JP5542928B2

JP5542928B2 - ミミズの生殖巣再生能力を利用した形質転換ミミズの作製方法、これにより作製された形質転換ミミズ、及び形質転換ミミズの体液から組換たんぱく質の生産方法

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Publication number: JP5542928B2
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Inventors: フェギョンキム; チヒョンアン; オンシクタク
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Description

本発明は、ミミズの生殖巣再生能力を利用した形質転換ミミズの作製方法、これにより作製された形質転換ミミズ、及び形質転換ミミズの体液からの組換たんぱく質の生産方法に関する。

従来の形質転換法（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ）には、大きく体細胞形質転換と生殖細胞形質転換とがある。体細胞形質転換は、新しい遺伝形質が処置動物では現れるが次の世代には伝達されない方法であり、生殖細胞形質転換は、新しい遺伝子を生殖細胞に直接或いは形質転換細胞が生殖細胞に転移されるように誘導して新しい遺伝形質が持続的に発現するようにする方法である。

生殖細胞形質転換法としては、前核注入法、ウイルスベクター利用法、胚性幹細胞利用法、核移植法、体外受精法などがある。

前記前核注入法は、受精卵の核に新しい遺伝子を入れてこれを着床させて形質転換体を構築する方法であって、この際に、着床した受精卵の細胞分裂時期に、染色体に遺伝子がランダムに挿入され、その形質を現すこととなる。この方法は、最も簡単で比較的に高い効率を示すため、現在、最も産業的に多く使われている（ＧｏｒｄｏｎＪＷ，ＲｕｄｄｌｅＦＨ，１９８１．Ｓｃｉｅｎｃｅ２１４：１２４４２４６；ＨａｍｍｅｒＲＥ，ＰｕｒｓｅｌＶＧ，ＲｅｘｒｏａｄＣＥ，Ｊｒ．，ＷａｌｌＲＪ，ＢｏｌｔＤＪ，ＥｂｅｒｔＫＭ，ｅｔａｌ．１９８５．Ｎａｔｕｒｅ３１５：６８０８３）。しかし、新しい遺伝子の発現により新しい形質を得る反面、ランダムな挿入で発現度を調節することが難しく、正確な結果が得られないという短所がある。

前記ウイルスベクター利用法は、前核注入方法とは非常に類似であるが、新しい遺伝子を直接注入するのではなく、非毒性処理ウイルスベクターを利用して組換遺伝子を作り、強力なウイルスの感染方法を通じて形質転換体を構築する方法である。この方法は、非常に高い遺伝子注入効率のために、人間において遺伝子治療法として使用されているが、前核注入法と同様に、ランダムな挿入による発現調節が難しいという短所がある（ＪａｅｎｉｓｃｈＲ，ＦａｎＨ，ＣｒｏｋｅｒＢ，１９７５．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ７２：４００８０１２；ＲｏｂｅｒｔｓｏｎＥ，ＢｒａｄｌｅｙＡ，ＫｕｅｈｎＭ，ＥｖａｎｓＭ，１９８６．Ｎａｔｕｒｅ３２３：４４５４８）。

前記胚性幹細胞利用法は、全能性をもつ胚性幹細胞の未分化細胞に新しい遺伝子を導入して形質転換させた胚性幹細胞を新しい受精卵に移植すると、胎児発達過程中に移植された胚性幹細胞が生殖細胞に分化して形質転換動物が生まれるという方法である。この方法は、新しい遺伝子を固体の特定の部位に注入できるという特徴を有するため、一般的に研究用の形質転換動物を作製することに使用されている。また、この方法により作られる形質転換動物は、特定の遺伝部位を調節するため、産業的、かつ医学的に、その利用範囲が非常に広いという長所を有するが、その反面、他の方法に比べて時間とコストがかかり、現在、齧歯類を除いた他の動物では構築方法が確立していない（ＭａｒｔｉｎＧＲ，１９８１．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ７８：７６３４６３８；ＴｈｏｍａｓＫＲ，ＣａｐｅｃｃｈｉＭＲ，１９８７．Ｃｅｌｌ５１：５０３１２；ＮａｇａｎｏＭ，ＢｒｉｎｓｔｅｒＣＪ，ＯｒｗｉｇＫＥ，ＲｙｕＢＹ，ＡｖａｒｂｏｃｋＭＲ，ＢｒｉｎｓｔｅｒＲＬ，２００１．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９８：１３０９０３０９５）。

前記核移植法は、クローン羊ドリーを通じて広く知られた方法で、未受精卵の核を除去して供与細胞の核を移植して、代理母（動物）の体内で個体として発達させる方法である。この方法は、核供与細胞として、受精卵由来未分化細胞から体細胞まで殆ど制限無く使用することができ、一気に多くの数の形質転換動物を複製生産できるという長所がある反面、まだ非常に低い生産効率と死産及び奇形出産など、解決すべき課題を抱えている（ＷｉｌｌａｄｓｅｎＳＭ，１９８６．Ｎａｔｕｒｅ３２０：６３５；ＳｃｈｎｉｅｋｅＡＥ，ＫｉｎｄＡＪ，ＲｉｔｃｈｉｅＷＡ，ＭｙｃｏｃｋＫ，ＳｃｏｔｔＡＲ，ＲｉｔｃｈｉｅＭ，ＷｉｌｍｕｔＩ，ｅｔａｌ．，１９９７．Ｓｃｉｅｎｃｅ２７８：２１３０１３３；ＣｉｂｅｌｌｉＪＢ，ＳｔｉｃｅＳＬ，ＧｏｌｕｅｋｅＰＪ，ＫａｎｅＪＪ，ＪｅｒｒｙＪ，ＢｌａｃｋｗｅｌｌＣ，ｅｔａｌ．，１９９８．Ｓｃｉｅｎｃｅ２８０：１２５６２５８）。

前記体外受精法は、試験管ベビーとして親しまれた方法であり、精子と卵子の受精を体外で行った後、母体に移植して妊娠できるようにする方法である。この過程を活用して形質転換動物を生産し、体外受精の実施前に精子の頭部分に新しい遺伝子を取り付けて卵子と受精させると、流入された新しい遺伝子により形質を発現することとなり、形質転換動物の生産が可能となる。この方法は、既存の形質転換動物生産技法のうち最も簡単で、高価の装備を必要としないが、まだ成功した例が少なく、且つ、ランダムな遺伝子変形のみ可能という限界がある（ＢｒａｃｋｅｔｔＢＧ，ＢａｒａｎｓｋａＷ，ＳａｗｉｃｋｉＷ，ＫｏｐｒｏｗｓｋｉＨ，１９７１．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ６８：３５３５７；ＭａｉｏｎｅＢ，ＬａｖｉｔｒａｎｏＭ，ＳｐａｄａｆｏｒａＣ，ＫｉｅｓｓｌｉｎｇＡＡ，１９９８．ＭｏｌＲｅｐｒｏｄＤｅｖ５０：４０６０９；ＲｉｅｔｈＡ，ＰｏｔｈｉｅｒＦ，ＳｉｒａｒｄＭＡ，２０００．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ５７：３３８４５；ＣｅｌｅｂｉＣ，ＧｕｉｌｌａｕｄｅｕｘＴ，ＡｕｖｒａｙＰ，Ｖａｌｌｅｔ−ＥｒｄｔｍａｎｎＶ，ＪｅｇｏｕＢ，２００３．ＢｉｏｌＲｅｐｒｏｄ６８：１４７７４８３）。

しかし、前記に述べた全ての方法は、形質転換体を構築するのに時間とコストが非常にかかり、高価の装備と熟練した研究人力が必要とされる。

一方、ミミズは、いわゆる、土龍、地龍或いは白頸蚯蚓と呼ばれる貧毛類の環形動物であって、一体に雌性器官と雄性器官とを有している雌雄同体でありながら、各地の豊かな湿地帯の土壌の中で有機物を摂取しながら生きる。このようなミミズは、世界的におよそ２，７００種余りが分布しているものと知られており、韓国にはおよそ６０種類ほど生息するものと報告されている。東醫寶鑑や本草綱目などの韓国の医学書によると、ミミズは、薬用成分が含まれており、溶血、解熱などの効果があるだけでなく、腸内の寄生虫の殺虫、解熱作用、発狂、黄疸、季節性伝染病、咽喉炎などに効果があると知られている。またミミズは、一部種で再生能力を有していることが知られている。ミミズの再生は、主要器官が含まれない環帯以後に限られて現れると知られており、種によって非常に多様な再生能力を示している。しかし、一部の研究者は、環帯以前の器官も再生できるという学説を主張しているが、その生物学的なメカニズムと方法については知られていない。また、ミミズの再生能力を利用した形質転換技術に関する研究についても未だ無い状態である。

従って、ミミズの再生能力を利用した形質転換方法に関する開発の必要性が求められている。

本発明者等は、従来の形質転換技術の短所を補完して時間とコストが少なくかかり、簡単に形質転換体を構築することができる方法について研究していたところ、ミミズの生殖巣を含む前半部を切断した後、再生を誘導して再生芽細胞を形成させ、再生初期にミミズの再生芽細胞部位に組換遺伝子発現ベクターを注入して形質転換されたミミズを作製し、前記形質転換されたミミズの体液から組換たんぱく質を生産することができることを確認し、本発明を完成した。

本発明は、ミミズの生殖巣再生能力を利用した形質転換ミミズの作製方法を提供しようとする。

また、本発明は、前記方法により作製された形質転換ミミズを提供しようとする。

また、本発明は、前記形質転換ミミズの体液から組換たんぱく質の生産方法を提供しようとする。

図１は山ミミズ（Ｐｅｒｉｏｎｙｘｅｘｃａｖａｔｕｓ）の生殖巣が含まれる前半部を切断した後、６時間後に生成された再生芽細胞（矢印の部分）を光学顕微鏡で観察した結果を示した図である。図２は山ミミズの生殖巣が含まれる前半部を切断した後、約３０日が過ぎた後、再生部位に精巣と卵巣が再生されたことを光学顕微鏡で観察した結果を示した図である。図３は本発明のCMVプロモーターを含む組換遺伝子発現ベクター（ｐＣＭＶ−ｈＥＰＯ，ｐＣＭＶ−ｈＧＨ）の導入模式図を示した図である。図４は形質転換されたミミズのｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡＰＣＲを通じたｈＥＰＯ遺伝子の検出を示した図である。図５は形質転換されたミミズのｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡＰＣＲを通じたｈＧＨ遺伝子の検出を示した図である。図６は形質転換されたミミズの体液から分離した人組換たんぱく質（ｈＥＰＯ）が発現したかどうかを免疫ブロッティングにて分析した結果を示した図である。図７は形質転換されたミミズの体液から分離した人組換たんぱく質（ｈＧＨ）が発現したかどうかを免疫ブロッティングにて分析した結果を示した図である。図８はミミズの体液から抽出したｈＥＰＯを皮下及び腹腔注射したマウスの血色素の含量変化を示した図である。図９はミミズの体液から抽出したｈＥＰＯを経口投与したマウスの血色素の含量変化と血液でｈＥＰＯが存在するか否かを免疫ブロッティングにて検査した結果を示した図である。

本発明は、
１）ミミズの生殖巣を含む前半部を切断した後、再生を誘導して再生芽細胞を形成する段階、
２）CMVプロモーターを含む遺伝子発現系であるｐＣＭＶ＿ＥＧＦＰ−Ｃ１ベクターに標的遺伝子を導入して組換遺伝子発現ベクターを作製する段階、及び
３）前記１）段階で切断した後、２４時間以内に再生が始まったミミズの再生芽細胞部位に、前記２）段階で作製した組換遺伝子発現ベクターを注入し、代を次いで培養して形質転換されたミミズを作製する段階を含む、ミミズの生殖巣再生能力を利用した形質転換ミミズの作製方法を提供する。

また、本発明は、前記方法により作製された形質転換ミミズを提供する。

また、本発明は、
１）前記形質転換ミミズからミミズの体液を得る段階、
２）前記１）段階から得たミミズの体液に溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ）を入れて攪拌機で均質粉砕して均質液を得る段階、
３）前記均質液を遠心分離し沈殿を通じて組換たんぱく質を収得する段階、及び
４）前記収得された組換たんぱく質を精製及び分離する段階を含む、組換たんぱく質の生産方法を提供しようとする。

以下、本発明について詳しく説明する。

本発明によるミミズの生殖巣再生能力を利用した形質転換ミミズの作製方法は、ミミズの生殖巣を含む前半部を切断した後、再生を誘導して再生芽細胞を形成させ、再生初期にミミズの再生芽細胞部位に組換遺伝子発現ベクターを注入して形質転換されたミミズを作製することを特徴とする。

前記ミミズは、前半部に生殖巣を含むミミズはいずれも可能で、前記前半部とは、一般的に環帯部位まで含むことを意味する。前記ミミズは、環形動物（Ａｎｎｅｌｉｄｓ）のうち多毛類（Ｐｏｌｙｃｈａｅｔａ）と貧毛類（Ｏｌｉｇｏｃｈａｅｔａ）に属するミミズを全て含むことができ、本発明では、特に山ミミズ（Ｐｅｒｉｏｎｙｘｅｘｃａｖａｔｕｓ）或いはヤマトヒメミミズ（Ｅｎｃｈｙｔｒａｅｕｓｊａｐｏｎｅｎｓｉｓ）が好ましい。

前記標的遺伝子としては、成長ホルモン、成長ホルモン分泌誘導ホルモン、性腺ホルモン、性ホルモン分泌誘導ホルモン、インターフェロン類及びインターフェロン受容体類、コロニー刺激因子、インターロイキン類、エリスロポエチン、インシュリン、アンジオテンシン、トロンボポエチン、レプチン、レチノール結合因子、アディポネクチン、骨形成成長因子、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、神経成長因子類、細胞表面抗原、単一クローン抗体、ウイルス由来ワクチン抗原、血液凝固調節因子、プロラクチン、肥満抑制調節因子、抗酸化酵素（ＳＯＤ）、たんぱく質分解酵素などを含むが、これに限られない。本発明では、人間エリスロポエチン（ｈｕｍａｎｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，ｈＥＰＯ）と人間成長ホルモン（ｈＧＨ）が好ましい。

また、本発明は、前記方法で形質転換されたミミズの体液から組換たんぱく質を大量生産することができる。具体的には、前記形質転換ミミズからミミズの体液を得た後、これに溶解緩衝液を入れて攪拌機で均質粉砕して均質液を得た後、前記均質液を遠心分離し沈殿を通じて組換たんぱく質を収得し、収得された組換たんぱく質を精製及び分離する。

前記ミミズの体液は、１）アルコールを利用して抽出する方法、２）冷温水を含む温度調節装置の温度偏差を利用して抽出する方法、３）しおを含む塩を利用して抽出する方法、４）体液抽出緩衝液（ｂｏｄｙｆｌｕｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ）を利用して抽出する方法、及び５）電気衝撃を利用して抽出する方法のうち選ばれた方法を利用してミミズから抽出して得ることができる。

前記組換たんぱく質は、一般的に生理活性ポリペプチドを含む概念であって、ホルモン、サイトカイン、インターロイキン、インターロイキン結合たんぱく質、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造たんぱく質、リガンドたんぱく質或いは受容体、細胞表面抗原、受容体拮抗物質のような多様なたんぱく質及びこれらの誘導体及び類似体が挙げられる。具体的には、成長ホルモン、成長ホルモン分泌誘導ホルモン、性腺ホルモン、性ホルモン分泌誘導ホルモン、インターフェロン類及びインターフェロン受容体類、コロニー刺激因子、インターロイキン類、エリスロポエチン、インシュリン、アンジオテンシン、トロンボポエチン、レプチン、レチノール結合因子、アディポネクチン、骨形成成長因子、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、神経成長因子類、細胞表面抗原、単一クローン抗体、ウイルス由来ワクチン抗原、血液凝固調節因子、プロラクチン、肥満抑制調節因子、抗酸化酵素（ＳＯＤ）、たんぱく質分解酵素などを含むが、これに限定されない。本発明では、人間エリスロポエチン（ｈＥＰＯ）と人間成長ホルモン（ｈＧＨ）が好ましい。

本発明によるミミズの生殖巣再生能力を利用した形質転換ミミズの作製方法は、従来の形質転換技術の短所を補完する形態の新しい生命工学的技法により高い注入効率性を有し、胚性幹細胞のような全能性をもつ再生芽細胞を使用することで、形質転換体の全ての部位に組換遺伝子を挿入することができ、形質転換体の体液を通じて組換たんぱく質を生産することができ、生殖巣に標的遺伝子を直接投入することで、代理母（動物）が必要とされず、生殖可能な形質転換体を利用するため、持続的に多数の形質転換体を生産することができ、既存の形質転換技術より簡単で、高価の装備及び熟練した技術を必要としない。

以下、本発明の理解のため、好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するため提供されるものであり、実施例により本発明の内容が限定されるのではない。

実施例１：山ミミズの生殖巣の再生誘導

山ミミズ（Ｐｅｒｉｏｎｙｘｅｘｃａｖａｔｕｓ）の生殖巣を含む前半部再生を誘導するため、山ミミズの生殖巣が含まれる環帯部位の後ろから５〜１５節から頭部分を切断した。切断されたミミズを水に浸した紙のタオルを引いて７０％の湿度が保たれる蓋のある試験皿に入れて、２３±２℃に調節される恒温槽で飼育した。ミミズの切断部位から再生芽細胞が生成されるか確認するため、再生時期別に凍結切片組織を作り、光学顕微鏡で観察した。また、前半部が完全に再生されたミミズが生殖活動を通じて卵袋（３−４個の受精卵を含む袋）を生産することを光学顕微鏡で観察した。

山ミミズの生殖巣が含まれる前半部を切断した後、６時間後に生成された再生芽細胞（矢印の部分）を光学顕微鏡で観察した結果は図１に示し、山ミミズの生殖巣が含まれる前半部を切断した後、再生部位に精巣と卵巣が再生されたことを光学顕微鏡で観察した結果は図２に示した。

図１に示したとおり、山ミミズの再生芽細胞（矢印の部分）は、頭部分切断後、６時間以内に形成され始め、１２〜１８時間内に活発に分裂した。

また図２に示したとおり、山ミミズの再生芽細胞は、頭部分切断後、およそ３０日が過ぎた後、ミミズの切断された前半部が完全に再生され、再生部位に新しい精巣と卵巣が形成されたことを確認した。
実施例２：標的遺伝子のクローニング、及び組換遺伝子発現ベクターの作製

既存に、ＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，米国国立生命工学情報センター）に報告され知られた人間エリスロポエチン（ｈＥＰＯ）と人間成長ホルモン（ｈＧＨ）の遺伝子を確保するため、既存の塩基序列を基に標的遺伝子の特異的センス−プライマーとアンチセンス−プライマーをそれぞれ設計した（ＥＰＯ：５'−ＮＮＮＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＡＴＧＴＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＴＧ−３'，５'−ＮＮＮＧＴＣＧＡＣＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＴＣＣＣＣＴＧＴ−３'；ＧＨ：５'−ＮＮＮＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＣＴＣＣＣＧＧＡＣＧＴＣＣ−３'，５'−ＮＮＮＧＴＣＧＡＣＣＴＡＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣＴＣＣＡＣ−３'；制限酵素部位を含む）。市販中の人細胞ｍＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用して製作されたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い（条件：９４℃ 、５分、３５回への９４℃ ３０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ １分）、ＰＣＲの生成物を１％アガロースゲル電気泳動を利用して確認した。ＨｉＹｉｅｌｄｇｅｌ／ＰＣＲＤＮＡＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＲｅａｌＧｅｎｏｍｉｃｓ）を利用してＰＣＲ生成物を精製し、精製されたＰＣＲ生成物の全長ｃＤＮＡをｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙｃｌｏｎｉｎｇｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に挿入した。標的遺伝子が挿入されたベクターをＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α細胞に形質転換した後、形成れた白いコロニーを５ｍｌのＬＢ培地で１６時間培養した。Ｐｌａｓｍｉｄｓｐｉｎｋｉｔ（Ｇｎｅｍｅｄ）を利用して培養された細胞からプラスミドを抽出し、分離されたプラスミドは制限酵素ＥｃｏＲＩを利用して切断した。切断後、アガロースゲル電気泳動を行いｈＥＰＯとｈＧＨ遺伝子の挿入を確認し、挿入が確認されたベクターは、Ｓｐ６逆方向プライマーとＴ７正方向プライマーを利用して塩基序列を最終決定した。

標的遺伝子を導入し発現するため'ＣＭＶｐｒｏｍｏｔｏｒ' ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍを利用しようと、CMVプロモーターを含む遺伝子発現系であるｐＣＭＶ_ＥＧＦＰ−Ｃ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を選んで組換遺伝子を製作した。まず、ベクターに含まれている緑色蛍光たんぱく質（ＥＧＦＰ）標識遺伝子を制限酵素ＮｈｅＩとＢａｍＨＩで切断して除去した。また標的遺伝子が含まれたクローンも前記と同様の制限酵素で切断して標的遺伝子を分別抽出した。前記ベクターと標的遺伝子を混ぜた後、Ｔ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅで４℃で１６時間組換遺伝子を製作した（CMVプロモーターを含む遺伝子発現系であるｐＣＭＶ−ｈＥＰＯ，ｐＣＭＶ−ｈＧＨ）。これを大腸菌宿主に再度形質転換させ大量増幅し、その組換遺伝子を精製して形質転換ベクターとして使用した。

前記製作されたCMVプロモーターを含む組換遺伝子発現ベクター（ｐＣＭＶ−ｈＥＰＯ，ｐＣＭＶ−ｈＧＨ）の導入模式図を図３に示した。
実施例３：形質転換されたミミズ（Ｐｅｘ−ｈＥＰＯ，Ｐｅｘ−ｈＧＨ）の作製及び発現確認

山ミミズの生殖巣を含む前半部を切断した後、２４時間以内に、再生が始まったミミズの再生芽細胞部位に前記実施例２で製作したCMVプロモーターを含む組換遺伝子発現ベクター（ｐＣＭＶ−ｈＥＰＯ，ｐＣＭＶ−ｈＧＨ）を０．３〜０．５μｇ／μｌの濃度で注入し、初期再生期間である２週間十分に水分を供給し続け、代を次いで培養した。ある程度初期再生が完了したミミズは、再び餌の供給を再開するため、一定の方法で組成された土壌に投入して湿度７０％、温度２３±２℃に自動調節される恒温槽で飼育した。前記形質転換されたミミズをそれぞれＰｅｘ−ｈＥＰＯとＰｅｘ−ｈＧＨと命名した。

３−１．形質転換されたミミズのｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡで標的遺伝子の検出

形質転換されたミミズのｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡに標的遺伝子が成功的に挿入されたかを確認するため、下記のような実験を行った。

再生が完成した形質転換ミミズを２日間濡れた紙のタオルが敷かれた試験ボックスに入れて内臓を空にさせた後、再生された前半部を再び切断してＥｌＡｄｌｏｕｎｉなど（１９９５, ＭｏｌｅａｎｄＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍ１４２：１９−２３）の方法に従ってミミズのｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡを抽出した。抽出したｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い（条件；９４℃ ５分、３５回への９４℃ ３０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ １分）、ＰＣＲの生成物を１％アガロースゲル電気泳動を利用してｈＥＰＯとｈＧＨ遺伝子の挿入を確認した。

形質転換されたミミズのｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡＰＣＲを通じたｈＥＰＯとｈＧＨ遺伝子の検出は、それぞれ図４及び図５に示した。

図４及び図５に示したとおり、ＰＣＲ生成物のｈＥＰＯ遺伝子は、５８２ｂｐであらわれ、ｈＧＨ遺伝子は６５４ｂｐであらわれることを確認した。

３-２．形質転換されたミミズに挿入された標的遺伝子から人組換たんぱく質（ｈＥＰＯ，ｈＧＨ）の発現検証

形質転換されたミミズに挿入された標的遺伝子から人組換たんぱく質（ｈＥＰＯ，ｈＧＨ）が発現するか否かを確認するため、免疫ブロッティング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）分析を行った。形質転換されたミミズから１００％エチルアルコール（Ｍｅｒｃｋ）を使用してミミズの体液を抽出し、抽出液に溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ）を入れて攪拌機で３００〜５００ｒｐｍの速度で均質粉砕した。均質液を１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、アセトン沈殿法を通じて水溶性たんぱく質を収得した。得られたたんぱく質をｐｕｒｅｄｏｗｎＰｒｏｔｅｉｎＡ／Ｇａｇａｒｏｓｅｋｉｔ（ＧｅｎＤｅｐｏｔ）に精製して１０％ポリアクリルアミドゲルでたんぱく質を電気泳動して分離し、電気泳動したゲルをＰＶＤＦｍｅｍｂｒａｎｅでＭｉｎｉ−ｇｅｌｔｒａｎｓｆｅｒｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して７０Ｖで１時間伝達した。分別されたたんぱく質が伝達されたｍｅｍｂｒａｎｅを１×ＴＢＳＴで洗った後、標的たんぱく質に対する１次抗体が１：２０００の割合で希釈された遮断溶液（ｂｌｏｃｋｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎ）に入れて１時間攪拌させた。再度ＴＢＳＴで１５分ずつ４回洗浄し、２次抗体が１：５０００の割合で希釈された遮断溶液に十分反応させＴＢＳＴで１５分ずつ４回洗浄した。標的たんぱく質の存在の有無を観察するため、ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）で染色し、ＥＣＬｋｉｔ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）のＳｏｌｕｔｉｏｎＡ（Ｌｕｍｉｎｏｌとｅｎｈａｎｃｅｒ含む）とＳｏｌｕｔｉｏｎＢ（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅ含む）を同量混ぜた後、１分間振った後、ｍｅｍｂｒａｎｅに混合したＥＣＬ溶液を加えて１分間満遍なく攪拌させＧｅｌＤｏｃｕｍｅｎｔＳｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で撮影して標的たんぱく質の反応を検出した。

形質転換されたミミズの体液で分離した人組換たんぱく質（ｈＥＰＯ，ｈＧＨ）が発現するか否かを免疫ブロッティングで分析した結果はそれぞれ図６及び図７に示した。

図６及び図７に示したとおり、形質転換されたミミズの体液で分離した人組換たんぱく質（ｈＥＰＯ）は、約３９ＫＤａで発現され、人組換たんぱく質（ｈＧＨ）は約３７ＫＤａで発現された。
実施例４：発現された組換たんぱく質（ＥＰＯ）の生物活性の検証

発現された組換たんぱく質の生理活性を測定するため、ミミズの体液から抽出したｈＥＰＯをマウスに投与し、その活性を測定した。具体的には、抽出したミミズの体液を凍結乾燥した後、再び生理食塩水に乾燥粉末が５０％の濃度になるよう溶解させ、これをマウスに口腔投与、腹腔注射及び皮下注射の方法で注入した。注入後、ＥＰＯによる血色素含量の変化をマウスの目から採血した血液の赤血球容積率（ｈｅｍａｔｏｃｒｉｔ）を測定して確認した。また、口腔投与したマウスから抽出した血液のｈＥＰＯが存在するか否かを前記実施例３−２と同様に免疫ブロッティング方法で確認した。

ミミズの体液から抽出したｈＥＰＯを皮下及び腹腔注射したマウスの血色素含量変化は図８に示し、ミミズの体液から抽出したｈＥＰＯを経口投与したマウスの血色素含量変化と血液でｈＥＰＯが存在するか否かを免疫ブロッティングで検査した結果は図９に示した。

図８に示したとおり、ミミズの体液から抽出したｈＥＰＯを皮下及び腹腔注射したマウスの血色素含量は、それぞれ５９．７％と６７．０％を示し、ｈＥＰＯを処理しないマウスの血色素含量は、５２．８％を示した。

また、図９に示したとおり、ミミズの体液から抽出したｈＥＰＯを経口投与したマウスの血色素含量は、投与１日目に５５．８％、２日目に５８．３％、１週目に５６．６％を示し、人組換たんぱく質（ｈＥＰＯ）が発現されることを確認した。また、ｈＥＰＯを処理しないマウスの血色素含量は、５５．１％〜５５．５％と殆ど変化が無かった。

本発明によるミミズの生殖巣再生能力を利用した形質転換ミミズの作製方法は、従来の形質転換技術の短所を補完する形態の新しい生命工学的技法で高い注入効率性を有し、胚性幹細胞のような全能性を有する再生芽細胞を使用することで、形質転換体の全ての部位に組換遺伝子を挿入することができるため、形質転換体の体液を通じて組換たんぱく質を生産することができ、生殖巣に標的遺伝子を直接投入することで、代理母（動物）が必要とされず、生殖可能な形質転換体を利用するため、持続的に多数の形質転換体を生産することができ、既存の形質転換技術より簡単で、且つ、高価の装備及び熟練した技術を必要としない。

Claims

１）ミミズの生殖巣を含む前半部を切断した後、再生を誘導して再生芽細胞を形成する段階、２）CMVプロモーターを含む遺伝子発現系（'ＣＭＶｐｒｏｍｏｔｏｒ' ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ）に標的遺伝子を導入して組換遺伝子発現ベクターを作製する段階、３）前記１）段階で切断した後、２４時間以内に再生が始まったミミズの再生芽細胞部位に前記２）段階で作製した組換遺伝子発現ベクターを注入し、代を次いで培養して形質転換されたミミズを作製する段階、を含む、ミミズの生殖巣再生能力を利用した形質転換ミミズの作製方法。
前記ミミズは、前半部に生殖巣を含むミミズであることを特徴とする請求項１に記載の形質転換ミミズの作製方法。
前記ミミズは、環形動物（Ａｎｎｅｌｉｄｓ）多毛類（Ｐｏｌｙｃｈａｅｔａ）或いは環形動物（Ａｎｎｅｌｉｄｓ）貧毛類（Ｏｌｉｇｏｃｈａｅｔａ）に属するミミズであることを特徴とする請求項２に記載の形質転換ミミズの作製方法。
前記ミミズは、山ミミズ（Ｐｅｒｉｏｎｙｘｅｘｃａｖａｔｕｓ）或いはヤマトヒメミミズ（Ｅｎｃｈｙｔｒａｅｕｓｊａｐｏｎｅｎｓｉｓ）であることを特徴とする請求項３に記載の形質転換ミミズの作製方法。
前記標的遺伝子は、成長ホルモン、成長ホルモン分泌誘導ホルモン、性腺ホルモン、性ホルモン分泌誘導ホルモン、インターフェロン類及びインターフェロン受容体類、コロニー刺激因子、インターロイキン類、エリスロポエチン、インシュリン、アンジオテンシン、トロンボポエチン、レプチン、レチノール結合因子、アディポネクチン、骨形成成長因子、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、神経成長因子類、細胞表面抗原、単一クローン抗体、ウイルス由来ワクチン抗原、血液凝固調節因子、プロラクチン、肥満抑制調節因子、抗酸化酵素（ＳＯＤ）及びたんぱく質分解酵素からなる群から選ばれた１種以上であることを特徴とする請求項１に記載の形質転換ミミズの作製方法。
請求項１から５のいずれか一項の方法により作製された形質転換ミミズ。
前記形質転換ミミズは、ｈＥＰＯ遺伝子が標的遺伝子として導入されている或いはｈＧＨ遺伝子が標的遺伝子として導入されていることを特徴とする請求項６に記載の形質転換ミミズ。
１）請求項６の形質転換ミミズからミミズの体液を得る段階、２）前記１）段階から得たミミズの体液に溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ）を入れて攪拌機で均質粉砕して均質液を得る段階、３）前記均質液を遠心分離し沈殿を通じて組換たんぱく質を収得する段階、４）前記収得された組換たんぱく質を精製及び分離する段階、を含む、組換たんぱく質の生産方法。
前記１）段階でミミズの体液は、アルコールを利用して抽出する方法、冷温水を含む温度調節装置の温度偏差を利用して抽出する方法、塩化ナトリウムを含む塩を利用して抽出する方法、体液抽出緩衝液（ｂｏｄｙｆｌｕｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ）を利用して抽出する方法、及び電気衝撃を利用して抽出する方法のうち選ばれた方法を利用してミミズから抽出して得られたことを特徴とする請求項８に記載の組換たんぱく質の生産方法。
前記組換たんぱく質は、成長ホルモン、成長ホルモン分泌誘導ホルモン、性腺ホルモン、性ホルモン分泌誘導ホルモン、インターフェロン類及びインターフェロン受容体類、コロニー刺激因子、インターロイキン類、エリスロポエチン、インシュリン、アンジオテンシン、トロンボポエチン、レプチン、レチノール結合因子、アディポネクチン、骨形成成長因子、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、神経成長因子類、細胞表面抗原、単一クローン抗体、ウイルス由来ワクチン抗原、血液凝固調節因子、プロラクチン、肥満抑制調節因子、抗酸化酵素（ＳＯＤ）及びたんぱく質分解酵素からなる群から選ばれた１種以上であることを特徴とする請求項８に記載の組換たんぱく質の生産方法。
明細書を補正する場合（段落単位）