CN113087787B - 一种蚯蚓血红蛋白分离及纯化方法 - Google Patents
一种蚯蚓血红蛋白分离及纯化方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种蚯蚓血红蛋白分离及纯化方法，将粗蚯蚓血红蛋白液采用双水相萃取制备高浓度蛋白液，高浓度蛋白液再经超滤纯化及层析分离后冻干成粉；双水相萃取的萃取剂由PEG6000、(NH4)2SO4、NaCl和H2O组成。本发明全程使用无毒试剂，所获得的蚯蚓血红蛋白提取率高，纯度高，活性好，耗时较短，可用于生物医学领域血红蛋白结构与功能精深研发。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质分离纯化技术领域，尤其涉及一种蚯蚓血红蛋白分离及纯化方法。
背景技术
蚯蚓血红蛋白分子由于在某些方面具备独特优势，在国外已成为血红蛋白氧载体研发领域新靶标，但国内尚无从蚯蚓分离纯化活性血红蛋白方法的公开文献。
特定蛋白分离技术主要由目标蛋白理化特性决定，但不同方法在获得率、纯度、活性、效率等方面有明显差异。蚯蚓体内血红蛋白含量极低，易受多种混杂蛋白影响，活性保护困难，使用常规的蛋白分离技术提纯蚯蚓血红蛋白，很难在获得率、纯度、活性、效率等方面取得满意效果。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是：如何从蚯蚓中高效分离纯化活性蚯蚓血红蛋白。
为了解决上述的技术问题，本发明采用了如下的技术方案：一种蚯蚓血红蛋白分离及纯化方法包括以下步骤：
一种蚯蚓血红蛋白分离及纯化方法，包括制备粗蚯蚓血红蛋白液、超滤纯化、层析分离、制备冻干粉，其特征在于将粗蚯蚓血红蛋白液采用双水相萃取制备高浓度蛋白液，高浓度蛋白液再经超滤纯化及层析分离后制成冻干粉；所述双水相萃取的萃取剂由PEG6000、(NH4)2SO4、NaCl和H2O组成，PEG6000质量分数为10％-12％，(NH4)2SO4质量分数为9％-11％，NaCl质量分数为范围为0.1％-1.0％，其余为H2O。
双水相萃取的萃取剂各组方最佳质量分数为PEG6000 10％、(NH4)2SO49％、NaCl0.5％，其余为H2O。
本发明的一种蚯蚓血红蛋白分离及纯化方法要求在2-8℃低温环境中进行，所有操作需要轻柔。
双水相萃取时按以下进行操作：将粗蚯蚓血红蛋白液加入到萃取剂轻轻摇匀，于2-8℃环境，静置萃取3.4h-16.2h，收集下层红色液体，于12000r/min，2-8℃，30min离心，去沉淀，去上层少许淡黄色液体，得到高浓度蛋白液。
所述的萃取剂与粗蚯蚓血红蛋白液的质量比例比为4∶1-6∶1。
所述的制备粗蚯蚓血红蛋白液按以下操作进行：
1)将鲜活的蚯蚓用洁净水洗净；
2)将洗净的蚯蚓置于2-8℃纯水中2-4h，待蚯蚓腔内容物排出后捞出蚯蚓；
3)再用2-8℃纯水再次清洗，放入组织匀浆机中搅碎，制成蚯蚓组织匀浆；
4)将蚯蚓组织匀浆离心，取上层暗红色液体，再次离心，取上层清液即为粗蚯蚓血红蛋白液。
本方法全程在低温环境中进行，低温为2-8℃。
所述的超滤纯化为使用100kDa超滤离心管进行超滤纯化。
层析分离使用葡聚糖凝胶G200装柱，使用2-8℃0.9％NaCl水溶液洗脱。
制备冻干粉步骤包括层析分离所得的浓缩液体置于-20℃中完全冻结，再使用真空低温冷冻干燥机冷冻干燥。
真空低温冷冻干燥机设置为真空度0.37mbar，温度-30℃。
1)制备粗蚯蚓血红蛋白液：
a.将鲜活的蚯蚓用洁净水洗净；
b.置于2-8℃纯水中2-4h，待蚯蚓腔内容物排出；
c.用2-8℃纯水再次清洗后，置于组织匀浆机中搅碎，制成蚯蚓组织匀浆；
d.将蚯蚓组织匀浆离心；
e.取上层暗红色液体，再次离心；
f.取上层清液即为粗蚯蚓血红蛋白液；
2)双水相萃取：
a.选取PEG6000、(NH4)2SO4、NaCl、H2O建立双水相萃取体系；
b.确定各组分最佳配比浓度范围；
c.缓慢加入适量的粗蚯蚓血红蛋白液，使用超声波促进溶解，制成萃取混合液、静置于2-8℃的低温环境中，静置3.4h-16.2h后收集下层红色液体；
d.将收集到的下层红色液体离心分离，去掉沉淀及上层淡黄色液体，取得红色的高浓度蛋白液。
3)超滤纯化；
将高浓度蛋白液加入到超滤管中，采用离心超滤的方式，滤膜使用100kDa。在此过程中，重复加入与滤出液同体积的2-8℃低温纯水，多次离心超滤后，直至滤出液成分接近纯水，离心超滤过程完成。超滤纯化液密闭保存在2-8℃低温环境中。
4)层析分离；
a.装柱：选择葡聚糖凝胶颗粒G200装填；
b.平衡：NaCl水溶液预冷层析柱；
c.上样：超滤纯化液2ml，湿法上样；
d.洗脱：使用低温NaCl水溶液洗脱；
e.收样：待洗脱液体稍变红，立刻使用1.5-2.5ml EP管收集洗脱液，依次编号，每管收集1ml。当洗脱液接近无色时，停止收样；
f.绘制洗脱曲线：将各管洗脱液取20μl，利用氰化高铁血红蛋白法依次测量其540nm处吸光度值，绘制蛋白洗脱曲线；
g.选样：选取占洗脱曲线峰面积约80％的对应样本，合并；
h.浓缩：超滤离心，得蚯蚓血红蛋白高纯浓缩液；
5)制备冻干粉；
a.层析分离所得的蚯蚓血红蛋白高纯浓缩液置于-20℃中完全冻结；
b.放于真空低温冷冻干燥机3h-6h，冷冻干燥，获得蚯蚓血红蛋白粉；
所有步骤在2-8℃环境中完成，减少室温暴露时间有利于蚯蚓血红蛋白活性保护。所有操作应该轻柔，粗暴操作可能影响结果。
针对目前蚯蚓血红蛋白分离提取困难的问题，发明人建立了一种蚯蚓血红蛋白分离及纯化方法，包括制备粗蚯蚓血红蛋白液、超滤纯化、层析分离、制备冻干粉，将粗蚯蚓血红蛋白液采用双水相萃取制备高浓度蛋白液，高浓度蛋白液再经超滤纯化及层析分离后制成冻干粉；所述双水相萃取的萃取剂由PEG6000、(NH4)2SO4、NaCl和H2O组成。为获得更好的技术效果，发明人深入研究了双水相萃取体系，获得各组分的最佳配比。
本发明所获得的有益效果是：本发明通过建立双水相萃取体系提高提取率并缩短萃取时间，随后使用超滤纯化、层析分离、制备冻干粉，全程采用无毒试剂，在2-8℃环境实施，保障纯度和活性，获取蚯蚓血红蛋白纯度＞76％，提取率＞71％，以血氧分析仪可检测到携氧活性，以SDS-PAGE电泳及扫描光谱可检测到特征结构。
附图说明
图1是PEG6000/(NH4)2SO4双水相体系相图。
图2是通过本发明获得的蚯蚓血红蛋白携氧活性检测图。图中P50＝9.44mmHg。
图3是通过本发明获得的蚯蚓血红蛋白SDS-PAGE电泳鉴定图。图中A为Hr三聚体，B为Hr四条连接链(27-30kDa)浓集带，C为珠蛋白(a17.5kDa、b16.3kDa、c17.3kDa)浓集带，D为珠蛋白d链(15.9kDa)。
图4是通过本发明获得的蚯蚓血红蛋白紫外光谱鉴定图。图中以牛血红蛋白(BHb)为对照，蚯蚓血红蛋白(Hr)具备Soret带(416nm)及更明显的Q带特征吸收峰(540nm，576nm)。
图5是通过本发明获得的蚯蚓血红蛋白红外光谱鉴定图。图中1655，1540，1397和1250cm-1谱带，分别为Hr主链肽键产生的酰胺I、酰胺II、酰胺IV和酰胺V带，与牛血红蛋白(BHb)吸收带非常接近。
具体实施方式
实施例1 将鲜活的赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)用自来水洗净，去除泥土、黏液等。将洗净的蚯蚓浸泡于4℃纯水中，静置2h后将蚯蚓再次用4℃纯水清洗，再将蚯蚓置于组织匀浆机中搅碎，6000-7000r/min，15s，制成蚯蚓匀浆。将蚯蚓匀浆离心，4℃，6000r/min，40min，取上层暗红色液体，再次离心：12000r/min，4℃，30min。取上层清液粗蚯蚓血红蛋白液，密封保存待用。
以PEG6000、(NH4)2SO4、NaCl和H2O，配制萃取剂混合液：PEG6000质量分数为10％，(NH4)2SO4质量分数为为9％，NaCl质量分数为为0.1％，其余为H2O。配制好轻轻摇匀后冷却至4℃，按萃取剂：粗蚯蚓血红蛋白液质量比6∶1将粗蚯蚓血红蛋白液加入到萃取剂中，轻轻摇匀，于4℃环境萃取，萃取时间为7.2h，收集下层红色液体，于12000r/min，4℃，30min离心，去沉淀，去上层少许淡黄色液体，得到高浓度蛋白液。
将高浓度蛋白液置于100kDa超滤离心管中，4000r/min，30min超滤，再次加入与滤除液等质量4℃纯水，4000r/min，30min超滤。再次加入与滤除液等质量4℃纯水，4000r/min，30min超滤，取滤除液备用。
选用葡聚糖凝胶G200装填层析柱，使用4℃的0.9％NaCL水溶液，设定流速为1ml/min。取滤除液2ml，湿法上样，待洗脱液体稍变红，立刻使用2.5ml EP管收集洗脱液，依次编号，每管收集1ml。当洗脱液接近无色时，停止收样。绘制洗脱曲线：将各管洗脱液取20μl，利用氰化高铁血红蛋白法依次测量其540nm处吸光度值，绘制蛋白洗脱曲线，选取占洗脱曲线峰面积约80％的对应样本，合并。然后再超滤离心得层析浓缩液。
将层析浓缩液置于-20℃中完全冻结后，使用真空低温冷冻干燥机进行冷冻干燥，真空低温冷冻干燥机最好设置为真空度0.37mbar，温度-30℃，即可获得纯度为87％蚯蚓血红蛋白粉，提取率为85％。
实施例2 将鲜活的赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)用自来水洗净，去除泥土、黏液等。将洗净的蚯蚓浸泡于4℃纯水中，静置2h后将蚯蚓再次用4℃纯水清洗，再将蚯蚓置于组织匀浆机中搅碎，6000-7000r/min，15s，制成蚯蚓匀浆。将蚯蚓匀浆离心，4℃，6000r/min，40min，取上层暗红色液体，再次离心：12000r/min，4℃，30min。取上层清液粗蚯蚓血红蛋白液，密封保存待用。
以PEG6000、(NH4)2SO4、NaCL和H2O，配制萃取剂混合液：PEG6000质量分数为12％，(NH4)2SO4质量分数为11％，NaCl质量分数为1.0％，其余为H2O。配制好轻轻摇匀后冷却至4℃，按萃取剂：粗蚯蚓血红蛋白液质量比4∶1将粗蚯蚓血红蛋白液加入到萃取剂中，轻轻摇匀，于4℃环境，静置萃取，萃取时间为16.2h，收集下层红色液体，于12000r/min，4℃，30min离心，去沉淀，去上层少许淡黄色液体，得到萃取液。
萃取液置于100kDa超滤离心管中，4000r/min，30min超滤，再次加入与滤除液等质量4℃纯水，4000r/min，30min超滤，再次加入与滤除液等质量4℃纯水，4000r/min，30min超滤，取滤除液备用。
选用葡聚糖凝胶G200装填层析柱，使用4℃的0.9％NaCl水溶液，设定流速为1ml/min。取滤除液2ml，湿法上样，待洗脱液体稍变红，立刻使用2.5ml EP管收集洗脱液，依次编号，每管收集1ml。当洗脱液接近无色时，停止收样。绘制洗脱曲线：将各管洗脱液取20μl，利用氰化高铁血红蛋白法依次测量其540nm处吸光度值，绘制蛋白洗脱曲线，选取占洗脱曲线峰面积约80％的对应样本，合并。然后再超滤离心得层析浓缩液。
将层析浓缩液置于-20℃中完全冻结后，使用真空低温冷冻干燥机进行冷冻干燥，真空低温冷冻干燥机最好设置为真空度0.37mbar，温度-30℃，即可获得纯度为76％的蚯蚓血红蛋白粉，提取率为71％。
实施例3 将鲜活的赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)用自来水洗净，去除泥土、黏液等。将洗净的蚯蚓浸泡于4℃纯水中，静置2h后将蚯蚓再次用4℃纯水清洗，再将蚯蚓置于组织匀浆机中搅碎，6000-7000r/min，15s，制成蚯蚓匀浆。将蚯蚓匀浆离心，4℃，6000r/min，40min，取上层暗红色液体，再次离心：12000r/min，4℃，30min。取上层清液粗蚯蚓血红蛋白液，密封保存待用。
建立双水相萃取体系：由于PEG6000和(NH4)2SO4在水中达到一定浓度时才能形成两相才能形成两相，只有当成相组分的配比在曲线的上方时，才能自动分为两相。所以首先绘制PEG6000和(NH4)2SO4双水相相图，如图1。由于各组分浓度在曲线上方才能形成萃取体系，由此初步筛选(NH4)2SO4起始浓度为9％，PEG6000起始浓度为10％。
确定最优(NH4)2SO4质量分数：向A组1号至7号试管中加入1.0g的PEG6000粉末，2.0g的粗蚯蚓血红蛋白液，分别加入0.9g至1.5g等梯度的(NH4)2SO4粉末，用纯水补足总质量到10.0g，方法见表1。充分溶解后，于4℃冰箱中静置萃取。结果表明当PEG6000的量固定为10％时，(NH4)2SO4质量分数9％时Hr的分配系数K值最大，T最小，见表2。筛选出最优质量分数(NH4)2SO4为9％。
表1 A组各试管药物质量一览表
表2：(NH4)2SO4质量分数对萃取的影响
注：相比R＝下相体积/上相体积，Hr分配系数k＝下相Hr浓度/上相Hr浓度，萃取率Y＝RK/(1+RK)×100％。
确定最优PEG6000质量分数。在B组1号至7号试管中加入0.9g的(NH4)2SO4粉末，2.0g的粗蚯蚓血红蛋白液，分别加入1.0g至1.6g等梯度的PEG6000粉末，用纯水补足总质量到10.0g，具体方法见表3。充分溶解后，于4℃冰箱中萃取，结果表明随着PEG6000质量分数的增加，K、R和Y都呈现减小的趋势，并且在PEG6000质量分数为10.0％时，K和Y都达到最大值，见表4。
表3 B组各试管药物质量一览表
表4 PEG6000质量分数对萃取的影响
确定最优NaCl质量分数。在C组1号至7号试管中加入0.9g的(NH4)2SO4粉末，1.0g的PEG6000粉末，2g的粗蚯蚓血红蛋白液，分别加入0.005g至0.035g等梯度的NaCl粉末，用纯水补足总质量到10.0g，具体方法见表5。充分溶解后，于4℃冰箱中萃取，结果在NaCl质量分数为0.5％时，K和Y都达到最大值，见表6。
表5 C组各试管药物质量一览表
表6 NaCl质量分数对萃取的影响
最后确定PEG6000、(NH4)2SO4双水相最佳配比参数为：PEG6000 10％、(NH4)2SO49％、NaCl 0.5％。据此，以PEG6000、(NH4)2SO4、NaCl和H2O，配制萃取剂混合液，轻轻摇匀后冷却至4℃。
按萃取剂：粗蚯蚓血红蛋白液质量比5∶1将粗蚯蚓血红蛋白液加入到萃取剂中，轻轻摇匀，于4℃环境静置萃取，萃取时间为3.4h，收集下层红色液体，于12000r/min，4℃，30min离心，去沉淀，去上层少许淡黄色液体，得到萃取液。
盐析萃取液置于100kDa超滤离心管中，4000r/min，30min超滤，再次加入与滤除液等质量4℃纯水，4000r/min，30min超滤，再次加入与滤除液等质量4℃纯水，4000r/min，30min超滤，取滤除液备用。
选用葡聚糖凝胶G200装填层析柱，使用4℃的0.9％NaCl水溶液，设定流速为1ml/min。取滤除液2ml，湿法上样，待洗脱液体稍变红，立刻使用2.5ml EP管收集洗脱液，依次编号，每管收集1ml。当洗脱液接近无色时，停止收样。绘制洗脱曲线：将各管洗脱液取20μl，利用氰化高铁血红蛋白法依次测量其540nm处吸光度值，绘制蛋白洗脱曲线，选取占洗脱曲线峰面积约80％的对应样本，合并。然后再超滤离心得层析浓缩液。
将层析浓缩液置于-20℃中完全冻结后，使用真空低温冷冻干燥机进行冷冻干燥，即可获得蚯蚓血红蛋白，真空低温冷冻干燥机最好设置为真空度0.37mbar，温度-30℃。
采用实施例3的方案所获蚯蚓血红蛋白粉纯度达96.2％，提取率达95.5％，血氧分析仪检测可见活性良好，如图2；以SDS-PAGE电泳可见珠蛋白肽链浓集带，如图3；紫外光谱检测可见Soret带(416nm)及Q带特(540nm，576nm)征吸收峰，如图4；红外光谱可见Hr主链酰胺I、酰胺II、酰胺IV和酰胺V特征吸收带位于1655，1540，1397和1250cm-1，如图5。
从以上实施例可以得出，使用本方法可以获得纯度在76％-96.2％的高纯度蚯蚓血红蛋白，提取率在71％-95.5％，提取出的蚯蚓血红蛋白活性良好，耗时较短，可用于生物医学领域血红蛋白结构与功能精深研发。
Claims (9)
1.一种蚯蚓血红蛋白分离及纯化方法，包括制备粗蚯蚓血红蛋白液、超滤纯化、层析分离、制备冻干粉，其特征在于将粗蚯蚓血红蛋白液采用双水相萃取制备高浓度蛋白液，高浓度蛋白液再经超滤纯化及层析分离后制成冻干粉；所述双水相萃取的萃取剂由PEG6000、(NH4)2SO4、NaCl和H2O组成，PEG6000质量分数为10％-12％，(NH4)2SO4质量分数为9％-11％，NaCl质量分数为范围为0.1％-1.0％，其余为H2O；所述双水相萃取按以下进行操作：将粗蚯蚓血红蛋白液加入萃取剂轻轻摇匀，于2-8℃环境,静置萃取3.4h-16.2h，收集下层红色液体，于12000r/min，30min离心，去沉淀，去上层少许淡黄色液体，得到高浓度蛋白液。
2.根据权利要求1所述的蚯蚓血红蛋白分离及纯化方法，其特征在于所述双水相萃取的萃取剂中各组分质量分数为PEG6000：10％、(NH4)2SO4：9％、NaCl:0.5％，其余为水。
3.根据权利要求1所述的蚯蚓血红蛋白分离及纯化方法，其特征在于所述萃取剂与粗蚯蚓血红蛋白液的质量比例比为4:1-6:1。
4.根据权利要求1所述的蚯蚓血红蛋白分离及纯化方法，其特征在于制备粗蚯蚓血红蛋白液按以下操作进行：
1)将鲜活的蚯蚓用洁净水洗净；
2)将洗净的蚯蚓置于2-8℃纯水中2-4h，待蚯蚓腔内容物排出后捞出蚯蚓；
3)再用2-8℃纯水再次清洗，放入组织匀浆机中搅碎，制成蚯蚓组织匀浆；
4)将蚯蚓组织匀浆离心，取上层暗红色液体，再次离心，取上层清液即为粗蚯蚓血红蛋白液。
5.根据权利要求1所述的一种蚯蚓血红蛋白分离及纯化方法，其特征在于该法全程在低温环境中进行。
6.根据权利要求5所述的一种蚯蚓血红蛋白分离及纯化方法，其特征在于所述的低温为2-8℃。
7.根据权利要求1所述的一种蚯蚓血红蛋白分离及纯化方法，其特征在于所述的超滤纯化为使用100kDa超滤离心管进行超滤纯化。
8.根据权利要求1所述的一种蚯蚓血红蛋白分离及纯化方法，其特征在于所述的层析分离使用葡聚糖凝胶颗粒G200装柱，使用2-8℃0.9％NaCl水溶液洗脱后浓缩，获得层析高纯浓缩液体。
9.根据权利要求1所述的一种蚯蚓血红蛋白分离及纯化方法，其特征在于所述的制备冻干粉包括层析浓缩液体置于-20℃中完全冻结，再使用真空低温冷冻干燥机冷冻干燥。
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0278473A1 (en) * | 1987-02-10 | 1988-08-17 | Drug Delivery Systems Inc. | Electrolytic transdermal delivery of proteins |
| CN102603889A (zh) * | 2011-01-20 | 2012-07-25 | 赣南师范学院 | 一种钉螺呼吸蛋白的制备方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5545727A (en) * | 1989-05-10 | 1996-08-13 | Somatogen, Inc. | DNA encoding fused di-alpha globins and production of pseudotetrameric hemoglobin |
| CN1380319A (zh) * | 2001-04-10 | 2002-11-20 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种多肽——血红蛋白－9.24和编码这种多肽的多核苷酸 |
| CN1169836C (zh) * | 2002-04-11 | 2004-10-06 | 中南民族大学 | 液-固萃取体系分离纯化血红蛋白的方法 |
| CN101210918A (zh) * | 2006-12-31 | 2008-07-02 | 中国科学院沈阳应用生态研究所 | 生物标记物-蚯蚓内脏p450含量的测定方法 |
| CN101289493B (zh) * | 2008-04-22 | 2010-11-10 | 中国人民解放军第三军医大学野战外科研究所 | 一种从猪血中提取高纯度血红蛋白的方法 |
| EP2370470B1 (en) * | 2008-12-04 | 2016-10-05 | Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology | Screening of abundantly secreted proteins and their use as fusion partners for the production of recombinant proteins |
| KR101235297B1 (ko) * | 2009-10-22 | 2013-02-20 | (주)에코젠크래프트 | 지렁이의 생식소 재생능력을 이용한 형질전환 지렁이의 제조방법, 이에 의해 제조된 형질전환 지렁이, 및 형질전환 지렁이의 체액으로부터 재조합 단백질의 생산방법 |
| CN104936622B (zh) * | 2012-12-28 | 2019-05-28 | 塔弗达治疗有限公司 | 包封在颗粒中的靶向缀合物及其制剂 |
-
2021
- 2021-05-19 CN CN202110545013.7A patent/CN113087787B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0278473A1 (en) * | 1987-02-10 | 1988-08-17 | Drug Delivery Systems Inc. | Electrolytic transdermal delivery of proteins |
| CN102603889A (zh) * | 2011-01-20 | 2012-07-25 | 赣南师范学院 | 一种钉螺呼吸蛋白的制备方法 |
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