CN106432406A - 一种梅花鹿角盘小分子蛋白单体的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种梅花鹿角盘小分子蛋白单体的制备方法，包括：鹿角盘总肽的提取、总肽粗提物的除盐、反相高效液相层析分离鹿角盘蛋白单体、SDS‑PAGE电泳检测、电喷雾质谱检测、目标小分子蛋白的富集和冷冻干燥，一共七个步骤，通过电喷雾质谱及电泳检测收集物确定目标物的保留时间(洗脱时间)为28.93min，最终得到相对分子质量为18.907kDa的小分子蛋白单体PGRP，其纯度达到89％以上。

Description

一种梅花鹿角盘小分子蛋白单体的制备方法

技术领域

本发明涉及生物蛋白质技术领域，尤其涉及一种梅花鹿角盘小分子蛋白单体的制备方法。

背景技术

鹿角盘指的是雄性鹿在锯茸后残留在角柄上的骨化物，到了第二年新茸长出前自动脱落的盘状物质，也命名为“鹿花盘”、“鹿角帽”，主要含有多种必需氨基酸及多种矿物质元素。鹿角盘呈盔状或扁盔状，直径2-5cm，高2-4.5cm，表面为灰黄色或灰褐色，呈蜂窝状，底面较平并富有一定光泽，上部呈现出不规则的半球形形状，质地较为坚硬，颜色呈灰白色。近些年来，对于鹿角盘的成分主要从以下几个部分进行研究，主要是氨基酸、无机元素、蛋白多肽类物质等等，同时也有少量报道称鹿角盘中含有甾体类、多糖类等物质。

相比于分子量较大的蛋白，小分子蛋白及多肽更容易被机体所吸收从而具有更加明显的医疗保健效果，而蛋白质或多肽单体的研究及氨基酸序列的获得可以为蛋白质工程研究与基因工程研究之间搭建桥梁并为蛋白质组学的发展做出贡献，因此，近年来，越来越多的人把对梅花鹿角盘研究的目光集中在了小分子多肽、蛋白多肽单体上。姜薇用5mM的预冷醋酸钠溶液对梅花鹿角盘粉末中的可溶性蛋白进行搅拌提取，并通过醇沉、旋蒸、冻干、葡聚糖凝胶除盐、离子交换层析和高效液相法得到纯化的蛋白单体，电泳检测(SDS-PAGE)显示其相对分子质量大小为17.2kDa，经MALDI-TOF-MS鉴定，确定其为肽聚糖识别蛋白1(PGRP 1)，匹配的序列为RLYEIIQKWPHYRA，将其命名为cnPGRP1，并通过抑菌试验证明其具有明显的抑菌活性(志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、大肠杆菌、枯草杆菌)。黄凤杰等人通过pH3.5稀醋酸缓冲液匀浆提取、色谱柱Resource S纯化、Superdex 75凝胶柱层析、反相高效液相等方法得到相对分子质量大小为7.1276kDa的梅花鹿角盘多肽单体，将其给药于KK-ay小鼠观察其降糖活性，并建立胰岛素抵抗模型(利用高胰岛素诱发HepG2细胞)，研究该多肽对胰岛素抵抗HepG2细胞糖消耗的影响，结果显示，该多肽既可降低KK-ay小鼠血糖水平，又可显著促进胰岛素抵抗模型的糖消耗，说明该蛋白单体具有一定的降糖活性。唐任能通过超滤(中空纤维膜)、离子交换层析、凝胶过滤层析等手段纯化出一个相对分子质量大小为17.0kDa的小分子蛋白单体，经MALDI-TOF-MS分析发现其与哺乳动物的肽聚糖识别蛋白同源性较高，并发现该小分子蛋白单体对L929等细胞的增殖有显著影响。王志兵等人通过酶解得到梅花鹿角盘蛋白CPP，电泳检测(SDS-PAGE)其相对分子质量在8-15kDa之间，活性试验证明CPP能够抗大鼠乳腺增生，并对小鼠的吞噬功能产生显著影响。邱芳萍等人将梅花鹿角盘低温粉碎成粒度0.01mm的微粉后，45℃蒸馏水浸提并抽滤浸提液，上清液进行盐析得到蛋白沉淀并对蛋白沉淀进行复性，再通过透析及层析(Sephadex G-100)手段得到鹿角盘蛋白APPB，电泳检测(SDS-PAGE)其相对分子质量在20.1-31.0kDa之间，并对其进行醋酸致小鼠扭体实验，结果显示其具有镇痛作用。

相比于分子量较大的蛋白，小分子蛋白更容易被机体所吸收从而具有更加明显的医疗保健效果，而蛋白质单体的研究及氨基酸序列的获得可以为蛋白质工程研究与基因工程研究之间搭建桥梁并为蛋白质组学的发展做出贡献，因此，越来越多的人把对梅花鹿角盘研究的目光集中在了小分子蛋白单体上。

近年来使用频率最高的蛋白质及多肽一级结构的测定方法为Edman降解法和质谱测序法。Edman降解法是一种化学的测序法，是从肽链的N末端测定氨基酸残基的过程，自动测序仪就是基于此种原理制成的。但是现有的技术水平限制了自动测序仪最多只能测定N端的30～50个氨基酸，且所测蛋白越大，费用越昂贵，所以此种方式并不适用于分子量高于5kDa的小分子蛋白及多肽的全序列的测定。

发明内容

为了得到相对分子质量小，纯度高的梅花鹿角盘小分子蛋白单体，本发明提供一种梅花鹿角盘小分子蛋白单体的制备方法。

一种梅花鹿角盘小分子蛋白单体的制备方法，按照下述步骤进行：

步骤一：鹿角盘总肽的提取；

步骤二：总肽粗提物的除盐；

步骤三：反相高效液相层析分离鹿角盘蛋白单体；

步骤四：SDS-PAGE电泳检测；

步骤五：电喷雾质谱检测；

步骤六：目标小分子蛋白的富集；

步骤七：冷冻干燥。

优选的，鹿角盘总肽的提取，包括以下步骤：

步骤一：称取450-550g鹿角盘粉末，加入3000mL于4℃冰箱充分预冷的pH为3.2-3.8的醋酸-醋酸钠缓冲液，磁力搅拌器充分搅拌后，对匀浆液进行离心，取上清；向其中缓慢加入4℃冰箱充分预冷的95％乙醇直至上清液终浓度达到55％后，4℃冰箱放置并每隔1h搅拌一次，3.5-5h后离心，取上清；以上操作除旋转蒸发外均在4℃条件下进行；

步骤二：上清液用真空旋转蒸发仪在40℃-45℃条件下旋转蒸发至浓缩液体积为400mL左右；

步骤三：浓缩液过滤后置于大培养皿内，真空冷冻干燥机冻干，得梅花鹿角盘总肽粗提物，装于自封袋后于-20℃冰箱保存待用；

所述的步骤一中的两次离心的速度为5000-6500rpm，时间为25min。

优选的，总肽粗提物的除盐，包括以下步骤：

步骤一：取梅花鹿角盘总肽粗提物1.2-1.8g，用10mL去离子水溶解充分后，过0.45μm滤器，为上样液；

步骤二：用胶头滴管将上样液沿柱内壁缓缓滴入层析柱内并注意不要冲击胶面，用去离子水洗脱，并通过调节蠕动泵转速控制流速稳定在0.8-1.2mL/min，核酸蛋白检测仪在280nm处检测吸光值，出峰后用干净烧杯收集，待吸光值回归基线时停止收集，并继续用三倍柱体积去离子水洗脱，洗脱后关闭出水口；

步骤三：收集液冻干，装于自封袋后于-20℃冰箱保存待用。

优选的，反相高效液相层析分离鹿角盘蛋白单体，包括以下步骤：取梅花鹿角盘除盐品100mg，溶解于2mL 15％乙腈溶液中，过0.22μm微孔滤器，为进样液，流动相分为A、B两相，A相为：1mL色谱纯三氟乙酸(TFA)+1000mL脱气超纯水，B相为：0.85ml色谱纯三氟乙酸(TFA)+1000mL脱气乙腈，洗脱的梯度设置为：乙腈浓度0％，0-5min；0％-70％，5-35min；70％-100％，35-50min；进样量为每次梯度80μL进样液，进样液浓度为50mg/ml；检测波长为280nm；柱温22℃；流速1mL/min；每次梯度结束后，用20％乙腈平衡色谱柱40min，流速仍为1.0mL/min，收集各峰并保存于-20℃冰箱中。

优选的，目标小分子蛋白的富集，选择液相出峰时间为28.93min的的峰为目标进行富集。

反向高效液相各峰经SDS-PAGE电泳及电喷雾质谱检测后可以发现，液相出峰时间为28.93min处的峰为单一小分子蛋白且纯度和含量均较高，故以28.93min的峰为目标进行富集。经计算，在富集时，B相液的浓度为55.9％左右时目标峰会出现。

本发明所提供的梅花鹿角盘小分子蛋白单体的制备方法，包括：鹿角盘总肽的提取、总肽粗提物的除盐、反相高效液相层析分离鹿角盘蛋白单体、SDS-PAGE电泳检测、电喷雾质谱检测、目标小分子蛋白的富集和冷冻干燥，一共七个步骤，通过电喷雾质谱及电泳检测收集物确定目标物的保留时间(洗脱时间)为28.93min，最终得到相对分子质量为18.907kDa的小分子蛋白单体PGRP，其纯度达到89％以上。

附图说明

图1为实施例1中分析型反向高效液相层析图。

图2为实施例1中反向高效液相样品SDS-PAGE检测图。

图3为实施例1中28.93min处峰的质谱结果图。

图4为实施例1中32.80min处峰的质谱结果图。

图5为实施例1中富集液反相高效液相层析图。

图6为实施例2中富集液HPLC纯度检测结果图。

具体实施方式

实施例1

一种梅花鹿角盘小分子蛋白单体的制备方法，按照下述步骤进行：

步骤一：鹿角盘总肽的提取：称取500g鹿角盘粉末，加入3000mL于4℃冰箱充分预冷的pH 3.6的醋酸-醋酸钠缓冲液，磁力搅拌器充分搅拌后，对匀浆液进行离心(4℃，6000rpm，25min)，取上清，向其中缓慢加入4℃冰箱充分预冷的95％乙醇直至上清液终浓度达到55％后，4℃冰箱放置并每隔1h搅拌一次，4h后离心(4℃，6000rpm，25min)，取上清；上清液用真空旋转蒸发仪在45℃条件下旋转蒸发至浓缩液体积为400mL左右；浓缩液过滤后置于大培养皿内，真空冷冻干燥机冻干，得梅花鹿角盘总肽粗提物，装于自封袋后于-20℃冰箱保存待用；以上操作除旋转蒸发外均在4℃条件下进行，两次离心得到的沉淀分别于37℃烘箱中烘干后装于自封袋，低温保存；

步骤二：总肽粗提物的除盐：取梅花鹿角盘总肽粗提物1.5g，用10mL去离子水溶解充分后，过0.45μm滤器，为上样液；用胶头滴管将上样液沿柱内壁缓缓滴入层析柱内并注意不要冲击胶面，用去离子水洗脱，并通过调节蠕动泵转速控制流速稳定在1mL/min，核酸蛋白检测仪在280nm处检测吸光值，出峰后用干净烧杯收集，待吸光值回归基线时停止收集，并继续用三倍柱体积去离子水洗脱，洗脱后关闭出水口(洗脱后的层析柱可以再次使用)；收集液冻干，装于自封袋后于-20℃冰箱保存待用；

所述的步骤二的层析柱在使用前需进行平衡，包括以下步骤：称取30g SephadexG-25凝胶干粉置于1000mL烧杯中，向其中加入500mL去离子水，于沸水浴中溶胀2h，期间用玻璃棒轻轻搅拌促使凝胶溶胀充分，并观察是否有不均一的细小颗粒或杂质，如有需倾倒除去，使上清不再浑浊；待凝胶充分溶胀且上清不再浑浊后，真空减压除气泡，装柱；层析柱(Φ16mm×40cm)在装柱前需用0.2M氢氧化钠洗涤一遍，再用水冲洗干净，最后用蒸馏水和去离子水各清洗三遍；将柱子垂直固定于层析冷柜中，按顺序依次连接蠕动泵、核酸蛋白检测仪；在距离柱顶端5cm处做一标记为衡量灌装凝胶床体高度的依据；封住层析柱出水口，向柱底灌入1/4柱体积的去离子水，将盛装凝胶的烧杯中多余的去离子水缓慢倾倒出去直至剩余去离子水与凝胶体积的比为1∶1，玻璃棒轻轻搅拌使凝胶均匀悬浮在去离子水中后，将凝胶匀浆缓缓灌入柱中，待柱底部出现1～2cm左右的凝胶沉降后，打开层析柱出水口，蠕动泵控制流速为1mL/min；不断将凝胶匀浆缓缓灌入柱中以补充流出的去离子水直至凝胶沉降高于标记处2cm左右时停止，去离子水为流动相，使层析柱平衡12h；

步骤三：反相高效液相层析分离鹿角盘蛋白单体，包括以下步骤：取梅花鹿角盘除盐品100mg，溶解于2mL 15％乙腈溶液中，过0.22μm微孔滤器，为进样液，流动相分为A、B两相，A相为：1mL色谱纯三氟乙酸(TFA)+1000mL脱气超纯水，B相为：0.85ml色谱纯三氟乙酸(TFA)+1000mL脱气乙腈，洗脱的梯度设置为：乙腈浓度0％，0-5min；0％-70％，5-35min；70％-100％，35-50min；进样量为每次梯度80μL进样液，进样液浓度为50mg/ml；检测波长为280nm；柱温22℃；流速1mL/min；每次梯度结束后，用20％乙腈平衡色谱柱40min，流速仍为1.0mL/min，收集各峰并保存于-20℃冰箱中。

步骤四：采用Tricine-SDS-PAGE三层胶电泳，电泳目的为找到梅花鹿角盘小分子多肽混合物所在峰，具体的方法如下：

(1)垂直凝胶模具的固定：电泳所用玻璃板夹层宽度为1.0mm，用清水清洗玻璃板并用蒸馏水及去离子水润洗，将玻璃板固定于电泳槽中，坐于制胶夹上。

(2)凝胶的配制：分离胶的配制(5.0mL)：向干净的小烧杯中依次加入1.620mL去离子水、1.675mL凝胶缓冲液、1.675mL胶贮备液II、25μL 10％过硫酸铵和2.5μL TEMED，移液枪吹打均匀后灌胶，灌胶高度为4cm左右时停止灌胶，用移液枪向胶面上层灌入1mL异丙醇，室温下凝固1h。间层胶的配制(2.5mL)：滤纸除去异丙醇。向干净的小烧杯中依次加入1.149mL去离子水、0.838mL凝胶缓冲液、0.500mL胶贮备液I、12.5μL 10％过硫酸铵和1.25μL TEMED，移液枪吹打均匀后灌胶，灌胶高度为1.5cm左右时停止灌胶，用移液枪向胶面上层灌入1mL异丙醇，室温下凝固1h。浓缩胶的配制(2.5mL)：滤纸除去异丙醇。向干净的小烧杯中依次加入1.677mL去离子水、0.620mL凝胶缓冲液、0.200mL胶贮备液I、30μL 10％过硫酸铵和1.20μL TEMED，移液枪吹打均匀后灌胶，拆入制胶梳子，室温下凝固1h。

(3)样品处理和电泳：取分级分离收集峰液体20μL，加入等体积2×电泳上样缓冲液，移液枪吹打混匀10s。样品同电泳Marker共同沸水浴处理5min后，上样(蛋白Marker 10μL，样品25μL)。电泳起始电压为60V，当溴酚蓝指示线迁移至浓缩胶与间层胶分界线时将电压调至100V，待溴酚蓝指示线迁移至距离分离胶底0.2cm处时，关闭电泳仪，停止电泳。电泳过程中缓冲液保持冰浴。

(4)固定、染色和脱色：将胶片转移至干净大培养皿中，加入适量固定液，于摇床上固定1h。固定完毕后，倒掉固定液并用蒸馏水清洗胶片，加入染色液(考马斯亮蓝R-250)染色5h。染色完毕后，倒去染色液并用蒸馏水清洗胶片，脱色液脱色至背景干净为止。胶片于紫外成像仪中拍照并保存。

步骤五：电喷雾质谱检测；此部分由中国科学院长春应用化学研究所(质谱室)协助完成。质谱仪器型号为Thermo，LTQ XL电喷雾质谱仪。

步骤六：目标小分子蛋白的富集；

反向高效液相各峰经SDS-PAGE电泳及电喷雾质谱检测后可以发现，液相出峰时间为28.93min处的峰为单一小分子蛋白且纯度和含量均较高，故以28.93min的峰为目标进行富集。经计算，在富集时，B相液的浓度为55.9％左右时目标峰会出现。

富集所用仪器为瑞典AKTA purifier 215nm蛋白纯化系统(型号为AKTA PURIFIER100)，紫外分光光度检测器和二元梯度泵。所用色谱柱为半制备反相柱(Zorbax 300SBC18)，色谱柱规格为Zorbax 300SB C18 9.4×250mm制备柱。样品的处理：取梅花鹿角盘总肽200mg，溶解于2mL 15％乙腈溶液中，过0.45μm微孔滤器，为进样液。流动相分为A、B两相，A相为：1mL色谱纯三氟乙酸(TFA)+1000mL脱气超纯水，B相为：0.85ml色谱纯三氟乙酸(TFA)+1000mL脱气乙腈。洗脱的梯度设置为：乙腈浓度0％，0-5min；0％-70％，5-35min；70％-100％，35-50min。进样量为每次梯度500μL进样液(进样液浓度为100mg/mL)；检测波长为215nm；柱温40℃；流速1.8mL/min。每次梯度结束后，用20％乙腈平衡色谱柱40min，流速仍为1.8mL/min。收集目标峰，合并每次梯度收集液并保存于-20℃冰箱中。

步骤七：冷冻干燥。

将保存于-20℃冰箱的小分子蛋白富集液取出，待其融化后置于青瓶内，真空冷冻干燥，即获得梅花鹿角盘蛋白单体，于-20℃冰箱保存待用。

以下为总肽的反相高效液相层析(分析型)结果。

将梅花鹿角盘总肽经反向高效液相层析后，收集各峰共15管，按出峰时间依次标记为6.17min、6.80min、8.78min、13.8min、15.70min、18.84min、20.31min、20.76min、21.91min、23.51min、27.60min、28.93min、30.89min、31.99min及32.80min，如图1所示。在图1中，出现于3.2～4.0min处的大峰为溶剂峰(0～5min为浓缩样品走空样时期，此时出现的峰为溶剂峰，而非样品峰)。根据各峰代表物质的相对丰度(峰的高度与代表物质的相对丰度呈正相关)，我们选择13.8min、15.70min、18.84min、20.31min、20.76min、28.93min、30.89min及32.80min这8个峰进行进一步研究。

以下为分析型反相高效液相层析样品的SDS-PAGE电泳检测结果。

对8个峰进行电泳检测后我们发现电泳结果仅28.93min处峰出现了清晰的单一条带且条带位置为20.1kDa偏下。28.93min处峰电泳结果如图2所示。

以下为分析型反相高效液相层析样品的电喷雾质谱检测结果。

如图3和图4所示，通过质谱检测，我们发现了出峰时间为28.93min和32.80min的两处峰中所含小分子蛋白纯度较高，二者的分子量大小分别为18.907kDa和10.648kDa，但结合分析型反向高效液相层析结果图及两处峰的电泳结果，我们可知出28.93min处峰所含小分子蛋白(相对分子质量大小为18.907kDa)的含量要远远大于32.80min处峰所含小分子蛋白(相对分子质量大小为10.648kDa)的含量。因此，我们选择28.93min处的峰为目标峰，将相对分子质量为18.907kDa的梅花鹿角盘小分子蛋白确定为目标蛋白，进行下一步的富集。

目标蛋白(相对分子质量为18.907kDa的单体)的富集。

应用蛋白纯化仪进行了多次富集，共收集富集液20ml，富集时的反向高效液相层析图谱如图5所示。将富集液合并，取出40μL为富集液纯度检测样品，其余富集液经冷冻干燥后于-80℃冰箱中保存。

实施例2

对目标蛋白富集液进行HPLC纯度检测，所用仪器为岛津分析型HPLC仪(LC-10ATVP型)，紫外分光光度检测器和二元梯度泵。ACE分析型反相HPLC色谱柱(ACE-221-2546)，色谱柱的规格为ACE 5 C18-3004.6×250mm分析型柱。洗脱的梯度设置为：乙腈浓度0％，0-5min；0％-10％，5-15min；10％-60％，15-45min；60％-100％，45-50min。进样量为20μL。B液浓度为55.9％左右时目标峰会出现，对应时间应为40min左右。结果如下：

在新设置的梯度中，目标蛋白出现在39.4min左右，符合预期判断，且由图6可以看出目标蛋白纯度较高，符合测序要求(蛋白纯度达89％以上)。

实施例3

对目标蛋白进行质谱分析，得到如下结果：

此部分由北京协和医学院基础医学研究所(中国医学科学院基础医学研究所)协助完成。Mascot为蛋白质检索鉴定软件，检索数据库为NCBI。目标蛋白富集液酶解所用酶为胰蛋白酶。经过酶解后，应用串联质谱鉴定技术，对酶解片段进行MS/MS二级质谱鉴定，鉴定结果通过Mascot软件在NCBI蛋白质数据库中进行比对，找到匹配蛋白并进行分析，具体查询条件如表1所示。

表1 查询条件

经过酶解后，应用反向高效液相对酶解片段进行富集，应用串联质谱鉴定技术，对酶解片段进行MS/MS二级质谱鉴定，得到匹配的氨基酸序列为AAQSLLACGAARLYKIIQQWPHYRR，所得片段通过Mascot软件在NCBI蛋白数据库中进行比对，查得匹配蛋白为PGRP(肽聚糖识别蛋白)，分数为1634分，等电点为9.62。

综上所述：

在众多的蛋白多肽纯化方法中，高效液相色谱法(HPLC)因其回收率高、分离效果好等优点被越来越多的科研工作者所使用，而根据其分离原理的不同，主要分为反相高效液相色谱(reversed-phase HPLC，RP-HPLC)、离子交换色谱和凝胶过滤色谱等层析分离技术。本发明中，中小分子蛋白单体的分离就是采用了RP-HPLC的方法。RP-HPLC广泛应用于非极性物质的分离，也是蛋白质及多肽的分离纯化中常使用的方法。RP-HPLC的流动相为极性，固定相为非极性。最常见的固定相是通过化学反应将硅胶与烷基硅烷连接而制成的，其中使用的烷基硅烷包括C4、C8及C18。蛋白质在加样后与固定相结合，不同蛋白质因具有不同的疏水性与固定相结合的程度也会有所不同，在流动相极性溶剂的梯度洗脱下，结合不牢固的(极性大的)组分先于结合牢固(极性小的)的组分流出。流动相中最常使用的试剂是甲醇和乙腈，而向流动相中加入微量的三氟乙酸是为了与蛋白形成络合物从而缔合于固定相的疏水表面。在RP-HPLC过程中梯度的设置与调整是能否获得目标物纯品的决定性因素。

本发明中，在探索目的蛋白保留时间时采用的是分析型的液相仪与C18柱，为了确保样品与固定相的充分结合，在所设置梯度的前五分钟里将乙腈浓度调整为零(目的是开始液相的前五分钟里样品不会被洗出，而是在反相柱中与固定相充分结合)。电喷雾质谱及电泳检测收集物确定目标物的保留时间(洗脱时间)为28.93min，相对分子质量大小为18.907kDa。富集目标小分子蛋白所用的蛋白纯化系统可以增大上样量、增加流速从而节省时间，对富集物的纯度进行检测得知富集的相对分子质量为18.907kDa的小分子蛋白单体纯度达到89％以上，符合测序标准。

本实验的测序方式选用的是质谱测序法，此方法可以测定分子量相对较大的蛋白质及多肽的全序列，但前提是所测定的蛋白必须为已知蛋白。小分子蛋白经胰蛋白酶酶解后应用串联质谱鉴定技术，对酶解片段进行MS/MS二级质谱鉴定，鉴定结果为AAQSLLACGAARLYKIIQQWPHYRR，通过Mascot软件在NCBI蛋白质数据库中进行比对，发现其与PGRP蛋白相匹配。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种梅花鹿角盘小分子蛋白单体的制备方法，其特征在于，按照下述步骤进行：

步骤一：鹿角盘总肽的提取；

步骤二：总肽粗提物的除盐；

步骤三：反相高效液相层析分离鹿角盘蛋白单体；

步骤四：SDS-PAGE电泳检测；

步骤五：电喷雾质谱检测；

步骤六：目标小分子蛋白的富集；

步骤七：冷冻干燥。

2.如权利要求1所述的梅花鹿角盘小分子蛋白单体的制备方法，其特征在于，鹿角盘总肽的提取，包括以下步骤：

步骤一：称取450-550g鹿角盘粉末，加入3000mL于4℃冰箱充分预冷的pH为3.2-3.8的醋酸-醋酸钠缓冲液，磁力搅拌器充分搅拌后，对匀浆液进行离心，取上清；向其中缓慢加入4℃冰箱充分预冷的95％乙醇直至上清液终浓度达到55％后，4℃冰箱放置并每隔1h搅拌一次，3.5-5h后离心，取上清；以上操作除旋转蒸发外均在4℃条件下进行；

步骤二：上清液用真空旋转蒸发仪在40℃-45℃条件下旋转蒸发至浓缩液体积为400mL左右；

步骤三：浓缩液过滤后置于大培养皿内，真空冷冻干燥机冻干，得梅花鹿角盘总肽粗提物，装于自封袋后于-20℃冰箱保存待用；

所述的步骤一中的两次离心的速度为5000-6500rpm，时间为25min。

3.如权利要求1所述的梅花鹿角盘小分子蛋白单体的制备方法，其特征在于，总肽粗提物的除盐，包括以下步骤：

步骤一：取梅花鹿角盘总肽粗提物1.2-1.8g，用10mL去离子水溶解充分后，过0.45μm滤器，为上样液；

步骤二：用胶头滴管将上样液沿柱内壁缓缓滴入层析柱内并注意不要冲击胶面，用去离子水洗脱，并通过调节蠕动泵转速控制流速稳定在0.8-1.2mL/min，核酸蛋白检测仪在280nm处检测吸光值，出峰后用干净烧杯收集，待吸光值回归基线时停止收集，并继续用三倍柱体积去离子水洗脱，洗脱后关闭出水口；

步骤三：收集液冻干，装于自封袋后于-20℃冰箱保存待用。

4.如权利要求1所述的梅花鹿角盘小分子蛋白单体的制备方法，其特征在于，反相高效液相层析分离鹿角盘蛋白单体，包括以下步骤：取梅花鹿角盘除盐品100mg，溶解于2mL15％乙腈溶液中，过0.22μm微孔滤器，为进样液，流动相分为A、B两相，A相为：1mL色谱纯三氟乙酸+1000mL脱气超纯水，B相为：0.85ml色谱纯三氟乙酸+1000mL脱气乙腈，洗脱的梯度设置为：乙腈浓度0％，0-5min；0％-70％，5-35min；70％-100％，35-50min；进样量为每次梯度80μL进样液，进样液浓度为50mg/ml；检测波长为280nm；柱温22℃；流速1mL/min；每次梯度结束后，用20％乙腈平衡色谱柱40min，流速仍为1.0mL/min，收集各峰并保存于-20℃冰箱中。

5.如权利要求1所述的梅花鹿角盘小分子蛋白单体的制备方法，其特征在于，在进行目标小分子蛋白的富集时，选择液相出峰时间为28.93min的的峰为目标进行富集。