CN117821393A - 具有sirt-1基因敲除的哺乳动物细胞系 - Google Patents
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Abstract
本文报道了一种用于产生表达异源多肽的重组哺乳动物细胞的方法以及一种用于使用所述重组哺乳动物细胞产生异源多肽的方法，其中在所述重组细胞中，内源性SIRT‑1基因的表达已被降低。已经发现，哺乳动物细胞例如CHO细胞中的去乙酰化酶‑1基因(SIRT‑1)的敲除使重组生产率提高，并且减少所述细胞产生的乳酸。此外，已经发现，补料分批发酵结束时活力下降有所减少。
Description
本申请是申请日为2020年6月24日的、发明名称为“具有SIRT-1基因敲除的哺乳动物细胞系”的中国专利申请202080046545.X(PCT/EP2020/067579)的分案申请。
技术领域
本发明属于用于重组生产治疗性多肽(例如治疗性抗体)的细胞系开发领域。更详细地，本文报道了具有SIRT-1基因的功能性敲除的哺乳动物细胞，其导致表达特性的改善。
背景技术
哺乳动物宿主细胞系，尤其是CHO和HEK细胞系，用于分泌蛋白，例如供应蛋白(例如抗原、受体等)和治疗分子(例如抗体、细胞因子等)的重组生产。这些宿主细胞系用包含编码相应治疗分子的表达盒的载体进行转染。随后通过施加选择压力选择稳定的转染子。这导致由各个克隆组成的细胞池。在单个细胞克隆步骤中，这些克隆被分离出来，随后用不同的测定法进行筛选，以确定顶级生产细胞。
基因工程方法已应用于宿主细胞系以改善它们的特性，例如(i)参与未折叠蛋白反应途径的内源蛋白的过表达以改善蛋白折叠和分泌(Gulis,G.等人,BMCbiotechnology,14(2014)26)，(ii)抗凋亡蛋白的过表达以提高细胞活力和延长发酵过程(Lee,J.S.,等人Biotechnol.Bioeng.110(2013)2195-2207)，(iii)miRNA和/或shRNA分子的过表达以改善细胞生长和生产率(Fischer,S.,等人,J.Biotechnol.212(2015)32-43)，(iv)糖酶的过表达以调节治疗分子的糖基化模式(Ferrara,C.,等人,Biotechnol.Bioeng.93(2006)851-861)以及其他(Fischer,S.,等人,Biotechnol.Adv.33(2015)1878-1896)。
此外，已证明敲除内源性蛋白质可以改善细胞特性。实例是(i)敲除BAX/BAK蛋白导致细胞凋亡抗性增加(Cost,G.J.,等人,Biotechnol.Bioeng.105(2010)330-340)，(ii)敲除PUTS以产生非岩藻糖基化蛋白(Yamane-Ohnuki,N.,等人,Biotechnol.Bioeng.87(2004)614-622)，(iii)使用GS选择系统敲除GS以提高选择效率(Fan,L.,等人,Biotechnol.Bioeng.109(2012)1007-1015)以及其他(Fischer,S.,等人,Biotechnol.Adv.33(2015)1878-1896)。虽然过去主要使用锌指或TALEN蛋白，但最近已建立CRISPR/Cas9，用于基因组序列的通用和简单靶向，以实现敲除目的。例如，通过使用多个gRNA启用序列切除(Raab,N.,等人,Biotechnol.J.(2019)1800477)，使用CRISPR/Cas9在CHO细胞中靶向miRNA-744。
CN 109 161 545公开了一种用于抑制鸡SIRT-1表达的微小RNA，并且还公开了该微小RNA的重组过表达质粒和具体应用，以及一种通过利用过表达miRNA构建稳定低表达SIRT-1的LMH细胞系。
US2007/160586公开了用于延长细胞的复制寿命的方法。
US2011/015272公开了去乙酰化酶1和神经退行性疾病的治疗。
Younghwan,H.,等人公开了SIRT-1敲除小鼠的静息B细胞中Hspa1a和Hspa1b基因的增加(Mol.Biol.Rep.46(2019)4225-4234)。
EP 3 308 778公开了精氨酸及其作为t细胞调节剂的用途。
Fischer,S.等人公开了CHO细胞中，通过微小RNA-30家族增强的蛋白质生产是由泛素途径的调节介导的(J.Biotechnol.212(2015)32-43)。
目前，没有已知的可增加生产率的单个内源基因的敲除。因此，内源基因的单个敲除是非常需要的，因为它很容易被引入宿主细胞系中。
发明内容
本文报道了一种用于产生表达异源多肽的重组哺乳动物细胞的方法、和用于使用所述重组哺乳动物细胞产生异源多肽的方法，其中在所述重组哺乳动物细胞中，内源SIRT-1基因的活性或功能或表达已被降低或消除或减弱或(完全)敲除。
本发明至少部分基于以下发现：敲除哺乳动物细胞(例如CHO细胞)中的去乙酰化酶-1(SIRT-1)基因，一方面提高了以下项的重组生产率，例如标准IgG型抗体，尤其是复杂抗体形式，并且另一方面减少培养过程中细胞产生的乳酸。此外，已经发现，根据本发明的重组细胞在补料分批培养结束时的活力下降是减少的，即与具有全功能SIRT-1基因的细胞相比，活力高于某一阈值的时间跨度增加。
本发明的一个独立方面是一种哺乳动物细胞，其中内源SIRT-1基因的活性或/和功能或/和表达已被降低或消除或减弱或(完全)敲除。
本发明的一个独立方面是一种哺乳动物细胞，其中与在相同条件下培养的具有相同基因型但具有内源性SIRT-1基因表达的细胞相比，内源性SIRT-1基因的表达已被降低，并且其中所述哺乳动物细胞具有在培养期间异源多肽的生产率增加和/或乳酸产量减少和/或在培养期间和/或延长培养时间内的高活力水平。
本发明的一个独立方面是一种方法，用于与在相同条件下培养的具有相同基因型但具有内源性SIRT-1基因表达的细胞相比，对于包含编码所述异源多肽的外源核酸的具有降低的(内源性的)SIRT-1表达的重组哺乳动物细胞，实现以下中的至少一项：增加重组哺乳动物细胞的异源多肽效价和/或减少其乳酸产生和/或延长其在培养期间的高活力水平和/或延长其培养时间。
本发明的一个独立方面是一种用于产生具有提高的重组生产率和/或减少的乳酸产生的重组哺乳动物细胞的方法，其中该方法包括以下步骤：
a)在哺乳动物细胞中施加核酸酶辅助的和/或靶向内源性SIRT-1基因的核酸以降低内源性SIRT-1基因的活性，以及
b)选择哺乳动物细胞，其中内源性SIRT-1基因的活性已被降低，
从而与在相同条件下培养的具有相同基因型但具有内源性SIRT-1基因表达的细胞相比，产生具有增加的重组生产率和/或减少的乳酸产生的重组哺乳动物细胞。
本发明的一个独立方面是用于生产异源多肽的方法，所述方法包括以下步骤
a)任选地在适合表达异源多肽的条件下，培养包含编码所述异源多肽的外源脱氧核糖核酸的哺乳动物细胞，和
b)从所述细胞或培养基中回收所述异源多肽，
其中内源SIRT-1基因的活性或/和功能或/和表达已被降低或消除或减弱或(完全)敲除。
本发明的另一个独立方面是一种用于产生具有提高的和/或增加的重组生产率/和/或减少的乳酸产生的重组哺乳动物细胞的方法，其中该方法包括以下步骤：
a)向哺乳动物细胞施加靶向内源性SIRT-1基因的核酸或酶或核酸酶辅助的基因靶向系统，以减少或消除或减弱或(完全)敲除内源性SIRT-1基因的活性或/和功能或/和表达，和
b)选择一种哺乳动物细胞，其中内源SIRT-1基因的活性或/和功能或/和表达已被降低或消除或减弱或(完全)敲除，
从而产生具有提高的和/或增加的重组生产率/和/或减少的乳酸产生的重组哺乳动物细胞。
在本发明所有方面和实施例的一个实施例中，SIRT-1基因敲除是杂合敲除或纯合敲除。
在本发明所有方面和实施例的一个实施例中，与表达SIRT-1的(亲本)哺乳动物细胞相比，SIRT-1敲除细胞系的生产率增加了至少10％、优选地15％或更多、更优选的20％或更多。
在本发明所有方面和实施例的一个实施例中，减少或消除或减弱或敲除是由核酸酶辅助的基因靶向系统介导的。在一个实施例中，核酸酶辅助的基因靶向系统选自CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、锌指核酸酶和TALEN。
在本发明所有方面和实施例的一个实施例中，SIRT-1基因表达的降低由RNA沉默介导。在一个实施例中，RNA沉默选自由siRNA基因靶向和敲低、shRNA基因靶向和敲低、以及miRNA基因靶向和敲低组成的组。
在本发明所有方面和实施例的一个实施例中，在引入编码异源多肽的外源核酸之前或在引入编码异源多肽的外源核酸之后进行SIRT-1敲除。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中，多肽是抗体。在一个实施例中，抗体是包含两个或更多个不同结合位点和任选地结构域交换的抗体。在一个实施例中，抗体包含三个或更多个结合位点或VH/VL-对或Fab片段和任选地结构域交换。在一个实施例中，抗体是多特异性抗体。在一个实施例中，所述多特异性抗体选自由以下项组成的组
i)具有结构域交换的全长抗体，包含第一Fab片段和第二Fab片段，
其中在第一Fab片段中
a)第一Fab片段的轻链包含VL和CH1结构域，并且第一Fab片段的重链包含VH和CL结构域；
b)第一Fab片段的轻链包含VH和CL结构域，并且第一Fab片段的重链包含VL和CH1结构域；或
c)第一Fab片段的轻链包含VL和CH1结构域，并且第一Fab片段的重链包含VH和CL结构域；
并且
其中第二Fab片段包含：包含VL和CL结构域的轻链以及包含VH和CH1结构域的重链；
ii)一种具有结构域交换和额外的重链C末端结合位点的全长抗体，包括
-一种全长抗体，其包含各有全长抗体轻链和全长抗体重链的两个对，其中由全长重链和全长轻链对中的每个对形成的结合位点特异性结合至第一抗原；
并且
-一个额外的Fab片段，其中所述额外的Fab片段与全长抗体的一条重链的C末端融合，其中所述额外的Fab片段的结合位点与第二抗原特异性结合；
其中与第二抗原特异性结合的额外的Fab片段i)包含结构域交叉，使得a)轻链可变结构域(VL)和重链可变结构域(VH)被彼此替换，或b)轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域(CH1)被彼此替换，或ii)是单链Fab片段；
iii)一个单臂单链抗体，其包含第一结合位点和第二结合位点，所述第一结合位点与第一表位或抗原特异性结合，所述第二结合位点与第二表位或抗原特异性结合，所述单臂单链抗体包含
-轻链，其包含可变轻链结构域和轻链κ或λ恒定结构域；
-组合轻链/重链，其包含可变轻链结构域、轻链恒定结构域、肽连接基、可变重链结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域、和具有杵突变的CH3；
-重链，其包含可变重链结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域、和具有臼突变的CH3结构域；
iv)一个双臂单链抗体，其包含第一结合位点和第二结合位点，所述第一结合位点与第一表位或抗原特异性结合，所述第二结合位点与第二表位或抗原特异性结合，所述双臂单链抗体包含
-第一组合轻链/重链，其包含可变轻链结构域、轻链恒定结构域、肽连接基、可变重链结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域、和具有臼突变的CH3；
-第二组合轻链/重链，其包含可变轻链结构域、轻链恒定结构域、肽连接基、可变重链结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域、和具有杵突变的CH3结构域；
v)一种普通轻链双特异性抗体，其包含第一结合位点和第二结合位点，所述第一结合位点与第一表位或抗原特异性结合，所述第二结合位点与第二表位或抗原特异性结合，所述普通轻链双特异性抗体包含
-轻链，其包含可变轻链结构域和轻链恒定结构域；
-第一重链，其包含可变重链结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域、和具有臼突变的CH3结构域；
-第二重链，其包含可变重链结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域、和具有杵突变的CH3结构域；
vi)一种全长抗体，其具有：具有结构域交换的额外的重链N末端结合位点，包括
-第一Fab片段和第二Fab片段，其中第一Fab片段和第二Fab片段的每个结合位点与第一抗原特异性结合；
-第三Fab片段，其中第三Fab片段的结合位点与第二抗原特异性结合，并且其中第三Fab片段包含结构域交叉，使得可变轻链结构域(VL)和可变重链结构域(VH)被彼此替换；以及
-包含第一Fc区多肽和第二Fc区多肽的Fc区；
其中第一Fab片段和第二Fab片段各自包含重链片段和全长轻链，
其中第一Fab片段的重链片段的C-末端与第一Fc区多肽的N-末端融合，
其中第二Fab片段的重链片段的C末端与第三Fab片段的可变轻链结构域的N末端融合，并且第三Fab片段的CH1结构域的C末端与第二Fc区多肽的N末端融合；
并且
vii)一种包含全长抗体和非免疫球蛋白部分的免疫缀合物，任选地经由肽连接基彼此缀合。
除了所描绘和要求保护的各种实施例之外，所公开的主题还涉及具有本文所公开和要求保护的特征的其他组合的其他实施例。这样，本文所呈现的特定特征可以在所公开的主题的范围内以其他方式彼此组合，使得所公开的主题包括本文所公开的特征的任何合适的组合。出于图示和描述的目的，已经呈现了所公开主题的具体实施例的描述。其并不旨在穷举或将所公开的主题限制为所公开的那些实施例。
具体实施方式
本文报道了一种用于产生表达异源多肽的重组哺乳动物细胞的方法、和用于使用所述重组哺乳动物细胞产生异源多肽的方法，其中在所述重组细胞中，内源SIRT-1基因的活性/功能/表达已被降低/消除/减弱/(完全)敲除。
本发明至少部分基于以下发现：敲除哺乳动物细胞(例如CHO细胞)中的去乙酰化酶-1(SIRT-1)基因，提高了以下项的重组生产率，例如标准IgG型抗体，尤其是复杂抗体形式，并且减少细胞产生的乳酸。此外，已经发现，补料分批培养结束时的活力下降是减少的。
I.一般定义
可用于实施本发明的方法和技术描述于例如Ausubel,F.M.(编辑)，CurrentProtocols in Molecular Biology，第I卷至第III卷(1997)；Glover,N.D.和Hames,B.D.编辑，DNA Cloning:A Practical Approach，第I卷和第II卷(1985),Oxford UniversityPress；Freshney,R.I.(编辑)，Animal Cell Culture–a practical approach,IRL PressLimited(1986)；Watson,J.D.等人，Recombinant DNA，第二版，CHSL Press(1992)；Winnacker,E.L.,From Genes to Clones；N.Y.,VCH Publishers(1987)；Celis,J.编辑，Cell Biology，第二版，Academic Press(1998)；Freshney,R.I.,Culture of AnimalCells:A Manual of Basic Technique，第二版，Alan R.Liss,Inc.,N.Y.(1987)。
使用重组DNA技术能够生成核酸的衍生物。此类衍生物可以例如在单个或几个核苷酸位置处通过取代、改变、交换、缺失或插入来加以修饰。修饰或衍生化可以例如借助定点诱变来进行。此类修饰可以由本领域技术人员容易地进行(参见例如，Sambrook,J.等人，Molecular Cloning:A laboratory manual(1999)Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York,USA；Hames,B.D.和Higgins,S.G.,Nucleic acid hybridization–apractical approach(1985)IRLPress,Oxford,England)。
必须注意的是，如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指代，除非上下文另外明确规定。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个此类细胞和本领域技术人员已知的其等同物，诸如此类。同样，术语“一个/一种”、“一个或多个/一种或多种”和“至少一个/至少一种”在本文中可以互换使用。还应当注意的是，术语“包含”、“包括”和“具有”可以互换使用。
术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-20％范围。在一个实施例中，术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-10％范围。在一个实施例中，术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-5％范围。
术语“包括”还涵盖术语“由……组成”。
如本文所用，术语“重组哺乳动物细胞”表示包含能够表达多肽的外源核苷酸序列的哺乳动物细胞。此类重组哺乳动物细胞是已引入一种或多种外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。因此，术语“包含编码异源多肽的核酸的哺乳动物细胞”表示包含整合到哺乳动物细胞基因组中并且能够表达异源多肽的外源核苷酸序列的细胞。在一个实施例中，包含外源核苷酸序列的哺乳动物细胞是包含整合在宿主细胞基因组的基因座内的单个位点处的外源核苷酸序列的细胞，其中所述外源核苷酸序列包含侧接至少一个第一选择标志物的第一重组识别序列和第二重组识别序列，以及位于第一重组识别序列与第二重组识别序列之间的第三重组识别序列，并且所有重组识别序列都不同。
如本文所用，术语“重组细胞”表示遗传修饰后的细胞，例如表达目标异源多肽并且可以用于以任何规模生产所述目标异源多肽的细胞。例如，“包含外源核苷酸序列的重组哺乳动物细胞”表示其中已将目标异源多肽的编码序列引入宿主细胞基因组中的细胞。例如，已进行过重组酶介导的盒式交换(RMCE)，由此目标多肽的编码序列已被引入宿主细胞基因组中的“包含外源核苷酸序列的重组哺乳动物细胞”为“重组细胞”。
“包含外源核苷酸序列的哺乳动物细胞”和“重组细胞”都是“转化细胞”。该术语包括原代转化细胞以及由其衍生的子代，而不考虑传代次数。子代可能例如不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。涵盖了具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突变体子代。
“分离的”组合物是已经与其天然环境的组分分离的组合物。在一些实施例中，将组合物纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳、CE-SDS)或色谱(例如，尺寸排阻色谱或离子交换或反相HPLC)确定的。关于用于评估例如抗体纯度的方法的综述，参见Flatman,S.等人，J.Chrom.B 848(2007)79-87。
“经分离的”核酸是指已自其自然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸包括这样的核酸分子，其包含在通常含有所述核酸分子的细胞中，但所述核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
“分离的”多肽或抗体是指已经与其天然环境的组分分离的多肽分子或抗体分子。
术语“整合位点”表示细胞基因组内的已向其中插入外源核苷酸序列的核酸序列。在某些实施例中，整合位点在细胞基因组中的两个相邻核苷酸之间。在某些实施例中，整合位点包括一段核苷酸序列。在某些实施例中，整合位点位于哺乳动物细胞的基因组的特定基因座内。在某些实施例中，整合位点在哺乳动物细胞的内源基因内。
如本文所用，术语“载体”或“质粒”(可以互换使用)是指能够载运与其相连的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及并入其已被引入的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
术语“与……结合”表示结合位点与其靶标的结合，诸如，包含抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域的抗体结合位点与相应抗原的结合。这种结合可以使用例如测定(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)来确定。即，术语“(与抗原)结合”表示抗体在体外测定中与其抗原结合。在一个实施例中，结合在结合测定中确定，其中抗体与表面结合，并且抗原与抗体的结合通过表面等离子体共振(SPR)来测量。结合意味着例如结合亲和力(KD)为10-8M或更低，在一些实施例中为10-13M至10-8M，在一些实施例中为10-13M至10- 9M。术语“结合”还包括术语“特异性结合”。
例如，在测定的一个可能实施例中，抗原与表面结合，并且通过表面等离子体共振(SPR)来测量抗体(即其结合位点)的结合。结合的亲和力由术语ka(缔合常数：缔合以形成复合物的速率常数)、kd(解离常数：复合物解离的速率常数)和KD(kd/ka)限定。替代性地，SPR传感图的结合信号可以直接与参考物的响应信号在共振信号高度和解离行为方面进行比较。
术语“结合位点”表示对靶标表现出结合特异性的任何蛋白质实体。这可以是例如受体、受体配体、抗运载蛋白、亲和体、抗体等。因此，如本文所用的术语“结合位点”表示可以与第二多肽特异性结合或可以被第二多肽特异性结合的多肽。
如本文所用，术语“选择标志物”表示这样的基因：其允许在相应的选择性试剂的存在下特异性选择或排除携带该基因的细胞。例如，但不作为限制，选择标志物可以允许在相应选择性试剂(选择性培养条件)的存在下正选择用该选择标志物基因转化的宿主细胞；未转化的宿主细胞将不能在该选择性培养条件下生长或存活。选择标志物可以是正的、负的或双功能的。正选择标志物可以允许选择携带该标记的细胞，而负选择标志物可以允许选择性地消除携带该标记的细胞。选择标志物可以赋予对药物的抗性，或者补偿宿主细胞中的代谢或分解代谢缺陷。在原核细胞中，可以使用赋予对氨苄青霉素、四环素、卡那霉素或氯霉素的抗性的基因，以及其他基因。可用作真核细胞中的选择标志物的抗性基因包括但不限于针对氨基糖苷磷酸转移酶(APH)(例如，潮霉素磷酸转移酶(HYG)、新霉素和G418APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、谷氨酰胺合成酶(GS)、天冬酰胺合成酶、色氨酸合成酶(吲哚)、组氨醇脱氢酶(组氨醇D)的基因，以及编码对嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、博来霉素、腐草霉素、氯霉素、Zeocin和霉酚酸的抗性的基因。另外的标记基因描述于WO 92/08796和WO 94/28143中。
除有助于在存在相应选择性试剂的情况下进行选择之外，选择标志物还可以替代性地为通常不存在于细胞中的分子，例如绿色荧光蛋白质(GFP)、增强的GFP(eGFP)、合成的GFP、黄色荧光蛋白质(YFP)、增强的YFP(eYFP)、青色荧光蛋白质(CFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed单体、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean和T-Sapphire。可以例如分别通过检测到编码的多肽所发出的荧光或不存在这种荧光，来将表达这种分子的细胞与不含该基因的细胞区分开来。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指两种或更多种组分的并置，其中这些组分的关系允许它们以预期的方式发挥作用。例如，如果启动子和/或增强子用于调节编码序列的转录，则该启动子和/或增强子可操作地连接至编码序列。在某些实施例中，“可操作地连接”的DNA序列在单个染色体上相连并且相邻。在某些实施例中，例如，当必须接合两个蛋白质编码区(诸如分泌前导区和多肽)时，这些序列是相连、相邻的，并且在同一阅读框中。在某些实施例中，可操作地连接的启动子位于编码序列上游并且可以与该编码序列相邻。在某些实施例中，例如，关于调节编码序列表达的增强子序列，这两种组分能够可操作地连接，但并不相邻。如果增强子增加了编码序列的转录，则该增强子可操作地连接至编码序列。可操作地连接的增强子可以位于编码序列的上游、内部或下游，并且可以位于与编码序列的启动子距离相当远的位置。可操作的连接可以通过本领域中已知的重组方法(例如使用PCR方法和/或通过在方便的限制性位点处连接)来完成。如果不存在方便的限制性位点，则可以根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或连接基。如果内部核糖体进入位点(IRES)允许在内部位置处以独立于5’端的方式启动ORF的翻译，则IRES可操作地连接至开放阅读框(ORF)。
如本文所用，术语“外源”是指核苷酸序列并非来源于特异性细胞，而是通过DNA递送方法(例如，通过转染方法、电穿孔方法或转化方法)引入所述细胞中。因此，外源核苷酸序列是人工序列，其中人工性可以源自例如不同来源的子序列的组合(例如，具有SV40启动子的重组酶识别序列与绿色荧光蛋白质的编码序列的组合是人工核酸)或源自序列(例如仅编码膜结合受体的细胞外结构域或cDNA的序列)的部分的缺失，或者核碱基突变。术语“内源”是指来源于细胞的核苷酸序列。“外源”核苷酸序列可以具有碱基组成相同的“内源”对应物，但其中“外源”序列例如经由重组DNA技术被引入细胞中。
如本文所用，术语“异源”是指多肽并非来源于特异性细胞，而是通过DNA递送方法(例如，通过转染方法、电穿孔方法或转化方法)，已将相应的编码核酸引入所述细胞中。因此，异源多肽是对表达它的细胞而言是人工的多肽，由此这与该多肽是源自不同细胞/生物的天然存在的多肽还是人造多肽无关。
术语“去乙酰化酶-1”表示作为哺乳动物中的信号转导的一部分的酶，即NAD依赖性脱乙酰基酶去乙酰化酶-1。去乙酰化酶-1由SIRT-1基因编码。人去乙酰化酶-1具有UniProtKB条目Q96EB6，并显示在SEQ ID NO:17中。中国仓鼠去乙酰化酶-1具有UniProtKB条目A0A3L7IF96，并显示在SEQ ID NO:18中。
II.抗体
关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息给出于：Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中。
如本文所用，重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置是根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号系统编号的，并且在本文中被称为“根据Kabat编号”。具体地，将Kabat编号系统(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的第647-660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL，并且将Kabat的EU索引编号系统(参见Kabat等人，Sequences ofProteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD(1991)的第661-723页)用于恒定重链结构域(CH1、铰链、CH2和CH3，这在本文中通过在此情况下称为“根据KabatEU索引编号”而进一步分类)。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且涵盖各种抗体结构，其包括但不限于全长抗体、单克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体-抗体片段融合，及其组合。
术语“天然抗体”表示具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由经二硫键合的两条相同轻链和两条相同重链组成。从N末端到C末端，每条重链具有重链可变区(VH)，接着是三个重链恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，由此，铰链区定位在第一重链恒定结构域与第二恒定重链结构域之间。类似地，从N末端到C末端，每条轻链都有一个轻链可变区(VL)，接着是一个轻链恒定结构域(CL)。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，这两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。
术语“全长抗体”表示具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。全长抗体包含两条全长抗体轻链以及两条全长抗体重链，每条全长抗体轻链在N末端到C末端方向上包含轻链可变区和轻链恒定结构域，每条全长抗体重链在N末端到C末端方向上包含重链可变区、第一重链恒定结构域、铰链区、第二重链恒定结构域和第三重链恒定结构域。与天然抗体相反，全长抗体可以包含另外的免疫球蛋白结构域，例如，一个或多个额外的scFv，或重链或轻链Fab片段，或与全长抗体的不同链的一个或多个末端缀合的scFab，但每个末端仅缀合单个片段。这些缀合物也为术语全长抗体所涵盖。
术语“抗体结合位点”表示：成一对的重链可变结构域和轻链可变结构域。为了确保与抗原的正确结合，这些可变结构域是同源可变结构域，即属于在一起。抗体结合位点包含至少三个HVR(例如在VHH的情况下)或三-六个HVR(例如在天然存在的情况下，即具有VH/VL对的常规抗体)。通常，负责抗原结合的抗体的氨基酸残基形成结合位点。这些残基通常包含在成一对的抗体重链可变结构域和相应的抗体轻链可变结构域中。抗体的抗原结合位点包含来自“高变区”或“HVR”的氨基酸残基。“框架”或“FR”区是除本文定义的高变区残基以外的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻链可变结构域和重链可变结构域包含从N末端到C末端的区域FR1、HVR1、FR2、HVR2、FR3、HVR3和FR4。尤其是，重链可变结构域的HVR3区是最有助于抗原结合并且定义抗体的结合特异性的区域。“功能性结合位点”能够与其靶标特异性结合。术语“特异性结合”表示在结合测定的一个实施例中，结合位点在体外测定中与其靶标的结合。这种结合测定可以是任何测定，只要可以检测到结合事件。例如，在测定中，抗体与表面结合，并且抗原与抗体的结合通过表面等离子体共振(SPR)来测量。可替代地，可以使用桥接ELISA。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指以下项中的每一种：包含氨基酸残基延伸体的抗体可变结构域的在序列中高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上限定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。通常，抗体包含六个HVR；三个在重链可变结构域VH中(H1、H2、H3)，并且三个在轻链可变结构域VL中(L1、L2、L3)。
HVR包括
(a)存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处的高变环(Chothia,C和Lesk，A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；
(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIHPublication 91-3242)；
(c)存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原接触点(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；以及
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另外指明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人，出处同上编号。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区(优选地Fc区)的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
术语“重链恒定区”表示免疫球蛋白重链中含有恒定结构域的区域，即CH1结构、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。在一个实施例中，人IgG恒定区从Ala118延伸至重链的羧基末端(根据Kabat EU索引编号)。然而，恒定区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在(根据Kabat EU索引编号)。术语“恒定区”表示包含两个重链恒定区的二聚体，它们可以通过形成链间二硫键的铰链区半胱氨酸残基彼此共价连接。
术语“重链Fc区”表示免疫球蛋白重链的C末端区域，其含有铰链区(中和下铰链区)、CH2结构域和CH3结构域的至少一部分。在一个实施例中，人IgG重链Fc区从Asp221、或从Cys226、或从Pro230延伸至重链的羧基末端(根据Kabat EU索引编号)。因此，Fc区比恒定区小但在C末端部分中与之相同。然而，重链Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在(根据Kabat EU索引编号)。术语“Fc区”表示包含两个重链Fc区的二聚体，它们可以通过形成链间二硫键的铰链区半胱氨酸残基彼此共价连接。
抗体的恒定区，更准确地说是Fc区(以及同样的恒定区)直接参与补体活化、C1q结合、C3活化和Fc受体结合。虽然抗体对补体系统的影响取决于某些条件，但与C1q的结合由Fc区中限定的结合位点引起。此类结合位点在现有技术中是已知的，并且，例如，由Lukas,T.J.等人，J.Immunol.127(1981)2555-2560；Brunhouse,R.和Cebra,J.J.,Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton,D.R.等人，Nature 288(1980)338-344；Thommesen,J.E.等人，Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idusogie,E.E.等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hezareh,M.等人，J.Virol.75(2001)12161-12168；Morgan,A.等人，Immunology86(1995)319-324；和EP 0 307 434所述。此类结合位点为例如L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(根据Kabat EU索引编号)。亚类IgG1、IgG2和IgG3的抗体通常表现出补体活化、C1q结合和C3活化作用，而IgG4则不活化补体系统、不结合C1q并且不活化C3。“抗体的Fc区”是技术人员所熟知的术语，并且基于木瓜蛋白酶对抗体的切割来定义。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量形式呈递)之外，包含该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用包含全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法。
如在本申请中所用的术语“价”表示抗体中存在指定数目的结合位点。因此，术语“二价”“四价”和“六价”分别表示抗体中存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。
“单特异性抗体”表示具有关于一种抗原的单个结合特异性(即与其特异性结合)的抗体。单特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段(例如，F(ab')2)或它们的组合(例如，全长抗体加上额外的scFv或Fab片段)。单特异性抗体不需要是单价的，即单特异性抗体可以包含与一种抗原特异性结合的多于一个结合位点。例如，天然抗体是单特异性但二价的。
“多特异性抗体”表示具有关于同一抗原上至少两个不同表位或两个不同抗原的结合特异性。多特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段(例如，F(ab')2双特异性抗体)或它们的组合(例如，全长抗体加上额外的scFv或Fab片段)。多特异性抗体至少是二价的，即包含两个抗原结合位点。而且多特异性抗体至少是双特异性的。因此，二价双特异性抗体是多特异性抗体的最简单形式。具有两个、三个或更多个(例如，四个)功能性抗原结合位点的工程化抗体也已被报道(参见，例如，US2002/0004587 A1)。
在某些实施例中，抗体是多特异性抗体，例如至少双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两种抗原或表位具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施例中，结合特异性中的一个针对第一抗原，而另一个针对不同的第二抗原。在某些实施例中，多特异性抗体可以与同一抗原的两个不同的表位结合。多特异性抗体也可用于将细胞毒性剂定位于表达该抗原的细胞。
多特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体-抗体片段融合。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein,C.和Cuello,A.C.,Nature 305(1983)537-540,WO93/08829，以及Traunecker,A.等人,EMBO J.10(1991)3655-3659)和“杵臼结构”工程化(参见例如US 5,731,168)。多特异性抗体还可以通过以下方式来制备：工程化用于制备抗体Fc-异二聚体分子的静电操纵效应(参见例如，WO 2009/089004)；使两个或更多个抗体或片段交联(参见例如，US 4,676,980，以及Brennan,M.等人，Science,229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见例如，Kostelny,S.A.等人，J.Immunol.148(1992)1547-1553)；使用用于避免轻链错配问题的普通轻链技术(参见例如，WO 98/50431)；使用用于制备双特异性抗体片段的具体技术(参见例如Holliger,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448)；以及如Tutt,A.等人，J.Immunol.147(1991)60-69中所述制备三特异性抗体。
本文还包括具有三个或更多个抗原结合位点的工程化抗体，包括例如“章鱼抗体”或者DVD-Ig(参见例如，WO 2001/77342和WO 2008/024715)。具有三个或更多个抗原结合位点的多特异性抗体的其他实例可以在WO 2010/115589、WO 2010/112193、WO 2010/136172、WO 2010/145792和WO 2013/026831中找到。双特异性抗体或其抗原结合片段还包括“双作用Fab”或“DAF”(参见例如US2008/0069820和WO 2015/095539)。
多特异性抗体也可以以不对称形式提供，其中在具有相同抗原特异性的一个或多个结合臂中有结构域互换，即通过交换VH/VL结构域(参见例如，WO 2009/080252和WO2015/150447)、CH1/CL结构域(参见例如，WO 2009/080253)或完整的Fab臂(参见例如，WO 2009/080251、WO 2016/016299，还参见Schaefer等人，PNAS,108(2011)1187-1191，以及Klein等人，MAbs 8(2016)1010-20)。在一方面，多特异性抗体包含交叉Fab片段。术语“交叉Fab片段”或“xFab片段”或“交换型Fab片段”是指这样的Fab片段，其中重链和轻链的可变区或恒定区被交换。交叉Fab片段包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区1(CH1)组成的多肽链，以及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链。还可以通过将荷电或非荷电的氨基酸突变引入结构域界面以指导正确的Fab配对，以对不对称Fab臂进行工程化。参见例如WO2016/172485。
抗体或片段也可以是多特异性抗体，如WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792、或WO 2010/145793中所述。
其抗体或片段也可以是如WO 2012/163520中公开的多特异性抗体。
多特异性抗体的各种其他分子形式是在本领域中已知的并且包括在本文中(参见例如Spiess等人，Mol.Immunol.67(2015)95-106)。
双特异性抗体通常是与同一抗原上的两个不同的、不重叠的表位或不同抗原上的两个表位特异性结合的抗体分子。
复杂(多特异性)抗体是
-具有结构域交换的全长抗体：
包含第一Fab片段和第二Fab片段的多特异性IgG抗体，其中在第一Fab片段中
a)仅CH1和CL结构域相互替换(即第一Fab片段的轻链包含VL和CH1结构域，并且第一Fab片段的重链包含VH和CL结构域)；b)仅VH和VL结构域相互替换(即第一Fab片段的轻链包含VH和CL结构域，并且第一Fab片段的重链包含VL和CH1结构域)；或
c)CH1和CL结构域相互替换并且VH和VL结构域相互替换(即第一Fab片段的轻链包含VH和CH1结构域，并且第一Fab片段的重链包含VL和CL结构域)；并且
其中第二Fab片段包含：包含VL和CL结构域的轻链以及包含VH和CH1结构域的重链；
具有结构域交换的全长抗体可包含包括CH3结构域的第一重链和包括CH3结构域的第二重链，其中两个CH3结构域通过各自的氨基酸取代以互补方式工程化，以便支持第一重链与经修饰的第二重链的异二聚化，例如，如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954或WO 2013/096291(通过引用并入本文)中所公开；
-具有结构域交换和额外的重链C末端结合位点的全长抗体：
一种多特异性IgG抗体，包括
a)一种全长抗体，其包含各有全长抗体轻链和全长抗体重链的两个对，其中由全长重链和全长轻链对中的每个对形成的结合位点特异性结合至第一抗原，以及
b)一个额外的Fab片段，其中所述额外的Fab片段与全长抗体的一条重链的C末端融合，其中所述额外的Fab片段的结合位点与第二抗原特异性结合，
其中与第二抗原特异性结合的额外的Fab片段i)包含结构域交叉，使得a)轻链可变结构域(VL)和重链可变结构域(VH)被彼此替换，或b)轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域(CH1)被彼此替换，或ii)是单链Fab片段；
-单臂单链形式(＝单臂单链抗体)：
包含第一结合位点和第二结合位点的抗体，所述第一结合位点与第一表位或抗原特异性结合，所述第二结合位点与第二表位或抗原特异性结合，由此各个链如下
-轻链(可变轻链结构域+轻链κ恒定结构域)
-组合轻链/重链(可变轻链结构域+轻链恒定结构域+肽连接基+可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+带有杵突变的CH3)
-重链(可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+带有臼突变的CH3)；
-双臂单链形式(＝双臂单链抗体)：
包含第一结合位点和第二结合位点的抗体，所述第一结合位点与第一表位或抗原特异性结合，所述第二结合位点与第二表位或抗原特异性结合，由此各个链如下
-组合轻链/重链1(可变轻链结构域+轻链恒定结构域+肽连接基+可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+带有臼突变的CH3)
-组合轻链/重链2(可变轻链结构域+轻链恒定结构域+肽连接基+可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+带有杵突变的CH3)；
-普通轻链双特异性形式(＝普通轻链双特异性抗体)：
包含第一结合位点和第二结合位点的抗体，所述第一结合位点与第一表位或抗原特异性结合，所述第二结合位点与第二表位或抗原特异性结合，由此各个链如下
-轻链(可变轻链结构域+轻链恒定结构域)
-重链1(可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+带有臼突变的CH3)
-重链2(可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+带有杵突变的CH3)
-T细胞双特异性形式：
一种全长抗体，其具有：具有结构域交换的额外的重链N末端结合位点，包括
-第一Fab片段和第二Fab片段，其中第一Fab片段和第二Fab片段的每个结合位点与第一抗原特异性结合，
-第三Fab片段，其中第三Fab片段的结合位点与第二抗原特异性结合，并且其中第三Fab片段包含结构域交叉，使得可变轻链结构域(VL)和可变重链结构域(VH)被彼此替换，以及
-包含第一Fc区多肽和第二Fc区多肽的Fc区，
其中第一Fab片段和第二Fab片段各自包含重链片段和全长轻链，
其中第一Fab片段的重链片段的C-末端与第一Fc区多肽的N-末端融合，
其中第二Fab片段的重链片段的C末端与第三Fab片段的可变轻链结构域的N末端融合，并且第三Fab片段的CH1结构域的C末端与第二Fc区多肽的N末端融合。
杵臼结构二聚模块及其在抗体工程化中的用途在Carter P.、Ridgway J.B.B.、Presta L.G.:Immunotechnology，1996年2月第2卷第1期，第73-73(1)页中有所描述。
抗体重链中的CH3结构域可通过“杵臼结构(knob-into-holes)”技术改变，这一技术在例如WO 96/027011、Ridgway,J.B.等人，Protein Eng.9(1996)617-621和Merchant,A.M.等人，Nat.Biotechnol.16(1998)677-681中以若干实例详细描述。在这一方法中，改变两个CH3结构域的相互作用表面以增加这两个CH3结构域的异二聚化，从而增加包含它们的多肽的异二聚化。(两个重链的)两个CH3结构域中的一个可为“杵(knob)”而另一个为“臼(hole)”。二硫桥的引入进一步稳定化异二聚体(Merchant,A.M.等人，Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell,S.等人，J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并增加产率。
(抗体重链的)CH3结构域中的突变T366W表示为“杵突变”或“突变杵”，而(抗体重链的)CH3结构域中的突变T366S、L368A、Y407V表示为“臼突变”或“突变臼”(根据KabatEU索引编号)。通过将S354C突变引入具有“杵突变”(表示为“杵-cys-突变”或“突变杵-cys”)的重链的CH3结构域中或通过将Y349C突变引入具有“臼突变”(表示为“臼-cys-突变”或“突变臼-cys”)的重链的CH3结构域(根据Kabat EU索引编号)中，也可使用位于CH3结构域之间的额外的链间二硫桥(Merchant,A.M.等人，Nature Biotech.16(1998)677-681)。
如本文所用，术语“结构域交叉”表示在抗体重链VH-CH1片段及其相应的同源抗体轻链对中，即在抗体Fab中(片段抗原结合)，结构域序列偏离天然抗体中的序列，其中至少一个重链结构域由其相应的轻链结构域置换，反之亦然。结构域交叉有三种常见类型：(i)CH1和CL结构域的交叉，其由轻链中的结构域交叉导致VL-CH1结构域序列，由重链片段中的结构域交叉导致VH-CL结构域序列(或具有VH-CL-铰链-CH2-CH3结构域序列的全长抗体重链)；(ii)VH和VL结构域的结构域交叉，其由轻链中的结构域交叉导致VH-CL结构域序列，由重链片段中的结构域交叉导致VL-CH1结构域序列；以及(iii)完整轻链(VL-CL)和完整VH-CH1重链片段的结构域交叉(“Fab交叉”)，其由结构域交叉导致具有VH-CH1结构域序列的轻链，由结构域交叉导致具有VL-CL结构域序列的重链片段(所有上述结构域序列均以N末端至C末端方向表示)。
如本文所用，关于相应重链结构域和轻链结构域的术语“彼此替代”是指前述结构域交叉。因此，当CH1结构域和CL结构域“彼此替代”时，是指项目(i)下提及的结构域交叉以及所得重链和轻链结构域序列。因此，当VH和VL“彼此取代”时，是指在第(ii)项中提到的结构域交叉；以及当CH1和CL结构域“彼此取代”并且VH和VL结构域“彼此取代”时，是指在第(iii)项中提到的结构域交叉。例如，在WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO2009/080253、WO 2009/080254和Schaefer,W.等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 108(2011)11187-11192中报告了包括结构域交叉的双特异性抗体。此类抗体通常称为CrossMab。
在一个实施例中，多特异性抗体还包含至少一个Fab片段，包括如上文第(i)项所述的CH1和CL结构域的结构域交叉，或如上文第(ii)项所述的VH和VL结构域的结构域交叉，或如上文第(iii)项所述的VH-CH1和VL-VL结构域的结构域交叉。在具有结构域交叉的多特异性抗体的情况下，特异性结合相同抗原的Fab被构建为具有相同的结构域序列。因此，在多特异性抗体中包含多个具有结构域交叉的Fab的情况下，所述Fab与相同抗原特异性结合。
“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的抗体。在某些实施例中，人源化抗体将基本上包含所有中的至少一个可变结构域，通常是两个可变结构域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如，非人抗体，是指已经进行过人源化的抗体。
如本文所用，术语“重组抗体”表示所有通过重组手段(例如重组细胞)制备、表达、创造或分离的抗体(嵌合抗体、人源化抗体和人类抗体)。这包括从重组细胞(例如NS0、HEK、BHK、羊水细胞或CHO细胞)中分离的抗体。
如本文所用，术语“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包括完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原，即，它是功能片段。抗体片段的实例包括但不限于Fv；Fab；Fab’；Fab’-SH；F(ab’)2；双特异性Fab，双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv或scFab)。
III.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物来产生抗体，例如，如在US 4,816,567中所述。对于这些方法，提供了编码抗体的一种或多种分离的核酸。
在一方面，提供了一种制备抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体的条件下培养包括如上提供的编码所述抗体的核酸的宿主细胞，以及任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收所述抗体。
对于抗体重组生产，将编码抗体的核酸(例如，如上所述)分离并插入至一个或多个载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序来容易地对此类核酸进行分离和测序(例如，通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，或通过重组方法产生或通过化学合成获得此类核酸。
一般来讲，对于目标多肽(例如治疗性抗体)的重组大规模生产，需要稳定地表达和分泌所述多肽的细胞。这种细胞被称为“重组细胞”或“重组生产细胞”，用于产生这种细胞的过程被称为“细胞系开发”。在细胞系开发过程的第一步中，合适的宿主细胞(诸如CHO细胞)用适于表达所述目标多肽的核酸序列转染。在第二步中，基于已经用编码感兴趣多肽的核酸共转染的选择标志物的共表达，选择稳定表达感兴趣多肽的细胞。
编码多肽的核酸(即编码序列)称为结构基因。这种结构基因是简单的信息，并且其表达需要额外的调控元件。因此，结构基因通常整合在所谓的表达盒中。表达盒在哺乳动物细胞中起作用所需的最少调控元件是在所述哺乳动物细胞中起作用的启动子，其位于结构基因的上游，即5’，以及在所述哺乳动物细胞中起作用的多聚腺苷酸化信号序列，其位于结构基因的下游，即3’。启动子、结构基因和多聚腺苷酸化信号序列以可操作连接的形式排列。
在目标多肽是由不同(单体)多肽构成的异源多聚体多肽(例如抗体或复杂抗体形式)的情况下，需要的不仅是单个表达盒，而是在所含结构基因上不同的多个表达盒，即，对于该异源多聚体多肽的不同(单体)多肽中的每一者需要至少一个表达盒。例如，全长抗体是包含轻链的两个拷贝以及重链的两个拷贝的异源多聚体多肽。因此，全长抗体由两种不同的多肽构成。因此，全长抗体的表达需要两个表达盒，一个用于轻链，另一个用于重链。例如，如果全长抗体是双特异性抗体，即抗体包含与两种不同抗原特异性结合的两个不同结合位点，则两个轻链和两个重链也彼此不同。因此，这种双特异性全长抗体由四种不同的多肽构成，并且因此需要四个表达盒。
目标多肽的表达盒进而整合到一个或多个所谓的“表达载体”中。“表达载体”是提供用于在细菌细胞中扩增所述载体以及在哺乳动物细胞中表达所包含的结构基因的所有必需元件的核酸。通常，表达载体包含原核质粒增殖单元，例如用于大肠杆菌的原核质粒增殖单元，其包含复制起点和原核选择标志物，以及真核选择标志物，以及表达目标结构基因所需的表达盒。“表达载体”是用于将表达盒引入哺乳动物细胞的转运工具。
如前面的段落中所概述，待表达的多肽越复杂，所需的不同表达盒的数量也越高。固有地随着表达盒的数量增加，整合到宿主细胞基因组中的核酸的大小也增加。表达载体的大小也随之增加。但是，载体大小的实际上限在约15kbp的范围内，超过该范围，处理和加工效率显著下降。该问题可以通过使用两个或更多个表达载体来解决。因此，表达盒可以在不同的表达载体之间拆分，每个表达载体仅包含其中一些表达盒，导致尺寸减小。
用于产生表达异源多肽(例如多特异性抗体)的重组细胞的细胞系开发(CLD)，采用随机整合(RI)或靶向整合(TI)的核酸，所述核酸包含表达和产生目的异源多肽所需的相应表达盒。
使用RI，一般来说，若干个载体或其片段在相同或不同的基因座处整合到细胞的基因组中。
通常，使用TI，将包含不同表达盒的转基因的单拷贝整合到宿主细胞基因组中的预定“热点”。
用于表达(糖基化)抗体的合适宿主细胞通常来源于多细胞生物(例如脊椎动物)。
IV.宿主细胞
任何适合悬浮生长的哺乳动物细胞系均可用于根据本发明的方法中。同样独立于整合方法，即对于RI和TI，可以使用任何哺乳动物宿主细胞。
有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是人羊水细胞(例如，如在Woelfel,J.等人,BMCProc.5(2011)P133中所述的CAP-T细胞)；由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾细胞系(如在例如Graham,F.L.等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74中所述的HEK293或HEK293T细胞)；小仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利氏细胞(例如在Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中描述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞(如例如在Mather,J.P.等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所述)；MRC 5细胞；以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub,G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；以及骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki,P.和Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.(编辑)，Humana Press,Totowa,NJ(2004)，第255-268页。
在一个实施例中，哺乳动物宿主细胞是例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如CHOK1、CHO DG44等)、人胚肾(HEK)细胞、淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)或人类羊水细胞(例如CAP-T等)。在一个优选实施例中，所述哺乳动物宿主细胞为CHO细胞。
靶向整合允许将外源核苷酸序列整合到哺乳动物细胞基因组的预定位点中。在某些实施例中，靶向整合由识别一种或多种重组识别序列(RRS)的重组酶介导，所述重组识别序列存在于基因组中和待整合的外源核苷酸序列中。在某些实施例中，靶向整合由同源重组介导。
“重组识别序列”(RRS)是由重组酶识别的核苷酸序列，对于重组酶介导的重组事件是必需的并且足以引发此类重组事件。RRS可以用于限定核苷酸序列中将发生重组事件的位置。
在某些实施例中，RRS可以由Cre重组酶识别。在某些实施例中，RRS可以由FLP重组酶识别。在某些实施例中，RRS可以由Bxb1整合酶识别。在某些实施例中，RRS可以由整合酶识别。
在某些实施例中，当RRS为LoxP位点时，所述细胞需要Cre重组酶来执行重组。在某些实施例中，当RRS为FRT位点时，所述细胞需要FLP重组酶来执行重组。在某些实施例中，当RRS为Bxb1 attP或Bxb1 attB位点时，所述细胞需要Bxb1整合酶来执行重组。在某些实施例中，当RRS为 attP或/>位点时，所述细胞需要/>整合酶来执行重组。重组酶可以使用包含所述酶或作为蛋白的编码序列或mRNA的表达载体来引入细胞中。
关于TI，包含整合在基因组基因座内的单个位点上的如本文所述的着陆位点的任何已知的或未来的适用于TI的哺乳动物宿主细胞均可用于本发明。这种细胞被称为哺乳动物TI宿主细胞。在某些实施例中，所述哺乳动物TI宿主细胞为包含如本文所述的着陆位点的仓鼠细胞、人细胞、大鼠细胞或小鼠细胞。在一个优选实施例中，所述哺乳动物TI宿主细胞为CHO细胞。在某些实施例中，所述哺乳动物TI宿主细胞为包含整合在基因组基因座内的单个位点上的如本文所述的着陆位点的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、CHO K1细胞、CHOK1SV细胞、CHO DG44细胞、CHO DUKXB-11细胞、CHO K1S细胞或CHO K1M细胞。
在某些实施例中，哺乳动物TI宿主细胞包含整合的着陆位点，其中着陆位点包含一个或多个重组识别序列(RRS)。RRS可以由重组酶(例如，Cre重组酶、FLP重组酶、Bxb1整合酶或整合酶)识别。RRS可以彼此独立地选自由以下项组成的组：LoxP序列、LoxPL3序列、LoxP 2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列、Lox66序列、FRT序列、Bxb1 attP序列、Bxb1 attB序列、/> attP序列和/> attB序列。如果必须存在多个RRS，则对这些序列中的每一者的选择取决于在选择不同RRS的限度内的另一个序列。
在某些实施例中，着陆位点包含一个或多个重组识别序列(RRS)，其中所述RRS可以由重组酶识别。在某些实施例中，整合的着陆位点包含至少两个RRS。在某些实施例中，整合的着陆位点包含三个RRS，其中第三RRS位于第一RRS与第二RRS之间。在某些优选的实施例中，所有三个RRS都不同。在某些实施例中，所述着陆位点包含第一RRS、第二RRS和第三RRS，以及位于第一RRS与第二RRS之间的至少一个选择标志物，并且第三RRS不同于第一RRS和/或第二RRS。在某些实施例中，所述着陆位点还包含第二选择标志物，并且第一选择标志物和第二选择标志物是不同的。在某些实施例中，所述着陆位点还包含第三选择标志物和内部核糖体进入位点(IRES)，其中IRES可操作地连接至第三选择标志物。第三选择标志物可以不同于第一选择标志物或第二选择标志物。
尽管在下文中以CHO细胞举例说明本发明，但这仅是为了举例说明本发明而不应以任何方式解释为限制。本发明的真实范畴在权利要求书中阐述。
适用于根据本发明的方法的示例性哺乳动物TI宿主细胞是CHO细胞，其具有整合在其基因组基因座内的单个位点的着陆位点，其中所述着陆位点包含三个用于Cre重组酶介导的DNA重组的异种特异性loxP位点。
在该实例中，该异种特异性loxP位点为L3、LoxFas和2L(参见例如，Lanza等人，Biotechnol.J.7(2012)898-908；Wong等人，Nucleic Acids Res.33(2005)e147)，由此L3和2L分别在5’端和3’端侧接着陆位点，并且LoxFas位于L3位点与2L位点之间。着陆位点还包含双顺反子单元，其经由IRES将选择标志物的表达与荧光GFP蛋白的表达联系起来，从而允许通过正选择稳定着陆位点，以及选择在转染和Cre重组后不存在该位点(负选择)。绿色荧光蛋白质(GFP)用于监测RMCE反应。
如前一段中所概述的着陆位点的这种配置允许同时整合两个载体，例如携带L3和LoxFas位点的所谓前载体，以及包含LoxFas和2L位点的后载体。与着陆位点中存在的选择标志物基因不同的选择标志物基因的功能元件可以分布在两个载体之间：启动子和起始密码子可以位于前载体上，而编码区和多聚A信号位于后载体上。只有来自两个载体的所述核酸的正确的重组酶介导整合才诱导针对相应选择性试剂的抗性。
一般来讲，哺乳动物TI宿主细胞为包含整合在哺乳动物细胞基因组的基因座内的单个位点处的着陆位点的哺乳动物细胞，其中所述着陆位点包含侧接至少一个第一选择标志物的第一重组识别序列和第二重组识别序列，以及位于第一重组识别序列与第二重组识别序列之间的第三重组识别序列，并且所有重组识别序列都不同。
所述选择标志物可以选自由以下项组成的组：氨基糖苷磷酸转移酶(APH)(例如，潮霉素磷酸转移酶(HYG)、新霉素和G418 APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、谷氨酰胺合成酶(GS)、天冬酰胺合成酶、色氨酸合成酶(吲哚)、组氨醇脱氢酶(组氨醇D)，以及编码对嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、博来霉素、腐草霉素、氯霉素、Zeocin和霉酚酸的抗性的基因。所述选择标志物也可以是选自由以下项组成的组的荧光蛋白质：绿色荧光蛋白质(GFP)、增强的GFP(eGFP)、合成的GFP、黄色荧光蛋白质(YFP)、增强的YFP(eYFP)、青色荧光蛋白质(CFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed单体、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald6、CyPet、mCFPm、Cerulean和T-Sapphire。
外源核苷酸序列是并非来源于特异性细胞，而是可以通过DNA递送方法(诸如，通过转染方法、电穿孔方法或转化方法)引入所述细胞中的核苷酸序列。在某些实施例中，哺乳动物TI宿主细胞包含整合在哺乳动物细胞基因组中的一个或多个整合位点处的至少一种着陆位点。在某些实施例中，所述着陆位点整合在哺乳动物细胞基因组的特异性基因座内的一个或多个整合位点处。
在某些实施例中，整合的着陆位点包含至少一个选择标志物。在某些实施例中，整合的着陆位点包含第一RRS、第二RRS和第三RRS，以及至少一个选择标志物。在某些实施例中，选择标志物位于第一RRS与第二RRS之间。在某些实施例中，两个RRS侧接至少一个选择标志物，即，第一RRS位于该选择标志物的5’(上游)并且第二RRS位于该选择标志物的3’(下游)。在某些实施例中，第一RRS与该选择标志物的5’端相邻，并且第二RRS与该选择标志物的3’端相邻。在某些实施例中，所述着陆位点包含第一RRS、第二RRS和第三RRS，以及位于第一RRS与第三RRS之间的至少一个选择标志物。
在某些实施例中，选择标志物位于第一RRS与第二RRS之间，并且这两个侧接RRS是不同的。在某些优选的实施例中，第一侧接RRS为LoxP L3序列，并且第二侧接RRS为LoxP2L序列。在某些实施例中，LoxP L3序列位于该选择标志物的5’，并且LoxP 2L序列位于该选择标志物的3’。在某些实施例中，第一侧接RRS为野生型FRT序列，并且第二侧接RRS为突变体FRT序列。在某些实施例中，第一侧接RRS为Bxb1 attP序列，并且第二侧接RRS为Bxb1 attB序列。在某些实施例中，第一侧接RRS为attP序列，并且第二侧接RRS为/>attB序列。在某些实施例中，这两个RRS以相同的取向定位。在某些实施例中，这两个RRS均处于正向取向或反向取向。在某些实施例中，这两个RRS以相反的取向定位。/>
在某些实施例中，整合的着陆位点包含侧接两个RRS的第一选择标志物和第二选择标志物，其中第一选择标志物不同于第二选择标志物。在某些实施例中，这两个选择标志物均彼此独立地选自由以下项组成的组：谷氨酰胺合成酶选择标志物、胸苷激酶选择标志物、HYG选择标志物和嘌呤霉素抗性选择标志物。在某些实施例中，整合的着陆位点包含胸苷激酶选择标志物和HYG选择标志物。在某些实施例中，第一选择性标记选自由以下项组成的组：氨基糖苷磷酸转移酶(APH)(例如，潮霉素磷酸转移酶(HYG)、新霉素和G418 APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、谷氨酰胺合成酶(GS)、天冬酰胺合成酶、色氨酸合成酶(吲哚)、组氨醇脱氢酶(组氨醇D)，以及编码对嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、博来霉素、腐草霉素、氯霉素、Zeocin和霉酚酸的抗性的基因，并且第二选择性标记选自由以下项组成的组：GFP、eGFP、合成的GFP、YFP、eYFP、CFP、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed单体、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean和T-Sapphire荧光蛋白质。在某些实施例中，第一选择标志物为谷氨酰胺合成酶选择标志物，并且第二选择标志物为GFP荧光蛋白质。在某些实施例中，侧接两个选择标志物的两个RRS是不同的。
在某些实施例中，选择标志物可操作地连接至启动子序列。在某些实施例中，选择标志物可操作地连接至SV40启动子。在某些实施例中，选择标志物可操作地连接至人巨细胞病毒(CMV)启动子。
Ⅴ、靶向整合
用于产生根据本发明的重组哺乳动物细胞的一种方法是靶向整合(TI)。
在靶向整合中，将位点特异性重组用于将外源核酸引入哺乳动物TI宿主细胞基因组中的特定基因座中。这是一种酶促过程，其中基因组中整合位点处的序列被交换为外源核酸。一种用于实现这种核酸交换的系统是Cre-lox系统。催化交换的酶是Cre重组酶。要交换的序列由基因组和外源核酸中两个lox(P)位点的位置定义。这些lox(P)位点被Cre重组酶识别。不需要更多，即不需要ATP等。最初在噬菌体P1中发现了Cre-lox系统。
Cre-lox系统在不同的细胞类型中运行，如哺乳动物、植物、细菌和酵母。
在一个实施例中，编码异源多肽的外源核酸已通过单重组酶或双重组酶介导的盒交换(RMCE)整合到哺乳动物TI宿主细胞中。从而获得重组哺乳动物细胞，例如重组CHO细胞，其中确定的和特定的表达盒序列已整合到基因组的单个基因座中，进而导致异源多肽的有效表达和生产。
Cre-LoxP位点特异性重组系统已广泛用于许多生物实验系统中。Cre重组酶为38-kDa位点特异性DNA重组酶，其识别34bp LoxP序列。Cre重组酶来源于噬菌体P1并且属于酪氨酸家族位点特异性重组酶。Cre重组酶可以介导LoxP序列之间的分子内重组和分子间重组。LoxP序列由8bp非回文核心区及其侧接的两个13bp反向重复序列构成。Cre重组酶与13bp重复序列结合，从而介导8bp核心区内的重组。Cre-LoxP介导的重组以高效率发生，并且无需任何其他宿主因子。如果两个LoxP序列以相同的取向被置于同一核苷酸序列中，则Cre重组酶介导的重组将切除位于两个LoxP序列之间的DNA序列，成为共价闭环。如果两个LoxP序列以颠倒的位置被置于同一核苷酸序列中，则Cre重组酶介导的重组将反转位于这两个序列之间的DNA序列的取向。如果两个LoxP序列在两个不同的DNA分子上，并且如果一个DNA分子为环状分子，则Cre重组酶介导的重组将导致环状DNA序列的整合。
术语“匹配RRS”表示在两个RRS之间发生了重组。在某些实施例中，两个匹配RRS是相同的。在某些实施例中，两个RRS均为野生型LoxP序列。在某些实施例中，两个RRS均为突变体LoxP序列。在某些实施例中，两个RRS均为野生型FRT序列。在某些实施例中，两个RRS均为突变体FRT序列。在某些实施例中，两个匹配RRS为不同的序列，但是可以由同一重组酶识别。在某些实施例中，第一匹配RRS为Bxb1 attP序列，并且第二匹配RRS为Bxb1 attB序列。在某些实施例中，第一匹配RRS为 attB序列，并且第二匹配RRS为/> attB序列。
当使用两个载体组合时，在根据本发明的方法中采用“双质粒RMCE”策略或“双RMCE”。例如，但不作为限制，整合的着陆位点可以包含三个RRS，例如以下排列：其中第三RRS(“RRS3”)存在于第一RRS(“RRS1”)与第二RRS(“RRS2”)之间，而第一载体包含与该整合的外源核苷酸序列上的第一RRS和第三RRS相匹配的两个RRS，并且第二载体包含与该整合的外源核苷酸序列上的第三RRS和第二RRS相匹配的两个RRS。
双质粒RMCE策略涉及使用三个RRS位点来同时实施两个独立的RMCE。因此，在使用双质粒RMCE策略的哺乳动物TI宿主细胞中的着陆位点包括第三RRS位点(RRS3)，其与第一RRS位点(RRS1)或第二RRS位点(RRS2)没有交叉活性。两个待靶向的质粒需要相同的侧翼RRS位点才能高效靶向，其中一个质粒(前)侧接有RRS1和RRS3，另一个表达质粒(后)侧接有RRS3和RRS2。在该双质粒RMCE中还需要两个选择标志物。一个选择标志物表达盒被分成两部分。前质粒将包含启动子，随后是起始密码子和RRS3序列。后质粒将具有与选择标志物编码区的减去了起始密码子(ATG)的N末端融合的RRS3序列。可能需要在RRS3位点与选择标志物序列之间插入额外的核苷酸，以确保融合蛋白质发生框架内翻译(即可操作的连接)。仅当两个质粒均正确插入时，选择标志物的完整表达盒才将被组装，并因此使细胞对相应的选择性试剂具有抗性。
双质粒RMCE涉及靶标基因组基因座内的两个异种特异性RRS与供体DNA分子之间的双重组交叉事件，这些事件由重组酶催化。双质粒RMCE被设计成将来自组合的前载体和后载体的DNA序列的拷贝引入哺乳动物TI宿主细胞基因组的预定基因座中。RMCE可以实现为使得原核载体序列不被引入哺乳动物TI宿主细胞的基因组中，从而减少和/或防止不必要的触发宿主免疫或防御机制。RMCE过程可以用多个DNA序列重复。
在某些实施例中，靶向整合通过两次RMCE实现，其中两种不同的DNA序列均整合到RRS匹配的哺乳动物TI宿主细胞的基因组的预定位点中，其中每种DNA序列均包含至少一个编码异源多聚体多肽的一部分的表达盒和/或至少一个侧接两个异种特异性RRS的选择标志物或其部分。在某些实施例中，靶向整合通过多次RMCE实现，其中来自多个载体的DNA序列全部整合到哺乳动物TI宿主细胞的基因组的预定位点中，其中每种DNA序列均包含至少一个编码异源多聚体多肽的一部分的表达盒和/或至少一个侧接两个异种特异性RRS的选择标志物或其部分。在某些实施例中，该选择标志物可以在第一载体上部分编码并且在第二载体上部分编码，使得只有通过双RMCE正确整合两者才能够表达该选择标志物。
在某些实施例中，经由重组酶介导的重组进行的靶向整合导致多聚体多肽的选择标志物和/或不同的表达盒整合到不含来自原核载体的序列的宿主细胞基因组的一个或多个预定整合位点中。
必须指出，如在一个实施例中，SIRT-1敲除可以在引入编码异源多肽的外源核酸之前或之后进行。
VI.组合物和方法
本文报道了一种用于产生表达异源多肽的重组哺乳动物细胞的方法、和用于使用所述重组哺乳动物细胞产生异源多肽的方法，其中在所述重组哺乳动物细胞中，内源SIRT-1基因的活性/功能/表达已被降低/消除/减弱/(完全)敲除。
本发明至少部分基于以下发现：敲除哺乳动物细胞(例如CHO细胞)中的去乙酰化酶-1(SIRT-1)基因，提高了以下项的重组生产率，例如标准IgG型抗体，尤其是复杂抗体形式，并且减少培养过程中细胞产生的乳酸。此外，已经发现，在补料分批培养结束时的活力下降是减少的，即活力高于某一阈值的时间跨度增加。
通过敲除SIRT-1基因获得的结果令人惊讶，因为敲除其他同样可能影响生产率的基因没有产生积极影响。此外，不同基因的组合敲除效果并不比单个SIRT-1敲除效果好。这在产生包含靶向成纤维细胞活化蛋白(FAP)的抗原结合域和4-1BB配体(CD137L)的三聚体的分子的细胞系中显示，如报道的命名为FAP-4-1BBL，例如在WO 2016/075278中(数据见下表)。除了列举的敲除之外，所有细胞都具有与参考细胞相同的基因型。
不同基因的敲除对细胞生长没有影响，如图1所示。
去乙酰化酶1(SIRT-1)属于去乙酰化酶蛋白家族。SIRT蛋白在真核生物中高度保守，是NAD+依赖性酶，参与许多细胞途径的调节(Revollo,J.R.和Li,X.TrendsBiochem.Sci.38(2013)160-167)。SIRT-1基因编码位于细胞质和细胞核中的82kDa蛋白质。
SIRT-1基因活性/表达的敲除在用于生产异源多肽的任何真核细胞中是有利的，特别是在用于或打算用于生产重组多肽，尤其是抗体的重组CHO细胞中，更特别是在靶向整合重组CHO细胞中。敲除导致显著的生产率提高以及乳酸产量的减少以及培养时间的延长(减少/减缓/延迟活力下降)。这对于任何大规模生产过程都具有很高的经济重要性，因为这会导致各个补料分批过程的产物产量高。
SIRT-1敲除不仅限于CHO细胞，还可以用于其他宿主细胞系，例如HEK293细胞、CAP细胞和BHK细胞。
为了敲除SIRT-1基因活性/表达，已使用CRISPR/Cas9技术。同样，可以采用任何其他技术，例如锌指核酸酶或TALENS。此外，RNA沉默种类物，例如siRNA/shRNA/miRNA可用于敲低SIRT-1mRNA水平，从而降低SIRT-1基因活性/表达。
使用CRISPR-Cas9，使用多重核糖核蛋白递送，同时使用三种不同的gRNA(见图2)靶向SIRT-1基因的三个不同的位点。SIRT-1靶位点处的双链断裂会诱导插入缺失的形成，或者由于多重gRNA的使用也会导致外显子1序列内的缺失(参见图3)。对SIRT-1基因敲除细胞库的PCR扩增SIRT-1基因座进行测序表明，第一个gRNA位点处的测序反应突然中断，显示成功靶向SIRT-1基因(参见图4)。这些细胞库由含有未编辑、纯合和杂合SIRT-1基因座的细胞的混合物组成。
培养28天后，进行重新测序，显示敲除的稳定性(参见图5)。没有观察到野生型的生长优势，即分别是没有SIRT-1敲除的细胞，或敲除池的生长减少。
在14天的补料分批培养过程中，与未修饰的细胞库或克隆相比，表达不同复杂抗体形式的SIRT-1敲除细胞库或克隆的生产率提高了2-20％(数据显示在下表)。除了在敲除细胞中额外敲除SIRT-1基因外，参考细胞和敲除细胞具有相同的基因型。
此外，已经发现在SIRT-1敲除细胞中，乳酸产生(参见图6)和活力下降(参见图7)相似或略有降低。
毛细管免疫印迹证实，在核糖核酸颗粒(RNP)核转染后七天，去乙酰化酶-1的蛋白质水平被消除(图8)。
不受该理论的束缚，假设纯合敲除比杂合敲除对生产率增加具有更有利的影响。
本发明概述如下：
本发明的一个独立方面是一种哺乳动物细胞，其中内源SIRT-1基因的活性/功能/表达已被降低/消除/减弱/(完全)敲除。
本发明的一个独立方面是一种用于通减少/消除/减弱/(完全)敲除内源SIRT-1基因的活性/功能/表达来增加效价/减少乳酸产生/延长重组哺乳动物细胞培养时间的方法。
本发明的一个独立方面是用于生产多肽的方法，所述方法包括以下步骤
a)任选地在适合表达多肽的条件下，培养包含编码所述多肽的脱氧核糖核酸的哺乳动物细胞，和
b)从所述细胞或所述培养基中回收多肽，
其中内源SIRT-1基因的活性/功能/表达已被降低/消除/减弱/(完全)敲除。
本发明的另一个独立方面是一种用于产生具有提高的/增加的重组生产率/和/或减少的乳酸产生的重组哺乳动物细胞的方法，其中该方法包括以下步骤：
a)在哺乳动物细胞中施加靶向内源性SIRT-1基因的核酸，以减少/消除/减弱/(完全)敲除内源性SIRT-1基因的活性/功能/表达，和
b)选择一种哺乳动物细胞，其中内源SIRT-1基因的活性/功能/表达已被降低/消除/减弱/(完全)敲除，
从而产生具有提高的/增加的重组生产率/和/或减少的乳酸产生的重组哺乳动物细胞。
在本发明所有方面和实施例的一个实施例中，SIRT-1基因敲除是杂合敲除或纯合敲除。
在本发明所有方面和实施例的一个实施例中，与SIRT-1感受态亲本哺乳动物细胞相比，SIRT-1敲除细胞系的生产率增加了至少10％、优选地15％或更多、更优选的20％或更多。
在本发明所有方面和实施例的一个实施例中，减少或消除或减弱或敲除是由核酸酶辅助的基因靶向系统介导的。在一个实施例中，核酸酶辅助的基因靶向系统选自CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、锌指核酸酶和TALEN。
在本发明所有方面和实施例的一个实施例中，SIRT-1基因表达的降低由RNA沉默介导。在一个实施例中，RNA沉默选自由siRNA基因靶向和敲低、shRNA基因靶向和敲低、以及miRNA基因靶向和敲低组成的组。
在本发明所有方面和实施例的一个实施例中，在引入编码异源多肽的外源核酸之前或在引入编码异源多肽的外源核酸之后进行SIRT-1敲除。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中，多肽是抗体。在一个实施例中，抗体是包含两个或更多个不同结合位点和任选地结构域交换的抗体。在一个实施例中，抗体包含三个或更多个结合位点或VH/VL-对或Fab片段和任选地结构域交换。在一个实施例中，抗体是多特异性抗体。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中，多肽是抗体。在一个实施例中，所述抗体为复杂抗体。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中，(异源)多肽是异四聚体多肽，其包含-第一重链，其从N末端到C末端包含第一重链可变结构域、CH1结构域、第一轻链可变结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域，
-第二重链，其从N末端到C末端包含第一重链可变结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域，
-第一轻链，其从N末端到C末端包含第二重链可变结构域和CL结构域，和
-第二轻链，其从N末端到C末端包含第二轻链可变结构域和CL结构域，
其中第一重链可变结构域和第二轻链可变结构域形成第一结合位点，并且第二重链可变结构域和第一轻链可变结构域形成第二结合位点。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中，(异源)多肽是异四聚体多肽，其包含-第一重链，其从N末端到C末端包含第一重链可变结构域、CH1结构域、第二重链可变结构域、CL结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域，
-第二重链，其从N末端到C末端包含第一重链可变结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域，
-第一轻链，其从N末端到C末端包含第一轻链可变结构域和CH1结构域，和
-第二轻链，其从N末端到C末端包含第二轻链可变结构域和CL结构域，
其中第一重链可变结构域和第二轻链可变结构域形成第一结合位点，并且第二重链可变结构域和第一轻链可变结构域形成第二结合位点。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中，(异源)多肽是异四聚体多肽，其包含-第一重链，其从N末端到C末端包含第一重链可变结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域，
-第二重链，其从N末端到C末端包含第一轻链可变结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域，
-第一轻链，其从N末端到C末端包含第二重链可变结构域和CL结构域，和
-第二轻链，其从N末端到C末端包含第二轻链可变结构域和CL结构域，
其中第一重链可变结构域和第二轻链可变结构域形成第一结合位点，并且第二重链可变结构域和第一轻链可变结构域形成第二结合位点。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中，(异源)多肽是异四聚体多肽，其包含
-第一重链，其从N末端到C末端包含第一重链可变结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域，
-第二重链，其从N末端到C末端包含第一重链可变结构域、CL结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域，
-第一轻链，其从N末端到C末端包含第一轻链可变结构域和CH1结构域，和
-第二轻链，其从N末端到C末端包含第二轻链可变结构域和CL结构域，
其中第一重链可变结构域和第二轻链可变结构域形成第一结合位点，并且第二重链可变结构域和第一轻链可变结构域形成第二结合位点。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中，(异源)多肽是异源多聚体多肽，其包含
-第一重链，其从N末端到C末端包含第一重链可变结构域、CH1结构域、第一重链可变结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域和第一轻链可变结构域，
-第二重链，其从N末端到C末端包含第一重链可变结构域、CH1结构域、第一重链可变结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域和第二重链可变结构域，和
-第一轻链，其从N末端到C末端包含第二轻链可变结构域和CL结构域，
其中第一重链可变结构域和第二轻链可变结构域形成第一结合位点，并且第二重链可变结构域和第一轻链可变结构域形成第二结合位点。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中，(异源)多肽是异四聚体多肽，其包含
-第一重链，其从N末端到C末端包含第一重链可变结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域、肽连接基、第二重链可变结构域和CL结构域，
-第二重链，其从N末端到C末端包含第一重链可变结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域，
-第一轻链，其从N末端到C末端包含第一轻链可变结构域和CH1结构域，和
-第二轻链，其从N末端到C末端包含第二轻链可变结构域和CL结构域，
其中第二重链可变结构域和第一轻链可变结构域形成第一结合位点，并且第一重链可变结构域和第二轻链可变结构域形成第二结合位点。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中，(异源)多肽是治疗性抗体。在一个优选实施例中，治疗性性抗体是双特异性(治疗性)抗体。在一个实施例中，双特异性(治疗性)抗体是TCB。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中，(异源)多肽是双特异性(治疗性)抗体(TCB)，其包含
-第一Fab片段和第二Fab片段，其中第一Fab片段和第二Fab片段的每个结合位点与第二抗原特异性结合，
-第三Fab片段，其中第三Fab片段的结合位点与第一抗原特异性结合，并且其中第三Fab片段包含结构域交叉，使得可变轻链结构域(VL)和可变重链结构域(VH)被彼此替换，以及
-包含第一Fc区多肽和第二Fc区多肽的Fc区，
其中第一Fab片段和第二Fab片段各自包含重链片段和全长轻链，
其中第一Fab片段的重链片段的C-末端与第一Fc区多肽的N-末端融合，
其中第二Fab片段的重链片段的C-末端与第三Fab片段的可变轻链结构域的N-末端融合，且第三Fab片段的重链恒定结构域1的C-末端与第二Fc区多肽的N-末端融合。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中，(异源)多肽是三聚体多肽，其包含
-第一重链，其从N末端到C末端包含重链可变结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域，
-第二重链,其从N末端到C末端包含重链可变结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域、肽连接基和非免疫球蛋白蛋白质部分，和
-轻链，其从N末端到C末端包含轻链可变结构域和CL结构域，
其中重链可变结构域和轻链可变结构域形成结合位点。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中，(异源)多肽是三聚体多肽，其包含
-第一重链，其从N末端到C末端包含重链可变结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域，
-第二重链，其从N末端到C末端包含非免疫球蛋白蛋白质部分、肽连接基、铰链区、CH2结构域和CH3结构域，和
-轻链，其从N末端到C末端包含轻链可变结构域和CL结构域，
其中重链可变结构域和轻链可变结构域形成结合位点。
本发明的另一个独立方面是用于生产包含编码多肽的脱氧核糖核酸并且分泌多肽的重组哺乳动物细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含整合在哺乳动物细胞基因组的基因座内的单个位点处的外源核苷酸序列的哺乳动物细胞，其中所述外源核苷酸序列包含侧接至少一个第一选择标志物的第一重组识别序列和第二重组识别序列，以及位于第一重组识别序列与第二重组识别序列之间的第三重组识别序列，并且所有重组识别序列都不同；
b)向a)所提供的细胞中引入两种脱氧核糖核酸的组合物，这两种脱氧核糖核酸包含三种不同的重组识别序列和一至八个表达盒，其中
所述第一脱氧核糖核酸在5’至3’方向上包含
-第一重组识别序列，
-一个或多个表达盒，
-编码一个第二选择标志物的表达盒的5’端部分，以及
-第三重组识别序列的第一拷贝，
并且
所述第二脱氧核糖核酸在5’至3’方向上包含
-第三重组识别序列的第二拷贝，
-编码这一个第二选择标志物的表达盒的3’端部分，
-一个或多个表达盒，和
-第二重组识别序列，
其中所述第一脱氧核糖核酸和所述第二脱氧核糖核酸的第一重组识别序列至第三重组识别序列与整合的外源核苷酸序列上的第一重组识别序列至第三重组识别序列匹配，
其中编码这一个第二选择标志物的表达盒的5’端部分和3’端部分在合起来看时形成这一个第二选择标志物的功能性表达盒；
c)引入
i)与b)的第一脱氧核糖核酸和第二脱氧核糖核酸同时引入，或者
ii)随后依次引入
一种或多种重组酶，
其中所述一种或多种重组酶识别所述第一脱氧核糖核酸和所述第二脱氧核糖核酸的所述重组识别序列；(并且任选地其中所述一种或多种重组酶进行两次重组酶介导的盒式交换；)
并且
d)选择表达所述第二选择标志物并且分泌多肽的细胞，
从而产生包含编码多肽的脱氧核糖核酸并且分泌多肽的重组哺乳动物细胞。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中，重组酶是Cre重组酶。
在本发明所有方面和实施例的一个实施例中，所述脱氧核糖核酸在单个位点或基因座处稳定地整合到所述哺乳动物细胞的基因组中。
在本发明所有方面和实施例的一个实施例中，编码多肽的脱氧核糖核酸包含一至八个表达盒。
在本发明所有方面和实施例的一个实施例中，编码多肽的脱氧核糖核酸包含至少4个表达盒，其中
-位于最靠近5’的表达盒(即第一表达盒)的5’的第一重组识别序列，
-位于最靠近3’的表达盒的3’的第二重组识别序列，以及
-第三重组识别序列位于
-第一重组识别序列与第二重组识别序列之间，以及
-所述表达盒中的两者之间，
并且
其中所有重组识别序列都不同。
在本发明所有方面和实施例的一个实施例中，第三重组识别序列位于第四和第五表达盒之间。
在本发明所有方面和实施例的一个实施例中，所述编码多肽的脱氧核糖核酸包含编码选择标志物的另外的表达盒。
在本发明所有方面和实施例的一个实施例中，所述编码多肽的脱氧核糖核酸包含编码选择标志物的另外的表达盒，并且所述编码所述选择标志物的表达盒部分地位于所述第三重组识别序列的5’并部分地位于所述第三重组识别序列的3’，其中所述表达盒的位于5’的部分包含启动子和起始密码子，并且所述表达盒的位于3’的部分包含没有起始密码子的编码序列和多聚A信号，其中所述起始密码子可操作地连接至所述编码序列。
在本发明所有方面和实施例的一个实施例中，编码选择标志物的表达盒位于
i)5’，或
ii)3’，或
iii)部分地位于5’并且部分地位于3’。
在本发明所有方面和实施例的一个实施例中，所述编码选择标志物的表达盒部分地位于第三重组识别序列的5’并部分地位于第三重组识别序列的3’，其中所述表达盒的位于5’的部分包含启动子和起始密码子，并且所述表达盒的位于3’的部分包含没有起始密码子的编码序列和多聚A信号。
在本发明所有方面和实施例的一个实施例中，所述编码选择标志物的表达盒的位于5’的部分包含可操作地连接至起始密码子的启动子序列，由此启动子序列在上游分别侧接第二、第三或第四表达盒(即定位在这些表达盒的下游)，并且起始密码子在下游侧接第三重组识别序列(即定位在第三重组识别序列的上游)；并且所述编码选择标志物的表达盒的位于3’的部分包含编码选择标志物的核酸，该核酸缺乏起始密码子，并且在上游侧接第三重组识别序列，在下游分别侧接第三、第四或第五表达盒。
在本发明所有方面和实施例的一个实施例中，起始密码子是翻译起始密码子。在一个实施例中，所述起始密码子为ATG。
在本发明所有方面和实施例的一个实施例中，第一脱氧核糖核酸整合到第一载体中并且第二脱氧核糖核酸整合到第二载体中。
在本发明所有方面和实施例的一个实施例中，所述表达盒中的每一者在5’至3’方向上包含启动子、编码序列和多聚腺苷酸化信号序列，任选地随后是终止子序列。
在本发明所有方面和实施例的一个实施例中，所述启动子为具有或不具有内含子A的人CMV启动子，所述多聚腺苷酸化信号序列为bGH多聚A位点，并且所述终止子为hGT终止子。
在本发明所有方面和实施例的一个实施例中，对于除所述选择标志物的表达盒以外，所述启动子为具有内含子A的人CMV启动子，所述多聚腺苷酸化信号序列为bGH多聚腺苷酸化信号序列，并且所述终止子为hGT终止子；对于所述选择标志物的表达盒，所述启动子为SV40启动子，并且所述多聚腺苷酸化信号序列为SV40多聚腺苷酸化信号序列并且不存在终止子。
在本发明所有方面和实施例的一个实施例中，哺乳动物细胞是CHO细胞。在一个实施例中，所述CHO细胞为CHO-K1细胞。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中，多肽选自由以下组成的多肽组：二价单特异性抗体、包含至少一个结构域交换的二价双特异性抗体和包含至少一个结构域交换的三价双特异性抗体。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中，所述重组酶识别序列为L3、2L和LoxFas。在一个实施例中，L3具有序列SEQ ID NO:01，2L具有序列SEQ ID NO:02，并且LoxFas具有序列SEQ ID NO:03。在一个实施例中，所述第一重组酶识别序列为L3，所述第二重组酶识别序列为2L，并且所述第三重组酶识别序列为LoxFas。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中，所述启动子为具有内含子A的人CMV启动子，所述多聚腺苷酸化信号序列为bGH多聚A位点，并且所述终止子序列为hGT终止子。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中，对于除所述选择标志物的表达盒以外，所述启动子为具有内含子A的人CMV启动子，所述多聚腺苷酸化信号序列为bGH多聚A位点，并且所述终止子序列为hGT终止子，对于所述选择标志物的表达盒，所述启动子为SV40启动子，并且所述多聚腺苷酸化信号序列为SV40多聚A位点并且不存在终止子序列。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中，人CMV启动子具有序列SEQ IDNO:04。在一个实施例中，人CMV启动子具有序列SEQ ID NO:06。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中，bGH多聚腺苷酸化信号序列为SEQIDNO:08。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中，hGT终止子具有序列SEQ ID NO:09。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中，SV40启动子具有序列SEQ ID NO:10。
在本发明的所有方面和实施例的一个实施例中在所有前述方面和实施例中的一个实施例中，SV40多聚腺苷酸化信号序列为SEQ ID NO:07。
提供以下实例、序列和附图来辅助理解本发明，本发明的真实范畴在所附权利要求书中阐述。应当理解，在不脱离本发明实质的前提下，可以对阐明的程序进行修改。
序列描述
SEQ ID NO:01:L3重组酶识别序列的示例性序列
SEQ ID NO:02:2L重组酶识别序列的示例性序列
SEQ ID NO:03:LoxFas重组酶识别序列的示例性序列
SEQ ID NO:04-06:人CMV启动子的示例性变体
SEQ ID NO:07:示例性SV40多聚腺苷酸化信号序列
SEQ ID NO:08:示例性bGH多聚腺苷酸化信号序列
SEQ ID NO:09:示例性hGT终止子序列
SEQ ID NO:10:示例性SV40启动子序列
SEQ ID NO:11:示例性GFP核酸序列
SEQ ID NO:12:gRNA_SIRT1_1：TATCATCCAACTCAGGTGGA
SEQ ID NO:13:gRNA_SIRT1_2：GCAGCATCTCATGATTGGCA
SEQ ID NO:14:gRNA_SIRT1_3：GCATTCTTGAAGTAACTTCA
SEQ ID NO:15:oSA060_SIRT1_for：GCTGCCCTTCAAGTTATGGC
SEQ ID NO:16:oSA061_SIRT1_rev：GCTGGCCTTTTGACTCACAG
SEQ ID NO:17:人去乙酰化酶-1的氨基酸序列
SEQ ID NO:18:中国仓鼠去乙酰化酶-1的氨基酸序列
附图说明
图1靶基因基于CRISPR/Cas9的敲除(KO)后的生长和活力。显示的是表达抗体的细胞的工程克隆的活细胞计数，所述抗体包含靶向成纤维细胞活化蛋白(FAP)的抗原结合域和具有不同的基于CRISPR RNP的靶基因敲除的4-1BB配体(CD137L)的三聚体。NTC：非靶向对照gRNA；线＝活力；条形＝活细胞浓度。
图2来源于公开的CHO基因组的SIRT-1基因。(A)显示外显子和内含子的SIRT-1基因、gRNA靶位点(蓝色)和用于SIRT-1扩增子制备的引物序列(oSA060和oSA061)(绿色)。(B)放大SIRT-1基因的外显子1。
图3SIRT-1基因座的PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳。已检测到插入缺失。
泳道1＝能够特异性结合CD40和FAP的双特异性抗原结合分子；泳道2＝泳道1的复制品；泳道3＝包含靶向成纤维细胞活化蛋白(FAP)的抗原结合结构域和4-1BB配体(CD137L)的三聚体的分子(1)；泳道4＝泳道3的复制品；泳道5＝包含靶向成纤维细胞活化蛋白(FAP)的抗原结合结构域和4-1BB配体(CD137L)的三聚体的分子(2)；泳道6＝泳道5的复制品；泳道7＝T细胞双特异性形式抗体-1；泳道8＝泳道7的复制品；泳道9＝具有结构域交换的全长抗体；泳道10＝泳道9的复制品；泳道11＝包含突变白细胞介素-2多肽和结合PD-1的抗体的免疫缀合物(池)；泳道12＝泳道11的复制品；泳道13＝包含突变白细胞介素-2多肽和结合PD-1的抗体的免疫缀合物(克隆)；泳道14＝泳道13的复制品；泳道15＝T细胞双特异性形式抗体-2；泳道16＝泳道15的复制品；泳道17＝靶向整合CHO宿主细胞；泳道18＝泳道17的复制品；MW＝分子量标志物。
图4多重CRISPR/Cas9修饰细胞库中SIRT-1敲除的测序验证。六种不同复杂抗体形式的未修饰池/克隆的SIRT-1基因扩增子与SIRT-1敲除池/克隆(含有未修饰/杂合/纯合SIRT-1敲除基因座的混合物)的测序结果的比较。
图5SIRT-1基因座的Sanger重测序。敲除后28天，SIRT-1在所有细胞系中的池水平上稳定地保持破坏(Cas9-gRNA RNP转染)。
图6补料分批乳酸数据[mg/l]。六种不同复杂抗体形式的未修饰池/克隆与SIRT-1敲除池/克隆(含有未修饰/杂合/纯合SIRT-1敲除基因座的混合物)的测序结果的比较。
细胞表达
1＝T细胞双特异性形式抗体-2；2＝T细胞双特异性形式抗体-1；3＝具有结构域交换的全长抗体；4＝包含靶向FAP的抗原结合结构域和4-1BB配体(CD137L)的三聚体的分子；5＝包含突变白细胞介素-2多肽和结合PD-1的抗体的免疫缀合物(库)，6＝能够特异性结合CD40和FAP的双特异性抗原结合分子；7＝包含突变白细胞介素-2多肽和结合PD-1的抗体的免疫缀合物(克隆)。
图7补料分批活力数据[％]。六种不同复杂抗体形式的未修饰池/克隆与SIRT-1敲除池/克隆(含有未修饰/杂合/纯合SIRT-1敲除基因座的混合物)的测序结果的比较。
细胞表达
1＝T细胞双特异性形式抗体-2；2＝T细胞双特异性形式抗体-1；3＝具有结构域交换的全长抗体；4＝包含靶向FAP的抗原结合结构域和4-1BB配体(CD137L)的三聚体的分子；5＝包含突变白细胞介素-2多肽和结合PD-1的抗体的免疫缀合物(库)，6＝能够特异性结合CD40和FAP的双特异性抗原结合分子；7＝包含突变白细胞介素-2多肽和结合PD-1的抗体的免疫缀合物(克隆)。
图8毛细管免疫印迹证实,RNP核转染后7天的蛋白质水平被消除。1＝宿主细胞系用5pmol d的Cas9蛋白和5pmol靶向SIRT-1基因组基因座的3gRNA进行核转染；2＝宿主细胞系用5pmol的Cas9蛋白进行核转染。
实例实例1
一般技术
1)重组DNA技术
使用标准方法来操纵DNA，如在Sambrook等人，Molecular cloning:A LaboratoryManual，第二版，美国纽约州冷泉港实验室出版社(1989)。根据制造商的说明来使用分子生物学试剂。
2)DNA序列测定
DNA测序在SequiServe GmbH(Vaterstetten,Germany)进行
3)DNA和蛋白质序列分析及序列数据管理
EMBOSS(欧洲分子生物学开放软件套件)软件包和Invitrogen的Vector NTI 11.5版用于序列创建、映射、分析、注释和图示。
4)基因和寡核苷酸合成
在Geneart GmbH(Regensburg,德国)通过化学合成制备所需的基因片段。将合成的基因片段克隆到大肠杆菌质粒中进行繁殖/扩增。通过DNA测序来验证亚克隆基因片段的DNA序列。可替代地，通过对化学合成的寡核苷酸进行退火或通过PCR来组装短的合成DNA片段。各个寡核苷酸由metabion GmbH(Planegg-Martinsried，德国)制备。
5)试剂
如果没有另外说明，所有商业化学品、抗体和试剂盒均按照制造商的方案使用。
6)TI宿主细胞系的培养
TI CHO宿主细胞在37℃下在湿度为85％和5％CO2的加湿培养箱中培养。它们在含有300μg/ml潮霉素B和4μg/ml第二选择标志物的专有DMEM/F12基础培养基中培养。每3或4天以0.3x10E6个细胞/ml的浓度对细胞进行分盘，总体积为30ml。对于培养，使用了125ml无挡板锥形摇瓶。细胞以150rpm的速度振荡，振荡幅度为5cm。细胞计数用Cedex HiRes细胞计数器(Roche)测定。将细胞保持在培养中直到它们达到60天龄。
7)克隆
常规
使用R位点进行克隆取决于紧接着目的基因(GOI)的DNA序列，该序列等于位于以下片段中的序列。类似地，通过相同序列的重叠和随后由DNA连接酶密封组装的DNA中的切口，片段的组装是可能的。因此，有必要克隆单个基因，特别是含有正确R位点的初步的载体。在成功克隆这些初步的载体后，通过直接在紧接着R位点处进行切割的酶，通过限制性消化，将位于R位点侧翼的目的基因切掉。最后一步是一步组装所有DNA片段。更详细地说，5’核酸外切酶去除重叠区域(R位点)的5’端。之后，可以进行R位点的退火，DNA聚合酶延伸3'端以填补序列中的空位。最后，DNA连接酶密封核苷酸之间的缺口。添加含有不同酶(如外切核酸酶、DNA聚合酶和连接酶)的组装主混合物，随后在50℃下孵育反应混合物，导致将单个片段组装成一个质粒。之后，用质粒转化感受态大肠杆菌细胞。
对于一些载体，使用了通过限制性内切酶的克隆策略。通过选择合适的限制性内切酶，可以切下希望的目标基因，然后通过连接将其插入不同的载体中。因此，优选地使用在多克隆位点(MCS)进行切割的酶，并且以巧妙的方式选择，以便可以在正确的阵列中进行片段的连接。如果载体和片段之前用相同的限制性内切酶进行切割，则片段和载体的粘性末端会完美地结合在一起，随后可以通过DNA连接酶进行连接。连接后，用新生成的质粒转化感受态大肠杆菌细胞。
通过限制性消化进行克隆
为了用限制性内切酶消化质粒，将以下组分在冰上移液在一起：
表：限制性消化反应混合物
如果在一次消化中使用更多种酶，则使用1μl的每种酶，并且通过添加更多或更少的PCR级水来调整体积。选择所有酶的前提是它们有资格与来自new England Biolabs的CutSmart缓冲液一起使用(100％活性)并且具有相同的孵育温度(均为37℃)。
使用热混合器或热循环仪进行孵育，允许在恒定温度(37℃)下孵育样品。在孵育期间，不搅拌样品。孵育时间设定为60min。然后将样品直接与上样染料混合并且上样到琼脂糖电泳凝胶上或在4℃/冰上储存以备进一步使用。
制备1％琼脂糖凝胶用于凝胶电泳。为此，将1.5g的多用途琼脂糖称重到125锥形摇瓶中，并且填充150ml TAE缓冲液。在微波炉中加热混合物直至琼脂糖完全溶解。将0.5μg/ml溴化乙锭加入琼脂糖溶液中。此后将凝胶浇铸在模具中。琼脂糖凝固后，将模具放入电泳室，并且填充TAE缓冲液。之后将样品上样。在第一个槽中(从左侧开始)，上样了适当的DNA分子量标志物，然后是样品。凝胶在<130V下运行约60分钟。电泳后，将凝胶从腔室中取出并且在紫外成像仪中进行分析。
靶标条带被切割并且转移到1.5ml Eppendorf管中。对于凝胶的纯化，根据制造商的说明使用来自Qiagen的QIAquick凝胶提取试剂盒。将DNA片段储存在-20℃以备进一步使用。
用于连接的片段以1:2、1:3或1:5的载体与插入物的摩尔比一起移液，这取决于插入物和载体片段的长度以及它们彼此之间的相关性。如果应该插入到载体中的片段很短，则使用1:5的比率。如果插入物更长，则与载体相关地使用更少量的插入物。每次连接使用50ng的载体量，并且使用NEBio计算器来计算特定量的插入物。对于连接，使用来自NEB的T4DNA连接试剂盒。下表描绘了连接混合物的一个实例：
表：连接反应混合物
从混合DNA和水开始，加入缓冲液，并且最后加入酶，将所有组分在冰上移液在一起。通过上下吹打轻轻混合反应液，短暂微量离心，然后在室温下孵育10分钟。孵育后，将T4连接酶在65℃下加热灭活10分钟。样品在冰上冷却。在最后一步中，用2μl的连接的质粒转化10-β感受态大肠杆菌细胞(参见下文)。
通过R位点组装进行克隆
为了组装，将所有每个末端处具有R位点的DNA片段在冰上移液在一起。当组装超过4个片段时，按照制造商的建议，使用所有片段的等摩尔比(0.05ng)。反应混合物的一半由NEBuilder HiFi DNA组装主混合物体现。总反应体积是40μl，并且通过填充PCR清洁水达到此体积。在下表中描绘了示例性移液方案。
表：组装反应混合物
反应混合物建立后，将管在热循环仪中在恒定的50℃下孵育60分钟。成功组装后，用2μl的组装的质粒DNA转化10-β感受态大肠杆菌细菌(参见下文)。
转化10-β感受态大肠杆菌细胞
为了转化，将10-β感受态大肠杆菌细胞在冰上解冻。之后，将2μl的质粒DNA直接移入细胞悬浮液中。轻弹管并且置于冰上30分钟。此后，将细胞放入42℃温暖的热块中并且热激恰好30秒。紧接着，将细胞在冰上冷却2分钟。将950μl的NEB 10-β生长培养基加入细胞悬浮液中。将细胞在37℃下振荡孵育一小时。然后，将50-100μl移液到预热(37℃)LB-Amp琼脂平板上并且用一次性涂布器涂抹。将平板在37℃下孵育过夜。只有成功掺入质粒并且携带氨苄青霉素抗性基因的细菌才能在该平板上生长。次日挑取单菌落并且在LB-Amp培养基中培养用于随后的质粒制备。
细菌培养
大肠杆菌的培养在LB培养基(Luria Bertani的简称)中进行，该培养基中加入1ml/L 100mg/ml氨苄青霉素，导致氨苄青霉素浓度为0.1mg/ml。对于不同的质粒制备量，用单个细菌菌落接种以下量。
表：大肠杆菌培养体积
| 数量质粒制备 | 体积LB-Amp培养基[ml] | 孵育时间[h] |
| Mini-Prep 96孔(EpMotion) | 1.5 | 23 |
| Mini-Prep 15毫升管 | 3.6 | 23 |
| Maxi-Prep | 200 | 16 |
对于Mini-Prep，96孔2毫升深孔板每孔填充1.5ml LB-Amp培养基。挑取菌落并且将牙签放入培养基中。挑取所有菌落后，用粘性空气多孔膜将平板封闭。将平板在200rpm振荡速度下于37℃培养箱中孵育23小时。
对于Mini-Prep，在15ml管(带通风盖)中装入3.6ml LB-Amp培养基并且同样接种细菌菌落。在孵育过程中，牙签没有被移除，而是留在管中。与96孔板一样，管在37℃、200rpm下孵育23小时。
对于Maxi-Prep，将200ml LB-Amp培养基装入高压灭菌的1L Erlenmeyer玻璃烧瓶中，并且接种1ml的大约5小时后的细菌日间培养物。锥形瓶用纸塞封闭并在37℃、200rpm下孵育16小时。
质粒制备
对于Mini-Prep，将50μl的细菌悬浮液转移到1ml深孔板中。之后，将细菌细胞在平板中以3000rpm、4℃下离心5min。去除上清液，将具有细菌沉淀的平板置于EpMotion中。在大约90分钟之后。运行结束，并且可以从EpMotion中取出洗脱的质粒DNA以供进一步使用。
对于Mini-Prep，从培养箱中取出15ml管，并且将3.6ml细菌培养物分成两个2mlEppendorf管。在室温下，在台式微量离心机中以6,800xg将管离心3分钟。之后，根据制造商的说明使用Qiagen QIAprep Spin Miniprep试剂盒进行Mini-Prep。用Nanodrop测量质粒DNA浓度。
Maxi-Prep是根据制造商的说明使用Macherey-NagelXtra Maxi EF试剂盒进行的。用Nanodrop测量DNA浓度。
乙醇沉淀
将一定体积的DNA溶液与2.5倍体积的100％乙醇混合。混合物在-20℃下孵育10min。然后将DNA在14,000rpm、4℃下离心30min。小心去除上清液，并且用70％乙醇洗涤沉淀。再次将管在14,000rpm、4℃下离心5min。通过移液小心去除上清液并且干燥沉淀。待乙醇蒸发后，加入适量的无内毒素水。给予DNA时间，在4℃下过夜，直至重新溶解在水中。取一小部分并且用Nanodrop装置测量DNA浓度。
实例2
质粒生成
表达盒组成
为了表达抗体链，使用了包含以下功能元件的转录单元：
-来自人巨细胞病毒的即刻早期增强子和启动子，包括内含子A，
-人重链免疫球蛋白5'-非翻译区(5'UTR)，
-鼠免疫球蛋白重链信号序列，
-编码相应抗体链的核酸，
-牛生长激素多腺苷酸化序列(BGH pA)，以及
-任选地，人胃泌素终止子(hGT)。
除了包括所希望的待表达基因的表达单元/盒外，基础/标准哺乳动物表达质粒还包含
-来自载体pUC18的复制起点，其允许在大肠杆菌中进行该质粒的复制，以及
-β-内酰胺酶基因，其赋予大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性。
前后载体克隆
为构建双质粒抗体构建体，将抗体HC和LC片段克隆到包含L3和LoxFAS序列的前载体骨架以及包含LoxFAS和2L序列与pac选择标志物的后载体中。将Cre重组酶质粒pOG231(Wong,E.T.等人，Nuc.Acids Res.33(2005)e147；O'Gorman,S.,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(1997)14602-14607)用于所有RMCE进程。
通过基因合成(Geneart，Life Technologies Inc.)产生编码各个抗体链的cDNA。在37℃下用HindIII-HF和EcoRI-HF(NEB)将基因合成载体和骨架载体消化1小时，并且通过琼脂糖凝胶电泳分离。从琼脂糖凝胶切下插入物和骨架的DNA片段，并且通过QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)提取。经纯化的插入物片段和骨架片段经由快速连接试剂盒(Roche)，按照制造商的方案以3:1的插入物/骨架比连接。然后经由在42℃下热激30秒将连接方法转化到感受态大肠杆菌DH5α中，并且在37℃下温育1小时，之后将它们铺板在含有氨苄青霉素的琼脂平板上以供选择。在37℃下将平板温育过夜。
第二天，挑取克隆并且在37℃下振荡温育过夜，以进行最小量制备或最大量制备，这两种制备分别是用5075(Eppendorf)或QIAprep Spin Mini-Prep试剂盒(Qiagen)/NucleoBond Xtra Maxi EF试剂盒(Macherey&Nagel)来进行的。对所有构建体进行测序，以确保不存在任何不需要的突变(SequiServe GmbH)。
在第二个克隆步骤中，用KpnI-HF/SalI-HF和SalI-HF/MfeI-HF消化先前克隆的载体，条件与第一次克隆相同。用KpnI-HF和MfeI-HF消化TI骨架载体。如上所述进行分离和提取。按照制造方案，使用T4 DNA连接酶(NEB)以1:1:1的插入物/插入物/骨架比在4℃过夜，来将经纯化的插入物和骨架连接，并且在65℃下灭活10min。如上所述进行以下克隆步骤。
克隆的质粒用于TI转染和池生成。
实例3
培养、转染、选择和单细胞克隆
TI宿主细胞在标准加湿条件(95％rH、37℃和5％CO2)下以150rpm的恒定搅拌速率下，在专有DMEM/F12基础培养基中，在一次性125ml通风摇瓶中繁殖。每3-4天将细胞接种在化学成分确定的培养基中，该培养基含有有效浓度的选择标志物1和选择标志物2，浓度为3x10E5个细胞/ml。用Cedex HiRes细胞计数器(F.Hoffmann-La Roche Ltd，Basel，瑞士)测量培养物的密度和活力。
为了稳定转染，将等摩尔量的前后载体混合。每5μg的混合物添加1μg Cre表达质粒，即将5μg Cre表达质粒或Cre mRNA添加到25μg的前后载体混合物中。
转染前两天将TI宿主细胞以4x10E5个细胞/ml的密度接种在新鲜培养基中。根据制造商的方案，使用核转染试剂盒V(Lonza，瑞士)通过核转染装置进行转染。3x10E7细胞用总共30μg核酸转染，即用30μg质粒(5μg Cre质粒和25μg前后载体混合物)或用5μg CremRNA和25μg前后载体混合物转染。转染后，将细胞接种在不含选择剂的30ml培养基中。
接种后第5天，将细胞离心并转移到80mL化学成分确定的培养基中，该培养基含有嘌呤霉素(选择剂1)和1-(2'-脱氧-2'-氟-1-β-D-阿拉伯呋喃基-5-碘)尿嘧啶(FIAU；选择剂2)，有效浓度为6x10E5个细胞/ml，用于选择重组细胞。从这一天起，将细胞在37℃、150rpm、5％CO2和85％湿度下孵育，从这天开始，细胞不分盘。定期监测培养物的细胞密度和活力。当培养物的活力再次开始增加时，选择剂1和2的浓度减少到之前使用量的大约一半。更详细地说，为了促进细胞的回收，如果活力>40％并且活细胞密度(VCD)>0.5×10E6个细胞/mL，则降低选择压力。因此，将4×10E5个细胞/ml离心并且重悬在40ml选择性培养基II(化学成分确定的培养基，1/2选择标志物1和2)中。将细胞在与之前相同的条件下温育，并且也不分裂。
开始选择后十天，通过流式细胞术,测量细胞内GFP和与细胞表面结合的细胞外异源多肽的表达，检查Cre介导的盒式交换是否成功。将针对人抗体轻链和重链的APC抗体(别藻蓝蛋白标记的F(ab’)2片段山羊抗人IgG)用于FACS染色。使用BD FACS Canto II流式细胞仪(BD，Heidelberg，德国)进行流式细胞术。测量了每个样品的一万个事件。活细胞在前向散射(FSC)对侧向散射(SSC)的图中被门控。活细胞门控由未转染的TI宿主细胞定义，并且通过采用FlowJo 7.6.5EN软件(TreeStar，Olten，瑞士)应用于所有样品。在FITC通道中量化GFP的荧光(488nm激发，530nm检测)。在APC通道中测量异源多肽(645nm激发，660nm检测)。将亲本CHO细胞，即用于产生TI宿主细胞的那些细胞，用作关于GFP和[[X]]表达的阴性对照。选择开始后十四天，活力超过90％，并且认为选择完成。
选择后，通过有限稀释对稳定转染的细胞库进行单细胞克隆。为此，将细胞用CellTrackerGreenTM(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)染色，并且以0.6个细胞/孔置于384孔板中。对于单细胞克隆和所有进一步的培养步骤，培养基中省略了选择剂2。仅含有一个细胞的孔通过明视野和基于荧光的平板成像进行识别。仅进一步考虑含有一个细胞的孔。将克隆铺板后大约三周，从铺满的孔中挑取克隆并且在96孔板中进一步培养。
在96孔板中四天后，用抗人IgG夹心ELISA测量培养基中的抗体效价。简而言之，使用与MaxiSorp微量滴定板(NuncTM，Sigma-Aldrich)结合的抗人Fc抗体从细胞培养液中捕获抗体，并且使用与不同于捕获抗体的表位结合的抗人Fc抗体-POD缀合物进行检测。采用BM化学发光ELISA底物(POD)(Sigma-Aldrich)，通过化学发光对二抗进行定量。
实例4
FACS筛选
进行FACS分析以检查转染效率和转染的RMCE效率。将转染方法的4×10E5个细胞离心(1200rpm，4min)，并且用1mL PBS洗涤两次。在用PBS进行的洗涤步骤之后，将沉淀物再悬浮于400μL PBS中并且转移到FACS管(带细胞滤网帽的圆底试管；Corning)中。使用FACS Canto II进行测量，并且通过软件FlowJo分析数据。
实例5
补料分批培养
在摇瓶或Ambr15容器(Sartorius Stedim)中，使用专有的化学成分确定的培养基进行补料分批生产培养。第0天，以1x10E6个细胞/ml接种细胞；其中第3天改变温度。在第3、7和10天，向培养物中添加专有的供料基质。在第0、3、7、10和14天，使用CedexHiRes仪器(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)测量培养物中的活细胞计数(VCC)和细胞活力百分比。使用Cobas分析仪(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)在第3、5、7、10、12和14天测量葡萄糖、乳酸和产物效价浓度。在分批补料开始后14天，通过离心(10min，1000rpm，以及10min，4000rpm)收获上清液，并且通过过滤(0.22μm)使其澄清。第14天的效价使用具有UV检测的蛋白A亲和色谱确定。产物质量由Caliper的LabChip(Caliper LifeSciences)确定。
实例6
CHO细胞中基于RNP的CRISPR-Cas9基因敲除
材料/资源：
·Geneious 11.1.5用于指导和引物设计
·CHO TI宿主细胞系；培养状态：第30-60天
·TrueCutTMCas9蛋白v2(InvitrogenTM)
·TrueGuide合成gRNA(针对靶基因定制设计，3nm未修饰gRNA，Thermo Fisher)
·TrueGuideTMsgRNA阴性对照，非靶向1(Thermo Fisher)
·培养基(200μg/ml潮霉素B，4μg/ml选择剂2)
·DPBS-Dulbecco磷酸盐缓冲盐水，不含Ca和Mg(Thermo Fisher)
·微板24深孔板(安捷伦科技，Porvoir science)带盖(自制)
·用于装载OC-100盒的细长RNase、DNase、无热原过滤器吸头。(Biozyme)
·Hera安全罩(Thermo Fisher)
·Cedex HiRes分析仪(Innovatis)
·Liconic培养箱Storex IC
·HyClone电穿孔缓冲液
·MaxCyte OC-100盒
·MaxCyte STX电穿孔系统
CRISPR-Cas9 RNP递送
通过在10μL PBS中混合5μg Cas9和1μg gRNA混合物(每种gRNA的比率相等)预组装RNP，并且在RT下孵育20分钟。将浓度在2-4x10E6个细胞/mL之间的细胞离心(3分钟，300g)并且用500μL PBS洗涤。洗涤步骤后，细胞再次离心(3分钟，300g)并且重悬在90μLHyclone电穿孔缓冲液中。将预孵育的RNP混合物加入细胞中并且孵育5分钟。然后将细胞/RNP溶液转移到OC-100比色皿中，并且使用MaxCyte电穿孔系统，通过程序“CHO2”进行电穿孔。电穿孔后立即将细胞悬浮液转移至24孔中，并且在37℃下孵育30分钟。将新鲜和预热的培养基添加至最终细胞浓度为1x10E6个，并且在37℃和350rpm下孵育以进行细胞扩增。对于基因组DNA制备(第6天或第8天)，将QuickExtract试剂盒(Lucigen)添加到细胞中并用作PCR模板。使用标准Q5热启动聚合酶方案(NEB)和引物oSA060和oSA061(SEQ ID NO:15和16)对特定的SIRT-1扩增子进行PCR扩增。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Quiagen)纯化扩增子，并且由EurofinsGenomics GmbH通过Sanger测序进行分析。
补料分批培养
在摇瓶或Ambr15容器(Sartorius Stedim)中，使用专有的化学成分确定的培养基进行补料分批生产培养。以1x10E6个细胞/ml接种细胞。在第3、7和10天，向培养物中添加专有的供料基质。在第0、3、7、10和14天，使用Cedex HiRes(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)测量培养物中的活细胞计数(VCC)和细胞活力百分比。使用Cobas分析仪(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)在第3、5、7、10、12和14天测量葡萄糖、乳酸和产物效价浓度。在分批补料开始后14天，通过离心(10min，1000rpm，以及10min，4000rpm)收获上清液，并且通过过滤(0.22μm)使其澄清。第14天的效价使用具有UV检测的蛋白A亲和色谱确定。产物质量由Caliper的LabChip(Caliper LifeSciences)确定。
本发明的一些实施方案
1.一种与在相同条件下培养的具有相同基因型但具有内源性SIRT-1基因表达的哺乳动物细胞相比，通过减少SIRT-1表达来增加重组哺乳动物细胞的异源多肽效价和/或减少重组哺乳动物细胞的乳酸产生的方法，所述重组哺乳动物细胞包含编码异源多肽的外源性核酸。
2.一种用于产生异源多肽的方法，所述方法包括以下步骤
a)培养哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包含编码所述异源多肽的脱氧核糖核酸，以及
b)从所述细胞或培养基中回收所述异源多肽，
其中一种或多种内源性SIRT-1基因的表达已被降低。
3.一种用于产生具有提高的重组生产率和/或减少的乳酸产生的重组哺乳动物细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)在哺乳动物细胞中施加核酸酶辅助的和/或靶向所述内源性SIRT-1基因的核酸以降低所述内源性SIRT-1基因的活性，以及
b)选择哺乳动物细胞，其中所述内源性SIRT-1基因的活性已被降低，
从而与在相同条件下培养的具有相同基因型但具有内源性SIRT-1基因表达的哺乳动物细胞相比，产生具有提高的重组生产率和/或减少的乳酸产生的重组哺乳动物细胞。
4.根据实施方案1至3中任一项所述的方法，其中所述SIRT-1基因敲除是杂合敲除或纯合敲除。
5.根据实施方案1至4中任一项所述的方法，其中与SIRT-1感受态亲本哺乳动物细胞相比，SIRT-1修饰的细胞的生产率提高至少10％。
6.根据实施方案1至5中任一项所述的方法，其中SIRT-1基因表达的降低由核酸酶辅助的基因靶向系统介导。
7.根据实施方案6所述的方法，其中所述核酸酶辅助的基因靶向系统选自由CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、锌指核酸酶和TALEN组成的组。
8.根据实施方案1至5中任一项所述的方法，其中SIRT-1基因表达的降低由RNA沉默介导。
9.根据实施方案8所述的方法，其中RNA沉默选自由siRNA基因靶向和敲低、shRNA基因靶向和敲低、以及miRNA基因靶向和敲低组成的组。
10.根据实施方案1至9中任一项所述的方法，其中所述异源多肽为抗体。
11.根据实施方案1至10中任一项所述的方法，其中在引入所述编码异源多肽的外源性核酸之前或在引入所述编码异源多肽的外源性核酸之后进行SIRT-1敲除。
12.根据实施方案1至11中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是靶向整合宿主细胞。
13.根据实施方案1至12中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是CHO细胞。
Claims (12)
1.一种哺乳动物细胞，其中内源SIRT-1基因的活性或功能或表达已被降低或消除或减弱或完全敲除。
2.一种哺乳动物细胞，其中内源性SIRT-1基因的表达已被降低，并且其中与在相同条件下培养的具有相同基因型但具有内源性SIRT-1基因表达的细胞相比，所述哺乳动物细胞具有以下的至少一项：在培养期间增加的异源多肽生产率和/或减少的乳酸产量、和/或在培养期间和/或延长的培养时间内提升的高活力水平。
3.权利要求1或2任一项的哺乳动物细胞，其中所述SIRT-1基因敲除是杂合敲除或纯合敲除。
4.权利要求1-3任一项的哺乳动物细胞，其中与表达SIRT-1的亲本哺乳动物细胞相比，SIRT-1敲除细胞系的生产率增加了至少10％。
5.权利要求1-4任一项的哺乳动物细胞，其中所述减少或消除或减弱或敲除是由核酸酶辅助的基因靶向系统介导的。
6.权利要求5的哺乳动物细胞，其中核酸酶辅助的基因靶向系统选自CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、锌指核酸酶和TALEN。
7.权利要求1-4任一项的哺乳动物细胞，其中SIRT-1基因表达的降低由RNA沉默介导。
8.权利要求7的哺乳动物细胞，其中RNA沉默选自由siRNA基因靶向和敲低、shRNA基因靶向和敲低、以及miRNA基因靶向和敲低组成的组。
9.权利要求2-8任一项的哺乳动物细胞，其中在引入编码异源多肽的外源核酸之前或在引入编码异源多肽的外源核酸之后进行所述SIRT-1敲除。
10.权利要求2-9任一项的哺乳动物细胞，其中多肽是抗体。
11.权利要求10的哺乳动物细胞，其中抗体是多特异性抗体。
12.权利要求10-11任一项的哺乳动物细胞，其中所述多特异性抗体选自由以下项组成的组
i)具有结构域交换的全长抗体，包含第一Fab片段和第二Fab片段，
其中在第一Fab片段中
a)第一Fab片段的轻链包含VL和CH1结构域，并且第一Fab片段的重链包含VH和CL结构域；
b)第一Fab片段的轻链包含VH和CL结构域，并且第一Fab片段的重链包含VL和CH1结构域；或
c)第一Fab片段的轻链包含VH和CH1结构域，并且第一Fab片段的重链包含VL和CL结构域；
并且
其中第二Fab片段包含：包含VL和CL结构域的轻链以及包含VH和CH1结构域的重链；
ii)具有结构域交换和额外的重链C末端结合位点的全长抗体，包括
-一个全长抗体，其包含各有全长抗体轻链和全长抗体重链的两个对，其中由每对全长重链和全长轻链形成的结合位点特异性结合至第一抗原；
并且
-一个额外的Fab片段，其中所述额外的Fab片段与所述全长抗体的一条重链的C末端融合，其中所述额外的Fab片段的结合位点与第二抗原特异性结合；
其中与第二抗原特异性结合的该额外的Fab片段i)包含结构域交叉，使得a)轻链可变结构域(VL)和重链可变结构域(VH)被彼此替换，或b)轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域(CH1)被彼此替换，或ii)是单链Fab片段；
iii)单臂单链抗体，其包含第一结合位点和第二结合位点，所述第一结合位点与第一表位或抗原特异性结合，所述第二结合位点与第二表位或抗原特异性结合，所述单臂单链抗体包含
-轻链，其包含可变轻链结构域和轻链κ或λ恒定结构域；
-组合轻链/重链，其包含可变轻链结构域、轻链恒定结构域、肽连接基、可变重链结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域、和具有杵突变的CH3；
-重链，其包含可变重链结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域、和具有臼突变的CH3结构域；
iv)双臂单链抗体，其包含第一结合位点和第二结合位点，所述第一结合位点与第一表位或抗原特异性结合，所述第二结合位点与第二表位或抗原特异性结合，所述双臂单链抗体包含
-第一组合轻链/重链，其包含可变轻链结构域、轻链恒定结构域、肽连接基、可变重链结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域、和具有臼突变的CH3；
-第二组合轻链/重链，其包含可变轻链结构域、轻链恒定结构域、肽连接基、可变重链结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域、和具有杵突变的CH3结构域；
v)共同轻链双特异性抗体，其包含第一结合位点和第二结合位点，所述第一结合位点与第一表位或抗原特异性结合，所述第二结合位点与第二表位或抗原特异性结合，所述共同轻链双特异性抗体包含
-轻链，其包含可变轻链结构域和轻链恒定结构域；
-第一重链，其包含可变重链结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域、和具有臼突变的CH3结构域；
-第二重链，其包含可变重链结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域、和具有杵突变的CH3结构域；
vi)全长抗体，其具有：具有结构域交换的额外的重链N末端结合位点，包括
-第一Fab片段和第二Fab片段，其中第一Fab片段和第二Fab片段的每个结合位点与第一抗原特异性结合；
-第三Fab片段，其中第三Fab片段的结合位点与第二抗原特异性结合，并且其中第三Fab片段包含结构域交叉，使得可变轻链结构域(VL)和可变重链结构域(VH)被彼此替换；以及
-包含第一Fc区多肽和第二Fc区多肽的Fc区；
其中第一Fab片段和第二Fab片段各自包含重链片段和全长轻链，
其中第一Fab片段的重链片段的C-末端与第一Fc区多肽的N-末端融合，
其中第二Fab片段的重链片段的C末端与第三Fab片段的可变轻链结构域的N末端融合，并且第三Fab片段的CH1结构域的C末端与第二Fc区多肽的N末端融合；以及
vii)包含全长抗体和非免疫球蛋白部分的免疫缀合物，其中所述全长抗体和所述非免疫球蛋白部分，任选地经由肽连接基，彼此缀合。
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