CN102049039A - p65在制备上调SIRT1表达的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及p65在制备上调SIRT1表达的药物中的用途，特别地，所述药物是提纯的蛋白质类型的药物，所述药物的剂型为适于蛋白质药物应用的剂型，特别地，所述药物是表达p65蛋白质的重组核酸构建体。本发明还涉及p65在制备治疗哺乳动物包括人的受益于SIRT1表达上升的疾病的药物中的用途，特别地，所述哺乳动物包括人的受益于SIRT1表达上升的疾病选自代谢综合征、肿瘤、神经退行性疾病、心血管疾病、炎症或线粒体相关疾病。

Description

p65在制备上调SIRT1表达的药物中的用途

技术领域

本发明涉及p65在制备上调哺乳动物包括人SIRT1表达的药物中的用途，本发明还涉及p65在制备治疗哺乳动物包括人的受益于SIRT1表达上升的疾病的药物中的用途。

背景技术

SIRT1的功能

Sir2(silence information regulator)基因家族是一种保守的从古细菌到哺乳动物都存在的NAD+依赖的组蛋白/非组蛋白去乙酰化酶。在酵母中，Sir2连同与它相互作用的几个蛋白质在基因沉默、基因组稳定性、细胞寿命以及代谢调节上起着不可缺少的作用。在哺乳动物中有7个Sir2同源基因，分别命名为SIRT1到SIRT7，其中SIRT1与Sir2的同源性最高(Frye，1999)，研究也最为深入。SIRT1定位于第10号染色体的q21.3，基因长度33kb，编码747个氨基酸残基的蛋白质，它在DNA损伤修复、细胞周期控制、抑制细胞凋亡、抵抗氧化逆境和延长细胞寿命方面起着重要作用。SIRT1的这些功能是通过调节一些重要的转录因子、转录辅因子及组蛋白实现的，包括p53(Luoet al.，2001；Vaziri et al.，2001)、Ku70(Brunet et al.，2004)、FOXOs(Brunet et al.，2004；Motta et al.，2004)(Daitoku et al.，2004)、NF-κB(Yeung etal.，2004)、Smad7(Kume et al.，2002)、AR(Fu et al.，2006)、E2F1(Wang et al.，2006)、Tat(Pagans et al.，2005)、PGC-1α(Rodgers et al.，2005)、NcoR(Guarente & Picard，2005)、p300(Fulco et al.，2003；Motta et al.，2004)、H1、H3、H4(Vaquero et al.，2004)，具体的生理意义以及作用的部位见表1。

表1.与SIRT1相互作用的因子

SIRT1与疾病

1.SIRT1和代谢综合征

目前发现SIRT1至少可通过以下几方面影响代谢：(1)胰岛组织：促进胰岛素分泌和胰腺细胞生存。胰腺细胞可应答血糖升高，增加胰岛素分泌。SIRT1可抑制线粒体解偶联蛋白(uncoupling protein-2，UCP-2)表达，增加ATP生成，导致ATP/ADP比值增加，从而关闭K通道，导致Ca内流，最终含有胰岛素的分泌小泡和质膜融合分泌出胰岛素。胰岛组织特异性的SIRT1转基因鼠能增加血糖刺激的胰岛素分泌，SIRT1敲除鼠及其原代胰腺细胞胰岛素的分泌均受到抑制(Bordone &Guarente，2005；Moynihan et al.，2005)。研究表明，在氧化应激条件下，胰腺细胞中FOXO(forkhead box class O)蛋白入核，激活转录因子NeuroD和MafA，以对抗氧化应激，促进胰腺细胞生存。而在这个过程中，SIRT1可与FOXO结合加强其抗氧化应激作用(Kitamura et al.，2005)。(2)白色脂肪组织：降低脂肪储存，促进脂肪动员。PPARγ是白色脂肪组织的关键转录因子，可刺激脂肪细胞的分化和脂肪的储存。而SIRT1可抑制PPARγ的表达从而抑制脂肪储存蛋白，促进脂肪动员(Guarente & Picard，2005)。(3)肝脏：促进糖异生。在肝脏中，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)是糖异生的一个限速酶。FOXO和PGC-1是PEPCK调控的关键因子。研究表明，SIRT1敲除鼠肝脏内PEPCK的RNA水平降低。这种作用可能是通过SIRT1去乙酰化FOXO实现的(Frescas et al.，2005)。另外SIRT1也可能通过去乙酰化PGC-1来调控PEPCK的表达(Rodgers et al.，2005)。Resveratrol是SIRT1特异性较强的激活剂，有较强的抗氧化和抗自由基作用，最近研究发现，Resveratrol可增加高脂饮食小鼠对于胰岛素的敏感性，降低脂肪酸合酶的表达(Baur & Sinclair，2006)。

2.SIRT1与基因稳定性和肿瘤的发生

在高等动物，SIRT1可以通过去乙酰化p53促进细胞生存，使其重新进入细胞周期(Cheng et al.，2003；Langley et al.，2002；Luo et al.，2001；Vaziri et al.，2001)。SIRT1可以去乙酰化Ku70，抑制线粒体凋亡促进因子Bax的释放，以维持细胞生存。同时研究表明，SIRT1可以去乙酰化FOXO，对抗多种应激引起的凋亡。SIRT1还同时与FOXO和p53形成复合物，对抗多种DNA损伤，维持基因稳定性(Nemoto et al.，2004)。虽然SIRT1可以维持基因稳定性，但也抑制了抑癌基因的活性，这使得SIRT1又可能具有潜在的致瘤特性，但最近研究发现在动物水平这种去乙酰化作用并没有导致明显的肿瘤易感性(Motta et al.，2004)。造成以上现象的原因可能是，在动物整体水平，SIRT1可通过内分泌调节，降低机体生长因子水平，提高机体细胞死亡阈值，对抗各种持续存在的凋亡信号，于是更有利于维护基因稳定，同时又不会导致肿瘤发生。

3.SIRT1和神经退行性疾病

神经退行性疾病是一组以原发性神经元变性为基础的慢性进行性神经系统疾病，该类疾病主要包括阿尔茨海默氏病(Alzheimer’S disease)、帕金森病(Parkinson’S disease)等。在高等动物中，SIRT1在胚胎期大脑中有很高的表达，表明其可能在神经发育中发挥重要作用(Sakamoto et al.，2004)。直接表明SIRT1有神经保护作用的证据来自于华勒(氏)变性小鼠的研究，该研究发现这种鼠可以对抗物理和化学因素损伤。该鼠体内的烟酰胺单核苷酸腺苷酰(基)转移酶(nicotinamidemononucleotideadenyltransferase-1，Nmnatl)活性增高，促使NAD生成增加，从而升高SIRT1活性，最终保护神经细胞免受损伤。SIRT1激活剂resveratrol可避免神经功能失常，产生类似的保护作用。反之，如果干扰SIRT1或者使用SIRT1抑制剂sirtinol则可以阻止这种保护效应(Araki et al.，2004)。

4.SIRT1和心血管疾病

限制生物体摄取热量(calory restriction，CR)，是指在保证机体基本营养需求前提下，降低机体约30％～40％的能量摄入。CR可使啮齿类动物的寿命增加30％-50％(Guarente，2000)。而在人类发现，长期CR可显著降低患有动脉粥样硬化人群的发病并可通过降低血糖、血压和胆固醇来降低多种衰老相关疾病如心血管疾病的发病率(Chen & Guarente，2007；Fontana et al.，2004；Wolf，2006)。近年来对酵母、线虫和果蝇等的研究表明热量限制通过上调内源Sir2的表达发挥促长寿等作用(Kaeberlein et al.，1999；Rogina & Helfand，2004；Tissenbaum & Guarente，2001)。随后在大鼠模型中也证实了SIRT1介导了CR的促长寿作用(Brunet et al.，2004)。研究表明，在长期热量限制的小鼠主动脉SIRT1表达增高，并且SIRT1转基因模型鼠证实，SIRT1可以显著降低动脉粥样硬化的发病率(Zhang et al.，2008)。最近的实验进一步发现SIRT1能够抑制血管平滑肌增殖和迁移，从而缓解血管重塑相关疾病的症状(未发表)。先前的研究还发现SIRT1过表达能够缓解心肌肥厚和心衰，这主要和其抗凋亡及抗氧化应激相关(Alcendor et al.，2007)。

SIRT1的调节及以其为靶点的药物开发

SIRT1的各种保护性作用大多是通过对其下游的基因调节来实现的。考虑到SIRT1在多种代谢性疾病和衰老相关疾病中的保护作用，以其为靶点的药物研发已经成为科研领域和新药创制领域的焦点。研究证实，Resveratrol(白藜芦醇)是富含于煮花生、红葡萄皮及红葡萄籽中的一种多酚类物质。作为SIRT1的有效激活剂，白藜芦醇与SIRT1有类似的功效，例如在大小鼠动物模型中已经证实白藜芦醇具有抗癌(Baur & Sinclair，2006)、抗炎、降血糖(Palsamy & Subramanian，2009)和心血管保护功能(Alcendor et al.，2007)；在临床实验中，大剂量白藜芦醇能够显著降低血糖(Elliott & Jirousek，2008)。SRT-1720是由Sirtris药物制剂公司于2007年研发的SIRT1的强效激活剂，其活性比白藜芦醇高1000多倍，在美国己进入临床二期，并且预期在II型糖尿病，神经退行性病，心血管疾病，炎症及线粒体相关疾病中发挥治疗作用。对于SIRT1的激活剂的寻找仍在如火如荼的进行，其中的一种策略是找到SIRT1的内源性激活因子，将其作一定修饰后作为药物开发的靶标，或以其为靶标寻找功能类似物作为药物筛选的对象。对于SIRT1的内源性激活因子近年来也陆续有报道，如E2F1可结合在SIRT1的启动子区对其表达进行正向调节；而HnR通过加强mRNA的稳定性而参与对SIRT1的调节；FOXO3a通过影响p53在SIRT1的启动子区的结合上调SIRT1的表达(Abdelmohsen et al.，2007；Nemoto et al.，2004；Wang etal.，2006)。

p65的特点及功能

p65是转录因子NF-κB的转录激活亚基。NF-κB是一类具有转录调节作用的核蛋白因子，广泛存在于多种组织细胞中，激活后参与细胞因子、趋化因子、粘附分子、生长因子、免疫受体、氧化应激相关酶、转录因子、急性时相蛋白等基因的的转录调控表达，在免疫、炎症、氧化应激、细胞增殖、细胞凋亡等生理病理过程中发挥作用(Xiao，2004)。静息状态下，NF-κB以同源或异源二聚体的形式与IκB家族蛋白结合并存在于细胞质内，其中以p50/p65二聚体最普遍，p65含有转录激活域和DNA结合域，而p50仅有DNA结合域。当细胞受细胞外信号刺激时，p50/p65则进行核易位，与基因上的κB位点发生特异性结合，从而发挥调节细胞功能的作用(Li et al.，1999)。

鉴于SIRT1在体内具有上述多种积极的作用，因此其在体内表达的上调将对多种疾病的治疗具有积极而明确的作用。同时，如上所述，p65作为转录因子NF-κB的转录激活亚基，其参与了多种基因的转录表达的调控。因此，如果能证实p65也能上调SIRT1的表达，则将会对多种疾病的治疗开辟新的治疗途径。

发明内容

因此，本发明的技术目的是探究p65在调控SIRT1表达中的作用并继而探究p65在其治疗效果可受益于SIRT1表达上调的疾病中的用途。

因此，本发明的第一方面涉及p65在制备上调哺乳动物包括人SIRT1表达的药物中的用途，优选地，所述药物是提纯的蛋白质类型的药物，所述药物的剂型为适于蛋白质药物应用的剂型。优选地，所述药物是表达p65蛋白质的重组核酸构建体，且其中所述重组核酸构建体的表达载体是适用于基因治疗的病毒表达载体或非病毒表达载体。更优选地，所述病毒载体选自重组逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体或牛痘苗病毒载体，所述非病毒载体选自噬菌体载体或复制子载体。

本发明的第二方面涉及p65在制备治疗哺乳动物包括人的受益于SIRT1表达上升的疾病的药物中的用途。优选地，所述哺乳动物包括人的受益于SIRT1表达上升的疾病选自代谢综合征、肿瘤、神经退行性疾病、心血管疾病、炎症或线粒体相关疾病，其中所述代谢综合征选自I型或II型糖尿病、肥胖症或低血糖症，所述肿瘤选自乳腺癌、肝癌或肺癌，所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默病或帕金森症，所述心血管疾病选自动脉粥样硬化、心肌肥厚或心衰。优选地，所述药物是提纯的蛋白质类型的药物，所述药物的剂型为适于蛋白质药物应用的剂型。优选地，所述药物是表达p65蛋白质的重组核酸构建体，且其中所述重组核酸构建体的表达载体是适用于基因治疗的病毒表达载体或非病毒表达载体。更优选地，所述病毒载体选自重组逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体或牛痘苗病毒载体，所述非病毒载体选自噬菌体载体或复制子载体。

换言之，本发明人在研究中发现，NF-κB的亚基RelA/p65可以显著地上调血管平滑肌细胞中SIRT1的mRNA及蛋白水平的表达及启动子活性，而NF-κB的另一个亚基p50对SIRT1启动子活性没有显著影响。A20通过抑制NF-κB的核转位来抑制NF-κB活性，发现共转A20和NF-κBp65可以显著降低由NF-κBp65导致的SIRT1启动子活性的增高。将内源性p65干扰掉之后，p65对SIRT1的蛋白表达及启动子活性的上调作用消失，进一步证明了p65在诱导SIRT1表达中起关键作用。p50只有DNA结合能力，没有转录激活域，p65不仅有转录激活作用，而且有DNA结合能力。通过生物信息学软件(rVistar)的预测分析，发现在SIRT1的启动子区有p65结合的同源序列，利用染色质免疫沉淀(ChIP)实验，观察到在SIRT1的启动子区的确有p65的募集，这从另一个角度阐明NF-κBp65诱导SIRT1表达中发挥作用。有趣的是，在研究中还发现p50和p65两个亚基共同过表达后，SIRT1的启动子的活性和蛋白表达水平也会升高，但其程度低于单独过表达p65对SIRT1的诱导，据信这种现象可能和p50与p65竞争DNA结合位点，继而抑制p65的转录活性有关(Brasier，2006)。p65诱导SIRT1表达的结果提示p65或其类似物也许会作为可能的干预靶点在临床疾病的预防和治疗及新药的开发中发挥重要的作用。

附图说明

图1：(A)TNF-α诱导p65细胞核定位，TNF-α(30ng/ml)处理A7r5细胞30min后，免疫荧光检测p65在细胞内的定位(绿色荧光)，蓝色荧光表示核染色；(B)TNF-α诱导NF-κB转录因子活性。pGL-NF-κB-luc转染A7r5细胞24小时后TNF-α(30ng/ml，50ng/ml)处理A7r5细胞2小时，荧光素酶报告基因检测NF-κB报告基因活性，*表示p≤0.05；(C)p65增加SIRT1的表达，293细胞转染pCDNA3.1-p65 24小时后，以pCDNA3.1作对照，Western blot检测SIRT1，p65蛋白水平的表达。

图2：p65诱导SIRT1表达增加。(A)A7r5平滑肌细胞系中共转pCDNA3.1-p65和pCDNA3.1-p50 24小时后，以pCDNA3.1作对照，Western blot检测SIRT1，p65，p50蛋白水平的表达；(B)A7r5平滑肌细胞系中共转pCDNA3.1-p65和pCDNA3.1-p50 24小时后，以pCDNA3.1作对照，Western blot检测SIRT1mRNA水平的表达；(C)单独转染pCDNA3.1-p50 24小时后，以pCDNA3.1作对照，Western blot检测SIRT1，p50蛋白水平的表达；(D)单独转染pCDNA3.1-p65 24小时后，以pCDNA3.1作对照，Western blot检测SIRT1，p65蛋白水平的表达；(E)转染p65 RNAi质粒24小时后，以pSIREN-RetroQ-U6为对照，Western blot检测SIRT1，p65蛋白水平的表达。

图3：p65促进SIRT1启动子活性。(A)A7r5细胞分别转染或共转染过表达质粒pCDNA3.1-p65和pCDNA3.1-p50 24小时后，以pCDNA3.1作对照，荧光素酶报告基因检测SIRT1启动子活性。A7r5细胞分别转染p65 RNAi质粒24小时后，以pSIREN-RetroQ-U6为对照，荧光素酶报告基因检测SIRT1启动子活性；(B)A7r5细胞分别转染或共转过表达质粒pCDNA3.1-p65和pCDNA3.1-A20 24小时后，以pCDNA3.1作对照；或A7r5细胞分别转染p65 RNAi质粒24小时后，以pSIREN-RetroQ-U6为对照，荧光素酶报告基因检测SIRT1启动子活性，MMP9启动子荧光素酶报告基因和NF-κB荧光素酶报告基因作阳性对照；(C)A7r5细胞分别转染pCDNA3.1和pCDNA3.1-p65 24小时后，荧光素酶报告基因检测SIRT1片段删除启动子SIRT-2685，SIRT1-800，SIRT1-309的活性，每个实验均重复三次，每次均为三复孔均值，*表示p≤0.05

图4：p65被募集到SIRT1启动子上。TNF-α(30ng/ml)处理人脐动脉平滑肌原代细胞16小时后进行染色质免疫沉淀实验，(A)生物信息学预测SIRT1启动子区-339bp到-328bp为p65结合序列(红色序列)；(B)染色质免疫沉淀(ChIP)方法检测p65在SIRT1启动子区的募集，以(A)中绿色序列为引物，分别以p65在TNF-α启动子区和GAPDH启动子区的募集作为阳性对照和阴性对照。

具体实施方式

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

实施例1实验材料

1.菌株与质粒

大肠杆菌DH5α(遗传型supE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA96)(购自北京TIANGEN公司，目录号为CB101-03)。pTASirt-promoter(2825bp)质粒由是将人源性SIRT1的启动子区2825bp(ref Gene_NM_012238 range＝chr10：69311608-69314485)以MluI和XholI为酶切位点连接入pTA-Luc质粒中。NF-κB荧光素酶报告质粒是将4个κB反应元件GGGACTTTCC以串联方式插入pGL3basic中，以KpnI和BglII为酶切位点。MMP-9荧光素酶报告质粒是将是将人MMP-9基因启动子(-711～+19bp，refGene_NM_004994 range＝chr20：44070243-44070972)克隆入pGL-3basic载体的Mlu I和BglII位点间。pcDNA3.1-p65、pcDNA3.1-p50表达质粒是将人源性的p65和p50的cDNA(p65基因cDNA号为NM_021975.3，p50基因cDNA号为NM_003998.3)序列均以KpnI和XhoI为酶切位点克隆入pCDNA3.1中。

2.限制性内切酶和其他修饰酶

限制性内切酶分别购自New England Biolabs公司和TaKaRa公司；T4 DNALigase为Promega公司产品；M-MuLV逆转录酶为New England Biolabs公司产品；Taq DNA聚合酶为MBI公司产品。

3.细胞系

A7r5平滑肌细胞和293细胞(购自美国ATCC公司，目录号分别为CRL-1444和CRL-1573)。

4.其他主要试剂

进口胎牛血清和DMEM培养基为HyClone公司产品；阳离子转染试剂和质粒大量提取试剂盒为Vigorous公司产品；Trizol为invitrogen公司产品；硝酸纤维素膜为Amersham公司产品；TEMED、DMSO、PMSF、DEPC、NP-40、HEPES购自Sigma公司；TNF-α是Peprotech公司产品，丙烯酰胺为Serva公司产品，Dual-luciferasereporter 1000 assay system为Promega公司产品；预染蛋白Marker为New EnglandBiolabs公司产品；质粒小量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自TaKaRa公司、Tiangen公司；其它试剂均为分析纯试剂。

5.实验用抗体

Anti-p50抗体购自Santa Cruz公司；Anti-Actin抗体购自Sigma公司；Anti-p65，Anti-SIRT1购自Upstate公司。

6.主要仪器设备

倒置显微镜(DIAPHOT TMD)以及照相系统为日本Nikon公司产品；CO2孵箱(NAPCO 5410)为Precision Scientific公司产品；0.22μm和0.45μm滤器、超纯水制备器为Millipore公司产品；PCR热循环仪为Eppendorf公司产品；凝胶成像系统为Bio-Rad公司产品；紫外分光光度计(DU640)，超速离心机(XL-90)为美国Beckman公司产品；电泳仪和电泳槽为北京六一厂、Bio-Rad、Pharmacia公司产品。

实施例2实验方法

1.细菌操作与质粒的转化

1.1感受态大肠杆菌DH5a制备

将宿主菌的单菌落接种到5ml LB培养基中，37℃振摇过夜，次日取1/50体积的过夜菌液接种到50-100ml LB培养基中，37℃振摇，待菌液OD₆₀₀接近0.3-0.4时，于4℃、4000转/分离心10min，收集菌体，取原菌液1/5体积预冷的0.1mol/LCaCl₂溶液，轻轻加至菌体中，冰浴上轻轻摇动离心管，使菌体缓慢散开，冰浴静置20min，4℃离心，弃上清。重复上一次操作，同样条件离心收集菌体后，向菌体中加1/50体积预冷的CaCl₂，混匀，冰浴静置12h后用于转化。感受态细胞于4℃保存一周仍可维持较高效率，或加入1/10体积的DMSO冻存于-70℃保存。

1.2质粒的转化和扩增

取制备好的感受态细胞溶液200μl置于1.5ml Eppendorf管中，冰上静置5min。加入5-10μl连接反应液，轻轻混匀后，冰上静置30min，然后置于42℃水浴中热休克90秒，加入0.8ml LB培养基，37℃振摇45min，3000转/分离心5min，弃去0.8ml上清，然后接种于含抗生素的LB平板上，37℃温箱培养10-12h后观察菌落生长情况。或用快速转化法：取新鲜制备的感受态细胞溶液200μl置于1.5mlEppendorf管中，加入5-10μl连接反应液，轻轻混匀后，冰浴上静置5min，然后涂布于经37℃预热2h的含抗生素的LB平板上，37℃温箱培养8-12h后观察菌落生长情况。无菌牙签挑取单个转化菌落，接种到5ml LB培养基中，37℃剧烈振摇过夜，进行质粒小量扩增。

1.3质粒的提取和纯化

质粒的小量制备使用Tiangen公司质粒小量提取试剂盒进行提取，按照说明书操作。在1.5ml EP管中，加入过夜培养的菌液，12,000转/分离心30秒，倾出上清，加入100μl含100μg/ml RNaseA的溶液I振荡将沉淀的细菌充分混匀，再加入150μl溶液II轻柔颠倒混匀后室温裂解细菌5min，加入150μl溶液III室温混匀中和5min，12,000转/分室温离心5min，转移上清至吸附柱中，12,000转/分离心30秒，洗柱液每次700μl洗两次，最大速度离心30秒去除可能残存的乙醇。适量双蒸水或TE液洗脱，紫外分光光度计定量，1％琼脂糖凝胶电泳观察质量，-20℃保存。

质粒的大量制备利用Vigorous公司的质粒大量提取试剂盒(Plasmid MaxprepKit)按照其提供的说明书进行操作。以单菌落接种至含适当抗菌素的5ml LB培养基中，37℃振荡培养过夜，取0.1ml过夜培养物加到含抗菌素的150ml LB培养基中，37℃振荡培养过夜。4℃4,000转/分离心10min收集细菌，用含有RNaseA的溶液I 10ml重悬细菌，加入15ml溶液II，轻柔颠倒混匀充分裂解细菌，冰上放置约10min。至液体呈透明状，加入溶液III 15ml，颠倒混匀，使充分沉淀，室温放置约10min。4℃12,000转/分离心15min，上清转移到一个新的50ml离心管，加入10ml异丙醇，室温放置10min使质粒充分沉淀，4℃12,000转/分离心15min，弃上清，沉淀用500μl溶液I溶解，转移到一个新的1.5ml EP管，室温12,000转/分离心2min去除沉淀。上清转移到新的1.5ml EP管，加入溶液IV 200μl充分混匀，12,000转/分离心2min。将上清转移到新的1.5ml EP管，重复上述步骤一次。加入70μl溶液V，轻轻混匀，12,000xg离心5min，将上清液转移至新的离心管中。加入0.5ml异丙醇，混匀，室温放置10min。12,000g室温离心10min，弃去上清液，用70％乙醇1ml轻轻洗涤，弃去液体，室温倒置晾5min。用0.5ml TE溶解沉淀(可在37℃水浴中振荡或用宽口吸管轻轻吹打辅助溶解)，加入200μl溶液VI，混匀后冰上放置10-30min，12,000g室温离心10min，弃去上清液，轻轻加入1ml 70％乙醇洗涤两次，室温倒置晾5-10min使乙醇完全蒸发。加适量TE(200-500μl)溶解沉淀。

2.克隆构建

2.1p65RNAi干扰质粒的构建

p65 RNA干扰(RNAi)质粒载体为pSIREN-RetroQ(购自Clontech公司，目录号为631526)，大鼠p65干扰序列参照invitrogen和clontech公司提供的在线软件(网页链接分别为：https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/design.do和http://bioinfo.clontech.com/rnaidesigner/oligoDesigner.do？overhangs＝on&restrictionSite＝on)进行设计，干扰序列5′-GGACCTACGAGACC TTCAA-3′(SEQ ID NO：1)。具体构建方法如下：首先合成两条互补的单链，正义链为5′-gatccGGACCTACGAGACCTTCAATTCAAGAGATTGAAGGTCTCGTAGGTCCTTTTTTg-3′(SEQ ID No：2)，其中包括GGACCTACGAGACCTTCAA(SEQ ID NO：1)干扰序列和它的互补序列TTGAAGGTCTCGTAGGTCC，中间是无关序列用于形成环状结构，TTTTTT序列是microRNA的转录终止序列，两端分别形成BamH I和EcoRI的粘末端。反义链为5′-aattcAAAAAAGGACC TACGAGACCTTCA ATCTCTTGAATTGAAGGTC TC GTAGGT CCg3′(SEQ ID No：3)。两条链合成后，用灭菌去离子水溶解成100uM，将两条链的溶解产物合并混匀，加入2.5μl退火缓冲液(1M NaCl，100mM Tris pH7.4)，在沸水浴中煮5分钟，关闭电源，将退火产物快速转入盛有沸水的保温桶中，加盖后置室温过夜，使其温度缓慢降至常温而形成稳定的双链。此时退火的产物两端分别相当于BamH I和EcoRI酶切后的粘末端。在克隆入载体之前，需将退火形成的双链作适当稀释，稀释的范围可以较大，50到1000倍之间都可以接受。然后将退火形成的双链首先克隆到pSIREN-RetroQ载体，具体过程是将pSIREN-RetroQ载体用BamH I和EcoRI酶双酶切，回收后与退火双链16℃过夜连接，转化DH-5a感受态细菌，涂Amp+LB平板，16小时后挑6个细菌单克隆摇菌小提质粒测序鉴定，阳性克隆是与U6启动子相连的干扰序列表达盒。此逆转录病毒载体可用于包装逆转录病毒颗粒感染细胞，也可以作为普通质粒直接转染细胞用于RNA干扰。

2.2SIRT1荧光报告质粒的构建

以pTASirt-promoter(2825bp)质粒为模板，下游引物为：

5’CCGCTCGAGCTCCTCCCTCGCCTCCTCT3’(SEQ ID No：4)，

上游引物分别为：

5’CGACGCGTCATTCTGCACG TGAGAAAACTGAGGCCCGGAG3’(SEQID No：5)，

5’CGACGCGTCATTCTGCACGTGAGAAAAC TG AGGCCCGGAG3’(SEQID No：6)，

5’CGACGCGTTGAAAGAGAAGTTGAGAAAGCGG3’(SEQ ID No：7)，以MluI和XholI为酶切位点，将PCR扩增产物2685bp，800bp和309bp插入pGL3-basic荧光素酶报告基因质粒中，用于SIRT1启动子活性检测。

3.细胞培养

3.1细胞的生长条件

239A细胞和A7r5平滑肌细胞培养于DMEM培养基中，每100ml培养液中加入10ml胎牛血清。在37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下静置培养。每个60mm平皿加5ml培养液，每个100mm平皿中加入10ml培养液。

3.2细胞的传代

239A细胞和A7r5平滑肌细胞为贴壁细胞，传代时需弃去旧培养基，用PBS洗3次，加入胰酶消化液，轻轻摇动培养皿，使其流遍所有细胞表面，在倒置显微镜下观察消化程度，发现胞质回缩，细胞间隙增大后，弃去消化液。加入少量完全培养基，用吸管反复吹打使细胞脱壁形成细胞悬液，传代种入新的培养皿。

3.3细胞的复苏及冻存

细胞复苏的操作方法：①从液氮中取出冻存管，用镊子持盖投入37-42℃水浴中剧烈振摇使细胞快速融化；②融化后取出冻存管，酒精消毒后用吸管吸出细胞悬液，1000rpm离心10min，除去上清，用新鲜的完全培养液重悬细胞后传至培养皿(瓶)中，放在37℃培养箱内静置培养，次日更换1次培养液，继续培养。

细胞冻存的操作方法：①选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天换一次培养液。②对于贴壁细胞，用消化液把单层生长的细胞消化下来；悬浮生长的细胞则不需处理，离心收集细胞即可。依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并低速离心。③加入1ml冻存培养液(含10％DMSO和20％血清的细胞培养液)，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后装入无菌冻存管中。④然后4℃静置2h，-20℃静置2h，-70℃静置过夜，然后迅速移入液氮中。

3.4细胞的转染

先将待转染细胞换成无血清培养基，用Vigorous阳离子转染试剂转染质粒，按照说明书的转染量将一定量质粒溶于opti-MEM中，同时按照说明书剂量取转染试剂溶于等量的opti-MEM，室温放置5分钟，将二者混合，室温放置20分钟后，加入准备好的待转染细胞中，6小时后换正常培基，继续培养24-36小时即可。

4脐动脉血管平滑肌细胞的培养

4.1细胞分离与原代培养

无菌条件下在产房内取健康新生儿脐带(5-10cm)，置入放有DMEM培养液(含有100U/ml青霉素、100g/ml链霉素)的无菌离心管中带回实验室，放入无菌培养皿于超净工作台上分离出脐动脉，用DMEM培养液反复冲洗，以去掉血管内外的血迹，用眼科镊小心分离下动脉外的结缔组织及血管外膜，然后用眼科剪纵向剪开血管，再用眼科剪将血管剪成约1-2mm大小的组织块，用弯头吸管将血管小块移入25cm塑料培养瓶，并以4-7块/cm的密度均匀排列于培养瓶底(培养瓶底提前用培养液湿润)，翻转后加入含有青霉素和链霉素及20％胎牛血清的DMEM培养液约3-5ml，放入37℃、5％CO培养箱内(湿度100％)，贴壁12h后再轻轻翻转培养瓶，使组织块浸入到培养液中，开放式培养，一周后取出观察并换液。

4.2.胎儿脐动脉血管平滑肌细胞的传代培养

细胞生长融合后，用0.25％的胰蛋白酶消化传代。先将胰蛋白酶放入37℃水浴箱预热。用吸管将组织块从培养瓶底轻轻吹打下来，可以将组织块重新移入另一培养瓶继续贴块法培养。用PBS将培养瓶底冲洗两遍，洗掉残留的血清，然后迅速加入预热的胰蛋白酶，放回培养箱，每隔1min观察一次，并轻轻拍打培养瓶壁，使细胞从瓶底脱落下来，待镜下观察多数细胞收缩变圆后，向培养瓶中加入含血清的培养液，终止胰蛋白酶的作用，再用吸管轻轻吹打培养瓶底，使细胞脱落，然后将培养瓶中的液体移入离心管，1000r/min，离心5min后，弃上清液，然后加入含有10％胎牛血清的培养液将沉淀制成均匀的细胞悬液，按1∶2的比例将细胞悬液移入培养瓶，放回培养箱继续培养。

5.双荧光素酶报告系统测定启动子活性

用Promega公司的双荧光素酶报告试剂盒(Dual-Luciferase Reporter AssaySystem)测定NF-κB转录因子活性、MMP-9启动子活性、SIRT1启动子活性。具体步骤如下，细胞传代到24孔板，用Vigorous阳离子转染试剂转染质粒，以pRL-TK-Renilla质粒作为内对照，按说明书操作。转染后24h弃去培养基，加药物处理8小时后，用50μl 1×passive lysis buffer裂解细胞20min。将荧光素酶底物反应液混匀备用。接下来的操作用荧光检测仪进行。首先检测空管荧光值3次，用均值校0。在荧光检测管中加入10μl细胞裂解液和40μl LAR，检测目的基因的firefly荧光值；接着反应体系中再加入40μl Stop&Glo试剂，在灭活firefly荧光的同时激活Renilla荧光，混匀后，立即检测对照质粒荧光值。用相对荧光值作为衡量启动子活性的指标，相对荧光值＝目的基因荧光值/对照基因荧光值。

6.半定量RT-PCR

6.1RNA提取

用Invitrogen公司的Trizol试剂提取总RNA。按试剂使用说明操作，在10⁵-10⁶细胞中加入1ml Trizol，将匀浆或细胞裂解液转移到1.5ml EP管中，随后加入200μl氯仿，剧烈振荡15秒钟，室温放置5min，然后于4℃12,000g离心5min，将水相转移至一个新的EP管中，加入500μl异丙醇后混匀。4℃12,000g离心15min，弃去上清。加入用DEPC处理水配制的75％乙醇1ml洗涤沉淀一次，4℃ 7,500g离心5min，小心吸去乙醇，让残余乙醇挥发殆尽。RNA沉淀溶于适量DEPC处理过的水中，取适量稀释后读OD₂₆₀和OD₂₈₀数值，计算RNA浓度。另取一小部分用电泳检测RNA质量。其余部分按每管10μg分装后于-70℃冻存。

6.2逆转录PCR(RT-PCR)

cDNA第一链合成按照下列步骤进行。在无RNA酶EP管中加入以下试剂：总RNA 1-10μl(2μg)，oligo(dT)18引物2μl，dNTP混合物(2.5M each)4μl，加无核酸酶污染水至16μl，70℃加热5min，短暂离心后置于冰上。混合以下样品：步骤1的RNA/引物/dNTP 16μl，10×RT反应缓冲液2μl，RNase抑制剂0.5μl，M-MuLV反转录酶1μl，总体积20μl。42℃温育1h。95℃孵育5min使酶失活。用无核酸酶污染水将反应体系稀释到适当浓度，取1μl用内参引物进行PCR扩增反应检验cDNA质量。

PCR反应按照常规条件进行。检测每个基因表达水平时都首先扩增不同的循环数确定线性范围，然后选择在线性范围内的循环数进行实验。取5-10μl的PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳拍照。PCR用引物序列：大鼠SIRT1上游引物：5′-CAGAGCATCACACGCAAGC-3′(SEQ ID No：8)，

下游引物：5′-CAGGAAACAGAAACCCCAGC-3′(SEQ ID No：9)，

大鼠B-actin上游引物：5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′(SEQ ID No：10)，

下游引物5′-TAGAGCCACCAATCCACACAGAG-3′(SEQ ID No：11)。

7.Western Blot

7.1细胞及组织总蛋白提取

细胞用预冷的PBS洗两次，弃去PBS，加约为细胞压积5倍体积的RIPA裂解缓冲液裂解细胞，冰浴15-30min。4℃，12000rpm离心15min。上清液即为细胞总蛋白。BCA法测定蛋白质浓度，分装，-70℃保存，备用。

7.2聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

配制一定量的12％的分离胶，待胶自然凝聚后倾出，配制一定量的5％的浓缩胶，待凝固后小心拔出梳子将蛋白质样品30μg用微量注射器将样品加入样品孔中。浓缩胶中电泳电压60V，当样品进入分离胶时，调节电压使恒定在120V。待染料的前沿迁移至分离胶的底部关闭电源。取下凝胶，将凝胶放入电转缓冲液中平衡5min后进行转膜。在冰浴中进行电转，200mA，根据蛋白分子量大小不同确定转膜时间，一般为1.5-2.5h；(PVDF膜需先经100％甲醇浸透，电转液平衡10min后方可使用)。电转结束后，将膜置于TBST漂洗5min。

7.3抗原抗体反应

将膜揭下放入5％牛奶(TBST配制)封闭液中，室温振摇封闭2h。弃去封闭液，用TBST洗膜5min，同时用一抗稀释液将一抗以1∶1000稀释，然后将洗好的膜放入稀释好的一抗中，4℃过夜。膜用TBST洗3遍，每次10min。用5％牛奶(TBST配制)稀释辣根酶标记的二抗，稀释度1∶5000，室温孵育2h。

7.4辣根过氧化物酶化学发光法检测蛋白(ECL反应)

弃去二抗，TBST洗3次，每次10min。取等体积Western Blotting LuminolReagent试剂A液、B液混合加到膜上，反应1min，在暗室内行放射自显影，定影后观察结果。

8.染色质免疫共沉淀(ChIp)

8.1细胞固定及核的提取

TNF-α30ng/ml处理人脐动脉平滑肌原代细胞16小时后，先以冷的PBS洗涤两次细胞再加入固定液。固定后的细胞用细胞刮子刮下，2000rpm离心5min后，用5ml预冷的PBS洗涤沉淀两次。将细胞重悬在细胞收集缓冲液中，冰上放置15min，30℃水浴保温15min，2000g离心5min收集细胞，先以1ml冷的PBS，后分别以1ml核制备缓冲液I、核制备缓冲液II重悬，并于冰上放置10min后，并每隔5min涡悬震荡一次，3000g离心5min收获细胞核。

8.2细胞核的裂解与超声处理

加入150μl细胞裂解缓冲液溶解沉淀(相对于起始细胞数为2-5×10⁶)，涡悬使细胞核充分裂解，然后冰上放置10min后，用超声波破碎仪断裂染色质，操作条件为8瓦，每次10秒，每次超声波断裂的时间间隔为60秒，超声10次。超声处理后，4℃，12000rpm离心10min，取上清，即得到全细胞核提取液。

8.3超声结果的分析

取20ul全细胞核提取液检测超声效率，超声片段平均长度应在500bp左右(200-800bp)。加入去离子水使总体积达到100μl，加入4μl 5M NaCl、20μg蛋白酶K及20μg RNaseA，65℃保温过夜解交联。次日以酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提DNA，分别取5μl、10μ、15μl、20μl样品，1％琼脂糖凝胶电泳检测剪切效率。重复后几步的操作，直到获得合适大小的片段。之后检测蛋白裂解液的浓度，将裂解液浓度调整至约1μg/μl。此时裂解液可在4℃保存数月。

8.4免疫沉淀

加入625μl IP缓冲液将125ul样品稀释六倍，混匀。加入55μl ssDNA/Protein Aagarose，20μl兔免疫原血清，10μl蛋白酶抑制剂，4℃轻微摇动3h，预处理以降低非特异的结合。800rpm，4℃，离心1min，取上清至另一新EP管中，加入4μg抗体(anti-p65)，4℃轻微摇动孵育过夜。次日再加入35ul proteinA agarose，4℃轻微摇动3h，800rpm，4℃离心1min。弃上清，沉淀依次用预冷的950μl低盐洗液洗两次，高盐洗液、氯化锂洗液各洗涤1次，每次轻微摇动3-5min，4℃，800rpm离心1min。最后用TE洗涤沉淀2次，每次轻微摇动3-5min，4℃，800rpm离心1min后，弃上清。

8.5DNA的分离及纯化

在上述所得的沉淀中，先加入230μl新鲜配制的ChIP提取液，涡旋振荡，室温轻微摇动30min(间或振荡)后，4℃，1000g离心5min，小心吸取上清至另一干净离心管中。再加入200μl ChIP提取液，重复上述操作一次，合并两次所得的ChIP提取液(约420μl)。

在所得的ChIP提取液和Input样品(25μl+400ul灭菌水)中，分别加入16μl 5MNaCl(终浓度0.3M)，2μl RNaseA(10mg/ml)，1ul蛋白酶K(20μg/ul)，混匀后，65℃过夜。

次日用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提2次，等体积氯仿抽提一次，在上清中依次加入1/10体积的醋酸钠(3M，pH5.2)、2.5μl糖元(10mg/ml)和2.5倍体积的预冷无水乙醇，分别混匀，-80℃下沉淀DNA至少1h后，于4℃，12000rpm离心15min。弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀1-3次，晾干后，溶于50μl灭菌水中。

8.6PCR反应

根据人SIRT1启动子序列，设计下列引物(产物238bp，包括预测的p65结合位点)

正义链：5′TCCTTTTGCCTCTCTTCCTAC 3′(SEQ ID No：12)

反义链：5′GCCGCTTTCTCAACTTCTC 3′(SEQ ID No：13)

阴性对照引物参考Fan Yeung文章中提到的GAPDH的引物(Yeung et al.，2004)

正义链：5′AGCTCAGGCCTCAAGACCTT 3′(SEQ ID No：14)

反义链：5′-AAGAAGATGCGGCTGACTGT-3′(SEQ ID No：15)

阳性对照引物参考Hajime Ishinaga文章中提到的TNF-α的引物(Ishinaga et al.，2007)

正义链：5′-CCCTCCAGTTCTAGTTCTATC-3′(SEQ ID NO：16)

反义链：5′GGGGAAAGAATCATTCAACCA3′(SEQ ID NO：17)

从纯化的DNA中取出1μl input或2μl样品，在20μl反应体系中进行PCR反应。95℃变性5min后，94℃变性30秒，55℃或60℃退火30秒，72℃延伸30秒，30-36个循环后，72℃保温10min。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳分离，用BioRad凝胶照相系统照相分析。

9.免疫荧光

A7r5细胞接种细胞于24孔板，孔底放置按要求预处理好的盖玻片，进行细胞爬片。TNF-α30ng/ml处理24小时后，用PBS轻柔的洗细胞爬片2次。用4％的多聚甲醛/PBS室温固定10分钟。0.5％Triton X-100/PBS作用10分钟，以增加通透性。PBS洗3次，每次3分种，用5％BSA/PBS进行封闭。轻柔吸出封闭液，加入100μl 1∶50稀释的一抗(anti-p65)，在湿盒中室温作用2小时。PBS洗3次，加入相应的FITC标记二抗，室温作用1小时。PBS洗3次，加入Hoechst作用5分钟染细胞核。PBS洗3次，加入抗淬灭剂，封片，及时在荧光显微镜下观察结果。

实施例3实验结果

1.p65诱导SIRT1表达的上调作用

NF-κB由两个亚基p65和p50构成，其中p65即可与DNA结合，又具有转录活性，而p50则仅有DNA结合结构域。在研究中，着重考察了有转录激活功能的NF-κBp65亚基诱导SIRT1表达中的作用。转录因子NF-κB在胞核中发挥作用，静息状态下，IκB与NF-κB结合形成三聚体，覆盖了NF-κB的核定位信号而稳定存在于细胞的胞质中，在TNF-α，IL-6，氧化应激，UV等的刺激下，IκB磷酸化从三聚体解离，NF-κB发生胞质至胞核的移位。用TNF-α处理血管平滑肌细胞系A7r530分钟后，原位固定细胞，进行免疫荧光检测，发现用TNF-α处理后，p65的确从胞质移位至胞核(图1A)。TNF-α不但能引起NF-κB从胞质至胞核的移位，也可以提高NF-κB的转录活性，在接种于24孔板的血管平滑肌细胞系A7r5中转染含有6个串联κB结合位点的质粒pGL3-NF-κB-luc(0.2ug)24小时后，用TNF-α(30ng/ml，50ng/ml)处理A7r5细胞2小时，利用荧光素酶报告系统，检测到TNF-α可以提高NF-κB的转录活性，且有剂量依赖效应(图1B)，这和以往的研究结果一致。在进行SIRT1诱导因子的筛选过程中，惊奇地发现单独转染p65质粒或p65与p50两个质粒共同转染后，SIRT1的mRNA和蛋白表达水平都有明显的增高(图2A，B，D)，将细胞内源性p65干扰掉之后，SIRT1的表达随之下降(图2E)，但单独转染p50，SIRT1的表达并没有明显改变(图2C)。以上这些结果提示p65可以特异地诱导SIRT1 mRNA和蛋白水平的表达，并且在平滑肌细胞和293细胞中均发现有这种诱导效应(图1C)。

2.p65促进SIRT1启动子活性。

既然p65可以促进SIRT1 mRNA表达水平，说明p65对SIRT1的调节发生在转录水平。接下来，利用荧光素酶报告系统观察了p65对SIRT1转录活性的调节，发现单独过表达p65，或p65与p50两种质粒共同转染后，SIRT1启动子活性显著增高(分别升高4.9倍和3.0倍)，而单独过表达p50后SIRT1启动子活性与对照相比没有显著变化(图3A)。A20通过影响NF-κB的核转位来抑制NF-κB的活性。发现p65与A20两种质粒共同转染与单独转染p65相比，SIRT1启动子活性有显著降低(从1.70降为0.28)，而单独过表达A20后SIRT1启动子活性与对照相比没有显著变化(图3B)。将细胞内源性p65干扰掉之后SIRT1启动子活性降低近一半(图3A，B)。以上这些结果提示NF-κBp65可以影响SIRT1启动子的转录活性。为了进一步研究p65究竟在SIRT1启动子的那个区域发挥作用，对SIRT1的启动子进行了片段删除，发现2685bp和800bp的SIRT1启动子仍然受p65的诱导，而309bp的SIRT1启动子几乎不受p65的影响(图3C)。这一结果说明p65可能作用于SIRT1启动子309bp至800bp的区域。

3.p65通过直接募集到SIRT1的启动子区来发挥作用

接下来，需要明确NF-κBp65是否是通过与Sirt1启动子区的结合发挥作用。通过rVista生物信息学预测和比对，预测在人源性Sirt1的启动子区(-339bp～-328bp)有p65结合的同源序列(图4A)。利用TNF-α(30ng/ml，16h)处理后的人脐动脉原代血管平滑肌细胞通过染色质免疫共沉淀实验(ChIP)证实SIRT1的启动子区的确有NF-κBp65的募集(图4B)。

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序列表

<110>中国医学科学院基础医学研究所

<120>p65在制备上调SIRT1表达的药物中的用途

<130>890262CG

<160>17

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>p65干扰序列

<400>1

ggacctacga gaccttcaa                                                19

<210>2

<211>59

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>p65干扰序列构建所需正义链

<400>2

gatccggacc tacgagacct tcaattcaag agattgaagg tctcgtaggt ccttttttg    59

<210>3

<211>59

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>p65干扰序列构建反义链

<400>3

aattcaaaaa aggacctacg agaccttcaa tctcttgaat tgaaggtctc gtaggtccg    59

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>SIRT1荧光报告质粒下游引物

<400>4

ccgctcgagc tcctccctcg cctcctct                                      28

<210>5

<211>40

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>SIRT1荧光报告质粒上游引物1

<400>5

cgacgcgtca ttctgcacgt gagaaaactg aggcccggag    40

<210>6

<211>40

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>SIRT1荧光报告质粒上游引物2

<400>6

cgacgcgtca ttctgcacgt gagaaaactg aggcccggag    40

<210>7

<211>31

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>SIRT1荧光报告质粒上游引物3

<400>7

cgacgcgttg aaagagaagt tgagaaagcg g             31

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>大鼠SIRT1上游引物

<400>8

cagagcatca cacgcaagc                           19

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>大鼠SIRT1下游引物

<400>9

caggaaacag aaaccccagc                          20

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>大鼠β-actin上游引物

<400>10

gagagggaaa tcgtgcgtga c                        21

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>大鼠β-actin下游引物

<400>11

tagagccacc aatccacaca gag      23

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>人SIRT1启动子上游引物

<400>12

tccttttgcc tctcttccta c        21

<210>13

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>人SIRT1启动子下游引物

<400>13

gccgctttct caacttctc           19

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>人GAPDH上游引物

<400>14

agctcaggcc tcaagacctt          20

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>人GAPDH下游引物

<400>15

aagaagatgc ggctgactgt          20

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>人TNF-α上游引物

<400>16

ccctccagtt ctagttctat c                    21

<210>17

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>人TNF-α下游引物

<400>17

ggggaaagaa tcattcaacc a                    21

Claims (9)

1.p65在制备上调哺乳动物包括人SIRT1表达的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述药物是提纯的蛋白质类型的药物，所述药物的剂型为适于蛋白质药物应用的剂型。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述药物是表达p65蛋白质的重组核酸构建体，且其中所述重组核酸构建体的表达载体是适用于基因治疗的病毒表达载体或非病毒表达载体。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述病毒载体选自重组逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体或牛痘苗病毒载体，所述非病毒载体选自噬菌体载体或复制子载体。

5.p65在制备治疗哺乳动物包括人的受益于SIRT1表达上升的疾病的药物中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述哺乳动物包括人的受益于SIRT1表达上升的疾病选自代谢综合征、肿瘤、神经退行性疾病、心血管疾病、炎症或线粒体相关疾病，其中所述代谢综合征选自I型或II型糖尿病、肥胖症或低血糖症，所述肿瘤选自乳腺癌、肝癌或肺癌，所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默病或帕金森症，所述心血管疾病选自动脉粥样硬化、心肌肥厚或心衰。

7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述药物是提纯的蛋白质类型的药物，所述药物的剂型为适于蛋白质药物应用的剂型。

8.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述药物是表达p65蛋白质的重组核酸构建体，且其中所述重组核酸构建体的表达载体是适用于基因治疗的病毒表达载体或非病毒表达载体。

9.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述病毒载体选自重组逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体或牛痘苗病毒载体，所述非病毒载体选自噬菌体载体或复制子载体。

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