CN104984739B - 一种明胶亲和层析介质的制备方法及其应用 - Google Patents
一种明胶亲和层析介质的制备方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104984739B CN104984739B CN201510338852.6A CN201510338852A CN104984739B CN 104984739 B CN104984739 B CN 104984739B CN 201510338852 A CN201510338852 A CN 201510338852A CN 104984739 B CN104984739 B CN 104984739B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- affinity chromatography
- gelatin
- liquid
- chromatography medium
- volume
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
本发明涉及一种明胶亲和层析介质的制备及其利用明胶亲和层析介质分离纯化纤维连接蛋白的方法。将CNBr‑琼脂糖亲和层析介质用激活液清洗激活配基，再用结合液清洗；配制明胶溶液，加入已用结合液清洗的CNBr‑琼脂糖亲和层析介质，控温搅拌偶联；检测明胶偶联浓度，结合液清洗，封闭液控温搅拌封闭；酸清洗液和碱清洗液交替清洗，再用水清洗得到明胶亲和层析介质；将明胶亲和层析介质装入层析柱中；用平衡液平衡层析柱；将样品流穿明胶亲和层析介质；用清洗液清洗杂蛋白；用洗脱液洗脱纤维连接蛋白；用酸碱清洗液清洗再生明胶亲和层析介质。本发明所述一种明胶亲和层析介质的制备方法具有纯化效率高、生产周期短、工艺简单等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种明胶亲和层析介质的制备方法及其应用。
背景技术
纤维连接蛋白(简称FN)广泛分布于细胞表面和血浆中，其中血浆型的纤维连接蛋白存在于血浆和体液中,具可溶性。大量国内外的研究结果证明，纤维连结蛋白在进化过程中保守性很强，各种动物的纤维连接蛋白具有非常相近的结构、性质和生物学功能，因而不同来源的FN可以相互替代使用。由于血浆纤维连接蛋白浓度增高常见于急性和慢性肝炎、脂肪肝、肝硬化、阻塞性黄疸、脑血管病变、妊娠晚期、妊高症、胰腺癌、肺癌、癌性腹水、腺癌广泛转移等，浓度降低常见于急性白血病、弥散性血管内凝血(简称DIC)、暴发性肝衰竭、烧伤、创伤、休克、细菌性或病毒性感染、急性呼吸窘迫综合症、糖尿病并发酮症酸中毒、尿毒症、急性循环衰竭、绝经期妇女以及部分化疗耐受差的患者。所以纤维连接蛋白主要应用于细胞培养、伤口修复和愈合、癌症的诊断和治疗、治疗血液系统和心脑血管系统疾病、修复并加速愈合宫颈糜烂异常细胞、败血症和休克等急救的辅助治疗。目前国内纤维连接蛋白市场几乎全部被国外产品所占领，国内现在还处在早期的研究及分离纯化工艺的开发，在工艺的优化设计中，层析介质也几乎全部被国外产品所占领，而层析介质的选择决定了整个产品的质量和规模化生产的进度。
现有制备技术是通过微囊发生器-静电法、离子凝聚法和三次冻干法制得三维多孔壳聚糖/明胶微球，主要步骤为：将1.5％壳聚糖乙酸溶液和2％明胶B水溶液按体积比，吸入安装在便携式微量注射泵上的注射器中，注射器针头末端连接高压脉冲微胶囊成型仪的正极，针头下方的金属导线环连接高压脉冲微胶囊成型仪的负极，导线环下方为液氮罐，依次打开高压脉冲微胶囊成型仪、便携式微量注射泵开关，在高压静电作用下使得形成的液滴滴入液氮中快速冷冻成球,成球后再进行冻干，控制冻干温度为-60℃至-80℃，冻干24-48h后得到一次冻干的壳聚糖/明胶微球1；将微球1用含有饱和三聚磷酸盐(TPP)85％的乙醇溶液，控制体系pH值在5-6，交联固化24-72h后，终止交联反应，放入-20℃冰箱过夜，次日上冻干机，控制冻干温度为-60℃至-80℃，冻干24-48h后得到二次冻干的微球2；将微球2充分水化，加入2％水溶性交联剂碳二亚胺/N-羟基琥珀酰(EDC/NHS)和2％明胶A，在38℃水浴、避光反应24-48h后，洗去未反应EDC/NHS和明胶A，放入-20℃冰箱过夜，次日进行第三次冻干，控制冻干温度为-60℃至-80℃冻干24-48h后即得到三维多孔壳聚糖/明胶微球3。(彭承宏，黄芳，韩宝三，吴旭波，董亚东，崔龙.一种三维多孔壳聚糖/明胶微球及其制备方法和在肝细胞培养中的应用[P].中国专利:201110025674,2011-01-24)
现有分离纯化技术是通过盐析沉淀，再过亲和层析柱分离纯化FN，最后过分子筛层析柱脱盐，超滤浓缩，冷冻干燥得到FN成品，主要过程为：采集新鲜动物血，加入柠檬酸三钠抗凝，迅速离心，分别收集血浆和血球，贮存于10℃以下环境中；向血浆中加硫酸铵至饱和度20-30％，静置1小时以上，过滤，取沉淀物溶解；上亲和层析柱，提取分离出FN主峰液；再经分子筛纯化，超滤浓缩，除菌，最后冷冻干燥，得到FN产品。(王德亮.动物血纤维连接蛋白联产工艺[P].中国专利:200510017717,2005-06-22)
现有制备技术的缺点为该制备方法分三步冻干，反应和清洗过程均繁琐复杂，时间过长；所需生产设备过多且昂贵，严重增加了生产成本；对设备及过程控制较为严格，只适合实验室级别制备，不易放大至生产线规模生产；产品的圆度较差，粒径和孔径过大，生产过程中过低的温度会导致产品的质量不稳定和重复性不高等。
现有分离纯化技术的缺点为分离纯化步骤过多，耗时过长，纤维连接蛋白活性偏低，蛋白浓度和纯度过低。
发明内容
鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种明胶亲和层析介质的制备方法，并利用制备的明胶亲和层析介质来分离纯化纤维连接蛋白，具有纯化效率高、生产周期短、工艺简单等优点。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种明胶亲和层析介质的制备方法，包括以下步骤：
1)利用激活液清洗CNBr-琼脂糖亲和层析介质(优选地，激活液的体积为CNBr-琼脂糖亲和层析介质的体积的5-10倍)，去除激活液；再用结合液清洗CNBr-琼脂糖亲和层析介质(优选地，结合液的体积为CNBr-琼脂糖亲和层析介质的体积的5-10倍)，去除结合液，得到已激活的CNBr-琼脂糖亲和层析介质；所述激活液为HCl溶液或NaCl-HCl溶液，pH为2.0-4.5；所述结合液为NaCl-NaHCO3溶液，pH为7.0-8.6；
2)利用结合液配制明胶的浓度为5-20mg/mL的明胶溶液(其中溶质为明胶，溶剂为步骤1)所述的结合液)，混匀；
3)向步骤2)得到的明胶溶液中加入等体积的步骤1)中已激活的CNBr-琼脂糖亲和层析介质，4-35℃条件下搅拌偶联1-24小时；
4)偶联完毕，过滤，得到滤液和已偶联的明胶亲和层析介质；检测并计算CNBr-琼脂糖亲和层析介质结合明胶的浓度；
5)将步骤4)得到的已偶联的明胶亲和层析介质抽干，用封闭液清洗(优选地，封闭液的体积是已偶联的明胶亲和层析介质的体积的3-5倍)，所述封闭液为HO(CH2)2NH2或pH为7.0-8.6的0.001-1.0mol/L Tris溶液(优选地，pH为7.0-8.6的0.001-1.0mol/L Tris-HCl溶液)，去除封闭液后，并加入等体积的封闭液控温(4-35℃条件下)慢速(转速为100-200rpm)搅拌封闭(时间为3-18h)，得到封闭液处理后的明胶亲和层析介质；
6)将步骤5)得到的封闭液处理后的明胶亲和层析介质抽干，利用酸清洗液和碱清洗液交替清洗，再用水清洗，加入乙醇溶液，保存，得到明胶亲和层析介质；所述碱清洗液为NaCl-Tris溶液，pH为7.0-8.6；所述酸清洗液为NaCl-NaAc溶液，pH为2.0-4.5。
本发明的有益效果是：
本发明中明胶亲和层析介质与一般的亲和层析介质相比(例如三维多孔壳聚糖/明胶微球)具有以下优势：
1、提高了明胶亲和层析介质的圆度，降低了粒径和孔径，本发明制备的明胶亲和层析介质的粒径为45-165微米、孔径为0.003-0.9微米，而现有技术中的亲和层析介质的粒径为300-800微米、孔径为50-200微米；由于分辨率是由孔径大小决定的，孔径越小，分辨率越高，从而本发明所述的明胶亲和层析介质可以显著提高分辨率和纯化效率；
2、针对现有的制备技术中存在的问题(例如：制备方法需要分三步冻干，反应和清洗过程均繁琐复杂，时间过长)，本发明所述明胶亲和层析介质的制备只需要一步反应和一步封闭，反应过程操作简单、易于控制、品质稳定，生产周期大大缩短至24小时内；
3、针对现有技术中所需生产设备过多且昂贵，严重增加了生产成本(例如现有技术种使用的主要设备为:高压脉冲微胶囊成型仪30000元/台左右、便携式微量注射泵3000元/台左右、真空冷冻干燥机100000元/台左右、冷冻冰箱5000元/台左右)；本发明所述的明胶亲和层析介质的制备过程中所需设备更少更便宜，大大降低了生产成本，更适合大规模生产。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述激活液含有0-0.5mol/L NaCl和0.001-0.1mol/L HCl，所述激活液的pH为2.0-4.5。
采用上述进一步方案的有益效果是：pH为2.0-4.5可以保证配基的激活最高，激活液含有0-0.5mol/L NaCl和0.001-0.1mol/L HCl可以保证在后续步骤中CNBr-琼脂糖亲和层析介质与明胶中的蛋白质的结合量最高。
进一步，所述结合液含有0.001-0.5mol/L NaCl和0.001-0.5mol/L NaHCO3，所述结合液的pH为7.0-8.6。
采用上述进一步方案的有益效果是：采用上述pH和浓度可以保证在后续步骤中CNBr-琼脂糖亲和层析介质与明胶中的蛋白质的结合量最高。
进一步，所述封闭液为HO(CH2)2NH2或pH为7.0-8.6的0.1mol/L Tris-HCl。
采用上述进一步方案的有益效果是：采用上述的pH和浓度可以保证封闭明胶中的蛋白质的效果最好。
进一步，所述碱清洗液含有0.001-0.5mol/L NaCl和0.001-0.5mol/L Tris，所述碱清洗液pH为7.0-8.6；所述酸清洗液含有0.001-0.5mol/L NaCl和0.001-0.5mol/L NaAc，所述酸清洗液的pH为2.0-4.5。
采用上述进一步方案的有益效果是：采用上述pH和浓度可以保证制备的明胶亲和层析介质的适用稳定性和重复性。
进一步，所述激活液、结合液、封闭液、酸清洗液、碱清洗液均为预冷溶液，预冷溶液的温度为4-8℃；步骤6)的水为预冷的水，预冷的水的温度范围为4-8℃，所述保存的温度为4-8℃。
采用上述进一步方案的有益效果是：可以保证即使在长时间的操作下，也能够保持明胶中的蛋白质的活性不受温度的影响而变性。
本发明中，HO(CH2)2NH2的中文名称为2-羟基乙胺，为液体，质量分数为100％。
本发明所述的明胶亲和层析介质的制备过程中：
步骤1)将CNBr-琼脂糖亲和层析介质上活化的氰酸酯基团进行水解，从而激活CNBr-琼脂糖亲和层析介质；
步骤2)溶解明胶，便于明胶中的基团与CNBr-琼脂糖亲和层析介质上的基团进行连接反应；
步骤3)将CNBr-琼脂糖亲和层析介质与明胶偶联，将CNBr-琼脂糖亲和层析介质上水解活化的基团与明胶中的伯胺基团或相似的亲和基团反应形成异脲连接物；
步骤4)CNBr-琼脂糖亲和层析介质与明胶结合浓度检测，中间过程质量控制，实时监测并控制CNBr-琼脂糖亲和层析介质与明胶的结合浓度；
步骤5)封闭，增加CNBr-琼脂糖亲和层析介质与明胶中的蛋白质的结合作用，防止明胶中的蛋白质在其他条件下与CNBr-琼脂糖亲和层析介质分离；
步骤6)明胶亲和介质清洗，使明胶亲和介质具有更好的稳定性和重复性。
本发明所述的明胶亲和层析介质的制备方法中，在步骤4)过滤后，可以通过检测滤液在UV280处的吸光度值，根据测定明胶的标准曲线计算出虑液中的明胶浓度，最终计算出CNBr-琼脂糖亲和层析介质结合明胶的浓度。
利用上述方法制备的明胶亲和层析介质可以用于蛋白质的分离和纯化，尤其是纤维连接蛋白的分离和纯化。
一种利用上述方法制备的明胶亲和层析介质分离纯化纤维连接蛋白的方法，包括以下步骤：
1)将制备的明胶亲和层析介质用水清洗(优选地，水的体积是明胶亲和层析介质的体积的5-10倍)，去除水；再用平衡液清洗(优选地，平衡液的体积是明胶亲和层析介质的体积的3-5倍)，去除平衡液；之后，向明胶亲和层析介质中加入平衡液，混匀后装入层析柱中，直至柱面无变化；所述平衡液为0.001-0.5mol/L Na2HPO4、0.001-0.5mol/L KH2PO4、0.001-0.5mol/L KCl、0.001-0.5mol/L NaCl的混合液，所述平衡液的pH为7.0-8.6；
2)打开蛋白纯化系统，打开检测器预热，清洗管路并将步骤1)中的层析柱与蛋白纯化系统连接，设置参数，用5-10倍体积(指层析柱中明胶亲和层析介质的柱体积)的平衡液以恒速平衡层析柱至各参数不变10min以上，调零；
3)将待分离纯化纤维连接蛋白的样品恒速流过装有明胶亲和层析介质的层析柱，分管收集样品流穿峰，利用蛋白电泳检测收集的样品；
4)利用平衡液恒速清洗装有明胶亲和层析介质的层析柱(优选地，所述平衡液的体积是层析柱中明胶亲和层析介质的体积的3-5倍)，至各参数(例如紫外吸光度UV、pH、电导等参数)不变，清洗时间为10min以上，分管收集样品清洗峰，利用蛋白电泳检测；
5)利用洗脱液恒速清洗装有明胶亲和层析介质的层析柱(优选地，洗脱液的体积为层析柱中明胶亲和层析介质的体积的3-5倍)，至各参数(例如UV、pH、电导等参数)不变，清洗时间为10min以上，收集样品洗脱峰，并通过测定纤维连接蛋白的标准曲线来计算出纤维连接蛋白浓度，再计算出明胶亲和层析介质结合纤维连接蛋白的载量；取洗脱峰的样品进行蛋白电泳检测；所述洗脱液为0.001-0.5mol/L Na2HPO4、0.001-0.5mol/L KH2PO4、0.001-0.5mol/L KCl、0.001-0.5mol/L NaCl、1.0-8.0mol/L尿素的混合溶液，所述洗脱液的pH为7.0-8.6；
6)将层析柱中的明胶亲和层析介质分别用酸清洗液和碱清洗液交替清洗(优选地，酸清洗液的体积和碱清洗液的体积分别为明胶亲和层析介质的3-5倍)，再用水清洗，最后用乙醇溶液清洗(优选地，乙醇溶液的体积为明胶亲和层析介质的体积的3-5倍)，保存；所述碱清洗液为NaCl-Tris溶液，pH为7.0-8.6；所述酸清洗液为NaCl-NaAc溶液，pH为2.0-4.5。
本发明技术方案的有益效果是：
本发明将上述制备的明胶亲和层析介质用于蛋白质的分离和纯化，尤其是纤维连接蛋白的分离和纯化，与现有技术的动物血纤维连接蛋白联产工艺相比具有以下优势：
1、专一性强，本发明制备的明胶亲和层析介质与纤维连接蛋白特异性吸附强，本发明制备的明胶亲和层析介质中的多糖高亲和性的部位与纤维连接蛋白的结构域相互作用,可以特异性的吸附纤维连接蛋白；载量可以达到1-3mg/L，明显高于其他亲和层析介质；
2、步骤单一，缩短纯化时间，仅仅12-24小时之内就可以完成纤维连接蛋白的分离和纯化；
3、不仅保证了纤维连接蛋白的活性，而且提高了纤维连接蛋白浓度(纤维连接蛋白浓度甚至可以达到8-13mg/L)和纯度。
进一步，所述碱清洗液含有0.001-0.5mol/L NaCl和0.001-0.5mol/L Tris(优选地，Tris-HCl)，所述碱清洗液的pH为7.0-8.6。
进一步，所述酸清洗液含有0.001-0.5mol/L NaCl和0.001-0.5mol/L NaAc，所述酸清洗液的pH为2.0-4.5，所述保存的温度为4-8℃。
采用上述进一步方案的有益效果是：在这个浓度和pH条件下，制备的明胶亲和层析介质具有更好的稳定性和重复性，应用更广泛。
本发明所述的乙醇溶液，优选为体积分数20％的乙醇溶液，也可以选择体积分数高于20％的乙醇溶液。若不考虑保存的时间尽可能的长，也可以选择低于体积分数20％的乙醇溶液。
本发明所述CNBr-琼脂糖亲和层析介质指利用溴化氰(CNBr)活化琼脂糖形成的亲和层析介质。
本发明所述的溶液，若没有特别指出溶剂，溶剂均为水。
本发明中所述的用“A”清洗“B”，清洗完毕后，把A过滤掉，其中“A”和“B”分别代表不同物质。
附图说明
图1为本发明所述的明胶亲和层析介质的制备流程；
图2为本发明制备的明胶亲和层析介质与现有技术中三维多孔壳聚糖/明胶微球圆度对比图，图2A为本发明制备的45-165微米明胶亲和层析介质的数码显微镜图(平面图)，图2B为现有技术中300-500微米三维多孔壳聚糖/明胶微球的扫描电镜图(立体图)；
图3为实施例1中的原液、流穿液、清洗液、洗脱液的SDS-PAGE图，从左到右依次为原液、清洗液、洗脱液、流穿液；
图4为实施例2中的原液、流穿液、清洗液、洗脱液的SDS-PAGE图，从左到右依次为原液、流穿液、洗脱液、清洗液；
图5为实施例3中的原液、流穿液、清洗液、洗脱液的SDS-PAGE图，从左到右依次为原液、洗脱液、流穿液、清洗液。
图6为实施例4中的原液、流穿液、清洗液、洗脱液的SDS-PAGE图，从左到右依次为清洗液、洗脱液、流穿液、原液。
图7为实施例5中的原液、流穿液、清洗液、洗脱液的SDS-PAGE图，从左到右依次为清洗液、洗脱液、流穿液、原液。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
如图1所示，一种明胶亲和层析介质的制备方法，包括以下步骤：
1)称取CNBr-琼脂糖亲和层析介质加入到抽滤漏斗中，利用4-8℃预冷的激活液清洗CNBr-琼脂糖亲和层析介质，激活液的体积为CNBr-琼脂糖亲和层析介质的体积的5-10倍，清洗15-30min，去除激活液；再用4-8℃预冷的结合液清洗CNBr-琼脂糖亲和层析介质，结合液的体积为CNBr-琼脂糖亲和层析介质体积的5-10倍，去除结合液，得到已激活的CNBr-琼脂糖亲和层析介质；所述激活液为HCl溶液或NaCl-HCl溶液，pH为2.0-4.5；所述结合液为NaCl-NaHCO3溶液，pH为7.0-8.6；
2)称取明胶加入到结合液中，搅拌溶解，制得明胶的浓度为5-20mg/mL的明胶溶液；
3)向步骤2)得到的明胶溶液中加入等体积的步骤1)中已激活的CNBr-琼脂糖亲和层析介质，温度为4-35℃，搅拌转速为50-200rpm，偶联1-24小时；
4)偶联完毕，利用0.45微米膜过滤，得到滤液和已偶联的明胶亲和层析介质；检测滤液的UV280吸光度，根据测定明胶的标准曲线(测定明胶的标准曲线为y＝11.862x，其中x是UV280的吸光度，y是明胶浓度)计算出虑液中的明胶浓度，根据步骤2)的明胶浓度，再计算出CNBr-琼脂糖亲和层析介质结合明胶的浓度；
5)将步骤4)得到的已偶联的明胶亲和层析介质抽干并用4-8℃预冷的封闭液清洗，封闭液的体积是已偶联的明胶亲和层析介质体积的3-5倍，所述封闭液为HO(CH2)2NH2或pH为7.0-8.6的0.001-1.0mol/L Tris-HCl溶液，去除封闭液，并加入等体积的封闭液控温(4-35℃条件下)慢速(转速为100-200rpm)搅拌封闭(时间为3-18h)，得到封闭液处理后的明胶亲和层析介质；
6)将步骤5)得到的封闭液处理后的明胶亲和层析介质在抽滤漏斗中抽干，分别利用3-5倍体积的4-8℃预冷酸清洗液和碱清洗液交替清洗，再用5-10倍体积的4-8℃预冷的纯水清洗，加入体积分数20％乙醇溶液，4-8℃保存，得到明胶亲和层析介质；所述碱清洗液为NaCl-Tris溶液，pH为7.0-8.6；所述酸清洗液为NaCl-NaAc溶液，pH为2.0-4.5。
一种利用上述方法制备的明胶亲和层析介质分离纯化纤维连接蛋白的方法，包括以下步骤：
1)装柱：称取800mL上述制备的明胶亲和层析介质，用纯水清洗，纯水的体积是明胶亲和层析介质的体积的5-10倍，去除纯水；再用平衡液清洗，平衡液的体积是明胶亲和层析介质的体积的3-5倍，去除平衡液；之后，向明胶亲和层析介质中加入少量平衡液(平衡液清洗后，再加入20％-100％明胶亲和层析介质的体积的平衡液，要求为能够将明胶亲和层析介质搅拌均匀，但总体积不会超过层析柱体积)，混匀后一次性装入层析柱中，重力沉降30min以上至柱面无变化，用蠕动泵将平衡液快速压柱10min以上至柱面无变化；所述平衡液为0.001-0.5mol/L Na2HPO4、0.001-0.5mol/L KH2PO4、0.001-0.5mol/L KCl、0.001-0.5mol/L NaCl的混合液，所述平衡液的pH为7.0-8.6；
2)平衡：打开蛋白纯化系统，打开AKTA检测器电源预热30min以上，清洗管路并将步骤1)中的层析柱与蛋白纯化系统连接，设置参数，用5-10倍体积(指层析柱中明胶亲和层析介质的柱体积)的平衡液以恒速平衡层析柱至各参数(例如UV、pH、电导等参数)不变10min以上，调零；
3)上样：将待分离纯化纤维连接蛋白的样品处理后，恒速流过装有明胶亲和层析介质的层析柱，分管收集样品流穿峰，利用蛋白电泳检测收集的样品；
4)清洗：利用平衡液恒速清洗装有明胶亲和层析介质的层析柱，所述平衡液的体积是层析柱中明胶亲和层析介质的体积的3-5倍，至各参数(例如UV、pH、电导等参数)不变，清洗时间为10min以上，分管收集样品清洗峰，利用蛋白电泳检测(例如SDS-PAGE)；
5)洗脱：利用洗脱液恒速清洗装有明胶亲和层析介质的层析柱，洗脱液的体积为层析柱中明胶亲和层析介质的体积的3-5倍，直至各参数(例如UV、pH、电导等参数)不变，清洗时间为10min以上，收集样品洗脱峰，检测稀释10倍后UV280吸光度，并通过测定纤维连接蛋白的标准曲线(测定纤维连接蛋白的标准曲线为y＝0.781x，其中x是UV280的吸光度，y是纤维连接蛋白浓度)来计算出纤维连接蛋白浓度，再计算出明胶亲和层析介质结合纤维连接蛋白的载量；取洗脱峰的样品进行蛋白电泳检测；所述洗脱液为0.001-0.5mol/LNa2HPO4、0.001-0.5mol/L KH2PO4、0.001-0.5mol/L KCl、0.001-0.5mol/L NaCl、1.0-8.0mol/L尿素的混合溶液，所述洗脱液的pH为7.0-8.6；
6)再生：将层析柱中的明胶亲和层析介质分别用酸清洗液和碱清洗液交替清洗3次，酸清洗液的体积和碱清洗液的体积分别为明胶亲和层析介质的3-5倍，再用纯水清洗，最后用体积分数20％的乙醇溶液清洗，乙醇溶液的体积为明胶亲和层析介质的体积的3-5倍，4-8℃保存；所述碱清洗液为NaCl-Tris溶液，pH为7.0-8.6；所述酸清洗液为NaCl-NaAc溶液，pH为2.0-4.5。
实施例中的汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质购自武汉汇研生物科技股份有限公司。
实施例中未详细说明的部分为本领域的常用技术，本领域技术人员依说明书的记载可以实现本技术方案。
实施例中称取重力沉降状态的的汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质目的是为了精确称量，这是一个称量的标准，因为汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质中含有水分，如用抽干则会因为抽干不均匀导致称量不准确，因此采用靠汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质自身重力让其沉降后，精确称量。
实施例1：
1)称取835g重力沉降状态的汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质加入到抽滤漏斗中，用真空泵抽滤清洗，用10倍体积的4℃预冷激活液(即激活液的体积是汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质的10倍，激活液含有0.001mol/L HCl，激活液的pH为3.0)清洗30min，过滤，除去滤液；再用10倍体积的4℃预冷结合液(即结合液的体积是汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质体积的10倍，结合液含有0.1mol/L NaCl和0.1mol/L NaHCO3，结合液的pH为8.3)清洗，过滤，除去滤液；测定重力沉降状态下的汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质(简称沉降介质)的重量为1kg，即已激活的汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质。
2)称取10g的明胶加入到1L结合液中，搅拌溶解后，得到明胶溶液；利用紫外分光光度计检测明胶溶液的UV280吸光度为0.841，根据测定明胶的标准曲线y＝11.862x(其中x是UV280的吸光度，y是明胶浓度)，计算出明胶的浓度为9.98mg/mL。
3)将步骤2)中得到的明胶溶液与1kg已激活的汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质一起装入容积为3L的反应瓶，在水浴锅中4℃反应、100rpm搅拌、偶联18h。
4)偶联完毕，用0.45微米过滤膜的PD-10柱管重力过滤，得到滤液和已偶联的明胶亲和层析介质；检测滤液的UV280吸光度为0.489，根据测定明胶的标准曲线计算出滤液中的明胶浓度为5.80mg/mL，再计算出汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质结合明胶的浓度为4.18mg/mL；。
5)将步骤4)得到的已偶联的明胶亲和层析介质在抽滤漏斗中用真空泵抽干，用3倍体积的4℃预冷封闭液(即封闭液的体积为已偶联的明胶亲和层析介质的体积的3倍，封闭液含有0.1mol/L Tris-HCl，封闭液的pH为8.3)清洗，抽干后装入容积为3L的反应瓶中，再向反应瓶中加入1L的封闭液在水浴锅中4℃、100rpm搅拌条件下封闭18h。
6)将步骤5)得到的封闭反应后的明胶亲和层析介质在抽滤漏斗中用真空泵抽干，用5倍体积的4℃预冷碱清洗液(碱清洗液的体积为封闭反应后的明胶亲和层析介质体积的5倍，碱清洗液含有0.1mol/L NaCl和0.1mol/LTris-HCl，碱清洗液的pH为8.0)清洗，再用5倍体积的4℃预冷酸清洗液(酸清洗液的体积为封闭反应后的明胶亲和层析介质体积的5倍，酸清洗液含有0.1mol/L NaCl、0.1mol/L NaAc，酸清洗液的pH为4.0)清洗，酸清洗液和碱清洗液交替清洗3次，之后用10倍体积的4℃预冷纯水清洗(纯水的体积为封闭反应后的明胶亲和层析介质体积的10倍)，抽干装瓶，加入200mL体积分数为20％的乙醇溶液，4℃保存，最终得到明胶亲和层析介质。
7)装柱：称取800mL步骤6)制备的明胶亲和层析介质，用10倍体积的纯水清洗(即纯水的体积是明胶亲和层析介质的体积的10倍)，再用5倍体积的平衡液(即平衡液的体积是明胶亲和层析介质的体积的5倍，平衡液含有0.001mol/L Na2HPO4、0.001mol/L KH2PO4、0.001mol/L KCl和0.001mol/L NaCl，调平衡液的pH为7.4)清洗，加入少量平衡液搅拌均匀后倒入中压层析柱XK50/60中，重力沉降30min以上至柱面高度无变化，用蠕动泵将平衡液以流速10mL/min压柱10min以上至柱面高度无变化。
8)平衡：打开AKTA检测器电源预热30min以上，清洗管路，将层析柱与AKTA蛋白纯化仪管路连接，设置参数，用5倍体积的平衡液(即平衡液的体积为明胶亲和层析介质的体积的5倍)以恒速8mL/min的速率平衡层析柱至各参数不变10min以上，调零。
9)上样：将牛血液在4℃下5000rpm离心30min，收集牛血浆2500mL，将牛血浆以恒速8mL/min的速率过层析柱，收集样品流穿峰，取样进行SDS-PAGE检测，电泳条带见附图3的流穿液，可以看出样品饱和上样，流穿液中含有少量目的蛋白，目的蛋白结合很高。
10)清洗：用5倍体积的平衡液(即平衡液的体积为明胶亲和层析介质的体积的5倍)以恒速8mL/min的速度清洗层析柱中的杂蛋白至各参数不变10min以上，收集样品清洗峰，取样SDS-PAGE进行检测，见附图3的清洗液，可以看出清洗液中含有少量目的蛋白，明胶亲和介质的蛋白结合载量已达饱和。
11)洗脱：用3倍体积的洗脱液(洗脱液的体积为明胶亲和层析介质的体积的3倍，洗脱液含有0.001mol/L Na2HPO4、0.001mol/L KH2PO4、0.001mol/L KCl、0.001mol/L NaCl和3.0mol/L Urea，调pH为7.4)，以恒速8mL/min的速度洗脱纤维连接蛋白至各参数不变10min以上，收集样品洗脱峰的洗脱液233mL，利用紫外分光光度计检测稀释10倍后的洗脱液的UV280吸光度为0.817，根据测定纤维连接蛋白的标准曲线(y＝0.781x，其中x是UV280的吸光度，y是纤维连接蛋白浓度)，计算出纤维连接蛋白浓度为6.38mg/mL，再计算出明胶亲和层析介质结合纤维连接蛋白的载量为1.86mg/mL，取样SDS-PAGE进行检测，见附图3的洗脱液，可以看出洗脱液中目的蛋白浓度很高，纯度较高，纯化效果很好。
12)再生：用5倍体积的碱清洗液(即碱清洗液的体积为明胶亲和层析介质的体积的5倍，碱清洗液含有0.1mol/L NaCl和0.1mol/L Tris-HCl，调pH为8.5)清洗，再用5倍体积的酸清洗液(即酸清洗液的体积为明胶亲和层析介质的体积的5倍，酸清洗液含有0.1mol/LNaCl和0.1mol/L NaAc，调pH为4.5)清洗，酸清洗液和碱清洗液交替清洗3次，再用10倍体积的纯水(即纯水的体积为明胶亲和层析介质的体积的10倍)清洗，最后用3倍体积20％体积分数的乙醇溶液清洗(即乙醇溶液的体积为明胶亲和层析介质的体积的3倍)，4℃保存。
实施例2：
1)称取835g重力沉降状态的汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质加入到抽滤漏斗中，用真空泵抽滤清洗，用5倍体积的6℃预冷激活液(即激活液的体积是汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质的5倍，激活液含有0.5mol/L NaCl和0.001mol/L HCl，调pH为3.0)清洗15min，过滤，除去滤液；再用5倍体积的6℃预冷结合液(即结合液的体积是汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质体积的5倍，结合液含有0.5mol/L NaCl和0.2mol/L NaHCO3，调pH为8.3)清洗，测定重力沉降介质的重量1kg，即已激活的汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质。
2)称取10g的明胶加入到1L结合液中，搅拌溶解后，得到明胶溶液；利用紫外分光光度计检测明胶溶液的UV280吸光度为0.841，根据测定明胶的标准曲线y＝11.862x(其中x是UV280的吸光度，y是明胶浓度)计算出明胶的浓度为9.98mg/mL。
3)将步骤2)中得到的明胶溶液与1kg已激活的汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质一起装入容积为3L的反应瓶，在水浴锅中25℃、50rpm搅拌条件下偶联1h。
4)偶联完毕，用0.45微米过滤膜的PD-10柱管重力过滤，得到滤液和已偶联的明胶亲和层析介质；检测滤液的UV280吸光度为0.296，根据测定明胶的标准曲线计算出滤液中的明胶浓度为3.51mg/mL，再计算出汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质结合明胶的浓度为6.47mg/mL。
5)将步骤4)得到的已偶联的明胶亲和层析介质在抽滤漏斗中用真空泵抽干，用3倍体积的6℃预冷封闭液(即封闭液的体积为已偶联的明胶亲和层析介质的体积的3倍，封闭液含有0.1mol/L Tris-HCl，调pH为8.3)清洗，抽干后装入3L反应瓶中，加入1L的封闭液在水浴锅中25℃，100rpm搅拌封闭3h。
6)将步骤5)得到的封闭反应后的明胶亲和层析介质在抽滤漏斗中用真空泵抽干，用3倍体积的6℃预冷碱清洗液(碱清洗液的体积为封闭反应后的明胶亲和层析介质体积的3倍，碱清洗液含有0.5mol/L NaCl和0.1mol/L Tris-HCl，调pH为8.0)清洗，再用3倍体积的6℃预冷酸清洗液(即酸清洗液的体积为封闭反应后的明胶亲和层析介质体积的3倍，酸清洗液含有0.5mol/L NaCl和0.1mol/L NaAc，调pH为4.0)清洗，酸碱清洗液交替清洗3次，最后用10倍体积的6℃预冷纯水清洗(纯水的体积为封闭反应后的明胶亲和层析介质体积的10倍)，抽干装瓶，加入200mL体积分数为20％的乙醇溶液，6℃保存。
7)装柱：称取800mL步骤6)制备的明胶亲和层析介质，用5倍体积的纯水(即纯水的体积是明胶亲和层析介质的体积的5倍)清洗，再用3倍体积的平衡液(即平衡液的体积是明胶亲和层析介质的体积的3倍，平衡液含有0.01mol/L Na2HPO4、0.01mol/L KH2PO4、0.01mol/L KCl、0.01mol/L NaCl，调pH为7.4)清洗，加入少量平衡液搅拌均匀后倒入中压层析柱XK50/60中，重力沉降30min以上至柱面高度无变化，用蠕动泵将平衡液以流速10mL/min压柱10min以上至柱面高度无变化。
8)平衡：打开AKTA检测器电源预热30min以上，清洗管路，将层析柱与AKTA蛋白纯化仪管路连接，参数设置，用10倍体积(即平衡液的体积为明胶亲和层析介质的体积的10倍)的平衡液以恒速8mL/min平衡层析柱至各参数不变10min以上，调零。
9)上样：将牛血液在4℃下5000rpm离心30min，收集牛血浆2500mL，将牛血浆以恒速8mL/min过层析柱，收集样品流穿峰处的流穿液，取样SDS-PAGE检测，见附图4流穿液，可以看出样品饱和上样，流穿液中含有少量目的蛋白，目的蛋白结合很高。
10)清洗：用3倍体积(即平衡液的体积为明胶亲和层析介质的体积的3倍)的平衡液以恒速8mL/min清洗杂蛋白至各参数不变10min以上，收集样品清洗峰处的清洗液，取样SDS-PAGE检测，见附图4清洗液，可以看出清洗液中含有少量目的蛋白，明胶亲和介质的蛋白结合载量已达饱和。
11)洗脱：用5倍体积的洗脱液(洗脱液的体积为明胶亲和层析介质的体积的5倍，洗脱液含有0.01mol/L Na2HPO4，0.01mol/L KH2PO4，0.01mol/L KCl，0.01mol/L NaCl，6.0mol/L Urea，pH为7.4)以恒速8mL/min洗脱纤维连接蛋白至各参数不变10min以上，收集样品洗脱峰处的洗脱液254mL，紫外分光光度计检测稀释10倍后的洗脱液的UV280吸光度为1.040，根据测定纤维连接蛋白的标准曲线(y＝0.781x，其中x是UV280的吸光度，y是纤维连接蛋白浓度)计算出纤维连接蛋白浓度为8.12mg/mL，再计算出明胶亲和层析介质结合纤维连接蛋白的载量为2.58mg/mL，取样SDS-PAGE检测，见附图4洗脱液，可以看出洗脱液中目的蛋白浓度很高，纯度较高，纯化效果很好。
12)再生：用3倍体积的碱清洗液(即碱清洗液的体积为明胶亲和层析介质的体积的3倍，碱清洗液含有0.5mol/L NaCl和0.1mol/L Tris-HCl，调pH为8.5)清洗，再用3倍体积的酸清洗液(即酸清洗液的体积为明胶亲和层析介质的体积的3倍，酸清洗液含有0.5mol/LNaCl和0.1mol/L NaAc，调pH4.5)清洗，酸清洗液和碱清洗液交替清洗3次，再用10倍体积的纯水(即纯水的体积为明胶亲和层析介质的体积的10倍)清洗，最后用3倍体积20％体积分数的乙醇溶液清洗(即乙醇溶液的体积为明胶亲和层析介质的体积的3倍)，6℃保存。
实施例3：
1)称取835g重力沉降状态的汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质加入到抽滤漏斗中，用真空泵抽滤清洗，用8倍体积的8℃预冷激活液(即激活液的体积是汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质的8倍，激活液含有0.5mol/L NaCl和0.001mol/L HCl，调pH为3.0)清洗20min，再用8倍体积的8℃预冷结合液(即结合液的体积是汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质体积的8倍，结合液含有0.5mol/L NaCl和0.2mol/L NaHCO3，调pH为8.3)清洗，测定重力沉降介质的重量为1kg，即已激活的汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质。
2)称取10g的明胶加入到1L结合液中，搅拌溶解后，得到明胶溶液；利用紫外分光光度计检测明胶溶液在UV280处的吸光度为0.841，根据测定明胶的标准曲线y＝11.862x(其中x是UV280的吸光度，y是明胶浓度)计算出明胶浓度为9.98mg/mL。
3)将步骤2)中得到的明胶溶液与1kg已激活的汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质一起装入容积为3L的反应瓶，在水浴锅中35℃，200rpm搅拌条件下，偶联24h。
4)偶联完毕，用0.45微米膜的PD-10柱管重力过滤，得到滤液和已偶联的明胶亲和层析介质；检测滤液在UV280处的吸光度为0.115，根据测定明胶的标准曲线计算出滤液中的明胶浓度为1.36mg/mL，再计算出汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质结合明胶的浓度为8.62mg/mL。
5)将步骤4)得到的已偶联的明胶亲和层析介质在抽滤漏斗中用真空泵抽干，用4倍体积的8℃预冷封闭液HO(CH2)2NH2(即封闭液的体积为已偶联的明胶亲和层析介质的体积的4倍)清洗，抽干后装入容积为3L的反应瓶中，加入1L的封闭液后，在水浴锅中35℃、100rpm搅拌条件下封闭3h。
6)将步骤5)得到的封闭反应后的明胶亲和层析介质在抽滤漏斗中用真空泵抽干，用4倍体积的8℃预冷碱清洗液(碱清洗液的体积为封闭反应后的明胶亲和层析介质体积的4倍，碱清洗液含有0.5mol/L NaCl和0.5mol/L Tris-HCl，调pH为8.0)清洗，再用4倍体积的8℃预冷酸清洗液(即酸清洗液的体积为封闭反应后的明胶亲和层析介质体积的4倍，碱清洗液含有0.5mol/L NaCl和0.5mol/L NaAc，调pH为4.0)清洗，酸清洗液和碱清洗液交替清洗3次，最后用8倍体积的8℃预冷纯水清洗，抽干装瓶，加入200mL体积分数为20％的乙醇溶液，8℃保存。
7)装柱：称取800mL步骤6)制备的明胶亲和层析介质，用8倍体积的纯水(即纯水的体积是明胶亲和层析介质的体积的8倍)清洗，再用4倍体积的平衡液(即平衡液的体积是明胶亲和层析介质的体积的4倍，平衡液为含有0.1mol/L Na2HPO4、0.1mol/L KH2PO4、0.1mol/L KCl、0.1mol/L NaCl的混合溶液，调pH为7.4)清洗，加入少量平衡液搅拌均匀后倒入中压层析柱XK50/60中，重力沉降30min以上至柱面高度无变化，用蠕动泵将平衡液以流速10mL/min压柱10min以上至柱面高度无变化。
8)平衡：打开AKTA检测器电源预热30min以上，清洗管路，将层析柱与AKTA蛋白纯化仪管路连接，参数设置，用6倍体积的平衡液(即平衡液的体积为明胶亲和层析介质的体积的6倍)以恒速8mL/min平衡层析柱至各参数不变10min以上，调零。
9)上样：将牛血液在4℃下5000rpm离心30min，收集牛血浆2500mL，将牛血浆以恒速8mL/min过层析柱，收集样品流穿峰处的流穿液，取样SDS-PAGE检测，见附图5流穿液，可以看出样品饱和上样，流穿液中含有少量目的蛋白，目的蛋白结合很高。
10)清洗：用4倍体积的平衡液(即平衡液的体积为明胶亲和层析介质的体积的4倍)以恒速8mL/min清洗杂蛋白至各参数不变10min以上，收集样品清洗峰处的清洗液，取样SDS-PAGE检测，见附图5清洗液，可以看出清洗液中含有少量目的蛋白，明胶亲和介质的蛋白结合载量已达饱和。
11)洗脱：用4倍体积的洗脱液(洗脱液的体积为明胶亲和层析介质的体积的4倍，洗脱液为含有0.1mol/L Na2HPO4、0.1mol/L KH2PO4、0.1mol/L KCl、0.1mol/L NaCl、8.0mol/L Urea的混合溶液，调pH为7.4)以恒速8mL/min洗脱纤维连接蛋白至各参数不变10min以上，收集样品洗脱峰处的洗脱液261mL，紫外分光光度计检测稀释10倍后的洗脱液在UV280处的吸光度为0.851，根据测定纤维连接蛋白的标准曲线(y＝0.781x，其中x是UV280的吸光度，y是纤维连接蛋白浓度)计算出纤维连接蛋白浓度为6.65mg/mL，再计算出明胶亲和层析介质结合纤维连接蛋白的载量为2.17mg/mL，取样SDS-PAGE检测，见附图5洗脱液，可以看出洗脱液中目的蛋白浓度很高，纯度较高，纯化效果很好。
12)再生：用4倍体积的碱清洗液(即碱清洗液的体积为明胶亲和层析介质的体积的4倍，碱清洗液含有0.5mol/L NaCl和0.5mol/L Tris-HCl，调pH为8.5)清洗，再用4倍体积的酸清洗液(即酸清洗液的体积为明胶亲和层析介质的体积的4倍，酸清洗液含有0.5mol/LNaCl和0.5mol/L NaAc，pH为4.5)清洗，酸清洗液和碱清洗液交替清洗3次，再用10倍体积(即纯水的体积为明胶亲和层析介质的体积的10倍)的纯水清洗，最后用3倍体积20％体积分数的乙醇溶液清洗(即乙醇溶液的体积为明胶亲和层析介质的体积的3倍)，8℃保存。
实施例4：
1)称取835g重力沉降状态的汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质加入到抽滤漏斗中，用真空泵抽滤清洗，用10倍体积的4℃预冷激活液(即激活液的体积是汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质的10倍，激活液含有0.1mol/L NaCl和0.05mol/L HCl，调pH为2.0)清洗30min，过滤，除去滤液；再用10倍体积的4℃预冷结合液(即结合液的体积是汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质体积的10倍，结合液含有0.001mol/L NaCl和0.001mol/L NaHCO3，调pH为7.0)清洗，过滤，除去滤液；测定重力沉降状态下的汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质(简称沉降介质)的重量为1kg，即已激活的汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质。
2)称取5g的明胶加入到1L结合液中，搅拌溶解后，得到明胶溶液；利用紫外分光光度计检测明胶溶液的UV280吸光度为0.420，根据测定明胶的标准曲线y＝11.862x(其中x是UV280的吸光度，y是明胶浓度)，计算出明胶浓度为4.98mg/mL。
3)将步骤2)中得到的明胶溶液与1kg已激活的汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质一起装入容积为3L的反应瓶，在水浴锅中4℃反应、100rpm搅拌、偶联18h。
4)偶联完毕，用0.45微米过滤膜的PD-10柱管重力过滤，得到滤液和已偶联的明胶亲和层析介质；检测滤液的UV280吸光度为0.054，根据测定明胶的标准曲线计算出滤液中的明胶浓度为0.64mg/mL，再计算出汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质结合明胶的浓度为4.34mg/mL。
5)将步骤4)得到的已偶联的明胶亲和层析介质在抽滤漏斗中用真空泵抽干，用3倍体积的4℃预冷封闭液(即封闭液的体积为已偶联的明胶亲和层析介质的体积的3倍，封闭液含有0.001mol/L Tris-HCl，pH为7.0)清洗，抽干后装入容积为3L的反应瓶中，再向反应瓶中加入1L的封闭液在水浴锅中4℃、150rpm搅拌条件下封闭15h。
6)将步骤5)得到的封闭反应后的明胶亲和层析介质在抽滤漏斗中用真空泵抽干，用5倍体积的4℃预冷碱清洗液(碱清洗液的体积为封闭反应后的明胶亲和层析介质体积的5倍，碱清洗液含有0.001mol/L NaCl和0.001mol/L Tris-HCl，pH为7.05)清洗，再用5倍体积的4℃预冷酸清洗液(酸清洗液的体积为封闭反应后的明胶亲和层析介质体积的5倍，酸清洗液含有0.001mol/L NaCl、0.001mol/L NaAc，调pH为2.0)清洗，酸清洗液和碱清洗液交替清洗3次，之后用10倍体积的4℃预冷纯水清洗(纯水的体积为封闭反应后的明胶亲和层析介质体积的10倍)，抽干装瓶，加入200mL体积分数为20％的乙醇溶液，4℃保存，最终得到明胶亲和层析介质。
7)装柱：称取800mL步骤6)制备的明胶亲和层析介质，用10倍体积的纯水清洗(即纯水的体积是明胶亲和层析介质的体积的10倍)，再用5倍体积的平衡液(即平衡液的体积是明胶亲和层析介质的体积的5倍，平衡液含有0.5mol/L Na2HPO4、0.5mol/L KH2PO4、0.5mol/L KCl和0.5mol/L NaCl，pH为7.0)清洗，加入少量平衡液搅拌均匀后倒入中压层析柱XK50/60中，重力沉降30min以上至柱面高度无变化，用蠕动泵将平衡液以流速10mL/min压柱10min以上至柱面高度无变化。
8)平衡：打开AKTA检测器电源预热30min以上，清洗管路，将层析柱与AKTA蛋白纯化仪管路连接，设置参数，用5倍体积的平衡液(即平衡液的体积为明胶亲和层析介质的体积的5倍)以恒速8mL/min的速率平衡层析柱至各参数不变10min以上，调零。
9)上样：将牛血液在4℃下5000rpm离心30min，收集牛血浆2500mL，将牛血浆以恒速8mL/min的速率过层析柱，收集样品流穿峰，取样进行SDS-PAGE检测，见附图6流穿液，可以看出样品饱和上样，流穿液中含有少量目的蛋白，目的蛋白结合很高。
10)清洗：用5倍体积的平衡液(即平衡液的体积为明胶亲和层析介质的体积的5倍)以恒速8mL/min的速度清洗层析柱中的杂蛋白至各参数不变10min以上，收集样品清洗峰，取样SDS-PAGE进行检测，见附图6清洗液，清洗液中含有少量目的蛋白，明胶亲和介质的蛋白结合载量已达饱和。
11)洗脱：用3倍体积的洗脱液(洗脱液的体积为明胶亲和层析介质的体积的3倍，洗脱液含有0.5mol/L Na2HPO4、0.5mol/L KH2PO4、0.5mol/L KCl、0.5mol/L NaCl和1.0mol/L Urea，pH为7.0)，以恒速8mL/min的速度洗脱纤维连接蛋白至各参数不变10min以上，收集样品洗脱峰的洗脱液179mL，利用紫外分光光度计检测稀释10倍后的洗脱液的UV280吸光度为0.796，根据测定纤维连接蛋白的标准曲线(y＝0.781x，其中x是UV280的吸光度，y是纤维连接蛋白浓度)，计算出纤维连接蛋白浓度为6.22mg/mL，再计算出明胶亲和层析介质结合纤维连接蛋白的载量为1.39mg/mL，取样SDS-PAGE进行检测，见附图6洗脱液，可以看出洗脱液中目的蛋白浓度很高，纯度较高，纯化效果很好。
12)再生：用5倍体积的碱清洗液(即碱清洗液的体积为明胶亲和层析介质的体积的5倍，碱清洗液含有0.001mol/L NaCl和0.001mol/L Tris-HCl，pH为7.0)清洗，再用5倍体积的酸清洗液(即酸清洗液的体积为明胶亲和层析介质的体积的5倍，酸清洗液含有0.001mol/L NaCl和0.001mol/L NaAc且酸清洗液的pH为2.0)清洗，酸清洗液和碱清洗液交替清洗3次，再用10倍体积的纯水(即纯水的体积为明胶亲和层析介质的体积的10倍)清洗，最后用3倍体积20％体积分数的乙醇溶液清洗(即乙醇溶液的体积为明胶亲和层析介质的体积的3倍)，4℃保存。
实施例5：
1)称取835g重力沉降状态的汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质加入到抽滤漏斗中，用真空泵抽滤清洗，用5倍体积的6℃预冷激活液(即激活液的体积是汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质的5倍，激活液含有0.1mol/L NaCl和0.05mol/L HCl，pH为4.5)清洗15min，过滤，除去滤液；再用5倍体积的6℃预冷结合液(即结合液的体积是汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质体积的5倍，结合液含有0.5mol/L NaCl和0.5mol/L NaHCO3，pH为8.6)清洗，测定重力沉降介质的重量1kg，即已激活的汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质。
2)称取20g的明胶加入到1L结合液中，搅拌溶解后，得到明胶溶液；利用紫外分光光度计检测稀释两倍后的明胶溶液的UV280吸光度为0.838，根据测定明胶的标准曲线y＝11.862x(其中x是UV280的吸光度，y是明胶浓度)计算出明胶浓度为19.88mg/mL。
3)将步骤2)中得到的明胶溶液与1kg已激活的汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质一起装入容积为3L的反应瓶，在水浴锅中25℃、50rpm搅拌条件下偶联1h。
4)偶联完毕，用0.45微米过滤膜的PD-10柱管重力过滤，得到滤液和已偶联的明胶亲和层析介质；检测滤液的UV280吸光度为0.604，根据测定明胶的标准曲线计算出滤液中的明胶浓度为7.16mg/mL，再计算出汇琼亲CNBr-琼脂糖亲和层析介质结合明胶的浓度为12.72mg/mL。
5)将步骤4)得到的已偶联的明胶亲和层析介质在抽滤漏斗中用真空泵抽干，用3倍体积的6℃预冷封闭液(即封闭液的体积为已偶联的明胶亲和层析介质的体积的3倍，封闭液含有1.0mol/L Tris-HCl，pH为8.6)清洗，抽干后装入3L反应瓶中，加入1L的封闭液在水浴锅中25℃，200rpm搅拌封闭3h。
6)将步骤5)得到的封闭反应后的明胶亲和层析介质在抽滤漏斗中用真空泵抽干，用3倍体积的6℃预冷碱清洗液(碱清洗液的体积为封闭反应后的明胶亲和层析介质体积的3倍，碱清洗液含有0.5mol/L NaCl和0.1mol/L Tris-HCl，pH为8.6)清洗，再用3倍体积的6℃预冷酸清洗液(即酸清洗液的体积为封闭反应后的明胶亲和层析介质体积的3倍，酸清洗液含有0.5mol/L NaCl和0.1mol/L NaAc，pH为4.5)清洗，酸碱清洗液交替清洗3次，最后用10倍体积的6℃预冷纯水清洗(纯水的体积为封闭反应后的明胶亲和层析介质体积的10倍)，抽干装瓶，加入200mL体积分数为20％的乙醇溶液，6℃保存。
7)装柱：称取800mL步骤6)制备的明胶亲和层析介质，用5倍体积的纯水(即纯水的体积是明胶亲和层析介质的体积的5倍)清洗，再用3倍体积的平衡液(即平衡液的体积是明胶亲和层析介质的体积的3倍，平衡液含有0.01mol/L Na2HPO4、0.01mol/L KH2PO4、0.01mol/L KCl、0.01mol/L NaCl，pH为8.6)清洗，加入少量平衡液搅拌均匀后倒入中压层析柱XK50/60中，重力沉降30min以上至柱面高度无变化，用蠕动泵将平衡液以流速10mL/min压柱10min以上至柱面高度无变化。
8)平衡：打开AKTA检测器电源预热30min以上，清洗管路，将层析柱与AKTA蛋白纯化仪管路连接，参数设置，用10倍体积(即平衡液的体积为明胶亲和层析介质的体积的10倍)的平衡液以恒速8mL/min平衡层析柱至各参数不变10min以上，调零。
9)上样：将牛血液在4℃下5000rpm离心30min，收集牛血浆2500mL，将牛血浆以恒速8mL/min过层析柱，收集样品流穿峰处的流穿液，取样SDS-PAGE检测，见附图7流穿液，流穿液，可以看出样品饱和上样，流穿液中含有少量目的蛋白，目的蛋白结合很高。
10)清洗：用3倍体积(即平衡液的体积为明胶亲和层析介质的体积的3倍)的平衡液以恒速8mL/min清洗杂蛋白至各参数不变10min以上，收集样品清洗峰处的清洗液，取样SDS-PAGE检测，见附图7清洗液，清洗液中含有少量目的蛋白，明胶亲和介质的蛋白结合载量已达饱和。
11)洗脱：用5倍体积的洗脱液(洗脱液的体积为明胶亲和层析介质的体积的5倍，洗脱液含有0.01mol/L Na2HPO4，0.01mol/L KH2PO4，0.01mol/L KCl，0.01mol/L NaCl，6.0mol/L Urea，pH为8.6)以恒速8mL/min洗脱纤维连接蛋白至各参数不变10min以上，收集样品洗脱峰处的洗脱液371mL，紫外分光光度计检测稀释10倍后的洗脱液的UV280吸光度为0.672，根据测定纤维连接蛋白的标准曲线(y＝0.781x，其中x是UV280的吸光度，y是纤维连接蛋白浓度)计算出纤维连接蛋白浓度为5.25mg/mL，再计算出明胶亲和层析介质结合纤维连接蛋白的载量为2.43mg/mL，取样SDS-PAGE检测，见附图7洗脱液，可以看出洗脱液中目的蛋白浓度很高，纯度较高，纯化效果很好。
12)再生：用3倍体积的碱清洗液(即碱清洗液的体积为明胶亲和层析介质的体积的3倍，碱清洗液含有0.001mol/L NaCl和0.5mol/L Tris-HCl，pH为8.6)清洗，再用3倍体积的酸清洗液(即酸清洗液的体积为明胶亲和层析介质的体积的3倍，酸清洗液含有0.5mol/LNaCl和0.5mol/L NaAc，且酸清洗液的pH为4.0)清洗，酸清洗液和碱清洗液交替清洗3次，再用10倍体积的纯水(即纯水的体积为明胶亲和层析介质的体积的10倍)清洗，最后用3倍体积20％体积分数的乙醇溶液清洗(即乙醇溶液的体积为明胶亲和层析介质的体积的3倍)，6℃保存。
实验结果：
选取上述部分实施例来进一步说明。
如图2所示，现有技术中三维多孔壳聚糖/明胶微球的粒径和孔径过大：粒径为300-800微米，孔径为50-200微米；而本发明实施例1制备的明胶亲和层析介质粒径在45-165微米，孔径为3-900纳米；由于分辨率是由孔径大小决定的，孔径越小，分辨率越高，从而本发明所述的明胶亲和层析介质可以显著提高分辨率和纯化效率。
现有技术中三维多孔壳聚糖/明胶微球与本发明制备的明胶亲和层析介质的对比结果，见表1。其中，“对照”为三维多孔壳聚糖/明胶微球；表1中“实施例1”、“实施例2”、“实施例3”、“实施例4”、“实施例5”分别代表“实施例1”、“实施例2”、“实施例3”、“实施例4”、“实施例5”中制备的明胶亲和层析介质。从表1中可以看出，本发明制备的明胶亲和层析介质具有分辨率高、纯化效率好、成本低等优点。
表1 三维多孔壳聚糖/明胶微球与本发明制备的明胶亲和层析介质的对比结果
本发明中分离纯化的纤维连接蛋白与现有技术的对比见表2所示。其中，“对照”为现有技术中的方法(王德亮.动物血纤维连接蛋白联产工艺[P].中国专利:200510017717,2005-06-22)，过程如下：向新鲜动物血中加入柠檬酸三钠抗凝，迅速离心，分别收集血浆和血球，贮存于10℃以下环境中，向血浆中加硫酸铵至饱和度20-30％，静置1小时以上，过滤或吊滤，取沉淀物溶鲜，上亲和层析柱，提取分离出FN主峰液，再经分子筛层析纯化，超滤浓缩，除菌，最后冷冻干燥，得到FN产品。
表2中“实施例1”、“实施例2”、“实施例3”、“实施例4”、“实施例5”分别代表“实施例1”、“实施例2”、“实施例3”、“实施例4”、“实施例5”中利用本发明制备的明胶亲和层析介质来分离和纯化纤维连接蛋白的方法。从表2中可以看出，利用本发明制备的明胶亲和层析介质来分离和纯化纤维连接蛋白具有纯化时间短、蛋白浓度高、载量高等优点。
表2 本发明中分离纯化的纤维连接蛋白与现有技术的对比结果
表2中“载量”为纤维连接蛋白的载量，胶体积和洗脱液体积均不能改变，改变后影响到其浓度的计算，“载量”的计算公式是这样的：洗脱液中纤维连接蛋白的浓度x洗脱液体积，得到洗脱液中的纤维连接蛋白含量，再除以明胶介质的体积得到每毫升明胶介质的纤维连接蛋白载量。
表2中的“明胶浓度”为结合的明胶浓度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种明胶亲和层析介质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)利用激活液清洗CNBr-琼脂糖亲和层析介质，去除激活液；再用结合液清洗CNBr-琼脂糖亲和层析介质，去除结合液，得到已激活的CNBr-琼脂糖亲和层析介质；所述激活液为HCl溶液或NaCl-HCl溶液，pH为2.0-4.5；所述结合液为NaCl-NaHCO3溶液，并调节pH至7.0-8.6；
2)利用结合液配制明胶的浓度为5-20mg/mL的明胶溶液，混匀；
3)向步骤2)得到的明胶溶液中加入等体积的步骤1)中已激活的CNBr-琼脂糖亲和层析介质，4-35℃条件下搅拌偶联1-24小时；
4)偶联完毕，过滤，得到滤液和已偶联的明胶亲和层析介质；检测并计算CNBr-琼脂糖亲和层析介质结合明胶的浓度；
5)将步骤4)得到的已偶联的明胶亲和层析介质抽干，用封闭液清洗，所述封闭液为HO(CH2)2NH2或pH为7.0-8.6的0.001-1.0mol/L Tris-HCl，去除封闭液后，再加入等体积的封闭液进行封闭，得到封闭液处理后的明胶亲和层析介质；
6)将步骤5)得到的封闭液处理后的明胶亲和层析介质抽干，利用酸清洗液和碱清洗液交替清洗，再用水清洗，加入乙醇溶液保存，得到明胶亲和层析介质；所述碱清洗液为NaCl-Tris溶液，并调节pH至7.0-8.6；所述酸清洗液为NaCl-NaAc溶液，并调节pH至2.0-4.5。
2.根据权利要求1所述明胶亲和层析介质的制备方法，其特征在于，所述激活液含有0-0.5mol/L NaCl和0.001-0.1mol/L HCl，所述激活液的pH为2.0-4.5。
3.根据权利要求2所述明胶亲和层析介质的制备方法，其特征在于，所述结合液含有0.001-0.5mol/L NaCl和0.001-0.5mol/L NaHCO3，调节 后的所述结合液的pH为7.0-8.6。
4.根据权利要求3所述明胶亲和层析介质的制备方法，其特征在于，所述封闭液为0.1mol/L Tris-HCl，所述封闭液的pH为7.0-8.6。
5.根据权利要求4所述明胶亲和层析介质的制备方法，其特征在于，所述碱清洗液含有0.001-0.5mol/L NaCl和0.001-0.5mol/L Tris，调节后的所述碱清洗液pH为7.0-8.6；所述酸清洗液含有0.001-0.5mol/L NaCl和0.001-0.5mol/L NaAc，调节后的所述酸清洗液的pH为2.0-4.5。
6.根据权利要求5所述明胶亲和层析介质的制备方法，其特征在于，所述激活液、结合液、封闭液、酸清洗液、碱清洗液均为预冷溶液，预冷溶液的温度为4-8℃；步骤6)中的水为预冷的水，预冷的水的温度范围为4-8℃，所述保存的温度为4-8℃。
7.一种利用权利要求1-6任一项所述明胶亲和层析介质的制备方法制备的明胶亲和层析介质在蛋白的分离和纯化中的应用。
8.一种分离纯化纤维连接蛋白的方法，包括以下步骤：
1)将权利要求1-6任一项所述明胶亲和层析介质的制备方法制备的明胶亲和层析介质用水清洗，去除水；再用平衡液清洗，去除平衡液；之后，向明胶亲和层析介质中加入平衡液，混匀后装入层析柱中，直至柱面无变化；平衡液为0.001-0.5mol/L Na2HPO4、0.001-0.5mol/L KH2PO4、0.001-0.5mol/L KCl、0.001-0.5mol/L NaCl的混合液，所述平衡液的pH为7.0-8.6；
2)打开蛋白纯化系统，打开检测器预热，清洗管路并将步骤1)中的层析柱与蛋白纯化系统连接，设置参数，利用平衡液平衡层析柱并调零；
3)将待分离纯化纤维连接蛋白的样品恒速流过装有明胶亲和层析介质的层析柱，分管收集样品流穿峰，利用蛋白电泳检测收集的样品；
4)利用平衡液恒速清洗装有明胶亲和层析介质的层析柱，清洗时间为10min以上，分管收集样品清洗峰，利用蛋白电泳检测；
5)利用洗脱液恒速清洗装有明胶亲和层析介质的层析柱，清洗时间为10min以上，收集样品洗脱峰，并通过测定纤维连接蛋白的标准曲线来计算出纤维连接蛋白浓度，再计算出明胶亲和层析介质结合纤维连接蛋白的载量；取洗脱峰的样品进行蛋白电泳检测；所述洗脱液为0.001-0.5mol/L Na2HPO4、0.001-0.5mol/L KH2PO4、0.001-0.5mol/L KCl、0.001-0.5mol/L NaCl、1.0-8.0mol/L尿素的混合溶液，所述洗脱液的pH为7.0-8.6；
6)将层析柱中的明胶亲和层析介质分别用酸清洗液和碱清洗液交替清洗，再用水清洗，最后用乙醇溶液清洗，保存；所述碱清洗液为NaCl-Tris溶液，并调节其pH至7.0-8.6；所述酸清洗液为NaCl-NaAc溶液，并调节其pH至2.0-4.5。
9.根据权利要求8所述一种分离纯化纤维连接蛋白的方法，其特征在于，步骤6)中所述碱清洗液含有0.001-0.5mol/L NaCl和0.001-0.5mol/L Tris，调结后的所述碱清洗液的pH为7.0-8.6。
10.根据权利要求9所述一种分离纯化纤维连接蛋白的方法，其特征在于，步骤6)中所述酸清洗液含有0.001-0.5mol/L NaCl和0.001-0.5mol/L NaAc，调节后的所述酸清洗液的pH为2.0-4.5，所述保存的温度为4-8℃。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510338852.6A CN104984739B (zh) | 2015-06-17 | 2015-06-17 | 一种明胶亲和层析介质的制备方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510338852.6A CN104984739B (zh) | 2015-06-17 | 2015-06-17 | 一种明胶亲和层析介质的制备方法及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104984739A CN104984739A (zh) | 2015-10-21 |
| CN104984739B true CN104984739B (zh) | 2018-01-16 |
Family
ID=54296702
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510338852.6A Active CN104984739B (zh) | 2015-06-17 | 2015-06-17 | 一种明胶亲和层析介质的制备方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104984739B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108096878A (zh) * | 2017-11-01 | 2018-06-01 | 深圳清华大学研究院 | 用于葡聚糖凝胶脱盐柱再生的试剂盒及将使用过的葡聚糖凝胶脱盐柱再生的方法 |
| CN109705208B (zh) * | 2018-12-29 | 2022-04-26 | 山东泰邦生物制品有限公司 | 一种单步层析制备高纯度血管性血友病因子的工艺 |
| CN112774254A (zh) * | 2021-01-09 | 2021-05-11 | 北京智飞绿竹生物制药有限公司 | 一种离子交换层析介质的清洗方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1088584A (zh) * | 1992-12-22 | 1994-06-29 | 向明明 | 从体液中提取纤维结合蛋白的生产工艺 |
-
2015
- 2015-06-17 CN CN201510338852.6A patent/CN104984739B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1088584A (zh) * | 1992-12-22 | 1994-06-29 | 向明明 | 从体液中提取纤维结合蛋白的生产工艺 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Purification of Fibronectin from Human Plasma by Affinity Chromatography under Non-Denaturing Conditions;Matti VUENTO et al;《Biochem. J.》;19791231;第183卷;331-337 * |
| 少加样高收效制备创伤修复剂纤维粘连蛋白的方法;谭见容等;《中国临床康复》;20051221;第9卷(第47期);167-169 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104984739A (zh) | 2015-10-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106478810B (zh) | 一种同时分离纯化试剂级的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的方法 | |
| CN104984739B (zh) | 一种明胶亲和层析介质的制备方法及其应用 | |
| CN103772497B (zh) | 蜂王浆中得到王浆主蛋白和活性滤后液的超滤膜分离方法 | |
| CN110231207B (zh) | 一种分离外泌体的方法 | |
| CN106771261A (zh) | 糖化血红蛋白质控品的制备方法及其质控品 | |
| CN104278069A (zh) | 一种低分子量胶原蛋白的制备方法 | |
| CN105153297A (zh) | 一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中分离纯化α2-巨球蛋白的方法 | |
| CN104725506A (zh) | 一种应用免疫亲和柱纯化人血清前白蛋白多克隆抗体的方法 | |
| KR20120108816A (ko) | 천연 휴믹 물질로 부터 휴믹산과 풀빅산 추출방법 | |
| CN112266415A (zh) | 规模化生产凝血酶调节蛋白的方法 | |
| CN110628744A (zh) | 一种从浓香型大曲中分离纯化酯化酶的方法 | |
| CN107011433A (zh) | 一种葛仙米藻胆蛋白的提取、纯化方法及纯化的藻蓝蛋白 | |
| CN113101737A (zh) | 一种亲和切向流过滤系统及其构建方法和外泌体提取方法及应用 | |
| CN102018955A (zh) | 一种病毒性疫苗大规模生产的纯化方法 | |
| CN108840960A (zh) | 一种柴达木大肥菇抗缺氧多糖的提取与纯化方法 | |
| CN109107536A (zh) | 一种以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质及其制备方法与应用 | |
| CN106432406A (zh) | 一种梅花鹿角盘小分子蛋白单体的制备方法 | |
| CN104109204A (zh) | 一种从水稻种子中分离纯化重组人乳铁蛋白的方法 | |
| CN103059149B (zh) | 一种prp多糖提取方法 | |
| CN105738628A (zh) | 一种纯化羊抗人血浆载脂蛋白a-i多克隆抗体的方法 | |
| CN103131693B (zh) | 一种血液中稀有细胞的分离方法 | |
| CN105651575B (zh) | 大孔吸附树脂中贝类毒素的解吸装置及其方法 | |
| CN106637956B (zh) | 一种含有磷酸根的棉花修饰材料及其制备方法和应用 | |
| CN101038275A (zh) | 一种分离肝癌α1－抗胰蛋白酶异质体、转铁蛋白异质体的凝集素亲和层析离心柱方法 | |
| CN107200774A (zh) | 一种葛仙米藻胆蛋白的提取、纯化方法及纯化的藻红蛋白 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP03 | Change of name, title or address | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 430000 room 01, 20 / F, building 11, phase 3.2, Wuhan Optical Valley International Biomedical enterprise accelerator, No. 388, Gaoxin Second Road, East Lake New Technology Development Zone, Wuhan, Hubei Province (Wuhan area of free trade zone) Patentee after: WUHAN HUIYAN BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Address before: 437075 C270, Building B1, No. 666 Gaoxin Avenue, Wuhan, Hubei Province Patentee before: WUHAN HUIYAN BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. |