fab y F(ab)2, así como en forma de cadenas individuales (scFv) (por ejemplo, Huston J.S. et al., PNAS USA 85:5879-5883, 1988; Bird R.E. et al., Science 242:423426, 1988; en general Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2a edición, 1984; y Hunkapiller T. y Hood L., Nature 323:15-16, 1986).
Una inmunoglobulina en general comprende por lo menos dos polipéptidos de cadena ligera y dos polipéptidos de cadena pesada. Cada una de los polipéptidos de las cadenas pesadas y ligeras puede contener un dominio (región) variable (generalmente la parte aminoterminal de la cadena polipeptídica) que contiene una región (dominio) de unión que puede interactuar con un antígeno. Cada una de las cadenas de polipéptido de las cadenas pesada y ligera comprende una región constante (generalmente la parte carboxilo-terminal). La región constante de la cadena pesada media en la unión del anticuerpo i) a células que portan un receptor Fc gamma (FcγR), tales como células fagocíticas, o ii) a células que portan el receptor Fc neonatal (FcRN), también conocido como receptor Brambell. También media en la unión de algunos factores, entre ellos los factores del sistema clásico del complemento, tales como el componente (Clq).
El dominio variable de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina a su vez comprende diferentes segmentos, es decir, cuatro regiones marco (FR) y tres regiones hipervariables (CDR).
Un "fragmento de inmunoglobulina" se refiere a un polipéptido que comprende por lo menos los dominios constantes de una cadena de una inmunoglobulina, es decir, el dominio CH1, la región bisagra, los dominios CH2 y CH3 y opcionalmente CH4 de una cadena pesada de una inmunoglobulina o el dominio CL de una cadena ligera de una inmunoglobulina. También se encuentran comprendidos los derivados y variantes de los mismos. Además, puede encontrarse presente un dominio variable, en el que han sido delecionados uno o más aminoácidos o regiones de aminoácidos. En una realización preferente, se ha delecionado el dominio variable en el fragmento de inmunoglobulina.
La expresión "terminador de transcripción" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a una secuencia de ADN que presenta una longitud de entre 50 y 750 pares de bases que proporciona a la ARN polimerasa la señal de terminación de la síntesis de ARNm. Resultan recomendables los terminadores muy eficientes (fuertes) en el extremo 3' de una casete de expresión para evitar que la ARN polimerasa siga leyendo, paraticularmente al utilizar promotores fuertes. Los terminadores de transcripción ineficientes pueden conducir a la formación de un ARNm de tipo operón, que puede ser el motivo para una expresión génica no deseada, por ejemplo la codificada por un plásmido.
El término "molécula conectora" tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a moléculas conectoras péptidos de origen natural o sintético. Construyen una cadena lineal de aminoácidos. La cadena presenta una longitud de entre 1 y 50 aminoácidos, preferentemente de entre 3 y 25 aminoácidos. La molécula conectora puede contener secuencias repetitivas de aminoácidos o partes de polipéptidos naturales, tales como polipéptidos con una función de bisagra.
Las "moléculas conectoras sintéticas" se diseñan para ser ricas en residuos de glicina, glutamina y serina. Estos residuos se disponen en una unidad peptídica pequeña de hasta cinco aminoácidos, tal como GGGGS, QQQQG o SSSSG. La unidad peptídica pequeña se repite dos a cinco veces, formando una unidad multimérica. En cada extremo aminoterminal y/o carboxilo-terminal de la unidad multimérica pueden añadirse hasta seis aminoácidos adicionales.
La expresión "molécula biológicamente activa" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una molécula orgánica, por ejemplo una macromolécula biológica tla como un péptido, proteína, glucoproteína, nucleoproteína, mucoproteína, lipoproteína, polipéptido sintético o proteína, que causa un efecto biológico al administrarla a sistemas biológicos artificiales o en sistemas biológicos artificiales, tales como bioensayos, utilizando líneas celulares y virus, o in vivo a un animal, incluyendo, aunque sin limitación, aves y mamíferos, incluyendo el ser humano. Este efecto biológico puede ser, aunque sin limitación, la inhibición o la activación enzimática, la unión a un receptor o a un ligando, en el sitio de unión o circunferencial, la inducción de una señal o la modulación de una señal.
Las moléculas biológicamente activas son, aunque sin limitación, por ejemplo, hormonas, citoquinas, factores de crecimiento, ligandos de receptor, agonistas o antagonistas, agentes citotóxicos, agentes antivíricos, agentes para la obtención de imágenes, inhibidores enzimáticos, activadores enzimáticos o moduladores de la actividad enzimática tales como sustancias alostéricas.
El término "aminoácido" tal como se utiliza en la presente solicitud comprende alanina (código de tres letras: ala, código de una letra: A), arginina (arg, R), asparagina (asn, N), ácido aspártico (asp, D), cisteína (cys, D), glutamina (gln, Q), ácido glutámico (glu, E), glicina (gly, G), histidina (his, H), isoleucina (ile, I), leucina (leu, L), lisina (lys, K), metionina (met, M), fenilalanina (phe, F), prolina (pro, P), serina (ser, S), treonina (thr, T), triptófano (trp, W), tirosina (tyr, Y) y valina (val, V).
Los métodos y técnicas conocidos por el experto en la materia, que resultan útiles para poner en práctica la presente ivnención, se describen en, por ejemplo, Ausubel F.M., editor, Current Protocols in Molecular Biology, volúmenes I a III, 1997, Wiley and Sons; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.
La invención comprende un método para la producción recombinante de un polipéptido heterólogo en una célula huésped eucariótica. La célula huésped comprende un plásmido de expresión, que comprende, en dirección 5' a 3': a) un promotor, b) un ácido nucleico codificante de un primer polipéptido cuya secuencia de aminoácidos se selecciona de la Tabla 1 dependiendo de los primeros dos aminoácidos del segundo polipéptido, c) un ácido nucleico codificante de un segundo polipéptido que comprende un ácido nucleico codificante de un polipéptido heterólogo que presenta una actividad biológica, un ácido nucleico codificante de un péptido o polipéptido seleccionado de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 06-10, 139, 140 y 554-557, un ácido nucleico codificante de un fragmento de inmunoglobulina, y d) una región 3' no traducida. Este plásmido de expresión se introduce en una célula huésped que se cultiva bajo condiciones adecuadas para la expresión del segundo polipéptido. El segundo polipéptido secretado se recupera del medio de cultivo.
El primer polipéptido es una denominada secuencia de señal. La secuencia de señal es responsable de la secreción del polipéptido unido/situado seguidamente/operablemente ligado. Para que resulte efectiva, la secuencia de señal debe ser reconocida y procesada por las proteínas y enzimas del interior de la célula que expresa el polipéptido. En el caso de una célula huésped eucariótica, la secuencia de señal preferentemente es eucariótica. Para garantizar que el segundo polipéptido según la presente invención se secreta correctamente, la secuencia de señal se selecciona de entre las secuencias de señal de inmunoglobulinas humanas y murinas. En la Tabla 1 se muestra una recopilación de las secuencias de señal.
Qué secuencia de señal se selecciona depende de los aminoácidos situados a continuación. Debe asegurarse de que la peptidasa de señal, que corta la secuencia de señal después del proceso de secreción, reconoce la secuencia de señal del polipéptido secretado y lo elimina. Para proporcionar una transición "natural" de secuencia de señal a polipéptido heterólogo, la secuencia de señal debe seleccionarse de manera que los primeros dos aminoácidos del polipéptido heterólogo sean idénticos a los primeros dos aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la región FR1 de inmunoglobulina situada de manera natural a continuación.
Tabla 1: conjunto de los primeros dos aminoácidos (proporcionados en código de una letra) del segundo polipéptido asignado a péptidos de señal (se proporciona el primer polipéptido en código de una letra).
(continuación) (continuación)
(continuación)
(continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación)
En el caso de que el dipéptido de los primeros dos aminoácidos del segundo polipéptido no se encuentren explícitamente listados en la TAbla 1, y no se pretenda utilizar ninguna de las secuencias listadas en la última fila de la 5 Tabla 1, resulta beneficioso no enlazar directamente entre sí el primer polipéptido y el segudo polipéptido. En este caso resulta favorable insertar una secuencia corta de hasta cinco aminoácidos para que resulte similar al inicio de la secuencia de la región FR1 de inmunoglobulina que seguiría/podría seguir naturalmente al primer polipéptido. Esta secuencia puede ser un solo aminoácido o un dipéptido, el dipéptido QIWNN (SEC ID nº 472) o un fragmento del mismo para que resulte similar a los primeros dos aminoácidos de la región FR1 de inmunoglobulina que sigue naturalmente. 10 En una realización, esta secuencia es el péptido QIWNN (SEC ID nº 472) o una fracción N-terminal de la misma que
comprende por lo menos el dipéptido QI.
Tras el primer polipéptido, u opcionalmente tras la secuencia corta insertada, el segundo polipéptido comprende un polipéptido heterólogo. Este polipéptido heterólogo presenta una secuencia de aminoácidos de entre 5 y 500 residuos 5 aminoácidos. En una primera realización de la invención, la secuencia de aminoácidos es de entre 10 y 350 residuos aminoácidos, y en una realización más preferente es de entre 15 y 150 residuos aminoácidos. El polipéptido heterólogo conjugado con la inmunoglobulina se selecciona de entre el grupo que comprende moléculas biológicamente activas. Estas moléculas muestran un efecto biológico al administrarlas en un sistema biológico artificial o en una célula viva, tal como en un sistema de ensayo, o en organismos vivos tales como aves o mamíferos, incluyendo el ser humano. Estos 10 compuestos biológicamente activos comprenden, aunque sin limitación, agonistas así como antagonistas de receptores; inhibidores, así como activadores de enzimas, y similares, y también péptidos, polipéptidos y proteínas que muestran actividad citotóxica, antivírica, antibacteriana o anticáncer, así como antígenos. El efecto biológico puede ser, aunque sin limitación, la inhibición enzimática, la unión a un receptor, tanto en el sitio de unión como circunferencial, y la inducción de señales. Estos compuestos biológicamente activos resultan útiles, por ejemplo, para aplicaciones farmacéuticas,
15 terapéuticas o diagnósticas.
El segundo polipéptido comprende adicionalmente después del polipéptido heterólogo una molécula conectora. Las moléculas conectoras que preferentemente pueden utilizarse con la presente invención se listan en la Tabla 2.
20 Tabla 2: posibles moléculas conectoras
- Molécula conectora nº
- Secuencia de aminoácidos de la molécula conectora SEC ID nº
- 1
- [Ser(Gly)4]3 06
- 2
- [Ser(Gly)4]5 07
- 3
- [Gly(Gln)4]3 08
- 4
- Gly(Ser)15Gly 09
- 5
- GST 10
- 6
- [(Gly)4Ser]3-Gly-Ala-Ser 139
- 7
- Gly(Ser)15Gly-Ala-Ser 140
- 8
- [(Gly)4Ser]3-Gly 554
- 9
- [(Gly)4Ser]5-Gly 555
- 10
- [(Gly)4Ser]3-Gly2 556
- 11
- [(Gly)4Ser]5-Gly2 557
Tras la molécula conectora sigue un fragmento de inmunoglobulina a modo de parte carboxi-terminal del segundo polipéptido.
25 El segundo polipéptido comprende un polipéptido heterólogo seguido de una molécula conectora y seguido de un fragmento de inmunoglobulina a modo de parte carboxi-terminal, es decir, el ácido nucleico codificante del segundo polipéptido comprende, en dirección 5' a 3', ácidos nucleicos codificantes de un polipéptido heterólogo, una molécula conectora y un fragmento de inmunoglobulina.
30 Las moléculas de inmunoglobulina se asignan a cinco clases diferentes: IgA (inmunoglobulina A), IgD, IgE, IgG e IgM. De éstas, la IgG y la IgE se utilizan más frecuentemente en aplicaciones farmacéuticas y diagnósticas. Dentro de estas clases, las inmunoglobulinas difieren en su estructura global aunque los bloques constructivos son similares. Todas las inmunoglobulinas están construidas con dos cadenas polipeptídicas diferentes, una cadena ligera y una cadena pesada.
35 Un fragmento de inmunoglobulina comprende el dominio o dominios constantes carboxi-terminales de una cadena ligera
o pesada de inmunoglobulina, por ejemplo comprende por lo menos el dominio CH1, CH2, CH3 y la región bisagra de una cadena pesada de inmunoglobulina y opcionalmente un dominio CH4, o el dominio CL de una cadena ligera de inmunoglobulina. La inmunoglobulina de la que se deriva el fragmento puede ser una inmunoglobulina natural o sintética. En una realización de la invención, el fragmento de inmunoglobulina contiene además un fragmento de un dominio 40 variable de cadena pesada o ligera o de una variante del mismo. En el fragmento de dominio variable se han delecionado uno o más aminoácidos o regiones. En una realización se han delecionado entre uno y seis aminoácidos del dominio variable. En otra realización se han delecionado entre una y seis regiones del dominio variable. En una realización adicional se ha delecionado el dominio variable. La presencia de un dominio variable funcional, es decir, que reconoce antígenos, en el fragmento de inmunoglobulina, no resulta esencial para la presente invención. Una
45 inmunoglobulina no funcionable según la invención es una inmunogloublina que no presenta un dominio variable que reconoce antígenos. En una realización, el fragmento de inmunoglobulina no es una inmunoglobulina funcionable. En una realización, los dominios variable y constante comprendidos en el fragmento de inmunoglobulina son/se derivan del mismo anticuerpo, es decir, pertenecen al mismo anticuerpo.
Las diferentes secuencias de ácidos nucleicos se ligaron operablemente en un plásmido de expresión. Para la expresión, se introdujo el plásmido en una célula huésped. Se produjeron preferentemente proteínas en células de mamífero tales como células CHO, NS0, Sp2/0, COS, HEK, K562, BHK, PER.C6 y similares.
Los ejemplos siguientes, listado de secuencias y figuras se proporcionan con el fin de ayudar a la comprensión de la presente invención, el alcance real de la cual se proporciona en las reivindicaciones adjuntas.
Figura 1 Estructura común de las inmunoglobulinas de la clase IgG.
Figura 2 Mapa plasmídico del vector de expresión 4848 de cadena pesada γ1 anti-IGF-1R.
Figura 3 Mapa plasmídico del vector de expresión 4802 de cadena ligera κ anti-IGF-1R .
Figura 4 Mapa plasmídico del vector génico 4962 de la región constante de la cadena pesada γ1.
Figura 5 Mapa plasmídico del vector de expresión 4964 modificado de la cadena ligera κ anti-IGF-1R.
Figura 6 Mapa plasmídico del vector de expresión 4963 modificado de la cadena ligera anti-IGF-1R.
Figura 7 Geles SDS-PAGE teñidos con azul de Coomassie de conjugados de inmunoglobulinas purificados por
afinidad; la disposición de las muestras se indica en la Tabla 6. Figura 8 Inmunodetección de la cadena ligera en sobrenadantes de cultivo celular tras la expresión transitoria en células HEK293 EBNA; disposición de las muestras según la Tabla 6. Figura 9 Inmunodetección de la cadena pesada en sobrenadantes de cultivo celular tras la expresión transitoria en células HEK293 EBNA; disposición de las muestras según la Tabla 6.
Ejemplos
La información general referente a las secuencias de nucleótidos de las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas humanas se proporciona en Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, publicación de la NIH nº 91-3242, 1991.
Los aminoácidos de las cadenas de anticuerpos se numeran según el sistema EU (Edelman G.M. et al., PNAS 63:78-85, 1969; Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, publicación de la NIH nº 913242, 1991).
Se utilizaron métodos estándares para manipular el ADN, tales como los descritos en Sambrook J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Los reactivos biológicos moleculares se utilizaron siguiendo las instrucciones del fabricante.
Se determinó la concentración de proteínas a partir de la densidad óptica (DO) a 280 nm, utilizando el coeficiente de extinción molar calculado a partir de la secuencia de aminoácidos.
Las secuencias de ADN se determinaron mediante secuenciación de doble cadena, que se llevó a cabo en MediGenomix GmbH (Martinsried, Alemania).
Se utilizaron el paquete informático versión 10.2 del GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) y Vector NTI Advance suite versión 8.0 de Infomax para la creación, mapaje, análisis, anotación e ilustración de las secuencias.
Los segmentos génicos deseados fueron preparados por Medigenomix GmbH (Martinsried, Alemania) a partir de oligonucleótidos construidos mediante síntesis química. Los segmentos génicos de entre 100 y 600 pb que se encontraban flanqueados por sitios individuales de corte de endonucleasa de restricción se ensamblaron mediante hibridación y ligación de oligonucleótidos, incluyendo la amplificación por PCR, y posteriormente se clonaron en el vector de clonación pCR2.1-TOPO-TA (Invitrogen Corp., USA) utilizando extremos protuberantes de A. La secuencia de ADN de los fragmentos génicos subclonados se confirmó mediante secuenciación del ADN.
Los conjugados de inmunoglobulinas expresados y secretados se purificaron mediante cromatografía de afinidad utilizando proteína A-SepharoseTM CL-4B (GE Healthcare, antes Amersham Bioscience, Suecia) según métodos conocidos. Brevemente, tras la centrifugación (10.000 g durante 10 minutos) y la filtración a través de un filtro de 0,45 µm, los sobrenadantes de cultivo clarificados que contenían el conjugado de inmunoglobulinas se aplicaron a una columna de proteína A-SepharoseTM CL-4B equilibrada con tampón PBS (Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1 mM, NaCl 137 mM y KCl 2,7 mM, pH 7,4). Las proteínas no adsorbidas se lavaron con tampón de equilibrado PBS y tampón citrato 0,1 M, pH 5,5. Los conjugados de inmunoglobulinas se eluyeron con tampón citrato 0,1 M, pH 3,0, y las fracciones que contenían conjugado de inmunoglobulinas se neutralizaron con base Tris 1 M. A continuación, los conjugados de inmunoglobulinas se dializaron intensivamente frente a tampón PBS a 4ºC, se concentraron con un dispositivo de filtración centrífuga Ultrafree dotado de una membrana Biomax-SK (Millipore Corp., USA) y se almacenaron en un baño de agua helada a 0ºC.
Ejemplo 1
Preparación de los plásmidos de expresión
Los segmentos génicos codificantes de dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo del receptor de factor I de crecimiento (IGF-1R) y el dominio (región) constante de cadena ligera kappa humana (CL) se unieron, al igual que los segmentos génicos para el dominio (región) variable de cadena pesada (VH) anti-IGF-1R y la región constante de cadena pesada gamma 1 humana (CH1-bisagra-CH2-CH3).
El vector 4818 es el plásmido de expresión para la expresión transitoria de la cadena pesada del anticuerpo anti-IGF-1R (también denominado anti-IGF-1R en lo sucesivo) (casete de expresión organizado genómicamente; organización exónintrón) en células HEK293 EBNA (para las secuencias, ver la patente US nº 2005/0008642). Comprendía los elementos funcionales siguientes:
Además del casete de expresión de cadena pesada γ1 anti-IGF-1R, dicho vector contenía:
- -
- un gen de resistencia a la higromicina a modo de marcador seleccionable,
- -
- un origen de replicación, oriP, del virus de Epstein-Barr (EBV),
- -
- un origen de replicación procedente del vector pUC18 que permitía la replicación de este plásmido en E. coli, y
- -
- un gen beta-lactamasa que proporcionaba resistencia a la ampicilina en E. coli.
La unidad de transcripción del gen de la cadena pesada gamma-1 anti-IGF-1R estaba compuesta de los elementos siguientes:
- -
- el intensificador y promotor tempranos inmediatos del citomegalovirus humano (HCMV),
- -
- una región 5' no traducida sintética (UT),
- -
- una secuencia de señal de la cadena pesada de inmunoglobulina murina que incluía un intrón de secuencia de señal (secuencia de señal 1, intrón, secuencia de señal 2 [L1-intrón-L2]),
- -
- el segmento codificante de la cadena pesada variable anti-IGF-1R clonada, dispuesta con un sitio de restricción BsmI único en el extremo 5' (secuencia de señal L2) y un sitio donador de corte y empalme y un sitio de restricción NotI único en el extremo 3',
- -
- un intrón 2 híbrido de cadenas pesadas de ratón/humana que incluía el elemento intensificador de cadena pesada de ratón (parte JH3, JH4) (Neuberger M.S., EMBO J. 2:1373-1378, 1983),
- -
- la región constante genómica del gen de cadena pesada γ1 humana,
- -
- la secuencia de señal de poliadenilación ("poli-A") de la inmunoglobulina γ1 humana, y
- -
- los sitios de restricción únicos AscI y SgrAI en los extremos 5' y 3', respectivamente.
El mapa plasmídico del vector de expresión 4818 de la cadena pesada γ1 anti-IGF-1R se muestra en la figura 2.
El vector 4802 es el plásmido de expresión para la expresión transitoria de la cadena ligera del anticuerpo anti-IGF-1R (ADNc) en célula HEK293 EBNA. Comprendía los elementos funcionales siguientes.
10 Además del casete de expresión de la cadena ligera kappa anti-IGF-1R, dicho vector contenía:
- -
- un gen de resistencia a la higromicina a modo de marcador seleccionable,
- -
- un origen de replicación, oriP, del virus de Epstein-Barr (EBV),
- -
- un origen de replicación procedente del vector pUC18 que permitía la replicación de este plásmido en E. coli, y 15 - un gen beta-lactamasa que proporcionaba resistencia a la ampicilina en E. coli.
La unidad de transcripción del gen de la cadena ligera κ anti-IGF-1R estaba compuesta de los elementos siguientes:
- -
- el intensificador y promotor tempranos inmediatos del citomegalovirus humano (HCMV), 20 - el ADNc de la cadena ligera anti-IGF-1R clonada, que incluía:
- el extremo 5'-UT nativo y
-la secuencia de señal de cadena ligera nativa del gen de línea germinal de inmunoglobulina humana dispuesto con un sitio de restricción BgIII único en el extremo 5',
- -
- la región constante del gen de la cadena ligera κ humana, 25 - la inmunoglobulina κ humana-secuencia de señal de poliadenilación ("poli-A"), y
- los sitios de restricción únicos AscI y FseI en los extremos 5' y 3', respectivamente.
El mapa plasmídico del vector de expresión 4802 de la cadena ligera κ anti-IGF-1R se muestra en la figura 3.
30 c) Plásmido 4962
El vector 4962 sirvió como estructura básica para el ensamblado de los plásmidos de expresión 4965, 4966 y 4967. Estos plásmidos permitieron la expresión transitoria de las cadenas pesadas de anticuerpo modificadas (conjugación N-terminal sin dominio variable, organización de ADNc) en células HEK293 EBNA. El plásmido 4962 comprendía los
35 elementos funcionales siguientes.
Además del casete de expresión para la región constante de la cadena pesada gamma1, dicho vector contenía:
- un gen de resistencia a la higromicina a modo de marcador seleccionable, 40 - un origen de replicación, oriP, del virus de Epstein-Barr (EBV),
- -
- un origen de replicación procedente del vector pUC18 que permitía la replicación de este plásmido en E. coli, y
- -
- un gen beta-lactamasa que proporcionaba resistencia a la ampicilina en E. coli.
La unidad de transcripción del gen de región constante de la cadena pesada γ1 (CH1-bisagra-CH2-CH3) estaba 45 compuesta de los elementos siguientes:
- -
- el intensificador y el promotor tempranos inmediatos del citomegalovirus humano (HCMV),
- -
- una molécula conectora sintética (SEC ID nº 1) que comprendía un sitio de restricción BgIII único en el extremo
5' y un sitio de restricción NheI único en el extremo 3' (sitio NheI en el extremo N-terminal CH1). 50
- -
- los dominios constantes del gen de la cadena pesada γ1 humana (CH1-bisagra-CH2-CH3, organización del ADNc),
- -
- la inmunoglobulina γ1-secuencia de señal de poliadenilación ("poli-A"), y
- -
- los sitios de restricción únicos AscI y FseI en los extremos 5' y 3', respectivamente. 28
El mapa plasmídico del vector génico 4962 de los dominios/regiones constantes de la cadena pesada γ1 se muestra en la figura 4.
El vector 4964 sirvió como estructura básica para el ensamblado de los plásmidos de expresión 4976 y 4977. Estos plásmidos permitieron la expresión transitoria de las cadenas ligeras del anticuerpo anti-IGF-1R modificado (conjugación N-terminal) en células HEK293 EBNA.
10 El plásmido 4964 es una variante del plásmido de expresión 4802.
La unidad de transcripción del gen de la cadena ligera κ anti-IGF-1R se modificó tal como se indica a continuación.
15 La secuencia de señal de la cadena ligera nativa se sustituyó por un segmento conector sintético dispuesto con un sitio de restricción BgIII único en el extremo 5' y un sitio de restricción NheI único en el extremo 3' directamente unido al dominio (región) variable VL de IGF-1R (SEC ID nº 3).
20 El mapa plasmídico del vector de expresión 4964 modificado de la cadena ligera κ anti-IGF-1R se muestra en la figura 5.
e) Plásmido 4969
El plásmido de expresión 4969 se derivó del plásmido 4802, que es un plásmido de expresión de la cadena ligera del 25 anticuerpo anti-IGF-1R. El plásmido codifica un fragmento modificado de cadena ligera de anticuerpo (conjugación N-terminal sin dominio variable; polipéptido-molécula conectora-región constante de la cadena kappa).
Para la construcción del plásmido 4969, se introdujo un sitio de restricción BgIII único en el extremo 3' del promotor de CMV y se introdujo un sitio de restricción BbsI único en el interior de la región constante de la cadena ligera del 30 anticuerpo anti-IGF-1R (SEC ID nº 4).
35 Este plásmido permite la expresión transitoria de las cadenas ligeras del anticuerpo anti-IGF-1R en células HEK293 EBNA. El plásmido 4963 es una variante del plásmido de expresión 4802. 40 La unidad de transcripción del gen de la cadena ligera κ anti-IGF-1R se modificó tal como se indica a continuación:
- la región del gen constante de la cadena ligera κ humana se modificó ligeramente en la región de unión de dominio constante de kappa-Ig kappa-pA (inserción de sitios de restricción únicos HindIII y KasI, SEC ID nº 558).
El mapa plasmídico del vector de expresión 4963 modificado de la cadena ligera anti-IGF-1R se muestra en la figura 6.
Ejemplo 2
Preparación de los plásmidos de expresión finales
5 Los genes de fusión de inmunoglobulinas (cadenas pesada y ligera) que comprendían el segmento génico de inmunoglobulina, el segmento génico conector, y el segmento génico del polipéptido se ensamblaron mediante métodos y técnicas de recombinación conocidos mediante la conexión de los segmentos génicos (ácidos nucleicos) correspondientes.
10 Las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de cada uno de los péptidos y polipéptidos conectores se sintetizaron mediante síntesis química y después se ligaron en un plásmido de E. coli. Las secuencias de ácidos nucleicos subclonadas se verificaron mediante secuenciación del ADN.
Las cadenas de polipéptido de inmunoglobulina utilizadas, el fragmento de inmunoglobulina, la localización de la
15 conjugación (N-terminal) de polipéptidos, el conector utilizado y el polipéptido utilizado se indican en lasTablas 2 (página 25), 3 y 3a.
Tabla 3: proteínas y polipéptidos utilizados; la secuencia de aminoácidos y la numeración de las posiciones son iguales en la cepa de referencia BH8 (locus HIVH3BH8; aislado de VIH-1 LAI/IIIB clon BH8 de France; Ratner L. et al., Nature 20 313:277-384, 1985).
- Proteínas y polipéptidos
- SEC ID nº
- gp41 de VIH-1
- (posiciones 507-851 de gp160 BH8) 11
- T-651
- (ver, por ejemplo, la patente US nº 6.656.906) 12
- VIH-1
- ectodominio variante mutante individual de gp41: I568P 13
- VIH-1
- ectodominio variante mutante cuádruple de gp41: I568P, L550E, L566E, I580E 14
Tabla 3a: segmentos génicos preparados químicamente, utilizados para la construcción de genes de conjugado de inmunoglobulinas
- Inserción
- SEC ID nº
- Inserción 4964 (introducción de sitios de restricción únicos)
- 15
- Inserción 4965 (con T-651) que comprendía la secuencia de señal (MDTLCSTLLLLTIPSWVLS), la secuencia corta insertada (QIWNN), el polipéptido heterólogo (MTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL), el conector (GGGGSGGGGSGGGGSG)
- 16
- Inserción 4966 (con T-651) que comprendía la secuencia de señal (MDTLCSTLLLLTIPSVWLS), la secuencia corta insertada (QIWNN), el polipéptido heterólogo (MTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL), el conector (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG)
- 17
- Inserción 4967 (con T-651) que comprendía la secuencia de señal (MDTLCSTLLLLTIPSWVLS), la secuencia corta insertada (QIWNN), el polipéptido heterólogo (MTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL), el conector (GSSSSSSSSSSSSSSSG)
- 18
- Inserción 4969 (mutante individual de gp41) que comprendía el péptido de señal (MEFGLSWVFLVALLRGVQC), la secuencia corta insertada (Q), el polipéptido heterólogo (VQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEGQQHLLQLTVWGPKQLQARIL AVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKSLEQIVNN MTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL), conector (GGGGSGGGGSGGGGSG)
- 19
Los componentes utilizados para la construcción de los plásmidos de expresión finales para la expresión transitoria de las cadenas ligera y pesada del polipéptido de inmunoglobulina modificado (los casetes de expresión) se indican en la Tabla 4 con respecto al plásmido base utilizado, y la secuencia de ácidos nucleicos insertada codificante de los
30 polipéptidos de inmunoglobulinas conjugadas.
Tabla 4: componentes utilizados en la construcción de los plásmidos de expresión utilizados
- Plásmido de expresión
- Vector de base Segmento génico de ADN insertado Sitios de clonación
- Conjugación N-terminal: cadena pesada (sin dominio variable)
- 4965
- 4962 Inserción 4965 (249 pb) BgIII/NheI
- 4966
- 4962 Inserción 4966 (279 pb) BgIII/NheI
- 4967
- 4962 Inserción 4967 (252 pb) BgIII/NheI
- Conjugación N-terminal: cadena ligera (sin dominio variable)
- 4969
- 4802 Inserción 4969 (589 pb) BgIII/BbsI
- Conjugación N-terminal: cadena ligera (que incluye el dominio variable)
- 4976
- 4964 Inserción 4965 (249 pb) HindIII/KasI
- 4977
- 4964 Inserción 4967 (252 pb) HindIII/KasI
5 En la Tabla 5 se indica: los polipéptidos utilizados con propiedades de inhibición del VIH-1 (T-651 y variantes del ectodominio de gp41 del VIH-1), los conectores utilizados para unir la cadena ligera o pesada de inmunoglobulina al polipéptido, y el peso molecular deducido de las cadenas de anticuerpo modificado según deducción a partir de las secuencias de aminoácidos codificadas.
10 Tabla 5: resumen de los polipéptidos utilizados y el peso molecular deducido de las cadenas de polipéptido de inmunoglobulina modificada
- Plásmido de expresión
- polipéptido Peso molecular [Da] SEC ID nº del conector
- Plásmidos de referencia
- 4818
- Cadena pesada anti-IGF-1R 49.263,5 Sin conector
- 4802
- Cadena ligera anti-IGF-1R 23.572,2 Sin conector
- Fusiones N-terminales: cadena pesada (sin dominio variable)
- 4965
- T-651 42.227,3 554
- 4966
- T-651 42.857,9 554
- 4967
- T-651 42.644,7 09
- Fusiones N-terminales: cadena ligera (sin dominio variable)
- 4969
- Mutante individual de gp41 27.247,3 554
- Fusiones N-terminales (cadena ligera (que incluye el dominio variable)
- 4976
- T-651 29.851,9 139
- 4977
- T-651 30.269,2 140
Ejemplo 3
15
Se generaron variantes recombinantes de inmunoglobulina mediante transfección transitoria de células HEK293-EBNA en crecimiento adherente (línea celular 293 de riñón embrionario humano que expresaba el antígeno nuclear del virus de 20 Epstein-Barr; número de depósito en la American Type Culture Collection ATCC nº CRL-10852) cultivadas en DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco, Gibco, Invitrogen Corp., USA) suplementado con FCS al 10% de nivel ultrabajo de IgG (suero de feto bovino, Gibco, Invitrogen Corp., USA), glutamina 2 mM (Gibco, Invitrogen Corp., USA), aminoácidos esenciales al 1% v/v (Gibco, Invitrogen Corp., USA) y G418 250 µg/ml (Roche Molecular Biochemicals, Roche Diagnostics GmbH, Alemania). Para la transfección se utilizó el reactivo de transfección FugeneTM 6 (Roche
25 Molecular Biochemicals, Roche Diagnostics GmbH, Alemania) en una proporción de reactivo (µl) a ADN (µg) comprendida entre 3:1 y 6:1.
Se expresaron las cadenas ligera y pesada del polipéptido inmunoglobulina en dos plásmidos diferentes utilizando una proporción molar de plásmidos codificantes de cadena ligera a plásmidos codificantes de cadena pesada de entre 1:2 y
30 2:1. Los sobrenadantes de cultivo celular que contenían las variantes de inmunoglobulina se recolectaron los días 4 a 11 después de la transfección. Los sobrenadantes se almacenaron a 0ºC en un baño de hielo y agua hasta la purificación.
Se proporciona información general referente a la expresión recombinante de inmunoglobulinas humanas en, por ejemplo, las células HEK293, en: Meissner P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75:197-203, 2001.
Ejemplo 4
Análisis de expresión utilizando SDS-PAGE, transferencia a filtros western y detección con conjugados de anticuerpos específicos de inmunoglobulina.
Los polipéptidos expresados y secretados se procesaron mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico (SDS)poliacrilamida (SDS-PAGE) y los polipéptidos separados se transfirieron a una membrana desde el gel y se detectaron seguidamente utilizando un método inmunológico.
Tampón de muestras LDS, concentrado cuatro veces (4x): 4 gramos de glicerol, 0,682 gramos de base Tris, 0,666 gramos de hidrocloruro de Tris, 0,8 gramos de LDS (dodecilsulfato de litio), 0,006 gramos de EDTA (ácido etilendiamintetraacético), 0,75 ml de una solución al 1% en peso (p/v) de Serva Blue G250 en agua, 0,75 ml de una solución al 1% en peso (p/v) de rojo fenol, y adición de agua hasta completar un volumen de 10 ml.
El caldo de cultivo que contenía el polipéptido secretado se centrifugó para eliminar las células y residuos celulares. Se mezcló una alícuota del sobrenadante clarificado con 1/4 volúmenes (v/v) de 4x tampón para muestras LDS y 1/10 volúmenes (v/v) de 1,4-ditiotreitol (DTT) 0,5 M. A continuación, las muestras se incubaron durante 10 minutos a 70ºC y las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE. El sistema de gel premoldeado NuPAGE® (Invitrogen Corp., USA) se utilizó siguiendo las instrucciones del fabricante. En particular, se utilizaron geles premoldeados Bis-Tris NuPAGE® Novex® (pH 6,4) y un tampón de corrido MOPS NuPAGE®.
Tampón de transferencia: glicina 39 mM, hidrocloruro de Tris 48 mM, SDS al 0,04% en peso (p/v) y metanol al 20% en volumen (v/v).
Tras el SDS-PAGE, las cadenas de polipéptido del conjugado de inmunoglobulinas separado se transfirieron electroforéticamente a un filtro de membrana de nitrocelulosa (tamaño de poro: 0,45 µm) según el "método de transferencia en semiseco" de Burnette (Burnette W.N., Anal. Biochem. 112:195-203, 1981).
Tampón TB: hidrocloruro de Tris 50 mM, NaCl 150 mM, ajustado a pH 7,5.
Solución de bloqueo: reactivo de bloqueo western al 1% (p/v) (Roche Molecular Biochemicals, Roche Diagnostics GmbH,
Alemania) en tampón TBS.
Tampón TBST: 1x tampón TBS con Tween-20 al 0,05% en volumen (v/v).
Para la detección inmunológica, las membranas de transferencia western se incubaron bajo agitación a temperatura ambiente dos veces durante 5 minutos en tampón TBS y una vez durante 90 minutos en solución de bloqueo.
Cadena pesada: para la detección de los polipéptidos que contenían cadena pesada o fragmento de cadena pesada, se utilizó un anticuerpo de conejo anti-IgG humana purificado conjugado con una peroxidasa (nº de código P 0214, DAKO, Dinamarca).
Cadena ligera: los polipéptidos que contenían cadena ligera o fragmentos de cadena ligera se detectaron con un anticuerpo purificado de conejo anti-cadena ligera kappa humana conjugado con peroxidasa (DAKO, Dinamarca, nº de código P 0129).
Para la visualización de las cadenas ligera y pesada de anticuerpo o de los fragmentos de las mismas, en primer lugar las membranas de filtros western lavados y bloqueados se incubaron en el caso de una cadena pesada con un anticuerpo purificado de conejo anti-IgG humana conjugado con peroxidasa, y en el caso de una cadena ligera con un anticuerpo purificado de conejo anti-cadena ligera kappa humana conjugado con peroxidasa, en dilución 1:10.000 en 10 ml de solución de bloqueo a 4ºC bajo agitación durante la noche. Tras lavar las membranas tres veces con TBTS- tampón y una vez con tampón TBS durante 1,0 minuto a temperatura ambiente, las membranas de transferencia western se revelaron con una solución de Luminol-peróxido, que genera quimioluminiscencia (sustrato de transferencia western Lumi-LightPLUS, Roche Molecular Biochemicals, Roche Diagnostics GmbH, Alemania). Por lo tanto, las membranas se incubaron en 10 ml de solución de Luminol/peróxido durante un periodo de entre 10 segundos y 5 minutos, y la luz emitida se detectó posteriormente con un analizador Lumi-Imager F1 (Roche Molecular Biochemicals, Roche Diagnostics GmbH, Alemania) y/o se registró en una película de rayos X.
5
Se cuantificó la intensidad de las manchas con el software LumiAnalyst (versión 3.1).
10 El conjugado de anticuerpo secundario marcado con peroxidasa utilizado para la detección puede eliminarse del filtro teñido mediante incubación de la membrana durante una hora a 70ºC en tampón de hidrocloruro de Tris 1 M (pH 6,7) que contiene beta-mercaptoetanol 100 mM y SDS al 20% (p/v). Tras este tratamiento, el filtro puede teñirse con un anticuerpo secundario diferente en una segunda ocasión. Previamente a la segunda detección, el filtro se lava tres veces a temperatura ambiente bajo agitación en tampón TBS durante 10 minutos cada vez.
15 Se muestra la organización de las muestras en la Tabla 6.
Tabla 6: organización de las muestras de geles SDS-PAGE/filtros western
- muestra
- Plásmidos de expresión Nota
- Cadena ligera
- Cadena pesada
- Marcador de PM
- Anti-IGF-1R (Ab de referencia), 50 ng
- Anti-IGF-1R (Ab de referencia), 150 ng
- Anti-IGF-1R (Ab de referencia), 500 ng
- Medio de cultivo de HEK293
- 3
- 4802 (wt) 4818 (wt) Control de Anti-IGF-1R (Ab de referencia)
- 4
- 4802 (wt) 4961 (wt) Control de Anti-IGF-1R (Ab de referencia)
- 5
- 4963 (wt) 4818 (wt) Control de Anti-IGF-1R (Ab de referencia)
- 6
- 4802 (wt) 4965 N-terminal; pesada, sin VH
- 7
- 4802 (wt) 4966 N-terminal; pesada, sin VH
- 8
- 4802 (wt) 4967 N-terminal; pesada, sin VH
- 9
- 4969 4818 (wt) N-terminal; ligera, sin VL
- 10
- 4976 4818 (wt) N-terminal; ligera
- 11
- 4977 4918 (wt) N-terminal; ligera
- 12
- 4969 4966 N-terminal, ligera, sin VL; N-terminal, pesada, sin VH
- 13
- 4976 4966 N-terminal, ligera; N-terminal, pesada, sin VH
- 14
- 4977 4967 N-terminal, ligera; N-terminal, pesada, sin VH
20
Ejemplo 5
Detección de polipéptidos de inmunoglobulina ensamblados
25 purificación y concentración de polipéptidos de inmunoglobulina mediante unión de afinidad a proteína A-SepharoseTM CL-4B
Las células HEK293-EBNA que contenían uno o más plásmidos se cultivaron bajo condiciones adecuadas para la
expresión transitoria del gen o genes de polipéptido situados en el plásmido o plásmidos, durante 6 a 10 días. A 1 ml de 30 sobrenadante de cultivo clarificado en un vaso Eppendorf se añadieron 0,1 ml de una suspensión de proteína A-
SepharoseTM CL-4B (GE Healthcare, antes Amersham Biosciences, Suecia) (suspensión 1:1 (v)v) de proteína A-sefarosa
en tampón PBS (Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1 mM, NaCl 137 mM y KCl 2,7 mM, pH 7,4). La suspensión se incubó
durante un periodo de entre una y dieciséis horas a temperatura ambiente bajo agitación. A continuación, se peletizaron
las perlas de sefarosa mediante centrifugación (30 s, 5.000 rpm) y se descartó el sobrenadante. El pellet de sefarosa 35 seguidamente se lavó con 1,6 ml de tampón PBS, 1,6 ml de tampón citrato 0,1 M, pH 5,0 y 1,6 ml de agua destilada. La
inmunoglobulina unida a proteína A se extrajo de las perlas de sefarosa con 0,1 ml de 1x tampón para muestras LDSPAGE a 70ºC durante un periodo de entre 5 y 10 minutos. El análisis se realizó mediante separación en SDS-PAGE y tinción con azul brillante de Coomassie tal como se ha descrito en el Ejemplo 4.
Análisis de expresión/secreción de polipéptidos que contienen fragmento de caena pesada y/o ligera tras la expresión transitoria:
Figura 7a-c: geles de SDS-PAGE de polipéptidos purificados por afinidad y teñidos con azul de Coomassie; organización de las muestras según la Tabla 6.
Inmunodetección de polipéptidos que contienen inmunoglobulina:
Figura 8a-c: inmunodetección de polipéptidos que contienen fragmento de cadena ligera en sobrenadantes de cultivo celular tras la expresión transitoria en células HEK293-EBNA.
Figura 9a-c: inmunodetección de los polipéptidos que contienen fragmento de cadena pesada en sobrenadantes de cultivo celulas tras la expresión transitoria en células HEK293-EBNA.
A partir de las figuras 7a-c, 8a-c y 9a-c puede deducirse que los polipéptidos son expresados transitoriamente y secretados al medio de cultivo. En el caso de que el polipéptido que contienen inmunoglobulina presente uno o varios sitios de glucosilación, los polipéptidos finales no presentan un peso molecular exactamente definido sino una distribución de pesos moleculares dependiente del grado de glucosilación. Esto provoca que en la SDS-PAGE, las especies que representan un mismo polipéptido no migren homogéneamente y que de esta manera las bandas se encuentren ensanchadas.
Ejemplo 6
Cuantificación de los polipéptidos que contienen cadena pesada expresados con ELISA de IgG humana
Se determinó la concentración de polipéptido que contenía fragmento de cadena pesada de inmunoglobulina en sobrenadantes de cultivo celular mediante un ELISA de sándwich que utilizó un fragmento F(ab')2 anti-IgG humana biotinilado a modo de reactivo de captura, y para la detección, un fragmento de anticuerpo F(ab')2 anti-IgG humana conjugado con peroxidasa.
Se recubrieron placas de 96 pocillos recubiertos con estreptavidina (placas de tira de poliestireno recubiertas con estreptavidina Reacti-BindTM de Pierce, código nº 15121, Pierce Chemical Company, USA) con 0,5 µg/ml de fragmento de anticuerpo F(ab')2 policlonal de cabra anti-IgG humana biotinilado ((F(ab')2<h-Fcγ<Bi; Dianova, Alemania, código nº 109-066-098), anticuerpo de captura (0,1 ml/pocillo) en tampón diluyente (tampón diluyente: tampón PBS que contenía albúmina de suero bovino al 0,5% en peso-volumen (p/v)) mediante incubación durante una hora a temepratura ambiente (RT) bajo agitación. A continuación, las placas se lavaron tres veces con más de 0,3 ml de tampón de lavado (tampón de lavado: PBS que contenía Tween-20 al 1% en peso-volumen (p/v)). Los sobrenadantes de cultivo celular (muestras) que contenían conjugado de inmunoglobulina IgG se diluyeron en serie (dos veces) hasta una concentración de entre 0,5 y 20 ng/ml en tampón diluyente, se añadieron a las placas y se incubaron durante una hora a RT bajo agitación. Se utilizó anticuerpo estándar anti-IGF-1R purificado (0,5 a 20 ng/ml) en tampón diluyente para la generación de una curva estándar de proteína IgG. Tras lavar las placas tres veces con 0,3 ml/pocillo de tampón de lavado, los complejos unidos a Fc-gamma humana se detectaron con un fragmento F(ab')2 conjugado con peroxidasa de IgG policlonal de cabra específico de anti-F(ab')2 humano (F(ab')2<h-Fcγ>POD, Dianova, código nº 109-036-098]. Tras lavar las placas 3 veces con 0,3 ml/pocillo de tampón de lavado, las placas se revelaron con solución de sustrato ABTS® (ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolín-6-sulfónico) de peroxidasa (Roche Molecular Biochemicals, código nº 1684302, Roche Diagnostics GmbH, Alemania). Tras 10 a 30 minutos, se midió la absorbancia a 405 nm y a 490 nm frente a un blanco de reactivo (tampón de incubación + solución ABTS®) en un lector de placas Tecan Spectrafluorplus (Tecan Deutschland GmbH, Alemania). Para la corrección del fondo, se restó la absorbancia a 490 nm de la absorbancia a 405 nm según la fórmula I. Todas las muestras se sometieron a ensayo por lo menos por duplicado, y se calculó una media de dobles o triples mediciones de absorbancia. Se calculó el contenido de IgG de las muestras a partir de una curva estándar.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> F. Hoffmann-La Roche AG
<120> Conjugado péptido-inmunoglobulina
<130> 23215 FT
<150> EP 05023003
<151> 2005-10-21
<150> EP 06010665
<151> 2006-05-24
<160> 558
<170> PatentIn versión 3.2
<210> 1
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> conector sintético que comprende un sitio de restricción BgIII en el extremo 5' y un sitio de restricción NheI en el extremo 3' (sitio NheI en el interior del extremo N-terminal de CH1)
<400> 1 agatcttttg ccaccgctag c 21
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
<210> 3
<211> 24
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> molécula conectora sintética dispuesta con un sitio de restricción BgIII en el extremo 5' y un sitio de restricción NheI en el extremo 3' directamente unido a la región variable VL-IR
<400> 3 agatctatat atatatatgc tagc 24
<210> 4
<211> 27
<212> ADN
<213> Artificial
<220> <223> sitio de restricción BglII en el extremo 3' del promotor del CMV y sitio de restricción BbsI en el interior de la región constante de la cadena ligera del anticuerpo Mab humano <IGF-1R>
<400> 4
cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttc 27
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 5
- <210>
- 6 15 <211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> molécula conectora 1
<400> 6
- <210>
- 7 25 <211> 25
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> molécula conectora 2
<400> 7
- <210>
- 8 35 <211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> molécula conectora 3
<400> 8
- <210>
- 9 45 <211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> molécula conectora 4
<400> 9
<210> 10
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> molécula conectora 5
<400> 10
<210> 11
<211> 345
<212> PRT
<213> Virus de la inmunodeficiencia humana
<220>
<221> misc feature
<223> Secuencia natural de aminoácidos derivada de la glucoproteína gp41 del VIH-1 del aislado HN-1 LAI/IIIB clon BH8 (locus HIVH3BH8) (posición pb: 507-851)
<400> 11
<210> 12
<211> 36
<212> PRT
5 <213> Virus de la inmunodeficiencia humana
<220>
<221> misc feature
<223> Secuencia natural de aminoácidos derivada del ectodominio de gp41 del VIH-1 (posición pb: 621-656) 10
<400> 12
<210> 13
<211> 123 15 <212> PRT
<213> Virus de la inmunodeficiencia humana
<220>
<221> misc_feature 20 <223> variante 1568P (mutante único) de ectodominio de la gp41 del VIH-1, posición-pb 534-656
<400> 13
<210> 14
<211> 135
<212> PRT
5 <213> Virus de la inmunodeficiencia humana
<220>
<221> misc feature
<223> variante I568P, L550E, L566E, I580E (mutante cuádruple) del ectodominio de la gp41 del VIH-1, posición-pb 52210 656
<400> 14
<210> 15
<211> 133
<212> ADN 5 <213> Virus de la inmunodeficiencia humana
<220>
<221> misc_feature
<223> inserción 4964 10
<400> 15
<210> 16
<213> Virus de la inmunodeficiencia humana
<220>
<221> misc feature 20 <223> inserción 4965
<400> 16
<210> 17
<211> 279
<212> ADN 5 <213> Virus de la inmunodeficiencia humana
<220>
<221> misc_feature
<223> inserción 4966 10
<400> 17
<210> 18
<213> Virus de la inmunodeficiencia humana
<220>
<221> misc_feature 20 <223> Insert 4967
<400> 18
<212> ADN
<213> Virus de la inmunodeficiencia humana
<220> 30 <221> misc_feature
<223> inserción 4969
<400> 19
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 20
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 21
<210> 22
<211> 13
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 22
<210> 23
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 23
<210> 24
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 24
<210> 25
<211> 16
<212> PRT 10 <233> Mus musculus
<400> 25
<212> PRT
<213> Mus musculus
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 27
<210> 28
<211> 19 30 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
40 <400> 29
<210> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 31
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
<210> 32
<213> Homo sapiens
<400> 32
20 <210> 33
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
25 <400> 33
<210> 34
<211> 19
<212> PRT 30 <213> Homo sapiens
<400> 34
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 36
<211> 19
<212> PRT 10 <213> Homo sapiens
<400> 36
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 38
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<900> 39
<210> 40
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 42
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
<210> 44
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
5 <210> 45
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
10 <400> 45
<210> 46
<211> 19
<212> PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 46
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 48
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 48
<210> 49
<213> Homo sapiens 48
<400> 49
<210> 50
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 51
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
<210> 52
<213> secuencia de línea germinal humana
<400> 52
<210> 53
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 53
<210> 54
<211> 19
<213> Homo sapiens
<400> 54
5 <210> 55
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
10 <400> 55
<210> 56
<211> 19
<212> PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 56
20 <210> 57
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
25 <400> 57
<210> 58
<211> 19
<212> PRT 30 <213> Homo sapiens
<400> 58
<210> 59
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 59
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 61
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 61
<210> 62
<213> Homo sapiens
<400> 62
30 <210> 63
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
35 <400> 63
<210> 64
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 64
<212> PRT
<213> secuencia de línea germinal humana
<210> 66
<211> 20 20 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 66
25 <210> 67
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
30 <400> 67
<210> 68
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 68
<210> 69
<211> 22
<212> PRT
<213> secuencia de línea germinal humana
<400> 69
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 70
<210> 71
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 71
<210> 72
<213> Homo sapiens
<400> 72
<210> 73
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 73
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 75
<211> 22
<212> PRT 20 <213> Homo sapiens
<400> 75
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 77
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 78
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 78
<210> 79
<213> Homo sapiens
<400> 79
20 <210> 80
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
25 <400> 80
<210> 81
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- <212>
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
<210> 84
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- <212>
- PRT 20 <213> Homo sapiens
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<212> PRT
<213> secuencia de línea germinal humana
<210> 86
<211> 22
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<213> Homo sapiens
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<223> molécula conectora 7
<400> 140
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- <212>
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- PRT 20 <213> Mus musculus
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<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 249
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220> 15 <221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido natural
<400> 250
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 251
<210> 252
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<400> 252
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<400> 445
<210> 446
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 446
<210> 447
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 447
<210> 448
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 448
<210> 449
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 449 <210> 450
<211> 4
<212> PRT
<213> Mus musculus
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<900> 451
<210> 452
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 452
<210> 453
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 453
<210> 454
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 454
<210> 455
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 455
<210> 456
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 457
<210> 458
<211> 15 15 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 458
20 <210> 459
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
25 <400> 459
<210> 460
<211> 15
<212> PRT 30 <213> Mus musculus
<400> 460
<210> 461 35 <211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 462
<210> 463
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 464
<210> 465
<211> 16 15 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 465
20 <210> 466
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
25 <400> 466
<210> 467
<211> 15 30 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 467
35 <210> 968
<211> 11
<212> PRT
<213> Mus musculus
40 <400> 468
<210> 469
<211> 16
<212> PRT 45 <213> Mus musculus
<400> 469
<210> 470
<211> 4
<212> PRT
<213> Mus musculus
<211> 4
<212> PRT
<213> Mus musculus
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> péptido de unión
<400> 472
<210> 473
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 473
<210> 474
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 474
<210> 475
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 475
<210> 476
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 477
<212> PRT
<213> Mus musculus
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus 30 <400> 479
<210> 480
<211> 19
- <212>
- PRT 35 <213> Mus musculus
<400> 480
<212> PRT
<213> Mus musculus
<210> 482
<211> 19
- <212>
- PRT 15 <213> Mus musculus
<400> 482
<212> PRT
<213> Mus musculus
<211> 23
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 484
<210> 485
<213> Mus musculus
<400> 485
<210> 486
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 487
<210> 488
<213> Mus musculus
<400> 488
25 <210> 489
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
30 <400> 489
<210> 490
<211> 19 35 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 490
<210> 491
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 491
<212> PRT
<213> Mus musculus
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 493
<210> 494
<213> Mus musculus
<400> 494
30 <210> 495
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
35 <400> 495
<210> 496
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 496
<212> PRT
<213> Mus musculus
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 498
<210> 499
<213> Mus musculus
<400> 499
30 <210> 500
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
35 <400> 500
<210> 501
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 501
<212> PRT
<213> Mus musculus
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 503
<210> 504
<213> Mus musculus
<400> 504
<210> 505
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 505
5 <210> 506
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
10 <400> 506
<210> 507
<211> 19
<212> PRT 15 <213> Mus musculus
<400> 507
<212> PRT
<213> Mus musculus
<211> 18
<212> PRT .
<213> Mus musculus
<400> 509
<210> 510
<213> Mus musculus
<400> 510
<210> 511
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 512
<210> 513
<213> Mus musculus
<400> 513
25 <210> 514
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
30 <400> 514
<210> 515
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 516
<210> 517
<213> Mus musculus
<400> 517
20 <210> 518
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
25 <400> 518
<210> 519
<213> Mus musculus
<400> 519
<210> 520
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 520
<212> PRT
<213> Mus musculus
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 522
<210> 523
<213> Mus musculus
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 524
<210> 525
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 525
10 <210> 526
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
15 <400> 526
<210> 527
<211> 18
<212> PRT 20 <213> Mus musculus
<400> 527
<212> PRT
<213> Mus musculus
<210> 529
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 529
<210> 530
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 531
<210> 532
<213> Mus musculus
<400> 532
25 <210> 533
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
30 <400> 533
<210> 539
<211> 18
<212> PRT
35 <213> Mus musculus 137
<400> 534
<210> 535
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 536
<210> 537
<213> Mus musculus
<400> 537
25 <210> 538
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
30 <400> 538
<210> 539
<211> 18
<212> PRT 35 <213> Mus musculus
<400> 539
<210> 540
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 540
<212> PRT
<213> Mus musculus
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 542
<210> 543
<213> Mus musculus
<400> 543
30 <210> 544
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
35 <400> 544
<210> 545
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 545
<212> PRT
<213> Mus musculus
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 547
<210> 548
<213> Mus musculus
<400> 548
30 <210> 549
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
35 <400> 599
<210> 550
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 550
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 551
<212> PRT
<213> Mus musculus
<210> 553
<211> 18
- <212>
- PRT 30 <213> Mus musculus
<400> 553
<210> 554
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> molécula conectora 8
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> molécula conectora 9
<210> 557
<211> 27
- <212>
- PRT 35 <213> Artificial
- 25
- <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> molécula conectora 10
- 30
- <400> 556
<220>
<223> molécula conectora 11
<210> 558 <211> 38
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> inserción de sitios de restricción únicos HindIII y KasI
<400> 558 aagcttcaac aggggagagt gttgaaggga gaggcgcc 38
Claims (11)
- REIVINDICACIONES1. Método para la producción recombinante de un polipéptido heterólogo en una célula huésped eucariótica que comprende un plásmido de expresión, caracterizado porque:a) el plásmido de expresión comprende, en dirección 5' a 3', aa) un promotor, ab) un ácido nucleico codificante de un primer polipéptido que es una secuencia de señal, la secuencia de aminoácidos del cual se selecciona de la Tabla 1 dependiendo de los primeros dos aminoácidos del segundo polipéptido seleccionados de manera que los primeros dos aminoácidos del segundo polipéptido sean idénticos a los primeros dos aminoácidos de las secuencias de aminoácidos de la región FR1 de inmunoglobulina que sigue naturalmente, ac) un ácido nucleico codificante de un segundo polipéptido que comprende:i) un ácido nucleico codificante de dicho polipéptido heterólogo, ii) un ácido nucleico codificante de un conector, iii) un ácido nucleico codificante de un fragmento de inmunoglobulina que comprende por lo menos los dominios constantes de una cadena de una inmunoglobulina,ad) una región 3' no traducida que comprende una señal de poliadenialción,b) el plásmido de expresión se introduce en una célula huésped eucariótica, c) la célula huésped se cultiva bajo condiciones adecuadas para la expresión del segundo polipéptido, d) el segundo polipéptido se recupera del medio de cultivo.
-
- 2.
- Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho segundo polipéptido comprende, tras el polipéptido heterólogo, un conector, y tras el conector, un fragmento de inmunoglobulina a modo de parte carboxi-terminal del segundo polipéptido.
-
- 3.
- Método según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el segundo polipéptido contiene, en posición 5' respecto al ácido nucleico codificante de dicho polipéptido heterólogo, un ácido nucleico adicional codificante de un único aminoácido o un dipéptido o el péptido QIWNN (SEC ID nº 472) o un fragmento de los mismos.
-
- 4.
- Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el fragmento de inmunogloublina se obtiene a partir de una IgG o de una IgE.
-
- 5.
- Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la célula eucariótica es una célula de mamífero.
-
- 6.
- Método según la reivindicación 5, caracterizado porque la célula de mamífero es una célula CHO, NS0, Sp2/0, COS, K562, BHK, PER.C6 ó HEK.
-
- 7.
- Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el conector es un péptido o polipéptido seleccionado de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 06, 07, 08, 09, 10, 139, 140, 554, 555, 556 y 557.
-
- 8.
- Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el fragmento de inmunoglobulina comprende:
a) el dominio CH1, CH2, CH3 y la región bisagra de una cadena pesada de inmunoglobulina o el dominio CL de una cadena ligera de inmunoglobulina, y b) un fragmento de un dominio variable de cadena pesada o ligera de inmunoglobulina. -
- 9.
- Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el fragmento de inmunoglobulina comprende únicamente dominios constantes.
-
- 10.
- Plásmido que comprende, en dirección 5' a 3':
a) un promotor, 144b) un ácido nucleico codificante de un primer polipéptido que es una secuencia de señal, la secuencia de aminoácidos del cual se seleccionan de la Tabla 1 dependiendo de los primeros dos aminoácidos del segundo polipéptido seleccionados de manera que los primeros dos aminoácidos del segundo polipéptido sean idénticos a los primeros dos aminoácidos de las secuencias de aminoácidos de la región FR1 de inmunoglobulina que sigue naturalmente, c) un ácido nucleico codificante de un segundo polipéptido que comprende:i) un ácido nucleico codificante de un polipéptido heterólogo, ii) un ácido nucleico codificante de un conector, iii) un ácido nucleico codificante de un fragmento de inmunoglobulina que comprende por lo menos los dominios constantes de una cadena de una inmunoglobulina,d) una región 3' no traducida que comprende una señal de poliadenilación. - 11. Kit para la preparación de un plásmido para la expresión de un polipéptido heterólogo en una célula eucariótica que comprende un plásmido que comprende, en dirección 5' a 3':a) un promotor, b) un ácido nucleico codificante de un primer polipéptido que es una secuencia de señal, cuya secuencia de aminoácidos se selecciona de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 36, 37, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328 y 329, c) un ácido nucleico codificante de un segundo polipéptido que comprende:i) un ácido nucleico codificante de un péptido QIWNN (SEC ID nº 472) o una fracción N-terminal del mismo que comprende por lo menos el dipéptido QI, ii) un sitio de clonación que comprende por lo menos un sitio de corte de restricción, iii) un ácido nucleico codificante de un conector seleccionado de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID nº 06, 07, 08, 09, 10, 139, 140, 554, 555, 556 y 557, iv) un ácido nucleico codificante de un fragmento de inmunoglobulina, que comprende por lo menos los dominios constantes de una cadena de una inmunoglobulina.d) una región 3' no traducida que comprende una señal de poliadenilación.
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EP05023003 | 2005-10-21 | ||
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- 2006-10-19 ES ES06806380T patent/ES2361188T3/es active Active
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