JPH08503844A

JPH08503844A - トランスジェニック動物の表皮に遺伝子発現を標的化するベクターの開発

Info

Publication number: JPH08503844A
Application number: JP5519481A
Authority: JP
Inventors: ループ、デニス・アール; ロスナゲル、ジョセフ・エイ; グリーンハル、デイビッド・エイ; ユスパ、スチュアート・エイチ
Original assignee: Baylor College of Medicine; US Department of Health and Human Services
Current assignee: Baylor College of Medicine; US Department of Health and Human Services
Priority date: 1992-04-30
Filing date: 1993-04-28
Publication date: 1996-04-30
Also published as: EP0652948B1; EP0652948A4; EP0652948A1; DE69331144D1; WO1993022430A1; DE69331144T2; AU4220793A; AU672409B2; ATE208814T1; CA2134675A1

Abstract

(57)【要約】表皮に核酸カセットを発現させるためのケラチンＫ１ベクター。このクターは、５’フランキング配列、ケラチンＫ１プロモーター、転写されるが翻訳されない５’領域及び最初のイントロン及びイントロン／エキソン境界を該核酸カセットの発現のための連続性及び位置関係をもってすべて含有するケラチンＫ１遺伝子の５’フランキング領域を含有する。Ｋ１ケラチン遺伝子の３’フランキング領域は、転写されるが翻訳されない３’領域、及び転写終止領域を含有する隣接非コード化ＤＮＡを含有する調節配列を含有する。３’フランキング領域と５’フランキング領域とは核酸カセットを挿入するための種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を有するポリリンカーによって結合されている。核酸カセットは、タンパク質、ポリペプチド又はアンチセンスＲＮＡを発現するために使用できる配列をコードしている。ベクターはインビボ及びex vivoの両者で表皮細胞に挿入できる。さらに、これはトランスジェニック動物又は表皮のバイオリアクターを作成するために使用できる。このベクターは皮膚癌、創傷治癒、外科的切開、乾癬及び癌などの種々の疾患を処置するための遺伝子治療に有用であることが見いだされた。

Description

【発明の詳細な説明】トランスジェニック動物の表皮に遺伝子発現を標的化するベクターの開発本発明は国立衛生研究所（ＮＩＨ）に与えられたＨＤ２５４７９、ＡＩ３０２８３及びＣＡ５２６０７の下、米国政府の許可に部分的に支持されている。さらに、本研究はナショナル・カンサー・インスティチュート、癌病態部門、細胞発癌及び腫瘍促進の研究所、ＮＩＨにて部分的に行われた。政府は本発明について特定の権利を有している。発明の分野本発明はトランスジェニック動物の表皮細胞にポリペプチドを発現させるために使用される発現ベクターに関する。より詳細には、Ｋ１ケラチン遺伝子プロモーター、その５’フランキング領域、転写されるが翻訳されないその５’領域、その最初のイントロン及びイントロン／エキソン境界、転写されるが翻訳されないその３’領域、遺伝子の天然の転写終止領域を含有するその隣接非コード化ＤＮＡ、及びその３’フランキング領域を含有するベクターに関する。発明の背景マウスの生殖細胞系（germline）に遺伝子が安定に導入できることから、ヒト疾患の動物モデルを作成するうえで見通しが大きく開かれた［Palmiter及びBrin ster，Ann.Rev.Genet.，Vol．20，pp．465-499（1986)］。このような動物モデルの必要性は増大しており、それは、ヒトウイルスの発現を抑制し又はヒト疾患を引き起こす突然変異遺伝子の効果を相殺するように精巧に設計された新たな薬剤が開発されていることから明らかである。これらの新規な治療剤の効能評価は現在のところ、インビトロモデルに限定されており、これは供給経路の評価ができず、又はインビボの疾患過程、例えば疾患の進行に対する血液供給、無傷の免疫系、体液性及び細胞性成長制御及び物理的障壁に影響することが知られている他の因子の評価ができない。さらに、ヒト障害を処置するために遺伝子治療を利用できる見込みは現実のものとなりつつある。従って、ヒト疾患の動物モデルはこれらのアプローチの治療潜在力を評価するうえで有用であろう。表皮は他の扁平上皮のための一般的モデルとして役立ち、またそのアクセスの容易性から病態現象の顕微鏡観察及び治療潜在力を評価することができるので、その表皮は動物モデルの開発のための魅力的な組織である。トランスジェニック動物の表皮に対する遺伝子発現に特異的に標的化するベクターの開発が本発明の対象である。表皮は継続して再生する層状の扁平上皮である。分化した上皮細胞は基底細胞層に位置する増殖性細胞の後代（子孫）であり、ゆっくりとサイクルする自己更生（セルフ−リニュウ）性の幹細胞、増殖性であるが更生しない通過増幅細胞、及び有糸分裂後に成熟する表皮細胞、から構成される増殖単位で再生プロセスが起こることを示す実質的な証拠が存在する［Iversenら，Cell Tissue Kinet.，V ol．1.，pp．351-367（1968）；MacKenzieら，Nature，Vol．226，pp．653-655 （1970）；Christophersら，J．Invest．Dermatol.，Vol．56，pp．165-170（19 71）；Potten，In Stem Cells：Their Identification and Characterization， pp．200-232（1983）；Cotsarelisら，Cell，Vol．61，pp．1329-1337（1990）］。成熟過程（ターミナル分化）は、表皮細胞が細胞周期から外れ、基底層から有輔層に移行する時に開始される。有棘層が顆粒層に移行し、角質層が形成されて終了するように、成熟は続行される。形態学的及び生化学的研究により、ターミナル分化は段階的に起こることが示された。［Matoltsy，J．Invest．Dermato l.，Vol．65，pp．127-142（1975)］。ケラチンＫ５及びＫ１４は基底表皮細胞の主要な産物である［Woodcock-Mitchellら，J．Cell Biol.，Vol．95，pp．580 -588（1982)］。１０nmフィラメント（介在性フィラメント［ＩＦ］）に組み立てられるこれらのタンパク質は微小管（チューブリン）及び微小フィラメント（アクチン）と共に、表皮細胞の細胞骨格を形成している［Steinert，P．M．ら， Cell，Vol．42，pp．411-419（1985)］。分化及び有輔層への移行に対するコミットメントに関連する最近の変化のひとつは他のケラチンの分化−特異的な対（Ｋ１及びＫ１０）の誘導である。Ｋ１及びＫ１０を含有するＩＦは有輔層細胞の主要な産物としてＫ５及びＫ１４を含有するものと換わる［Woodcock-Mitchellら，J．Cell Biol.，Vol．95，pp．580-588（ 1982）；Roopら，Proc．Natl．Acad．Sci.，U．S．A．Vol．80．pp．716-720（1 983）；Schweizerら，Cell，Vol．37，pp．159-170（1984)］。顆粒層では、他の高分子量である非ＩＦタンパク質が合成され、それはフィラグリン（filaggri n）にプロセッシングされ、ケラチンフィラメントの凝集及びジスルフィド結合の形成を促進すると考えられる［Dale，B．A．ら，Nature，Vol．276，pp．729- 731（1978）；Harding，C．R．ら，J．Mol．Biol.，Vol．170，pp．651-673（19 83)］。表皮細胞成熟の最終段階では、トランスグルタミナーゼが（γ−グルタミル）リジン・イソペプチドの形成によってインボラクリン（involucrin）及びロリクリン（loricrin）の架橋を触媒し、原形質膜の真下に位置する角質化した難溶性のエンベロープとなる［Rice及びGreen，Cell Vol．II，pp．417-422（19 77）Mehrelら，Cell Vol．61，pp．1103-1112（1990)］。表皮細胞に発現される主要なケラチンをコードする遺伝子又はｃＤＮＡはクローンされている：Ｋ５［Lerschら，Mol．and Cell Biol.，Vol．8，pp．486-493 （1988)］、Ｋ１４［Marchukら，Proc．Natl．Acad．Sci.，U．S．A.，Vol．82 ，pp．1609-1613（1985）；Knappら，J．Biol．Chem，Vol．262，pp．938-945（ 1987）；Roopら，Cancer Res.，Vol．48，pp．3245-3252（1988)］、Ｋ１［Stei nertら，J．Biol．Chem，Vol．260，pp．7142-7149（1985)］、及びＫ１０［Kri egら，J．Biol．Chem，Vol．260，pp．5867−5870（1985)］。ノーザン・ブロット分析及びin situハイブリダイゼーション研究により、増殖している基底層ではケラチン遺伝子Ｋ５及びＫ１４が主として転写され、ケラチン遺伝子Ｋ１及びＫ１０の転写は有輔層への細胞移行として誘導されることが示された［Lerschら，Mol．and Cell Biol.，Vol．8，pp．486-493（1988）；Knappら，J．Biol．Ch em，Vol．262，pp．938-945（1987）；Roopら，Cancer Res.，Vol．48，pp．324 5-3252（1988)］。ラット［Haydockら，J．Biol．Chem，Vol．261，pp．12520-1 2525（1986）］及びマウス［Rothnagelら，J．Biol．Chem，Vol．262，pp．1564 3-15648（1987）］フィラグリンをコードする遺伝子は現在、同定されており、i n situハイブリダイゼーション実験によって、この遺伝子の転写は顆粒層に限定されることが確かめられている［Rothnagelら，J．Biol．Chem，Vol．262，pp． 15643-15648（1987）；Fischerら，J．Invest．Dermatol.，Vol．88，pp．661-6 64（1 987)］。現在までのところ、ロリクリンが、in situハイブリダイゼーションによって分子レベルで研究されている角質化エンベロープの成分をコードする唯一の遺伝子であり、この遺伝子の転写体は顆粒層に限定されている［Mehrel，ら， Cell，Vol．61，pp．1103-1112（1990)］。表皮における遺伝子発現の説明から、表皮に標的化するために選択される多くの候補遺伝子が明らかになると思われる。しかし、これは当て嵌まらない。表皮の増殖コンパートメントに発現されるケラチンＫ５及びＫ１４は表皮ばかりでなく、すべての扁平上皮にて発現される。さらに、これらの遺伝子は発育の初期に発現されるが［Dala及びHolbrook，In：Current Topics in Developmental Biol ogy，pp．127-155（1987)］、これは子宮内における致死の原因となり得る。癌及び乾癬などの過増殖性疾患の動物モデルを作成するには、増殖能力を有する細胞における基底コンパートメントでの発現が必要となる可能性が最も高いため、有糸分裂後に発現される遺伝子、例えばケラチンＫ１及びＫ１０、並びにフィラグリン及び細胞エンベロープの成分（インボルクリン及びロリクリン）をコードするものはこの基本から排除されよう。しかし、本発明により、ヒトケラチン遺伝子Ｋ１（ＨＫ１）の１２kb断片がトランスジェニック・マウスにおける組織及び発育特異的な発現を調節する配列を含有していることが証明された。この断片は、表皮の基底細胞コンパートメントのある種の細胞におけるＨＫ１遺伝子の発現を導く分化特異的な発現の負の制御に関与する配列を欠いている。ＨＫ１遺伝子の調節要素は内生マウスＫ１遺伝子の発現パターンを完全には模擬できないが、以下の理由から遺伝子発現を標的化するのに理論的に適している：（１）発現は表皮のみで起こり、他の扁平上皮では起こらない；（２）発現は発育の後期段階（１５日）で起こるので、子宮内における致死をもたらさないと考えられる；（３）発現は増殖能を有する大きな比率の基底細胞にて起こる。発明の概要本発明は表皮にて核酸配列を発現するためのケラチンＫ１を目的とする。本発明のさらなる目的は、腫瘍遺伝子を含有するケラチンＫ１ベクターである。また、本発明の別の目的は、形質導入された表皮細胞にてタンパク質、ポリペプチド及びアンチセンスＲＮＡを調製するためのバイオリアクターである。また、本発明は表皮細胞にケラチンＫ１ベクターを形質導入するためのインビボ方法を目的とする。さらに、本発明はケラチンＫ１表皮ベクターを含有するトランスジェニック動物を提供する。また、本発明は癌を研究するためのトランスジェニック動物を提供する。また、本発明はヒフ潰瘍を処置する方法に関する。また、本発明は創傷治癒又は外科的切開を治癒させる増強方法に関する。また、本発明は乾癬を処置する方法に関する。また、本発明はヒフ癌を処置する方法に関する。さらに、本発明はケラチンＫ１表皮ベクターを使用するワクチン接種（予防接種）法に関する。このように、上記の多くの目的を達成するに当たり、本発明は１つの態様として、以下のケラチンＫ１ベクターを提供する：表皮にて核酸カセットを発現するためのケラチンＫ１ベクターであって、ケラチンＫ１プロモーター、転写されるが翻訳されない５’領域、及び最初のイントロン及びイントロン／エキソン境界を核酸カセットの発現のための連続性（配列）及び位置関係にそのすべてを含有する５’フランキング配列であるケラチンＫ１遺伝子の５’フランキング領域；調節配列を含有するケラチンＫ１遺伝子の３’フランキング領域であって、転写されるが翻訳されない３’領域、及び転写終止領域を含有する隣接非コード化ＤＮＡを含有する３’フランキング領域；並びに５’フランキング領域と３’フランキング隣接とを結ぶ、種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を有するポリリンカーであって核酸カセットを挿入するための位置をさらに提供するポリリンカー、を含有するベクター。本発明の特定の態様として、ケラチンＫ１ベクターは約１．２kbの５’フランキング領域及び約３．９kbの３’フランキング領域を有する。本発明の別の態様では、１８kb Ｅco ＲＶ断片由来の５’フランキング配列約８．０kbが上記のベクターの末端に付加されたものを提供する。別の態様では、ヒトＫ１ケラチン遺伝子内にビタミンＤ₃調節要素を同定し、それをケラチンＫ１ベクターの発現を抑制するために利用する。本発明の特定の態様では、ケラチンＫ１ベクターを表皮細胞の形質導入に使用し、バイオリアクターを作成する。このバイオリアクターにより、種々のタンパク質、ポリペプチド及びＲＮＡ群が調製される。さらに、このベクターはトランスジェニック動物を作成するためにも使用できる。トランスジェニック動物は癌、薬物反応及び処置の研究に使用することができる。ケラチンＫ１ベクターはまた、種々の疾患、例えば創傷、外科的切開、乾癬、ヒト潰瘍及びヒト癌を処置するために使用することができ、またワクチンを調製するためにも使用できる。現在の好ましい本発明の態様を説明する以下の記載から、本発明のさらなる目的、特徴及び利点は明らかであろうが、これらは添付の図面と共に開示を目的として記載するものに過ぎない。図面の簡単な説明第１図は、ヒトケラチンＫ１遺伝子（ＨＫ１）及びその調節配列から誘導される発現ベクターの模式図である。第２図は、大腸菌（Ｅ．coli）β−ガラクトシダーゼをコードするレポーター遺伝子を利用する、トランスジェニックマウスにおけるＨＫ１ベクターのインビボ発現の特性を示している。第３図は、ビタミンＤ₃の存在下、ＨＫ１遺伝子（ＨＫ１．ＮＲＥ）由来の新規な負の調節要素によるＳＶ４０プロモーターの抑制を示している。第４図は、Harveyネズミ肉腫ウイルスのｖ−ｒａｓ^Haタンパク質のコード化配列を含有するＨＫ１ベクターの模式図である。第５図は、ＦＢＪ／ＦＢＲキメラプラスミド由来のｖ−ｆｏｓタンパク質のコード化配列を含有するＨＫ１ベクターの模式図である。第６図は、ヒトポピローマウイルス１８由来のＥ６及びＥ７タンパク質のコード化配列を含有するＨＫ１発現ベクターの模式図である。第７図は、ＴＧＦ−αのコード化配列を含有するＨＫ１ベクターの模式図である。第８図は、ヒト免疫不全ウイルス由来のトランス調節タンパク質ｔａｔのコード化配列を含有するＨＫ１ベクターの模式図である。第９図は、ＨＫ１遺伝子を含有する１８kb Ｅco ＲＶ断片の模式図である。第１０図は、分化した表皮細胞に発現を制限させる付加的な５’フランキング配列を含有するＨＫ１ベクターの誘導体の模式図である。図面は必ずしも一定の比率で描いているわけでなく、本発明の特徴を大きさの点で誇張している場合があり、明瞭さ及び簡潔さの観点から図を示している。発明の詳しい説明本明細書に開示している発明には本発明の範囲及び精神を逸脱することなく、種々の置換及び修飾を施すことのできることは当業者には容易に理解されよう。本明細書に使用している「形質転換（された）」なる用語は、遺伝子移動の機序によって細胞の特性（発現される表現型）に変化を誘導する方法及びメカニズムを意味し、それによりＤＡＮが細胞に導入されるとその細胞は特定の遺伝子産物を発現し、又は内生遺伝子産物の発現を変化させる形態になる。本明細書に使用している「形質導入」なる用語は、ＤＮＡ発現ベクターを細胞に導入する方法を意味する。種々の形質導入の方法が可能であり、例えばマイクロインジェクション、ＣａＰＯ₄、リポフェクション（ライソゾーム融合）、遺伝子銃及びＤＮＡベクター運搬体の使用などである。ヒトケラチンＫ１ベクターは上記の種々の方法によって表皮細胞に形質導入することができる。本明細書に使用している「ＤＮＡベクター運搬体」なる用語は、ＤＮＡベクターに結合し、そして表皮細胞に取り込まれ得る分子を意味する。ＤＮＡ運搬体はＤＮＡと非共有結合的に結合できる分子複合体であり、細胞膜を介してＤＮＡを運搬することができる。必ずしも必須でないが、その運搬体は核膜を介してもＤＮＡを運搬するものが好ましい。一時的トランスフェクション、一時的形質導入、又は一時的に形質転換するという語句に関連して使用している「一時的」なる用語は、表皮細胞に遺伝子を導入し、特定のタンパク質、ポリペプチド、及びＲＮＡを発現させるが、導入された遺伝子は宿主細胞のゲノムに組み込まれないので一定期間の後には細胞から排除されることを意味する。一時的発現は一時的トランスフェクションの際の遺伝子産物の発現に関連する。さらに、一時的とは細胞への安定なトランスフェクション又は形質導入を意味し、そこでは細胞は死滅しヒフから抜け落ちる。従って、形質転換細胞は導入遺伝子の発現のために一時的に利用可能であるのみである。安定なトランスフェクション、安定な形質導入又は安定に形質転換された、にて使用している「安定」なる用語は、標的細胞の染色体への遺伝子の導入であって、その遺伝子が組み込まれ、その細胞内の遺伝子材料の永久的な成分になることを意味する。安定な形質導入後の遺伝子発現は永久的に細胞の特性を改変し、安定な形質転換を導くことができる。エピソーム形質転換は、導入遺伝子が宿主細胞染色体に組み込まれず、むしろ染色体外要素として複製する、安定な形質転換の変異である。これにより、明らかに安定な細胞の形質転換特性を導くことができる。上記のように、ヒフを介して体から抜け落ちる表皮細胞では、安定な形質転換が、細胞が喪失するので一時的な形質転換になる場合がある。本明細書にて使用している「核酸カセット」なる用語は、表皮細胞に組込むことのできるタンパク質、ポリペプチド又はＲＮＡを発現できる目的の遺伝子材料を意味する。核酸カセットはケラチンＫ１ベクター内に位置的かつ配列的に配向させ、カセット内の核酸がＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡに転写され、要すれば形質転換表皮細胞にてタンパク質又はポリペプチドに翻訳され得るようにする。その核酸カセット内の配列に基づき、種々のタンパク質及びポリペプチドが形質転換表皮細胞にて発現され得る。これらの発現され得るタンパク質又はポリペプチドにはホルモン、成長因子、酵素、凝固因子、アポリポタンパク質、レセプター、薬物、腫瘍抗原、ウイルス抗原、寄生虫抗原、細菌抗原及び腫瘍遺伝子などがある。これらの化合物を具体的に例示すれば、プロインスリン、インスリン、成長ホルモン、インスリン様成長因子Ｉ、インスリン様成長因子ＩＩ、インスリン成長因子結合タンパク質、表皮成長因子、ＴＧＦ−α、皮膚成長因子ＰＤＧＦ、血管形成因子、例えば酸フィブロブラスト（線維芽細胞）及び塩基性フィブロブラスト成長因子及びアンジオゲニン、マトリックスタンパク質、例えばＩＶ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲン、ラミニン（laminin）、ニドゲン（nidogen）、及びウイルス、細菌及び寄生虫由来の免疫応答を誘起させるのに使用できるタンパク質、などを挙げることができる。さらに、核酸カセットは、ウイルス腫瘍遺伝子、内生プロト腫瘍遺伝子及び活性化プロト腫瘍遺伝子を包含する「トランスフォーミング遺伝子」をコードすることができる。「腫瘍遺伝子」なる用語は、癌の原因となる遺伝子を意味し、これにはウイルス性及び細胞性腫瘍遺伝子の両者が包含され、その多くは齧歯類及び／又はヒトにとって内生のＤＮＡ配列と相同的である。腫瘍遺伝子なる用語には、ウイルス配列及びその相同的内生配列の両者が包含される。トランスフォーミング遺伝子の幾つかの例を以下の第１表に列記する：ケラチンＫ１ベクターを使用して表皮細胞に組込まれる遺伝子材料には、表皮細胞に通常は見いだされないＤＮＡ、表皮細胞に通常に見いだされるが物理的に有意なレベルでは発現されないＤＮＡ、表皮細胞に通常に見いだされ物理的に望ましいレベルで通常発現されるＤＮＡ、表皮細胞に発現するよう修飾できる他のＤＮＡ、及びこれらの組合わせ体などが包含される。本明細書にて使用している「ケラチンＫ１ベクター」又は「ＨＫ１ベクター」なる用語は、核酸配列を表皮細胞にて発現させるのに有用であるベクター意味する。ケラチンＫ１ベクターは、プロモーター、最初のイントロン及びイントロン／エキソン境界が核酸カセットが発現される配列及び位置関係でそのすべてを包含するケラチンＫ１遺伝子の５’フランキング領域：ケラチンＫ１遺伝子の３’ フランキング配列；及びポリリンカー、が包含される。ポリリンカーは種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を包含している。このポリリンカーは５’フランキング領域と３’フランキング配列とをつなぐものであり、さらに核酸カセットの挿入位置を提供している。ヒトケラチンＫ１遺伝子の３’フランキング領域の配列は調節要素を含有しており、これはケラチンＫ１ベクターの調製に使用される。これは配列番号１に示す。ケラチンＫ１ベクターは、配列番号１の１から１２４６ヌクレオチドからなる５’フランキング領域を有している；調節配列を含有する３’フランキング配列は配列番号１の６８９１から１０７４７ヌクレオチドからなる；及びポリリンカーは配列番号２の２３５１から２３７６ヌクレオチドからなる［ＨＫ１発現ベクター］。ケラチンＫ１ベクターは約１．２kbの５’フランキング領域、約１．０kbのイントロン及びイントロン／エキソン境界、及び約３．９kbの３’フランキング配列を有している。ケラチンＫ１ベクターのリンカー及びポリリンカー内に見いだされる制限エンドヌクレアーゼ部位は、核酸カセットの挿入を許す制限エンドヌクレアーゼであればよい。好ましい態様では、それらは通常、ＢamＨＩ、ＫpnＩ、ＣlaＩ、Ｎot Ｉ、ＸmaＩ及びＢglIIからなる群の中から選択される。表皮細胞にケラチンＫ１ベクターを導入する方法が種々あることは当業者ならば、容易に理解できよう。ベクターはインビボ又はエクスビボ（ex vivo）のいずれによっても導入することができる。挿入の態様はある程度、挿入のために利用できる方法を決定する。インビボ挿入は遺伝子治療にとって好ましい。この操作では、表皮細胞を形質転換するに充分な時間、ヒトケラチンＫ１ベクターを表皮細胞に接触させる。本発明の１つの態様にはバイオリアクターが包含される。バイオリアクターは、ケラチンＫ１ベクターを含有する形質転換された表皮細胞を含む。ベクターを表皮細胞に挿入すれば、表皮細胞は核酸カセットを発現し、目的のタンパク質、ポリペプチド又はアンチセンスＲＮＡを産生する。これはインビボ又はex vivo のいずれによっても行うことができる。核酸カセットにコードされ、それによって発現され得る化合物はバイオリアクターによって製造することができる。ケラチンＫ１ベクターを表皮細胞にex vivo導入するための１つの方法には、選択マーカーを有するベクターの同時トランスフェクションが包含される。選択マーカーは、形質転換された細胞を選択するために使用する。次いで、本明細書に記載のいずれかの方法によって細胞を使用することができる。本発明の別の態様は、トランスジェニック動物を作成するための方法であって、ヒトケラチンＫ１ベクターを動物の胚に挿入する工程を包含する方法である。トランスジェニック動物には、そのベクターが胚又はあらゆる子孫に挿入されている得られる動物が包含され得る。本明細書にて使用している子孫なる用語は、トランスジェニック動物の直接の子孫、及び継承する子孫のあらゆる子孫を包含する意である。従って、当業者ならば、核酸カセットが異なる遺伝子を使用して２つの異なるトランスジェニック動物を作成したなら、得られる子孫の中には２つ又はそれ以上の導入配列を含有するものがあることは容易に理解されよう。当業者ならば、交尾の制御によって多重ベクターを有するトランスジェニック動物が作成できることは容易に認識できよう。ヒトケラチンＫ１ベクターをその胚芽及び体細胞に含有しているトランスジェニック動物では、そのベクターの核酸カセットは表皮細胞でしか発現されない。これは、組織の配列の発現をそれほど制御できない他のトランスジェニック動物モデルと比較して顕著な利点である。好ましい態様では、トランスジェニック動物は核酸カセット内に腫瘍遺伝子配列を含有する。好ましくは、動物は齧歯類である。トランスジェニック動物は、癌の起源、癌の処置、環境と癌との相互作用、並びに薬物、医薬及び他の化学相互作用を目的とする種々の疾患を研究するための方法に使用することができる。トランスジェニック動物は動物のヒフ細胞を使用できるあらゆる検定に有用である。本発明の特定の１つの態様は、創傷又は外科的切開の治癒を増強させる方法である。この方法は、ケラチンＫ１ベクターで表皮細胞をインビボ形質導入することを特徴とする。このベクターの核酸カセットは成長因子の核酸配列を含有している。創傷又は外科的切開を処置するための好ましい態様では、多くのベクターを表皮細胞に導入することである。この多くのベクターでは、少なくとも１つのベクターのカセットは表皮成長因子（ＴＧＦ−α）の核酸配列を含有し、少なくとも１つのベクターのカセットは皮膚成長因子（ＰＤＧＦ）を含有し、少なくとも１つのベクターのカセットは表皮を真皮にアンカーするためのマトリックスタンパク質の核酸配列を含有し、そして少なくとも１つのベクターのカセットは血管形成因子の核酸配列を含有する。マトリックスタンパク質の配列は、表皮を真皮にアンカーするために有用な配列から選択することができるが、通常は、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ニドゲン（nidogen）、及びＶＩＩ型コラーゲンからなる群の中から選択される。ベクターの組合わせにより、創傷又は外科的切開を早急かつ迅速に治癒させる増強のために必須の要素すべてを提供することができる。この操作は形成外科又は再建外科の場合、非常に有用である。さらに、ヒフ潰瘍は、以下の創傷治癒又は外科的切開に関して記載している以下の類似の操作によって処置することができる。これらの創傷、外科的切開及びヒフ潰瘍を治癒するための操作は動物及びヒトに有用である。創傷、外科的切開及びヒフ損傷を処置し又は治癒させるためのex vivoアプローチでは、まずベクターを表皮細胞にex vivo導入する。この形質転換した表皮細胞を、処置する動物又はヒトに移植する。本発明の他の態様は乾癖を処置する方法である。この方法では、表皮細胞をケラチンＫ１ベクターでインビボ形質導入する。該ベクター内の核酸カセットはＴＧＦ−β、サイトカインレセプターの可溶性形態及びアンチセンスＲＮＡからなる群から選ばれるタンパク質又はポリペプチドの核酸配列を含有している。サイトカインレセプターはＩＬ−１、ＩＬ−６及びＩＬ−８からなる群から選ぶことができる。アンチセンスＲＮＡ配列はＴＧＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６及びＩＬ −８からなる群から選ばれる。本発明のもう１つの態様は、ヒト癌を処置する方法である。この方法は、表皮細胞をケラチンＫ１ベクターでインビボ形質導入する工程を包含する。いずれかのベクターの核酸カセットは、ヒトパピローマウイルスのＥ６又はＥ７遺伝子のアンチセンスＲＮＡをコードする核酸配列、又は正常なｐ５３タンパク質をコードする核酸配列を含有している。ケラチンＫ１ベクターは３’フランキング配列内に、ビタミンＤ₃によって抑制することのできる新規な負の調節要素を含有している。ベクター内のビタミンＤ₃調節要素を用いれば、動物及びヒトに普通に使用される物質であるビタミンＤによって核酸カセットの発現を調節できる。ヒトケラチンＫ１ベクターは、１８kb Ｅco ＲＶ断片由来の付加的な５’フランキング配列をその５’末端に挿入することによっても修飾することができる［配列番号３の６０９０から１４１８０ヌクレオチド］。これらの配列を付加すれば、ヒトケラチンＫ１ベクターを内生Ｋ１遺伝子と全くおなじように発現させることができ、即ちターミナル分化に傾倒した細胞にて有糸分裂後に発現させることができる。これらの細胞は死亡するようにプログラムされ、結局、環境下に抜け落ちるので、これは細胞内にて一時的に発現させるための他の方法である。本発明の他の態様はケラチンＫ１ベクターを表皮細胞にインビボ形質導入する工程を包含するワクチン接種の方法である。ベクター内の核酸カセットは通常、免疫学的応答を誘導するポリペプチドをコードしている。この例はヒトパピローマウイルス由来のウイルスキャプシドである。当業者ならば、他の種々のタンパク質を使用して、免疫応答を生成させ、従ってワクチン接種用の抗体を生産できることは容易に理解されよう。本発明を説明するために以下に実施例を記載するが、これはいかなる意味においても本発明の限定を意図するものでない。実施例１ＨＫ１遺伝子由来のベクターの構築及び特性化内生ＤＮＡの発現を表皮に標的化させるため、ヒトケラチンＫ１遺伝子からベクターを構築した。その多くの用途の中には、トランスジェニック動物を作成するのに有用なものがある。ヒトケラチンＫ１遺伝子の構造を第１図に模式図として表す。全ヒトケラチンＫ１遺伝子を含有する１２kb ＥcoＲＩ断片をλクローンｃ５５から始めに単離した［Johnsonら，PNAS，USA，Vol．82，pp．1896-1900（1985）］。標的化（ターゲッティング）ベクターを構築するに当たり、ＡＴＧを含有する最初のエキソンの殆どを取り出し、５’非コード化配列、最初のイントロン及びイントロン− エキソン境界のみを残した。さらに、終止コドンまでの遺伝子の残りを除去した。以下の唯一の制限部位（ＢamＨＩ、ＸmaＩ、ＫpnＩ、ＮotＩ及びＣlaＩ）を含有するポリリンカーを最初のイントロンの３’部位内に操作し、内生ＤＮＡの挿入を容易にした。これらの操作はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによって行った。唯一のＥcoＲＩ部位はベクターの末端に保存し、ｐＧＥＭベクター内にて容易に増幅できるようにし、胚に注射する前にプラスミド配列から精製のために切除できるようにした。この方法によってベクターを構築できる原理は次の通りである。１２kbヒトケラチンＫ１断片の発現特性に関与する特定の要素は規定しなかったので、全５’ 及び３’フランキング領域をベクター構築物中に含ませた。当業者ならば、これらの要素をさらに規定し、フランキング配列をそれに従って変化させることのできることは容易に理解されよう。さらに、３’非コード化領域内の配列は表皮細胞における内生ＤＮＡの転写体に対する安定性を確実にできるので、その配列は保持させた。最初のイントロンは保持させ、発現効能を向上させ得るようにした［Brinsterら，PNAS，USA，Vil．82，pp．1896-1900（1988)］。実施例２表皮ケラチノサイトにおけるＨＫ１発現ヒトケラチンＫ１標的化ベクターを表皮ケラチノサイトにおける専属的な発現に関して評価するため、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を発現ベクターのポリリンカー領域内に位置するＢamＨＩ及びＣlaＩ制限部位にクローンした（第１図）。β−ガラクトシダーゼ遺伝子は標的化の特異性を評価するためのレポーター遺伝子として頻繁に使用されている［MacGregorら，In：Methods in Mole cular Biology Vol．7，pp．217-235（1991)］。この構築物をｐＨＫ１．β−ガルと命名した。この構築物の発現が機能的タンパク質を産生するか否か、及びベクターが細胞タイプ特異性を保持しているか否かを決定するため、この構築物を初代表皮ケラチノサイト及び初代表皮フィブロブラストにトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に、基質、５−ブロモ−４−クロロ−３− インドリル−β−ガラクトシダーゼ（Ｘガル）を含有する溶液で染色した。β− ガラクトシダーゼ活性は青呈色によって示されるが、これはケラチノサイトにて検出され、フィブロブラストには検出されなかった。従って、ＨＫ１．β−ガル構築物の発現は細胞タイプ特異的であり、機能的タンパク質が産生された。実施例３トランスジーン・マウス実施例２に述べているインビトロ試験に利用した同じｐＨＫ１．β−ガル構築物をトランスジェニックマウスの作成に使用した。この構築物をＥcoＲＩで消化し（第１図参照）、調製用アガロースゲル電気泳動にかけ、発現を妨害しかねないプラスミド配列（ｐＧＥＭ３）からｐＨＫ１．β−ガル発現構築物を分離精製した。分離した発現構築物配列を精製し、ＮＡ４５ＤＥＡＥ膜［Schleicher & S chuell］を使用して回収した。ＤＮＡを沈降させ、１−３ｎｇ／μｌに再懸濁した。異系交配したＩＣＲ雌性マウス［Sasco］にＰＭＳ及びＨＣＧを与えて過剰排卵を剌激し、ＦＶＢ雄性マウス［Taconic］と交尾させ、得られた輸卵管から初期受精胚（最も好ましくは細胞段階）を採取した。ＤＮＡを生殖核にマイクロインジェクトし、偽妊娠した受容体である雌性マウス（精管除去したＢ₆Ｄ₂Ｆ₁ 雄性マウス（Taconic）と交尾させたＩＣＲ雌性マウスの結果）に胚を外科的に移した。初期の実験では、４０匹のマウスが産まれた。ｐＨＫ１．β−ガルのトランスジーン（transgene）がこれらのマウスの表皮に専属的に発現されているか否かを迅速に決定するため、出生時にこれらの動物を殺した。少量の組織を取り出してＤＮＡを抽出し、残りの新生児をTissue-Tek Ｏ．Ｃ．Ｔ．中にて迅速に凍結し、凍結切片とした。ＨＫ１ベクター内のイントロンに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、抽出したＤＮＡについてＰＣＲ分析を行い、それにより、４０匹の新生児のうち５匹がＨＫ１．β−ガル構築物を含有していることが証明された。ＨＫ１β−ガル構築物の発現が表皮に限定されているか、又は他の扁平上皮でも発現されているかを評価するため、凍結した縦軸切片を幾つかのＰＣＲ陽性及びＰＣＲ陰性の包埋した新生児から切断し、それらをＸ−ガルで染色した。典型的な結果を第２図に示す。ここでは、ＰＣＲ陽性動物＃３０が表皮にてβ−ガラクトシダーゼを高いレベルで発現し（第２Ａ図）、またＰＣＲ陰性の兄弟＃２９は完全に陰性であったが（第２Ｂ図）、このことは内生ネズミβ−ガラクトシダーゼが充分なレベルで表皮に発現されておらず、この検定の偽陽性の原因となったことを示している。陽性（＃３０）及び陰性（＃２９）の新生児ともに、腸に染色が観察された。このことは内生酵素活性、又は腸内細菌によるβ−ガラクトシダーゼの産生と考えられる。Ｘ−ガル染色は基底コンパートメント内に見いだされるが、これは分化層における程には強くない（第２Ｄ図）。従って、ヒトケラチンＫ１発現ベクターは増殖性基底細胞にも実質的な数で発現されている。これらの初期トランスジェニック実験による最も重要な知見は、ヒトケラチンＫ１遺伝子から構築したベクターが内生コード化配列の発現をトランスジェニックマウスの表皮に専属的に標的化できるという点である。この標的化の特異性は第２Ａ図から容易に理解できる。＃３０のヒフにおけるこの低いパワーの暴露はＸ−ガルによる強い染色を示している。さらに、この切片には矢印で示す多くの毛包及び皮脂腺があり、これらはＸ−ガルによって染色されない。ケラチンＫ５及びＫ１４は表皮にて発現されるばかりでなく、毛包及び皮脂腺などのすべての扁平上皮にて発現される。ケラチンＫ１４の発現パターン（第２Ｃ図）は、第２Ａ図と一致する連続切片から得た領域の特異的なＫ１４抗血清との免疫蛍光により認められる。表皮の染色性と毛包及び皮脂腺の染色性とに注意すべきである。ヒトケラチンＫ１発現ベクターの構築に使用する戦略がトランスジェニックマウスにおける標的化特異性を変化させるならば、Ｘ−ガル染色は毛包、皮脂腺、他の扁平上皮、及びおそらくは他の組織型さえでも観察されたであろう。しかし、ＨＫ１．β−ガル・トランスジーンの発現はケラチンＫ１遺伝子自身のように表皮に限定されている。実施例４ビタミンＤ₃によるケラチンＫ１ベクターの調節新規なビタミンＤ₃応答要素を使用し、表皮における発現レベルを調節した。ヒトケラチンＫ１遺伝子の調節要素のすべてが同定されているわけではないが、ヒトケラチンＫ１遺伝子由来の新規な負調節要素（ＨＫ１．ＮＲＥ）は同定されており、この実施例はそれがビタミンＤ₃に対して応答してヘテロローガスな（異種の）プロモーターを抑制できることを証明するものである。ＨＫ１．ＮＲＥは７０ヌクレオチド長（配列番号１の９１３４から９２０４ヌクレオチド）である。ＰＣＲ技法を使用し、この断片の反対末端にＢamＨＩ及びＢgl II部位を創製した。これにより、この断片の多重コピーが創製されるが、その理由は連結及び、ＢamＨＩ及びＢgl IIによる消化が、頭−尾（ヘッド−ｔｏ−テイル）連結したオリゴヌクレオチドを選択するからである。ＨＫ１．ＮＲＥの４つの直列（タンデム）コピーをｐＡ１０．ＣＡＴのＢgl IIクローニング部位に挿入した。この構築物を初代マウスの表皮細胞にトランスフェクトすると、ビタミンＤ₃の不存在下では、この構築物は高度に発現される（第３図）。培養培地に増加濃度でビタミンＤ₃を添加すると、この異種プロモーターの転写が抑制される。この観察事項は、ヒトケラチンＫ１発現ベクターの活性が表皮にて調節できることを示している。ヒトケラチンＫ１ベクターの活性はビタミンＤ₃又はその同族体を皮膚に局所適用することによって表皮にて抑制される。実施例５ヒフ発癌のためのトランスジェニック動物モデルの開発マウスの生殖細胞系（germline）に遺伝子を安定に導入できることから、ヒト疾患の動物モデルの作成の見通しが大幅に増大した［Leder及びStewart１９８８年４月１２日発行の米国特許第４，７３６，８６６号、及びPalmiter及びBrinst er，Ann．Rev．Genet.，Vol．20，pp．465-499］。このような遺伝子を、発現を特定の組織に標的化する調節配列と結合させると、生きた生物に関連する研究疾患ばかりでなく、それらの遺伝子の標的であると疑われる特定の組織における研究疾患に対するモデルが提供される。従って、トランスジェニックマウスは疾患進行に対する血液供給、無傷の免疫系、体液性及び細胞性成長制御及び物理的障壁などの因子の及ぼす影響を決定できる可能性を提供できる。表皮は標的化される遺伝子発現のための魅力的な組織である：これは一般に上皮疾患のモデルばかりでなく、表皮のアクセス容易性から、進行性の病態変化を容易に検出でき、さらにトランスジーン発現及びこれらの過程における環境因子が果す潜在的な役割を評価することができる。さらにまた、癌を処置するために遺伝子治療を利用する見通しが現実のものになりかかっている。従って、ヒト癌の動物モデルはこれらのアプローチの治療可能性を評価するうえで有用であろう。ヒフ疾患の動物モデルの開発は、表皮に遺伝子発現を特異的に標的化できる能力に左右される。実施例１に記載するヒトケラチンＫ１標的化ベクターは、この目的に理想的に適している。実施例６表皮へのｖ−ｒａｓ^Ha腫瘍遺伝子の標的化トランスフォーミング能を活性化するコドン１２、１３及び６１の点突然変異によって、プロト腫瘍遺伝子の１つの族であるｒａｓ族（ｒａｓ^Ha、ｒａｓ^K1、ｒａｓ^N）がヒト腫瘍の約２０％で同定された。ｒａｓ遺伝子が活性化されるメカニズムは現在のところ分かっていないが、環境因子がｒａｓ突然変異の病因に中枢的役割を果していることを示す広く行き渡った証拠が存在する。現在までのところ、ヒト皮膚悪性腫瘍におけるｒａｓ活性化を調べる研究は殆ど為されていない。しかし、最近の報告では、太陽光線にさらされた体部位、興味深いことにＵＶ放射線によるヒフ暴露から導かれる可能性ある潜在的なピリミジンダイマー部位に現れる基底及び扁平細胞癌腫のｒａｓ^Ha活性化が同定された。開始（イニシエーション）、増進（プロモーション）及び悪性腫瘍保存の３つの別個の段階が規定されている化学的発癌のマウス皮膚モデルでは、ｒａｓ^Ha活性化が良性の扁平乳頭腫に見いだされ、イニシエーション及びプロモーションの最終点はヒフ発癌におけるｒａｓ^Haの初期の役割を示している。これらを総合すれば、上記の実験の証拠は、ｒａｓ^Ha誘導化ヒフ発癌のメカニズムをさらに研究するための動物モデルを開発する重要性を示している。この目的に沿って、Ｈarveryネズミ肉腫ウイルスのｖ−ｒａｓ^Haタンパク質［Dharら，Science，Vol．217，pp．934-9 37（1982)］をコードする配列をヒトケラチンＫ１発現ベクターのＢamＨＩ及びＣlaＩ部位にクローンした（第４図）。ｖ−ｒａｓ^Haトランスジーンの発現を内生ｒａｓ遺伝子の発現と峻別するため、ヒトケラチンＫ６エピトープをコードする配列（配列番号４）をｖ−ｒａｓ^Haカセットの５’末端にて操作した。ＨＫ１ｒａｓトランスジェニックマウスは以下の表現型を示す：１）表皮に専属的にｖ−ｒａｓ^Ha（ＨＫ１ｒａｓ）を発現する新生児トランスジェニックマウスは４８時間目に明瞭な皺のあるヒフを示す；２）若年性ＨＫ１ｒａｓトランスジェニックマウスは、１４日目にピークを迎える角化（keratinization)を示す；３）新生児ＨＫ１ｒａｓマウスの組織型は表皮の２０倍までの厚さを有する塊状の表皮過形成を示す；４）１４日までにこれは塊状の角質増殖症に進行する。組織型はともに腫瘍発現前であり乳頭腫性であり異形成でないものであり、皮膚の付属物を殆ど示さない。ＨＫ１ｒａｓトランスジェニックマウスは良性腫瘍を発達させる。通常の損傷は単一の部位に１０−１２週以内で現れる。これらの腫瘍の組織型により、充分に分化した扁平乳頭腫であることが判明している。乳頭腫は創傷後に部位にて現れることが多い。これらの乳頭腫の多くは退行する傾向がある。この退行減少は、ｒａｓ^Ha単独では良性の表現型さえも維持するのに充分でなく、またさらなる腫瘍遺伝子／アンチ腫瘍遺伝子の役割が関与できる事象がさらに必要であることを示している。実施例７トランスジェニックマウスの表皮へのｆｏｓ腫瘍遺伝子の標的化最近のインビトロ試験は、ｖ−ｆｏｓ遺伝子は活性化ｒａｓ^Haを発現する悪性の初代ケラチノサイト又は乳頭セルラインに変換できることを示している［Gree nhalghら，PNAS，USA，Vol．1，pp．643-647（1990）；Greenhalgh及びYuspa，M ol．Carcinogen.，Vol．1，pp．134-143（1988)］。このことは、ｆｏｓが表皮発現の後期の役割を果し、活性化ｒａｓ^Ha発現によって伝えられる良性の表現型と共同作業することを示唆している。これ単独で、ＨＫ１ｒａｓマウスと交尾する観点からＨＫ１ｆｏｓトランスジェニックマウスの確立を開始させるのに充分であるが、さらに２つの研究により、通常の表皮分化におけるｆｏｓの役割が同定され、ｆｏｓが摂動に対する魅力的な標的として強調された。ｃ−ｆｏｓ／β −ガル融合遺伝子を使用し、Curran及びその共同研究者［Smeyneら，Neuron，Vo l．8，pp．13-23（1992)］は表皮の分化層において有意なｆｏｓ発現を示し、［ Fisherら，Dev elopment，Vol．III，pp．253-258（1991）］はｃ−ｆｏｓ発現を顆粒細胞の特定のサブセットに局在化させた。つまり、ｆｏｓはケラチノサイト分化の最終段階の制御に際し、重要な役割を有している場合がある。このような特殊細胞におけるｃ−ｆｏｓの正常な役割のｖ−ｆｏｓによる推定の摂動はトランスジェニックマウスにおける標的化された発現に関連してのみ研究することができる。さらに、ｃ−ｆｏｓプロト腫瘍遺伝子はｃ−ｊｕｎ／ＡＰ１遺伝子産物と関連して転写調節物質として機能することが知られており、従ってｒａｓ^Ha標的化が腫瘍形成の際に膜シグナリングの研究を代表する一方、ｆｏｓ標的化によりこの工程の転写制御の役割が解明される。従って、ＦＢＪ／ＦＢＲキメラｖ−ｆｏｓプラスミドｐＦＢＲＪ由来のｆｏｓタンパク質コード化配列をヒトケラチンＫ１標的化ベクターに挿入した（第５図）。ｖ−ｆｏｓトランスジーンの発現を内生ｆｏｓ遺伝子の発現と峻別するため、ヒトケラチンＫ１エピトープをコードする配列（配列番号５）をｖ−ｆｏｓカセットの５’末端において操作した。ＨＫ１ｆｏｓトランスジェニックマウスは次の表現型を表す：１）傷付けた（タッグした）耳に特異的な耳表現型が３−４カ月目の初期に現れ、左右対称となる；２）顕著な表現型を表す幾つかの動物では、傷付けた耳損傷は大ざっぱに言って良性の角化棘細胞腫に似ていることがある；３）高齢の動物（約１年齢）では、腋窩に脱毛症及び角質増殖症が発達することが多い。ＨＫ１ｆｏｓマウスの組織型は次の通りである：初期の耳損傷の組織型は、形成異常の細胞が殆どなくてさらなる新生物進行の証拠もない腫瘍発現前の病態である過形成及び角質増殖症を示す；２）後期の段階では、大ざっぱな角質増殖症の組織型は良性の角化棘細胞腫に似ている。３−４カ月で明らかな腫瘍発現前の耳表現型を発達させるＨＫ１ｆｏｓトランスジェニックマウスの３つの系統が確立されている。傷付け（即ち、耳タッグ）によるプロモーション剌激はこの表現型の外観を明らかに促進しており、それは結果的に左右対称となる。また、腋窩及び鼡径領域の摩擦も腫瘍発現前の過形成及び角質増殖症応答を有意な潜伏期間後に促進できるようである。これらのデータを総合すると、ｖ−ｆｏｓによる正常なケラチノサイト分化及び摂動における、腫瘍発現前の分化障害を導くｆｏｓ遺伝子の基本的な役割が支持される。幾つかのＨＫ１ｆｏｓマウスでは、重篤な耳損傷は良性の角化棘細胞腫に類似して進行するようである。この時の数は少ないが、得られた腫瘍型の数はターミナル分化の後期段階におけるｆｏｓの役割と矛盾がなく、少ない数と潜伏はさらなる事象が必要であることを示している。実施例８ＨＰＶ１８Ｅ６及びＥ７遺伝子発現の表皮への標的化ヒトの特定の扁平上皮癌の病因論においてヒト乳頭腫（パピローマ）ウイルス（ＨＰＶ）が関連する臨床及び疫学的な研究により、広い証拠が存在する。ＨＰＶは扁平上皮細胞に対する特異的な指向性を有しており、種々の型のＨＰＶが、感染する解剖学的部位に対する特異性を有している。さらに、ＨＰＶの特定のサブグループ内の特定の型は良性（例えばＨＰＶ６及び１１）又は悪性（例えばＨＰＶ−１６及び１８）疾患のいずれかの発達に関与しており、これはＥ６及びＥ７遺伝子の性質を中心に展開する。これらが感染した上皮の分化プログラムに適合させることにより、感染子孫を生産するための賢明な戦略がＨＰＶによって開発された。ＨＰＶは基底上皮細胞に感染するが、このコンパートメントでは細胞溶解性の複製を受けないことから、細胞の胚芽プールは後期のウイルス遺伝子発現の細胞変性作用を受けない。ウイルスの産生は、増殖能を欠きかつ環境中に落屑されるであろう最終的に（terminally）分化した細胞にのみ起こる。この戦略は成熟ウイルス粒子の広がりを提供するばかりでなく、基底コンパートメントから細胞を補充することによってそれらを連続的に産生させることができる。ウイルスの生活環は扁平上皮細胞の分化のすべての段階と非常に密接に関係しているので、成功する培養系を確立するのは困難であった。現在までのところ、これらの宿主因子はパピローマウイルスゲノム自身の内に存在する調節メカニズムと関係して、トランスジェニックマウスの扁平上皮におけるＨＰＶ遺伝子発現の病因効果を観察する企ても妨げていた。これらのトランスジェニックマウスモデル利用に対する制限は、ヒトケラチンＫ１標的化ベクターを使用して扁平上皮にＨＰＶ遺伝子発現を特異的に標的化できる能力によって克服することができた。記載している実施例では、ＨＰＶ１８のＥ６及びＥ７遺伝子のコード化配列をヒトケラチンＫ１標的化ベクターのＢgl II及びＣlaＩ部位に挿入した。ＨＫＩＥ６／Ｅ７マウスは次の表現型及び組織型を示す：１）１匹のマウスは、薄皮（fur）におけるヒフ硬直、肥厚及びざらざらさによって特徴付けられる繊細（subtle）なヒフ損傷を７カ月目に示し、これはその後、１０カ月までにいぼ様構造体に進行する；２）この損傷の組織型は過形成、角質増殖及び疣贅形成の始まりを示す；３）１１カ月目の別のマウスの損傷の組織型は、ＨＰＶによって誘導される典型的ないぼを特徴とする。低い頻度と長い潜伏期間を有するＨＰＶ様損傷を発達させる３つのＨＫ１Ｅ６／Ｅ７トランスジェニックマウス系統がこれまでに確立されている。この場合、この限定された表現型の外観が損傷の繊細な性質、及び長い潜伏期間の必要性又はＨＰＶ生物学の複雑な性質を反映しているか否かは不明である。しかし、本発明者らの研究がヒトにおけるＨＰＶ感染の疫学と矛盾のないことは注目に値するものであり、即ち大きなパーセンテイジの特定の雌性集団はＨＰＶ６、１１、１６及び１８による子宮頚感染に対して陽性であると試験され得るが、殆どは明白な損傷に発達するほどには進行しない。これらのマウスが示す見掛けの遅れ及び低い表現型の頻度は上皮分化の際のＨＰＶ発現の結果を研究する相当する背景を提供できるのは当然であると言い得る。さらに、これらのマウスは、ＨＰＶ１８のＥ６及びＥ７の発現を阻害するよう設計された新規なアンチセンス医薬の効能を評価する際にも有用であり得る。実施例９ＴＧＦ−αを表皮に発現するトランスジェニックマウスの調製トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）は表皮成長因子（ＥＧＦ）に類似した構造及び機能特性を有しているサイトカインである。ＴＧＦ−α 及びＥＧＦともに表皮成長因子レセプター（ＥＧＦ−Ｒ）と結合し、チロシンキナーゼカスケードを刺激する。ＴＧＦ−αは正常細胞及び形質転換細胞の両者で発現され、培養ケラチノサイトの増殖の原因となる。インビトロでは、ＴＧＦ− αは血管形成を誘導し、創傷治癒の促進能がＥＧＦよりも強力である。正常なヒトの皮膚では、表皮のすべての層及び皮膚の付属物の特定領域にてＴＧＦ−αの発現が起こる。乾癬、扁平上皮細胞癌、及び先天性水疱性魚鱗癬様紅皮症などの幾つかの皮膚疾患はＴＧＦ−αの発現の改変と関連している。ＴＧＦ−α発現の改変がこれらの疾患の発症に役割を担っているか否かを決定するため、ヒトＴＧＦ−αのタンパク質コード化配列をヒトケラチンＫ１標的化ベクターに挿入した（第７図）。ＨＫ１．ＴＧＦ−α構築物を胚に挿入すると、ｒａｓ^Haと極めて類似している表現型創始者（founder）が得られる。表現型も表皮過形成、角質増殖症及び相対的脱毛症と類似していた。１つの創始者（２１／２月齢）は多重乳頭腫を発育させた。組織学的には、これらは明らかに扁平乳頭腫のようであった。現在までのところ、これらの損傷の中には悪性表現型を保存しているものはない。実施例１０ＨＩＶｔａｔ遺伝子を表皮に発現させるトランスジェニックマウスの調製ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）によって感染された患者は特定のＡＩＤＳ関連の皮膚障害を発現させる高い危険性を有している。徴候を示す患者は乾癬などの過剰増殖状態からカボシ肉腫及び転移性基底細胞癌の範囲のヒフ損傷を有することが多い。ＨＩＶ遺伝子の正確な役割、起源の細胞、及びこのようなヒフ損傷の病因については不明のままである。特定のＨＩＶ遺伝子、即ちトランス調節タンパク質、ｔａｔは、宿主細胞及び組織の恒常性メカニズムに対して直接又は間接的な役割を果たしている可能性がある。あるいは、ＨＩＶｔａｔ遺伝子は潜在的又は日和見感染に由来する他のウイルス遺伝子、即ちヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）と相互作用し又はそれを活性化するのかもしれない。ＡＩＤＳ関連の皮膚障害の発達におけるケラチノサイトの役割を直接的に評価するため、ＨＩＶｔａｔ遺伝子をトランスジェニックマウスの表皮に標的化させた。ヒトケラチンＫ１ベクターを使用することにより、ｔａｔ遺伝子が標的化され、かつケラチノサイトにおいて専属的に発現された（第８図）。ＨＩＶｔａｔ遺伝子単独又は他の腫瘍遺伝子と共同しての発現の結果として、予期できる動力学によって皮膚損傷を発達させるマウス株の開発は、ＨＩＶｔａｔ遺伝子の発現を阻害するよう設計したアンチセンス医薬の治療可能性を評価するために有用なモデルとして役立つ。実施例１１遺伝子治療の応用のためのＨＫ１ベクターの利用表皮細胞における専属的な発現を望み、それがＨＫ１ベクターの一時的な発現のためである場合、ＨＫ１ベクターは遺伝子治療のための優れた選択肢である。ヒトケラチンＫ１遺伝子自体とは異なり、１２kb断片由来のヒトケラチンＫ１ベクターは表皮の増殖性基底細胞にて発現される。より最近のトランスジェニック実験にて、ヒトケラチンＫ１遺伝子を含有する大きな断片である１８kb ＥcoＲＶ断片［第９図の模式図を参照］が内生マウスＫ１遺伝子と正確に同じように、即ちターミナル分化にコミットした細胞において有糸分裂後に発現することが決定された。これらの細胞は死滅するように前もってプログラムされており、結局は環境中に脱落する。従って、一時的発現が望ましいヒト適用のために、細胞がターミナル分化にコミットし、表皮の外側の層への上方移行を開始する後にのみ細胞に発現されるベクターを設計することができる。このベクターは環境に脱落する約１０−１４日前に発現されるであろう。このことは、元のヒトケラチンＫ１ベクターの末端に１８kb Ｅco ＲＶ断片由来の付加的な５’フランキング配列を挿入することによって行うことができる。実施例１２発癌物質及び腫瘍プロモーターの検出ヒトに対する化学物質の有害可能性を評価するための迅速かつ安価な検定法として、遺伝子毒性化学物質のための短期間試験（ＳＴＴｓ）が元々開発されていた。しかし、ナショナル・トキシコロジー・プログラムによって開始された、齧歯類発癌性を予測するためのＳＴＴｓの能力を評価するプロジェクトの結果を要約した最近の報告は、ＳＴＴｓのみに頼る確実性に疑問を投げ掛けている。この齧歯類検定にて検出された最も強力な３つの発癌物質は評価された４つのＳＴＴ_S のいずれにも遺伝子毒性を産生しなかった［Tennantら，Science，Vol．236，p p．933-941（1987)］。従って、化学、農学、食品及び医薬の企業が新規化合物についてＥＰＡ／ＦＤＡ承認を受けるためには現在、２百万ドルに上る費用のかかる２年動物試験を行うことを要求されている。発癌物質及び腫瘍プロモーターを迅速に検出するよう遺伝子操作された新規なトランスジェニックマウス系統の開発は長期動物試験の諸経費を大幅に削減することになろう。ここに特許請求しているトランスジェニックマウス系統が発癌物質の迅速検出に適合しているか否かをまず始めに、既知の皮膚癌の発癌物質、ＤＭＢＡを用いて決定するにあたり、良性の損傷が対照の非処置小動物よりも早く現れるか否かを決定した。腫瘍プロモーターを検出するための適合性を決定するには、既知のプロモーター、１２ −Ｏ−テトラ−デカノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）をｒａｓ^Ha 及びｆｏｓマウスに適用した。ｒａｓ^Haマウスの良性の損傷及びｆｏｓマウスの過形成が創傷部位（即ち、タッグした耳）に現れ、創傷が腫瘍形成を促進（プロモート）することができるので、この系統は上記の試験に有用である。本明細書に言及しているすべての特許及び公報は本発明が関連する当業者のレベルを示している。本明細書に引用によって記載しているすべての特許及び公報は、個々の文献が具体的にかつ個々に引用して記載されているのと同じ程度に本明細書に包含される。当業者ならば、本発明を実施し、記載している目的及び利点並びに本発明に本質的なものを入手するために本発明を充分に適合させることは容易に理解できるであろう。方法、操作、処理、特定の化合物の分子と関連して記載しているバイオリアクター、核酸配列、形質転換された表皮細胞、トランスジェニック動物及びヒトケラチンＫ１ベクターは例示であって、本発明の範囲の限定を意図するものでない。以下の請求の範囲によって規定される本発明の精神に包含される本発明の改変及び他の使用が当業者には明らかである。（１）一般的情報（ｉ）特許出願人：ループ、デニス・アールロスナゲル、ジョセフ・エイグリーンハル、デイビッド・エイユスパ、スチュアート・エイチ（ii）発明の名称：トランスジェニック動物の表皮に遺伝子発現を標的化するベクターの開発（iii）配列の数：５（iv）連絡先：（Ａ）名宛人：フルブライト・アンド・ヤオースキ（Ｂ）通り：スイート５１００、マクキネイ１３０１番（Ｃ）市：ヒュストン（Ｄ）州：テキサス（Ｅ）国：アメリカ合衆国（Ｆ）ＺＩＰ：７７００１０−３０９５（ｖ）コンピューター解読書式（Ａ）媒体型：フロッピーデスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣ適合（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウエア：パテントインリリース＃１．０，バージョン＃１．２５（vi）本出願のデータ：（Ａ）出願番号：ＵＳ（Ｂ）出願日：（Ｃ）分類：（viii）弁理士／代理人情報（Ａ）氏名：ポール、トーマス・ディー（Ｂ）登録番号：３２，７１４（Ｃ）参照／整理番号：Ｄー５４７８（ix）電話連絡先情報：（Ａ）電話番号：７１３／６５１−５３２５（Ｂ）ファックス番号：７１３／６５１−５２４６（Ｃ）テレックス：７６２８２９（２）配列番号１の情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：１０７４７塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ（xi）配列：配列番号１：（２）配列番号２の情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：６６９３塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ（vi）アンチセンス：ＮＯ（xi）配列：配列番号２：（２）配列番号３の情報：（Ａ）長さ：２４９７９塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ（iv）アンチセンス：ＮＯ（xi）配列：配列番号３：（２）配列番号４の情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：８アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ（iv）アンチセンス：ＮＯ（xi）配列：配列番号４：（２）配列番号５の情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：１６アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ（iv）アンチセンス：ＮＯ（xi）配列：配列番号４：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 31/70 ＡＤＵ 39/00 Ａ 9284−4Ｃ 48/00 8314−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 Ｂ 8615−4ＣＣ１２Ｎ 5/10 // Ａ６１Ｋ 31/24 9455−4Ｃ 38/00 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＵＡ (72)発明者ループ、デニス・アールアメリカ合衆国77030テキサス州、ヒューストン、ベルフォンテイン2331番 (72)発明者ロスナゲル、ジョセフ・エイアメリカ合衆国77096テキサス州、ヒューストン、クイーンズロック・ドライブ5427 番 (72)発明者グリーンハル、デイビッド・エイアメリカ合衆国77025テキサス州、ヒューストン、ブロンプトン7423番 (72)発明者ユスパ、スチュアート・エイチアメリカ合衆国20817メリーランド州、ベセスダ、カリタ・コート8013番

Claims

【特許請求の範囲】１．表皮に核酸カセットを発現させるためのケラチンＫ１ベクターであって、ケラチンＫ１プロモーター、転写されるが翻訳されない５’領域及び最初のイントロンを該核酸カセットの発現のための配列及び位置関係をもってすべて含有するケラチンＫ１遺伝子の５’フランキング配列である該５’フランキング領域；転写されるが翻訳されない３’領域、及び転写終止領域を含有する隣接非コード化ＤＮＡを含有する、ビタミンＤ₃調節配列を含有するケラチンＫ１遺伝子の３’フランキング領域；及び５’フランキング領域と３’フランキング隣接とを結ぶ、種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を有するポリリンカーであって核酸カセットを挿入するための位置をさらに提供するポリリンカー、を含有するベクター。２．５’フランキング領域が約１．２kbであり、３’フランキング領域が約３９kbである、請求項１に記載のケラチンＫ１ベクター。３．該核酸カセットがタンパク質、ポリペプチド又はアンチセンスＲＮＡをコードする核酸配列を包含する、請求項１に記載のベクター。４．該カセットが腫瘍遺伝子をコードする核酸配列を包含する、請求項１に記載のベクター。５．腫瘍遺伝子がｒａｓ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｅｒｂ、ｓｒｃ、ｓｉｓ及びｊｕｎからなる群の中から選ばれる請求項４に記載のベクター。６．該カセットがトランスフォーミング遺伝子をコードする核酸配列を包含する請求項１に記載のベクター。７．制限エンドヌクレアーゼがＢamＨＩ、ＸmaＩ、ＫpnＩ、ＮotＩ、ＣlaＩ及びＢｇｌIIからなる群の中から選ばれる、請求項１に記載のベクター。８．該核酸カセットがヒトパピローマウイルスのＥ６又はＥ７トランスフォーミング配列を含有する、請求項１に記載のベクター。９．該核酸カセットがＴＧＦ−α配列を含有する、請求項１に記載のベクター。１０．１８kbＥcoＲＶ断片由来の付加的な５’フランキング配列を末端にさらに含有する、請求項１に記載のベクター。１１．請求項３に記載のベクターを含有する形質転換表皮細胞を有するバイオリアクター。１２．ホルモン、成長因子、酵素、薬物、腫瘍サプレッサー、レセプター、アポリポタンパク質、凝固因子、腫瘍抗原、ウイルス抗原、昆虫抗原、細菌抗原、及び寄生虫抗原からなる群の中から選ばれるタンパク質又はポリペプチドをコードする核酸配列を有するカセットをベクターが包含する、請求項１１に記載のバイオリアクター。１３．核酸配列がプロインスリン又はインスリンをコードしている請求項１２に記載のバイオリアクター。１４．核酸配列が成長ホルモンをコードしている請求項１２に記載のバイオリアクター。１５．核酸配列がインスリン様成長因子Ｉ、インスリン様成長因子ＩＩ、又はインスリン成長因子結合性タンパク質をコードしている請求項１２に記載のバイオリアクター。１６．核酸配列が凝固因子をコードしている請求項１２に記載のバイオリアクター。１７．核酸配列が表皮成長因子（ＴＧＦ−α）、皮膚成長因子（ＰＤＧＦ）、又は血管形成因子をコードしている請求項１２に記載のバイオリアクター。１８．核酸配列がＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ニドゲン、又はＶＩＩ型コラーゲンをコードしている請求項１２に記載のバイオリアクター。１９．該カセットが免疫学的応答を誘導するタンパク質を包含する、ワクチン生産のための請求項１２に記載のバイオリアクター。２０．ケラチンＫ１ベクターを表皮細胞にex vivo導入するための方法であって、選択マーカーを有するベクターを同時形質転換し、得られた形質転換細胞を選択する工程を包含する方法。２１．配列番号１に記載の調節配列を含有するヒトケラチンＫ１遺伝子の非コード化断片。２２．配列番号１の１から１２４６ヌクレオチドからなる５’フランキング領域；配列番号１の６８９１から１０７４７ヌクレオチドからなる３’フランキング領域；及び配列番号２の２３５１から２３７６ヌクレオチドからなるリンカーを有するヒトケラチンＫ１ベクター。２３．即座に受精した卵を採取し、請求項３に記載のベクターを前核にマイクロインジェクションすることによって該ベクターを該受精卵に挿入し、そして得られたインジェクション卵を偽妊娠した雌性の受容体に移すこと、を特徴とするトランスジェニック動物の作成方法。２４．その胚及び体細胞に請求項３に記載のベクターを含有しているトランスジェニック動物であって、該ベクターが該動物又は該動物の祖先へ胚段階に導入されたものであり、該ベクターの核酸カセットが表皮のみにおいて発現される該トランスジェニック動物。２５．核酸カセットがトランスフォーミング遺伝子配列を含有する、請求項２４に記載のトランスジェニック動物。２６．腫瘍遺伝子が第１表に記載のものから選ばれる、請求項２５に記載のトランスジェニック動物。２７．動物が謡歯類である請求項２４に記載のトランスジェニック動物。２８．癌の起源を研究し、又は癌を処置するための方法であって、核酸カセット中に腫瘍遺伝子を含有するヒトケラチンＫ１ベクターによって胚をインジェクションすることにより、トランスジェニック動物を作成し、得られた動物又はその子孫を癌の研究に使用すること、を特徴とする方法。２９．核酸カセットがｆｏｓ腫瘍遺伝子配列を含有している請求項２８に記載の方法。３０．核酸カセットがｒａｓ腫瘍遺伝子配列を含有している請求項２８に記載の方法。３１．試験動物が１以上の腫瘍遺伝子を含有している請求項２８に記載の方法。３２．ケラチンＫ１ベクターを表皮細胞にインビボ形質導入する方法であって、該表皮細胞を形質転換するに充分な時間、該表皮細胞に該ベクターを接触させる方法。３３．ヒトに核酸カセットを一時的に導入するための方法であって、該カセットを含有するケラチンＫ１ベクターを表皮細胞に、該ベクターを該細胞に形質導入するに充分な時間接触させる方法。３４．創傷又は外科的切開の治癒を速める方法であって、成長因子をコードする核酸配列を有する核酸カセットを含有するケラチンＫ１ベクターを表皮細胞にインビボ形質導入する方法。３５．種々のベクターを表皮細胞に形質導入するにあたり、少なくとも１つのベクターのカセットが表皮成長因子（ＴＧＦ−α）の核酸配列を含有し、少なくとも１つのベクターのカセットが皮膚成長因子（ＰＤＧＦ）を含有し、少なくとも１つのカセットが表皮を真皮にアンカーするためのマトリックスタンパク質の核酸配列を含有し、そして少なくとも１つのベクターのカセットが血管形成因子の核酸配列を含有する、請求項３４に記載の方法。３６．マトリックスタンパク質の配列が、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ニドゲン及びＶＩＩ型コラーゲンからなる群の中から選ばれるタンパク質をコードする配列から選ばれる請求項３５に記載の方法。３７．血管形成因子が酸フィブロブラスト成長因子、塩基性フィブロブラスト成長因子及びアンジオゲニンからなる群の中から選ばれる請求項３５に記載の方法。３８．成長因子の核酸配列を有する核酸カセットを含有するケラチンＫ１ベクターを表皮細胞にインビボ形質導入することを特徴とする、皮膚漬瘍を処置する方法。３９．種々のベクターを表皮細胞に形質導入するにあたり、少なくとも１つのベクターのカセットが表皮成長因子（ＴＧＦ−α）の核酸配列を含有し、少なくとも１つのベクターのカセットが皮膚成長因子（ＰＤＧＦ）を含有し、少なくとも１つのカセットが表皮を真皮にアンカーするためのマトリックスタンパク質の核酸配列を含有し、そして少なくとも１つのベクターのカセットが血管形成因子の核酸配列を含有する、請求項３８に記載の方法。４０．マトリックスタンパク質の配列が、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ニドゲン及びＶＩＩ型コラーゲンからなる群の中から選ばれるタンパク質をコードする配列から選ばれる請求項３９に記載の方法。４１．血管形成因子が酸性フィブロブラスト成長因子、塩基性フィブロブラスト成長因子及びアンジオゲニンからなる群の中から選ばれる請求項３９に記載の方法。４２．ヒト及び動物の創傷、外科的切開又は皮膚潰瘍の治癒を速める方法であって、成長因子の核酸配列を有する核酸カセットを含有するケラチンＫ１ベクターを表皮細胞にex vivo形質導入し、そして得られた形質導入表皮細胞を、処置する動物又はヒトに移植する、ことを特徴とする方法。４３．種々のベクターを表皮細胞に形質導入するにあたり、少なくとも１つのベクターのカセットが表皮成長因子（ＴＧＦ−α）の核酸配列を含有し、少なくとも１つのベクターのカセットが皮膚成長因子（ＰＤＧＦ）を含有し、少なくとも１つのカセットが表皮を真皮にアンカーするためのマトリックスタンパク質の核酸配列を含有し、そして少なくとも１つのベクターのカセットが血管形成因子の核酸配列を含有する、請求項４２に記載の方法。４４．マトリックスタンパク質の配列が、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ニドゲン及びＶＩＩ型コラーゲンからなる群の中から選ばれるタンパク質をコードする配列から選ばれる請求項４３に記載の方法。４５．血管形成因子が酸性フィブロブラスト成長因子、塩基性フィブロブラスト成長因子及びアンジオゲニンからなる群の中から選ばれる請求項４３に記載の方法。４６．ＴＧＦ−β、サイトカインレセプターの可溶性形態、及びアンチセンスＲＮＡからなる群から選ばれるタンパク質又はポリペプチドをコードする核酸配列を有する核酸カセットを含有するケラチンＫ１ベクターを表皮細胞にインビボ形質導入することを特徴とする、乾癖を処置する方法。４７．該カセットがＴＧＦ−βの配列を含有する請求項４６に記載の方法。４８．該カセットがＩＬ−１、ＩＬ−６及びＩＬ−８からなる群の中から選ばれるサイトカインレセプターの可溶性形態を含有する、請求項４６に記載の方法。４９．該カセットがＴＧＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６及びＩＬ−８からなる群の中から選ばれる配列に対するアンチセンスＲＮＡを含有する、請求項４６に記載の方法。５０．ヒトパピローマウイルスのＥ６又はＥ７遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡをコードする核酸配列を有する核酸カセットを含有するケラチンＫ１ベクターを表皮細胞にインビボ形質導入する、皮膚癌を処置する方法。５１．正常なｐ５３タンパク質をコードする核酸配列を有する核酸カセットを含有するケラチンＫ１ベクターを表皮細胞にインビボ形質導入する、皮膚癌を処置する方法。５２．免疫学的応答を誘導するタンパク質又はポリペプチドをコードする核酸配列を有する核酸カセットを含有するケラチンＫ１ベクターを表皮細胞にインビボ形質導入する、ワクチン接種の方法。５３．該カセットがウイルスキャプシドタンパク質の配列を含有する請求項５２に記載の方法。５４．キャプシドタンパク質がヒトパピローマウイルス由来である請求項５３に記載の方法。