CN104725506A

CN104725506A - 一种应用免疫亲和柱纯化人血清前白蛋白多克隆抗体的方法

Info

Publication number: CN104725506A
Application number: CN201310717124.7A
Authority: CN
Inventors: 张海涛; 孙卫兵; 张跃建
Original assignee: Shanghai Fosun Changzheng Medical Science Co Ltd; Shanghai Fosun Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Shanghai Fosun Changzheng Medical Science Co Ltd; Shanghai Fosun Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2013-12-23
Filing date: 2013-12-23
Publication date: 2015-06-24

Abstract

本发明提供一种一种应用免疫亲和柱纯化人血清前白蛋白多克隆抗体的方法，该方法包括下列步骤：琼脂糖凝胶Sepharose6B的活化：用溴化氰法活化Sepharose6B凝胶；人血清前白蛋白免疫亲和柱的制备成Sepharose6B-PA蛋白免疫亲和柱；使用含有万分之二叠氮钠的PBS缓冲液浸泡，2～8℃密封保存；纯化羊抗人血清前白蛋白多克隆抗体。本发明的人血清前白蛋白多克隆抗体免疫亲和柱，通过一次性纯化即可去除绝大部分杂质，有效的消除了免疫比浊试剂中的伪浊度问题，可以简便、高效、特异性地从血清中分离纯化前白蛋白多克隆抗体，有较大的应用价值。

Description

一种应用免疫亲和柱纯化人血清前白蛋白多克隆抗体的方法

技术领域

本发明涉及生物技术，具体涉及一种生物分离、纯化装置，尤其涉及一种高效应用免疫亲和柱纯化人血清前白蛋白多克隆抗体的方法。

背景技术

前白蛋白（Prealbumin,PA）是肝脏细胞合成的一种血清蛋白质，由4个相同的亚基组成，分子量约55KD，消光系数（E280nm）13.6，半衰期1.9天，电泳时迁移在白蛋白之前，故称为前白蛋白。血清中前白蛋白的测定结果在临床上是反映肝功能和机体营养状态的重要指标之一，常见于营养不良者。由于前白蛋白半衰期很短，可以显示肝脏合成和分解代谢的轻微改变，其血清浓度降低的幅度与肝实质损害的程度密切相关，因此在临床上也常见于肝功能损伤、肝硬化、外伤及感染患者。临床上,把检测前白蛋白含量的变化作为衡量肝功能损害和营养不良的一种敏感可靠的指标。

现有技术中最常用的检测方法是免疫透射比浊法，其基本原理是：抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体复合物，反应液出现浊度。当反应液中保持抗体过量时，形成的浊度会随抗原量增加而增加，与一系列浓度的标准品对照，即可计算出待检测物的含量。

免疫透射比浊法检测临床样本效果的决定因素之一是能够获得抗干扰能力强的前白蛋白抗体纯品，即尽量去除抗血清中除有效抗体之外的其他组分以消除伪浊度的影响，因此分离纯化、富集前白蛋白抗体的技术越来越显示其重要性。从成份复杂的抗血清中富集、纯化出目标抗体而又尽可能保持其活性和含量是一项艰巨而繁重的任务。而亲和层析法是目前最有效的分离纯化、富集目标抗体的技术之一，拟进一步研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计一种通过该免疫亲和柱从血清中简便、高效、特异性分离纯化前白蛋白多克隆抗体的方法。

本发明提供了一种应用免疫亲和柱纯化人血清前白蛋白多克隆抗体的方法，该方法包括下列步骤：

1）琼脂糖凝胶Sepharose6B的活化：用溴化氰法活化Sepharose6B凝胶，活化

过程如下：

a)取10ml Sepharose6B放在布氏漏斗中抽干，用30ml去离子水分两次洗涤后抽干，再加入少量0.1mol/L pH8.3的NaHCO₃洗涤，立即转入100ml烧杯中，冰浴下缓慢搅拌；

b)在通风橱内称取1g溴化氰，加去离子水10ml溶解，然后分批加入Sepharose6B中，边加边搅拌，同时测pH值，通过滴加2mol/L NaOH,使得pH维持在10.5，待溴化氰溶液滴加完毕，继续搅拌30分钟，pH保持不变，停止搅拌；

c)将活化的Sepharose6B加入小冰块，迅速导入布氏漏斗中，以冰水抽洗成pH7，再迅速以150ml冷的0.1mol/L pH8.3的NaHCO₃溶液抽洗备用；

2）人血清前白蛋白多克隆抗体免疫亲和柱的制备：

人血清前白蛋白与琼脂糖凝胶Sepharose6B偶联得到亲和吸附填料，填入玻璃柱中制得人前白蛋白多克隆抗体免疫亲和柱，操作步骤如下：

d)偶联

以纯化制备获得的PA蛋白纯品作为配基，采用GE AKTA^TM快速蛋白层析仪purifier100系统HiTrap^TM Desalting脱盐柱置换成亲和偶联缓冲液体系：pH8.3的内含有0.5M NaCl的0.1mol/L NaHCO₃偶联缓冲液；

将上述步骤1）c)活化好的Sepharose6B置于砂芯漏斗中用偶联缓冲液快速抽洗，然后迅速倒入PA蛋白溶液中进行偶联，蛋白检测仪监控偶联过程；用10倍体积以上的偶联缓冲液洗去未偶联的PA蛋白溶液，得到Sepharose6B-PA蛋白偶联复合物；收集全部洗脱液，通过测定其蛋白质含量计算偶联率；

e)封闭活性基团

将Sepharose6B-PA蛋白偶联复合物转入5倍偶联复合物体积的pH8.0的内含有0.5M NaCl的0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）缓冲液中，旋转震荡2h,以封闭琼脂糖凝胶中多余的活性基团；

f)洗涤

步骤e）得到的Sepharose6B-PA蛋白偶联复合物依次用10倍偶联复合物体积的pH4.0的内含有0.5M NaCl的0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液和5倍体积的pH8.0的内含有0.5M NaCl的0.1mol/L Tris-HCl缓冲液中洗涤，此洗涤过程重复三次；然后用10倍偶联复合物体积的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次；

g）装柱

将步骤e）得到的Sepharose6B-PA蛋白偶联复合物填充5ml或10ml固相萃取空柱管中，在负压下用PBS将凝胶压紧，制成Sepharose6B-PA蛋白免疫亲和柱；

用本发明方法制备的Sepharose6B-PA蛋白偶联复合物如需放置一段时间，应使用含有万分之二叠氮钠的PBS缓冲液浸泡，2-8℃密封保存。

本发明方法制成的Sepharose6B-PA蛋白免疫亲和柱，在使用后通过以下方法再生：

Sepharose6B-PA蛋白免疫亲和柱用5-10个柱床体积pH8.5的内含有0.5MNaCl的0.1mol/L Tris-HCl缓冲液和5-10个柱床体积pH4.0的内含有0.5M NaCl的0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液清洗亲和柱2次，再用PBS缓冲液充分平衡后保存2-8℃待用。

3）纯化羊抗人血清前白蛋白多克隆抗体：

取免疫后羊抗人血清前白蛋白抗血清200ml，依次用0.8um、0.45um微孔滤膜过滤，滤液过制备的Sepharose6B-PA蛋白亲和柱（柱子用含50ml的PBS预处理）。分别用50ml含0.5M NaCl的PBS淋洗杂质组分，紫外检测器检测吸光度平衡后，用pH4.0的内含有0.5M NaCl的0.1mol/L Tris-柠檬酸缓冲液洗脱，洗脱液经HiTrap^TM Desalting脱盐柱置换成PBS缓冲液后，自动生化仪（OLYMPUS AU400）上机，标准品定标测试，观察定标曲线的线性。

本发明人血清前白蛋白多克隆抗体免疫亲和柱的制备方法，所述步骤2）d)偶联过程中使用单蛋白配基偶联缓冲液的置换采用的脱盐柱体系选自HiTrap^TMDesalting或Hiprep26/10Desalting优选HiTrap^TM Desalting；

所述步骤2）d)偶联过程中使用单蛋白配基偶联缓冲液的置换脱盐层析条件为:层析液：pH8.3的内含有0.5M NaCl的0.1mol/L NaHCO₃偶联缓冲液；上样量为柱床体积的10%～50%，优选但不限于25%；流速为1～3毫升/分钟，优选但不限于3毫升/分钟；洗脱体积为1～2个柱床体积，优选但不限于1.5个柱床体积。

所述步骤2）d)偶联过程中配基PA蛋白偶联的量为1～10mg/ml填料，优选5mg/ml填料。

所述步骤2）d)偶联过程中配基与填料的偶联时间为1～5h，优选但不限于2h；

偶联温度为20～40℃，优选但不限于25℃；

本发明的人血清前白蛋白多克隆抗体免疫亲和柱，通过一次性纯化即可去除绝大部分杂质，有效的消除了免疫比浊试剂中的伪浊度问题，可以简便、高效、特异性地从血清中分离纯化前白蛋白多克隆抗体，有较大的应用价值。

附图说明

图1HiTrapTM Desalting脱盐柱置换配基蛋白为偶联缓冲液；

收集蛋白A1～A4管；其中实线峰为蛋白峰；虚线峰为离子峰。

图2Sepharose6B-PA蛋白亲和柱纯化PA多克隆抗体图谱；

峰1：未吸附的杂质峰；峰2：PA多克隆蛋白洗脱峰。

图3自动生化仪标准品定标测试：亲和纯化前；

回归方程：y=0.0008x+0.1166；线性相关系数：R²=0.8649

图4自动生化仪标准品定标测试：亲和纯化后；

回归方程：y=0.0006x+0.0052；线性相关系数：R²=0.992

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

以下实施例原料市售得到。

实施例1：琼脂糖凝胶Sepharose6B的活化

取10ml Sepharose6B放在布氏漏斗中抽干，用30ml去离子水分两次洗涤后抽干，再加入50ml0.1mol/L pH8.3的NaHCO₃洗涤，立即转入100ml烧杯中，冰浴下缓慢搅拌；在通风橱内称取1g溴化氰，加去离子水10ml溶解，然后逐滴加入Sepharose6B中，边加边搅拌，同时测pH值，通过滴加2mol/L NaOH,使得pH维持在10.5，待溴化氰溶液滴加完毕，继续搅拌30分钟，pH保持不变，停止搅拌；将活化的Sepharose6B加入小冰块，迅速导入布氏漏斗中，以冰水抽洗成pH7，再迅速以150ml冷的0.1mol/L pH8.3的NaHCO₃溶液抽洗后备用；

实施例2：配基：人血清前白蛋白溶液的置换

采用GE AKTA^TM快速蛋白层析仪purifier100系统HiTrap^TM Desalting脱盐柱置换成亲和偶联缓冲液体系：首先用pH8.3的内含有0.5M NaCl的0.1mol/LNaHCO₃偶联缓冲液冲洗脱盐柱5～10个柱床体积，流速3毫升/分钟；上样量5ml；流速为3毫升/分钟；洗脱体积为1.5个柱床体积；部分收集器收集蛋白溶液1ml/管，详见图1；

实施例3：人血清前白蛋白多克隆抗体免疫亲和柱的制备

1）偶联：人血清前白蛋白（PA）纯品纯化制备

取100ml正常人血清（取自上海市金山区血站）溶解20g NaCl,充分溶解使NaCl溶解度达到20%（w/v）；配置120ml的5.5%（w/v）的苯酚水溶液，通风橱内缓慢逐滴滴入，充分混匀，静置30min；10000g（8500转/分钟）离心15min后，弃去沉淀，保留上清液；上清液经0.8μm的水相滤头过滤后，装入透析袋，4℃透析（50mM PBS pH7.4）48小时，每隔6～12小时更换一次透析液；

HiTrap Capto Q FF（美国GE医疗公司产品）强阴离子交换层析：A液(50mM磷酸缓冲液（pH7.4）；B液(50mM磷酸缓冲液、1M氯化钠，pH7.4)，待100ml待纯化组分泵入层析柱后，首先在AKTA^TM快速蛋白层析仪purifier100系统上用50ml A液冲洗层析柱,洗掉非特异性吸附的杂蛋白，然后设定程序，洗脱50ml的A、B混合液形成总体积为5个柱床体积的0～20%（v/v）B液（100%～80%A液）的线性洗脱，除去杂蛋白，后用50ml(5个柱床体积)20%～100%B液（80%～0%A液）线性洗脱，洗脱峰中含PA,收集PA洗脱液约45ml；

首先用Sephacryl S200分子筛（美国GE医疗公司产品）层析柱中度纯化，纯化条件为：待纯化样品上样量约12ml，洗脱流速为1毫升/分钟，洗脱400ml，收集吸收峰二30ml，弃峰一；

Superdex G75（美国GE医疗公司产品）分子筛层析精细纯化，纯化条件为：待纯化样品上样量约5ml，洗脱流速为1毫升/分钟，洗脱250ml收集最大的吸收峰组分20ml，得到高纯度的前白蛋白。（制备详细过程请见专利申请：201210489310.5）

以上述纯化获得的PA纯品作为配基，采用GE AKTATM快速蛋白层析仪purifier100系统HiTrapTM Desalting脱盐柱置换成亲和偶联缓冲液体系：偶联过程中使用单蛋白配基偶联缓冲液的置换脱盐层析条件为:层析液：pH8.3的内含有0.5M NaCl的0.1mol/L NaHCO₃偶联缓冲液；所使用脱盐柱的柱床体积为20ml;上样量为5ml；流速为2毫升/分钟；洗脱体积为2个柱床体积;

置换缓冲液后的PA蛋白溶液，通过超滤管浓缩，自动生化仪检测定量浓度；活化好的Sepharose6B凝胶填料10ml置于砂芯漏斗中用偶联缓冲液快速抽洗，然后迅速倒入10ml PA蛋白溶液中进行磁力搅拌偶联，偶联过程中配基PA蛋白偶联的量为5mg/ml填料；偶联过程中配基与填料的偶联时间为2h；偶联温度为25℃.用200ml以上的偶联缓冲液去除未偶联的人前白蛋白溶液，得到Sepharose6B-PA蛋白偶联复合物；收集全部洗脱液，通过测定洗脱液中蛋白质含量计算偶联率。

	PA浓度（mg/ml）	PA溶液体积(ml)
			偶联前	5	10
偶联后	0.15	120

通过计算得本次偶联率为64%

2）封闭活性基团

将Sepharose6B-PA蛋白偶联复合物转入5倍体积pH8.0的内含有0.5MNaCl的0.1mol/L Tris-HCl缓冲液中，旋转震荡约2h,以封闭琼脂糖凝胶中多余的活性基团；

3）洗涤

步骤1）得到的Sepharose6B-PA蛋白偶联复合物依次用10倍偶联复合物体积的pH4.0的内含有0.5M NaCl的0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液和5倍体积的pH8.0的内含有0.5M NaCl的0.1mol/L Tris-HCl缓冲液中洗涤，此洗涤过程重复三次；然后用10倍偶联复合物体积的PBS洗涤2次；

4）装柱

将上述得到的Sepharose6B-PA蛋白偶联复合物填充5ml或10ml固相萃取空柱管中，在负压下用PBS将凝胶压紧，制成Sepharose6B-PA蛋白免疫亲和柱；

5）保存

步骤（f）制备好的Sepharose6B-PA蛋白偶联复合，使用含有万分之二叠氮钠的PBS缓冲液浸泡，2～8℃密封保存。

6）柱的再生

亲和柱使用后，用5-10个柱床体积pH8.5的内含有0.5M NaCl的0.1mol/LTris-HCl缓冲液和5-10个柱床体积pH4.0的内含有0.5M NaCl的0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液清洗亲和柱2次，再用PBS缓冲液充分平衡后保存2～8℃待用。4）实施例4：纯化羊抗人血清前白蛋白多克隆抗体：

取免疫后羊抗人血清前白蛋白抗血清（购自深圳菲鹏生物，批号：1108003R）200ml，依次用0.8um、0.45um微孔滤膜过滤，滤液过制备的Sepharose6B-PA蛋白亲和柱（柱子用含50ml的PBS预处理）。分别用50ml含0.5M NaCl的PBS淋洗杂质组分，紫外检测器检测吸光度平衡后，用pH4.0的内含有0.5M NaCl的0.1mol/L Tris-柠檬酸缓冲液洗脱，洗脱液经HiTrap^TM Desalting脱盐柱置换成PBS缓冲液后，得到亲和纯化后PA抗体，自动生化仪（AU400）上机，标准品定标测试，观察定标曲线的线性，纯化前后定标线性结果如图3、4所示。

实施例5：纯化后人血清前白蛋白多克隆抗体自动生化仪标准品定标测试分析

由于标准品（Roche PAC,Lot:166520）中的PA蛋白与PA多克隆抗体特异性结合，形成不溶性免疫复合物，使反应液产生浊度。反应液产生浊度的高低与标准品中PA的浓度成正比。通过在340nm处测定吸光度的变化值，即可以测得样本中PA的浓度。试验所用的自动生化仪型号为OLYMPUS AU400，采用的PA标准品的浓度分别为0、134、268、402、536、670mg/L。实施例4纯化前后PA抗体上机测试结果如下表所示：

抗血清在经过亲和纯化之前，因某些干扰物质的存在，导致与抗原反应时出现非特异性免疫反应，上机测试体现的结过则是在低浓度时，浊度异常偏高，由图3、图4对比可见，在抗体经过亲和纯化前，标准品浓度低于402mg/L时的A₃₄₀吸光度的OD值普遍偏高，线性相关系数低于0.990，而在经过亲和纯化后，6点标准品定标基本上成一条直线，线性相关系数大于0.990。由此说明利用本发明所研制的亲和层析填料，通过一次性纯化即可去除绝大部分杂质，有效的消除了免疫比浊试剂中的伪浊度问题。

Claims

1.一种应用免疫亲和柱纯化人血清前白蛋白多克隆抗体的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

1）琼脂糖凝胶Sepharose6B的活化：用溴化氰法活化Sepharose6B凝胶，活化过程如下：

2）人血清前白蛋白免疫亲和柱的制备：

人血清前白蛋白与琼脂糖凝胶Sepharose6B偶联得到亲和吸附填料，填入玻璃柱中制得人前白蛋白免疫亲和柱，操作步骤如下：

d）偶联

以纯化制备获得的人血清前白蛋白（PA）纯品作为配基，采用GE AKTATM快速蛋白层析仪purifier100系统HiTrapTM Desalting脱盐柱置换成亲和偶联缓冲液体系：pH8.3的内含有0.5M NaCl的0.1mol/L NaHCO₃偶联缓冲液；

将实施例1）活化好的Sepharose6B置于砂芯漏斗中用偶联缓冲液快速抽洗，然后迅速倒入PA蛋白溶液中进行偶联，蛋白检测仪监控偶联过程；用10倍体积以上的偶联缓冲液去除未偶联的人前白蛋白溶液，得到Sepharose6B-PA蛋白偶联复合物；收集全部洗脱液，通过测定其蛋白质含量计算偶联率；

e）封闭活性基团

f）洗涤

g）装柱

h）保存

3)纯化羊抗人血清前白蛋白多克隆抗体：

取免疫后羊抗人血清前白蛋白抗血清200ml，依次用0.8um、0.45um微孔滤膜过滤，滤液过制备的Sepharose6B-PA蛋白亲和柱，柱子用含50ml的PBS预处理：分别用50ml含0.5M NaCl的PBS淋洗杂质组分，紫外检测器检测吸光度平衡后，用pH4.0的内含有0.5M NaCl的0.1mol/L Tris-柠檬酸缓冲液洗脱，洗脱液经HiTrapTM Desalting脱盐柱置换成PBS缓冲液后，自动生化仪AU400上机，标准品定标测试，观察定标曲线的线性。

2.根据权利要求1所述一种应用免疫亲和柱纯化人血清前白蛋白多克隆抗体的方法,其特征在于，所述步骤2）d)偶联过程中使用单蛋白配基偶联缓冲液的置换采用的脱盐柱体系选自HiTrapTM Desalting或Hiprep26/10Desalting。

3.根据权利要求2所述一种应用免疫亲和柱纯化人血清前白蛋白多克隆抗体的方法,其特征在于，所述步骤2）d)偶联过程中使用单蛋白配基偶联缓冲液的置换采用的脱盐柱体系为HiTrapTM Desalting。

4.根据权利要求1所述一种应用免疫亲和柱纯化人血清前白蛋白多克隆抗体的方法,其特征在于，所述步骤2）d)偶联过程中使用单蛋白配基偶联缓冲液的置换脱盐层析条件为:层析液：pH8.3的内含有0.5M NaCl的0.1mol/LNaHCO₃偶联缓冲液；上样量为柱床体积的10%～50%；流速为1～3毫升/分钟；洗脱体积为1～2个柱床体积。

5.根据权利要求4所述一种应用免疫亲和柱纯化人血清前白蛋白多克隆抗体的方法,其特征在于，所述步骤2）d)偶联过程中使用单蛋白配基偶联缓冲液的置换脱盐层析条件为:层析液：pH8.3的内含有0.5M NaCl的0.1mol/LNaHCO₃偶联缓冲液；上样量为柱床体积的25%；流速为3毫升/分钟；洗脱体积为1.5个柱床体积。

6.根据权利要求1所述一种应用免疫亲和柱纯化人血清前白蛋白多克隆抗体的方法,其特征在于，所述步骤2）d)偶联过程中配基PA蛋白偶联的量为1～10mg/ml填料。

7.根据权利要求6所述一种应用免疫亲和柱纯化人血清前白蛋白多克隆抗体的方法,其特征在于，所述步骤2）d)偶联过程中配基PA蛋白偶联的量为5mg/ml填料。

8.根据权利要求1所述一种应用免疫亲和柱纯化人血清前白蛋白多克隆抗体的方法,其特征在于，所述步骤2）d)偶联过程中配基与填料的偶联时间为1～5h；偶联温度为20～40℃。

9.根据权利要求8所述一种应用免疫亲和柱纯化人血清前白蛋白多克隆抗体的方法,其特征在于，所述步骤2）d)偶联过程中配基与填料的偶联时间为2h；偶联温度为25℃。

10.根据权利要求2所述一种应用免疫亲和柱纯化人血清前白蛋白多克隆抗体的方法,其特征在于，所述步骤2）g)制成的Sepharose6B-PA蛋白免疫亲和柱，在使用后通过以下方法再生：

Sepharose6B-PA蛋白免疫亲和柱用5-10个柱床体积pH8.5的内含有0.5MNaCl的0.1mol/L Tris-HCl缓冲液和5-10个柱床体积pH4.0的内含有0.5M NaCl的0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液清洗亲和柱2次，再用PBS缓冲液充分平衡后2-8℃保存备用。