CN102008718A - SIRT1在制备下调细胞周期蛋白如cyclin D1表达的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及SIRT1在制备下调细胞周期蛋白如cyclin D1表达的药物中的用途。特别地，所述药物是提纯的蛋白质类型的药物，其剂型可以是适于蛋白质药物应用的任何剂型。所述药物是能表达SIRTI蛋白的重组核酸构建体，其表达载体可以是任何适用于基因治疗用的表达载体，包括病毒载体如重组逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、牛痘苗病毒载体等和非病毒载体如噬菌体载体、复制子载体等。

Description

SIRT1在制备下调细胞周期蛋白如cyclin D1表达的药物中的用途

技术领域

本发明涉及SIRT1在制备调控细胞周期蛋白表达的药物中的用途，特别地，本发明涉及SIRT1在制备下调cyclin D1、cyclin E或CDK2表达的药物中的用途。

背景技术

新生内膜形成与血管重塑密切相关，主要包括血管平滑肌细胞的增殖、迁移、凋亡以及基质成分合成、降解及重新排列等过程。过度的血管平滑肌细胞增殖是动脉粥样硬化、肺动脉高压、系统性高血压、腹主动脉瘤及经皮腔内血管成形术后再狭窄等心血管疾病的重要病理基础。

细胞增殖正常与否与细胞周期密切相关。细胞周期分为G1期(DNA合成准备期)、S期(DNA合成期)、G2期(有丝分裂准备期)和M期(有丝分裂期)。在哺乳动物的整个细胞周期调控中，G1→S期的调控是至关重要的核心过程，它决定细胞对外界增殖信号如各种生长因子等的加工、反应，决定细胞是进入有丝分裂，还是发生凋亡抑或进入静止期G0期，修复损伤DNA(Hunter and Pines.1994)。细胞增殖主要通过以下三种蛋白进行调控：周期蛋白依赖性蛋白激酶(Cyclin-dependentkinase，CDK)，周期蛋白(Cyclin)，周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制因子(Cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI)。细胞周期的G1到S期转换受到多种Cyclin-CDK复合物的正性调控，同时受到CKI两个亚家族INK4和Cip/Kip的负性调控。在周期蛋白中cyclin D1在细胞周期中最早被合成，于G1中期到达高峰，并与CDK4/CDK6形成复合物，对决定G1/S期转换的限制点进行调控。其中cyclin D1/CDK4和cyclin E/CDK2两个复合物是极其重要的G1/S转换和DNA合成的决定因素(Baldin，Lukas et al.1993；Quelle，Ashmun et al.1993；Tsai，Lees et al.1993；Ohtsubo，Theodoras et al.1995)。有活性的cyclin D-CDK4/CDK6复合物可以磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma，Rb)，从而释放E2F，促进细胞周期进行。cyclin E/CDK2复合物在G1期中、晚期合成增加，加速细胞进入S期，并促使DNA合成。在许多细胞体系里，生长因子刺激后cyclin D1比cyclin E更早被诱导表达升高。因此，cyclin D1相关的激酶远比cyclin E相关的激酶更早被大量激活(Sherr.1993)。CDK4主要与cyclin D1形成复合物，而CDK2(NCBI登录号NM 001798)则结合cyclin E和cyclinA形成复合物。另外，cyclin D1表达也先于CDK4的激活，同时CDK4蛋白水平也在PDGF刺激后显著升高(Koyama，Nishizawa et al.1996；Koyama，Raine et al.1996；Rao.1999；Kronemann，Nockher et al.1999)。

在上述细胞周期调控中起到重要作用的人cyclin D1基因(NCBI登录号NM_053056.2)于1991年在甲状旁腺腺瘤中被克隆发现，它位于11号染色体长臂1区三带(11q13)，包含5个外显子。cyclin D1最初是被作为集落刺激因子激活的早期反应基因从小鼠骨髓巨噬细胞中分离获得(Matsushime，Roussel et al.1991)，目前对cyclin D1的调控主要见于对其转录水平及其蛋白通过泛素化途径降解的研究(Diehl，Zindy et al.1997)。cyclin D1基因启动子区域含有多个顺式反应元件，其中包括AP-1(activator protein-1)，NF-κB(nuclear factor-κB)，SP1以及激活转录因子ATF(activating transcription factor)/cAMP反应元件结合蛋白CREB(cAMP-responsive element-binding protein)等(Schneider，Oswald et al.2002)。cyclin D1作为细胞周期调节因子之一，在正常人体组织中呈低水平表达，当cyclin D1表达失控时，将引起细胞增殖周期失调，导致恶性肿瘤发生。目前cyclin D1已经被确认为一个癌基因，其过度表达是多种人类原发性肿瘤(如甲状旁腺腺瘤，乳腺癌，结肠癌，淋巴瘤，黑素瘤以及前列腺癌等)的特征，对肿瘤的诊断及预后具有重要意义。cyclin D1的转基因和缺失鼠的研究结果进一步明确了其与肿瘤发生发展的相关性。cyclin D1过表达拮抗很多因素引起的肿瘤细胞生长抑制。cyclin D1转基因鼠自发形成肝癌，并且反义cyclin D1能抑制其肝癌生长(Deane NG et al.2001；Uto H et al.2001)。同时cyclin D1转基因鼠乳房过增生，并且易罹患乳腺癌(Wang et al.1994)。当同时敲除cyclin D1、D2和D3后，对小鼠胚胎正常的组织发育几乎没有什么影响，但在缺乏cyclin D的胚胎细胞中诱导肿瘤转化，该细胞仍然正常，这说明抑制过度活跃的cyclin D可能阻断癌症细胞增殖(Kozar K et al.2004)。实验证明，瘤细胞中注射cyclin D1抗体、反义寡核苷酸或导入反义cyclin D1重组质粒，可一定程度抑制G1一S期过渡，改变或逆转细胞恶性表型(Reed JC et al.1999)。近年来研究发现cyclin D1还可以调控细胞代谢，脂肪细胞分化，并且可以作为细胞衰老的标志。

Cyclin E基因(NCBI登录号NM_57182.1)定位于人染色体19q12～13，由4个外显子和3个内含子组成，编码395个氨基酸，蛋白分子量为50KD。cyclin E不仅参与细胞周期G1/S的正性调控，其过表达可以直接激活CDK2，从而造成肿瘤细胞的异常增殖。另外也可能导致肿瘤细胞对内分泌治疗产生耐受性(Harwell RM et al.2004；Span PN et al.2003)。cyclin E在很多肿瘤中的表达在质和量上都有异常。乳腺癌中cyclin E的增加不仅与肿瘤组织分级和临床分期有关，而且与不良预后和较高死亡率有关。

目前，现有技术中记载人类SIRT1(SIRTuin 1，NCBI登录号为NM_012238)是NAD+依赖的III类组蛋白去乙酰化酶，SIRT1基因位于人10号染色体，编码747个氨基酸残基的蛋白质，其在各物种之间呈现高度的保守性，在7个SIRT成员中与酵母Sir2(silence information regulator2)的同源性最高。近年来的研究发现，SIRT1能够去乙酰化组蛋白(H3，H4)和多种转录因子和转录辅助因子，包括MyoD、p300、PGC-1α、PPARγ、NF-κB、Ku70、p53、FOXO、E2F1等，在胚胎发育、组织分化、代谢调节、细胞凋亡、DNA损伤修复，抵抗应激，细胞衰老以及肿瘤发展等方面发挥重要的作用。

鉴于细胞周期蛋白如cyclin D1在调控细胞增殖中具有重要的作用，而细胞的过度增殖与众多心血管疾病及肿瘤密切相关，因此，如果能找到能有效调控cyclin D1及相关细胞周期蛋白的表达，特别是下调cyclin D1及相关细胞周期蛋白表达的作用因子，那么将对与细胞过度增殖导致的众多心血管疾病及肿瘤的治疗具有巨大的治疗潜力。同时，如前所述，SIRT1作为NAD+依赖的III类组蛋白去乙酰化酶，在很多方面发挥重要的作用。然而，现有研究尚未涉及SIRT1在cyclin D1及相关细胞周期蛋白调控中的作用情况。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是探究SIRT1在cyclin D1及相关细胞周期蛋白表达调控中的作用并探究SIRT1在心血管疾病治疗中的应用前景。

因此，本发明提供了SIRT1在制备下调哺乳动物包括人的细胞周期蛋白表达的药物中的用途，特别地，所述细胞周期蛋白是cyclin D1、cyclin E或CDK2。特别地，所述药物是提纯的蛋白质类型的药物，其剂型可以是适于蛋白质药物应用的任何剂型，如注射剂。特别地，所述药物是能表达SIRTI蛋白的重组核酸构建体，其表达载体可以是任何适用于基因治疗用的表达载体，包括常用的病毒载体或非病毒载体，所述表达载体选自重组逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体或牛痘苗病毒载体，所述非表达载体选自噬菌体载体或复制子载体。

由于cyclin D1的过表达与新生内膜形成异常密切相关，而新生内膜形成异常是动脉粥样硬化等心血管疾病的重要病理基础，因此，上述基于SIRT1的下调cyclin D1及cyclin E表达的药物可以进而抑制新生内膜形成并可预防和/或治疗由于新生内膜形成异常导致的心血管疾病。

具体而言，本发明通过具体的实验证明，SIRT1抑制了血清刺激及小鼠颈总动脉结扎引起的细胞周期蛋白cyclin D1表达增高，使血管平滑肌细胞(VSMCs)阻滞在G1期，抑制VSMCs增殖和小鼠颈总动脉结扎引起的细胞增殖，进而抑制新生内膜形成。

细言之，发明人首先通过³H-TdR、流式细胞术检测SIRT1在体外对细胞增殖和细胞周期的影响。随后，通过Western blot、RT-PCR观察在基础水平和血清诱导下，过表达和干扰SIRT1对细胞周期蛋白表达水平的影响；用荧光素酶报告系统检测过表达SIRT1对细胞周期蛋白cyclin D1活性的影响。为验证体内水平SIRT1对小鼠颈总动脉结扎引起的细胞周期蛋白cyclin D1表达增高的下调作用，构建了平滑肌特异性SIRT1转基因鼠，应用RT-PCR、Southern blot、Western blot、免疫组化等方法对平滑肌特异性SIRT1转基因鼠进行鉴定，用Western blot和免疫组化方法观察在小鼠颈总动脉结扎情况下，体内过表达SIRT1对细胞周期蛋白cyclin D1表达的影响，并进一步应用小鼠颈总动脉结扎模型，采用HE染色、免疫组化、Masson染色等方法观察转基因鼠新生内膜形成、血管平滑肌细胞增殖和细胞外基质(ECM)。

本发明发现，腺病毒介导的SIRT1过表达可以抑制基础水平和血清诱导的原代血管平滑肌细胞增殖，并使血清诱导的原代血管平滑肌细胞阻滞在G1期。SIRT1在体内外抑制G1期开关分子cyclin D1的表达，SIRT1转基因鼠可以抑制由颈总动脉结扎所引起的新生内膜形成，并且可以减少细胞外基质。

即，本发明发现，SIRT1在体内外可以降低cyclin D1的表达，并可能由此使血管平滑肌细胞阻滞在G1期，抑制细胞增殖和新生内膜形成。因此，SIRT1是调控平滑肌细胞增殖的重要基因，提高SIRT1的表达可以作为抑制血管平滑肌细胞增殖和新生内膜形成及影响血管重塑过程的一个新手段。

在实验中也发现，10％FBS刺激血清饥饿48小时后，已处于静止期的VSMC、cyclin D1、cyclin E及CDK2均表达增高，而当过表达SIRT1时，cyclin D1、cyclin E及CDK2的蛋白表达与对照组相比均降低。为排除腺病毒的干扰，在大鼠平滑肌细胞系A10中通过转染p3.1SIRT1及pcDNA3.1对照，也同样发现过表达SIRT1能下调cyclin D1、cyclin E及CDK2的蛋白表达水平。反之，当RNAi干扰SIRT1近50％时，发现cyclin D1的蛋白表达水平升高，而干扰SIRT1后，cyclin E及CDK2蛋白表达水平变化不明显。同时进一步在颈总动脉结扎模型中发现，与相同处理的野生型鼠相比，结扎28天后的SIRT1转基因鼠颈总动脉中cyclin D1蛋白水平明显降低(p＜0.05)。考虑到cyclin D1作为调控G1期的早期变化基因，同时根据上述结果，在G1期相关周期蛋白及周期蛋白依赖性蛋白激酶中，SIRT1对cyclin D1具有更为明显的调控作用，同时SIRT1过表达在体外和体内均能降低cyclin D1的蛋白水平，因此进一步研究了SIRT1能否在转录水平上对cyclin D1进行调控。

现有研究证明，SIRT1能与AP-1的两个亚基c-Fos/c-Jun相互作用并确定了其相互作用的确切的结构域，并且明确了SIRT1通过去乙酰化及抑制c-Fos/c-Jun的DNA结合能力来抑制AP-1的转录活性。研究发现，SIRT1过表达不仅能降低由血清诱导的cyclin D1mRNA水平的增高，同时SIRT1还能显著降低大鼠cyclin D1(NCBI登录号NM_171992)启动子活性，由c-Fos/c-Jun诱导升高的cyclin D1启动子活性也同样被SIRT1所抑制。为进一步考察SIRT1能否通过c-Fos/c-Jun实现对cyclin D1转录水平的调控，分别对包含有AP-1结合位点的大鼠cyclin D1启动子进行删除和突变，结果发现：当删除-818--814AP-1结合位点后，cyclin D1启动子活性降低0.85倍，但SIRT1对大鼠cyclin D1启动子活性的抑制效应依然存在(降低0.4倍)；而进一步删除包括-44--41AP-1结合位点后，cyclin D1启动子活性也降低0.94倍，而SIRT1对大鼠cyclin D1启动子活性的抑制效应几乎消失(降低0.1倍)；进一步对-44--41AP-1结合位点进行突变后，发现cyclin D1启动子活性仍有大幅降低，为0.79倍，而SIRT1对大鼠cyclin D1启动子活性的抑制效应也有明显降低(降低0.19倍)。因此，这些结果说明AP-1的结合对cyclin D1启动子活性的提高起重要作用，同时由于SIRT1对cyclinD1启动子活性的降低效应可以由-44--41AP-1结合位点的缺失而部分消除，提示-44--41AP-1结合位点对AP-1参与SIRT1对cyclin D1的调节中起着关键作用。用ChIP实验也证实SIRT1和c-Fos/c-Jun可以被募集到cyclin D1启动子上包含有-44--41AP-1结合位点的同一区域，并且当RNAi干扰掉SIRT1的表达时，c-Fos/c-Jun在cyclinD1启动子上该区域的募集增加。因此，上述结果提示SIRT1可能通过与AP-1的相互作用，降低c-Fos/c-Jun在cyclin D1启动子上的募集来调节cyclin D1启动子区的活性。

由此可见，本发明通过体内外实验首次证明SIRT1可下调cyclin D1及相关细胞周期蛋白如cyclin E和CDK2的表达，由于cyclin D1及相关细胞周期蛋白如cyclin E和CDK2可正向调控细胞增殖，因此，SIRT1可以负向调控细胞的增殖作用。因此，蛋白质SIRT1可以制备为蛋白质类型的药物，或者将SIRT1基因制备为重组表达载体类型的核酸构建物。在将上述药物给予患者之后，直接提供的SIRT1蛋白或者所述核酸构建物在患者体内重组表达的SIRT1蛋白能通过下调cyclin D1及相关细胞周期蛋白如cyclin E和CDK2的表达，抑制患者体内血管平滑肌细胞过增殖，并进而抑制新生内膜形成并可预防和/或治疗由于新生内膜形成异常导致的心血管疾病或相关细胞增殖性疾病如肿瘤。

附图说明

图1：平滑肌特异性转基因鼠SMC-SIRT1 Tg的构建模式图，用平滑肌特异性启动子SM22α介导人源SIRT1的表达。

图2：Southern blot鉴定获得两株转基因鼠Tg1和Tg2，WT为同窝野生型鼠，Tg为转基因鼠。

图3：转基因鼠胸主动脉mRNA水平的过表达，WT为同窝野生型鼠，Tg为转基因鼠。

图4：转基因鼠胸主动脉SIRT1蛋白水平的过表达，WT为同窝野生型鼠，Tg为转基因鼠，LCCA为左颈总动脉。

图5：免疫组化鉴定SIRT1在转基因鼠中膜平滑肌层的特异性表达，IgG为阴性对照，WT为同窝野生型鼠，Tg为转基因鼠，标尺为25μM。

图6：HE染色结果，WT为同窝野生型鼠，Tg为转基因鼠，N代表新生内膜，M代表中膜，标尺为50μM。

图7：SIRT1体内过表达抑制颈总动脉结扎引起的新生内膜形成，新生内膜形成率用内膜/中膜面积比表示，**代表P＜0.01。

图8：SIRT1体内过表达抑制由颈总动脉结扎28天引起的细胞增殖，A，SIRT1体内过表达显著降低PCNA阳性细胞，PCNA阳性细胞为细胞核棕黄色的细胞，标尺为25μM；B，SIRT1体内过表达显著降低颈总动脉结扎28天后的内膜PCNA阳性细胞率，**代表P＜0.01。

图9：SIRT1体内过表达抑制由颈总动脉结扎28天引起的血管细胞外基质形成，A，SIRT1体内过表达显著降低胶原纤维形成，胶原纤维为血管内蓝色着色区域，标尺为50μM；B，SIRT1体内过表达显著降低颈总动脉结扎28天后的内膜胶原百分率，**代表P＜0.01。

图10：SIRT1转基因鼠由颈总动脉结扎引起的内膜中TUNEL阳性细胞数在每1000个细胞(A)和每10000μm2(B)均与野生型鼠相比无显著差异。

图11：SIRT1过表达抑制基础状态及血清刺激12小时后的血管平滑肌细胞DNA合成，**代表P＜0.01，***代表P＜0.001。

图12：SIRT1过表达在血清刺激12小时后使血管平滑肌细胞阻滞在G1期，*代表P＜0.05。

图13：SIRT1过表达在血清刺激12，16，20小时后使大鼠平滑肌细胞系A7r5阻滞在G1期，*代表P＜0.05。

图14：SIRT1过表达下调血清刺激引起的血管平滑肌细胞cyclin D1，cyclin E，CDK2蛋白水平的增高，*代表P＜0.05。

图15：SIRT1过表达下调血清刺激引起的大鼠平滑肌细胞系A10 cyclin D1，cyclin E，CDK2蛋白水平的增高，*代表P＜0.05。

图16：RNAi SIRT1干扰后进一步上调血清刺激引起的血管平滑肌细胞cyclin D1蛋白水平的增高(A)，而cylinE，CDK2变化不大(B)，*代表P＜0.05。

图17：SIRT1体内过表达下调由颈总动脉结扎28天后引起的cyclin D1蛋白水平的增高，A，蛋白水平结果；B，免疫组化结果，细胞核棕黄色的为cyclin D1阳性细胞，*代表P＜0.05。

图18：SIRT1过表达下调血清刺激引起的血管平滑肌细胞cyclin D1 mRNA水平的增高，*代表P＜0.05。

图19：大鼠cyclin D1启动子AP-1结合位点及突变位点模式图，也即大鼠cyclin D1报告基因cyclin D1-luc序列。

图20：SIRT1过表达下调c-Fos和c-Jun引起的cyclin D1报告基因活性的增高，*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。

图21：AP-1介导了SIRT1对cyclin D1报告基因活性的抑制I，*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，***代表P＜0.001。

图22：AP-1介导了SIRT1对cyclin D1报告基因活性的抑制II，***代表P＜0.001。

图23：SIRT1、c-Fos、c-Jun结合在cyclinD1启动子区，上图柱状图为实时定量PCR结果，下图为普通PCR结果。

图24：SIRT1干扰后，c-Fos，c-Jun在cyclin D1启动子上该区域的募集增加。

具体实施方式

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例

实施例1平滑肌特异性人源SIRT1转基因鼠构建

1.用于制备转基因的SMC-SIRT1的克隆构建

包含5’摆动序列445个碱基对的小鼠SM22α启动子是一个血管平滑肌细胞特异表达的启动子，它只在成年大鼠的大动脉及中动脉有活性，而在静脉或内脏平滑肌细胞，心肌或骨骼肌细胞中均无表达。

将含BssH II和BamHI酶切位点的小鼠SM22α启动子片段与用BamHI和NotI双酶切的人源野生型SIRT1质粒用T4DNA连接酶连接并克隆入含PolyA的载体中，经转感受态大肠杆菌细胞，小提质粒单酶切和联合酶切鉴定并送测序，所得结果在网上经BLAST比对确认克隆的正确并命名为SMC-SIRT1。相关结果见图1。

2.显微注射用质粒DNA的制备与纯化

将正确的SMC-SIRT1质粒经大量制备后，用BssHII酶切50μg质粒DNA，然后将产物于1.0％琼脂糖凝胶电泳，切取5.5Kb条带回收并溶解于2.4mlTE液中。加入3克氯化铯充分溶解后经超速离心后从管底分管接取液体经电泳观察，将含有DNA的管中液体合并，透析后取少量琼脂糖电泳观察质量，紫外分光光度计测定浓度，然后按照1-3ng/μl的浓度稀释供显微注射。

3小鼠的超排卵和取卵

选择4-6周龄(体重12-16克)C57BL/6小鼠作为卵供体母鼠，腹腔注射孕马血清PMS(5U/只鼠)，46-48小时后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素hCG(5U/只鼠)后每只母鼠同一只种鼠(选用C57BL/6与FVB杂交一代的公鼠，8周龄后(体重25克以上)开始使用)合笼，次日晨检查精栓，有精栓的小鼠用于取卵。取有精栓之卵供体鼠，引颈法处死，70％酒精冲洗腹部表皮，剪开腹部皮肤，腹肌和腹膜，暴露腹腔，沿子宫找到卵巢及输卵管，夹住子宫，剥离子宫及卵巢系膜，剪断子宫与输卵管连接处；夹住输卵管，剪断卵巢与输卵管连接处，将输卵管置于M2工作液中。以同样操作剪取对侧输卵管。在解剖显微镜下，以钟表镊撕开输卵管膨大部分的输卵管壁，吸取卵团置于含透明质酸酶的M2培养基中(透明质酸酶浓度为0.3mg/ml)；显微镜下反复吸吹后将卵转移至不含透明质酸酶的M2培养基中，重复洗3-4次。将清洗后的单个卵细胞集中置于M16培养基中，转至37℃二氧化碳孵箱中(5％CO₂)培养待注射。

4.显微注射

将一大滴M2培养液置于注射室中央，上面覆盖矿物油(Sigma公司)。从CO₂孵箱中转移10-30个卵到注射室M2培养基中，将拉制出的注射针虹吸DNA溶液至尖端后，接在显微注射器的正压出口处，调整注射时间为50ms，注射压力为40psi，平衡压力为3-4psi，将注射针在低倍镜监视下插入液滴中；脚踏开关使产生负压，以持卵针开口对准一个受精卵的中部边缘将受精卵吸牢；换至高倍镜使受精卵原核清晰可见，选择较大的雄原核，把注射针头部调整至与原核一个平面上，缓慢插入受精卵透明带、胞膜、胞浆、核膜至核基质中，脚踏微注射器开关，可见核膜明显膨胀，表示DNA溶液已进入核浆，迅速抽出注射针，观察注射后的受精卵是否有明显损伤，用持卵针将注射后的受精卵转移至液滴左下部，即完成一次注射。将注射后仍完好的受精卵移至另一M16培养液中培养待输卵管转移。显微注射后完好的卵在M16培养基中(5％CO₂，37℃)，培养过夜后分裂成两细胞的比例约为60-80％。为避免卵长时间体外培养可能对卵发育产生的损害，一般将注射当天的单细胞受精卵进行输卵管移卵。

5.输卵管移卵

注射后当天的单细胞受精卵或培养至第二天的两细胞受精卵均可用于输卵管移卵。取假孕母鼠称其体重，按0.015ml/g体重给小鼠腹腔注射麻醉剂三溴乙醇(Avertin)水饱和液，3-7分钟麻醉进入平稳期。将鼠腹侧卧位，70％酒精消毒皮肤，用解剖剪剪开一个小口，开口处位于脊柱旁侧1cm，约与最后1根肋骨平齐。用镊子沿切口撕开皮肤肌肉，透过腹膜可见卵巢(桔黄色)和/或脂肪垫(白色)。然后用钟表镊在相当于卵巢上部的腹膜开1个小口。这时应尽可能避开血管以防出血。用外科缝合针在腹膜上穿一根缝合线以便于其后腹膜固定。用无齿镊夹住脂肪垫并带出左侧的卵巢、输卵管与部份子宫，用动脉夹夹住脂肪垫并将其放在鼠背后侧，这样卵巢与输卵管暴露在腹膜外。在解剖镜下，用钟表镊尖端轻轻撕开输卵管开口上部的透明膜，开一小口，尽可能避开血管以防出血模糊视野。将移卵管从开口部插入输卵管，将卵缓慢吹入输卵管，直至第二个气泡进入壶腹部，不能将矿物油一同吹入。将移卵管略停一下再拔出，以防气泡以至卵逸出；去除脂肪夹，将所有组织回位腹腔，缝合肌肉和皮肤切口，等小鼠苏醒后放回动物室饲养。输卵管移卵可在注射当天下午4-6点或次日晨进行。可做单侧或双侧输卵管移卵。

6.转基因鼠的检测

6.1利用PCR鉴定转基因鼠

剪鼠的耳或脚趾于鼠耳消化液中，55℃消化至少4小时，煮沸5-10分钟，室温12,000rpm5分钟，上清即可作为PCR模板。

鼠耳消化液成分：KCl 500mM，Tris-HCl 100Mm，明胶(Sigma G2500)0.1mg/ml，NP-400.45％，Tween20 0.45％，蛋白酶K(临用时加入)0.5mg/ml。

用于鉴定SIRT1的引物：P1：5′-CTTCAGGTCAAGGGATGGTAT-3′(SEQ IDNO：1)，P2：5′-GCGTGTCTATGTTCTGGGTAT-3′(SEQ ID NO：2)。PCR扩增产物长度233bp。

扩增SIRT1的PCR反应条件：94℃5分钟，(94℃20秒，53℃20秒，72℃30秒)30循环，72℃10分钟。

6.2利用Southern杂交鉴定转基因鼠

6.2.1鼠尾基因组DNA的提取

麻醉状态下剪取2-3cm长鼠尾，以微火焰去毛，以消毒过的手术剪沿纵轴剪开鼠尾部皮肤，钳住一头，使皮肤与尾骨剥离。剪碎尾部皮肤组织，置于EP管中，加入530μl DNA抽提缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.4，10mM NaCl，25mM EDTA)、70μl 10％SDS，混匀后，加入40μl蛋白酶K(10mg/ml)，轻轻混匀后，55℃保温过夜。消化完全后，加入70μl 5M NaCl后，用等体积饱和酚抽提去除蛋白，离心去除酚相，将上清转至另一EP管，用650μl酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，离心后将上清再用650μl氯仿∶异戊醇(24∶1)混合液抽提一次，取上清转至另一EP管中，加入等体积异丙醇，轻轻摇动离心管数次，可见丝状基因组DNA出现，静置待沉淀完全；用tip头轻挑起沉淀，转移DNA至新EP管中，用70％乙醇洗沉淀两次，晾干后加150μl TE溶解沉淀过夜。溶解完全后，取适量溶液用0.7％琼脂糖凝胶电泳检查DNA质量，DNA主带应清晰无降解。做适当稀释后，读取OD_260nm值及OD_280nm值，计算DNA浓度。根据所测结果，用TE缓冲液稀释至终浓度1μg/μl，4℃保存。

6.2.2Southern杂交鉴定转基因鼠

取15μg上述提取的鼠尾基因组DNA，在200μl反应体系中用150单位EcoRI酶切24小时(杂交目的片段为2.1kb)。酶切体系的配制要点是充分混匀。取1.5μl在0.8％琼脂糖凝胶上电泳，观察是否完全酶解。如仍有主带，再加入30单位酶切4小时。向酶解样品中加入等体积的酚∶氯仿，混匀10分钟后，12,000rpm离心10分钟，将上清转移到一个新的1.5ml离心管中，加入1/10体积的3M NaAC，两倍体积的乙醇，混匀后-20℃放置2小时，12,000rpm，4℃离心10分钟，弃去上清，用70％乙醇洗涤一次，12,000rpm，4℃离心10分钟，弃去上清。晾干后，加入15μl TE溶解。取1μl稀释到80μl测量OD_260nm值及OD_280nm值，计算DNA浓度。取10μg酶切后的鼠尾基因组DNA，在1％琼脂糖凝胶上于1V/cm条件下电泳，待溴酚兰泳动至距点样孔约12cm处，停止电泳。电泳完毕，EB染色后紫外灯下观察电泳结果，呈现均一的弥散状，拍照后，估计条带所在的位置，切除多余的边缘。凝胶经变性、中和。将胶块倒置于水平玻璃上，胶下有纸桥与20×SSC相连，胶上依次覆盖有尼龙膜、Whatman 3M滤纸、普通新华滤纸或吸水纸及500g重物。室温下转移12-24小时。转移完毕，检查硝酸纤维素膜上及胶上EB染料分布情况，判断转移效率。用滤纸吸去多余水分，室温晾干1小时，选C3程序进行紫外交联。将转移了DNA的尼龙膜在6×SSC中润湿后，放入杂交管中，加入适量的快速杂交液，42℃预杂交40分钟。在等待预杂交的过程中标记探针，标记按照随机引物标记试剂盒提供的说明书操作。探针模板对应于SIRT1 cDNA起始密码子下游160bp-360bp，用PCR产物切胶回收的方法得到。PCR引物序列如下。P3：5′-CCCCAGAGCGTGAGGTGC-3′(SEQ ID NO：3)，P4：5′-CGTACAAGTTGTCGGCCAGC-3′(SEQ ID NO：4)。预杂交结束后加入标记好的探针，继续杂交1.5-2小时。杂交结束后洗膜，放射自显影观察结果。结果如图2所示。

PCR方法研究转基因小鼠中外源基因的遗传规律，发现各株系转基因小鼠后代中外源基因的出现频率接近50％，符合孟德尔遗传规律。

6.2.3转基因鼠胸主动脉SIRT1mRNA水平的过表达。

提取转基因和阴性同窝小鼠胸主动脉中总RNA，进行反转录合成cDNA第一链。cDNA产物各取1μl作为模板，所用引物与鉴定转基因小鼠的引物相同，进行PCR反应。反应产物电泳结果显示转基因动物的胸主动脉样品可以扩增出233bp的阳性条带，与预期结果一致，而阴性同窝鼠样品中检测不到扩增产物，提示SIRT1在转基因动物主动脉的特异性表达。同时使用提取的组织总RNA作为模板，进行同样的PCR反应，转基因组与阴性对照组都没有阳性条带，排除了上述cDNA模板当中基因组DNA污染可能造成的假阳性。将RT-PCR反应的产物测序，结果显示产物序列与SIRT1转基因序列相同，这表明在转基因小鼠主动脉内SIRT1能够表达。结果见图3。

6.2.4用Western-blot鉴定转基因鼠动脉中的SIRT1表达。

取转基因小鼠和阴性同窝小鼠胸主动脉，左颈总动脉匀浆提取蛋白质，用Western blot发现SIRT1在转基因小鼠中的胸主动脉，左颈总动脉均有表达，阴性同窝小鼠没有检测到明显的条带(以下如无特殊说明，SIRT1抗体均来源于美国Santa cruz公司)。结果见图4。

6.2.5免疫组化鉴定转基因鼠动脉中膜中SIRT1的表达。

最后，用免疫组化的方法检测颈总动脉SIRT1的表达，结果显示在阳性转基因小鼠颈总动脉中膜中有棕黄色信号，而阴性同窝对照仅有非常微弱的阳性信号(可能是SIRT1抗体对于内源性SIRT1也有微弱识别能力)，没有加一抗的两组血管作为阴性对照。说明在血管平滑肌细胞实现SIRT1过表达。结果见图5。

实施例2小鼠颈总动脉结扎模型致新生内膜形成

三溴乙醇(30mg/kg-50mg/kg)腹腔注射麻醉12-14周雄性C57BL/6小鼠。仰卧位固定小鼠四肢及头部，使完全暴露颈部，皮肤消毒后行颈上部正中切口。纵向剪开皮肤及肌层，开口约1-1.5cm。用直和弯眼科镊轻轻分开甲状腺，于右下方撕开鞘膜，可见有血流搏动的左颈总动脉。用小号弯头止血钳轻轻挑起左颈总动脉，另一侧用小号弯头止血钳将左颈总动脉和伴行的迷走神经分离，并进一步分离至左颈总动脉分叉处，在接近分叉处用6号手术缝合线正向反向完全结扎左颈总动脉。将甲状腺位置还原，缝合伤口。

左侧颈总动脉结扎0d，14d，28d的转基因阴、阳性小鼠，经腹腔注射麻醉，待麻醉充分后进行整体灌流法原位固定组织器官。颈上部正中切口完全剪开颈部皮毛，纵向剪开皮肤及肌层，用直和弯眼科镊轻轻分开甲状腺，于左、右下方撕开鞘膜，可见已经结扎的左颈总动脉和未结扎的右侧颈总动脉。小号弯头止血钳轻轻挑起左颈总动脉的结扎线或右侧颈总动脉周围组织，小心顺势分离颈总动脉，切勿提拉钳夹损伤动脉，力求反映动脉原貌，做免疫组化的样本取颈总动脉血管分叉(结扎处)至其下0.5cm处至于中性甲醛溶液中固定24h准备石蜡包埋。

用于分析基因表达水平的组织取材不做甲醛固定，只需用灭菌PBS冲洗循环系统中残留的血液，取胸腹主动脉、肺脏、肌、肝、肾、心脏液氮速冻，-80℃保存，用于提取总RNA，作基因表达水平的研究。或提取左颈总动脉总蛋白做目的基因表达水平研究。一根颈总动脉提取的蛋白不足做一次Western blot，故六个样品组每次每组用3根颈总动脉一起提取，其结果反映的是这几根颈总动脉目的基因蛋白表达的平均水平。

经常规的组织切片，HE染色后，新生内膜形成从结扎14天开始动脉管腔内出现新生内膜，到28天动脉管腔内径缩窄近80％并伴有新生内膜的形成，说明造模是成功的。结扎后28天，与野生型鼠相比，SIRT1转基因鼠的新生内膜面积有显著降低。结果见图6。

经照相后选离结扎位置500μm切片用图像分析软件Image pro plus 6.0进行分析，圈定内腔，内弹力膜和外弹力膜后，软件测量出内腔面积，内膜面积以及中膜面积，新生内膜厚度由新生内膜面积与中膜面积之比来表示。其他后续分析均在距离结扎部位500μm范围内进行。分别统计了结扎14天和28天野生型鼠(WT)和SIRT1转基因鼠(SIRT1-Tg)颈总动脉的内膜面积，中膜面积，新生内膜面积与中膜面积比(I/M)以及新生内膜比率(新生内膜面积与总血管面积比)，发现在结扎后14天，与WT鼠相比，SIRT1-Tg鼠的内膜面积，中膜面积，新生内膜面积与中膜面积比以及新生内膜比率没有明显变化。而结扎后28天，与WT鼠相比，SIRT1-Tg鼠的内膜面积，新生内膜面积与中膜面积比以及新生内膜比率都有显著降低(P＜0.01)。其中，SIRT1-Tg鼠的内膜面积仅为WT鼠的46.8％，而新生内膜比率也仅为WT鼠的46.6％。由此可以得出结论，在SIRT1平滑肌特异性转基因鼠中，由颈总动脉结扎所导致的新生内膜形成受到显著抑制。结果见图7。

实施例3转基因鼠中PCNA的表达

作为反映细胞活跃增殖的指标，细胞增殖核抗原(PCNA)被广泛应用。为了进一步验证SIRT1在体内能显著抑制由颈总动脉结扎所导致的新生内膜形成，首先用SIRT1免疫组化染色确证了SIRT1在结扎28天的转基因鼠动脉中层平滑肌中表达，再比较了结扎28天的WT和SIRT1转基因鼠的PCNA免疫组化染色及PCNA染色指数。在平滑肌特异表达SIRT1转基因鼠与WT鼠相比，SIRT1转基因鼠PCNA阳性着色(棕褐色或者棕黄色)细胞数显著减少，内膜PCNA阳性细胞率也显著降低(P＜0.01)。结果见图8。

实施例4转基因鼠中血管细胞外基质的形成

在血管重塑的进程中，细胞外基质(ECM)蛋白如胶原和纤维结合蛋白的沉着也起着至关重要的作用。因此，用Masson染色观察SIRT1平滑肌特异性转基因是否对结扎28天引起的血管重塑有遏制作用。结果发现，在SIRT1转基因鼠中，染成蓝色的胶原纤维较WT鼠明显减少，胶原面积占整个内膜面积比有明显降低(WT：55.2％；Tg：34.6％，P＜0.01)，说明在转基因鼠中，血管细胞外基质形成受到明显抑制。结果见图9。

实施例5与野生型鼠相比，转基因鼠由颈总动脉结扎引起的凋亡细胞数无显著差异

细胞凋亡也参与了颈总动脉结扎引起的血管重塑过程，为此，通过TUNEL染色考察了SIRT1在体内是否通过影响细胞凋亡来抑制血管重塑过程。经统计发现，虽然SIRT1转基因鼠组在内膜中TUNEL阳性细胞数在每1000个细胞和每10000μm2均有降低，但不具有统计学意义。结果见图10。

实施例6SIRT1抑制血管平滑肌细胞的增殖

在小鼠颈总动脉结扎模型中观察到：与野生型鼠相比，平滑肌特异SIRT1转基因鼠能显著抑制新生内膜形成，明显降低PCNA阳性细胞数，显著降低ECM的形成，但是并没有发现细胞凋亡有明显的差异。为进一步考察SIRT1是否在体外也能抑制血管平滑肌细胞增殖并探讨其分子机制，取原代大鼠动脉平滑肌细胞，分别用MOI值为100的腺病毒Ad-GFP和Ad-SIRT1感染12小时后，换无血清DMEM培基饥饿48小时使细胞同步化，再用含10％FBS的DMEM培基培养24小时，分别取0小时和24小时的细胞，采用[³H]-TdR掺入的方法测定10％FBS对VSMC DNA合成的作用。结果显示：10％FBS诱导可以显著增加VSMC的[³H]-TdR掺入量，而过表达SIRT1可使基础状态下和血清刺激24小时VSMC的[³H]-TdR掺入量显著减少(P＜0.01和P＜0.001)。结果见图11。

过表达SIRT1可以抑制10％FBS诱导的VSMC增殖，为此进一步用流式细胞仪检测了过表达SIRT1对VSMC在血清刺激时细胞周期改变的影响。首先分别用MOI值为100的腺病毒Ad-GFP和Ad-SIRT1感染VSMC24小时，然后用无血清DMEM培养基继续培养24小时使细胞同步化。之后换成含10％FBS的DMEM培养基培养，分别在0、4、8、12、16、20、24小时检测细胞周期变化。结果显示，通过血清饥饿法可以很好地使细胞阻滞在G0/G1，通过同步化后，VSMC基本90％以上处于G0/G1期。再重新给予10％FBS刺激后，在最初的4小时内，细胞仍处于G0/G1期。从8小时开始，Ad-GFP组的细胞开始进入S期，G0/G1期细胞减少，而Ad-SIRT1组仍处于G0/G1期。12小时，Ad-GFP组G0/G1期细胞进一步减少，S期细胞明显增多，而Ad-SIRT1组的细胞周期明显落后于Ad-GFP组。20小时后，两者细胞周期进程间的差距开始减小，直到血清作用24小时后，由SIRT1引起的细胞周期阻滞效应才逐渐消失。结果见图12。

利用大鼠平滑肌细胞系A7r5进行上述的细胞周期检测实验，也发现相似的结果，过表达SIRT1能在10％FBS重新刺激饥饿的大鼠平滑肌细胞系A7r512，16，20小时后是细胞阻滞在G0/G1期。结果见图13。

实施例7SIRT1抑制血管平滑肌细胞G1期细胞周期蛋白cyclin D1，cyclin E及CDK2和结扎28天颈总动脉中G1期细胞周期蛋白cyclin D1的表达

过表达SIRT1可以抑制10％FBS诱导的VSMC增殖，并使VSMC阻滞在G1期，因此，用Western blotting检测了G1期相关周期蛋白的变化。发现：过表达SIRT1可以下调G1期重要的相关周期蛋白cyclin D1，cyclin E及CDK2的蛋白表达水平。结果见图14。

为了验证过表达SIRT1可以下调G1期相关周期蛋白cyclin D1，cyclin E及CDK2的蛋白表达水平，用pcDNA3.1和p3.1SIRT1质粒转染平滑肌细胞系A10 24小时后，再无血清培基饥饿24小时，重新换为含10％FBS的DMEM培养基培养，在血清刺激12小时后，也发现过表达SIRT1可以下调G1期相关周期蛋白cyclin D1，cyclin E及CDK2的蛋白表达水平。结果见图15。

利用SIRT1干扰腺病毒感染原代血管平滑肌细胞24小时后，再无血清培基饥饿24小时，在与对照(Ad-U6-vector)相比感染量一致的情况下，换为含10％FBS的DMEM培养基培养，血清刺激12小时，发现干扰掉SIRT1后能够上调cyclin D1的蛋白表达水平，而cyclin E，CDK2的蛋白表达水平变化不大(所用SIRT1抗体来源为Millipore公司的upstate)。结果见图16。

文献报导在大鼠颈总动脉球囊损伤模型中，伴随VSMC增殖，cyclin D1蛋白水平也增高(Slater，Koutsouki et al.2004)。因此，为进一步验证过表达SIRT1是否在体内也能下调cyclin D1的表达水平，利用小鼠颈总动脉结扎模型，用Western blot和免疫组化检测发现：结扎28天后，cyclin D1蛋白表达增高，组化结果显示阳性着色程度明显增强，而动脉血管平滑肌特异的SIRT1转基因鼠与野生型鼠相比，cyclin D1蛋白表达明显降低，并且cyclin D1的阳性着色程度也明显减低。结果见图17。

实施例8SIRT1过表达下调了血管平滑肌细胞中cyclin D1的mRNA水平

进一步在VSMC中观察到，10％FBS可以诱导cyclin D1 mRNA表达水平增高，而SIRT1过表达则抑制了由10％FBS所诱导的cyclin D1 mRNA表达水平增高。用于扩增大鼠cyclin D1 mRNA的引物：P5：5′-GCGAAGTGGAGACCATCCG-3′(SEQ ID NO：5)，P6：5′-GTCCACATCTCGGACGTCG-3′(SEQ ID NO：6)。PCR扩增产物长度860bp。用于扩增大鼠β-肌动蛋白mRNA的引物：P7：5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′(SEQ ID NO：7)，P8：5′-TAGAGCCACCAATCCACACAGAG-3′(SEQ ID NO：8)。PCR扩增产物长度421bp。

结果见图18。

实施例9AP-1介导了SIRT1对cyclin D1表达的抑制作用

之前的研究发现SIRT1抑制cyclin D1 mRNA水平的表达，提示SIRT1可能影响cyclin D1启动子的转录活性。cyclin D1的表达主要受转录水平的调节，多种转录因子与cyclin D1启动子的特异性结合位点结合后启动cyclin D1的转录，其中AP-1(c-Fos，c-Jun)受血清诱导激活，参与细胞增殖调控，同时c-Fos，c-Jun也激活cyclin D1，使细胞越过G1期，进入S期。本发明在HEK293细胞系里发现SIRT1可以通过降低c-Fos/c-Jun的乙酰化水平来抑制AP-1的转录活性，提示SIRT1可能是通过与AP-1的相互作用实现对cyclin D1的调节。因此，构建了含有大鼠cyclin D1启动子区的报告基因(cyclin D1-luc，序列见SEQ ID NO：9，所用引物序列为P9和P10，序列见SEQ ID NO：10-11)，利用荧光素酶报告系统将SIRT1表达质粒和pGL3-cyclinD1-luc(各0.2μg/孔)共转染接种于24孔板的A10血管平滑肌细胞系，与共转染pcDNA3.1和pGL3-cyclin D1-luc的对照相比，SIRT1可以使cyclin D1的启动子活性降低0.4倍(由1.378降为0.833)。c-Fos和c-Jun都分别能激活cyclin D1的启动子活性，与共转染pcDNA3.1和pGL3-cyclin D1-luc的对照相比，c-Fos可以使cyclin D1的启动子活性增高2.21倍(由1.378升为3.047)，c-Jun可以使cyclin D1的启动子活性增高1.9倍(由1.378升为2.625)。而共转了pcDNA-SIRT1后，由c-Fos导致的cyclin D1启动子活性的升高和c-Jun导致的启动子活性的升高均显著降低(分别由3.047降为1.24及由2.625降为1.511)，且有统计学意义。结果见图19和图20。

SIRT1可以下调由c-Fos和c-Jun激活的cyclin D1报告基因活性，提示SIRT1可能通过c-Fos和c-Jun调节cyclin D1的转录。通过预测发现在大鼠cyclin D1启动子区(-903-0)内有两个AP-1结合位点：-818--814(5`-GTCA-3`)及-44--41(5`-GTCA-3`)，分别对包含这两个位点的大鼠cyclin D1报告基因cyclin D1-luc截短，获得缺失-818--814(5`-GTCA-3`)AP-1结合位点的cyclin D1-900-luc(序列见SEQ ID NO：12，所用引物序列为P11和P12，序列见SEQ ID NO：13-14)，以及缺失-818--814(5`-GTCA-3`)及-44--41(5`-GTCA-3`)两个AP-1结合位点的cyclin D1-200-luc(序列见SEQ ID NO：15，所用引物序列为P13和P14，序列见SEQ ID NO：16-17)。利用荧光素酶报告系统发现，缺失-818--814(5`-GTCA-3`)AP-1结合位点的cyclin D1-900-luc，cyclin D1启动子活性有大幅降低，为0.85倍(由1.378降为0.207)，说明AP-1的结合对cyclin D1启动子活性的提高起极其重要的作用，但与pcDNA-SIRT1共转后cyclin D1-900-luc启动子活性仍有0.4倍(由0.207降为0.123)降低；而同时缺失-818--814(5`-GTCA-3`)及-44--41(5`-GTCA-3`)AP-1结合位点的cyclin D1-200-luc，cyclin D1启动子活性降低0.94倍(由1.378降为0.088)，与pcDNA-SIRT1共转后Cyclin D1-200-luc仅有0.1倍(由0.088降为0.078)降低，这说明-44--41(5`-GTCA-3`)AP-1结合位点对于SIRT1调节cyclin D1的启动子活性很重要。为此，进一步将-44--41(5`-GTCA-3`)AP-1的结合位点突变为：5`-GTTG-3`，获得cyclin D1-APm-luc(序列见SEQ ID NO：18，所用引物序列为P15和P16，序列见SEQ ID NO：19-20)。突变了AP-1结合位点后cyclinD1启动子活性仍有大幅降低，为0.79倍(由1.378降为0.29)，与pcDNA-SIRT1共转后cyclin D1-APm-luc仅有0.19倍(由0.29降为0.236)降低，这一结果说明SIRT1对cyclin D1启动子活性的降低效应可以由-44--41(5`-GTCA-3`)AP-1结合位点的缺失而部分消除，提示转录因子AP-1在SIRT1对cyclin D1表达降低的调节中起重要作用，而且-44--41(5`-GTCA-3`)AP-1结合位点对AP-1参与SIRT1对cyclin D1的调节中起着关键作用。结果见图21和图22。

实施例10SIRT1、c-Fos、c-Jun结合在cyclin D1启动子区

研究发现，SIRT1调节基因表达的基本模式是通过结合序列特异的转录因子，从而被募集到特定基因的启动子或增强子上，对该基因进行调控，或者SIRT1可以作为去乙酰化酶直接去乙酰化组蛋白H3、H4(Leibiger and Berggren 2006)(Vaquero，Scher et al.2004)来调节基因表达。上述结果证明转录因子AP-1在SIRT1对cyclin D1表达降低的调节中起重要作用，那么SIRT1是否通过AP-1被募集到cyclin D1的启动子上，从而对其进行调控？通过ChIP实验发现在VSMC中SIRT1可以结合在cyclin D1的启动子区，且与c-Fos/c-Jun有共同的结合区域(图23)。其中普通PCR中扩增包括AP-1结合位点的大鼠cyclin D1启动子序列的引物为：P17：5′GAGGGGGATACCAGAGGACC 3′(SEQ ID NO：21)，P18：5′CCTGGCATGTACTCGCTCAAAA 3′(SEQ ID NO：22)，产物长度409bp；所用实时定量PCR引物为：P19：5′TGCTCCCGAGCCCCCT 3′(SEQ ID NO：23)，P20：5′CCCTGTAGTCCGAGTGACGTTACT 3′(SEQ ID NO：24)，产物长度109bp。

实施例11SIRT1RNAi干扰增加了c-Fos和c-Jun在cyclin D1启动子区的招募

通过ChIP实验还发现，当SIRT1被干扰掉后，c-Fos和c-Jun在cyclin D1启动子区结合增加，提示SIRT1可能影响c-Fos和c-Jun被募集到cyclin D1启动子区。实时定量PCR结果见图24。

参考文献：

Baldin，V.，J.Lukas，M.J.Marcote，M.Pagano & G.Draetta(1993)Cyclin D1 is a nuclear protein required for cell cycle progression in G1.Genes Dev，7，812-21.

Deane NG，Parker MA，Aramandla R，Diehl L，Lee WJ，Washington MK，Nanney LB，Shyr Y，Beauchamp RD(2001)Hepatocellular carcinoma results from chronic cyclin D1 overexpression in transgenic mice.Cancer Res.15；61(14)：5389-95.

Diehl，J.A.，F.Zindy & C.J.Sherr(1997)Inhibition of cyclin D1 phosphorylation on threonine-286 prevents its rapid degradation via the ubiquitin-proteasome pathway.Genes Dev，11，957-72.

Harwell RM，Mull BB，Porter DC，et al(2004)Activation of cyclin-dependent kinase 2 by full length and low molecular weight forms of cyclin E in breast cancer cells.J Biol Chem，279(13)：12695-12705.

Hunter，T.& J.Pines(1994)Cyclins and cancer.II：Cyclin D and CDK inhibitors come of age.Cell，79，573-82.

Koyama，H.，Y.Nishizawa，M.Hosoi，S.Fukumoto，K.Kogawa，A.Shioi & H.Morii(1996)The fumagillin analogue TNP-470 inhibits DNA synthesis of vascular smooth muscle cells stimulated by platelet-derived growth factor and insulin-like growth factor-I.Possible involvement of cyclin-dependent kinase 2.Circ Res，79，757-64.

Koyama，H.，E.W.Raines，K.E.Bornfeldt，J.M.Roberts & R.Ross(1996)Fibrillar collagen inhibits arterial smooth muscle proliferation through regulation of Cdk2 inhibitors.Cell，87，1069-78.

Kozar K，Ciemerych MA，Rebel VI，Shigematsu H，Zagozdzon A，Sicinska E，Geng Y，Yu Q，Bhattacharya S，Bronson RT，Akashi K，Sicinski P.(2004)Mouse development and cell proliferation in the absence of D-cyclins.Cell.118(4)：477-91.

Kronemann，N.，W.A.Nockher，R.Busse & V.B.Schini-Kerth(1999)Growth-inhibitory effect of cyclic GMP-and cyclic AMP-dependent vasodilators on rat vascular smooth muscle cells：effect on cell cycle and cyclin expression.Br J Pharmacol，126，349-57.

Matsushime，H.，M.F.Roussel，R.A.Ashmun & C.J.Sherr(1991)Colony-stimulating factor 1 regulates novel cyclins during the G1 phase of the cell cycle.Cell，65，701-13.

Ohtsubo，M.，A.M.Theodoras，et al.(1995).″Human cyclin E，a nuclear protein essential for the G1-to-Sphase transition.″Mol Cell Biol 15(5)：2612-24.

Quelle，D.E.，R.A.Ashmun，S.A.Shurtleff，J.Y.Kato，D.Bar-Sagi，M.F.Roussel& C.J.Sherr(1993)Overexpression of mouse D-type cyclins accelerates G1 phase in rodent fibroblasts.Genes Dev 7，1559-71.

Rao，G.N.(1999)Differential regulation of p27kipl levels and CDK activities by hyPertrophic and hyperplastic agents in vascular smooth muscle cells.Biochim Biophys Acta，1448，525-32.

Reed JC(1999).Dysregulation of apoptosis in cancer.J Clin Oncol，17(9)：2941-2953.

Schneider，G.，F.Oswald，C.Wahl，F.R.Greten，G.Adler & R.M.Schmid(2002)Cyclosporine inhibits growth through the activating transcription factor/cAMP-responsive element-binding protein binding site in the cyclin D1 promoter.J Biol Chem，277，43599-607.

Sherr CJ(1994).G1 phase progression：cycling on cue.Cell 79：551-555.

Span PN，Tjan-Heijnen VC，Manders P，et a1(2003)Cyclin-E is a strong predictor of endocrine therapy failure in human breast cancer.Oncogene，22(31)：4898-4904.

Tsai，L.H.，E.Lees，B.Faha，E.Harlow & K.Riabowol(1993)The cdk2 kinase is required for the G1-to-S transition in mammalian cells.Oncogene，8，1593-602.

Uto H，Ido A，Moriuchi A，Onaga Y，Nagata K，Onaga M，Tahara Y，Hori T，Hirono S，Hayashi K，Tsubouchi H.(2001)Transduction of antisense cyclin D1 using two-step gene transfer inhibits the growth of rat hepatoma cells.Cancer Res.61(12)：4779-83.

Wang TC，Cardiff RD，Zukerberg L，Lees E，Amold A，Schmidt EV(1994)Mammary hyperplasia and carcinoma in MMTV-cyclin D1 transgenic mice.Nature.369(6482)：669-71.

序列表

<110>中国医学科学院基础医学研究所

<120>SIRT1在制备下调细胞周期蛋白如cyclin D1表达的药物中的用途

<130>890091CG

<160>24

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物P1

<400>1

cttcaggtca agggatggta t                                                          21

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物P2

<400>2

gcgtgtctat gttctgggta t                                                          21

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物P3

<400>3

ccccagagcg tgaggtgc                                                              18

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物P4

<400>4

cgtacaagtt gtcggccagc                                                            20

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<223>引物P5

<400>5

gcgaagtgga gaccatccg                                                             19

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物P6

<400>6

gtccacatct cggacgtcg                                                             19

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物P7

<400>7

gagagggaaa tcgtgcgtga c                                                          21

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物P8

<400>8

tagagccacc aatccacaca gag                                                        23

<210>9

<211>1056

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>大鼠cyclin D1报告基因cyclin D1-luc序列

<400>9

tgcagaacat ttctctatcg ataggtaccg agctcttacg cgtggaggag ggggatacca     60

gaggaccctg gccaggataa accgctgtaa gaaggcaaat ctcagacccc atccccaccc    120

ccaccccacc cccagcgagg aggaatagat gaaggaaata atggccacca tcttgagctg    180

ttgctgagat tttcggggtt ttattttatt ttatttttga gcgagtacat gccaggctgg    240

ggacccttta aagctcaaag atacccctct ggccctttgc aaccacccca gtgcgccagg    300

agggagcctg cacgagaact tagggctcgt ctggcatctt cgcctgttac acagttcctg    360

aattttacac gtgttgatga aattgaaaga agtcgaggac gacgggattt cttagcaatc    420

ggtccgcccg tgggtgccct cgtggcgtcc tcggaaacgc gcccattctc tccgcttaag    480

tatagggtgt ccttgcaccc cccacgatcc ccttccatac attctttctt ggcttgcgtg    540

tggcctggcc tccctcctag ctgtccccct gtccagagcc gccgctaccc caccttcaca    600

ggtctcggag gacccacttg gggaaagaag cccccctccc cattgccctt gccccgctct    660

ttcccagctt agagagaagc agtcccggcg atttgcatat ctacgaaggc cgagggggga    720

gggggcaggc tttgggtttg tcccccccca cccccgccgc tcactgctcc cgagccccct    780

ccccctgcgc ccgcctcggc ccgccccccc tcctttttct ctgcccggct ttgatctctg    840

cttaacaaca gtaacgtcac tcggactaca ggggagtttt gttgaagttg caaagtcctg    900

cagcctccag agggctgttg gcgcagtagc agagagctgc agactccgcg cgctccggag    960

accggtcgta gagcgcgagg cagcgcgcgt cagcagcaga caccggaccc aacccgctcg   1020

agatctgcga tctaagtaag ctggcatccg tacgtg                             1056

<210>10

<211>33

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物P9

<400>10

agtccgacgc gtggaggagg gggataccag agg                                             33

<210>11

<211>31

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物P10

<400>11

agtccgctcg agcgggttgg gtccggtgtc t                                               31

<210>12

<211>972

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>大鼠cyclin D1报告基因cyclin D1-900-luc序列

<400>12

ctgtaagaag gcaaatctca gaccccatcc ccacccccac cccaccccca gcgaggagga     60

atagatgaag gaaataatgg ccaccatctt gagctgttgc tgagattttc ggggttttat    120

tttattttat ttttgagcga gtacatgcca ggctggggac cctttaaagc tcaaagatac    180

ccctctggcc ctttgcaacc accccagtgc gccaggaggg agcctgcacg agaacttagg    240

gctcgtctgg catcttcgcc tgttacacag ttcctgaatt ttacacgtgt tgatgaaatt    300

gaaagaagtc gaggacgacg ggatttctta gcaatcggtc cgcccgtggg tgccctcgtg    360

gcgtcctcgg aaacgcgccc attctctccg cttaagtata gggtgtcctt gcacccccca    420

cgatcccctt ccatacattc tttcttggct tgcgtgtggc ctggcctccc tcctagctgt    480

ccccctgtcc agagccgccg ctaccccacc ttcacaggtc tcggaggacc cacttgggga    540

aagaagcccc cctccccatt gcccttgccc cgctctttcc cagcttagag agaagcagtc    600

ccggcgattt gcatatctac gaaggccgag gggggagggg gcaggctttg ggtttgtccc    660

cccccacccc cgccgctcac tgctcccgag ccccctcccc ctgcgcccgc ctcggcccgc    720

cccccctcct ttttctctgc ccggctttga tctctgctta acaacagtaa cgtcactcgg    780

actacagggg agttttgttg aagttgcaaa gtcctgcagc ctccagaggg ctgttggcgc    840

agtagcagag agctgcagac tccgcgcgct ccggagaccg gtcgtagagc gcgaggcagc    900

gcgcgtcagc agcagacacc ggacccaacc cgctcgagat ctgcgatcta agtaagctgg    960

catccgtacg tg                                                        972

<210>13

<211>37

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物P11

<400>13

agtccgacgc gttaagaagg caaatctcag accccat                                         37

<210>14

<211>31

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物P12

<400>14

agtccgctcg agcgggttgg gtccggtgtc t                                               31

<210>15

<211>197

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>大鼠cyclin D1报告基因cyclin D1-200-luc序列

<400>15

ctcggactac aggggagttt tgttgaagtt gcaaagtcct gcagcctcca gagggctgtt     60

ggcgcagtag cagagagctg cagactccgc gcgctccgga gaccggtcgt agagcgcgag    120

gcagcgcgcg tcagcagcag acaccggacc caacccgctc gagatctgcg atctaagtaa    180

gctggcatcc gtacgtg                                                   197

<210>16

<211>37

<213>人工

<220>

<223>引物P13

<400>16

agtccgacgc gtctcggact acaggggagt tttgttg                                         37

<210>17

<211>31

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物P14

<400>17

agtccgctcg agcgggttgg gtccggtgtc t                                               31

<210>18

<211>1060

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>大鼠cyclin D1报告基因cyclin D1-APm-luc序列

<400>18

tgcagaacat ttctctatcg ataggtaccg agctcttacg cgtggaggag ggggatacca     60

gaggaccctg gccaggataa accggtcact gtaagaaggc aaatctcaga ccccatcccc    120

acccccaccc cacccccagc gaggaggaat agatgaagga aataatggcc accatcttga    180

gctgttgctg agattttcgg ggttttattt tattttattt ttgagcgagt acatgccagg    240

ctggggaccc tttaaagctc aaagataccc ctctggccct ttgcaaccac cccagtgcgc    300

caggagggag cctgcacgag aacttagggc tcgtctggca tcttcgcctg ttacacagtt    360

cctgaatttt acacgtgttg atgaaattga aagaagtcga ggacgacggg atttcttagc    420

aatcggtccg cccgtgggtg ccctcgtggc gtcctcggaa acgcgcccat tctctccgct    480

taagtatagg gtgtccttgc accccccacg atccccttcc atacattctt tcttggcttg    540

cgtgtggcct ggcctccctc ctagctgtcc ccctgtccag agccgccgct accccacctt    600

cacaggtctc ggaggaccca cttggggaaa gaagcccccc tccccattgc ccttgccccg    660

ctctttccca gcttagagag aagcagtccc ggcgatttgc atatctacga aggccgaggg    720

gggagggggc aggctttggg tttgtccccc cccacccccg ccgctcactg ctcccgagcc    780

ccctccccct gcgcccgcct cggcccgccc cccctccttt ttctctgccc ggctttgatc    840

tctgcttaac aacagtaacg ttgctcggac tacaggggag ttttgttgaa gttgcaaagt    900

cctgcagcct ccagagggct gttggcgcag tagcagagag ctgcagactc cgcgcgctcc    960

ggagaccggt cgtagagcgc gaggcagcgc gcgtcagcag cagacaccgg acccaacccg   1020

ctcgagatct gcgatctaag taagctggca tccgtacgtg                         1060

<210>19

<211>50

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物P15

<400>19

tgatctctgc ttaacaacag taacgttgct cggactacag gggagttttg                           50

<210>20

<211>50

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物P16

<400>20

caaaactccc ctgtagtccg agcaacgtta ctgttgttaa gcagagatca                           50

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物P17

<400>21

gagggggata ccagaggacc                                                            20

<210>22

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物P18

<400>22

cctggcatgt actcgctcaa aa                                                         22

<210>23

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物P19

<400>23

tgctcccgag ccccct                                                                16

<210>24

<211>24

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物P20

<400>24

ccctgtagtc cgagtgacgt tact                                                       24

Claims (9)

1.SIRT1在制备下调哺乳动物包括人的细胞周期蛋白表达的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述细胞周期蛋白是cyclin D1、cyclinE或CDK2。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述药物是提纯的蛋白质类型的药物。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述药物的剂型为适于蛋白质药物应用的任何剂型。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述药物的剂型为注射剂。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述药物是表达SIRT1蛋白质的重组核酸构建体。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于所述重组核酸构建体的表达载体是任何适用于基因治疗的表达载体。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于所述表达载体是病毒载体或非病毒载体。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于所述病毒载体选自重组逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体或牛痘苗病毒载体，所述非病毒载体选自噬菌体载体或复制子载体。

Images